CZ292953B6 - Syntetická sekvence DNA s rozšířenou insekticidní aktivitou v kukuřici - Google Patents

Abstract

Popisuje se nukleotidová sekvence obsahující kódující sekvenci, která kóduje protein z Bacillus thuringiensis schopný usmrtit hmyz, přičemž tato kódující sekvence vykazuje alespoň 90% homologii s kódující sekvencí obsahující 100 % kukuřicí preferovaných kodonových sekvencí pro tento protein. Dále se popisují rekombinantní vektory a rostliny obsahující tyto nukleotidové sekvence a způsob jejich vytvoření. Rostliny kukuřice takto transformované vykazují vysokou úroveň exprese daného proteinu schopného usmrtit hmyz.ŕ

Description

Oblast techniky

Vynález se týká sekvencí DNA. které kódují insekticidní proteiny, a exprese těchto sekvencí v rostlinách.

Dosavadní stav techniky

Exprese genů insekticidních proteinů (IP) získaných z Bacillus thuringiensis (Bt) v rostlinách se ukázala jako velmi obtížná. Byly prováděny pokusy exprimovat v rostlinách chimérické kombinace promotor / gen insekticidního proteinu Bt. Typicky však byla v transgenických rostlinách získána pouze nízká hladina proteinu, viz například Vacek a kol., Nátuře 328: 33 - 37, 1987, Bartoň a kol., Plant Physiol. 85: 1103 - 1109, 1987, Fischoff a kol., Bio/Technology 5: 807-813, 1987.

Jedním z předpokládaných vysvětlení příčin nízké exprese je názor, že náhodná místa transkripčních úprav (processingu) vytváří aberantní formy mRNA-transkriptu insekticidního proteinu Bt. Tyto nenormálně upravené transkripty jsou v rostlinách z hlediska produkce insekticidního proteinu nefunkční. Mezi možná místa úprav patří místa polyadenylace, místa sestřihu intronů, signály terminace transkripce a signály pro transport. Většina genů neobsahuje místa mající Škodlivý vliv na expresi genu v normálním hostitelském organizmu genu. Náhodný výskyt takových míst úprav v kódující oblasti však může komplikovat expresi tohoto genu v transgenických hostitelích. Například kódující oblast genu insekticidního krystalického proteinu Bt získaného z Bacillus thuringiensis kmen kurstaki (GENBANK BTHKURHD, přírůstkové číslo M15271, B. thuringiensis var. kurstaki, HD-1; Geiser a kol. Gene 48: 109 - 118 (1986)) může v důsledku přímého získání z Bacillus thuringiensis obsahovat místa, která zabraňují náležité úpravě genu v rostlinách.

Při snaze o dosažení exprese proteinu z Bacillus thuringiensis v organizmu jako je rostlina dochází i k dalším obtížím. Bylo zjištěno, že se použití kodonů v nativním genu insekticidního proteinu Bt podstatně liší od typického použití kodonů v rostlinném genu. Použití kodonů v nativním genu insekticidního proteinu Bt se zejména podstatně liší od použití kodonů v genu kukuřice. V důsledku toho nemusí být mRNA z tohoto genu efektivně využita. Použití kodonů může ovlivnit expresi na úrovni translace, transkripce nebo úprav mRNA. Za účelem optimalizace insekticidního genu pro expresi v rostlinách byly prováděny pokusy změnit gen tak, aby se podobal v nejvyšší možné míře genům přirozeně obsaženým v transformované hostitelské rostlině.

Adang a kol., v EP 0359472 (1990) popisují syntetický gen Bacillus thuringiensis tenebrionis (Btt), který je z 85 % homologický s nativním genem Btt a který je vytvořen tak, že se v něm obsah A + T blíží tomuto obsahu zjištěnému obecně v rostlinách. Adang a kol. uvádějí v tabulce 1 sekvenci kodonů syntetického genu Btt vytvořenou tak, že se více podobá normální distribuci kodonů v genech dvouděložných rostlin. Adang a kol. uvádějí, že podobným způsobem může být optimalizován syntetický gen kódující insekticidní protein pro zlepšení exprese vjednoděložných rostlinách, a v tabulce 1 je znázorněna frekvence použití kodonů u vysoce exprimovaných proteinů jednoděložných rostlin. Na straně 9 Adang a kol. uvádějí, že je syntetický gen Btt vytvořen tak, aby v něm obsah A + T činil 55 % (a obsah G + C tedy činí 45 %). Na straně 20 Adang a kol. popisují, zeje syntetický gen vytvořen pomocí změny kodonů jednotlivých aminokyselin v nativním genu Bt tak, aby se v kódující oblasti tohoto genu odrážela celková distribuce kodonů preferovaných geny dvouděložných rostlin pro každou aminokyselinu. Adang a kol. dále uvádějí, že se pouze některé z kodonů nativního genu Btt zamění za kodony

-1 CZ 292953 B6 nejvíce preferované rostlinami pro každou aminokyselinu, takže je zachována celková distribuce kodonů používaných u proteinů dvouděložných rostlin.

Fischoff a kol. v EP 0 385 962 (1990) popisují rostlinné geny kódující krystalický proteinový toxin zBacillus thuringiensis. V tabulce V Fischoff a kol. uvádějí procentuální použití kodonů pro každou aminokyselinu. Na straně 8 navrhují Fischoff a kol modifikaci nativní genu Bt odstraněním předpokládaných polyadenylačních signálů a sekvencí ATTTA. Fischoff a kol. dále doporučují kvůli identifikaci předpokládaných polyadenylačních signálů rostlin vyhledat v sekvenci nativního genu Bt oblasti obsahující více než čtyři po sobě jdoucí nukleotidy adenin nebo thymin. Fischoff a kol. uvádějí, že nukleotidová sekvence by měla být změněna pokud je mezi deseti nukleotidy navzájem identifikován více než jeden předpokládaný polyadenylační signál. Na straně 9 Fischoff a kol. uvádějí, že by kodony měly být vybírány tak, aby byl obsah G + C upraven s výhodou přibližně na 50 %.

Perlak a kol., PNAS USA, 88: 3324 - 3328 (1991) popisují modifikované kódující sekvence genu crylA(b) Bacillus thuringiensis, podobné jako uvádějí Fischoff a kol. Perlak a kol. znázorňují v tabulce 1 na straně 3325, že jejich částečně modifikovaný gen crylA(b) je přibližně z 96% homologický s nativním genem crylA(b) (1681 z 1743 nukleotidů), s obsahem G + C 41 %, při snížení počtu polyadenylačních signálních sekvencí rostlin z 18 na 7 a snížení počtu sekvencí ATTTA z 13 na 7. Perlak a kol. označují plně modifikovaný gen crylA(b) jako plně syntetický (viz strana 3325, sloupec 1). Tento gen je přibližně ze 79 % homologický s nativním genem crylA(b) (1455 z 1845 nukleotidů), s obsahem G + C 49 %, při snížení počtu polyadenylačních signálních sekvencí rostlin na 1 a odstraněni všech sekvencí ATTTA.

Bartoň a kol. vEP 0431 829 (1991) popisují expresi insekticidních toxinů v rostlinách. Ve sloupci 10 popisují Bartoň a kol. konstrukci syntetického genu hmyzího toxinu AalT kódujícího toxin štíra za použití nejvíce preferovaného kodonů pro každou aminokyselinu v souladu s diagramem znázorněným na obrázku 1 dokumentu.

Podstata vynálezu

Vynález se týká způsobů zvýšení exprese heterologních genů v rostlinných buňkách. Obecně se zajímavý gen nebo kódující oblast konstruuje tak, aby obsahovala sekvenci rostlinou specificky preferovaných kodonů. Tímto způsobem se změní použití kodonů pro konkrétní protein, aby se zvýšila exprese v konkrétní rostlině. Takovéto kódující sekvence optimalizované pro rostliny mohou být operabilně spojeny s promotory schopnými řídit expresi kódující sekvence v rostlinné buňce.

Konkrétně, jedním z předmětů vynálezu jsou syntetické geny insekticidních proteinů, které byly optimalizovány pro expresi v rostlinách.

Dalším předmětem vynálezu jsou syntetické geny insekticidních proteinů Bt pro maximalizaci exprese proteinů Bt v rostlině, výhodně v rostlině kukuřice. Podle jednoho provedení vynálezu se konstruuje syntetický gen insekticidního proteinu Bt za použití kodonů nejvíce preferovaných kukuřicí, kromě změn nutných pro zajištění míst ligace pro konstrukci plně syntetického genu.

V souladu s výše uvedenými předměty vynálezu jsme syntetizovali geny insekticidních krystalických proteinů Bt, ve kterých bylo změněno použití kodonů tak, aby se zvýšila exprese v rostlinách, zejména v kukuřici. Místo změny použití kodonů tak, aby se podobalo kukuřičnému genu ohledně celkové distribuce kodonů jsme však při syntéze syntetického genu spíše optimalizovali použití kodonů pomocí kodonů, které jsou v kukuřici nejvíce preferované (kukuřicí preferovaných kodonů). Optimalizované kukuřicí preferované použití kodonů umožňuje expresi insekticidního proteinu Bt ve vysokém množství, což může být důsledek maximalizace množství insekticidního proteinu Bt vzniklého translací zdané populace mediátorových RNA. Syntéza

-2CZ 292953 B6 genu insekticidního proteinu Bt za použití kukuřicí preferovaných kodonů má též za cíl odstranění náhodných míst úprav, která se mohou vyskytovat v nativní kódující sekvenci. Exprese tohoto syntetického genu je v buňkách kukuřice podstatně vyšší než exprese nativního genu insekticidního proteinu Bt.

Výhodné syntetické, pro kukuřici optimalizované sekvence DNA podle vynálezu jsou odvozeny od proteinu kódovaného genem crylA(b) zBacillus thuringiensis var. kurstaki, HD-1; Geiser a kol., Gene, 48: 109- 118 (1986) nebo genem crylB (gen AKA Crya4), který popsali Brizzard a Whiteley, Nuc. Acids, Res., 16: 2723 (1988). Sekvence DNA nativního genu kurstaki HD-1 crylA(b) je znázorněna jako sekvence 1. Tyto proteiny jsou účinné proti mnoha druhům hmyzu z řádu motýlů, včetně zavíječe kukuřičného Ostrinia nubilalis.

Ačkoliv je ve vynálezu jako příklad uvedena syntéza genů proteinů Bt optimalizovaných pro kukuřici, je zřejmé, že tento postup může být využit pro optimalizaci exprese libovolného proteinu v rostlinách.

Připravené optimalizované geny mohou být pro přípravu rekombinantních molekul DNA, tj. chimérických genů, spojeny s řadou promotorů, včetně konstitutivních, indukovatelných, časově regulovaných, vývojově regulovaných, tkáňově preferovaných a tkáňově specifických promotorů. Gen (kódující sekvence) optimalizovaný pro kukuřici zajišťuje v porovnání s genem neoptimalizováným pro kukuřici v transformované rostlině podstatně vyšší úroveň exprese.

V souladu s tím mohou být vytvořeny rostliny rezistentní vůči škůdcům z řádu brouků nebo motýlů, jako je Ostrinia nubilalis a Diatraea saccharalis.

Nukleotidové sekvence podle vynálezu mohou obsahovat tkáňové preferované a tkáňové specifické promotory, které řídí expresi operativně připojené optimalizované kódující sekvence v specifické části nebo částech rostliny za podstatného vyloučení exprese v ostatních částech.

Takovými promotory mohou být dřeňové preferované promotory. Termín „dřeňové preferovaný“ označuje, že promotor je schopen řídit expresi operativně připojeného strukturního genu v dřeni rostlin ve větším množství než v kořenech, vnějších obalech a opěrných kořenech, při v podstatě nulové expresi v semenech.

Výhodně lze použít též pylově specifické promotory. Termín „pylově specifický“ označuje, že promotor je schopen řídit expresi operativně připojeného zajímavého strukturního genu v podstatě výhradně v pylu rostliny, při zanedbatelné expresi v jakékoli další části rostliny. Termín „zanedbatelný“ znamená funkčně nevýznamný.

Dalším předmětem vynálezu jsou nukleotidové sekvence obsahující tkáňově preferovaný promotor nebo tkáňově specifický promotor operabilně spojený nebo navázaný k optimalizované kódující sekvenci kódující insekticidní protein z Bacillus thuringiensis, přičemž tyto sekvence lze exprimovat v rostlině.

Získají se tak transgenické rostliny, které exprimují alespoň jednu optimalizovanou kódující sekvenci, kódující innsekticidní protein, operativně začleněnou v tkáňově preferovaném nebo tkáňově specifickém typu exprese.

V jednom z popsaných a v nárocích uvedených specifických provedení vynálezu je tkáňově preferovaný nebo tkáňově specifický promotor operabilně spojen se strukturním genem kódujícím insekticidní protein, a alespoň jednou takovouto rekombinantní molekulou je stabilně transformována rostlina. Výsledná rostlina je rezistentní vůči konkrétnímu hmyzu, který se živí na těch částech rostliny, ve které je tento gen (nebo tyto geny) exprimován. Výhodně strukturní geny kódují insekticidní proteiny B.t. Ještě výhodnější jsou geny insekticidních proteinů B.t. optimalizované pro kukuřici.

-3CZ 292953 B6

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 představuje porovnání nativního genu Bt crylA(b) o plné délce (označen BTHKURHD), syntetického genu Bt crylA(b) optimalizovaného pro kukuřici o plné délce (označen flsynbt.fin) a zkráceného syntetického genu Bt crylA(b) optimalizovaného pro kukuřici (označen bssyn). Z tohoto obrázku je vidět, že sekvence syntetického genu crylA(b) optimalizovaného pro kukuřici o plné délce odpovídá sekvenci nativního genu crylA(b) v případě zhruba 2354 z 3468 nukleotidů (přibližně 68% homologie).

Obrázek 2 znázorňuje porovnání zkráceného nativního genu Bt crylA(b) (označen BTHKURHD) a zkráceného syntetického genu Bt optimalizovaného pro kukuřici (označen bssyn). Z tohoto obrázku je vidět, že sekvence zkráceného syntetického genu ciylA(b) optimalizovaného pro kukuřici odpovídá sekvenci nativního genu crylA(b) v případě zhruba 1278 z 1947 nukleotidů (přibližně 66% homologie).

Obrázek 3 představuje porovnání sekvence genu Bt zcela optimalizovaného pro kukuřici (označen synlT.mze) se zkráceným syntetickým genem Bt optimalizovaným pro kukuřici (označen bssyn) a syntetickým genem Bt optimalizovaným pro kukuřici o plné délce modifikovaným tak, aby obsahoval restrikční místa pro usnadnění konstrukce genu (označen synfuLmod). Z tohoto obrázku je vidět, že sekvence zkráceného syntetického genu crylA(b) optimalizovaného pro kukuřici odpovídá sekvenci genu crylA(b) zcela optimalizovaného pro kukuřici v případě 1913 z 1947 nukleotidů (přibližně 98% homologie).

Obrázek 4 znázorňuje porovnání nativního zkráceného genu Bt crylA(b) (označen BTHKURHD) se zkráceným syntetickým genem crylA(b), který popsali Perlak a kol., PNAS USA, 88: 3324- 3328 (1991) (označen PMONBT) a zkráceným syntetickým genem Bt optimalizovaným pro kukuřici (označen bssyn). Z tohoto obrázku je vidět, že sekvence genu PMONBT odpovídá sekvenci nativního genu crylA(b) v případě zhruba 1453 z 1845 nukleotidů (přibližně 79% homologie), zatímco zkrácený syntetický gen Bt ciylA(b) optimalizovaný pro kukuřici odpovídá nativnímu genu crylA(b) v případě zhruba 1209 z 1845 nukleotidů (přibližně 66% homologie).

Obrázek 5 představuje porovnání zkráceného syntetického genu crylA(b), který popsali Perlak a kol., PNAS USA, 88: 3324- 3328 (1991) (označen PMONBT) a zkráceného syntetického genu Bt crylA(b) optimalizovaného pro kukuřici (označen bssyn). Z tohoto obrázku je vidět, že sekvence genu PMONBT odpovídá sekvenci zkráceného syntetického genu Bt crylA(b) optimalizovaného pro kukuřici v případě zhruba 1410 z 1845 nukleotidů (přibližně 77% homologie).

Obrázek 6 znázorňuje gen CrylB optimalizovaný pro kukuřici o plné délce.

Obrázek 7 představuje sekvenci DNA hybridního chimérického genu CrylA(b) částečně optimalizovaného pro kukuřici o plné délce, obsaženého v pCIB4434. Syntetickou oblast tvoří nukleotidy 1 - 1938 (aminokyseliny 1 - 646) a nativní oblast tvoří nukleotidy 1939 - 3468 (aminokyseliny 647 - 1155). Místo fúze mezi syntetickou a nativní kódující sekvencí je v sekvenci označeno lomítkem (/).

Obrázek 8 znázorňuje mapu pCIB4434. Symbol Btk-syn označuje syntetickou část, symbol Btk-n označuje nativní část.

Obrázek 9 představuje hybridní sekvenci DNA optimalizovanou pro kukuřici o plné délce, která kóduje tepelně stabilní protein CrylA(b) obsažený v pCIB5511.

Obrázek 10 znázorňuje mapu pCIB5511.

-4CZ 292953 B6

Obrázek 11 představuje hybridní sekvenci DNA optimalizovanou pro kukuřici o plné délce, která kóduje tepelně stabilní protein CrylA(b) obsažený v pCIB5512.

Obrázek 12 znázorňuje mapu pCIB5512.

Obrázek 13 představuje sekvenci DNA optimalizovanou pro kukuřici o plné délce, která kóduje tepelně stabilní protein CrylA(b) obsažený v pCIB5513.

Obrázek 14 znázorňuje mapu pCIB5513. Symbol GFCRYIA(b)syn znamená syntetický GFCRYIA (b).

Obrázek 15 představuje sekvenci DNA optimalizovanou pro kukuřici o plné délce, která kóduje tepelně stabilní gen CrylA(b) obsažený v pCIB5514.

Obrázek 16 znázorňuje mapu pCIB5514.

Obrázek 17 představuje mapu pCIB4418.

Obrázek 18 znázorňuje mapu pCIB4420. Symbol f označuje PCR-fragment nahrazující místo Nco I dřeňového promotoru (ATG je iniciační kodon) místem Bam HI, sekvence je dřeňový promotor-5'-GGATCCAACA(ATG)-3'-syntetický Bt. Symbol P označuje dřeňový promotor, symbol syn-Bt označuje syntetický Bt CrylA(b).

Obrázek 19 představuje mapu pCIB4429. Symbol P označuje pylový promotor.

Obrázek 20 znázorňuje mapu pCIB4431. Symbol P označuje pylový promotor.

Obrázek 21 představuje mapu pCIB4428. Symbol P označuje pylový promotor.

Obrázek 22 znázorňuje mapu pCIB4430. Symbol P označuje pylový promotor.

Na obrázku 23A je tabulka obsahující údaje o množství proteinu crylA(b) v transgenické kukuřici. Množství Bt bylo stanoveno pomocí ELISA-testu u polních rostlin. Množství Bt je uvedeno v ng crylA(b) na mg celkového proteinu. Údaje byly získány u potomstva popsaných transformovaných rostlin kukuřice exprimujících protein crylA(b). ELISA-test transgenického rostlinného materiálu byl prováděn za použití standardních postupů uvedených na libovolném místě. Symbol I x P označuje křížení inbrední linie x rodič, symbol ABRU č. označuje číslo rostliny a symbol m označuje množství Bt v ng na mg celkového proteinu.

Na obrázku 23 B je uvedena tabulka, která shrnuje výsledky biologických testů Ostrinia nubilalis a Diatraea saccharalis na listovém materiálu z potomstva kukuřice obsahující gen CrylA(b) optimalizovaný pro kukuřici.

Obrázek 23C představuje tabulku, která obsahuje údaje o množství proteinu ciylA(b) v transgenické kukuřici. Jedná se o rostliny pěstované ve skleníku. Množství Bt je uvedeno v ng crylA(b) na mg celkového proteinu. Údaje byly získány u potomstva uvedených transformovaných rostlin kukuřice exprimujících protein crylA(b). ELISA-test transgenického rostlinného materiálu byl prováděn za použití standardních postupů uvedených na libovolném místě. Symbol NT znamená netestováno.

Na obrázku 23D je uvedena tabulka, která shrnuje výsledky biologických testů Ostrinia nubilalis na listovém materiálu z potomstva kukuřice obsahující syntetický gen Bt pro kukuřici operabilně spojený s dřeňovým promotorem.

-5CZ 292953 B6

Na obrázku 23E je uvedena tabulka, která obsahuje údaje o expresi genu crylA(b) v transgenické kukuřici za použití dřeňové preferovaného promotoru. U listových vzorků malých klíčních rostlinek transformovaných za použití postupů popsaných na libovolném místě pCIB4433 byla analyzována přítomnost proteinu crylA(b) pomocí ELISA-testu. Všechny rostliny exprimující crylA(b) byly v standardním biologickém testu s Ostrinia nubilalis označeny za insekticidní. Je třeba vzít v úvahu, že dřeňově preferovaný promotor vykazuje nízkou, avšak detekovatelnou úroveň exprese v listové tkáni kukuřice. Detekce proteinu CrylA(b) je v souladu s tímto typem exprese. Symbol č znamená rostlina číslo, symbol M znamená množství crylA(b) v ng na mg celkového proteinu.

Obrázek 24 představuje úplnou sekvenci genomové DNA genu alfa podjednotky tryptofan-synthasy (genu podjednotky TrpA) kukuřice. Znázorněny jsou introny, exony, místa počátku transkripce a translace a počátek a konec cDNA. Symbol $ označuje počátek a konec cDNA, +1 je počátek transkripce, 73******* označuje primer pro metodu zkoumající prodlouženi primeru „primer extension“, symbol □ označuje počátek translace, +++ označuje terminační kodon, v poloze bp 1495 - 1499 je podtržen CCAAT box, v poloze bp 1593 - 1598 je podtržen TATAA box a v poloze bp 3720- 3725 polyadenylační signál; čísla nad ostatními podtrženými sekvencemi označují primery pro polymerázovou řetězovou reakci.

Obrázky 25A, 25B, 25C a 25D představují výsledky analýzy pomocí Northem blottingu, které ukazují diferencovanou expresi kukuřičného genu podjednotky TrpA vtkáni kukuřice po expozici 2 hodiny (obr. 25A), 4 hodiny (obr. 25B), 18 hodin (obr. 25C), respektive 48 hodin (obr. 25D), při -80 °C při zesilování obrazu pomocí DuPont Cronex intensifying screens. Jednotlivé obecné symboly mají následující význam: P = dřeň, C = palice, BR = opěrné kořeny, ES = vřeteno, LP = dřeň spodní části, MP = dřeň střední části, UP = dřeň vrchní části, S = semeno, L = list, R = kořen a P (nahoře vlevo) = dřeň celkem.

Obrázek 26 představuje výsledek analýzy pomocí Northem blottingu, na kterém dvě levé dráhy znázorňují expresi kukuřičného genu podjednotky TrpA v listech (označeno L) a dřeni (označeno P) inbredních linií Funk 21 ID a 5N984. Pět pravých drah svědčí o nepřítomnosti exprese v celkové RNA semen Funk 21 ID. Symbol S(l, 2, 3, 4 a 5) znamená semena 1, 2, 3, 4 a 5 týdnů po opylení. Film byl exponován po dobu 65 hodin při -80 °C při zesilování obrazu pomocí DuPont Cronex intensifying screens.

Obrázek 27 znázorňuje výsledek pomocí Southem blottingu prováděné analýzy genomové DNA linie Funk 21 ID, kdy jako sondy bylo použito cDNA 8-2 kukuřičné TrpA (pCIB5600).

Symbol B znamená BamHI, symbol E EcoRI, symbol EV EcoRV, symbol H HindlII a symbol S Sací. Symboly IX, 5X a 10X označují ekvivalenty kopií rekonstruovaného genu. Film byl exponován po dobu 120 hodin při -80 °C při zesilování obrazu pomocí DuPont Cronex intensifying screens.

Obrázek 28A představuje výsledky analýzy pomocí „primer extension“, a znázorňuje počátek transkripce kukuřičného genu podjednotky TrpA a jednotlivé dráhy po sekvenování („sekvenační žebřík“). Dráhy 1 a 2 představují IX a 0,5X vzorky po reakci „primer extension“. Film byl exponován po dobu 1 hodiny při -80 °C při zesilování obrazu pomocí DuPont Cronex intensifying screens.

Obrázek 28B znázorňuje analýzu oblasti od +2 bp do +387 bp za použití metody chránění proti účinkům RNasy („RNase protection“) při teplotách teplotní hybridizace 42 °C, 48 °C a 54 °C. Film byl exponován po dobu 16 hodin při -80 °C při zesilování obrazu pomocí DuPont Cronex intensifying screens.

-6CZ 292953 B6

Obrázek 29 představuje mapu původního pylové specifického cDNA-klonu typ II. Je zde znázorněno subklonování tří EcoRI-fragmentů do vektorů pBluescript, kterým se vytvoří pCIB3168, pCIB3169 a II-.6.

Obrázek 30 znázorňuje sekvenci DNA cDNA kukuřičného genu pylově specifické kalcium-dependentní protein-kinázy, jak je obsažena ve fragmentech původního cDNA-klonu typ II o velikosti 1,0 kb a 0,5 kb (v klonech pCIB3168 a pCIB3169). Je označeno místo EcoRI, které rozděluje fragmenty o velikosti 1,0 kb a 0,5 kb. Tato cDNA nemá plnou délku, jelikož se počáteční místo mRNA nachází 490 bp upstream od konce cDNA-klonu.

Obrázek 31 ilustruje tkáňově specifickou expresi mRNA pylově specifické kalciumdependentní protein-kinázy. U RNA z uvedených tkání kukuřice 21 ID byla provedena denaturace, elektroforéza na agarózovém gelu, přenos na nitrocelulózu, a jako sondy bylo použito cDNA-fragmentu pylově specifické kalcium-dependentní protein-kinázy o velikosti 0,5 kb. mRNA je detekovatelná pouze v pylu, kde je vidět silný signál. Jednotlivé symboly mají tento význam: VLP = vnitřní část listové pochvy, VL = vnitřní část listového přeslenu, ZL = zelený list, A = prašník, P = pyl, V = vlákno, Z = zrno, D = dřeň a K = kořen.

Obrázek 32 představuje porovnání sekvence aminokyselin proteinové sekvence odvozené pro pylově specifickou kalcium-dependentní protein-kinázu (označeno pol CDPK ptn) a proteinové sekvence protein-kinázy 2 krysy, kterou popsali Tobimatsu a kol., J. Biol. Chem. 263: 16082- 16086 (1988) (označeno rat pk2 ptn). Pro vyhodnocení sekvencí byl použit Align program ze softwarového souboru DNAstar. Homologie s protein-kinázou je zjevná ve dvou třetinách od 5'-konce genu, tj. ve fragmentu o velikosti 1,0 kb. Jedná se o porovnání proteinů Lipman-Pearson, významnost mezery (gap penalty) = 2, významnost délky mezery (gap length penalty) = 12. Sekvencí 1 je pol CDPK ptn (1>551), sekvencí 2 je rat pk2 ptn (1>528), index podobnosti činí 36,5, počet mezer 4, délka mezer 4, konsensuální délka 297.

Obrázek 33 představuje porovnání sekvence aminokyselin proteinové sekvence odvozené pro pylově specifickou kalcium-dependentní protein-kinázu (označeno pol CDPK ptn) a proteinové sekvence kalmodulinu člověka, kterou popsali Fischer a kol., J. Biol. Chem. 263: 17055 - 17062 (1988) (označeno humcama ptn). Homologie s kalmodulinem je zjevná v jedné třetině od 3'-konce genu, tj. ve fragmentu o velikosti 0,5 kb. Jedná se o porovnání proteinů Lipman-Pearson, gap penalty - 2, gap length penalty = 12. Sekvencí 1 je pol CDPK ptn (1>551), sekvencí 2 je humcama ptn (1>150), index podobnosti činí 40,3, počet mezer 2, délka mezer 2, konsensuální délka 142.

Obrázek 34 představuje porovnání sekvence aminokyselin proteinové sekvence odvozené pro pylově specifickou kalcium-dependentní protein-kinázu (označeno pol CDPK ptn) a proteinové sekvence kalcium-dependentní protein-kinázy sóji (označeno soybean CDPK ptn). Homologie je zjevná v celém genu. Jedná se o porovnání proteinů Lipman-Pearson, gap penalty = 2, gap length penalty = 12. Sekvencí 1 je pol CDPK ptn (1>551), sekvencí 2 e soybean CDPK ptn (l>509), index podobnosti činí 62,4, počet mezer 1, délka mezer 1, konsensuální délka 464.

Obrázek 35 znázorňuje sekvenci kukuřičného genu pylově specifické kalcium-dependentní protein-kinázy. Je znázorněno 1,4 kb sekvence před počátečním místem mRNA. Pod odpovídající sekvencí DNA jsou označeny polohy sedmi exonů a šesti intronů. Uvedeno je místo polyadenylace v cDNA-klonu. Symbol mRNA start označuje místo počátku mRNA. Uvedena je sekvence a místa mapy genu pylově specifické kalcium-dependentní protein-kinázy (I>4165) (enzymy: 6 ze 198 enzymů (filtrováno), úprava: cirkulámí, pouze některá místa, standardní genetický kód).

Obrázek 36 představuje mapu pCIB4433. Symbol P znamená dřeňový promotor.

-7CZ 292953 B6

Obrázek 37 znázorňuje hybridní sekvenci DNA optimalizovanou pro kukuřici o plné délce, kódující tepelně stabilní protein crylA(b) (označení: pCIB5515, cirkulámí DNA 7415 bp, popis:

pGFl + syntetický geiser fix).

Obrázek 38 představuje mapu pCIB5515.

Popis sekvencí

Sekvence 1 představuje sekvenci DNA nativního genu Bt crylA(b) o plné délce.

Sekvence 2 znázorňuje sekvenci DNA syntetického genu Bt crylA(b) zcela optimalizovaného pro kukuřici o plné délce.

Sekvence 3 představuje sekvenci DNA zkráceného syntetického genu Bt crylA(b) optimalizovaného pro kukuřici o velikosti přibližně 2 kb.

Sekvence 4 znázorňuje sekvenci DNA syntetického genu Bt crylA(b) optimalizovaného pro kukuřici o plné délce.

Sekvence 5 představuje sekvenci DNA syntetického genu Bt, který popsali Perlak a kol., o velikosti přibližně 2 kb.

Podrobný popis vynálezu

Z důvodů jasného vymezení termínů používaných v popisu a nárocích vynálezu jsou uvedeny následující definice.

Kukuřicí preferovaný kodon: Termín preferovaný kodon se týká preferencí vykazovaných specifickou hostitelskou buňkou při použití nukleotidových kodonů specifikujících danou aminokyselinu. Preferovaným kodonem pro aminokyselinu v případě konkrétního hostitele je jediný kodon, který v tomto hostiteli nejčastěji kóduje tuto aminokyselinu. Kukuřicí preferovaný kodon pro konkrétní aminokyselinu lze odvodit ze známých genových sekvencí z kukuřice. Například použití kodonů u kukuřice u 28 genů z rostlin kukuřice uvedli Murray a kol. v tabulce 4 práce zveřejněné v Nucleic Acids Research, 17: 477 - 498 (1989). Například kukuřicí preferovaný kodon pro alanin je GCC, jelikož na základě spojení sekvencí 26 genů kukuřice, jak uvádějí Murray a kol., viz výše, tento kodon kóduje alanin v 36 % případů, ve srovnání s kodonem GCG (24 %), GCA (13 %) a GCT (27 %).

Sekvence zcela optimalizovaná pro kukuřici: Optimalizovaný gen nebo sekvence DNA označuje gen, ve kterém byla nukleotidové sekvence nativního genu modifikována tak, aby byly využívány kodony preferované kukuřicí. Například, syntetickým genem Bt crylA(b) optimalizovaným pro kukuřici je gen, ve kterém byla nukleotidové sekvence nativního genu Bt crylA(b) modifikována tak, že používanými kodony jsou kukuřicí preferované kodony, jak je popsáno výše. Genem zcela optimalizovaným pro kukuřici je gen, ve kterém nukleotidové sekvence obsahuje 100 % kukuřicí preferovaných kodonových sekvencí pro konkrétní polypeptid. Například genem Bt crylA(b) zcela optimalizovaným pro kukuřici je gen, ve kterém nukleotidová sekvence obsahuje 100 % kukuřicí preferovaných kodonových sekvencí a kóduje polypeptid se stejnou sekvencí aminokyselin jako má polypeptid produkovaný nativním genem Bt crylA(b). Nukleotidová sekvence optimalizovaného genu může být změněna tak, aby umožňovala manipulaci s genem, přičemž mezi tyto úpravy patří například změna nukleotidů kvůli vytvoření nebo odstranění restrikčních míst. Nukleotidová sekvence optimalizovaného genu může být též změněna tak, aby byla odstraněna potenciální škodlivá místa úprav, jako jsou potenciální místa polyadenylace nebo místa rozpoznání intronů.

-8CZ 292953 B6

Je zřejmé, že mohou být využity též sekvence „částečně optimalizované pro kukuřici“. Termín částečně optimalizované pro kukuřici znamená, že kódující oblast genu je chimérická (hybridní), protože sestává ze sekvencí získaných z nativního insekticidního genu a sekvencí, které byly optimalizovány pro expresi v kukuřici. Částečně optimalizovaný gen exprimuje insekticidní protein v množství dostatečném pro kontrolu hmyzích škůdců, a tato exprese je na vyšší úrovni než exprese dosažená za použití pouze nativních sekvencí. Mezi sekvence částečně optimalizované pro kukuřici patří sekvence, které obsahující alespoň asi 5 % optimalizovaných sekvencí.

Termín „geny Bt o plné délce“ označuje sekvence DNA obsahující úplnou nukleotidovou sekvenci nutnou pro kódování polypeptidů produkovaného nativním genem Bt. Například nativní gen Bt crylA(b) je dlouhý přibližně 3,5 kb a kóduje polypeptidů o délce přibližně 1150 aminokyselin. Syntetický gen Bt crylA(b) o plné délce má délku alespoň přibližně 3,5 kb.

Termín „zkrácené geny Bt“ označuje sekvence DNA, které obsahují méně než úplnou nukleotidovou sekvenci nutnou pro kódování polypeptidů produkovaného nativním genem Bt, ale které kódují část polypeptidů aktivní jako toxin. Například zkrácený syntetický gen Bt o velikosti přibližně 1,9 kb kóduje takovou část polypeptidů aktivní jako toxin, že proteinový produkt vykazuje insekticidní aktivitu.

