BE522290A

BE522290A -

Info

Publication number: BE522290A
Authority: BE

Description

PROCEDE DE PRODUCTION DE L'HORMONE CIRCULATOIRE KALLIKREINEo
Il a été trouvé que l'hormone circulatoire Kallikréine peut être précipitée à partir de l'urine ou de thermolysats (voir à ce sujet le brevet belge n . 513.523 du 14 août 1952) ou d'autolysats du pancréas par addition d'une solution aqueuse de sels de plomb ou de zinc, Le précipité formé est un adsorbat insoluble dans l'eau, qui peut être séparé de la majeure partie des matières d'accompagnement biologiquement inactives. La Kallikréine peut être récupérée par élution à partir des adsorbats insolubles dans l'eau
Les préparations hormonales ainsi obtenues possèdent un haut degré de pureté et peuvent âpres dialyse , trouver leur application en thérapeuti- . que aux fins d'injection, sans aucune purification ultérieure.

Les rendements obtenus s'élèvent à 100 %.

Les solutions peuvent être au besoin purifiées davantage suivant des méthodes connues. C'est ainsi, par exemple, qu'on obtient à partir de ces solutions des préparations sèches stables, éventuellement après dialyse par précipitation avec des solvants organiques, tels que l'acétone, l'alcool ou des mélanges de tels solvants organiques.

La précipitation des solutions aqueuses de sels de plomb ou de zinc avec adsorption de la Kallikréine active est une réaction très spécifique et tout à fait inattendue de la Kallikr-éine. La précipitation, respectivement l'adsorption n'a pas lieu avec les sels de magnésium, calcium, strontium, baryum, cadmium, mercure, cuivre, fer bivalent, fer trivalent ou manga- nèse
La formation des précipités est sensiblement indépendante de la concentration en ions hydrogène.

Ainsi, par exemple, en effectuant la précipitation avec une solution aqueuse de sel de plomb et après élution avec une solution de phosphate de diammonium, la même solution de départ fournit 22.800 unités de Kallikréine lorsqu'elle est précipitée à une valeur pH de

4,2, et 18.600 unités lorsqu'elle est précipitée à une valeur pH de 7,0.

Le rendement et la pureté du produit obtenu dépendent dans une large mesure du choix de l'agent d'élution. On obtient de bons résultats par exemple avec des solutions tampon de phosphate, carbonate de soude, bicarbonate ou ammoniaque étendue Mais on peut aussi utiliser d'autres agents d'élution connus dans la chimie des fermentations.

Le procédé conforme à l'invention présente des avantages techniques très appréciables sur les procédés de purification connus de la Kallikréine. Sa mise en oeuvre est très simple et on obtient un produit d'un haut degré de pureté. L'effet de purification de la Kallikréine extraite de l'urine est augmenté dans la proportion de 100 %, celui des thermolysats pancréatiques dans la proportion de 80 - 90%. Le rendement varie entre 60 et 100 %. La Kallikréine obtenue à l'origine à l'état fort dilué peut être concentrée à un petit volume sans qu'il soit nécessaire de recourir à la distillation sous vide.

Le procédé est applicable à la récupération de la Kallikréine à partir d'urine et de pancréas et permet de renoncer à l'emploi de 1-?acétate d'uranyle comme agent de précipitation, produit très-coûteux et difficile à obtenïr
On avait déjà essayé à maintes reprises d'utiliser des sels de plomb et de zinc pour la purification de la Kallikréine, mais ces essais n'ont pas abouti à des résultats satisfaisants
Des essais ont été faits en vue de faire adsorber de la Kallikréine à partir d'urine par l'addition de suspensions toutes faites d'hydroxyde de zinc à une valeur pH comprise entre 7,4 et 9,2 (voir à ce sujet F.

Bischoff et A.J. Elliot, Journal of Biol, Chem. 109, 423 (1935) @ Bien que les essais aient été répétés jusqu'à quatre fois de suite, ils n'avaient pas permis, en règle générale, de faire adsorber la Kallikréine substantiellement sur l'hydrcxyde de zinc Les auteurs font remarquer que "les produits obtenus sont en général instables", tandis que les solutions préparées conformément à l'invention peuvent être conservées pendant des semaines, sans altération La différence fondamentale entre le procédé préconisé par Elliot et le procédé conforme à l'invention réside dans le fait qu'Elliot fait adsorber des matières d'accompagnement ou des substances actives avec des suspensions d'hydroxyde de zinc, tandis que, conformément à 1-9invention.,

un précipité de zinc-protéine est formé dans la solution de Kallikréine par l'addition de sels de zinc solubles ou dissous, précipité qui fixe la substance active par adsorption...

On avait aussi essayé de produire des précipités de phosphate de zinc dans des solutions de Kallikréine urinaire en vue de faire adsorber sur ces précipités soit de la Kallikréine, soit ses matières d'accompagnement (voir à ce sujet H. Kraut, E.K.Frey, E o Bauer et F Schultz, Zeitschr. physiol.Chem. 205, 99 (1932). Cependant, ce procédé nécessite des opérations fort compliquées (voir page 106 dans ladite publication) qui ne peuvent pas être appliquées à la fabrication sur une échelle industrielle.