Termín „tkáňově preferovaný promotor“ znamená, že daná regulační sekvence DNA způsobuje vyšší úroveň transkripce připojeného strukturního genu nebo kódující sekvence DNA, nebo exprese produktu připojeného genu, jak se stanoví libovolným běžným RNA-testem nebo proteinovým testem, nebo že daná sekvence DNA vykazuje některé odlišné účinky;, tj., že je transkripce připojených sekvencí DNA nebo exprese genového produktu vyšší v některé tkáni než ve všech ostatních tkáních rostliny.

Termín „tkáňově specifický promotor“ znamená, že daná regulační sekvence DNA způsobuje transkripci připojené kódující sekvence DNA v podstatě pouze v jedné nebo několika tkáních v rostlině, nebo v jednom typu tkáně, například zelené tkáni, zatímco ve všech ostatních tkáních nebo typech tkání rostliny nedochází v podstatě k žádné transkripci připojené kódující sekvence DNA.

Vynález popisuje sekvence DNA optimalizované pro expresi v rostlinách, zejména v rostlinách kukuřice. Podle výhodného provedení vynálezu kódují sekvence DNA jako produkt insekticidní toxin, výhodně polypeptid mající v podstatě sekvenci aminokyselin jako insekticidní krystalický proteinový toxin normálně produkovaný Bacillus thuringiensis. Syntetický gen může kódovat zkrácený insekticidní protein nebo insekticidní protein o plné délce. Zejména výhodné jsou syntetické sekvence DNA kódující polypeptid účinný proti hmyzu řádu Lepidoptera aColeoptera, a syntetické sekvence DNA kódující polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci v podstatě stejnou jako jeden z krystalických proteinových toxinů Bacillus thuringiensis varieta kurstaki, HD-1.

Vynález popisuje syntetické sekvence DNA umožňující dosažení vysoké exprese aktivních insekticidních proteinů v rostlinách, zejména v protoplastech, rostlinných buňkách a rostlinách kukuřice. Syntetické sekvence DNA podle vynálezu byly modifikovány tak, aby se podobaly, pokud se týká použití kodonů a obsahu G + C, genům kukuřice. V důsledku těchto modifikace neobsahují syntetické sekvence DNA podle vynálezu potenciální místa úprav, která jsou přítomna v nativním genu. Výsledné syntetické sekvence DNA (syntetické kódující sekvence insekticidního proteinu Bt) a vektory pro transformaci rostlin obsahující tyto syntetické sekvence DNA (syntetické geny insekticidního proteinu Bt) mají za následek ve srovnání s nativním genem insekticidního proteinu Bt překvapivě zvýšenou expresi syntetického genu insekticidního proteinu Bt, pokud se týká produkce insekticidního proteinu v rostlinách, zejména kukuřici.

-9CZ 292953 B6

Vysoká úroveň exprese způsobuje, že buňky a rostliny kukuřice vykazují rezistenci vůči hmyzu z řádu motýlů, zejména vůči Ostrinia nubilalis a Diatraea saccharalis.

Syntetické sekvence DNA podle vynálezu jsou vytvořeny tak, že kódují insekticidní proteiny z Bacillus thuringiensis, ale jsou optimalizovány pro expresi v kukuřici, pokud se týká obsahu G + C a použití kodonů. Například tabulka použití kodonů u kukuřice, kterou popsali Murray a kol., viz výše, se použije k reverzní translaci sekvence aminokyseliny toxinu produkovaného genem Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki HD-1 crylA(b), za použití pouze kodonů nejvíce preferovaných kukuřicí. Sekvence DNA vzniklá reverzní translací se označuje jako sekvence zcela optimalizovaná pro kukuřici a je znázorněna jako sekvence 4. Tato sekvence se následně modifikuje tak, aby se odstranila nežádoucí rozpoznávací místa pro restrikční endonukleázy a vytvořila požadovaná rozpoznávací místa pro restrikční endonukleázy. Tyto modifikace se provádí tak, aby se usnadnilo klonování genu, aniž by se výrazně měnilo použití kodonů nebo sekvence optimalizovaná pro kukuřici. Během postupu klonování se v oblastech, které se jeví jako zejména citlivé k chybám vyvolaným během klonování pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR), vytvoří další modifikace, kvůli usnadnění klonování genu. Výsledná sekvence syntetického genu insekticidního proteinu Bt optimalizovaného pro kukuřici je znázorněna jako sekvence 2. Porovnání syntetického genu insekticidního proteinu Bt optimalizovaného pro kukuřici s nativním genem Bt kurstaki crylA(b) je uvedeno na obrázku 1.

Podle výhodného provedení vynálezu je protein produkovaný pomocí syntetické sekvence DNA účinný proti hmyzu z řádu Lepidoptera nebo Coleoptera. Podle ještě výhodnějšího provedení je tvořen polypeptid kódovaný syntetickou sekvencí DNA v podstatě zkrácenou sekvencí aminokyselin nebo sekvencí aminokyselin o plné délce insekticidního proteinu normálně produkovaného Bacillus thuringiensis var. kurstaki HD-1. Podle zejména výhodného provedení kóduje syntetická sekvence DNA polypeptid sestávající v podstatě ze zkrácené sekvence aminokyselin proteinu Bt CrylA(b).

Insekticidní proteiny podle vynálezu jsou v rostlině exprimovány v množství dostatečném pro kontrolu hmyzích škůdců, tj. v množstvích kontrolujících hmyz. Je zřejmé, že se exprimované množství insekticidního proteinu v rostlině nutné pro kontrolu hmyzu může lišit v závislosti na druhu rostliny, typu hmyzu, faktorech prostředí a podobně. Obecně bude populace hmyzu udržována pod prahem ekonomické škodlivosti, který se liší v závislosti na rostlině. Například pro kontrolu Ostrinia nubilalis u kukuřice činí práh ekonomické škodlivosti 0,5 vaječné hmoty na rostlinu, ze které vznikne přibližně 10 larev na rostlinu.

Způsoby podle vynálezu jsou vhodné pro kontrolu široké řady hmyzu, včetně, ale nikoliv výlučně, hmyzu vybraného ze skupiny zahrnující travaříky, osenice, různé druhy rodu Spodoptera, zejména Spodoptera frugiperda a Spodoptera exigua, drátovce (larvy kovaříků), mšice, zavíječe, zejména zavíječe kukuřičného Ostrinia nubilalis. Diatraea saccharalis, Elasmopalpus lignosellus, Zeadiatraca grandiosella, atd.

Podle výhodného provedení vynálezu obsahuje syntetická kódující sekvence DNA optimalizovaná pro expresi v kukuřici vyšší procento G + C než nativní gen crylA(b). Je výhodné, pokud činí procento G + C alespoň asi 50 %, a ještě výhodnější pokud činí alespoň asi 60 %. Zejména je výhodné, pokud činí obsah G + C přibližně 64 %.

Podle dalšího výhodného provedení vynálezu obsahuje syntetická kódující sekvence DNA optimalizovaná pro expresi v kukuřici nukleotidovou sekvenci, která je alespoň z přibližně 90 % homologická s nukleotidovou sekvencí zcela optimalizovanou pro kukuřici nativního proteinu Bacillus thuringiensis crylA(b), ještě výhodněji je alespoň z přibližně 95% homologická a nej výhodněji alespoň z přibližně 98 % homologická.

Mezi další výhodná provedení vynálezu patří syntetické sekvence DNA, které mají v podstatě sekvenci DNA uvedenou v Sekvenci 4, stejně jako jejich mutanty nebo variace; transformační

-10CZ 292953 B6 vektory obsahující sekvenci DNA v podstatě jako je sekvence 4; a izolované sekvence DNA získané z plazmidu pCIB4406, pCIB4407, pCIB4413, pClB4414, pCIB4416, pCIB4417, pCIB4418, pCIB4419, pCIB4420, pCIB4421, pCIB4421, pCIB4423, _PC1B4434, _PC1B4429, pCIB44312, pCIB4433. Nejvýhodnější jsou izolované sekvence DNA získané zplazmidů pCIB4418 a pCIB4420, pCIB4434, pCIB4429, pCIB4431, a pCIB4433.

Za účelem zkonstruování jedné ze sekvencí DNA optimalizovaných pro kukuřici podle vynálezu se vytvoří syntetické DNA-oligonukleotidy o průměrné délce přibližně 80 nukleotidů. Tyto nukleotidy se zkonstruují tak, aby hybridizovaly s fragmenty produktu obsahujícími různé čtvrtiny zkráceného genu toxinu. Oligonukleotidy pro danou čtvrtinu se nechají hybridizovat a amplifikují se za použití polymerázové řetězové reakce. Čtvrtiny se poté klonují a nakloňované čtvrtiny se sekvenují, aby byly nalezeny ty, které obsahují požadované sekvence. V případě čtvrté čtvrtiny se hybridizované oligonukleotidy klonují přímo bez amplifikace pomocí polymerázové řetězové reakce. Jakmile jsou nalezeny všechny klony čtyř čtvrtin, které obsahují otevřené čtecí rámce, sestaví se intaktní gen kódující aktivní insekticidní protein. U sestaveného genu může být poté testována jeho insekticidní aktivita vůči libovolnému zajímavému hmyzu včetně Ostrinia nubilalis a Diatraea saccharalis (příklady 5A, respektive 5B). Pokud se získá úplně funkční gen, je znovu sekvenován, aby se potvrdila jeho primární struktura. Bylo zjištěno, že plně funkční gen způsobuje pří biologickém testu s Ostrinia nubilalis 100% mortalitu. Plně funkční gen se též modifikuje pro expresi v kukuřici.

Gen optimalizovaný pro kukuřici se testuje pomocí testu dočasné exprese, například testu dočasné exprese v kukuřici. Nativní kódující sekvence Bt crylA(b) pro aktivní insekticidní toxin není při použití systému dočasné exprese v kukuřici exprimována v detekovatelném množství. Může být tedy stanovena úroveň exprese syntetizovaného genu. Uvedenými způsoby může být exprese proteinu v transformované rostlině zvýšena alespoň zhruba stonásobně až přibližně 50 000-násobně, přesněji alespoň zhruba 1000-násobně až alespoň zhruba 20 000-násobně.

Pro zvýšení exprese insekticidního genu na účinnou úroveň není nutná manipulace s celou sekvencí nativního genu. Účinné exprese lze dosáhnout pomocí manipulace pouze s částí sekvencí nutnou pro dosažení zvýšené exprese. Lze připravit gen CrylA(b) optimalizovaný pro kukuřici o plné délce, který obsahuje protein nativní sekvence CrylA(b). Například na obrázku 7 je znázorněn gen CrylA(b) optimalizovaný pro kukuřici o plné délce, který je hybridem sestávajícím ze syntetické a nativní části. Část genu o velikosti přibližně 2 kb (nukleotidy 1 - 1938) je optimalizována pro kukuřici, tj. syntetická, a zbytek, tj. C-koncové nukleotidy 647- 1155, je identický s odpovídající sekvencí nativního genu CrylA(b). Konstrukce uvedeného genu je popsána v příkladu 6, viz níže.

Je třeba vzít v úvahu, že za použití zde popsaných postupů lze zkonstruovat a testovat expresi řady hybridů tvořených syntetickou a nativní částí. Důležitým hlediskem při konstrukci hybridu je snaha o to, aby byl protein produkován v dostatečné množství pro kontrolu hmyzích škůdců. Tímto způsobem mohou být identifikovány kritické oblasti genu, a následně mohou být tyto oblasti syntetizovány za použití preferovaných kodonů. Syntetické sekvence mohou být spojeny s nativními sekvencemi jak je popsáno níže v příkladech provedení vynálezu. Obecně mohou být pro dosažení rozšířené exprese v rostlinách syntetizovány a substituovány v nativní kódující sekvenci N-koncové části nebo místa úprav.

Podle jiného provedení vynálezu lze geny optimalizované pro kukuřici kódující protein ciylA(b) upravovat tak, aby byla u kódovaného proteinu zajištěna vyšší tepelná stabilita nebo teplotní stabilita ve srovnání s nativním proteinem crylA(b). Bylo uvedeno, že gen crylA(b) nacházející se v Bacillus thuringiensis kurstaki HD-1 obsahuje ve srovnání s proteiny ciylA(a) a crylA(c) deleci o velikosti 26 aminokyselin, v polovině bližší kC-konci proteinu. Tato delece má za následek, že je protein crylA(b) teplotně citlivý (viz M. Geiser, EP 0 440 581, s názvem „Temperaturstabiles Bacillus thuringiensis-Toxin“). Oprava této delece pomocí odpovídající oblasti z proteinu crylA(a) nebo crylA(c) zlepšuje teplotní stabilitu opraveného proteinu.

-11 CZ 292953 B6

Konstrukty modifikovaného syntetického genu crylA(b) o plné délce se vytvoří tak, aby se vložila sekvence kódující chybějící aminokyseliny na příslušné místo v sekvenci, aniž by se posunul čtecí rámec a aniž by se směnil zbytek proteinové sekvence. Syntetická verze genu o plné délce se sestaví pomocí syntézy řady dvouřetězcových DNA-kazet, z nichž každá má velikosti přibližně 300 bp, za použití standardních technik syntézy DNA a enzymatických reakcí. O opraveném genu se uvádí, že kóduje „tepelně stabilní“ nebo „teplotně stabilní“ protein crylA(b), jelikož si tento protein při vystavení vysokým teplotám udržuje vyšší biologickou aktivitu než jeho nativní protějšek. Specifické sekvence tepelně stabilních genů crylA(b) optimalizovaných pro kukuřici, které kódují teplotně stabilní proteiny, jsou znázorněny na obrázku 9, 11, 13 a 15, a jsou též popsány níže v příkladu 7.

Vynález zahrnuje kódující sekvence optimalizované pro kukuřici, které kódují jiné polypeptidy, včetně jiných insekticidních proteinů z jiných zdrojů. Například lze optimalizovat pro kukuřici, a poté stabilně introdukovat do rostlin, zejména rostlin kukuřice, geny crylB. Sekvence genu crylB optimalizovaného pro kukuřici, zkonstruovaného v souladu s vynálezem, je znázorněna na obrázku 6.

Optimalizace genu insekticidního proteinu Bt pro expresi v kukuřici za využití kukuřicí preferovaného užití kodonů podle vynálezu má za následek podstatné zvýšení exprese insekticidního genu. Předpokládá se, že za využití znalosti preferování kodonů rostlinami lze syntetizovat jiné geny pro zlepšení jejich exprese v kukuřici nebo jiných rostlinách. Využití znalosti preferování kodonů kukuřicí je vhodný postup pro optimalizaci a maximalizaci exprese cizích genů v kukuřici. Mezi takovéto geny patří geny používané jako selektabilní markéry nebo vyhodnocovací markéry (scoreable markers) při transformaci kukuřice, geny, které poskytují rezistenci vůči herbicidům, geny, které poskytují rezistenci vůči chorobám, a další geny poskytující rezistenci vůči hmyzu.

Syntetický gen crylA(b) též lze vložit do vektorů na bázi Agrobacteria, které jsou použitelné pro transformaci rozsáhlé řady druhů dvouděložných rostlin (viz příklad 44). Rostliny stabilně transformované vektory na bázi Agrobacteria obsahujícími syntetický crylA(b) vykazují insekticidní aktivitu.

Nativní gen Bt crylA(b) je dosti bohatý na obsah A + T. Obsah G + C v nativním genu Bt crylA(b) o plné délce činí přibližně 39 %. Obsah G + C ve zkráceném nativním genu Bt crylA(b) dlouhém zhruba 2 kb činí přibližně 37 %. Obecně platí, že kódující oblasti kukuřice bývají převážně bohaté na obsah G + C. Výsledkem modifikací provedených u genu Bt crylA(b) je syntetická kódující oblast insekticidního proteinu, která má vyšší obsah G + C než 50 %, a je, pokud jde o DNA, přibližně z 65 % homologická s nativním genem crylA(b). Protein kódovaný tímto syntetickým genem CrylA(b) je 100% homologický s nativním proteinem, a uchovává si tedy z hlediska insekticidní aktivity plně svoji funkci. Zkrácený syntetický gen insekticidního proteinu CrylA(b) je dlouhý přibližně 2 kb a kóduje aktivní toxinovou oblast nativního insekticidního proteinu Bt kurstaki CrylA(b). Protein kódovaný zkráceným syntetickým genem CrylA(b) obsahuje 648 aminokyselin.

Syntetické geny podle vynálezu jsou využitelné pro zvýšenou expresi v transgenických rostlinách, nejvýhodněji v transformované kukuřici. Transgenické rostliny podle vynálezu mohou být použity pro expresi insekticidního proteinu CrylA(b) ve velkém množství, která má za následek rezistenci vůči hmyzím škůdcům, výhodně vůči hmyzu z řádu brouků nebo motýlů, a nej výhodněji vůči Ostrinia nubilalis a Diatraea saccharalis.

Podle vynálezu může být kódující sekvence DNA syntetického genu optimalizovaného pro kukuřici pod kontrolou regulačních elementů, jako jsou promotory, které řídí expresi kódující sekvence. Mezi takovéto regulační elementy patří například funkční promotory jednoděložných nebo kukuřice a jiných jednoděložných rostlin, zajišťující expresi genu v různých částech rostliny kukuřice. Tento regulační element může být konstitutivní, tj. takový, který vyvolává nepřetržitou

- 12CZ 292953 B6 a stabilní expresi genu. Mezi takovéto promotory patří například, nikoliv však výlučně, promotor CaMV 35S, promotor CaMV 19S, promotory Agrobacterium tumefaciens, jako jsou promotory octopin-syntázy, promotory mannopin-syntázy, promotory nopalin-syntázy, nebo promotory jiných opin-syntáz, promotory ubiquitinu, promotory actinu, promotory histonu a promotory tubulinu. Regulačním elementem může být tkáňově preferovaný promotor, tj. takový, který způsobuje vyšší expresi v některých tkáních rostliny než v jiných tkáních. Výhodně mohou tkáňově preferované promotory řídit vyšší expresi syntetického genu v listech, stoncích, kořenech nebo/a pylu než v semenech. Regulační element může být též indukovatelný, například vystavením tepelnému stresu či vodnímu stresu, požerem hmyzem nebo chemickou indukcí, nebo mohou být vývojově regulované. V oboru je známa řada promotorů, o jejichž expresi bylo zjištěno, že se mění tkáňově specifickým způsobem. Jedním z příkladů je fosfoenolpyruvátkarboxyláza (PEPC) kukuřice, která je specifická pro zelenou tkáň, viz například Hudspeth, R. L. a Grula J. W., Plant Molecular Biology 12: 579 - 589, 1989. Mezi další promotory specifické pro zelenou tkáň patří promotory proteinu vázajícího chlorofyl a/b a promotory malé podjednotky RubisCO.

Vynález též popisuje izolované a purifikované dřeňové preferované promotory. Výhodné dřeňové preferované promotory jsou izolované ztrávovitých jednoděložných rostlin, jako je cukrová třtina, rýže, pšenice, čirok, ječmen, žito a kukuřice, nejvýhodnější jsou dřeňové preferované promotory izolované z rostlin kukuřice.

Podle výhodného provedení je dřeňově preferovaný promotor izolován s rostlinného genu TrpA, podle nejvýhodnějšího provedení je izolován z genu TrpA kukuřice, tj. je to promotor, který je v nativním stavu operativně připojen k genu alfa podjednotky tryptofan-syntázy kukuřice (dále je označována „TrpA“). Kódovaný protein má molekulovou hmotnost přibližně 38 kD. Společně s další alfa podjednotkou a dvěma beta podjednotkami tvoří TrpA multimemí enzym tryptofan-syntázu. Každá zpodjednotek může působit odděleně, ale společně pracují mnohem účinněji. TrpA katalyzuje přeměnu indol-glycerol-fosfátu na indol. Dosud nebyl ani gen TrpA kukuřice ani kódovaný protein izolován z žádné rostliny. Gen beta podjednotky tryptofansyntázy Arabidopsis thaliana byl klonován jak popsali Wright a kol., The Plant Cell, 4: 711 - 719 (1992). Připravený gen TrpA kukuřice není homologický s genem kódujícím beta podjednotku.

Vynález též popisuje purifikované pylově specifické promotory, které lze získat z rostlinného genu kalcium-dependentní fosfát-kinázy (CDPK), tj. takové promotory, které jsou v nativním stavu operabilně spojeny s rostlinným genem CDPK. Podle výhodného provedení je promotor izolován z genu CDPK kukuřice. Termín „pylově specifický“ označuje stav, kdy k expresi operativně připojeného zajímavého strukturního genu dochází v podstatě výhradně (tj. v podstatě pouze) v pylu rostliny, a ve všech ostatních částech rostliny je exprese zanedbatelná. Termín „CDPK“ označuje rostlinný protein kinázu, který má vysokou afinitu vůči vápníku, ale nikoli vůči kalmodulinu, a vyžaduje pro svoji katalytickou aktivitu vápník, ale ne kaimodulin.

K získání tkáňově preferovaných nebo tkáňově specifických promotorů lze izolovat geny kódující tkáňově specifickou mediátorovou RNA (mRNA) pomocí odečítacího screeningu (differential screening) cDNA-knihovny. Například dřeňově preferovanou cDNA lze získat podrobením cDNA-knihovny dřeně odečítacímu screeningu za použití cDNA-sond získaných z mRNAs dřeně a semen, viz Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Sambrook a kol. eds. Cold Spring Harbor Press: New York (1989).

Alternativně lze tkáňově specifické promotory získat pomocí izolace tkáňově specifických proteinů, sekvenování jejich N-konce, syntézy oligonukleotidových sond a použití těchto sond ke screeningu cDNA-knihovny. Příklad takovýchto postupů popisující izolaci pylově specifického promotoru je uveden v experimentální části.

Do rozsahu vynálezu, pokud se týká dřeňově preferovaných pylově specifických promotorů, patří i funkčně aktivní fragmenty promotoru o plné délce, které jsou též schopné řídit dřeňově

-13CZ 292953 B6 preferovanou respektive pylově specifickou transkripci připojených strukturních genů. Funkčně aktivní fragmenty promotorové sekvence DNA lze získat z promotorové sekvence DNA pomocí různých v oboru známých postupů, jako je například pomocí štěpení promotorové sekvence DNA restrikčními enzymy, syntézy podle sekvence promotorové sekvence DNA, nebo je lze získat za použití technologie polymerázové řetězové reakce (PCR), viz například Mullis a kol., Meth. Enzymol. 155: 335 - 350 (1987), Erlich (ed.), PCR Technology, Stockton Press (New York 1989).

Do rozsahu vynálezu dále spadají též dřeňové preferované a pylově specifické promotory „ekvivalentní“ promotorům o plné délce, tzn., že mohou být v souladu se známými postupy modifikovány, přidány nebo odstraněny různé nukleotidy nebo skupiny nukleotidů, způsobem, který neodstraní promotorovou aktivitu.

Dřeňové preferovaný promotor získaný z genu TrpA kukuřice je znázorněn na obrázku 24. Odborníkovi je při znalosti této sekvence zřejmé, že lze dřeňově preferované promotory spadající do rozsahu vynálezu získat z jiných rostlin za použití zkoumání dřeňových knihoven z těchto rostlin pomocí sond odvozených od strukturního genu TrpA kukuřice. Výhodné jsou sondy vytvořené ze sekvencí, které jsou vysoce konzervativní mezi geny podjednotky TrpA různých druhů, jak je obecně rozebráno v příkladu 17. Další pylově specifické promotory, které jsou v nativním stavu spojeny s geny CDPK jiných rostlin než kukuřice, lze izolovat podobným způsobem za použití sond odvozených od konzervačních oblastí genu CDPK kukuřice, jejichž pomocí se zkoumají pylové knihovny.

Dalším provedením vynálezu je dřeňově preferovaný nebo pylově specifický promotor operabilně spojený se sekvencí DNA, tj. strukturním genem, kódujícím zajímavý protein, k vytvoření rekombinantní molekuly DNA nebo chimérického genu. Výraz „operabilně spojený s“ má význam známý v oboru a lze ho zaměnit za výrazy „operativně připojený k“, „spojený s“ nebo „fúzován s“.

Strukturní gen může být, pokud se týká původu promotoru nebo/a cílové rostliny, která jím je transformována, homologní nebo heterologní. Bez ohledu na vzájemný původ bude připojená sekvence DNA exprimována v transformované rostlině v souladu s vlastnostmi exprese promotoru, se kterým je spojena. Výběr připojené sekvence DNA by tedy měl vyplývat z požadavku na expresi dané sekvence tímto způsobem. Mezi příklady heterologních sekvencí DNA patří ty sekvence, které kódují insekticidní proteiny, například proteiny nebo polypeptidy toxické nebo inhibičně působící na hmyz nebo jiné členovce parazitující na rostlinách, nebo na rostlinné patogeny, jako jsou houby, bakterie a háďátka. Tyto heterologní sekvence DNA kódují proteiny jako jsou magaininy, Zasloff, PNAS USA, 84; 5449 - 5453 (1987); cecropiny, Hultmark a kol., Eur. J. Biochem. 127: 207 - 217 (1982); attaciny, Hultmark a kol., EMBO J. 2: 571 - 576 (1983); melittin, gramicidin S, Katsu a kol., Biochem. Biophys. Acta, 939: 57- 63 (1988); proteiny sodíkového kanálu a syntetické fragmenty, Oiki a kol. PNAS USA 85: 2395 - 2397 (1988); alfa toxin ze Staphylococcus aureus, Tobkes a kol., biochem., 24: 1915 - 1920 (1985); apolipoproteiny a jejich fragmenty, Knott a kol., Science 230: 37 (1985); Nakagawa a kol., J. Am. Chem. Soc., 107: 7087 (1985); alamethicin a řada syntetických amfipathických peptidů, Kaiser a kol., Ann. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 16: 561 - 581 (1987); lectiny, Lis a kol., Ann. Rev. Biochem., 55: 35 - 68 (1986); inhibitory proteáz a amyláz; a insekticidní proteiny z Bacillus thuringiensis, zejména delta-endotoxiny z Bacillus thuringiensis; a z jiných bakterií nebo hub.

Podle výhodného provedení vynálezu je dřeňově preferovaný promotor získaný z genu podjednotky TrpA kukuřice nebo pylově specifický promotor získaný z genu CDPK kukuřice operabilně spojen s heterologní sekvencí DNA kódující insekticidní protein Bacillus thuringiensis („B.t.“). Tyto proteiny a odpovídající strukturní geny jsou v oboru dobře známé, viz Hofte a Whiteley, Microbial, Reviews 53: 242 - 255 (1989).

-14CZ 292953 B6

Ačkoli je třeba vzít v úvahu, že může být použit libovolný promotor schopný řídit expresi, může být výhodné použít spíše než nativní promotor zajímavého proteinu heterologní promotory. Tímto způsobem lze zkonstruovat chimérické nukleotidové sekvence, které mohou být určeny na základě transformované rostliny, stejně jako hmyzího škůdce. Například pro kontrolu hmyzích škůdců kukuřice může být operabilně spojen s proteinem Bt promotor jednoděložné rostliny nebo kukuřice. Promotor kukuřice může být vybrán ze skupiny zahrnující tkáňové preferované a tkáňově specifické promotory, jako jsou dřeňově preferované respektive pylově specifické promotory, popsané zde.

V některých případech může být výhodné transformovat rostlinnou buňku více než jedním chimérickým genem. Tak může být například jediná rostlina transformována dřeňově preferovaným promotorem operabilně spojeným s proteinem Bt, jakož i pylově specifickým promotorem operabilně spojeným s proteinem Bt. Transformované rostliny budou exprimovat proteiny Bt v dřeni a pylu rostliny a v menším rozsahu v kořenech, vnějších obalech a opěrných kořenech.

Z řady dalších důvodů, zejména kvůli zabránění vzniku potenciální rezistence hmyzu vůči rostlinou exprimovaným insekticidním proteinům, je výhodné, aby byl ve stejné rostlině exprimován více než jeden insekticidní protein. Dva rozdílné geny (jako jsou dva rozdílné delta-endotoxiny získané z Bacillus thuringiensis, které se ve středním střevu cílového hmyzu vážou na rozdílné receptory) mohou být exprimovány ve stejných tkáních, nebo mohou být dva toxiny selektivně exprimovány v rozdílných tkáních stejné rostliny za použití tkáňově specifických promotorů. Exprese dvou genů Bt (nebo libovolných dvou insekticidních genů) ve stejné rostlině za použití tří rozdílných tkáňově specifických promotorů představuje problém z hlediska vytvoření rostliny exprimující požadovaný fenotyp. Při použití tří rozdílných promotorů řídících dva rozdílné geny je nutné do rostliny současně introdukovat šest rozdílných insekticidních genů. Pro transformaci je nutný též selektabilní markér pomáhající při identifikaci transformovaných rostlin. To znamená, že je do rostliny třeba introdukovat současně sedm rozdílných genů. Je nej lepší, aby byly všechny geny, zejména insekticidní geny, integrovány do rostlinného genomu na stejném lokusu, aby se chovaly jako jediný genový znak a nikoliv jako vícenásobný genový znak, který by bylo složitější sledovat během pěstování komerčních hybridů. Celkový počet genů může být snížen za použití diferencované tkáňově specifické exprese rozdílných insekticidních proteinů.

Například při fúzi crylA(b) s pylovými promotory a promotory fosfoenolpyruvát-karboxylázy, dosáhne se exprese tohoto genu v zelených tkáních a pylu. Při fúzi dřeňově preferovaného promotoru s delta-endotoxinem crylB z Bacillus thuringiensis se dosáhne exprese tohoto insekticidního proteinu v hojném množství v dřeni transformovaných rostlin, ale nikoli v tkáních semene. Transformací rostliny pomocí tří genů, promotor fosfoenolpyruvát-karboxylázy / crylA(b), pylový promotor / crylA(b), a dřeňový promotor / crylA(b), se získá rostlina exprimující dva rozdílné insekticidní endotoxiny v rozdílných tkáních stejné rostliny. CrylA(b) bude exprimován ve „vnějších“ tkáních rostliny (zejména kukuřice), tj. v tkáních, kterými se Ostrinia nubilalis živí nejprve po vylíhnutí. Pokud by u Ostrinia nubilalis vznikla rezistence vůči crylA(b) a hmyz by byl schopen zavrtat se po požeru zelené tkáně nebo/a pylu do stvolu rostliny, setkal by se s delta-endotoxinem crylB a byl by vystaven druhé insekticidní složce. Tímto způsobem lze dosáhnout diferencované exprese dvou rozdílných insekticidních složek ve stejné rostlině a snížit celkový počet genů, které je nutné zavádět jako jedinou genetickou jednotku, a přitom současně předcházet vzniku rezistence vůči jediné insekticidní složce.

Podobně může být rostlina transformována pomocí konstruktů kódujících více než jeden typ insekticidního proteinu pro kontrolu různých druhů hmyzu. Odborník tak může vytvořit řadu obměn.

Rekombinantní molekuly DNA podle vynálezu lze připravit pomocí manipulace s různými elementy tak, aby byly umístěny ve vhodné orientaci. Pro připojení k fragmentům DNA tak mohou být použity adaptery nebo íinkery. Další manipulace mohou být prováděny kvůli vytvoře

-15CZ 292953 B6 ní vhodných restrikčních míst a odstranění restrikčních míst nebo přebytečné DNA. Tyto manipulace lze provádět v oboru známými způsoby, viz Sambrook a kol., Molecular Cloning: ALaboratoiy Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, druhé vydání, 1989. Pro spojení a ligaci tak mohou být použity například postupy jako je restrikce, zpětné navázání nebo zaplnění přečnívajících konců pro vytvoření tupých konců, ligace linkerů a komplementárních konců DNA-fragmentů, viz Sambrook a kol., viz výše.

V závislosti na způsobu, kterým má být molekula začleněna do genomu cílové rostliny, může rekombinantní molekula DNA zahrnovat další funkční sekvence DNA. Například v případě transformace prostřednictvím Agrobacteria, pokud je k transformaci rostlinných buněk použit Ti- nebo Ri-plazmid, bude pravá a levá hranice T-DNA Ti- a Ri-plazmidu spojena jako lemovací oblast s expresní kazetou. Transformaci rostlin prostřednictvím Agrobacterium tumefaciens popsali Horsch a kol., Science, 225: 1229 (1985), Marton, Cell Culture Somatic Cell Genetics of Plants, 1: 514 - 521 (1984), Hoekema, v: The Binary Plant Vector Systém Offset-Drukkerij Kanters Β. V., Alblasserdam, 1985, kapitola V, Fraley a kol., Crit. Rev. Plant. Sci., 4: 1 -46, a An a kol., EMBO J., 4: 277 - 284 (1985).

Rekombinantní molekuly DNA podle vynálezu mohou též obsahovat markerový gen pro usnadnění selekce v rekombinantních rostlinných buňkách. Mezi příklady signálních znaků (markérů) patří rezistence vůči biocidům jako jsou antibiotika, například kanamycin, hygromycin, chloramfenikol, paramomycin, methotrexat a bleomycin, nebo herbicidům jako jsou imidazolony, sulfonylmočoviny, glyfosat, fosfinothricin nebo bialafos. Markerové geny jsou známé v oboru.

Dalším provedením vynálezu jsou rostliny stabilně transformované pomocí rekombinantní molekuly DNA nebo chimérického genu, jak jsou popsány výše. Výsledná transgenická rostlina obsahuje ve svém genomu stabilně začleněný transformovaný gen a exprimuje strukturní gen operabilně připojený příslušným způsobem k promotoru.

Mezi transgenické rostliny podle vynálezu patří jak jednoděložné, tak dvouděložné rostliny. Mezi reprezentativní příklady patří kukuřice, tabák, rajče, bavlník, řepka, sója, pšenice, rýže, vojtěška, brambor a slunečnice. Mezi výhodné rostliny patří kukuřice, zejména inbrední rostliny kukuřice.

Všechny transformované rostliny spadající do rozsahu vynálezu lze připravit různými způsoby známými v oboru. Transformace prostřednictvím Agrobacterium tumefaciens byla popsána výše. Mezi další postupy patří přímý transfer genu do protoplastů, Paszkowski a kol., EMBO J., 12: 2717 (1984), Loerz a kol., Mol. Gen. & Genet., 1199: 178 (1985), Fromm a kol., Nátuře 319: 719 (1986); bombardování mikroprojektily, Klein a kol., Bio/Technology, 6: 559 - 563 (1988); injekce do protoplastů, kultivovaných buněk nebo tkání, Reich a kol., Bio/Technology, 4: 1001 - 1004 (1986); nebo injekce do meristematických tkání nebo semenáčků a rostlin jak popsali De LaPena a kol., Nátuře, 325: 274 - 276 (1987), Graves a kol., Plant Mol. Biol., 7: 43 - 50 (1986), Hoykaas - Van Slogteren a kol., Nátuře, 311: 763 - 764 (1984), Grimsley a kol., Bio/Technology, 6: 185 (1988), a Grimslexy a kol., Nátuře, 325: 177 (1988) a elektroporace, WO92/09696.

Typ exprese strukturního genu operativně připojeného k připravenému tkáňově preferovanému nebo tkáňově specifickému promotoru v transformované rostlině obsahující stejný promotor je klíčový v případě, že strukturní gen kóduje insekticidní protein. Například právě popsaný dřeňově preferovaný typ exprese umožňuje transgenické rostlině tolerovat a odolávat patogenům a herbivorům, kteří napadají primárně dřeň, ale též opěrné kořeny, vnější obaly a listy rostliny, jelikož protein je v těchto rostlinných částech exprimován v menším rozsahu, ale stále v množství kontrolujících hmyz, ale v případě obou typů promotorů nebudou ovlivněna semena rostliny.

-16CZ 292953 B6

Příklady provedení vynálezu

Materiál a postupy používané při provádění vynálezu jsou dále popsány následujícími příklady provedení vynálezu. Tyto příklady jsou uvedeny pouze pro ilustraci a v žádném směru neomezují rozsah vynálezu.

Příklad 1

Obecné postupy

Manipulace s DNA se provádějí za použití postupů standardních v oboru. Tyto postupy lze často modifikovat nebo/a nahradit, aniž by se podstatně změnil výsledek. Pokud není uveden jiný odkaz, je většina těchto postupů popsána v práci Sambrook a kol., Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, druhé vydání, 1989.

Syntéza DNA-oligomerů:

DNA-oligomery dlouhé od přibližně dvaceti do přibližně devadesáti, s výhodou od přibližně šedesáti do přibližně osmdesáti nukleotidů, se syntetizují za použití DNA-syntetizátoru Applied Biosystems model 380B podle standardních postupů. Oligomery se připraví za použití zmodernizovaného cyklu SSCAF3 na 0,2 pmol malorozsahové koloně ABI s širokými póry. Na konci postupu se vyplaví trityl a oligomer se odštěpí od kolony za využití automatického štěpícího cyklu v přístroji 380B. Oligomery se poté odblokují v nadbytku hydroxidu amonného při teplotě 55 °C po dobu 8 až 12 hodin. Poté se oligomery vysuší vodpařovacím přístroji používajícím plynný dusík. Po vysušení se oligomery převedou do suspenze v 0,25 až 0,5 ml deionizované vody.

Purifikace syntetických oligomerů:

Vzorek každého oligomerů se smíchá se stejným objemem směsi barviva a formamidu, kde výsledný roztok obsahuje 0,05 % bromfenolové modři, 0,05 % xylenkyanolu FF a 25 % formamidu. Směs se zahřívá po dobu 10 minut na teplotu 95 °C, aby se oligomery denaturovaly. Vzorky se poté aplikují na 12% polyakiylamido-močovinový gel obsahující 7 M močoviny (Sambrook a kol.). Po elektroforéze při 300 až 400 voltů po dobu 3 až 4 hodin za použití přístroje Vertical Slab Gel Unit (Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, Kalifornie), se pro lokalizaci fragmentu o správné velikosti v gelu použije UV světlo, a tento fragment se poté vyřízne žiletkou. Purifikovaný fragment gelu se rozmělní a inkubuje v pufru tvořeném 0,4M chloridem lithným a lmM kyselinou ethylendiamintetraoctovou (EDTA), o pH 8, přes noc při teplotě 37 °C.

K separaci oligomerů ze zbytků polyakrylamidového gelu se použijí buď filtrační jednotky z porézního polyethylenu Gene/X (25 μΜ), nebo filtrační jednotky Millipore ultrafree-MC (0,45 μΜ). Purifikované oligomery se vysráží ethanolem, izolují pomocí centrifugace vmikrocentrifuze po dobu 20 minut při 4 °C a nakonec opět převedou do suspenze v TE (lOmM Tris, lmM kyselina ethylendiamintetraoctová, pH 8,0). Koncentrace se upraví na 50 ng / μΐ na základě měření absorpce při 260 nm.

Kinasování oligomerů pro stanovení velikosti

Pro ověření velikosti některých oligomerů na sekvenačním gelu se provede pomocí kinázy značící reakce za použití purifíkovaných syntetických oligomerů o každé z následujících velikostí: 40-merů, 60-merů, 70-merů, 80-merů a 90-merů. Pro každou kinasovací reakci probíhající v objemu 20 μΐ se použije 1 pmol purifikovaného oligomerů v pufru, který tvoří 7,0 mM Tris o pH 7,5, 10 mM chloridu draselného a 1 mM chloridu hořečnatého, 0,5 mM

-17CZ 292953 B6 dithiothreitolu (DTT), 50 pg / ml N,O-bis(trimethylsilyl)acetamidu (BSA), 3000 pCi (3 pmoly)

32P-gammaATP, a 8 jednotek T4 polynukleotid-kinázy. Směs pro kinasovací reakci se inkubuje po dobu 1 hodiny při 37 °C, následuje extrakce směsí fenolu a chloroformu a třikrát vysrážení ethanolem za použití glykogenu jako nosiče (Tracy, Prep. Biochem. 11: 251 -268 (1981)).

Z každé reakční směsi se připraví s 25 % formamidu, 0,05 % bromfenolové modři a 0,05 % xylenkyanolu FF dvě dávky pro nanesení na gel (jedna z nich obsahuje množství vydávající lOOOpulzů za minutu (cpm), druhá 2000 pulzů za minutu). Kinasované oligomery se vaří po dobu 5 minut před nanesením na sekvenační gel obsahující 6 % polyakrylamidu a 7 M močoviny (BRL Gel Mix TM6, BRL, Gaithersburg, Maryland). Na stejném gelu se provádí sekvenační reakce plazmidu pUC18, pro zajištění velikostních markérů.

Po elektroforéze se gel vysuší a exponuje na diagnostický film citlivý na paprsky X (Kodak, X-OMAT AR). Výsledné autoradiografy ukazují, že všechny testované purifikované oligomery mají správnou velikost. U oligomerů, jejichž velikost nebyla zjišťována přímo na sekvenčním gelu, se tato velikost zjistí na gelu s 6 % polyakrylamidu a 7 M močoviny (BRL Gel Mix TM6), za použití již velikostně určených oligomerů jako velikostních markérů. Všechny oligomery se před nanesením na gel nejprve denaturují 25% formamidem při teplotě 100 °C po dobu 5 minut. Obarvení polyakrylamidového gelu ethidium-bromidem umožňuje vizualizaci všech oligomerů pro stanovení velikosti.

Hybridizace oligomerů pro přímé klonování:

Oligomery, které mají být hybridizovány se spojí dohromady (od 1 pg do 20 pg celkové DNA) akinazují v IX ligačním pufru (Promega), obsahujícím 30 mM Tris-HCl o pH 7,8, 10 mM chloridu hořečnatého, 10 mM dithiothreitolu a 1 mM dATP. K reakci se použije 1 až 20 jednotek T4 polynukleotid-kinázy, v závislosti na přítomném množství celkové DNA. Kinasovací reakce se zastaví umístěním reakční nádoby do vařící vodní lázně na dobu pěti minut. Oligomery, které mají vytvořit 5'-konce hybridizovaných molekul se nekinasují, ale přidají se ke kinasovaným oligomerům po zahřátí společně s dalším hybridizačnímu pufrem. Spojené oligomery jsou v objemu 50 až 100 pl s přidaným hybridizačním pufrem použitým kvůli upravení konečného obsahu solí na 100 mM chloridu sodného, 120 mM Tris pH 7,5 a 10 mM chloridu hořečnatého. Kinasované a nekinasované oligomery se spojí dohromady a zahřívají se ve vařící vodní lázni po dobu pěti minut a poté se nechají pomalu ochladit na teplotu místnosti v průběhu přibližně čtyř hodin. Hybridizované oligomery se poté extrahují směsí fenolu a chloroformu, vysráží ethanolem a znovu převedou do suspenze v 17 pl TE (10 mM Tris, 1 mM kyseliny ethylendiamintetraoctové, pH 8,0). Za použití těchto 17 pl se sestaví směs pro ligační reakci o konečném objemu 20 pl (konečné podmínky: 30 mM Tris-HCl pH 7,8, 10 mM chloridu hořečnatého, 10 mM dithiothreitolu, 1 mM ATP, a 3 jednotky T4 DNA-ligázy (Promega, Madison, Wisconsin). Ligační směs se nechá inkubovat po dobu 2 hodin při teplotě místnosti. Hybridizované a ligované fragmenty se předtím, než se klonují do vektorů, obecně purifikují na 2% Nusieve-gelech před nebo/a po rozštěpení restrikčními enzymy. Sestaví se směs pro ligační reakci o objemu 20 pl za použití 100 ng až 500 ng každého z fragmentů s přibližně ekvimolámím množstvím DNA v 30 mM Tris-HCl pH 7,8, 10 mM chloridu hořečnatého, 10 mM dithiothreitolu, 1 mM ATP a 3 jednotkami T4 DNA-ligázy (Promega, Madison, Wisconsin). Ligační směs se inkubuje při teplotě místnosti po dobu 2 hodin. Po ligaci se DNA za použití standardních postupů (Sambrook a kol.) transformuje do zmražených kompetentních buněk Escherichia coli, a selekce transformovaných buněk se provede na LB-agaru (Sambrook a kol.) obsahujícím ampicillin v množství 100 pg / ml (viz níže).

Polymerázové řetězové reakce (PCR-reakce) pro screening klonů v Escherichia coli:

Kolonie Escherichia coli, které obsahují správný DAN-inzert se identifikují za použití polymerázové řetězové reakce (PCR) (viz obecně, Sandhu a kol., BioTechniques 7: 689 - 690

-18CZ 292953 B6 (1989)). Za použití párátka se kolonie seškrábnou z desek, kde se ponechaly růst přes noc, a přidají se do reakční směsi pro polymerázovou řetězovou reakci o objemu 20 μΐ až 45 μ|, která obsahuje přibližně 50 pmolů každého hybridizačního primeru (viz například použití primerů MK23A28 a MK25A28 pro selekci orientace SacII-fragmentu v pHYB2#6), 200 μΜ až 400 μΜ každého dNTP a IX reakční pufr (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, Connecticut). Po varu směsi pro polymerázovou řetězovou reakci s Escherichia coli ve vařící vodní lázni po dobu 10 minut se přidá 5 μΐ Taq polymerázy (0,5 jednotek) (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, Connecticut) v IX reakčním pufru. Parametry polymerázové řetězové reakce jsou obecně stanoveny takto: denaturace při 94 °C po dobu 30 sekund, teplotní hybridizace při 55 °C po dobu 45 sekund a extenze při 72 °C po dobu 45 sekund, při 30 až 36 cyklech. Produkty polymerázové řetězové reakce se analyzují na agarózovém gelu nebo Nusieve-agarózovém gelu pro stanovení délky amplifikovaných fragmentů.

Ligace:

Fragmenty rozštěpené restrikčními enzymy se purifikují buď na 1% agaróze s nízkou teplotou gelovatění (LGT, low gelling temperature agarose (FMC)), 2% Nusieve-agaróze (FMC), nebo 0,75% agaróze za použití postupů standardních v oboru. Pásy DNA se vizualizují ethidium-bromidem a tyto pásy se izolují z gelů pomocí vyříznutí žiletkou. Fragmenty izolované zagarózy s nízkou teplotou gelovatění se ligují přímo v LGT. Deset mikrolitrů každého izolovaného fragmentu DNA se použije pro sestavení směsí pro ligační reakce, při konečných objemech směsí pro ligační reakce přibližně 23 μΐ. Po vyříznutí žiletkou se izolované pásy gelu obsahující požadované fragmenty DNA rozpustí a přenesou do IX ligačního pufru, a přidají se 3 jednotky T4 DNA-ligázy (Promega), jak je popsáno výše. Fragmenty izolované buďto z běžné agarózy, nebo Nusieve-agarózy se purifikují z agarózy za použití filtračních jednotek Millipore ultrafree-MC (45 μΜ) a fragmenty se ligují jak je popsáno výše. Směs pro ligační reakci se před transformací zmražených kompetentních buněk Escherichia coli za použití standardních postupů (Sambrook a kol.) inkubuje při teplotě místnosti po dobu dvou hodin.

Transformace:

Zmražené kompetentní buňky Escherichia coli kmenu DH5alfa nebo HB101 se připraví a transformují za použití standardních postupů (Sambrook a kol.). Kompetentní buňky Escherichia coli „SURE“ se získají od firmy Stratagene (La Jolla, Kalifornie). U ligací prováděných v agaróze s nízkou teplotou gelovatění se po dokončení ligační reakce směs doplní 50mM chloridem vápenatým na konečný objem přibližně 150 μΐ a roztok se zahřívá na teplotu přibližně 65 °C po dobu zhruba 10 minut, aby se agaróza zcela rozpustila. Roztok se poté promíchá a chladí na ledu po dobu přibližně 10 minut, a poté se přidá přibližně 200 μΙ kompetentních buněk, které byly rozmraženy na ledu. Tato směs se nechá inkubovat na ledu po dobu 30 minut. Směs se poté podrobí tepelnému šoku teplotou 42 °C působící po dobu 60 sekund, a poté se směs chladí na ledu po dobu 2 minut. Poté se přidá 800 μΐ média SOC (20% trypton, 0,5% kvasničný extrakt, lOmM chlorid sodný, 2,5mM chlorid draselný, upraveno na pH 8 5N hydroxidem sodným, 20mM směs chloridu hořečnatého a síranu hořečnatého, a 20mM glukóza, Sambrook a kol.) a buňky se inkubují při teplotě 37 °C za třepání po dobu přibližně 1 hodiny před nanesením na desky se selekčním médiem. Deskami je typicky L-agar (Sambrook a kol.) obsahující ampicillin v množství 100 pg / ml.

Pokud se ligace provádějí v roztoku bez agarózy, rozmrazí se na ledu typicky 200 μΐ zmražených kompetentních buněk Escherichia coli (kmen DH5alfa (BRL, Gaithersburg, Maryland) nebo buňky „Sure“ (Stratagene, La Jolla, Kalifornie)) a přidá se 5 μΐ ligační směsi. Reakční směs se inkubuje na ledu po dobu přibližně 45 až 60 minut, a buňky se poté podrobí tepelnému šoku teplotou 42 °C působící po dobu přibližně 90 sekund. Po regeneraci při teplotě místnosti po dobu přibližně 10 minut se přidá 800 μΐ média SOC a buňky se poté inkubují po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C za třepání a nanesou na desky, jak je uvedeno výše.

-19CZ 292953 B6

Při vyhledávání inzertů do genu beta-galaktosidázy v některých standardně používaných vektorech se nanese 200 μΐ regenerované transformační směsi na desky LB-agaru obsahujícího

0,008% X-gal (5-brom-4-chlor-3-indolyl-beta-D-galaktopyranosid), 80μΜ izopropyl-betathiogalaktosid (IPTG) a ampicillin v koncentraci 100 pg / ml (Sambrook a kol.). Desky se inkubují při teplotě 37 °C přes noc, aby byla umožněna selekce a růst transformantů.

Miniscreening DNA:

Transformanty z desek se selekčním médiem se nechají růst a struktura jejich plazmidů se zkoumá a potvrdí za použití standardních postupů miniscreeningu plazmidů (Sambrook a kol.). Typicky se k produkci malých množství plazmidové DNA pro analýzu používá postup využívající varu (tzv. „boiling“ proceduře) (Sambrook a kol.). Alternativně se v některých případech používá postup využívající octanu amonného. Tento postup je modifikací postupu, který popsali Shing-yi Lee a kol., Biotechniques 9: 676 - 679 (1990).

1) Jediná bakteriální kolonie ze selekčních desek ponechaných růst přes noc se inokuluje do 5 ml (může se snížit na 1 ml) TB-média (Sambrook a kol.) a nechá se růst v přítomnosti příslušného antibiotika.

2) Inkubace se provádí za otáčení přes noc při teplotě 37 °C.

3) Do umělohmotné zkumavky (Oakridge) se odebere 5 ml bakteriálních buněk a centrifugují se po dobu 5 minut při 5000 otáčkách za minutu na přístroji Sorvall SS-34 při teplotě 4 °C.

4) Supematant se odstraní.

5) Peleta se znovu převede do suspenze v 1 ml lysního pufru (50mM glukóza, 25mM Tris-HCl (pH 8,0), lOmM kyselina ethylendiamintetraoctová a 5 mg / ml lysozymu), promíchá se po dobu 5 sekund a inkubuje při teplotě místnosti po dobu 5 minut.

6) Přidají se 2 ml čerstvě připraveného alkalického roztoku (0,2N hydroxid sodný, 1% natrium-dodecylsulfát), pevně se uzavře víčko, směs se promíchá pětinásobným obrácením zkumavky a zkumavka se umístí na dobu 5 minut do lázně obsahující led a vodu.

7) K roztoku se přidá 1,5 ml 7,5M octanu amonného o teplotě ledu (pH 7,6), směs se promíchá pětinásobným jemným obrácením zkumavky a zkumavka se umístí na dobu 5 minut do lázně obsahující led a vodu.

8) Směs se centrifuguje při 9000 otáčkách za minutu po dobu 10 minut při teplotě místnosti.

9) Čirý supematant se přenese do zkumavky Corex o objemu 15 ml, přidá se 0,6-násobek objemu izopropanolu (přibližně 2,5 ml) a směs se nechá usadit při teplotě místnosti po dobu 10 minut.

10) Směs se centrifuguje při 9000 otáčkách za minutu po dobu 10 minut při teplotě místnosti a supematant se odstraní.

11) Peleta se opět převede do suspenze v 300 μΐ TE-pufru a přidá se 6 μΐ zásobného roztoku RNasy A a TI (připraveného jako 200 μΐ roztoku smícháním 180 μΐ RNasy A (3254jednotek/mg proteinu, 5,6 mg proteinu / ml) a 20 μΐ RNasy TI (481 jednotek / pg proteinu, 1,2 mg proteinu / ml). Tyto zásobní roztoky lze získat od firmy USB (US Biochemical). Směs se přenese do mikrocentrifugační kyvety a inkubuje při teplotě 37 °C po dobu 15 minut.

-20CZ 292953 B6

12) Přidá se 75 μΐ destilované vody a 100 μΐ 7,5M octanu amonného a směs se inkubuje po dobu 10 minut na lázni obsahující led a vodu.

13) Směs se centrifuguje při 14 000 otáčkách za minutu po dobu 10 minut v mikrocentrifuze (Beckman) při teplotě 4 °C.

14) Provede se vysrážení pomocí přidání 2,5-násobku objemu 100% ethanolu (přibližně 1 ml) a směs se inkubuje na lázni obsahující led a vodu po dobu 10 minut.

15) Směs se centrifuguje při 14 000 otáčkách za minutu po dobu 10 minut v mikrocentrifuze.

16) Peleta se promyje 0,5 ml až 1 ml 70% ethanolu, vysuší se a převede opět do suspenze ve 100 μΐ IX pufru New England Biolabs restriction enzyme Buffer 4 (20 mM Tris-HCl (pH 7,9), 10 mM octanu hořečnatého, 50 mM octanu draselného, lmM dithiothreitolu). Spektrofotometricky se změří koncentrace a zkontroluje čistota pomocí absorbance při 260 a 280 nm.

Pro rychlejší stanovení, zda konkrétní bakteriální kolonie obsahuje nebo neobsahuje rekombinantní plazmid, se provede miniscreening pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR miniscreen) za použití modifikace postupu, který popsali Sandhu, G. S. a kol., 1989, BioTechniques, 7: 689 - 690). Ve stručnosti, připraví se směs následujícího složení:

100 μΐ výše uvedené směsi primerů, 20 μΜ každého primeru.

100 μΐ směsi dNTP (2,5 mM každého deoxyribonukleotidtrifosfátu),

100 μΐ 10X pufru AmpliTaq buffer (Perkin-Elmer Cetus, IX pufr = 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 50 mM chloridu draselného, 1,5 mM chloridu hořečnatého a 0,01 % želatiny),

700 μΐ deionizované vody.

μΐ výše uvedené směsi se vloží do polypropylenové zkumavky pro polymerázovou řetězovou reakci (PCR). Transformovaná bakteriální kolonie se odebere párátkem a převede do suspenze v této směsi. Zkumavka se vloží do vařící vodní lázně na dobu 10 minut, ochladí se na teplotu místnosti a poté se přidá 5 μΙ směsi níže uvedeného složení:

265 μΐ deionizované vody, μΐ 10X pufru AmpliTaq buffer (Perkin-Elmer Cetus, IX pufr = 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 50 mM chloridu draselného, 1,5 mM chloridu hořečnatého a 0,01 % želatiny),

7,5 μΐ Tq polymerázy.

Vzorky se překryjí 50 μΐ minerálního oleje a provede se 30 cyklů polymerázové řetězové reakce s následujícími parametry:

denaturace: 94 °C po dobu 1 minuty, teplotní hybridizace: 55 °C po dobu 1 minuty, extenze: 72 °C po dobu 45 sekund.

Po amplifikaci pomocí polymerázové řetězové reakce se přidá do celého objemu reakční směsi 1 μΐ barviva (30 % glycerolu, 0,25 % bromfenolové modři, 0,25 % xylenkyanolu) a 20 μΐ směsi

-21 CZ 292953 B6 se nanese na gel (2 % Nusieve, 1 % agarózy), aby se zjistilo, zda je přítomen produkt polymerázové řetězové reakce o očekávané velikosti.

Tento postup se používá pouze jako počáteční screening. Následně se pro potvrzení struktury plazmidu a jeho inzertu provedou minipreparační postupy, a následně sekvenování.

Příklad 2

Amplifikace a sestavení každé čtvrtiny

Klonování fragmentů syntetického genu Bt crylA(b):

Syntetický gen se vytvoří tak, aby byl klonován do čtyř dílů, z nichž každý tvoří zhruba jednu čtvrtinu genu. Oligomery pro každou čtvrtinu se spojí, aby se sestavily buď pomocí polymerázové řetězové reakce, hybridizace, nebo kombinace hybridizace následované amplifikací za použití polymerázové řetězové reakce, jak je popsáno na libovolném místě. Syntetické čtvrtiny se spojí dohromady pomocí překrývajících se restrikčních míst Aat II, Nco I, a Apal mezi první a druhou, druhou a třetí, respektive třetí a čtvrtou čtvrtinou.

Každá čtvrtina genu (představující přibližně 500 bp) se sestaví hybridizací příslušných oligomerů a amplifikací požadovaného fragmentu za použití primerů pro polymerázovou řetězovou reakci specifických pro konce této čtvrtiny. Použijí se dva odlišné způsoby uspořádání polymerázových řetězových reakcí užívající dvě sady mírně odlišných primerů. PCR-produkty těchto dvou reakcí se vytvoří tak, že jsou identické s tím rozdílem, že v první reakci je na 5'-konci kódující oblasti přídatná sekvence AATT a ve druhé reakci je na 3'-konci dané čtvrtiny sekvence AGCT. Když se produkty těchto dvou reakcí pro konkrétní čtvrtinu smíchají (po odstranění polymerázy, primerů a neúplných produktů), denaturují a následně znovu tepelně hybridizují, má určitý podíl (teoreticky 50 %) tepelně hybridizovaného produktu nehomologní přečnívající konce. Tyto konce se vytvoří tak, aby odpovídaly lepivým koncům vytvořeným během restrikčního štěpení EcoRI na 5'-konci a Hind III na 3'-konci molekuly. Výsledné molekuly se fosforylují, ligují do vektoru Bluescript rozštěpeného EcoRI a HindlII a fosfatázovaného, a transformují do zmraženého kompetentního kmene Escherichia coli DH5alfa. Po selekci se kolonie Escherichia coli obsahující požadovaný fragment identifikují pomocí způsobů restrikčního štěpení DNA. Inzerty, které představují části syntetického genu, se následně purifikují a sekvenují za použití standardních postupů. Ve všech případech se vyrobí a sekvenují klony z více polymerázových řetězových reakcí. Čtvrtiny se poté navzájem spojí za použití jedinečných restrikčních míst na místech spojení, čímž se získá kompletní gen.

Klonované čtvrtiny se identifikují pomocí miniscreeningu a fragmenty genu se sekvenují. Do sekvence se často zavedou chyby, nejpravděpodobněji během amplifikace v polymerázové řetězové reakci. K opravě těchto chyb v klonech, které jich obsahují pouze několik, se použijí hybridizované oligomery. Hybridizované fragmenty se rozštěpí na rozpoznávacím místě pro restrikční enzym v fragmentu a klonují, aby se nahradila zmutovaná oblast v syntetickém genu. Délka hybridizovaných fragmentů činí od 90 bp (například v případě oblasti, která nahrazuje fragment mezi místy Sac II v druhé čtvrtině) až do přibližně 350 bp v případě fragmentu čtvrté čtvrtiny, který nahrazuje dvě mutace vzniklé při polymerázové řetězové reakci ve čtvrté čtvrtině genu.

Kvůli vysokému výskytu chyb po polymerázové řetězové reakci se vytvoří a zkonstruuje plazmid, který umožňuje selekci klonovaného fragmentu genu, který obsahuje otevřený čtecí rámec. Tento plazmid se vytvoří takovým způsobem, že, pokud je do klonovacích míst zaveden otevřený čtecí rámec, může transformovaná bakterie růst v přítomnosti kanamycinu. Konstrukce tohoto vektoru je podrobně popsána níže. Tento selekční systém vysoce urychluje postup, jelikož umožňuje rychle identifikovat klony s otevřenými čtecím rámci, aniž by se musel sekvenovat

-22CZ 292953 B6 velký počet nezávislých klonů. Syntetické čtvrtiny se sestaví v různých plazmidech, včetně BSSK (Stratagene, La Jolla, Kalifornie), pUC18 (Sambrook a kol.), a Km-expresívního vektoru (expresívního vektoru exprimujícího kanamycin). Další vhodné plazmidy, včetně plazmidů na bázi pUC, jsou známy v oboru a lze je též použít. Získání plně funkčních syntetických genů Bt crylA(b) se ověří pomocí úplného sekvenování klonovaných fragmentů, analýzy produktů klonovaných genů pomocí western blottingu a biologických testů s hmyzem za použití Ostrinia nubilalis jako testovacího hmyzu.

Konstrukce Km-expresívního vektoru pro selekci otevřených čtecích rámců:

Km-expresívní vektor se vytvoří pro selekci fragmentů syntetického genu, které obsahují otevřené čtecí rámce. Pomocí polymerázové řetězové reakce se vytvoří oligomery, které umožňují fúzi genu NPTII z Tn5 počínaje nukleotidem 13 (Reiss a kol., EMBO J. 3: 3317 - 3322 (1984)) s pUC18 a zavedení vhodných restrikčních míst mezi segmenty DNA. Oblast polylinkeru obsahuje rozpoznávací místa pro restrikční endonukleázy, která umožňují klonování různých syntetických fragmentů insekticidních proteinů Bt ve stejném rámci s genem Km. 5'-oligomer o velikosti 88 bp, který obsahuje oblast polylinkeru, se purifikuje na 6% polyakrylamidovém gelu, jak je popsáno výše pro purifikaci oligomerů pomocí elektroforézy na polyakrylamidovém gelu. Polymerázová řetězová reakce se provede za použití fragmentu Bgl II / Srna I o velikosti 1 kb, který obsahuje gen NPT II získaný z Tn5, jako matrice. Reakční směs pro polymerázovou řetězovou reakci obsahuje 100 ng matrice se 100 pmoly oligomerů KE72A28 a KE74A28 (viz sekvence níže), 200 nM dNTP, a 2,5 jednotky Taq polymerázy v celkovém objemu 50 μΐ, při překrytí stejným objemem minerálního oleje. Sekvence primerů jsou:

KE74A2B

5' -GCAGATCTGG ATCCATGCAC GCCGTGAAGG GCCCTTCTAG AAGGCCTATC GATAAAGAGC TCCCCGGGGA TGGATTGCAC GCAGGTTC-3'

KE72A28

5'-GCGTTAACAT GTCGACTCAG AAGAACTCGT CAAGAAGGCG-3'

Parametry použité polymerázové řetězové reakce jsou: 94 °C po dobu 45 sekund, 55 °C po dobu 45 sekund, a 72 °C po dobu 55 sekund s prodloužením ve stupni 3 o 3 sekundy při 20 cyklech. Všechny polymerázové řetězové reakce se provádí v teplotním cyklovači Perkin-Elmer Cetus. Amplifikovaný produkt polymerázové řetězové reakce má velikost 800 bp a obsahuje oblast polylinkeru s místem počátku translace následovaným jedinečnými restrikčními místy fúzovanými ve stejném čtecím rámci s genem Km od báze č. 13 přes terminátor translace. pUC:KM74 je Km-expresívní kazeta, která se sestaví z fragmentu Bgl II / Sall polylinker / Km o velikosti 800 bp klonovaného do vektoru pUC18. Promotor lacZ umožňuje, aby byl gen Km exprimován v Escherichia coli. Deriváty pUX:KM74 se musí nejprve nanést na desky LB-agaru obsahující ampicillin v množství 100 pg / ml, aby se provedla selekce transformantů, které mohou být následně vyhledávány na deskách LB-agaru obsahujících 25 pg / ml směsi kanamycinu a izopropyl-beta-thiogalaktosidu (IPTG). Fragmenty syntetického genu insekticidního proteinu Bt se sestaví z každé čtvrtiny v Km-kazetě, aby se ověřilo klonování částí fragmentů obsahujících otevřené čtecí rámce. Prvním fragmentem syntetického genu insekticidního proteinu Bt aktivním proti Ostrinia nubilalis, pBt:Km#6, je gen insekticidního proteinu Bt, který vykazuje rezistenci vůči Km. Následně se zjistí, že tento fragment obsahuje mutace ve třetí a čtvrté čtvrtině, které se později opraví.

-23CZ 292953 B6

Příklad 2A

Syntéza a klonování první čtvrtiny syntetického genu (páry bází 1 až 550)

Za účelem klonování první čtvrtiny syntetické sekvence DNA kódující syntetický gen Bt crylA(b) se provede následující postup. V podstatě stejné postupy se použijí pro syntézu a klonování dalších čtvrtin, s tím, že se liší primery a restrikční místa, jak je uvedeno.

Matrice pro čtvrtinu 1: směs purifikovaných oligomerů Ul - U7 a LI až L7 ve stejných množstvích.

Primery pro polymerázovou řetězovou reakci:

Přímé:

PÍ (a): 5'-GTCGACAAGG ATCCAACAAT GG-3'

PÍ (b) : 5'-AATTGTCGAC AAGGATCCAA CAATGG-3'

Obrácené:

P2 (a): 5'-ACACGCTGAC GTCGCGCAGC ACG-3'

P2 (b) : 5'-AGCTACACGC TGACGTCGCG CAG-3'

Pár primerů Al: Pl(b) + P2(a)

Pár primerů A2: Pl(a) + P2(b)

Směs pro polymerázovou řetězovou reakci, která obsahuje oligomery tvořící první čtvrtinu syntetického genu insekticidního proteinu Bt optimalizovaného pro kukuřici se připraví následovně:

200 ng směsi oligomerů (všechny oligomery pro tuto čtvrtinu smíchané ve stejných hmotnostních množstvích), μΐ směsi primerů (směs 1 : 1 každého primeru při koncentraci 20 μΜ, primery jsou popsány výše), μΐ 10X pufru pro PCR.

Použitým pufrem pro PCR může být buď:

(a) IX koncentrace = 10 mM chloridu draselného, 10 mM síranu amonného, 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 2 mM síranu hořečnatého a 0,1 % Tritonu X-100, nebo (b) IX koncentrace = 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM chloridu draselného, 1,5 mM chloridu hořečnatého, 0,01 % (hmotnost / objem) želatiny.

Složky se smíchají, zahřívají ve vařící vodní lázní po dobu 5 minut a inkubují při 65 °C po dobu 10 minut.

-24CZ 292953 B6

Poté se přidají následující činidla:

μΐ směsi dNTP (konečná koncentrace v reakční směsi = 0,2 mM každého deoxyribonukleotidtrifosfátu), jednotek polymerázy.

Konečný objem reakční směsi činí 50 mikrolitrů.

Oligomery se inkubují po dobu 3 minut při teplotě 72 °C a poté se nechá proběhnout polymerázová řetězová reakce, která se provádí v teplotním cyklovači Perkin Elmer.

Jednotlivé kroky cyklu jsou následující:

denaturace: 94 °C po dobu 1 minuty, teplotní hybridizace: 60 °C po dobu 1 minuty, extenze: 72 °C po dobu 45 sekund (+ 3 sekundy na cyklus), počet cyklů: 15.

Po dokončení reakce se 10 μΐ reakční směsi polymerázové řetězové reakce nanese na analytický gel obsahující 2 % Nusieve-GTG (FMC) a 1 % agarózy, pro zmonitorování reakce. Zbylých 40 μΙ se použije pro klonování fragmentů genu, jak je popsáno níže.

Produkty polymerázové řetězové reakce

Znázorněny jsou konce dvouřetězcových produktů polymerázové řetězové reakce odpovídající různým párům primerů (pouze vrchní řetězec):

Al AATTGTCGAC_________;___________GCGTGT (554 bp) první čvrtina

A2 GTCGAC____________________GCGTGTAGCT (554 bp) první čtvrtina

Hybridizace μΐ každé zvýše popsaných reakčních směsí polymerázové řetězové reakce se purifikuje za použití kolony chromaspin 400 (Clonetech, Palo Alto, Kalifornie), podle pokynů výrobce. K reakční směsi se před nanesením na kolonu přidá 5 μg DNA jako nosiče. (To se provádí ve většině případů klonování. U některých reakcí se však reakční směs polymerázové řetězové reakce extrahuje směsí fenolu a chloroformu za použití standardních postupů (Sambrook a kol.), pro odstranění Taq polymerázy a DNA vyrobená pomocí polymerázové řetězové reakce se izoluje z vodné fáze za použití standardního postupu srážení ethanolem). DNA používaná jako nosiče se s fragmenty vytvořenými pomocí polymerázové řetězové reakce nevymývá. Reakční protějšky Al a A2 pro každou čtvrtinu se smíchají, zahřívají ve vařící vodní lázni po dobu 10 minut a poté inkubují přes noc při teplotě 65 °C. Reakční směsi se poté vyjmou z lázně teplé 65 °C a vysráží ethanolem s 1 μΐ (20 μg) glykogenu prostého nukleázy (Tracy, Prep. Biochem. 11: 251 - 268 (1981)) jako nosiče. Peleta se převede zpět do suspenze v 40 μΐ deionizované vody.