Les méthodes opératoires connues sont contraires au procédé conforme à l'invention, suivant lequel la substance active nest pas adsorbée au phosphate de plomb, mais précipitée au moyen de solutions aqueuses de sel de,plomb et remise en liberté, au moyen d'un agent d'élution, par exemple une solution de phosphate
Exemple 1 :
25 litres d'urine humaine fraîche au pH de 6,5 sont précipités avec litres d'une solution à 10 % d'acétate de plomba Le précipité est séparé et lavé avec 3 litres d'eau distillée Après avoir délayé le précipité dans 1,3 litres d'eau, on y fait couler peu à peu 1,3 litres d'une solution à 10% de phosphate de diammonium, en agitant La valeur pH est de 7,2.

Après une demi-heure d'agitation, le précipité est séparé par essorage et la solution est dialysée durant 48 heures contre de l'eau courante. Le rendement est de 5000 unités = 100 %. Le degré de pureté est de 900²par unitéo

Exemple 2 :
90 litres de thermolysat pancréatique (obtenu suivant le procédé faisant l'objet du brevet belge no. 5130523 cité plus haut) contenant 900.000 unités de Kallikréine, sont précipités avec 12,6 litres d'une solution à
10% d'acétate de plomb, avec agitation. Le précipité est séparé sur le filtre à succion, lavé avec 5 litres d'eau et séparé de nouveau. Après avoir délayé le résidu dans 3 litres d'eau distillée, on y fait couler 2,5 litres d'une solution à 16% de phosphate de diammonium, en continuant à agiter.

Après une heure d'agitation, le précipité est éliminé par essorage et la solution limpide est dialysée durant 72 heures contre de l'eau courante. Le rende- ment s'élève à 720.000 unités avec un degré de pureté de 60 par unité.

Le dialysat ainsi obtenu est concentré à un litre, sous vide à 45 C, le résidu précipité est séparé sur le filtre à succion et la solution est précipitée à +3 C avec 5 litres d'un mélange d'alcool et d'acétone (50/ 50 %) . Le précipité est séparé par essorage, délayé dans un demi-litre d' - acétone et séparé sur le filtre à succion. Le filtrat est lavé avec de l'acé- tone, puis avec de l'éther et le résidu friable est séché quelques heures à l'air libre, et finalement dans le dessiccateur P O évacué Rendement : 23,22 g = 540.000 unités = 75%. La pureté est de 43 par unité.

Exemple 3 :
780 ce de thermolysat pancréatique contenant 7300 unités sont pré- cipités avec 200 cc d'une solution à 10% d'acétate de zinc, le précipité est séparé par essorage et lavé avec 100 cc d'eau distillée. Après élimina- tion de l'eau de lavage, le résidu est délayé dans 100 cc d'eau distillée.

A cette suspension sont ajoutés goutte à goutte, en agitant, 55 ce d'une solution à 10% de bicarbonate de sodium. Au bout d'une heure, le résidu insoluble est séparé, la solution est neutralisée et dialysée pendant 48 heures contre de l'eau courante.

Rendement : 5100 unités; pureté : 1 unité = 43
Exemple 4 :
1 litre d'autolysat pancréatique, obtenu par autolyse de 72 heures à 37 C, qui contient 20.000.unités de Kallikréine est précipité avec 100 cc d'une solution à 10% d'acétate de zinc. la précipite est séparé par essorage lavé avec 100 cc d'eau distillée et, après un nouvel essorage, délayé dans 60 cc d'eau. Ceci fait, on y fait couler 20 cc d'une solution à 105 de phosphate de diammonium. Après une heure d'agitation, les fractions insolubles sont sé- parées par filtration. La solution contenant la Kallikréine est neutralisée et dialysée pendant 40 heures contre de l'eau courante.

Rendement : 12,300 unités. Degré de pureté : 1 unité = 70 @.

Revendications :
1 Procédé de production de l'hormone circulatoire Kallikréine, caractérisé par le fait que la substance active est précipitée à partir de solutions contenant de l'urine ou de la Kallikréine extraite de l'urine, ou à partir de thermolysats ou autolysats pancréatiques, par addition d'une solution aqueuse d'un sel hydrosoluble de plomb ou de zinc, et remise en li- berté à partir de ces adsorbats au moyen d'un traitement par des agents d'élution.

**ATTENTION** fin du champ DESC peut contenir debut de CLMS **.

Claims

2 Modes de mise en oeuvre du procédé spécifié sous 1 , remarqua- bles notamment par les particularit és suivantes, prises séparément ou en combinaison a) les solutions obtenues sont soumises à une dialyse ou à d'au- tres procédés de purification connus de la Kallikréine; <Desc/Clms Page number 4> b) la Kallikréine est précipitée des solutions au moyen d'acétone ou de solvants organiques, tels que l'alcool, ou des mélanges de tels solvants organiques