-25CZ 292953 B6

Fosforylační reakce:

Fosforylační reakce se provádí následovně:

μΙ DNA,

2,5 μΐ 20mM ATP,

0,5 μ! 10X BS/DTT (IX = 5 mM dithiothreitolu (DTT),

0,5 mg / ml N,O-bis(trimethylsilyl)acetamidu (BSA))

1,0 μΐ 10X pufru pro polynukleotid-kinázu (IX = 7mM Tris.HCI, pH 7,6, 0,1 M chloridu draselného, 10 mM chloridu hořečnatého)

2,0 μΐ polynukleotid-kinázy (New England Biolabs, 20 jednotek).

Inkubace se provádí po dobu 2 hodin při teplotě 37 °C.

Reakční směs se poté extrahuje jedenkrát směsí fenolu a chloroformu v poměru 1:1, pak jedenkrát chloroformem a vodná fáze se vysráží ethanolem za použití standardních postupů. Peleta se opět převede do suspenze v 10 μΐ TE.

Restrikční štěpení

Směs tvoří:

pg vektoru Bluescript (BSSK+, Stratagene, La Jolla, Kalifornie), μΐ 10X restrikčního pufru (IX = 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM chloridu hořečnatého, 100 mM chloridu sodného), μΐ Eco RI (New England Biolabs), 100 jednotek, μΐ Hind III (New England Biolabs), 100 jednotek.

Konečný objem reakční směsi činí 100 μΐ.

Inkubace probíhá po dobu 3 hodin při 37 °C.

Po dokončení se reakční směs extrahuje stejným objemem fenolu nasyceného TE (10 mM Tris.HCI, pH 8,0 a 10 mM kyseliny ethylendiamintetraoctové). Po centrifugaci se vodná fáze extrahuje stejným objemem směsi (nasycené TE) fenolu a chloroformu v poměru 1 : 1 (termín „chloroform“ označuje směs chloroformu a izoamylalkoholu v poměru 24 : 1), a nakonec se vodná fáze vzniklá po této extrakci extrahuje stejným objemem chloroformu. Výsledná vodná fáze se vysráží ethanolem (přidá se 10 μΐ 3M octanu sodného a 250 μΙ absolutního ethanolu, směs se nechá stát při teplotě 4 °C po dobu 10 minut a centrifuguje se v mikrocentrifuze při maximální rychlosti po dobu 10 minut). Peleta se promyje v 70 % ethanolu, vysuší při teplotě místnosti po dobu 5 až 10 minut a převede opět do suspenze ve 100 μΐ lOmM Tris-HCl (pH 8,3).

-26CZ 292953 B6

Fosfatázová reakce

Vektorová DNA se běžně ošetřuje fosfatázou kvůli snížení počtu kolonií získaných bez inzertu. Typicky se používá alkalická fosfatáza ze střeva telat (Sambrook a kol.), mohou však být použity i jiné fosfatázové enzymy.

Typická fosfatázová reakce se připraví, jak je popsáno níže:

μΐ výše popsané rozštěpené DNA, μΐ 10X pufru pro alkalickou fosfatázu ze střeva telat (IX = 50 mM Tris-HCl (pH 8,3), 10 mM chloridu horečnatého. 1 mM chloridu zinečnatého, 10 mM spermidinu), μΐ (1 jednotka) alkalické fosfatázy ze střeva telat (CIP, Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana).

Inkubace se provádí při 37 °C po dobu 1 hodiny.

DNA se poté gelově purifikuje (na 1% agarózovém gelu s nízkou teplotou gelovatění (LGT)) a peleta se opět převede do suspenze v 50 μΐ TE. Po elektroforéze se příslušný pás vyřízne z gelu pomocí žiletky, rozpustí při teplotě 65 °C působící po dobu 5 minut a naředí TE v poměru 1:1. Tento roztok se extrahuje dvakrát fenolem, jednou vý še uvedenou směsí fenolu a chloroformu, a jednou chloroformem. Výsledná vodná fáze se vysráží ethanolem a opět převede do suspenze v TE-pufru.

Ligace:

Pro ligaci fragmentů syntetického genu do vektorů se typicky používají následující podmínky.

μΐ fosforylovaného inzertu DNA, μΐ fosfatázovaného vektoru Bluescript rozštěpeného Eci Rl a Hind III, zahřátého na 65 °C a poté ochlazeného, μΐ 10X ligačního pufru (IX pufr = 30 mM Tris.HCl (pH 7,8), 10 mM chloridu horečnatého, 10 mM dithiothreitolu, 1 mM ATP), plN,O-bis(trimethylsilyl)acetamidu (BSA)(1 mg/ml), μΐ ligázy (3 jednotky, Promega, Madison, Wisconsin).

Reakční směs pro ligace se typicky inkubuje při teplotě 16 °C přes noc nebo při teplotě místnosti po dobu 2 hodin.

Transformace:

Transformace ligovaných fragmentů DNA do Escherichia coli se provede za použití standardních postupů (Sambrook a kol.), jak je popsáno výše.

Identifikace rekombinantů

Vyberou se bílé nebo světle modré kolonie vzniklé inkubací transformačních desek přes noc. Plazmidy v transformantech se charakterizují za použití standardních postupů miniscreeningu

-27CZ 292953 B6 (Sambrook a kol.), nebo jak je popsáno výše. Typicky se používá jeden ze tří postupů, uvedených níže:

(1) minipreparační postup varu DNA, (2) miniscreening za použití polymerázové řetězové reakce, (3) minipreparace octanem amonným.

Restrikční štěpení rekombinantních plazmidů, o kterých se má za to, že obsahují první čtvrtinu, se provede následovně:

(a) štěpení Bam HI a Aat II:

μΐ DNA + 10 μΐ IX pufruNew England Biolabs restriction enzyme Buffer 4,

0,5 μΐ Bam HI (10 jednotek),

0,5 μΐ Aat II (5 jednotek).

Inkubace se provádí po dobu 2 hodin při 37 °C.

Klony, u kterých se identifikuje, že vykazují požadovaný typ restrikce, se poté rozštěpí v oddělených reakcích Pvu II a Bgl II. Pouze u klonů, které vykazují požadovaný typ restrikce při štěpení všemi třemi enzymy, se dále provádí sekvenování.

Sekvenování klonovaných fragmentů genů:

Sekvenování se provádí za použití modifikace Sangerovy metody využívající dideoxyribonukleotidů jako terminátorů reakce (Sambrook a kol.) za použití dvouřetězcová DNA se soupravou Sequenase 2 kit (United States Biochemical Corp., Cleveland, Ohio). Celkem se sekvenuje šest klonů první čtvrtiny. Ze sekvenovaných klonů se pouze u dvou klonů, označených pQAl a pQA5 zjistí, že obsahují pouze po jedné deleci. Každá z těchto delecí představuje jeden pár bází, umístěný u pQAl v poloze 452 a u pQA5 v poloze 297.

Plazmid pQAl se použije s pPl-8 (jak je popsáno níže) pro získání první čtvrtiny se očekávanou sekvencí.

Příklad 2B

Syntéza a klonování druhé čtvrtiny (páry bází 531 až 1050)

Matrice: oligomery U8 - U14 a L8 - L14

Primery pro polymerázovou řetězovou reakci:

Přímé:

P3 (a): 5'-GCTGCGCGAC GTCAGCGTGT TCGG-3'

P3 (b) : 5'-AATTGCTGCG CGACGTCAGC GTG-3'

-28CZ 292953 B6

Obrácené:

P4 (a): 5'-GGCGTTGCCC ATGGTGCCGT ACAGG-3'

P4 (b) : 5*-AGCTGGCGT TGCCCATGGT GCCG-3'

Pár primerů B1: P3(b) + P4(a)

Pár primerů B2: P3(a) + P4(b).

Produkty polymerázové řetězové reakce:

B1 AATTGCTGCG________________________AACGCC (524 bp) druhá čtvrtina

B2 GCTGCG________________________AACGCCAGCT (524 bp)

Hybridizace, amplifikace pomocí polymerázové řetězové reakce, velikostní frakcionace na centrifugační koloně (spin column) a klonování tohoto fragmentu genu do vektoru Bluescript rozštěpeného Eco RI a Hind III se provede jako je popsáno výše pro první čtvrtinu (příklad 2A). Produkt polymerázové řetězové reakce pro tuto čtvrtinu má velikost přibližně 529 bp, a představuje druhou čtvrtinu genu (nukleotidy 531 až 1050). Transformace se provádí do zmražených kompetentních buněk Escherichia coli (DH5alfa) za použití standardních postupů popsaných výše (Sambrook a kol.).

Miniscrenning klonů pQB:

Minipreparovaná DNA se připraví jak je popsáno výše a rozštěpí se (a) Aat II a Nco I, (b) Pvu II a (c) Bgl I, pro potvrzení struktury inzertu ve vektoru před sekvenováním.

Sekvenování se provádí jak je popsáno výše za použití Sangerovy metody využívající dideoxyribonukleotidů jako terminátorů reakce (Sambrook a kol.).

Pro tuto čtvrtinu se sekvenuje celkem třináct klonů. Druhá čtvrtina vždy obsahuje jednu nebo několik delecí mezi polohami 884 až 887. Ve většině případů je deletován G v poloze 884.

Plazmid pQB5 má pouze jednu deleci v poloze 884. Tato oblast leží mezi dvěma místy Sac II (polohy 859 a 949). Oprava této delece je popsána v příkladu 3.

Klony první poloviny (1 - 1050 bp)

Fragment pro klonování první poloviny (čtvrtiny 1 a 2) syntetického genu Bt kukuřice jako jediný fragment se získá restrikčním štěpením produktu polymerázové řetězové reakce obsahujícího první čtvrtinu a druhou čtvrtinu. Pro štěpení DNA (následující extrakci fenolem a vysrážení ethanolem) se použije restrikční endonukleáza AatlI, reakční směs má objem 20 μΐ. 15 μΐ obou čtvrtin rozštěpených Aat II se smíchá a liguje (v objemu 50 μΐ pomocí přidání 5 μΙ 10X ligačního pufru (IX = 30 mM Tris-HCl, pH 7,8, 10 mM chloridu hořečnatého, 10 mM dithiothreitolu, 1 mM ATP), 14 μΐ deionizované vody a 1 μΐ T4 DNA-ligázy (3 jednotky, Promega, Madison, Wisconsin)) při teplotě místnosti po dobu 2 hodin. Výsledkem je fragment o velikosti přibližně 1 kb, jak se stanoví elektroforézou na 1% agarózovém gelu probíhající za standardních podmínek (Sambrook a kol.). 10 μΐ produktu ligace se amplifikuje pomocí polymerázové řetězové reakce za podmínek popsaných dříve s tím rozdílem, že se nechá proběhnout pouze pět cyklů.

-29CZ 292953 B6

Pár primerů: HA = PÍ (a) + P4(b)

Pár primerů: HB = Pl(b) + P4(a).

Produkt těchto reakcí se klonuje do vektoru Bluescript (Stratagene, La Jolla, Kalifornie), jak je popsáno pro jednotlivé čtvrtiny. Tento postup se provede pouze jednou, tj. všechna inzertovaná DNA se získá v konkrétní oblasti z jediné polymerázové řetězové reakce.

Provede se miniscreening třiceti šesti kolonií pomocí štěpení Sal I a Pvu II. Všechny kromě čtyř obsahují inzert o velikosti přibližně 1 kb, a z nich alespoň 20 vykazuje správný typ štěpení Pvu II. Osm z těchto klonů se vybere pro analýzu sekvence. Jeden z klonů, Pl—8, má mezi místem Eco NI (396 bp) a Dra III (640 bp) požadovanou sekvenci. Tento klon se použije pro získání plazmidu s požadovanou sekvencí až k místu Dra III (640 bp) v druhé čtvrtině s pQAl (první čtvrtina s delecí v poloze 452 bp, popsáno výše).

Příklad 2C

Klonování a syntéza třetí čtvrtiny (páry bází 1021 až 1500)

Matrice: oligomery U15 -U20 a L15 - L21

Primery pro polymerázovou řetězovou reakci:

Přímé:

P5 (a): 5'-TTCCCCCTGT ACGGCACCAT GGGCAACGCC GC-3'

PS (b) ; 5 ' -AATTGTACGG CACCATGGGC AAC-3'

Obrácené:

P6 (a): 5'-GAAGCCGGGG CCCTTCACCA CGCTGG-3'

P6 (b) í 5·-AGCTGAAGCC GGGGCCCTTC ACC-3'

Pár primerů Cl: P5(b) + P6(a)

Pár primerů C2: P5(a) + P6(b).

Produkty polymerázové řetězové reakce:

Cl AATTGTACGG____________________GGCTTC (475 bp) třetí čtvrtina

C2 TTCCCCTGTACGG____________________GGCTTCAGCT (484 bp) třetí čtvrtina

Polymerázové řetězové reakce, izolace fragmentu DNA o správné velikosti na centrifugační koloně (spin column), a ligace do vektorů se provede jak je popsáno výše (příklad 2 A) za použití vektoru Bluescript rozštěpeného Eco Rl a Hind III. Produkt polymerázové řetězové reakce

-30CZ 292953 B6 o velikosti přibližně 479 párů bází představuje třetí čtvrtinu syntetického genu (nukleotidy 1021 až 1500).

Transformace do zmražených kompetentních buněk Escherichia coli kmen DH5alfa, selekce a identifikace transformantů, charakterizace transformantů pomocí miniscreeningu, a sekvenování fragmentu syntetického genu ve vektoru se provede, jak je popsáno výše.

Miniscreening klonů pQC:

Miniscreening třetí čtvrtiny se provede za použití standardního postupu (Sambrook a kol.). Minipreparovaná DNA se rozštěpí (a) Nco I a Apa I a (b) Pvu II. Klony, které vykazují správný typ restrikčního štěpení, se sekvenují za použití standardních postupů. Celkově se sekvenuje 22 klonů třetí čtvrtiny. Tři hlavní „horká místa“ delecí ve třetí čtvrtině se identifikují (a) v poloze 1083, (b) mezi polohami 1290 - 1397) a (c) mezi polohami 1356 - 1362. Ve všech klonech s výjimkou jednoho, pQC8, dochází též vždy k inzerci C v poloze 1365. Kromě těchto mutací obsahují klony třetí čtvrtiny řadu dalších zjevně náhodných delecí. Společnou vlastností třech „horkých míst“ mutací ve třetí čtvrtině a tohoto místa v druhé čtvrtině je, že tyto oblasti jsou lemovány na obou stranách sekvencemi, které obsahují přibližně 80 % C + G. Ostatní oblasti, které obsahují 5 až 9 C a G v řadě nejsou ovlivněny. Oligomery U15, U16, U18, U19, L15, L16, L18 a L19 se přetvoří tak, aby se snížil obsah C + G v těchto oblastech. Pět klonů z každé polymerázové řetězové reakce za použití modifikovaných oligomerů se sekvenuje.

Plazmid pQCN103 má správnou sekvenci třetí čtvrtiny, pouze se změnou v poloze 1326. Tato změna, kterou je substituce G za C, má za následek substituci jedné aminokyseliny (leucinu) za původní (fenylalanin).

Příklad 2D

Syntéza a klonování čtvrté čtvrtiny (páry bází 1480 až 1960)

Čtvrtá čtvrtina genu se získá z klonu, který je původně vytvořen aby obsahoval třetí a čtvrtou čtvrtinu genu. „Druhá polovina“ syntetického genu se získá pomocí polymerázových řetězových reakcí, pro fúzování třetí a Čtvrté čtvrtiny. Tyto reakce se provádějí s primery pro polymerázovou řetězovou reakci P5 (a) a P6(a) popsanými výše pro třetí čtvrtinu a primery P7(a) a P8(a) (popsanými níže). Obrácený primer je modifikován tak, aby obsahoval místo Sac I a terminační kodon. Pro každou čtvrtinu se provedou oddělené reakce se 30 cykly, za použití výše popsaných podmínek. Dvě uvedené čtvrtiny se navzájem spojí pomocí překrývající polymerázové řetězové reakce (overlapping PCR) a následně rozštěpí restrikčními enzymy Nco I a Sac I. Výsledný fragment o velikosti 953 bp se klonuje přímo do pCIB3054, který se předtím rozštěpí Nco I a Sac I a ošetří alkalickou fosfatázou.

pCIB3054 se zkonstruuje inzercí intronu č. 9 z fosfoenolpyruvát-karboxylázy (PEPC ivs č.9) do jedinečného místa Hpa I pCIB426 (podrobně popsáno v příkladu 4). pCIB246 se rozštěpí pomocí Hpal a fosfatázuje CIP za použití standardních postupů popsaných v příkladu 2A. PEPC ivs č.9 se získá pomocí polymerázové řetězové reakce za použití pPEP-10 jako matrice. pEP-10 je genomický subklon, který obsahuje celý gen fosfoenolpyruvát-karboxylázy kukuřice kódující C₄-fotosyntetický enzym, plus přibližně 2,2 kb 5'-lemovací a 1,8 kb 3'-lemovací DNA. DNA o délce 10 kb se liguje do místa HindlII v pUC18. (Hudspeth a kol., Plant Molecular Biology, 12: 576 - 589 (1989)). Přímým primerem pro polymerázovou řetězovou reakci používanou k získání PEPC ivsč.9 je GTACAAAAACCAGCAACTC a obráceným primerem je CTGCACAAAGTGGAGTAGT. Produktem polymerázové řetězové reakce je fragment o velikosti 108 bp, který obsahuje pouze sekvence intronu č. 9 fosfoenolpyruvát-karboxylázy. Reakční směs z polymerázové řetězové reakce se extrahuje fenolem a chloroformem, vysráží ethanolem, fosforyluje polynukleotid-kinázou a ošetří T4 polymerázovou k zaplnění přidaných bází na 3'-konci nepříto-31 CZ 292953 Β6 mných v matrici, které se nacházejí v produktech polymerázové řetězové reakce (Clark, J. M.,

Nucleic Acid Research, 16: 9677 - 9686 (1988)), za použití standardních postupů. Kinazovaný fragment se tupými konci klonuje do místa Hpal v pCIB246, za použití dříve popsaných standardních postupů.

Amplifikace a sestavení čtvrté čtvrtiny

Matrice: U21 - U26 a L22 - L28

Primery pro polymerázovou řetězovou reakci

Přímý:

P7 (a) 5' -TGGTGAAGGG CCCCGGCTTC ACCGG-3'

Obrácený:

P8 (a) 5' -ATCATCGATG AGCTCCTACA CCTGATCGAT GTGGTA-3'

Pár primerů 4: P7(a) + P8(a)

Pár primerů 3: P5(a) + P6(a)

Pár primerů pro overlapping PCR: P7(a) + P8(a)

Produkt polymerázové řetězové reakce:

čtvrtá čtvrtina: GGTGAA________________ATCAGGCGCTCATCGATGAT (484 bp) třetí čtvrtina: TTCCCCCTGTA---------------TTCACCGG (484 bp) druhá čtvrtina: GGTGAA-------CATGATGAT (953 bp)

Miniscreeningem plazmidů se identifikují čtyři pozitivní klony a následně se sekvenují za použití standardních postupů.

Plazmid Bt.P2 #1 obsahuje přibližně správnou sekvenci čtvrté čtvrtiny, pouze se dvěma mutacemi. Tyto mutace jsou v poloze 1523 (substituce A za G, která má za následek změnu aminokyselin, kdy se substituuje histidin za arginin) a v poloze 1634 (substituce T za C, která má za následek substituci aminokyseliny šeřinu za threonin).

Plazmid Bt.P2 #1 se použije pro konstrukci pCIB4414 popsanou níže. (Chyby se nakonec opraví hybridizací všech oligomerů čtvrté čtvrtiny, rozštěpením Apa I a Bst ΕII a nahrazením této oblasti v pCIB4414. Ve finálním konstruktu tudíž zůstanou z Bt.P#l pouze sekvence od polohy 1842-1960).

-32CZ 292953 B6

Příklad 3

Sestavení a oprava finálního syntetického genu

Syntetický gen Bt crylA(b) optimalizovaný pro kukuřici je vytvořen tak, aby se klonoval ve čtvrtinách. Použití polymerázové řetězové reakce má však za následek mutace, kterými jsou ve většině případů delece způsobující mutace čtecího rámce. Plazmidy obsahující jednotlivé čtvrtiny se tudíž sekvenují a správné části se za použití standardních postupů navzájem ligují.

Po získání klonů první a druhé čtvrtiny téměř s požadovanou sekvencí se zkonstruují plazmidy pEB!Q#4 a pEBlQ#5 pro získání požadované sekvence syntetického genu Bt až do místa Dra III v poloze páru bází 634 (tato mutace ničí místo Dra III). Konstrukty pEBlQ se vytvoří ligací fragmentu Eco NI / Bam HI o velikosti 3,9 kb zpPl-8 s fragmentem o velikosti 400 bp 15 z pQl.pEBlQ#5 má požadovanou sekvenci až k místu Dra III, ale pEBlQ#4 má mutaci v poloze páru bází 378.

Pro opravu místa Dra III v pEBlQ#4 a pEBlQ#5 se zkonstruují plazmidy plHlM4 a plHlM5.

Plazmidy plHlM#4 a #5 se vytvoří ligací fragmentu Nco I / Aat II o velikosti 3,5 kb z pEBlQ#4 20 respektive #5 s fragmentem Nco I / Aat II o velikosti 500 bp z pQB5. Plazmid plHlM5 obsahuje mutaci mezi místy Sac II v poloze 884 v druhé čtvrtině syntetického genu Bt. Plazmid plHlM4 obsahuje další mutaci, jakje popsána u jeho výchozího konstruktu pEBlQ#4.

Místo Sac II v oblasti vektoru Bluescript plHlM4 se deletuje rozštěpením plHlM4 pomocí 25 Notl a Sac I a přeměnou těchto míst na tupé konce za použití T4 DNA-polymerázy za standardních podmínek před ligací tohoto fragmentu o velikosti 3,9 kb, kterou se vytvoří plHIM4^AS. Delece místa Sac II ve vektorové oblasti umožňuje odstranění fragmentu Sac II o velikosti 90 bp s mutací v poloze 884 v druhé čtvrtině plHlM4^AS, před nahrazením fragmentem Sac II o velikosti 90 bp. Před rozštěpením Sac II a izolací fragmentu o velikosti 30 90 bp na 2% Nusieve-gelu se oligomery U / L 12 a 13 kinazují a hybridizují (popsáno výše).

Fragment Sac II se liguje do vektoru plHlM4^AS rozštěpeného Sac II o velikosti přibližně 3,8 kb, který byl fosfatázován pomocí CIP. Opravený konstrukt Sac II se nazývá pHYB2#6. Orientace fragmentu Sac II v pHYB2#6 se detekuje screeningem za použití polymerázové řetězové reakce, jakje popsáno dříve, za použití následujících primerů:

MK23A28 = 5'-GGGGCTGCGGATGCTGCCCT-3'

MK25A28 = 5'-GAGCTGACCCTGACCGTGCT-3'

MK26A28 = 5'-CACCTGATGGACATCCTGAA-3'

Provedením polymerázové řetězové reakce s 50 pmoly primerů MK23A28 a MK25A28 se vytvoří fragment o velikosti přibližně 180 bp, což svědčí o tom, že inzertovaný fragment vázaný místy Sac II v pHYB2#6 je ve správné orientaci. Použití primerů MK25A28 a MK26A28 při screeningu pomocí polymerázové řetězové reakce se používá jako negativní kontrola, kdy se 40 vytvoří fragment o velikosti přibližně 180 bp pouze u konstruktů obsahujících fragment vázaný

Sac II ve špatné orientaci. Sekvence pHYB2#6 se stanoví za použití standardních postupů.

pHYB2#6 obsahuje jednu mutaci v poloze 378, která se musí opravit, aby se získala první čtvrtina obsahující požadovanou sekvenci.

-33CZ 292953 B6

Plazmid plHG#6 obsahuje požadovanou sekvenci pro celou první polovinu syntetického genu

BtplHG#6 a vytvoří se z fragmentu Aat II / Nco I o velikosti 3,4 kb zplHlM5#2 ligací s fragmentem Aat II / Nco I o velikosti 500 bp z pHYB2#6.

Pro identifikaci klonů nebo částečných klonů syntetického genu, které obsahují otevřené čtecí rámce, se použije kanamycinový selekční vektor (popsaný výše). Čtvrtá čtvrtina syntetického genu Bt se do kanamycinové kazety umístí jako první. pKM74-4 obsahuje fragment Apa I / Cla I o velikosti přibližně 500 bp z plazmidu BtP2 (který- se předtím transformuje do dam- Escherichia coli kmenu (PO-100), aby jej bylo možné štěpit Cla I), ligovaný spUC:KM74 rozštěpeným Apa I a Cla I. Plazmid pKM74-4 vykazuje rezistenci vůči kanamycinu, ale později se zjistí, že obsahuje dvě substituční mutace v poloze 1523 a 1634 (mutace jsou popsány výše v části popisující klonování čtvrté čtvrtiny, jedná se o substituce, nikoli delece či inzerce).

Správná první polovina syntetického genu Bt z plazmidu plHG#6 se vloží do plazmidu pKM74^l. Výsledný plazmid, nazvaný pKml24 se vytvoří z fragmentu Apa I / Bam HI o velikosti přibližně 3,9 kb, který se získá z pKM74-4, ligovaného s fragmentem Apa I / Bam HI o velikosti 1 kb zplHG#6. pKml24 vykazuje rezistenci vůči kanamycinu. Tento plazmid obsahuje první, druhou a čtvrtou čtvrtinu syntetického genu vytvářející jediný otevřený čtecí rámec.

Do pKml24 se poté klonuje třetí čtvrtina syntetického genu. První funkční klon, v plazmidu pBt:Km#6, je funkční kopií zkráceného syntetického genu crylA(b) v Km-kazetě, která vykazuje rezistenci vůči kanamycinu, ale obsahuje deleční mutace mezi třetí a čtvrtou čtvrtinou. Plazmid pBt:Km#6 se vytvoří z fragmentu Apa I / Nco I o velikosti přibližně 5 kb z vektoru pKM124 ligací s fragmentem Apa I /Nco I o velikosti přibližně 500 bp z pQCN103 (pQCN103 obsahuje mutaci (chybné párování nukleotidů, mismatch mutation) v poloze 1326, která se opraví později). Zdá se, že kontaminující nukleázová aktivita deletovala v pBt:Km#6 místo Apa I mezi třetí a čtvrtou čtvrtinou. Protein Bt kódovaný syntetickým genem v plazmidu pBT:Km#6 vykazuje ve srovnání s nativním proteinem přibližně 50 až 60% aktivitu proti Ostrinia nubilalis. Fragment Srna I / Bam HI o velikosti 2 kb z pBt:Km#6 se vloží do expresívní kazety 35S, čímž se vytvoří plazmid nazvaný 35S:Bt6.

Nejprve se získají dva funkční syntetické klony Bt, každý s mutacemi: plazmidy pBT:KM#6 a pCIB4414. pCIB4414, který je v biologických testech na hmyzu ve srovnání s nativním genem 100% aktivní vůči Ostrinia nubilalis obsahuje substituční mutace ve třetí a čtvrté čtvrtině v polohách 1323, 1523 a 1634.

pCIB4414 se zkonstruuje ze dvou plazmidů, MG3.G4#18 a 1HG, který je popsán výše. MG3.G4#18 se získá pomocí klonování fragmentu Apa I / Κρη I z plazmidu Bt.P2#l do pQCN103 (za použití stejných restrikčních míst). Tím se vytvoří plazmid obsahující třetí a čtvrtou čtvrtinu genu. První polovina syntetického genu se vyštěpí z plazmidu 1HG pomocí Bam HI a Nco I a přesune do MG3.G4#18 (obsahujícího třetí a čtvrtou čtvrtinu genu). Výsledný plazmid, pCIB4414, obsahuje funkční verzi syntetického genu. Ačkoli je funkční, obsahuje syntetický gen v tomto plazmidu tři chyby, v poloze 1326 (G substituován za C), v poloze 1523 (substituce A za G), a v poloze 1634 (substituce T za C).

Čtvrtá čtvrtina vpCIB4414 se nahradí fragmentem Apa I / Bst E II čtvrté čtvrtiny o velikosti 354 bp získaným pomocí hybridizace, ligace a restrikčního štěpení oligomerů čtvrté čtvrtiny, jak je popsáno dříve, a izolací fragmentu na 2% Nusieve-agarózovém gelu. pCIB4408 je klonem syntetického genu Bt získaným pomocí nahrazení fragmentu čtvrté čtvrtiny vpCIB4414 hybridizováným fragmentem čtvrté čtvrtiny. Pro inzerci promotoru CaMV 35S před syntetický gen Bt se pCIB4406 vytvoří z fragmentu Eco NI / Κρη I o velikosti 4 kb z plazmidu p35SBt6 a fragmentu Eco NI / Κρη I o velikosti 1,8 kb z pCIB4408.

-34CZ 292953 B6 pCIB4406 je (při srovnání s proteinem z nativního genu) 100% aktivní proti Ostrinia nubilalis, ale obsahuje substituční mutaci ve třetí čtvrtině syntetického genu v poloze 1323, která má za následek náhradu aminokyseliny leucinu za fenylalanin. Pro opravu této mutace se použije plazmid pBS123#13.

Fragment třetí čtvrtiny v plazmidu pBS123#13 se vytvoří z fragmentu o velikosti přibližně 479 bp vyrobené hybridizací oligomeru. Oligomery třetí čtvrtiny U15 -U20 a L15- L21 se kinázují, hybridizují, a ligují jak je popsáno výše. Polymerázové řetězové reakce se provádějí jak je popsáno výše s příměry p5(a) a P6(b) při 15 cyklech. Produkt polymerázové řetězové reakce se ošetří proteinázou K v konečné koncentraci zhruba 50 pg / ml v objemu přibližně 95 μΐ po dobu 30 minut při 37 °C a následně po dobu 10 minut při 65 °C (Crowe a kol., Nucleic Acid Research 19: 184, 1991). Následně se produkt extrahuje fenolem a chloroformem a vysráží ethanolem za použití standardních postupů, načež se rozštěpí restrikčními enzymy Apa I aNco I.

Fragment Apa I / Nco I o velikosti přibližně 450 bp z polymerázové řetězové reakce se liguje s vektorovým fragmentem Apa I / Nco I o velikosti 3,8 kb zplHG#6, čímž se vytvoří pBS123#13. Plazmid pBS123#13 obsahuje požadovanou sekvenci pro třetí čtvrtinu genu crylA(b) optimalizovaného pro kukuřici od polohy 1319 v místě Nsp I přes místo Apa I v poloze 1493. Tento fragment Nsp I / Apa I o velikosti 170 bp z pBS123#13 se použije v plně aktivním syntetickém genu crylA(b) v plazmidu pCIB4418.

Analýza pomocí western blottingu:

Analýzy různých transformantů pomocí western blottingu (westernového přenosu) se provádí a použití surových extraktů získaných z Escherichia coli pěstovaných na selektivních deskách. Za použití párátka se kultury, které se nechaly růst přes noc při teplotě 37 °C, odeberou z čerstvých desek obsahujících zajímavé transformanty. Pozitivní kontrolou pro expresi genu Bt v Escherichia coli je konstrukt nazvaný pCIB3069, který obsahuje nativní gen Bt-k fúzovaný s promotorem CaMV 35S exprimovatelným v rostlinách. pCIB3069 též obsahuje promotor 35S operabilně spojený s genem rezistence vůči hygromycinu, promotor 35S s intronem Adh č.l operabilně spojený s genem GUS a promotor 35S operabilně spojený s genem kódujícím produkci nativního insekticidního proteinu Bt crylA(b). V analýzách je též zahrnuta negativní kontrola, kterou je Escherichia coli, která neobsahuje gen Bt. Kultury se převedou do suspenze ve 100 μΐ nanášecího pufru (loading buffer) obsahujícího 62 mM Trís-HCI, pH 6,8, 1 % dodecylsulfátu sodného (SDS), 0,0025 % bromfenolové modři, 10 % glycerolu a 7,5 % merkaptoethanolu. Po zahřátí směsi na 95 °C na dobu 10 minut se směs sonikuje po dobu 1 až 3 sekund. Zbytky se centrifugují na mikrocentrifúze při teplotě místnosti po dobu přibližně 5 minut a 10 až 15 μΐ každého vzorku se nanese na akrylamidový gel s 10% gelem (running gel) pod 6% gelem (stacking gel) (Laemmli, Nátuře 227, 680 - 685 (1970)). Po elektroforéze přes noc při 10 mA se proteiny přenesou z gelu na membránu Immobilon (Millipore). Transfer se provede za použití jednotky pro elektroforetický přenos electrophoretic Blotting Unit (Američan Bio-Nuclear, Emeryville, Kalifornie) v transferovém pufru (20 mM Tris, 150 mM glycinu a 20 % methanolu) po dobu 1,5 hodiny při 450 mA.

Mezi pufry pro western blotting patří:

blokující pufr (blocking buffer):

% povrchově aktivního činidla Tween-20, mM Tris-HCl, pH 10,2,

150 mM chloridu sodného,

-35CZ 292953 B6 promývací pufr (wash buffer):

0,05 povrchově aktivního činidla Tween-20, mM Tris-HCl, pH 10,2,

150 mM chloridu sodného, vyvíjecí pufr (developing buffer):

100 mM Tris-HCl, pH 9,6,

100 mM chloridu sodného, mM chloridu hořečnatého

Po dokončení transferu se membrána inkubuje po dobu přibližně 10 minut v blokujícím pufru. Před ošetřením první protilátkou se provede promytí promývacím pufrem třikrát po 15 minutách. První protilátkou je imunoafmitně purifikovaná králičí nebo kozí protilátka připravená za použití proteinu CrylA(b) jako antigenu (Ciba-Geigy, RTP, Severní Karolina, Rockland lne., Gilbertsville, Pensylvánie, a Berkeley Antibody CO., Richmond, Kalifornie). Protilátka specifická proti crylA(b) se ošetří bezprostředně před použitím lyzátem Escherichia coli z Bio-Rad v objemu 1 ml s 5 pg protilátky a 50 μΐ lyzátu Escherichia coli v promývacím pufru. Tato směs se inkubuje po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti, poté se naředí 1 ku 30 a pak na konečné zředění 1 : 6000 promývacím pufrem. Inkubace membrány s první protilátkou probíhá při teplotě místnosti po dobu 1,5 hodiny.

Mezi ošetřením první a druhou protilátkou se provede promytí třikrát po 10 minutách. Druhou protilátkou je buďto králičí proti-kozí, nebo kozí proti—králičí konjugát s alkalickou fosfatázou (Sigma, St. Louis, Montana). Inkubace s konjugátem alkalické fosfatázy se provádí při teplotě místnosti po dobu jedné hodiny za použití zředění promývacím pufrem 1 : 6000. Mezi ošetřením druhou protilátkou a vyvíjením western blottingu se provede promytí šestkrát po 10 minutách. Western blotting se vyvíjí ve 100 ml vyvíjecího pufru s 440 μΐ nitroblue-tetrazolium v 70% dimethylformamidu (75 mg/ml) a 330 μΐ 5-brom-4-chlorindolyl-fosfátu v 100% dimethylformamidu (50 mg / ml). Po vyvíjení po dobu 15 až 30 minut se membrána promyje ve vodě a vysuší vzduchem.

Příklad 4

Konstrukce transformačních vektorů

Konstrukce pCIB710 a derivátů:

Plazmidy pCIB709 a pCIB710 obsahující kazetu promotoru CaMV 35S se zkonstruují jak uvádějí Rothstein a kol., Gene 53: 153 - 161 (1987). pCIB710 obsahuje promotor CaMV a sekvence terminace transkripce pro RNA-transkript 35S (Covey a kol., Nucl. Acids. Res., 9: 6735 - 6747 (1981)). Fragment DNA CaMV vzniklý restrikcí BglII o velikosti 1149 (bp 6494 - 7643 vHohn a kol., Current Topics in Microbiology and Immunology, 96: 194 - 220 a přílohy A až G (1982)) se izoluje z DNA CaMV pomocí preparativní elektroforézy v agarózovém gelu, jak je popsáno drive. Fragment se smíchá sDNA plazmidu pUC19 rozštěpeného BamHI, ošetří T4 DNA-ligázou, a transformuje do Escherichia coli. (Je třeba si uvědomit, že restrikční místo BamHI ve výsledném plazmidu se zničí ligací lepivých konců BglII s lepivými konci BamHI.)

Výsledný plazmid, nazvaný pUC19/35S se poté použije pro oligonukleotidově řízenou mutagenezi in vitro pro inzerci rozpoznávací sekvence pro BamHI GGATCC bezprostředně za nukleotid CaMV 7483 (podle práce Hohn a kol., viz výše). Výsledný plazmid, pCIB710, obsahuje promotorovou oblast CaMV 35S a oblast terminace transkripce oddělenou restrikčním

-36CZ 292953 B6 místem BamHI. Sekvence DNA inzertované do tohoto místa BamHI se v rostlinách exprimují pomocí sekvencí regulujících transkripci CaMV. (Též je třeba si povšimnout, že pCIB710 neobsahuje žádné kodony iniciace translace ATG mezi počátkem transkripce a místem BamHI).

pCIB710 se modifikuje inzercí fragmentu Bam HI obsahujícího kódující sekvenci pro hygromycin-fosfotransferázu zpLG90 (Rothstein a kol., Gene, 53: 153 - 161 (1987)) do místa Bam HI, čímž se vytvoří pCIB709.

pCIB709 se modifikuje pro vytvoření pCIB996 tak, že se odstraní ATG bezprostředně upstream od iniciačního kodonů genu hygromycin-fosfotransferázy a použití standardních technik mutageneze, a do této polohy se inzertuje restrikční místo Bgl II. Výsledný plazmid, pCIB996 se dále modifikuje tak, že se odstraní místa Bam HI, Srna I a Bgl II v 5'-nepřekládané vedoucí oblasti umístěné směrem k 5'-konci od iniciačního kodonů pro iniciační kodon. Výsledkem je změna sekvence bází DNA z -TATAAGGATC CCGGGGGCA AGATCTGAGA TATG-Hyg na -TATAAGGATC TGAGATATG-Hyg. Výsledný plazmid se označí pCIB3073.

Alternativně se pCIB710 modifikuje pro vytvoření pCIB900 tak, že se inzertuje do místa Bam HI vpCIB710 fragment Bam HI - Bel I z pCIB10/35SBt, který obsahuje kódující sekvenci Bt pro 645 aminokyselin, popsanou níže v části C4, čímž se vytvoří pCIB710/35SBt. Pro zavedení markéru rezistence vůči antibiotiku se pCIB709 rozštěpí Sal I, liguje se adaptor Κρη I / Sal I a výsledný produkt ligace se rozštěpí Κρη I. Fragment Κρη I zpCIB709, který obsahuje 35S / gen rezistence vůči hygromycinu se inzertuje do místa Κρη I v pCIB710/35SBt, čímž se vytvoří pCIB900.

Mezi geny, které lze použít jako selektabilní markéry, patří gen rezistence vůči hygromycinu, který popsali Rothstein a kol., Gene 53: 153 - 161 (1987). Gen rezistence vůči hygromycinu popsaný v tomto odkazu se přenese do plazmidu pUC jako je pCIB710 nebo pCIB709 a ATG obsažený „navíc“ upstream od sekvence kódující hygromycin-fosfotransferázu se odstraní, čímž se vytvoří pCIB996. Tento modifikovaný gen pCIB996 se dále modifikuje tak, že se odstraní místa BglII, BamHI a Sami z 5'-koncové oblasti genu za použití standardních postupů molekulární biologie, čímž se vytvoří pCIB3073.

pCIB932 je plazmid na bázi pUC19, který obsahuje chimérický gen Pep-C: promotor / Bt / Pep-C: terminátor. Je složen z fragmentů získaných zpPEP-10, HindlII-subklonu genomového klonu, Hl-!ambda-14 PNAS USA, 83: 2884 - 2888 (1986), z kukuřičného genu kódujícího enzym fosfoenol-pyruvát-karboxylázu aktivní ve fotosyntéze, a z pCIB930, což je fragment BamHI obsahující zkrácenou formu endotoxinového genu crylAb o velikosti 645 aminokyselin v místě BamHI v pUC18.

Fragment EcoRI - Xhol o velikosti 2,6 kb zpPEP-10, obsahující polyadenylační místo z genu fosfoenolpyruvát-karboxylázy, se izoluje a rozštěpí Pst I a HincII. Štěp vzniklý restrikčním štěpením se liguje s pUC18 rozštěpeným Pstl a HincII, transformuje do Escherichia coli a mezi transformanty se vyhledají ty, které obsahují inzert Pstl - HincII o velikosti 412 bp v pUC18, a inzert se ověří sekvenováním. Výsledný plazmid se nazývá pCIB931.

Jaderný gen kódující izoenzym fosfoenolpyruvát-karboxylázy („Pep-C“) popsali Hudspeth a kol., Plant Molecular Biology, 12: 579 - 589 (1989). pCIBV932 se zkonstruuje ligací tří fragmentů. První fragment, obsahující terminátor transkripce fosfoenolpyruvát-karboxylázy se získá pomocí štěpení pCIB931 úplně HindlII a částečně Sphl a izolace fragmentu o velikosti 3098 bp. Druhý fragment, obsahující kódující sekvenci endotoxinu Bt se získá pomocí rozštěpení pCIB930 Ncol a Sphl a izolace fragmentu o velikosti 1950 bp. Třetí fragment, obsahující promotor fosfoenolpyruvát-karboxylázy se získá pomocí štěpení pEP-10 úplně HindlII, částečně Nco I a izolace fragmentu o velikosti 2,3 kb. Ligační směs se transformuje do Escherichia coli, transformanty se správným inzertem se identifikují, a inzert se ověří sekvenováním.

-37CZ 292953 B6 pCIB932 se rozštěpí PvuII, čímž se vytvoří fragment o velikosti 4,9 kb obsahující kukuřičný gen Pep-C: promotor / Bt / Pep-C: terminátor, který se purifikuje na 1% agarózovém gelu (s agarózou s nízkou teplotou gelovatění) v IX TAE. Linearizovaný vektor pCIB3079 a inzert o velikosti 4,9 kb z pCIB932 se ligují za použití T4 DNA-ligázy v agaróze s nízkou teplotou gelovatění, čímž se vytvoří pCIB4401. pCIB4401 je transformační vektor pro kukuřici, který obsahuje chimérické geny 35S: promotor / PAT / 35S: terminátor, Pep-C: promotor / Bt / Pep-C: terminátor, a 35S: promotor / Adhl intron č. 1 / Gus / 35S: terminátor.

Konstrukce pCIB246 (35S - GUS - 35S):

Kazeta s promotorem CaMV 35S, pCIB246, se zkonstruuje následovně.

Restrikční místo Ddel v nukleotidové poloze 7482 genomu CaMV (Franck a kol., Cell, 21: 285 - 294 (1980)) se modifikuje inzercí oligonukleotidu o velikosti 48 bp, který obsahuje několik rozpoznávacích míst pro restrikční enzymy, včetně místa Ncol (CCATGG), místa Sáli (GTCGAC) a místa Sstl (GAGCTC). Tento změněný promotor CaMV 35S se inzertuje do vektoru pUC19, který se předtím modifikuje tak, že se zničí místa Sstl a Sáli vektoru. Promotor CaMV 35S v pCIB1500 tedy obsahuje jedinečná místa Sstl a Sáli pro klonování.

pCIB1500 se rozštěpí Sstl a Ncol a liguje s genem GUS (glukuronidázy) získaným zpBI221 (Clontech Laboratories, lne., Palo Alto, Kalifornie). Místo Ncol se fúzuje s genem GUS tak, že ATG vmiste Ncol působí jako startovací kodon pro translaci genu GUS. Pro 3'-konec chimérického genu se použijí polyadenylační signál a terminační signál z CaMV 35S.

Konstrukce pCIB3069 (35S - Adhl - GUS - 35S):

pCIB246 se modifikuje tak, že se do místa Sal I v pCIB246 přidá intron č. 1 genu alkohol-dehydrogenázy Adhl kukuřice (Adhl) (Dennis a kol., Nucleic Acids Research, 12: 3983 - 4000 (1984)), čímž se vytvoří plazmid pCIB3007. Intron Adhl se vyštěpí z genu Adhl kukuřice jako fragment Bal I / Pst I a subklonuje se do pUC18 rozštěpeného Sami a Pst I, čímž se vytvoří plazmid nazvaný Adh 1026. Adh 1026 se rozštěpí Pvu II a Sac II, konce fragmentů se otupí T4 DNA-polymerázou, za použití standardních postupů se přidají linkery Sal I, fragment o velikosti přibližně 560 bp se izoluje z 3% NuSieve-gelu a liguje do pUC18 rozštěpeného Sal I a ošetřeného fosfatázou. Adh intron č. 1 navázaný Sal I ve výsledném plazmidu se vyštěpí Sal I, purifikuje v gelu, a liguje do pCIB246 rozštěpeného Sal I a ošetřeného fosfatázou, čímž se získá plazmid pCIB3007.

pCIB3007 se rozštěpí Pstl a konce se otupí za použití T4 DNA-polymerázy (New England Biolabs) podle pokynů dodavatele. Výsledné molekuly s tupými konci se rozštěpí Sphl a fragment o velikosti přibližně 5,8 kb s jedním tupým koncem a druhým koncem Sph I se purifikuje na agarózovém gelu s nízkou teplotou gelovatění za použití standardních postupů. pCIB900 se rozštěpí Srna I a Sph I a fragment obsahující gen 35S / Bt se purifikuje na agarózovém gelu s nízkou teplotou gelovatění. Tyto dva gelově purifikované fragmenty se ligují v agaróze s nízkou teplotou gelovatění za použití T4 DNA-ligázy za standardních podmínek. Výsledné ligované fragmenty se transformují do Escherichia coli za použití standardních postupů a výsledný plazmid se nazve pCIB3062. Existují dvě verze pCIB3062. pCIB3062#l má regenerované místo Srna I v místě ligace místa Srna I a konců otupených T4 polymerázou, což je pravděpodobně následkem toho, že T4 polymeráza odštěpila během reakce sloužící k otupení konců několik párů bází z místa Pst I. pCIB3062#3 toto místo Smál neobsahuje.

pCIB3062#3 se rozštěpí KpnI, konce se otupí za použití T4 DNA-polymerázy a následně se provede štěpení Pvu II, čímž se získá fragment o velikosti 6,4 kb s tupými konci obsahující geny 35S / GUS a 35S / Bt. Tento fragment s tupými konci se liguje do pCIB3073 rozštěpeného Srna I, čímž se vytvoří pCIB3063 nebo pCIB3069. pCIB3069 obsahuje stejný fragment jako se použije pro vytvoření pCIB3036, ale chimérické geny jsou v pCIB3069 na rozdíl od pCIB3063 všechny

-38CZ 292953 B6 ve stejné relativní orientaci. Tyto plazmidy obsahují a) promotor 35S operabilně spojený s genem rezistence vůči hygromycinu, b) promotor 35S, s Adh intronem č.l, operabilně spojený s genem

GUS, a c) promotor 35S operabilně spojený s genem kódujícím produkci syntetického insekticidního proteinu crylA(b) z Bacillus thuringiensis, jak je popsán výše.

GUS-testy:

GUS-testy se provádějí v podstatě jak popsal Jefferson, Plant Mol. Bio. Reportér, 5: 387 - 405 (1987). Jak je uvedeno výše, obsahuje plazmid pCIB246 promotor CaMV 35S fúzovaný s genem GUS. 5'-nepřekládaná vedoucí oblast tohoto chimérického genu obsahuje kopii Adhl intronu č. 1 kukuřice. Používá se zde jako transformační kontrola. Ačkoli se ke každé transformaci přidává stejné množství pCIB246, vypočítaná aktivita mezi testovanými konstrukty Bt se liší. Hodnoty uvedené níže tvoří průměr ze tří opakování. pCIB4407 se testuje dvakrát.

pCIB 3069 28 nM MU/pg/min, pCIB4407 0,7 nM MU/pg/min, 2,3 nM MU/pg/min.

Příklad 5 A

Test insekticidní aktivity syntetického genu crylA(b) proti Ostrinia nubilalis

U syntetického genu crylA(b) v pCIB4414 v Escherichia coli se testuje jeho insekticidní aktivita proti Ostrinia nubilalis podle následujícího postupu.

Tekutá umělá potrava pro hmyz se nalije do petriho misky (Gellman) o průměru 60 mm. Po jejím ztuhnutí se na povrch nanesou v koncentraci 3 x 10⁷ buněk/cm² buňky Escherichia coli suspendované v 0,1% preparátu Triton X-100. Desky se vysuší vzduchem. Na povrch potravy se poté umístí deset larev prvního instaru zavíječe kukuřičného, Ostrinia nubilalis, starých méně než 12 hodin. Test se inkubuje při 30 °C v úplné tmě po dobu 2 až 5 dnů. Na konci testu se stanoví procento mortality. Za pozitivní klon se považuje takový klon, který způsobuje mortalitu 50 % nebo vyšší, přičemž kontrolní buňky Escherichia coli způsobují mortalitu 0 až 10 % jako pozadí.

Pro srovnání se ve stejné koncentraci testuje nativní gen crylA(b) v pCIB3069. Klony se testují v koncentraci 3 x 10⁷ buněk / cm² potravy, používá se 20 jedinců hmyzu na klon.

Zjistí se následující výsledky:

Klon	Procento mortality
kontrola	0
pCIB3069	100
pCIB4414	100

Uvedené výsledky svědčí o tom, že insekticidní krystalický protein produkovaný syntetickým genem crylA(b) vykazuje aktivitu proti Ostrinia nubilalis srovnatelnou s insekticidním proteinem produkovaným nativním crylA(b). Ostatní plazmidy obsahující syntetický gen crylA(b) se testují podobným způsobem.

-39CZ 292953 B6

Příklad 5B

Test insekticidní aktivity proteinu crylA(b) proti Diatraea saccharalis

CrylA(b) se exprimuje v Escherichia coli a testuje se jeho insekticidní aktivita proti Diatraea saccharalis podle stejného postupu jako pro Ostrinia nubilalis, který je popsán bezprostředně výše. Výsledky jsou shrnuty v tabulce.

Tabulka

Test proteinu Bt z Escherichia coli s Diatraea saccharalis

Koncentrace proteinu (ng/g)	Procento mortality CrylA(b)
10	0
25	0
50	7
100	13
250	40
500	53
1000	80
LC50	380
95% Cl	249 - 646

Výsledky svědčí o tom, že insekticidní protein produkovaný genem Bt optimalizovaným pro kukuřici je účinný proti Diatraea saccharalis. Výše uvedených koncentrací proteinu CrylA(b), 250 ng / g - 1000 ng / g, lze dosáhnout v transgenických rostlinách kukuřice vytvořených podle vynálezu.

Příklad 6

Izolace protoplastů kukuřice a transformace syntetickým genem Bt

Exprese syntetického genu Bt se testuje v dočasně transformovaných protoplastech kukuřice.

Postup izolace protoplastů:

1. Obsah deseti suspenzních kultur kukuřičné 2717 linie 6 starých dva dny se pipetuje do sterilních zkumavek o objemu 50 ml a nechá se usadit. Kultivační médium se poté zcela odstraní.

2. Buňky (3 až 5 ml objemu (Packed Cell Volume)) se převedou do suspenze v 30 ml protoplastového enzymového roztoku následujícího složení:

% cellulasy RS, % macerozymu R10 v KMC-pufru.

KMC-pufr (předpis na 1 litr):

chlorid draselný 8,65 g hexahydrát chloridu hořečnatého 16,47g dihydrát chloridu vápenatého 12,50g morfolinethansulfonová kyselina5,0 g pH 5,6, sterilizováno filtrací

-40CZ 292953 B6

3. Buňky se důkladně promíchají a vzorky o objemu přibližně 15 ml na misku se nanesou do petriho misek o rozměrech 100 x 25 mm. Misky se třepou na třepačce s rotačním výkyvem po dobu 4 hodin, aby došlo ke štěpení.

4. Na každé používané síto o velikosti otvorů 100 pm se pipetuje 10 ml KMC a přes síto se zfiltruje obsah misek. Síto se promyje stejným objemem KMC.

5. Protoplasty přefiltrované přes síto se pipetují opatrně do kyvet o objemu 50 ml a centrifugují na centrifúze Beckman TJ-6 po dobu 10 minut při 1000 otáčkách za minutu (500 g).

6. Supematant se odstraní a peleta se opatrně převede do suspenze v 10 ml KMC. Obsah tří kyvet se smíchá a objem se upraví KMC na 50 ml.

7. Centrifugace a promytí se opakuje podle výše uvedených kroků.

8. Všechny promyté protoplasty se převedou do suspenze v 50 ml KMC a spočítají se v hemocytometru. Protoplasty se centrifugují a opět převedou do suspenze v koncentraci 8x 10⁶/ml v suspendovacím pufru (RS-pufru).

RS-pufr (předpis na 500 ml):

mannitol chlorid vápenatý (0,lM zásobní roztok) morfolinethansulfonová kyselina pH 5,8, sterilizováno filtrací.

27,33 g 75 ml 0,5 g

Postup transformace protoplastů:

1. 50 pg plazmidové DNA (konstruktů insekticidních proteinů Bt, jak syntetického (pC!B4407), tak nativního (pCIB3069)) se vloží do polystyrénových kultivačních zkumavek o objemu 15 ml. Do všech zkumavek se též přidá 25 pg plazmidové DNA obsahující GUS (která neobsahuje insekticidní protein Bt (pCIB246). Pro každý testovaný konstrukt se provádějí tři opakování, s jedním opakováním neobsahujícím žádnou DNA jako kontrolou.

konstrukty Bt:

konstrukty GUS:

pCIB3069 pCIB246 pCIB4407

2. Protoplasty se opatrně, ale dobře promíchají a přidá se jich 0,5 ml do každé zkumavky.

3. Do každé zkumavky se přidá 0,5 ml PEG—40.

PEG^IO:

0,4 M mannitolu,

0,1 M tetrahydrátu dusičnanu vápenatého, pH 8,0, sterilizováno filtrací.

4. Obsah se opatrně promíchá, aby se protoplasty smíchaly s PEG a počká se 30 minut.

5. Postupně se přidá v intervalech 5 minut 1 ml, 2 ml a 5 ml roztoku W5.

Roztok W5

154 mM chloridu sodného,

125 mM hydrátu chloridu vápenatého, mM chloridu draselného, mM glukózy, pH 7,0 sterilizováno filtrací.

6. Provede se centrifugace po dobu 10 minut v centrifuze Beckman TJ-6 při přibližně 1000 otáčkách za minutu (500 g) a supernatant se odstraní.

7. Peleta se opatrně převede do suspenze v 1,5 ml FW-média a suspenze se nanese opatrně do

petriho misek o rozměrech 35 x 10 mm.
FW-médium (předpis pro 1 litr):
MS-soli	4,3 g
200X B5 vit.	5 ml
sacharóza	30 g
prolin	1,5 g
mannitol	54 g
2,4 D (2,4-dichlorfenoxyoctová kyselina)	3 mg

pH 5,7, sterilizováno filtrací.

8. Směs se inkubuje přes noc ve tmě při teplotě místnosti.

9. Provedou se GUS-testy, biologické testy na hmyzu a ELISA-testy protoplastových extraktů, jak je popsáno níže.

Příklad 7

Konstrukce syntetického genu crylA(b) optimalizovaného pro kukuřici o plné délce

Sekvence 4 znázorňuje syntetickou sekvenci optimalizovanou pro kukuřici, která kóduje insekticidní protein crylA(b) o plné délce z Bacillus thuringiensis. Zkrácená verze, která je popsána výše, představuje prvních přibližně 2 kb tohoto genu. Zbytek genu o plné délce se klonuje za použití výše popsaných postupů. Ve stručnosti, do tohoto postupu patří syntéza DNAoligomerů o délce 40 až 90 nukleotidů, typicky za použití 80-merů jako průměrné velikosti. Oligomery se purifíkují za použití standardních postupů kapalinové chromatografie s vysokou rozlišovací schopností (HPLC) nebo izolace z polyakrylamidového gelu. Purifikované oligomery se kinasují a hybridizují, čímž se vytvoří fragmenty o velikosti přibližně 500 bp. Hybridizované oligomery lze amplifikovat za použití polymerázové řetězové reakce za standardních podmínek. Fragmenty o velikosti 500 bp, buďto přímo získané hybridizací, amplifikací pomocí polymerázové řetězové reakce, či izolované z agarózových gelů po hybridizací nebo amplifikací pomocí polymerázové řetězové reakce se poté klonují do plazmidu a transformují do Escherichia coli za použití standardních postupů.

Rekombinantní plazmidy obsahující požadované inzerty se identifikují, jak je popsáno výše, za použití polymerázové řetězové reakce nebo/a standardního miniscreeningu. Inzerty, které na základě analýzy pomocí polymerázové řetězové reakce nebo/a pomocí restrikčních enzymů vypadají jako správné, se sekvenují, aby se identifikovaly klony obsahující požadovaný otevřený čtecí rámec. Fragmenty se poté ligují se syntetickou sekvencí o velikosti přibližně 2 kb popsanou

-42CZ 292953 B6 v příkladu 2, čímž se vytvoří syntetický gen crylA(b) optimalizovaný pro kukuřici o plné délce, vhodný pro expresi vysokých množství proteinu CrylA(b) v kukuřici.

Obsah G + C v nativních a syntetických genech Bt:

nativní gen o plné délce zkrácený nativní gen syntetický gen o plné délce zkrácený syntetický gen

38.8 %

37,2 %

64.8 %

64,6 %.

Procento homologie finální zkrácené verze genu Bt při porovnání s genem obsahujícím pouze kodony preferované kukuřicí činí 98,25 %.

Příklad 8

Konstrukce hybridního genu crylA(b) částečně optimalizovaného pro kukuřici o plné délce exprimovatelného v rostlině pCIB4434 obsahuje gen CrylA(b) o plné délce tvořený syntetickým genem crylA(b) optimalizovaným pro kukuřici o velikosti přibližně 2 kb se zbytkem genu (část kódující C-konec) získaným z nativního genu. Kódující oblastí je tedy chimérický gen tvořený syntetickým genem a nativním genem, ale výsledný protein je identický s nativním proteinem crylA(b). Syntetická oblast je tvořena nukleotidy 1 - 1938 (aminokyseliny 1 až 646) a nativní kódující sekvence je tvořená nukleotidy 1939 až 3468 (aminokyseliny 647 až 1155). Sekvence tohoto genu je uvedena na obrázku 7. Mapa pCIB4434 je znázorněna na obrázku 8.

Pro vytvoření pCIB4434 byly zkonstruovány následující oligomery:

KE134A28 = 5'-CGTGACCGAC TACCACATCG ATCAAGTATC CAATTTAGTT

GAGT-3'

KE135A28 = 5'-ACTCAACTAA ATTGGATACT TGATCGATGT GGTAGTCGGTC

ACG-3'

KE136A28 = 5' -GCAGATCTGA GCTCTTAGGT ACCCAATAGC GTAACGT-3'

KE137A28 = 5'-GCTGATTATG CATCAGCCTAT-3'

ΚΕ138Α2Θ = 5'-GCAGATCTGA GCTCTTATTC CTCCATAAGA AGTAATTC-3'

MK05A28 = 5'-CAAAGGTACC CAATAGCGTA ACG-3'

MK35A28 = 5'-AACGAGGTGT ACATCGACCG-3'

-43CZ 292953 B6 pCIB4434 se vytvoří ligací čtyř částí z fragmentu zpCIB4418 o velikosti 5,7 kb, fragmentu

Bst E II / Κρη I z fúze syntetického a nativního genu vytvořené pomocí polymerázové řetězové reakce o velikosti 346 bp, fragmentu Κρη I / Nsi I nativního crylA(b) zpCIB1315 o velikosti

108 bp a fragmentu Nsi I / Bgl II vytvořeného pomocí polymerázové řetězové reakce o velikosti

224 bp. Standardní podmínky pro ligaci a transformaci jsou popsány dříve.

Fragment fúze syntetického a nativního genu se vytvoří ve dvou krocích za použití polymerázové řetězové reakce. Prvních 253 bp fúzního fragmentu vytvořeného pomocí polymerázové řetězové reakce se připraví za použití 100 pmol oligomerů KE134A28 a MK04A28 s přibližně 200 ng nativní matrice crylA(b) v objemu 100 μΐ s 200 nm každého z deoxyribonukleotidtrifosfátů, IX PCR-pufrem (Perkin Elmer Cetus), 20% glycerolem a 5 jednotkami Taq polymerázy (Perkin Elmer Cetus). Parametry prováděné polymerázové řetězové reakce jsou následující: 1 minuta při 94 °C, 1 minuta při 55 °C, 45 sekund při 72 °C, s prodloužením třetího kroku o 3 sekundy, počet cyklů je 25. Část (1 %) produktu této první polymerázové řetězové reakce se použije jako matrice spolu s 200 ng syntetické DNA crylA(b) pro vytvoření kompletního fragmentu fúze syntetického a nativního genu o velikosti 351 bp. Oligomery použité jako primery pro polymerázovou řetězovou reakci v této druhé polymerázové řetězové reakci jsou MK34A28 (50 pmol), MK04A28 (50 pmol) a KE135A28 (25 pmol). Reakční směs pro polymerázovou řetězovou reakci a parametry této reakce jsou stejné, jako je uvedeno výše. Výsledný fragment fúze syntetického a nativního genu o velikosti 351 bp se ošetří proteinázou K v celkové koncentraci 50 pg / ml, extrahuje fenolem a chloroformem a následně se vysráží ethanolem před rozštěpením Bst E II a Κρη I za standardních podmínek.

Fragment Nsi I / Bgl II vytvořený pomocí polymerázové řetězové reakce o velikosti 224 bp použití pro konstrukci pCIB4434 se vytvoří za použití 100 pmolů oligomerů KE137A28 aKE138A28 a 200 ng nativního genu crylA(b) jako matrice v objemu 100 μζ přičemž jsou reakční směs pro polymerázovou řetězovou reakci a parametry této reakce stejné, jako je uvedeno výše. Fragment nativního crylA(b) vytvořený pomocí polymerázové řetězové reakce o velikosti 230 bp se ošetří proteinázou K, extrahuje fenolem a chloroformem a před rozštěpením Bst E II a Κρη I se vysráží ethanolem, jak je popsáno výše.

pCIB4434 se transformuje do protoplastů kukuřice, jak je popsáno výše. Protoplasty linie 6 2717 se použijí s pCIB4434 a pCIB4419 jako kontroly pro srovnání. Výsledky jsou uvedeny níže:

ng Bt / mg proteinu

4419 (35S)

4434 (o plné délce)

400 ±2100

2200 ± 900 pozadí = 13 ng Bt / mg proteinu pro netransformované protoplasty

Výsledky svědčí o tom, že se pCIB4434 exprimuje při porovnání spCIB4419 v množství odpovídajícím přibližně 15 %.

Analýza pomocí western blottingu dokazuje, že alespoň jedna třetina proteinu crylA(b) vytvořeného v tomto systému za použití pCIB4434 má velikost přibližně 130 kD. V buňkách kukuřice se tedy pomocí exprese pCIB4434 vytváří významné množství proteinu crylA(b) o plné délce.

-44CZ 292953 B6

Příklad 7

Konstrukce genů crylA(b) o plné délce kódujících teplotně stabilní protein crylA(b)

Konstrukty pCIB5511 - 5515, z nichž každý obsahuje gen crylA(b) o plné délce, jsou popsány níže. V těchto sekvencích se opraví mezi aminokyselinami 793 a 794 delece 26 aminokyselin, KCGEPNRCAPHLEWNPDLDCSCRDGE, které jsou přítomny v crylA(a) a crylA(c), ale ne vcrylA(b). Gen v pCIB5513 je syntetický, zbylé čtyři geny jsou hybridní, a jsou tedy částečně optimalizované pro kukuřici.

Konstrukce pCIB5511:

Tento plazmid je derivátem pCIB4434. Mapa pCIB5511 je znázorněna na obrázku 10. Segment DNA o velikosti 435 bp mezi nukleotidy 2165 a 2590 se zkonstruuje hybridizací syntetických oligomerů vytvořených tak, že představují horní a dolní řetězec, jak je popsáno výše pro konstrukci zkráceného genu crylA(b). Tento segment syntetické DNA se syntetizuje za použití standardních postupů známých v oboru a zahrnuje 26 aminokyselin, která jsou přirozeně deletovány v proteinu crylA(b) z Bacillus thuringiensis kurstaki HD-1. Celý inzertovaný segment DNA používá ke kódování aminokyselin kodony preferované kukuřicí. V tomto fragmentu je obsaženo 26 aminokyselin použitých pro opravu přirozeně se vyskytující delece. Inzertují se do pCIB4434 počínaje polohou 2387 mezi místo Κηρ I (nukleotid 2170) a místo Xbal (nukleotid 2508, v pCIB5511 2586). pCIB5511 se zkonstruuje pomocí ligace tří částí za použití fragmentu o velikosti 3,2 kb získaného restrikčním štěpením pCIB4434 sphl a KpnI, fragmentu o velikosti 3,8 kb získaného štěpením pCIB4434 Sphl a Xbal, a fragmentu o velikosti 416 bp získaného štěpením syntetické DNA popsané výše KpnI a Xbal. Enzymatické reakce se provádějí za standardních podmínek. Po ligace se směs DNA transformuje do kompetentních buněk Escherichia coli za použití standardních postupů. Transformanty se selektují na L-agaru obsahujícím ampicillin v množství 100 pg / ml. Plazmidy v transformantech se charakterizují za použití standardního miniscreeningu. Sekvence opraveného genu crylA(b) kódujícího teplotně (tepelně) stabilní protein crylA(b) je znázorněna na obrázku 9.

Konstrukce pCIB5512:

Tento plazmid je derivátem pCIB4434. Mapa pC!B5512 je znázorněna na obrázku 12. DNA pro opravu delece 26 aminokyselin se připraví za použití standardních technik syntézy DNA a enzymatických reakcí. Připraví se tři kazety dvouřetězcové DNA, pGFcal, pGFcas2 a pGFcas3, z nichž každá má velikost přibližně 300 bp. Kazety se vytvoří tak, aby obsahovaly kodony optimalizované pro kukuřici, při zachování 100% aminokyselinové identity s insekticidním proteinem. Tyto kazety se použijí k nahrazení oblasti mezi restrikčními místy BstEII v poloze 1824 a Xbal v poloze 2508 a obsahují inzerci dalších 78 bp, které kódují chybějících 26 aminokyselin (popsány výše pro pCIB5511 a pCIB4434). Každá z těchto kazet se klonuje do místa EcoRV vektoru Bluescript (Stratagene) pomocí standardních postupů. Uvedené tři kazety jsou vytvořeny tak, že obsahují překrývající se restrikční místa. Kazeta 1 má na 5'-konci restrikční místo BstEII a na 3'-konci EcoRV, kazeta 2 má na 5'-konci místo EcoRV a na 3'-konci Clal a kazeta 3 má na 5'-konci místo Clal a na 3'-konci Xba I. Klonují se jednotlivě do vektoru Bluescript a kompletní fragment o velikosti 762 bp se následně sestaví ligací za použití standardních postupů. pCIB5512 se sestaví za použití tohoto fragmentu o velikosti 762 bp jeho ligací s fragmentem o velikosti 6,65 kb získaným úplným štěpením pCIB4434 BstEII a částečným štěpením Xbal. Alternativně se může použít ligace čtyř částí používající stejný vektor a tři kazety rozštěpené specifickými enzymy. Enzymatické reakce se provádí za standardních podmínek. Po ligaci se směs DNA transformuje do kompetentních buněk Escherichia coli za použití standardních postupů. Selekce transformantů se provádí na L-agaru obsahujícím ampicillin v množství 100 pg / ml. Plazmidy v transformantech se charakterizují za použití standardního miniscreeningu. Výsledný plazmid je pCIB5512. Sekvence opraveného genu crylA(b) je uvedena na obrázku 11. Tento opravený crylA(b) se liší od genu obsaženého

-45CZ 292953 B6 vpCIB5511 tím, že je za použití kodonů preferovaných kukuřicí optimalizována pro expresi v kukuřici větší část kódující oblasti crylA(b).

Konstrukce pCIB5513:

Tento plazmid obsahuje opravený gen crylA(b) získaný zpCIB5512. Mapa pCIB55l3 je znázorněna na obrázku 14. Oblast směrem k 3'-konci od místa Xbal v poloze 2586 do konce genu (místo BglII v poloze 3572) se zcela zamění kodony optimalizovanými pro kukuřici. Tato oblast se syntetizuje za použití standardních technik syntézy DNA a enzymatických reakcí, ío známých v oboru, ve formě čtyř kazet dvouřetězcové DNA (kazety č. 4, 5, 6, 7). Sousedící kazety mají překrývající se restrikční místa pro usnadnění spojení kazet. Jedná se o místa Xbal a Xhol na 5'-konci respektive 3'-konci kazety 4, Xhol a Sací na 5'-konci respektive 3'-konci kazety 5, Sací a BstXI na 5'-konci respektive 3'-konci kazety 6 a BstXI a BglII na 5'-konci respektive 3'-konci kazety 7. Jak je popsáno v případě pCIB5512, kazety se klonují do místa EcoRV 15 s otupenými konci vektoru Bluescript (Stratagene) a „opravený“ gen crylA(b) o plné délce se klonuje buď postupným sestavením výše uvedených kazet ve vektoru Bluescript následovaným ligací kompletní syntetické oblasti o velikosti 967 bp s fragmentem o velikosti 6448 bp získaným úplným štěpením pCIB5512 BglII a částečným štěpením Xbal. Alternativně se plazmid obsahující geny o plné délce získá ligací pěti částí každé ze čtyř kazet (po štěpení příslušnými 20 enzymy) a stejného vektoru, jako je uvedeno výše. Sekvence „opraveného“ genu crylA(b) o plné délce je znázorněna na obrázku 13. Různé chimérické kódující oblasti, syntetické a skládající se ze syntetické a nativní části, kódují stejný protein. Tento protein je tepelně stabilní verzí crylA(b) vytvořenou pomocí opravy přirozeně se vyskytující delece 26 aminokyselin nacházející se, při srovnání homologické oblasti s delta-endotoxiny crylA(a) nebo crylA(c) z Bacillus thuringiensis, 25 v genu crylA(b) z Bacillus thuringiensis kurstaki HD-1.

Konstrukce pCIB5514:

Tento plazmid je derivátem pCIB4434. Mapa pCIB5514 je znázorněna na obrázku 16. Vytvoří se 30 za použití kazety syntetické DNA č. 3 (viz výše), která obsahuje sekvenci optimalizovanou pro kukuřici oblasti mezi místem Clal (v poloze 2396) nacházejícím se v termostabilní oblasti 26 aminokyselin a místem Xbal v poloze 2508 v pCIB4434 (v pCIB5511 2586). Oblast mezi nukleotidem 2113 v pCIB4434 a spojením termostabilní oblasti se amplifikuje pomocí polymerázové řetězové reakce za použití pCIB4434 jako matrice s následujícími primery:

přímý:

’ GCACCGATATCACCATCCAAGGAGGCGATGACGTATTCAAAG-3' obrácený:

5' -AGCGCATCGATTCGGCTCCCCGCACTTGCCGATTGGACTTGGGGCTGAAAG-3'

Produkt polymerázové řetězové reakce se poté rozštěpí restrikčními enzymy KpnI a Clal a liguje se reakcí obsahující čtyři části s fragmentem o velikosti 189 bp získaným štěpením kazety 3 Clal a Sbal, fragmentem o velikosti 3,2 kb zpCIB4434 rozštěpeného Sphl a KpnI a fragmentu o velikosti 3,8 kb zpCIB4434 získaného rozštěpením Sphl a Xba. Enzymatické reakce se provádějí za standardních podmínek. Produkt ligace se transformuje do kompetentních buněk 45 Escherichia coli, selektuje pomocí ampicillinu a provede se screening za použití standardních postupů popsaných výše. Sekvence opraveného genu crylA(b) obsažená v pCIB5514 je znázorněna na obrázku 15.

-46CZ 292953 B6

Konstrukce pCIB5515:

pCIB4434 se modifikuje přidáním výše popsaného Geiserova termostabilního elementu (GeiserTSE) mezi místo Κρη I (v poloze 2170 bp) a místo Xba I (v poloze 2508 bp) v nativní oblasti Btk. Přesně místo inzerce začíná nukleotidem č. 2379. Oblast obsahující Geiser TSE se amplifikuje za použití dvou sad polymerázových řetězových reakcí, tj. polymerázové řetězové reakce fragmentu Κρη I - Geiser TSE a fragmentu Geiser TSE - Xba I.

Primer č. 1 pro polymerázovou řetězovou reakci (místo Κρη I)

5' ~ ATTACGTTAC GCTATTGGGT ACCTTTGATG - 3*

Primer č. 2 pro polymerázovou řetězovou reakci (Geiser TSE, spodní část)

5' - TCCCCGTCCC TGCAGCTGCA GTCTAGGTCC GGGTTCCACT

CCAGGTGCGG AGCGCATCGA TTCGGCTCCC CGCACTTGCC

GATTGGACTT GGGGCTGA - 3'

Primer č. 3 pro polymerázovou řetězovou reakci (Geiser TSE, vrchní část)

5' - CAAGTGCGGG GAGCCGAATC GATGCGCTCC GCACCTGGAG

TGGAACCCGG ACCTAGACTG CAGCTGCAGG GACGGGGAAA

AATGTGCCCA TCATTCCC -3'

Primer č. 4 pro polymerázovou řetězovou reakci (místo Xba I)

5* - TGGTTTCTCT TCGAGAAATT CTAGATTTCC - 3'

Po amplifikaci se fragmenty vzniklé polymerázovou řetězovou reakcí rozštěpí Κρη I a Cla I, respektive Cla I a Xba I. Tyto fragmenty se ligují do pCIB4434 rozštěpeného Κρη I a Xba I. Výsledný konstrukt pCIB5515 je pCIB4434 s Geiser TSE a přidaným místem Cla I lemovaným Κρη I a Xba I. Mapa pCIB5515 je znázorněna na obrázku 38. Zde obsažený gen crylA(b), který kóduje teplotně stabilní protein crylA(b), je znázorněn na obrázku 37.

Níže uvedené příklady 9 až 20 se zaměřují na izolaci a charakterizaci dřeňově preferovaného promotoru.

Příklad 9

Izolace RNA a northem blotting

RNA se izoluje z rostlin pěstovaných ve skleníku. Celková RNA se izoluje jak popsali Kramer a kol., Plant Physiol., 90: 1214 - 1220 (1990) z následujících tkání kukuřičné linie Funk 5N984: ze zelených listů rostlin starých 8, 11, 15, 25, 35, 40 a 60 dní, ze dřeně rostlin starých 8, 11, 15, 25, 35, 39, 46, 60 a 70 dní, z opěrných kořenů rostlin starých 60 a 70 dní kukuřičné linie Funk 5N84 a obalů a vřeteně rostlin 5N984 starých 60 a 70 dní. RNA se též izoluje z kořenů rostlin 21 ID starých 14 dní a z vyvíjejících se semen v týdenních intervalech od prvního do pátého týdne po opylení. Póly A+ RNA se izoluje za použití oligo-dT jak popsali Sambrook a kol.,

-47CZ 292953 B6

Molecular Cloning: A Laboratory Manual (druhé vydání). 1989. a provede se northern blotting, též jak popsali Sambrook a kol., za použití celkové RNA (30 pg) nebo póly A+ RNA (2-10 pg). Po elektroforéze se RNA blotuje na membrány Nitroplus 2000 (Micron Separations lne.). RNA se naváže na filtr za použití Stratalinkeru (Stratagene) při 0.2 mJ. Jako sonda se při northern 5 blottingu použije 8-2 cDNA-fragment EcoRI dřeně (TRpA) o velikosti 1200 bp, izolovaný za použití 0,8% agarózy s nízkou teplotou tání v pufrovacím systému TBE. Provede se hybridizace a promytí a filtry se exponují na film, jak je popsáno v části Izolace cDNA-kíonů.

io Příklad 10

Izolace cDNA-klonů

Syntéza prvního řetězce cDNA se provede za použití systému I reverzní transkriptázy BRL AMV 15 za podmínek specifikovaných dodavatelem (Life Technologies, lne., Gaithersburg, Maryland).

Přesněji se 25 pl reakční směsi obsahující 50 mM Tris-HCl pH 8,3, 20 mM chloridu draselného, 1 mM dithiothreitolu, 6 mM chloridu hořečnatého, 1 mM každého z deoxyribonukleotidtrifosfátů, 0,1 mM oligo (dT) 12 - 18, 2 pg dřeňové poly(A+) RNA, 100 pg/ ml N,O-bis(trimethylsilyl)acetamidu (BSA), 50 pg / ml aktinomycinu D, 8 jednotek placentálního inhibitoru 20 RNasy, 1 pl (10 mM Ci / ml) 32P dCTP s více než 3000 mCi / mM jako činidla pro sledování (tracer), a 30 jednotek reverzní transkriptázy AMV inkubuje při 42 °C po dobu 30 minut. Přidá se další chlorid draselný k upravení koncentrace na 50 mM a inkubace pokračuje po dobu dalších 30 minut při 42 °C. Opět se přidá chlorid draselný k dosažení konečné koncentrace 100 mM. Přidá se další reakční pufr pro reverzní transkriptázu AMV, aby se zachovaly výchozí 25 koncentrace ostatních složek, a dalších 10 jednotek, a inkubace pokračuje po dobu dalších minut při 42 °C. Syntéza druhého řetězce se dokončí za použití systému syntézy cDNA Riboclone s Eco Rl-linkery (Promega, Madison, Wisconsin). Velikost dvouřetězcové cDNA se zjistí na 1% agarózovém gelu za použití pufru Tris - boritan - kyselina ethylendiamintetraoctová (EDTA), jak popsali Sambrook a kol. a zjistí se, že průměrná velikost činí přibližně 1,2 kb. 30 Provede se velikostní frakcionace cDNA za použití membrány NA45 DEAE tak, že se zadrží molekuly o velikosti přibližně 1000 bp nebo větší, za podmínek specifikovaných dodavatelem (Schleicher a Schuell). Velikostně frakcionovaná cDNA se liguje do vektoru Lambda Zapil (Stratagene, La Jolla, Kalifornie) a sbalí do lambda částic za použití Gigapack II Plus (Stratagene, La Jolla, Kalifornie). Neamplifikovaná knihovna má titr 315000 pfu (phage forming 35 units, jednotek tvořících fágy), zatímco amplifikovaná knihovna má titr 3,5 miliardy / ml za použití buněk PLK-F'.

Rekombinantní fágy se nanesou v hustotě 5000 pfu na desky L-agaru o rozměrech 150 x 15 mm. Celkově se provede screening 50000 fágů za dvojitého odběru z každé desky a pomocí sond 40 prvního řetězce cDNA vytvořených buď z mRNA získané ze dřeně, nebo z mRNA získané ze semen. Odběr se provede jak popsali Sambrook a kol. za použití nitrocelulózových filtrů. DNA se upevní na filtry pomocí zesítění UV světlem za použití přístroje Stratalinker (Stratagene, La Jolla, Kalifornie) při 0,2 mJ. Prehybridizace a hybridizace filtru se provádí v roztoku, který tvoří 10X Denhardtova roztoku, 150 pg / ml DNA spermatu lososa (sheared salmon sperm 45 DNA), 1 % dodecylsulfátu sodného (SDS), 50 mM fosforečnanu sodného, pH 7, 5 mM kyseliny ethylendiamintetraoctové, 6X citrátového pufru s chloridem sodným (SSC), a 0,05 % pyrofosforečnanu sodného. Prehybridizace probíhá po dobu 4 hodin při 62 °C a hybridizace po dobu 18 hodin (přes noc) při 62 °C s 1 milionem cpm (pulzů za minutu) / ml v objemu 40 ml. Filtry se promyjí v 500 ml 2X SSC, 0,5% SDS při teplotě místnosti po dobu 15 minut a poté při 50 teplotě 63 °C v 0,lX SSC, 0,5% SDS po dobu 30 minut pro každé promytí. Radioaktivně značené DNA-sondy se připraví za použití systému značení random primer labeling systém (BRL) a nezačleněná radioaktivita se odstraní za použití kolon Nick Columns (Pharmacia). Filtry se exponují přes noc na film citlivý na paprsky X Kodak X-Omat AR za použití (DuPont) Cronex Lightning Plus intensifying screens při teplotě -80 °C. Plaky vykazující hybridizaci se

-48CZ 292953 B6 sondou získanou z dřeně a nikoli se sondou získanou ze semene se purifikují pro další charakterizaci.

Příklad 11

Izolace genomových klonů

Genomová DNA z inbrední kukuřičné linie Funk 21 ID se izoluje jak popsali Shure a kol., Cell, 35: 225 - 233 (1988). DNA se částečně rozštěpí Sau 3A a následně se provede velikostní frakcionace za použití gradientů sacharózy 10 až 40 % za centrifugace v rotoru Beckman SW40 při 22000 otáčkách za minutu po dobu 20 hodin při 20 °C. Frakce o velikosti 9 až 23 kb se spojí a vysráží ethanolem. Lambda Dash II (Stratagene) rozštěpený Bam HI se použije podle pokynů dodavatele. Provede se screening neamplifikované knihovny a zkoumá se celkem 300000 pfu za použití výše popsaných podmínek. Jako sonda pro knihovnu se použije dřeňově specifický (TrpA) cDNA-klon 8-2, pCIB5600, který se identifikuje pomocí odečítacího screeningu cDNA-knihovny. Izolované klony se purifikují jako plaky a provede se příprava fágů ve velkém rozsahu za použití Lambdasorb (Promega) podle pokynů dodavatele. Izolované genomové klony se rozštěpí Eco RI a fragment EcoRI o velikosti 4,8 kb se subklonuje do vektoru Bluescript (Stratagene).

Příklad 12

Sekvence DNA a počítačová analýza

Sekvenování nukleotidů se provede za použití postupu využívajícího dideoxyribonukleotidů jako terminátorů reakce, jak popsali Sanger a kol., PNAS, 74: 5463 - 5467 (1977). Primery pro sekvenování se syntetizují na DNA-syntetizátoru Applied Biosystems model 380B za použití standardních podmínek. Sekvenační reakce se provádí za použití systému Sequenase (US Biochemical Corp.). Gelová analýza se provádí na 6% polyakrylamidových gelech se 7 M močoviny o rozměrech 40 cm v pufr Tris-boritan-kyselina ethylendiamintetraoctová (BRL Gel-Mix 6). Analýza sekvencí a porovnání se sekvencemi v genové bance GenBank se provede za použití softwaru z Univerzity of Wisconsin Genetic Computer Group Sequence Analysis Software (UWGCG).

Příklad 13

Mapování místa počátku transkripce

Metoda „primer extension“ se provádí podle postupu, který popsali Metraux a kol., PNAS, 86: 896- 900 (1988). Ve stručnosti se 30 pg celkové RNA z dřeně kukuřice teplotně hybridizuje s primerem v 50mM Tris pH 7,5, 40mM chloridu draselném, 3mM chloridu hořečnatém (RT-pufr) tak, že se provede zahřátí na 80 °C na dobu 10 minut a pomalé ochlazení na 42 °C. Směs RNA a primerů se nechá hybridizovat přes noc. Přidá se další RT-pufr, dithiothreitol na koncentraci 6 mM, N,O-bis(trimethylsilyl)acetamid (BSA) na koncentraci 0,1 mg / ml, RNAsin v množství 4 jednotky (U) / ml a každý z deoxyribonukleotidtrifosfátů v množství 1 mM. Poté se přidá 8 jednotek reverzní transkriptázy a reakční směs se umístí na 1 hodinu do teploty 37 °C. Použitý primer je 5'-CCGTTCGTTCCTCCTTCGTC GAGG-3', který začíná v místě +90 bp, vztaženo na místo počátku transkripce, viz obrázek 28 A. Za použití stejného primerů jako v reakci „primer extension“ se vytvoří „sekvenační žebřík“, za použití genomového klonu o velikosti 4,8 kb, aby se umožnilo stanovení místa počátku transkripce. Sekvenační reakce se provádí jak je popsáno v příkladu 12.

-49CZ 292953 B6

Pro stanovení, zdaje sekvence o velikosti 371 bp od +2 bp do +373 bp (počátek cDNA) souvislá, nebo obsahuje jeden nebo více intronů, se použije metoda chránění proti účinkům RNasy („RNase protection“). Fragment Sphl - Ncol o velikosti 385 bp nacházející se od +2 bp do +387 bp, vztaženo k místu počátku transkripce, viz obrázek 28B, se klonuje do pGEM-5Zf(+) (Promega) a transkribuje za použití systému Riboprobe Gemini (Promega) pomocí promotoru SP6, aby se vytvořily radioaktivní antisense RNA-sondy, jak popisuje dodavatel. „RNase protection“ se provádí jak popsali Sambrook a kol. Použitými markéry molekulární hmotnosti jsou pBR322 (rozštěpený Hpall a koncově označený pomocí 32P-dCTP) a Klenow fragment. Použijí se gely obsahující 6 % akrylamidu a 7 M močoviny (BRL Gel-Mix 6), a analýza se provádí při stálém příkonu 60 W.

Příklad 14

Southem blotting genomové DNA

Genomová DNA se izoluje z kukuřičné linie 21 ID za použití postupu, který popsali Shure a kol., viz výše. Pro každé štěpení restrikčních enzymem se použije 8 pg genomové DNA. V pufru doporučovaném dodavatelem se použijí následující enzymy: BamHI, EcoRI, EcoRV, HindlII a Sací. Klon číslo 8-2 cDNA dřeně se použije pro odhad počtu kopií genu. Rozštěpená DNA se rozdělí na 0,7% agarózovém gelu za použití pufračního systému Tris-boritan-kyselina ethylendiamintetraoctová. Gel se před vlastním použitím ošetří 250mM kyselinou chlorovodíkovou po dobu 15 minut, aby se usnadnil přenos DNA o vysoké molekulové hmotnosti. DNA se přenese na membránu Nitroplus 2000 a následně se analyzuje s dřeňovou cDNA 8-2 jako sondou. Provede se promytí jak je popsáno v příkladu 10.

Příklad 15

Materiál a metody polymerázové řetězové reakce

Polymerázové řetězové reakce se provádějí za použití soupravy GeneAmp DNA Amplication reagent kit a rekombinantní Taq DNA-polymerázy AmpliTaq (Perkin Elmer Cetus). Reakční podmínky jsou následující: pro každou reakci se použije 0,1 až 0,5 μΜ každého ze dvou primerů, 25 ng fragmentu EcoRI ze dřeně o velikosti 4,8 kb ve vektoru Bluescript, a reakční směs pro polymerázovou řetězovou reakci popsaná dodavatelem, celkový objem činí 50 μΐ v reakční zkumavce GeneAmp o objemu 0,5 ml (Perkin Elmer Cetus). Použije se teplotní cyklovač DNA Therman Cycler (Perkin Elmer Cetus) za použití programu Step-Cycle, denaturace probíhá při 94 °C po dobu 60 sekund, teplotní hybridizace při 55 °C po dobu 60 sekund a extenze při 72 °C po dobu 45 sekund s následným prodloužením o 3 sekundy na cyklus, při celkovém počtu 30 cyklů. Použijí se následující sady primerů, naznačených na obrázku 24:1. 83 X 84, -429 bp až -2 bp, II. 49 X 73, -69 bp až +91 bp, III. 38 X 41, +136 bp až +258 bp, a IV. 40 X 75, +239 bp až+372bp.

Příklad 16

Izolace dřeňově preferovaného genu cDNA-knihovna získaná z dřeňové mRNA se klonuje do fága Lambda Zap a provede se screening za použití prvního řetězce cDNA získaného z mRNA buďto dřeně, nebo semene. Klony, které hybridizují pouze se sondou z dřeně se plakově purifikují a jejich screening se zopakuje. Klony, které projdou i druhým screeningem se použijí jako sondy při northern blottingu za použití RNA z různých tkání kukuřice.

-50CZ 292953 B6

Příklad 17

Struktura genu a analýza sekvence

Inzert cDNA-klonu 8-2 o velikosti 1,2 kb se sekvenuje za použijí postupu využívajícího dideoxyribonukleotidů jako terminátorů reakce, který popsali Sanger a kol., viz výše. Podobně se sekvenuje genový ekvivalent obsažený v fragmentu EcoRI o velikosti 4,8 kb ve vektoru bluescript označeném jako pC!B5601. Získá se tak informace, že genomová kopie kódující oblasti má velikost 1,7 kb a obsahuje pět intronů. mRNA-transkript obsahuje šest exonů, což je uvedeno na obrázku 24. Velikost exonů činí od 43 bp do 313 bp a velikost intronů je v rozmezí od 76 bp do 130 bp. Celá sekvence genu a jeho odpovídající odvozená aminokyselinová sekvence je znázorněna na obrázku 24.

Tento gen kóduje protein obsahující 346 aminokyselin o molekulové hmotnosti přibližně 38 kD. Jak je uvedeno v tabulce 1, vykazuje předpokládaný protein podobnost 62 % a identitu 41 % s podjednotkou proteinu z Pseudomonas aeruginosa a je vysoce homologický s proteiny trpA z jiných organizmů.

Tabulka 1

Porovnání sekvencí TrpA mezi genem TrpA kukuřice a jinými organizmy

Porovnávaný organizmus	% podobnosti aminokyselin	% identity aminokyselin
Haloferax volancii	56,4	36,1
Methanococcus voltae	58,1	35,1
Pseudomonas aeruginosa	62,5	41,8
Neurospora crassa	61,4	39,3
Saccharomyces cerevisiae	56,7	36,1

Legenda k tabulce 1:

Za podobné aminokyseliny se považují: I = L = Μ = V, D = E, F = Y, K = R, N = Q, S = T.

Podobnost a identita se porovná za použití programu GAP z UWGCG.

Crawford a kol., Ann. Rev. Microbiol., 43: 567 - 600 (1989) našli v bakteriálních genech TrpA oblasti konzervativních aminokyselin. Jsou jimi aminokyseliny 49 až 58, aminokyseliny 181 až 184, a aminokyseliny 213 až 216, stím, že zbytek genu vykazuje větší variabilitu než je pozorována u sekvence TrpB. Porovnání známých proteinů trpA s proteinem TrpA kukuřice (není uvedeno) svědčí o tom, že existuje značná homologie mezi genem kukuřice a ostatními proteiny trpA. Tato homologie je též srovnatelná s úrovní homologie zjištěnou při porovnání ostatních proteinů TrpA navzájem, jak popsali Crawford a kol., viz výše.

Pro stanovení lokalizace místa počátku transkripce a toho, zda jsou v této oblasti přítomné introny či nikoli, se použijí čtyři fragmenty vytvořené pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) o velikosti 122 bp až 427 bp z oblasti od -429 bp do +372 bp pro analýzu pomocí northem blottingu. Výsledky této analýzy ukazují, že PCR-sondy II, III a IV hybridizují s celkovou RNA dřeně a PCR-sonda I nehybridizuje, což svědčí o tom, že se místo počátku transkripce nachází v oblasti -69 bp až +90 bp. Pro přesnější lokalizaci místa počátku transkripce se použije metoda „primer extension“. Na obrázku 28A je znázorněno, že v případě, že se pro „primer extension“ použije primer (č. 73) umístěný v poloze +90 bp vzhledem k místu počátku transkripce, je místo počátku transkripce umístěno v místě +1, 1726 bp na genomové sekvenci.

-51 CZ 292953 B6

První kodon ATG od místa počátku transkripce je v poloze +114 bp. Předpokládá se, že tento kodon slouží jako místo iniciace translace. Tento kodon ATG začíná otevřené čtení, které probíhá v otevřeném čtecím rámci nacházejícím se v cDNA-klonu. Prvních 60 aminokyselin tohoto předpokládaného otevřeného čtecího rámce silně připomíná chloroplastový tranzitní peptid, viz Berlyn a kol. PNAS, 86: 4604 - 4608 (1989) a Neumann-Karlin a kol., EMBO J., 5: 9 - 13 (1986). Tento výsledek svědčí o tom, že je zkoumaný protein cílen do plastidu a je pravděpodobně upraven tak, že se získá aktivní protein. Testy dočasné exprese s genem B.t. optimalizovaným pro kukuřici řízeným promotorem trpA za použití protoplastů kukuřičného mesofylu ukazují, že v případě, že se jako místa spojení použije ATG v poloze +114 bp, dosáhne se nejvyšší úrovně exprese. Použití kteréhokoli z dalších dvou kodonů ATG v sekvenci podstatně snižuje úroveň exprese reportérového genu. Při použití ATG v poloze +390 bp se dosáhne určité aktivity, ale na mnohem nižší úrovni než při použití ATG v poloze +114, a při použití ATG v poloze +201 se nezjistí žádná aktivita.

Ačkoli je upstream od místa počátku transkripce v poloze +1 bp umístěna řada boxů podobných TATA-boxu, je rostlinné konvenční sekvenci TATAAA nejpodobnější TATAAT v poloze -132 bp, viz Joshi, Nuc. Acids Res., 15: 6643 - 6653 (1987). Box, o kterém se předpokládá, zeje podobný CCAAT, se nachází v poloze -231 bp. Nukleotidová sekvence obklopující kodon počátku translace ATG (GCGACATGGC) vykazuje homologii s jinými místy počátku translace u kukuřice, jak popsali Messing a kol., Genetic Engineering of Plants: An Agricultural Perspective, Plenům Press, str. 211 - 227 (1983), ale liší se od sekvence považované za konvenční sekvenci v rostlinách (ANNATGGC), viz Joshi, výše. Předpokládaný polyadenylační signál je umístěn v poloze 3719 bp (AATAAA) genomové sekvence, 52 bp od konce cDNA. Sekvence se podobá známým sekvencím kukuřice, jak popsali Dean a kol., Nuc. Acids Res., 14: 2229 - 2240 (1986), a je umístěna 346 bp downstream od konce translace proteinu, viz Dean a kol., Nuc. Acids Res., 14: 2229-2240 (1986). 3'-nepřekládaná sekvence cDNA končí v poloze 3775 bp genomové sekvence.

Obrázek 27 znázorňuje výsledek analýzy genomové DNA kukuřičné linie 21 ID pomocí Southern blottingu s přibližným počtem kopií genu, jak se rekonstruuje za použití 8-2 cDNA genu dřeně. Restrikčního štěpení a rekonstrukce svědčí o tom, že jsou v haploidním genomu přítomny 1 až 2 kopie genu. Zdá se, že jiné geny s nižším stupněm homologie s tímto genem neexistují. Gen tedy představuje genovou rodinu kukuřice s jediným genem nebo malým počtem genů.

Příklad 18 „RNase protection“

Struktura 5'-konce mRNA se stanoví za použití metody „RNase protection“. „RNase protection“ se provádí za použití sondy představují 385 nukleotidů od +2 bp do +387 bp. Tato oblast genomového klonu se umístí do RNA-transkripčního vektoru pGEM-5Zf(+) a za použití SP6 polymerázy se vytvoří RNA-sonda značená 32P. Sonda a další báze z násobného klonovacího místa vytvoří transkript o velikosti 461 nukleotidů. Sonda se hybridizuje s celkovou R|NA dřeně a následně se rozštěpí směsí RNasy A a TI a chráněné fragmenty se analyzují na denaturačních polyakrylamidových gelech. Analýzou gelů se zjistí, že existuje chráněný fragment o velikosti 355 nukleotidů a další fragment o velikosti přibližně 160 nukleotidů, viz obrázek 28B.

Skutečnost, že se metodou „primer extension“ za použití primeru (č. 73) v poloze +80 bp vytvoří produkt o délce 90 nukleotidů svědčí o tom, zeje 5'-konec transkriptu umístěn v poloze +1 bp. Pomocí „primer extension“ za použití primeru se v této oblasti vytvoří produkt, takže se předpokládá, že to lze též detekovat pomocí testu „RNase protection“. Tento primer je umístěn v 5'—části sondy pro „RNase protection“. cDNA-klon obsahuje sekvence přítomné na 3'-konci sondy pro „RNase protection“ a tudíž se má za to, že bude v tomto testu chráněn. Jelikož je na gelu přítomen pouze jeden pás, který může vznikat díky oběma těmto sekvencím, jsme

-52CZ 292953 B6 přesvědčeni, že chráněným fragmentem je skutečně větší pás a jediný menší pás je artefaktem.

Pokud by byl v této oblasti intron, byly by v sondě přítomny fragmenty z každého konce, a byly by tedy detekovatelné na gelu. Z dvou pozorovaných pásů, jeden zřejmě představuje celou

5'-oblast, a tudíž se nedomníváme, zeje v této oblasti lokalizován intron.

Příklad 19

Komplementace TrpA-mutantu Escherichia coli s cDNA 8-2 dřeně

Kmen Escherichia coli CGSC kmen 5531 z centra genetického materiálu E. coli Genetic Stock Center, Yale University (laboratorní označení kmene M5004 (O. H. Smith)) s chromozomálním markéry glnA3, TrpA9825, l-IN(rmD-rmE), thi-1, jak popsali Mayer a kol., Mol. Gen. Gentet., 137: 131 - 142 (1975) se transformuje buď pomocí cDNA 8-2 dřeně (TrpA), nebo plazmidu Bluescript (Stratagene), jak popsali Sambrook a kol., viz výše. Transformanty obsahující cDNA 8-2 (TrpA) jsou schopny růstu za nepřítomnosti tryptofanu na minimálním médiu, zatímco transformanty s plazmidem Bluescript (Stratagene) nebo netransformované kontroly nejsou bez tryptofanu schopny růstu. Buňky transformované genem TrpA kukuřice rostou velmi pomalu, kolonie jsou viditelné po sedmi dnech růstu při teplotě místnosti. Všechny kmeny se pěstují na minimálním médiu M9 doplněném glutaminem v množství 200 pg / ml, thiaminem v množství 0,01 pg / ml a s nebo bez tryptofanu v množství 20 pg / ml. U všech transformantů se zkontroluje přítomnost příslušného plazmidu za použití analýzy pomocí restrikčních enzymů. Všechny kolonie rostoucí za nepřítomnosti tryptofanu obsahují klon 8-2 obsahující cDNA pro předpokládaný gen TrpA kukuřice, jak se potvrdí pomocí Southemovy hybridizace (údaje nejsou uvedeny). Tyto výsledky potvrzují závěr, že jde o protein podjednotky A tryptofan-syntázy kukuřice.

Příklad 20

Exprese genu

Zkoumá se exprese dřeňově preferovaného genu v rostlině. Pro zkoumání exprese tohoto genu se použijí též různé genotypy kukuřice. Jako zdroj RNA pro tato zkoumání se použijí následující tkáně: dřeň z vrchní, střední a spodní části rostliny, opěrné kořeny, vřeteno a palice u genotypu 5N984, dřeň z vrchní, střední a spodní části rostliny, listy staré 10 dnů, kořeny staré 14 dnů a dřeň z celé rostliny u genotypu 21 ID, a semena genotypu 21 ID, která se sklízí v týdenních intervalech jeden až pět týdnů po opylení. Dřeň ze spodní části rostliny se získá ze dvou intemodií nad opěrnými kořeny, dřeň ze střední části rostliny se získá z dalších tří intemodií a dřeň z horní části rostliny představuje dřeň posledních dvou intemodií před vlákninou u 60 až 70 dnů starých rostlin. U 39 dnů starých rostlin jsou přítomna pouze dvě intemodia a u 46 dnů starých rostlin pouze tři intemodia. Analýza pomocí northem blottingu ukazuje, že se transkripty hybridizující se sondou získanou z cDNA dřeně akumulují rychle v mladé dřeni a mladých listech. Se zvyšujícím se věkem rostliny a při pohybu nahoru po stéble se množství detekovaného transkriptu podstatně snižuje, viz obrázky 25A - D. mRNA tohoto genu se nikdy nedetekuje v RNA získané ze semen, ať už se jedná o celkovou RNA nebo póly A+RNA, viz obrázek 26. Transkript se též detekuje v kořenech, vřetenu a obalech, ale ne v tak velkém množství jako ve tkáni dřeně a mladých listů, viz obrázky 25B, 25C. mRNA se zdetekuje i v opěrných kořenech, ale pouze ve velmi malém množství, viz obrázek 25D. Šest linií kukuřice se analyzuje ve formě nediferencovaného kalusu pomocí northem blottingu, a v žádném vzorku kalusu se nezjistí exprese tohoto genu (údaje nejsou uvedeny). Úroveň exprese daného genu je extrémně vysoká, jelikož velmi silný signál sondy z genu 8-2 TrpA lze detekovat ve dřeni a listech už pouhé dvě hodiny po expozici výsledků blottingu na film (obrázek 25A). Množství vytvořené mRNA je srovnatelné s množstvím získaným z jiného vysoce exprimovaného kukuřičného genu, a to

-53CZ 292953 B6 kukuřičného genu fosfoenolpyruvát-karboxylázy, jak popsali Hudspeth a kol., Plant Mol.

Biology, 12: 579-589(1989).

Exprese tohoto genu není stálá v čase. Exprese je velmi vysoká v dřeni spodní a střední části rostliny u rostlin starých méně než 60 dnů a rychle se snižuje v blízkosti vrcholu rostliny. Jak rostlina zraje, například je-li rostlina starší než 70 dnů, exprese klesá na téměř nezdetekovatelnou úroveň, kromě exprese ve dřeni ze spodní části rostliny a vřetenu. Akumulace transkriptu v mladých listech je téměř tak vysoká jako ve dřeni ze spodní části rostliny, ale exprese rychle klesá a v listech starších než 40 dnů je transkript nezdetekovatelný. Bylo zjištěno, že exprese v listech se mění v závislosti na ročním období pěstování.

Níže uvedené příklady 21 až 39 se zaměřují na izolaci, charakterizaci a analýzu exprese pylově specifického promotoru podle vynálezu.

Identifikace pylově specifických proteinů

Příklad 21

Růst rostlin kukuřice

Rostliny kukuřice (Zea mays, inbrední linie Funk 21 ID) se pěstují ze semen ve směsi vermikulitu a písku ve skleníku při světelném režimu 16 hodin světla a 8 hodin tmy.

Příklad 22

Izolace celkového pylového proteinu

Zralý pyl se izoluje z rostlin kukuřice v době maximálního uvolňování pylu. Prošije se, zmrazí v kapalném dusíku, a 3 až 4 ml zmraženého pylu se rozmělní v třecí misce a rozetřou se stejným objemem skleněných kuliček o průměru 75 až 150 pm. Přidá se 40 ml pufru pro rozmělňování (2mM kyselina ethylendiamintetraoctová, 5mM dithiothreitol, 0,1% dodecylsulfát sodný, 100 mM Hepes pH 8) a směs se znovu tře. Skleněné kuličky a neporušená pylová zrna se odstraní pomocí centrifugace při nízké rychlosti a směs se vyčeří centrifugací při 10 000 g po dobu 15 minut. Protein se vysráží ze supematantu přidáním acetonu na konečnou koncentraci 90 %.

Příklad 23

Izolace proteinu pylové exiny

Protein exiny se izoluje z uvolněného pylu kukuřice 21 ID jak popsali Matoušek a Tupý, J., Plant Physiology 119: 169-178(1985).

Příklad 24

Izolace proteinů listů

Mladé listy (rozvinuté z přibližně 60 %) se odříznou od rostliny kukuřice a odstraní se střední žebro listů. Celkový protein se izoluje jako v případě pylu, s tím rozdílem, že se materiál nemrazí a rozmělní se provádí v míchačce Waring bez skleněných kuliček.

-54CZ 292953 B6

Příklad 25

Izolace proteinu zrna

Palice spině vyvinutými, ale stále vlhkými zrny se odstraní z rostliny a zrna se odřežou skalpelem. Celkový protein se izoluje jako v případě listů.

Příklad 26

Elektroforéza proteinů kukuřice v gelu.

Proteiny pylu, listů a zrna se oddělí na SDS-polyakrylamidovém gelu, jak popsali Sambrook a kol., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York (1989). Po obarvení modrým barvivém (Coomasie) se proteinové pásy z pylu, listů a zrna porovnají a hojně přítomné proteiny o velikosti přibližně 10 kD, 13 kD, 20 kD, 45 kD, 55 kD a 57 kD se určí jako pylově specifické.

Identifikace pylově specifických cDNA-klonů

Příklad 27

Částečné stanovení sekvence pylově specifických proteinů

Proteinové pásy určené jako pylově specifické se purifikují pomocí elektroblottingu zpolyakrylamidového gelu na membránu PVDF (Matsudaira, P., J. Biol. Chem. 261: 10035 - 10038 (1987)) nebo pomocí kapalinové chromatografie s vysokou rozlišovací schopností na reverzní fázi. N-koncová sekvence purifikovaných proteinů se stanoví pomocí automatické degradace (Edman) na sekvenátoru pracujícím s plynnou fází Applied Biosystems 470A. Fenylthiohydantoinové (PTH) aminokyseliny se identifikují za použití analyzátoru Applied Biosystems 120A PTH. Pro stanovení celé sekvence se proteiny rozštěpí endoproteinázou Lys-C (Boehringer Mannheim) v 0,lM Tris-HCl, pH 8,5, přičemž se proteináza nechá působit po dobu 24 hodin při teplotě místnosti za použití poměru enzymu a substrátu 1 : 10. Výsledné peptidy se izolují pomocí kapalinové chromatografie s vysokou rozlišovací schopností za použití kolony Aquapore C-8 vymývané lineárním gradientem (0 až 60 %) směsi acetonitrilu a izopropanolu (v poměru 1 : 1) v 0,1% kyselině trifluoroctové. Sekvence izolovaných peptidů Lys-C se určí jak je popsáno výše. Pro pylově specifický protein o velikosti 13 kD se stanoví následující sekvence:

N-konec:

TTPLTFQVGKGSKPGHLILTPNVATI

LysC 61:

KPGHLILTPNVATISDWIK

LysC 54:

SGGTRIADDVIPADFK

LysC 49

EHGGDDFSFTLK

LysC 43

EGPTGTWTLDTK

-55CZ 292953 B6

Příklad 28

Syntéza oligonukleotidových sond pro pylově specifické cDNA

Vyberou se oblasti peptidové sekvence v proteinu o velikosti 13 kD o nízké redundanci kodonů, a na syntetizátoru Applied Biosystems 380A se syntetizují vhodné oligonukleotidové sondy pro gen kódující tyto oblasti. Syntetizují se následující oligomery:

Oligomer č.51	S'-AA ATC ATC ACC ACC ATG TTC-3' GGG G C T C
Oligomer č.58	5'-CC TTT ACC CAC TTG AAA-3' CG CG T C

přičemž nukleotidy ve sloupcích nad sebou představují báze, které se inkorporují náhodně ve stejných poměrech na naznačeném místě v oligomeru. Oligomer č.51 kóduje aminokyselinovou sekvenci EHGGDDF nacházející se v peptidu LysC 49, a oligomer č.58 kóduje aminokyselinovou sekvenci FQVGKG nacházející se v N-koncovém peptidu. Použití této směsi oligonukleotidů k vyhledávání pylově specifického genu v cDNA-knihovně je popsáno níže.

Příklad 29

Konstrukce cDNA-knihovny kukuřičného pylu

Celková kukuřičná RNA z uvolněného pylu kukuřice 21 ID se izoluje jak popsali Glisen a kol., Biochemistry 13: 2633 - 2637 (1974). Póly A+ mRNA se purifikuje z celkové RNA jak popsali Sambrook a kol. Z této mRNA se připraví cDNA za použití soupravy pro syntézu cDNA od firmy Promega, podle postupů dodávaných se soupravou. K této cDNA se přidají linkery EcoRI a cDNA se liguje do ramen klonovacího vektoru lambda Zap od firmy Stratagene za použití postupu dodávaného výrobcem. Produkt ligace se sbalí v extraktu pro „packaging“ fága lambda (lambda packaging extract) též od firmy Stratagene a použije se pro infekci buněk Escherichia coli BB4.

Příklad 30

Izolace pylově specifických cDNA-klonů cDNA-knihovna pylu kukuřice se zkoumá za použití syntetických oligonukleotidových sond specifických pro gen proteinu o velikosti 13 kD, jak popsali Sambrook a kol. Ve stručnosti, přibližně 100 000 fágových plaků cDNA-knihovny pylu se nanese na desky a přesaje na nitrocelulózové filtry. Filtry se analyzují za použití oligonukleotidů č.51 a č.58, které se koncově

-56CZ 292953 B6 označí 32P za použití polynukleotid-kinázy, jako sond. Sondy se nechají hybridizovat na filtrech při nízké přísnosti (50 °C v lmM chloridu sodném, 10% dextran-sulfátu, 0,5% dodecylsulfátu sodném), promývají se po dobu 30 minut při teplotě místnosti a poté po dobu 30 minut při teplotě 45 °C v 6X citrátovém pufru s chloridem sodným (SSC), 0,1% dodecylsulfátu sodném a exponují na film citlivý na paprsky X, pro identifikaci pozitivních klonů. Předpokládané klony se purifikují pomocí čtyřikrát opakované plakové hybridizace. Izolují se tři třídy cDNA-klonů. Typ I obsahuje fragmenty EcoRI o velikosti 0,2 kb a 1,8 kb. Typ II obsahuje fragmenty EcoRI o velikosti 0,6 kb, 0,5 kb a 1,0 kb, a Typ III obsahuje fragment EcoRI o velikosti 2,3 kb.

Příklad 31

Charakterizace pylově specifických cDNA-klonů

Fragmenty EcoRI cDNA-klonu typu II se subklonují do plazmidového vektoru pBluescript SK+, od firmy Stratagene, viz obrázek 29. Fragment o velikosti 0,6 kb ve vektoru pBluescript se označí II—.6, fragment o velikosti 0,5 kb ve vektoru pBluescript se označí II—.5 (později se přejmenuje na pCIB3169) a fragment o velikosti 1,0 kb ve vektoru pBluescript se označí II—1.0 (později se přejmenuje na pCIB3168). Jak je popsáno níže, kódují fragmenty o velikosti 0,5 kb a 1,0 kb pylově specifický gen kalcium-dependentní fosfát-kinázu kukuřice. RNA z praŠníků, pylu, listů, kořenů a vláken se denaturuje glyoxalem, elektroforézuje se na 1% agarózovém gelu, přenese na nitrocelulózu a odděleně se provede analýza pomocí sond, kterými jsou uvedené tri fragmenty EcoRI označené 32P za použití náhodné extenze primerů („random primer extension“), jak popsali Sambrook a kol., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press: New York (1989). Provede se expozice filmu citlivého na paprsky X, a zjistí se, že pás mRNA o velikosti přibližně 1,5 kb se identifikuje se sondou tvořenou fragmentem o velikosti 0,6 kb, zatímco fragmenty o velikosti 0,5 a 1,0 kb hybridizují smRNA o velikosti přibližně 2,0 kb. Ve všech případech k hybridizaci dochází pouze u dráhy s pylovou RNA, s tou výjimkou, že fragment o velikosti 0,6 kb vykazuje slabý signál u mRNA prašníků. Z těchto údajů lze vyvodit závěr, že původní cDNA-klon představuje fúzi molekul cDNA získanou ze dvou různých mRNA. Fragment o velikosti 0,6 kb je částečnou cDNA pylově specifické mRNA o velikosti 1,5 kb, přičemž tato mRNA kóduje peptid LysC 49 a N-koncový peptid. Fragmenty o velikosti 1,0 a 0,5 kb představují částečnou cDNA pylově specifické mRNA o velikosti 2,0 kb nesouvisející s uvedenými peptidy a používanými oligonukleotidovými sondami. Tento závěr se ověří sekvenováním fragmentů za použití postupu využívajícího dideoxyribonukleotidů jako terminátorů reakce, jak popsali Sambrook a kol. Sekvence cDNA je znázorněna na obrázku 30.

Příklad 32

Stanovení specificity exprese mRNA

Pro stanovení, zdaje RNA o velikosti 2,0 kb představovaná cDNA-klony pCIB3169 a pCIB3168 přítomna pouze v pylu, se izoluje celková RNA z kořenů, listů, pylu, prašníků nebo vláken kukuřice 21 ID. RNA se denaturují glyoxalem, elektroforézují na 1% agarózovém gelu, přenesou na nitrocelulózu a analyzují za použití inzertu EcoRI z plazmidu pCIB3168 nebo pCIB3169 označeného 32P jako sondy, přičemž se ve všech krocích používají standardní postupy, které popsali Sambrook a kol., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press: New York (1989). Expozice na fotografický film ukazuje, že je gen představovanými těmito dvěma klony transkripčně aktivní pouze v pylu (viz obrázek 31).

Identifikace pylově specifického promotoru

-57CZ 292953 B6

Příklad 33

Konstrukce knihovny genomové DNA kukuřice

Genomová DNA z mladých výhonků kukuřičné linie 21 ID se izoluje jak popsali Shure a kol., Cell 35: 225 - 233 (1983). DNA se dodá firmě Stratagene, kde se zkonstruuje knihovna genomové DNA pomocí klonování DNA částečně rozštěpené Sau3AI do klonovacího vektoru Lambda Dash (Stratagene).

Příklad 34

Hybridizace genomové DNA po blottingu, pro stanovení počtu kopií genu

Genomová DNA z kukuřičné linie 21 ID se rozštěpí řadou restrikčních enzymů, výsledky jednotlivých štěpení se elektroforézují na agarózovém gelu, přenesou na nitrocelulózu a analyzují za použití inzertu EcoRI značeného 32P z plazmidu pCIB3168 (fragment o velikosti 1,0 kb), plazmidu pCIB3169 (fragment o velikosti 0,5 kb) nebo klonu II—.6 jako sondy, za použití standardních postupů, které popsali Sambrook a kol. Sondou II—.6 se detekuje více než 10 pásů ve většině štěpení, což svědčí o tom, že je tato cDNA získaná z velké multigenové rodiny. Fragmentem o velikosti 1,0 kb jako sondou se detekuje 3 až 6 pásů, a fragmentem o velikosti 0,5 kb se detekují pouze 1 až 3 pásy, které jsou podmnožinou pásů detekovaných pomocí fragmentu o velikosti 1,0 kb. Díky menší velikosti genové rodiny detekované fragmenty o velikosti 1,0 kb a 0,5 kb bylo rozhodnuto pokusit se o izolaci genomového klonu, který jim odpovídá.

Příklad 35

Izolace pylově specifického genomového klonu

Screening genomové knihovny kukuřice 21 ID (Stratagene) se provede pomocí analýzy přesátých plaků za použití inzertů značených 32P z plazmidu pCIB3168 (fragment o velikosti 1,0 kb) a pCIB3169 (fragment o velikosti 0,5 kb) jako sond, za použití standardních postupů, které jsou popsané v manuálu firmy Stratagene dodávaném s knihovnou. Za použití těchto postupů se izoluje Lambda-klon MG14, který hybridizuje s oběma sondami. Fragment BamHI zMG14 o velikosti 9,0 kb, který též hybridizuje s oběma sondami, se subklonuje do místa BamHI vektoru pBluescript SK+, čímž se vytvoří plazmid pCIB379. 1800 bp z pCIB379, v oblasti odpovídající sekvenci cDNA, se sekvenuje jak je popsáno výše. Porovnáním sekvence cDNA a genomové sekvence se zjistí identita pouze 91 %. Inzert pCIB379 představuje příbuzný pylově specifický gen, druhá genomová knihovna kukuřice 21 ID se zkonstruuje ve vektoru lambda GEM-11, od firmy Promega, za použití postupů popsaných v manuálu firmy Promega. Screeningem této neamplifikované knihovny, jak je popsáno výše, se získá klon GEM 11-1, který hybridizuje s oběma sondami o velikosti 0,5 kb a 1,0 kb. Fragment HindlII zGEMll-1 o velikosti 20 kb, který též hybridizuje s oběma sondami, se subklonuje do místa HindlII vektoru pBluescript SK+, čímž se získá pCIB3166. Stanoví se sekvence DNA části pClB3166 o velikosti 4,1 kb (viz obrázek 35), a taje po vyhledání šesti intronů v genomovém klonu 100% identická se sekvencí cDNA z pCIB3168 a pCIB3169. Porovnáním sekvence pCIB3166 s databází Genbank/EMBL se zjistí, že 5'-koncová část přes exon 3 je ze 34,6 % identická s kalmodulin-dependentní protein-kinázou II krysy, pokud se týká aminokyselin (obrázek 32), zatímco čtvrtý až sedmý exon je ze 39,4 % identický s kalmodulinem krysy, viz obrázek 33. Dosud nebyla popsána žádná jiná pylově specifická kináza a do té doby nebyl znám protein kombinující kinázové a kalmodulinové domény. Následně popsali Harper a kol., Science 252: 951 - 954 (1991)

-58CZ 292953 B6 sekvenci cDNA podobného proteinu ze sóji, ačkoli exprese tohoto genu není pylově specifická.

Porovnáním kalcium-dependentní protein-kinázy (CDPK) sóji a CDPK pylu kukuřice se zjistí, že jsou, pokud se týká sekvence aminokyselin, ze 38 % identické, viz obrázek 34.

Příklad 36

Identifikace místa počátku transkripce promotoru pomocí „primer extension“

Jako primer se syntetizuje oligonukleotid PE51, s následující sekvencí:

5' -TGGCCCATGGCTGCGGCGGGGAACGAGTGCGGC- 3^z

Analýza „primer extension“ se provádí na póly A+ mRNA pylu, jak popsali Metraux a kol., PNAS USA 86: 896 - 890 (1989). Určí se, že se místo iniciace transkripce nachází mezi bázemi 1415 a 1425 na částečné sekvenci pCIB3166, jak je uvedeno na obrázku 35.

Testování funkce promotoru v transgenických rostlinách

Příklad 37

Konstrukce promotorových vektorů pro transformaci rostlin

Pro demonstraci, že promotor pylové CDPK může řídit v transgenických rostlinách expresi připojeného genu, se zkonstruuje genová fúze promotoru pylové CDPK s genem beta-glukuronidázy z Escherichia coli, za použití následujícího postupu. Fragment BamHI z lambda GEM11-1 o velikosti 10 kb obsahující první exon a část prvního intronu genu pylové CDPK a 9 kb upstream genu se subklonuje do místa BamHI vektoru pBluescript SK+, čímž se vytvoří plazmid pCIB3167. Fragment BamHI - Hind III zpCIB3167 o velikosti 2,3 kb se subklonuje do místa BamHI a HindlII vektoru pBluescript SK+, čímž se vytvoří plazmid pSK105. pSK105 se rozštěpí Aval a HindlII a fragment HindlII - Aval o velikosti 1,75 g se izoluje na agarózovém gelu. Za standardních podmínek se provede polymerázová řetězová reakce, jak popsali Sambrook a kol., za použití neporušeného pSK105 jako matrice a následujících primerů:

č. 42: 5' -AGCGGTCGACCTGCAGGCATGCGATCTGCACCTCCCGCCG-3' č . 4 3 : 5' -ATGGGCAAGGAGCTCGGG-3

Produkty polymerázové řetězové reakce se rozštěpí Ava I a Sáli a výsledný fragment se izoluje na agarózovém gelu. Vektor pBluescript SK+ se rozštěpí HindlII a Sáli. Fragment HindlII - Aval o velikosti 1,75 g, fragment Aval - Sáli získaný pomocí polymerázové řetězové reakce a vektor pBluescript s konci HindlII a Sáli se ligují pomocí ligace tří částí, čímž se získá plazmid pSKl 10.

Fúze promotorového fragmentu v pSKl 10 s genem beta-glukuronidázy (GUS) se vytvoří pomocí rozštěpení pSKHO HindlII a Sáli, izolace fragmentu o velikosti 1,9 kb na agarózovém gelu a jeho ligace do míst HindlII a Sáli pCIB3054, čímž se vytvoří plazmid pKL2, plazmid odvozený od pUC19 obsahujícího gen GUS následovaný rostlinným intronem z genu fosfoenolpyruvátkarboxylázy a polyadenylačním signálem z viru mozaiky květáku. Tato promotorová fúze je v rostlinách neaktivní, pravděpodobně kvůli přítomnosti kodonů ATG mimo rámec, ve vedoucí sekvenci předcházející ATG genu GUS.

-59CZ 292953 B6

Funkční fúze promotoru se vytvoří pomocí rozštěpení pKL2 Xbal a Sáli, pro odstranění místa spojení předchozí fůze. Nové místo spojení fúze se vytvoří polymerázovou řetězovou reakci za použití pSK.105 jako matrice a následujících primerů:

č . SK5 0 : 5' -CCCTTCAAAATCTAGAAACCT-3'

Č.SK49; 5'-TAATGTCGACGAACGGCGAGAGATGGA-3'

Produkt polymerázové řetězové reakce se rozštěpí Xbal a Sáli a purifikuje na agarózovém gelu. Purifikovaný fragment se liguje do míst Xbal a Sáli v pKL2, čímž se vytvoří plazmid pCIB3171. Tento plazmid obsahuje funkční fúzi promotoru pylové CDPK a GUS, která řídí expresi genu GUS výhradně v pylu.

Pro vytvoření vektoru obsahujícího fúzi promotor pylové CDPK - GUS vhodného pro transformaci rostlin zprostředkovanou Agrobacterium tumefaciens, se izoluje fůzní gen zpC!B3171 pomocí štěpení HindlII a Sáli. Výsledný fragment se liguje do míst HindlII a Sáli v pBIlOl (od firmy Clontech), čímž se vytvoří plazmid pCIB3175.

Příklad 38

Vytvoření transgenických rostlin pCIB3175 se transformuje do Agrobacterium tumefaciens obsahujícího pomocný plazmid (helper plazmid) pCIB542, a výsledná kultura se použije k transformaci listových terčíků z kultur vrcholu výhonků tabáku, jak popsali Horsch a kol., Science 227: 1129 - 1231 (1985), stím rozdílem, že se vynechají pěstitelské kultury (nurse cultures) a selekce se provádí pomocí kanamycinu v množství 100 mg /1. Transgenické rostliny se regenerují a přítomnost transgenu se ověří pomocí polymerázové řetězové reakce.

Příklad 39

Analýza exprese genu GUS

U pylu z primárních transformantů a jejich potomstva se histochemicky analyzuje exprese genu GUS, jak popsali Guerrero a kol., Mol. Gen. Genet. 224: 161 - 168 (1990). Procento pylových zrn exprimujících gen GUS, což se dokáže modrým zbarvením v pufru X-gluc, je uvedeno v tabulce níže:

v Číslo rostliny	% modrého pylu
PP1-51	28%
PP1-54	54%
PP1-55	žádné
PP1-61	velmi málo
PP1-63	51 %
PP1-67	15%
PP1-80	10%
PP1-83	12%

Primární transformanty, do kterých byla integrována jediná fúze promotor pylové CDPK - gen GUS tvoří maximálně 50 % GUS-pozitivního pylu, kvůli segregaci jediného genu.

-60CZ 292953 B6

Na tkáni pylu, stonků, kořenů, listů a pestíků se lektovaných rostlin se provedou fluorometrické

GUS-testy, kvůli demonstraci specifičnosti exprese promotoru pylové CDPK. Testy se provádí jak popsal Jefferson, Plant Mol. Biol. 14: 995 - 1006 (1990), a hodnoty aktivity GUS se vyjádří v nmolech MU / pg proteinu / minutu.

Číslo rostliny	Tkáň	Aktivita GUS	Aktivita GUS u netransformovaných rostlin	Čistá aktivita GUS
PPI—51	stonek	0,01	0,02	0
	list	0	0	0
	kořen	0,15	0,10	0,05
	pestík	0,02	0,01	0,01
	py·	0,24	0,02	0,22
PP1-54	stonek	0,01	0,02	0
	list	0	0	0
	kořen	0,13	0,1	0,03
	pestík	0,01	0,01	0
	pyl	0,6	0,02	0,58
PP1-63	stonek	0,01	0,02	0
	list	0	0	0
	kořen	0,07	0,1	0
	pestík	0,01	0,01	0
	pyl	0,57	0,02	0,55
Příklady 40	až 50 se zaměřují	v prvé řadě	na přípravu chimérických	konstruktů, tj.

rekombinantních molekul DNA, obsahujících konstitutivní, tkáňově preferovaný nebo tkáňově specifický promotor operabilně spojený s připraveným genem B.t., inzerci těchto konstruktů do vektorů, vytváření transgenických rostlin obsahujících tyto vektory a analýzu úrovně expresu proteinů B.t. v transgenických rostlinách.

Příklad 40

Konstrukce transformačních vektorů obsahujících gen Bt optimalizovaný pro kukuřici.

K demonstraci efektivity syntetického genu Bt crylA(b) v kukuřici se se syntetickým gen Bt crylA(b) fúzují PepC a dřeňově specifické promotory za použití polymerázové řetězové reakce. Oligomery vytvořené pro fúzi pomocí polymerázové řetězové reakce jsou:

(PepC)

KE99A28 = 5'-TGCGGTTACC GCCGATCACATG-3'

ΚΕ97Ά28 = 5'-GCGGTACCGC GTCGACGCGG ATCCCGCGGC GGGAAGCTAAG-3'

-61 CZ 292953 B6 (Dřeňově specifický)

KE100A28 = 5'-GTCGTCGACC GCAACA-3'

ΚΕ9ΘΑ28 - 5'-GCGGTACCGC GTTAACGCGG ATCCTGTCCG ACACCGGAC-3'

KE104A28 «= 5'-GATGTCGTCG ACCGCAACAC-3'

KE103A28 = 5'-GCGGTACCGC GGATCCTGTC CGACACCGGA CGGCT-3'

Primery pro polymerázovou řetězovou reakci se vytvoří tak, že se místa Nco I v 5'-nepřekládané 5 vedoucí oblasti každého z těchto tkáňově specifických genů (obsahující místa počátku translace

ATG) nahradí místy Bam HI, pro usnadnění klonování syntetického genu crylA(b) do tohoto místa Bam HI. Následná konstrukce vektorů obsahujících tkáňově specifické promotory fúzované se syntetickým genem crylA(b) a též obsahujících markerový gen 35S : PAT: 35S zahrnuje několik konstruktů jako meziproduktů.

1. pCIB4406 (35S : syntetický crylA(b): pepC ivsč.9 : 35S) pCIB4406 obsahuje syntetický gen crylA(b) o velikosti 2 kb s konci Bam HI a Cla I fúzovaný s promotorem CaMV 35S (Rothstein a kol., Gene 53: 153 - 161 1987)). Gen též obsahuje intron 15 č.6 získaný z genu fosfoenolpyruvát-karboxylázy kukuřice (ivsč.9) v 3'-nepřekládané oblasti genu, kde se používá 3'-konec CaMV (PNAS USA, 83: 2884 - 2888 (1986), Hudspeth a kol., Plant Molecular Biology, 12: 579 - 589 (1989)). pCIB4406 se liguje a transformuje do buněk Escherichia coli kmene „SURE“ (Stratagene, La Jolla, Kalifornie), jak je popsáno výše. V genu crylA(b) zpCIB4406 se nachází jedna mutace v místě aminokyseliny č. 436, která má za 20 následek změnu požadované aminokyseliny fenylalaninu na leucin. pCIB4406 je při testování v biologických testech na hmyzu plně aktivní proti Ostrinia nubilalis, a produkuje protein CrylA(b) očekávané velikosti, jak se stanoví pomocí analýzy western blottingem.

2. pCIB4407 (35S : syntetický crylA(b): pepC ivsč.9: 35 S + 35S : PAT : 35S) pCIB4407 se vytvoří z fragmentu Hin III / Eco RI o velikosti přibližně 4 kb obsahujícího gen

35S : PAT: 35S, a fragmentu Hind III / Eco RI o velikosti 3,1 kb obsahujícího gen

35S : syntetický crylA(b): 35S z pCIB4406. pCIB4407 se liguje a transformuje do Escherichia coli kmenů „SURE“, DH5alfa a HB101 za použití standardních postupů (Sambrook a kol.).

Syntetický gen crylA(b) má stejné vlastnosti jako jeho prekurzor pCIB4406.

3. pCIB4416 (35S : syntetický crylA(b) : pepC ivsč.9: 35 S + 35S : PAT : 35S + 35S : Adh intron : GUS : 35S) pCIB4407 se rozštěpí Eco RI a ošetří alkalickou fosfatázou ze střeva telat (CIP) za standardních podmínek (Sambrook a kol.), čímž se získá fragment o velikosti přibližně 7,2 kb, který se liguje s fragmentem Eco RI 35S : Adh / GUS : 35S o velikosti 3,4 kb, čímž se vytvoří pCIB4416. Ligace a transformace do buněk „SURE“ se provede jak je popsáno výše. Syntetický gen crylA(b) v pCIB4416 má stejné vlastnosti jako gen v pCIB4406.

4. pCIB4418 (35S : syntetický crylA(b) : pepC ivsč.9 : 35S) pCIB4406 se rozštěpí Apa I a Bam HI a ošetří CIP. pCIB4406 se rozštěpí Bam HI a Nsp I, a pBS123#13 se rozštěpí Nsp I a Apa I. Pomocí ligace tří částí se z fragmentu Apa I / Bam HI 45 o velikosti 4,3 kb zpCIB4406, fragmentu Bam HI / Nsp I o velikosti 1,3 kb zpCIB4406 a fragmentu Nsp I / Apa I zpBS123#13 vytvoří pCIB4418. Hostitelský kmen Escherichia coli pro pCIB4418 je HB101.

-62CZ 292953 B6

5. pCIB4419 (35S : syntetický crylA(b) : pepC ivsč.9 : 35S + 35S : PAT : 35S + 35S : Adh intron : GUS : 35S) pCIB4416 a pCIB4418 se rozštěpí Bst Ε II a Eco NI a fragmenty pCIB4416 se ošetří CIP. Fragment o velikosti 9,1 kb z pCIB4416 se liguje s fragmentem o velikosti 1,4 kb z pCIB4418, čímž se vytvoří pCIB4419. pCIB4419 po transformaci do kompetentních buněk Escherichia coli kmen HB101 vykazuje v biologických testech na hmyzu plnou aktivitu proti Ostrinina nubilalis.

6. pCIB4420 (dřeňový promotor : syntetický crylA(b): PEPC ivsč.9 : 35S + 35S : PAT : 35S)

Intermediámí konstrukty při vytváření pCIB4420 jsou pBtinl, pBtin2, p4420A a pBtin3. pBtinl (dřeňový promotor : druhá polovina syntetického genu Bt + 35S : PAT : 35S) se vytvoří ligací fragmentu dřeňového promotoru Xba I / Nco I o velikosti 2,1 kb z plazmidu pith(3—1) s fragmentem Xba I / Nco I o velikosti 5,2 kb z pCIB4407. pBtin2 je intermediámím konstruktem obsahujícím dřeňový promotor modifikovaný fragmentem o velikosti 210 bp vytvořeným pomocí polymerázové řetězové reakce za použití primerů KE100A28 a KE98A28 uvedených výše. Reakční směs pro polymerázovou řetězovou reakci obsahuje přibližně 100 ng fragmentu dřeňového promotoru Bam HI / Nco I o velikosti 2,1 kb se 100 pmoly každého zoligomerů, 200 nM každého z deoxyribonukleotidtrifosfátů, IX pufr (Cetus) a 2,5 jednotek teplotně stabilní polymerázy. Jelikož je poloviční teplota denaturace (T_m) relativně nízká (mezi 40 °C a 50 °C), provádí se polymerázová řetězová reakce s následujícími parametry:

denaturace: 94 °C po dobu 1 minuty, teplotní hybridizace: 37 °C po dobu 1 minuty, extenze: 72 °C po dobu 45 sekund (+ 3 sekundy na cyklus), počet cyklů: 25.

Reakční směs po polymerázové řetězové reakci se ošetří proteinázou K, jak je popsáno výše, rozštěpí se Sal I a Κρη I, a poté se provede extrakce fenolem a chloroformem a vysrážení ethanolem, jak je popsáno výše. Fragment o velikosti 210 bp se purifíkuje na 2% Nusieve-gelu a extrahuje z gelu za použití filtračních jednotek Millipore. Fragment Sal I / Κρη I o velikosti 210 bp se liguje s fragmentem Sal I / Κρη I o velikosti 4,9 zpith(3-1), čímž se vytvoří pBtin2.p4420A (dřeňový promotor : syntetický Bt : Pep intron : 35S + 35S : PAT : 35S) se vytvoří pomocí ligace tří částí z fragmentu Nsi I / Bam HI o velikosti 700 bp z pBtin2, fragmentu Bam HI / Bst Ε II o velikosti 1,8 kb z pCIB4418, a fragmentu Bst Ε II / Nsi I o velikosti 5,9 kb zpBtinl. Po vytvoření p4420A se vpBtin2 objeví tři mutace. Za použití primerů KE104A28 aKE103A28 s hodnotami T_m přibližně 65 °C se získá druhý fragment vytvořený pomocí polymerázové řetězové reakce, aby se modifikovalo místo Nco I ve vedoucí části dřeňového promotoru. Reakční směs pro polymerázovou řetězovou reakci je identická s výše uvedenou směsí, stím, že se přidá glycerol na koncentraci 20 %, aby se snížil výskyt mutací v oblastech bohatých na G + C (Henry a kol., Planí Molecular Biology Reportér 9 (2): 139 - 144, 1991). Parametry polymerázové řetězové reakce jsou následuj ící:

Část I: 94 °C: 3 minuty, 1 cyklus

Část II: 60 °C: 1 minuta, °C: 1 minuta, cyklů,

Část III: 72 °C: 5 minut, 1 cyklus.

Reakční směs se po polymerázové řetězové reakci ošetří jak je uvedeno výše a rozštěpí se restrikčními endonukleázami Sal I a Κρη I. Fragment Sal I / Κρη I o velikosti 210 bp vytvoření pomocí polymerázové řetězové reakce (při použití glycerolu v reakci) se liguje s fragmentem

-63CZ 292953 B6

Sal I / Κρη I o velikosti 4,9 kb zplazmidu pith(3—1), čímž se vytvoří pBtin3. Údaje získané sekvenováním pBtin3-G#l svědčí o tom, že je tento fragment vytvořený pomocí polymerázové řetězové reakce správný.

pBtin3-G#l se použije pro vytvoření pCIB4420 (též nazývaného p4420B“G#6). pCIB4420 se zkonstruuje pomocí ligace tří částí za použití fragmentu Nsi I / Bam HI o velikosti 700 bp z pBtin3-G#l, fragmentu Bam HI / Bst Ε II o velikosti 1,8 kb z pCIB4418 a fragmentu Bst Ε II / Nco I o velikosti 5,9 kb zpBtinl. pCIB4420 se použije v pokusech na protoplastech mesofyiu a vykazuje plnou aktivitu syntetického genu crylA(b) proti Ostrinia nubilalis.

7. pCIB4413 (PEPC : syntetický Bt (mutace Phe): PEPC intron : 35S)

Pomocí polymerázové řetězové reakce se za použití primerů KE99A28 a KE97A28 a fragmentu Hind III / Sal I o velikosti 2,3 kb z pGUS4.5 jako matrice vytvoří fúzní fragment. Směs pro polymerázovou řetězovou reakci obsahuje primery, matrici, deoxyribonukleotidfosfáty, soli a teplotně stabilní polymerázu, ve stejných koncentracích jako je uvedeno výše. Polymerázová řetězová reakce má následující parametry:

denaturace: 94 °C po dobu 1 minuty, teplotní hybridizace: 55 °C po dobu 1 minuty, extenze: 72 °C po dobu 45 sekund (+ 3 sekundy na cyklus), počet cyklů: 30.

Po dokončení polymerázové řetězové reakce se reakční směs ošetří proteinázou K, poté se provede extrakce fenolem a chloroformem a vysrážení ethanolem, jak je popsáno výše, a následně rozštěpení restrikčními endonukleázami Bam HI a Bst ΕII.

pCIB4413 se vytvoří pomocí ligace tří částí za použití fragmentu Bam HI / Bst Ε II o velikosti 210 bp vytvořeného pomocí polymerázové řetězové reakce, fragmentu Bam HI / Hind III o velikosti 4,7 kb z pCIB4406, a fragmentu Hind III / Bst ΕII o velikosti 2,2 kb z pGUS4.5.

8. pCIB4421 (PEPC : syntetický crylA(b): PEPC intron : 35S)

Pro nahrazení syntetického genu crylA(b) obsahujícího mutaci v případě aminokyseliny fenylalaninu vpCIB4413 syntetickým genem crylA(b) zpCIB4419 se vytvoří pCIB4421, a to ligací fragmentu Bam HI / Sac I o velikosti 5,2 kb zpCIB4413 s fragmentem Bam HI / Sac I o velikosti 1,9 kb z pCIB4419.

9. pCIB4423 (PEPC : syntetický crylA(b): PepC intron : 35S + 35S : PAT : 35S)

Fragment Bam HI / Hind III o velikosti 2,4 kb promotoru PEPC zpCIB4421 se liguje s fragmentem Bam HI / Hind III o velikosti 6,2 kb z pCIB4420, čímž se vytvoří pCIB4423. Místo Hind III se při klonování pCIB4423 deletuje exonukleázami. pCIB4423 obsahuje syntetický gen crylA(b) pod kontrolou promotoru PEPC a gen PAT pod kontrolou promotoru 35S.

10. Syntetický gen crylA(b) v kmenech Agrobacteria

Kmeny Agrobacteria obsahující syntetický gen crylA(b) umožňují přenos tohoto genu do řady dvouděložných rostlin. Vektor pCIB4417 pro Agrobacterium obsahuje fragment Hind III / EcoRI o velikosti 3,3 kb 35S : syntetický CrylA(b) : PepC ivsč.9 : 35S zpCIB4406 (se zmutovaným Phe), ligovaný s fragmentem Hind III / Eco RI o velikosti 14 kb zpBIlOl (Clontech). Za použití elektroporace se pCIB4417 přenese do kmene Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (Diethard a kol., Nucleis Acids Research, svazek 17: č. 16: 6747, 1989).

-64CZ 292953 B6

Elektroporace 200 ng pC!B4417 a 40 μΐ kompetentních buněk LBA4404 rozmražených na ledu se provede v předem ochlazené elektroporační kyvetě o velikosti 0,2 cm (Bio-Rad Laboratories Ltd.). Za použití přístroje Gene Pulser-TM s jednotkou Pulse Controller unit (Bio-Rad) se bezprostředně použije elektrický impuls při nastavení napětí na 2,5 kV, a nastavení kapacity na 25 pF. Po impulzu se buňky okamžitě přenesou do 1 ml média YEB, třepou se po dobu 3 hodin při teplotě 27 °C, a poté se 10 ul směsi nanese na desky ABmin : Km50. Po inkubaci po dobu přibližně 60 hodin při teplotě 28 °C se vyberou kolonie pro miniscreening za použití analýzy pomocí restrikčních enzymů. Výsledný kmen Agrobacteria se označí pCIB4417:LBA4404.

Příklad 41

ELISA-test transformovaných protoplastů kukuřice

Přítomnost toxinu proteinu crvIA(b) se detekuje za použití ELISA-testu (enzyme-linked immunosorbent assay). ELISA-testy jsou velmi citlivé, specifické testy pro antigenní materiál. ELUSA-testy jsou vhodné pro stanovení exprese polypeptidových genových produktů. Antisérum pro tyto testy se vytvoří jako odpověď na imunizaci králíků gradientově purifikovanými krystaly Bt (Ang a kol., Applied Environ, Microbiol., 36: 625 - 626 (1978)) rozpuštěnými dodecylsulfátem sodným. ELISA-testy extraktů z dočasně transformovaných buněk kukuřice se provádějí za použití standardních postupů (viz například Harlow, E., a Lané, D. v „Antibodes: A Laboratory Manual“, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988). Postupy ELISA-testu dále popsali Clark a kol., Methods in Enzymology, 118: 742 - 766 (1986), aBradford, Anal. Biochem., 72: 248 (1976). Tyto postupy jsou tedy odborníkovi dobře známé.

ELISA-testy se provádějí pro detekci tvorby proteinu CrylA(b) v protoplastech kukuřice. Množství vytvořeného proteinu je níže uváděno v ng Bt na mg celkového proteinu (ng Bt / mg). Každý konstrukt se testuje dvakrát.

pCIB3069 nedetekovatelné množství Bt (v obou testech), pCIB4407 21 900 ng Bt / mg celkového proteinu,

000 ng Bt / mg celkového proteinu.

Transformované buňky kukuřice při transformaci genem Bt optimalizovaným pro kukuřici vytvářejí vysoké množství insekticidního proteinu Bt, řádově přibližně 20 000 ng proteinu Bt CrylA(b) na mg celkového rozpustného proteinu. Minimální množství detekovatelné pomocí těchto testů na bázi ELISA-testu činí přibližně 1 až 5 ng proteinu CrylA(b) na mg proteinu. Gen Bt optimalizovaný pro kukuřici tudíž způsobuje přibližně 20 000-násobný nárůst exprese tohoto proteinu v buňkách kukuřice.

Příklad 42

Test insekticidní aktivity extraktu z transformovaných protoplastů proti Ostrinia nubilalis

Za použití extraktů získaných z buněk kukuřice dočasně transformovaných DNA tak, aby exprimovaly gen optimalizovaný pro kukuřici, se též provede analýza pomocí western blottingu. Při zkoumání pomocí western blottingu se zdá, že je tento protein identický s proteinem vytvářeným v Escherichia coli. Naproti tomu, jak je uvedeno výše v příkladu 6, buňkami kukuřice transformovanými pomocí srovnatelných vektorů s cílem dosáhnout exprese nativní kódující sekvence získané z Bacillus thuringiensis není produkován insekticidní protein Bt crylA(b) v detekovatelném množství.

-65CZ 292953 B6

Kvalitativní testování toxicity pro hmyz lze provést za použití izolovaných protoplastů. Pro každé opakování testované ve všech biologických testech se připraví suspenze. Opakování se považuje za pozitivní, pokud způsobuje podstatně vyšší mortalitu než kontroly. Testuje se například aktivita proti hmyzu z řádu Lepidoptera za použití zavíječe kukuřičného Ostrinia nubilalis. 100 μΐ suspenze protoplastů v 0,1% preparátu Triton X-100 se pipetuje na povrch umělé potravy pro Agrotis ipsilon (Bioserv, lne., Frenchtown, NJ; F9240) v petriho miskách o rozměrech 50 mm x 10 mm. Po vysušení vzduchem se na každou desku přidá 10 neonatálních larev. Mortalita se stanovuje přibližně po 4 dnech. Tento protein, pokud ho larvy Ostrinia nubilalis přijímají, způsobuje 100% mortalitu.

Příklad 43

Exprese syntetického Bt v protoplastech kukuřičného mesofylu

Obecný postup izolace protoplastů kukuřičného mesofylu se upraví podle postupu, který uvedli Sheen a kol., The Plant Cell, 2: 1027 - 1038 (1990). Systém transformace protoplastů, který použili Sheen a kol. se modifikuje tak, že se místo elektroporace použije transformace zprostředkovaná PEG (polyethylenglykolem). Tento postup, jakož i změny provedené v postupu izolace, je popsán níže.

Izolace a transformace protoplastů kukuřičného mesofylu

1. Pro získání listového materiálu se vysterilizují a nechají vyklíčit semena kukuřice. Klíční rostliny se pěstují na světle při teplotě 25 °C.

2. Části listů klíčních rostlin starých 10 až 12 dnů se povrchově sterilizují 5% preparátem Clorox po dobu 5 minut a následně se provede několik promytí sterilní destilovanou vodou.

3. Do petriho misek o rozměrech 100 x 25 mm se dá enzymový roztok (předpis viz níže) v množství 25 ml na misku.

4. Z listů se odstraní nadbytek vody a do každé misky s enzymy se vloží 6 až 8 částí listů o velikosti zhruba 5 cm. Listový materiál přibližně ze 100 klíčních rostlin obvykle vystačí pro 14 misek.

5. Listy se rozetřou na co nejužší (2 až 5 mm) podélné pásy.

6. Misky se pomalu třepou při teplotě 25 °C po dobu 6,5 až 7 hodin a poté se přikryjí tak, aby inkubace probíhala ve tmě.

7. Před filtrací protoplastů se síta o velikosti otvorů 100 pm promyjí 10 ml 0,6M mannitolu. Protoplasty se pomalu pipetují přes síta. Pro získání všech protoplastů zbylých v miskách se misky promyjí 0,6M mannitolem.

8. Přefiltrovaná kapalina se opatrně pipetuje do sterilních zkumavek o objemu 50 ml. Pro naředění se přidá stejný objem 0,6M mannitolu.

9. Provede se centrifugace po dobu 10 minut při 1000 otáčkách za minutu (500 g) v centrifuze Beckman Model TJ-6.

10. Enzymový roztok se odstraní a pelety se opatrně převedou do suspenze v 5 ml mannitolu. Suspenze vzniklá z několika pelet se spojí, objem se upraví 0,6M mannitolem na 50 ml a provede se centrifugace.

-66CZ 292953 B6

11. Vytvoří se suspenze o známém objemu (50 ml) a protoplasty se spočítají.

12. Po spočítání a vytvoření pelety se protoplasty převedou do suspenze v množství 2 miliony/ml vresuspendujícím pufru (předpis níže). Protoplasty se před transformací nechají po dobu alespoň 30 minut inkubovat v resuspendujícím pufru.

Transformace:

1. Vzorky plazmidů se dají do zkumavek (polystyrénových kultivačních uzavíratelných zkumavek o rozměrech 17 x 100 mm (Fischerbrand), pro každé ošetření se provedou alespoň tři opakování. Použijí se ekvimolámí množství plazmidů tak, aby se provádělo porovnání stejného množství kopií genu.

2. Přidá se 0,5 ml protoplastů a 0,5 ml 40% PEG připraveného s 0,6M mannitolem.

3. Zkumavky se opatrně třepou kvůli míchání a inkubují se při teplotě 25 °C po dobu 30 minut.

4. Přidá se kultivační médium pro protoplasty v množstvích 1, 2 a 5 ml po 5-minutových intervalech.

5. Provede se centrifugace po dobu 10 minut při 1000 otáčkách za minutu (500 g).

6. Odstraní se kapalina a peleta se převede do suspenze v 1 ml kultivačního média (BMV-media).

7. Inkubace se nechá probíhat přes noc ve tmě při teplotě 25 °C.

Předpisy:

Enzymový roztok:

0,6 M mannitolu, mM morfolinethansulfonové kyseliny (MES), pH 5,7, mM chloridu vápenatého, mM chloridu hořečnatého,

0,1 % N,O-bis(trimethylsilyl)acetamidu (BSA), sterilizováno filtrací k tomuto roztoku se přidají následující enzymy:

% enzymu Cellulase RS, a

0,1 % enzymu Macereozyme R10.

Promývací pufr:

0,6 M mannitolu, sterilizováno filtrací.

Resuspendující pufr:

0,6 M mannitolu, mM chloridu draselného, sterilizováno filtrací.

-67CZ 292953 B6

Kultivační médium (předpis pro MBV-médium, který uvedli Okuno a kol., Phytopathology 67:

610-615 (1977)):

0,6 M mannitolu, mM morfolinethansulfonové kyseliny (MES), pH 5,7,

0,2 mM dihydrogenfosforečnanu draselného, mM dusičnanu draselného, mM síranu hořečnatého, mM chloridu vápenatého,

IX mikroživin K3, sterilizováno filtrací.

ELISA-testy transformovaných protoplastů se provádějí jak je popsáno výše, jeden den po transformaci. S inbrední linií kukuřice 21 ID se provedou následující tři pokusy. Samozřejmě lze použít i jiné linie kukuřice. Použije se 50 pg plazmidu pCIB4419 a ekvimolámí množství ostatních plazmidů. Celkový rozpustný protein se stanoví za použití proteinového testu BioRad (Bradford, Anal. Biochem, 72: 248 (1976)).

Transformační pokusy:

Testované konstrukty:

1. pCIB4419 (konstrukt obsahuje syntetický Bt pod kontrolou promotoru CaMV 35S a markerové geny 35S / PAT a 35S / GUS),

2. pCIB4420 (konstrukt obsahuje syntetický Bt pod kontrolou dřeňového promotoru a markerový gen PAT),

3. pCIB4421 (konstrukt obsahuje syntetický Bt pod kontrolou promotoru PEPC),

4. pCIB4423 (konstrukt obsahuje syntetický Bt pod kontrolou promotoru PEPC a markerový gen PAT) (PEPC : syntetický crylA(b): PepC intron : 35S + 35S : PAT : 35S).

V následujících pokusech se zkoumá produkce proteinu Bt CrylA(b) v klíčních rostlinách 21 ID starých 10 až 11 dnů pomocí proteinového testu Biorad:

Pokus 1 (klíční rostliny staré 11 dnů):

pCIB4419 15 000 ± 3 000 ng Bt / mg proteinu, pCIB4420 280 ± 65 ng Bt / mg proteinu, pCIB4421 9000 ± 800 ng Bt / mg proteinu.

Pokus 2 (klíční rostliny staré 10 dnů):

pCIB4419 5000 ± 270 ng Bt / mg proteinu, pCIB4420 80 ± 14 ng Bt / mg proteinu, pCIB4421 1600 ± 220 ng Bt / mg proteinu.

Pokus 3 (klíční rostliny staré 11 dnů):

pCIB4419 21 500 ± 1800 ng Bt / mg proteinu, pCIB4420 260 ± 50 ng Bt / mg proteinu, pCIB4421 11 900 ± 4000 ng Bt / mg proteinu, pCIB4423 7200 ± 3400 ng Bt / mg proteinu.

-68CZ 292953 B6

Výše uvedené pokusy potvrzují, že jak promotor CaMV 35S, tak PEPC exprimují syntetický protein Bt CrylA(b) ve velmi vysokém množství. Dřeňový promotor, ačkoli je méně účinný, je též efektivní při expresi syntetického proteinu CrylA(b).

Příklad 44

Stabilní exprese syntetického Bt v salátu

Syntetický gen Bt ve vektoru pCIB4417 pro Agrobacterium se transformuje do salátu Lactura sativa cv. Redprize. Použitý postup transformace popsali Enomoto a kol., Plant Cell. Reports, 9: 6-9(1990).

Postup transformace:

Semena salátu se povrchově sterilizují v 5% preparátu Clorox po dobu 5 minut a následně se několikrát promyjí ve sterilní destilované vodě. Povrchově sterilizovaná semena se nanesou na polovičně koncentrované MS-médium (Murashige a Skoog, Physiol. Plant. 15: 473 - 497 (1962)). Jako explantáty pro infekci Agrobacteriem se použijí dělohy šest dnů starých klíčních rostlin salátu Redprize, pěstovaných při teplotě 25 °C při 16-hodinovém osvětlení 3000 lx. Báze a vrchol každé dělohy se odstraní skalpelem. Explantáty se namočí na 10 minut do bakteriálního roztoku, který byl kultivován po dobu 48 hodin v minimálním médiu AB s odpovídajícími antibiotiky při teplotě 28 °C. Po odsátí nadbytku bakteriálního roztoku na sterilní filtrační papír se explantáty nanesou na MS-médium (0,1 mg / 1 BA a 0,1 mg / 1 NAA) na dobu 2 dnů. Explantáty se poté přenesou na selekční médium obsahující 500 mg / 1 karbenicillinu a 50 mg /1 kanamycinu. Explantáty se každý týden subkultivují do čerstvého média. Podmínky v růstové komoře jsou: světlo 2000 lx po dobu 16 hodin, 25 °C. Přibližně po 4 týdnech se na zdravě vypadajícím kalusu z každé ze čtyř subkultivovaných desek provedou ELISA-testy. Postup ELISA-testu je stejný jako je uveden výše pro protoplasty. Rozpustný protein se též stanoví pomocí výše popsaného testu Biorad.

Výsledky:

pCIB3021 (kanamycinová kontrola) pCIB4417 (deska 1) pCIB4417 (deska 2) pCIB4417 (deska 3) pCIB4417 (deska 4)

0, °,

505 ng Bt / mg proteinu, ng Bt / mg proteinu, 1200 ng Bt / mg proteinu.

Tento příklad svědčí o tom, že dvouděložné rostliny mohou též vykazovat zvýšenou expresi optimalizovaného insekticidního genu.

Příklad 45

Konstrukce pCIB4429 pCIB4429 obsahuje preferovaný kukuřičný pylově specifický promotor fúzovaný s genem crylA(b) optimalizovaným pro kukuřici. Pylově specifický kukuřičný promotor použitý v tomto konstruktu se získá z plazmidu pKL2, který je popsán v příkladu 37. Gen crylA(b) optimalizovaný pro kukuřici se získá z plazmidu pCIB4418, který je též popsán v příkladu 37.

pKL2 je plazmid, který obsahuje preferovaný kukuřičný pylově specifický promotor fúzovaný s genem beta-glukuronidázy z Escherichia coli. Je zkonstruován zplazmidů pSKHO apCIB3054. pSKllO obsahuje pylově specifický kukuřičný promotor. pCIB3054, který je

-69CZ 292953 B6 derivátem pUC19, obsahuje gen beta-glukuronidázy (GUS) zEscherichia coli fúzovaný s promotorem 35S z viru mozaiky květáku (CaMV). Jeho konstrukce je popsána kdekoliv v popisu. Tento promotor lze odstranit z uvedeného plazmidu pomocí rozštěpení Sáli a Hind III, čímž se získá fragment obsahující gen GUS, bakteriální gen rezistence vůči ampicillinu a počátek replikace ColEI. Druhý fragment obsahuje promotor CaMV 35S.

pCIB3054 se štěpí restrikčními enzymy Sáli a HindlII, za použití standardních podmínek, po dobu 2 hodin při teplotě místnosti. Reakční směs se poté extrahuje fenolem a chloroformem za použití standardních podmínek a DNA se izoluje pomocí vysrážení ethanolem za použití standardních postupů. Izolovaná DNA se převede do suspenze v pufru vhodném pro reakci s alkalickou fosfatázou ze střeva telat (CIP) a nechá se reagovat přes noc s 2,5 jednotkami CIP při teplotě 37 °C. Po reakci s CIP se DNA purifikuje na agarózovém gelu za použití standardních podmínek popsaných kdekoli v popisu. pSKHO se štěpí Sáli a Hind III za standardních podmínek po dobu 2 hodin při teplotě místnosti a DNA se následně purifikuje na agarózovém gelu za použití standardních podmínek. Izolované fragmenty DNA se ligují za použití standardních podmínek po dobu 2 hodin při teplotě místnosti a následně se pomocí standardních postupů transformují do kompetentních buněk Escherichia coli kmene HB101. Selekce transformantů se provede na L-agaru obsahujícím 100 pg ampicillinu / ml. Za použití standardních postupů miniscreeningu plazmidů se charakterizují transformanty obsahující požadovaný plazmidový konstrukt. Správný konstrukt se označí pKL2.

Pro vytvoření pCIB4429 se provede ligace tří částí za použití standardních podmínek známých v oboru. Třemi ligovanými fragmenty jsou:

1) fragment HindlII / BamHI zpCIB4418, o velikosti přibližně 4,7 kb, který obsahuje gen crylA(b), bakteriální gen rezistence vůči ampicillinu, a počátek replikace ColEI,

2) fragment HindlII / Xbal zpKL2, o velikosti přibližně 1,3 kb, který obsahuje pylově specifický promotor z kukuřice,

3) fragment vytvořený pomocí polymerázové řetězové reakce odvozený od pylového promotoru s místem BamHI zavedeným downstream od místa počátku transkripce. Tento fragment má velikost přibližně 120 bp a jeho konce jsou rozštěpeny restrikčními enzymy Xbal a BamHI.

Fragment vytvořený pomocí polymerázové řetězové reakce se získá za použití reakční směsi o objemu 100 μΐ a standardních podmínek popsaných výše. Použité primery jsou:

SK50: 5' -CCC TTC AAA ATC TAG AAA CCT-3'

KE127; 5' -GCG GAT CCG GCT GCG GCG GGG AAC GA-3'

Výše uvedené primery se smíchají v reakční směsi pro polymerázovou řetězovou reakci s plazmidem pSK.105, přičemž tento plazmid obsahuje pylově specifický promotor z kukuřice.

Po dokončení polymerázové řetězové reakce se 10 μΐ reakční směsi analyzuje za použití standardních podmínek na agarózovém gelu, kvůli ujištění, že se reakcí vytvořil produkt o očekávané velikosti.

Zbylých 90 μΐ se ošetří proteinázou K v konečné koncentraci 50 pg / ml po dobu 30 minut při teplotě 37 °C. Reakční směs se poté zahřívá na 65 °C po dobu 10 minut, a extrahuje se fenolem a chloroformem za použití standardních postupů. DNA se ze supematantu izoluje vysrážením dvojnásobným objemem ethanolu za použití standardních podmínek. Po vysrážení se DNA oddělí centrifugací v mikrocentrifúze. Peleta se jednou promyje 70% ethanolem (což je

-70CZ 292953 B6 standardní v oboru), rychle se vysuší kvůli odstranění veškerého ethanolu a převede se do suspenze v 17 μΙ TE-pufru. Přidají se 2 μΐ 10X pufru pro restrikční enzymy a též 0,5 μΐ BamHI a 0,5 μΐ Xbal. DNA se štěpí po dobu 1 hodiny při teplotě 37 °C, čímž se získá fragment DNA rozštěpený Xbal a BamHI. Po rozštěpení restrikčními enzymy se tento fragment purifikuje na agarózovém gelu tvořeném 2% NuSieve (FMC) / 1% agarózovým gelem. K vymytí DNA z agarózy se použijí filtrační jednotky Millipore podle pokynů výrobce. Po eluci se DNA použije k výše popsané ligaci tří částí.

Po ligaci se DNA transformuje za použití standardních postupů do kompetentních buněk Escherichia coli kmene HB101. Selekce transformantů se provede na deskách L-agaru obsahujících ampicillin v množství 100 pg / ml. Kolonie rostoucí za selekčních podmínek se charakterizují za použití postupů standardních v oboru podle plazmidových inzertů.

Příklad 46

Konstrukce pCIB4431, vektoru pro tkáňově specifickou expresi syntetického genu crylA(b) v rostlinách pCIB4431 je vektor vytvořený pro transformaci kukuřice. Obsahuje dva chimérické geny endotoxinu Bt exprimovatelné v kukuřici. Těmito geny jsou promotor fosfoenolpyruvát-karboxylázy / syntetický crylA(b) a pylový promotor / syntetický crylA(b). Gen PEPC / crylA(b) v tomto vektoru se získá zvýše popsaného pCIB4421. Pylový promotor je též popsán výše. Obrázek 20 představuje mapu plazmidu pCIB4431. pCIB4431 se zkonstruuje pomocí ligace tří částí za použití fragmentu Κρη I / Hind III o velikosti přibližně 3,5 kb (obsahujícího pylový promotor / syntetický crylA(b)) z pCIB4429, fragment Hind III / Eco RI o velikosti přibližně 4,5 kb (PEPC / syntetický crylA(b) a fragment Κρη I / Eco RI o velikosti přibližně 2,6 kb z vektoru Bluescript.

Mezi další vektory obsahující chimérický gen pylový promotor / syntetický CrylA(b) patří pCIB4428 a pCIB4430, viz obrázky 21 a 22. pCIB4430 též obsahuje výše popsaný gen PEPC / syntetický Bt.

Příklad 47 vytvoření transgenických rostlin kukuřice obsahujících syntetický gen CrylA(b) optimalizovaný pro kukuřici

Níže popsaný příklad používá zařízení Biolistics pro zavedení částic obalených DNA do buněk kukuřice, ze kterých se vytvoří transformované rostliny.

Pokus KC-65

Tvorba transgenických rostlin kukuřice exprimujících syntetický gen crylA(b) za použití tkáňově specifického promotoru

Tkáň

Z palice genotypu 6N615 se 14 - 15 dnů pro opylení vyříznou nezralá embrya kukuřice, dlouhá přibližně 1,5 až 2,5 mm. Mateřská rostlina se pěstuje ve skleníku. Před vyříznutím se palice povrchově sterilizuje 20% preparátem Clorox po dobu 20 minut a třikrát promyje sterilní vodou. Jednotlivá embrya se umístí štítkovou stranou na plochu 2 cm², v množství 36 embryí na desku, na médium iniciující tvorbu kalusu, médium 2DG4 + 5 chloramben (hlavní soli N6, vedlejší soli B5, MS-železo, 2 % sacharózy, s 5 mg / 1 chlorambenu, 20 mg / 1 glukózy, a 10 ml přísad G4 (tabulka 1) přidanými po autoklávování).

-71 CZ 292953 B6

Tabulka 1

Přísady G4

složka	množství na litr média
hydrolyzát kaseinu	0,5 mg
prolin	1,38 mg
kyselina nikotinová	0,2 mg
pyridoxin-HCl	0,2 mg
thiamin-HCl	0,5 mg
cholin-HCl	0,1 mg
riboflavin	0,05 mg
biotin	0,1 mg
kyselina listová	0,05 mg
kalcium-pantothenát	0,1 mg
kyselina p-aminobenzoová	0,05 mg
B12	0,136 pg

Bombardování

Tkáň se bombarduje za použití zařízení PDS-lOOOHe Biolistics. Tkáň se umístí 8 cm pod desku se stínítkem (stopping screen). Na tkáň se jednou vystřelí roztokem DNA a zlata jako mikronosiče, kdy je 10 μΐ vysušeno na makronosiči. Použité stínítko (stopping screen) se ručně přenese na ABRU za použití síťové mřížky z nerezavějící oceli (10 x 10). Použijí se disky (rupture discs) o hodnotě 1550 psi. Po bombardování se embrya kultivují ve tmě při teplotě 25 °C.

Příprava DNA pro bombardování

Mikronosič se připraví v podstatě podle pokynů dodávaných se zařízením Biolistic. K 50 μΙ zlata jako mikronosiče (o velikosti částic 1,0 μηι) se za míchání přidá 5 μΐ pCIB4431 (1,23 pg / μΐ) (č.898) spolu s 2 μΐ pCIB3064 (0,895 pg / μΐ) (č.456), následně 50 μΐ 2,5M chloridu vápenatého a poté 20 μΐ 0,lM spermidinu (ve formě technicky čisté volné báze). Výsledná směs se míchá po dobu 3 minut a mikrocentrifuguje po dobu 10 sekund. Supematant se odstraní a mikronosiče se promyjí dvakrát 250 μΐ 100% ethanolu (vhodného pro kapalinovou chromatografii s vysokou rozlišovací schopností) tak, že se směs rychle promíchá, centrifuguje a supematant se odstraní. Mikronosiče se převedou do suspenze v 65 μΐ 100% ethanolu.

Tvorba kalusu

Embrya se přenesou 1 den po bombardování do média iniciujícího tvorbu kalusu s 3 mg /1 PPT. U embryí se zjišťuje iniciace tvorby kalusu 2 a 3 týdny po bombardování. Pokud dojde k jakékoli odpovědi, provede se přenos do média pro udržování kalusu, média 2DG4 + 0,5 2,4-D s 3 mg / 1 PPT. Médium pro udržování kalusu tvoří hlavní soli N6, vedlejší soli B5, MS-železo, 2 % sacharózy, s 0,5 mg / 1 2,4-D (2,3-dichlorfenoxyoctové kyseliny), 20 mg / 1 glukózy a 10 ml přísad G4 přidanými po autoklávování. Embryogenní kalus se subkultivuje každé 2 týdny do čerstvého média pro udržování kalusu obsahujícího 3 mg /1 PPT. Všechen kalus se inkubuje ve tmě při teplotě 25 °C.

Formace kalusu typu I činí 15 %. Každé embryo, které vytvoří kalus, se kultivuje jako samostatný případ, a dá vzniknout samostatné linii.

-72CZ 292953 B6

Regenerace

Po 12 týdnech selekce se tkáň vyjme z média pro udržování kalusu sPPT a umístí do regeneračního média. Regeneračním médiem je 0,25MS3S5BA (0,25 mg / 1 2,4-D, 5 mg / 1 BAP, MS-soli, 3 % sacharózy), na kterém regenerace probíhá po dobu 2 týdnů, a následuje subkultivace do média MS3S pro regeneraci rostlin. Po 4 až 10 týdnech se rostliny vyjmou a umístí do nádob GA7. Z naší linie KC65 0 -6, která se stala případem č. 176 BT, bylo vytvořeno celkem 38 rostlin.

Testy

U všech rostlin, poté co se ujmou v nádobách GA7, se testuje pomocí testu s chlorfenolovou červení (CR) jejich rezistence vůči PPT, jak je popsáno v americké přihlášce vynálezu 07/759 243, podané 13. září 1991. Tento test využívá indikátorové barvivo citlivé na pH ke stanovení, které buňky rostou v přítomnosti PPT. Buňky, které rostou, způsobují změnu pH média, a barva indikátoru se změní z červené na žlutou. Tímto testem lze snadno určit rostliny exprimující gen rezistence vůči PPT (u č.176: 8 pozitivních a 30 negativních). U rostlin pozitivních v testu s chlorfenolovou červení se pomocí polymerázové řetězové reakce testuje přítomnost syntetického genu Bt (u č.176: 5 pozitivních, 2 negativní, 1 mrtvá).

Rostliny pozitivní při vyhledávání syntetického genu Bt pomocí polymerázové řetězové reakce se pošlou do fytotronu. Jakmile se rostliny ujmou ve fytotronu, charakterizují se za použití biologických testů s hmyzem a ELISA-testu. Biologické testy s hmyzem se u rostlin provádějí za použití standardního testu s Ostrinia nubilalis (popsaného v příkladu 5A), při kterém se z rostliny odstřihnou malé části listů a umístí v malé petriho misce s určitým počtem neonatálních larev Ostrinia nubilalis. Obvykle se rostliny testují ve výšce přibližně 15 cm. Rostliny, které vykazují v tomto testu 100% mortalitu pro Ostrinia nubilalis, se dále charakterizují. Údaje získané pomocí ELISA-testu jsou uvedeny níže. Pozitivní rostliny se přenesou do skleníku.

Fertilita ve skleníku

Rostlina č.176-11 se opylí pylem divokého typu 6N615. Vytvoření se jedna palice z vlákniny a jedna výhonková palice. Vyjme se všech 11 embryí z palice z vlákniny a 56 zrn z palice 1. 294 zrn zůstane na palici a uschne přirozeným způsobem.

Pyl z č.176-11 se zkříží s různými genotypy kukuřice 5N984, 5NA89 a 3N961. U všech tří křížení se vyjmou embrya (5N984: 45, 5NA89: 30, 3N961: 8). Většina zrn zůstane na palicích na rostlinách ve skleníku a uschne přirozeným způsobem. Z rostliny č. 176-11 se za použití standardních postupů izoluje DNA, která se analyzuje pomocí Southem blottingu. Zjistí se, že obsahuje sekvence, které hybridizují se sondami získanými ze syntetického genu crylA(b) a se sondou získanou z genu PAT. Tyto výsledky dokazují integraci těchto genů do genomu kukuřice.

Pokus K.C-64

Tvorba transgenických rostlin kukuřice exprimujících syntetický gen crylA(b) za použití konstitutivního promotoru

Tkáň

Z palice genotypu 6N615 se 14 - 15 dnů po opylení vyříznou nezralá embrya kukuřice, dlouhá přibližně 1,5 až 2,5 mm. Mateřská rostlina se pěstuje ve skleníku. Před vyříznutím se palice povrchově sterilizuje 20% preparátem Clorox po dobu 20 minut a třikrát promyje sterilní vodou. Jednotlivá embrya se umístí štítkovou stranou na plochu 2 cm², v množství 36 embryí na desku, na médium iniciující tvorbu kalusu, médium 2DG4 + 5 chloramben (hlavní soli N6, vedlejší soli

-73CZ 292953 B6

B5, MS-železo, 2 % sacharózy, s 5 mg / 1 chlorambenu, 20 mg / 1 glukózy, a 10 ml přísad G4 (tabulka 1) přidanými po autoklávování).

Tabulka 1

Přísady G4

složka	množství na litr média
hydrolyzát kaseinu	0,5 mg
prolin	1,38 mg
kyselina nikotinová	0,2 mg
pyridoxin-HCl	0,2 mg
thiamin-HCl	0,5 mg
cholin-HCl	0,1 mg
riboflavin	0,05 mg
biotin	0,1 mg
kyselina listová	0,05 mg
kalcium-pantothenát	0,1 mg
kyselina	0,05 mg
B12	0,136 pg

Bombardování

Tkáň se bombarduje za použití zařízení PDS-lOOOHe Biolistics. Tkáň se umístí 8 cm pod desku se stínítkem (stopping screen). Na tkáň se jednou vystřelí roztokem DNA a zlata jako mikronosiče, kdy je 10 μΐ vysušeno na makronosiči. Použité stínítko (stopping screen) se ručně přenese na ABRU za použití síťové mřížky z nerezavějící oceli (10 x 10). Použijí se disky (rupture discs) o hodnotě 1550 psi. Po bombardování se embrya kultivují ve tmě při teplotě 25 °C.

Příprava DNA pro bombardování

Mikronosič se připraví v podstatě podle pokynů dodávaných se zařízením Biolistic. K 50 μΐ zlata jako mikronosiče (o velikosti částic 1,0 pm) se za míchání přidá 3,2 μΐ pCIB4418 (0,85 pg/ ml) (č.905) spolu s 2 μΐ pCIB3064 (0,895 μg / pl) (č.456) a 1,6 μΐ pCIB3007A (1,7 pg / pl) (č. 152), následně 50 μΐ 2,5M chloridu vápenatého a poté 20 μΐ 0,1Μ spermidinu (ve formě technicky čisté volné báze). Výsledná směs se míchá po dobu 3 minut a mikrocentrifuguje po dobu 10 sekund. Supematant se odstraní a mikronosiče se promyjí dvakrát 250 μΐ 100% ethanolu (vhodného pro kapalinovou chromatografii s vysokou rozlišovací schopností) tak, že se směs rychle promíchá, centrifuguje a supematant se odstraní. Mikronosiče se převedou do suspenze v 65 μΐ 100% ethanolu.

Tvorba kalusu

Embrya se přenesou 1 den po bombardování do média iniciujícího tvorbu kalusu s 3 mg / 1 PPT. U embryí se zjišťuje iniciace tvorby kalusu 2 a 3 týdny po bombardování. Pokud dojde k jakékoli odpovědi, provede se přenos do média pro udržování kalusu, média 2DG4 + 0,5 2,4-D s 3 mg /1 PPT. Médium pro udržování kalusu tvoří hlavní soli N6, vedlejší soli B5, MS-železo, 2 % sacharózy, s 0,5 mg /12,4-D (2,4-dichlorfenoxyoctové kyseliny), 20 mg / 1 glukózy a 10 ml přísad G4 přidanými po autoklávování. Embryogenní kalus se subkultivuje každé 2 týdny do čerstvého média pro udržování kalusu obsahujícího 3 mg / 1 PPT. Všechen kalus se inkubuje ve tmě při teplotě 25 °C.

-74CZ 292953 B6

Formace kalusu typu I činí 18 %. Každé embryo, které vytvoří kalus, se kultivuje jako samostatný případ, a dá vzniknout samostatné linii.

Regenerace

Po 12 týdnech selekce se tkáň vyjme z média pro udržování kalusu s PPT, umístí do regeneračního média a inkubuje se při teplotě 25 °C za použití fotoperiody 16 hodin světla (50 μΕ . irT² . s’¹) a 8 hodin tmy. Regeneračním médiem je 0,25MS3S5BA (0,25 mg /1 2,4-D, 5 mg / 1 BAP, MS-soli, 3 % sacharózy), na kterém regenerace probíhá po dobu 2 týdnů, a následuje subkultivace do média MS3S pro regeneraci rostlin. Po 4 až 10 týdnech se rostliny vyjmou a umístí do nádob GA 7. Z naší linie KC64 0-1, která se stala případem č.170 BT, bylo vytvořeno 55 rostlin. Z naší linie KC64 0- 7, která se stala případem č.171 BT, bylo vytvořeno celkem 33 rostlin.

Testy

U 11 rostlin, poté co se ujmou v nádobách GA7, se testuje pomocí testu s chlorfenolovou červení (CR) jejich rezistence vůči PPT, jak popsali Shillito a kol., viz výše. Tento test využívá indikátorové barvivo citlivé na pH ke stanovení, které buňky rostou v přítomnosti PPT. Buňky, které rostou, způsobují změnu pH média, a barva indikátoru se změní z červené na žlutou. Tímto testem lze snadno určit rostliny exprimující gen rezistence vůči PPT. U rostlin pozitivních v testu s chlorfenylovou červení se pomocí polymerázové řetězové reakce testuje přítomnost syntetického genu Bt (u případu 170: 37 pozitivních, 18 negativních, u č.171: 25 pozitivních, 8 negativních).

Rostliny pozitivní při vyhledávání syntetického genu Bt pomocí polymerázové řetězové reakce se pošlou do fytotronu. Jakmile se rostliny ujmou ve fytotronu, charakterizují se za použití biologických testů s hmyzem a ELISA-testu. Biologické testy s hmyzem se u rostlin provádějí za použití standardního testu s Ostrinia nubilalis (viz níže), při kterém se z rostliny odstřihnou malé části listů a umístí v malé petriho misce s určitým počtem neonatálních larev Ostrinia nubilalis. Obvykle se rostliny testují ve výšce přibližně 15 cm. Rostliny, které vykazují v tomto testu 100% mortalitu pro Ostrinia nubilalis, se dále charakterizují. Údaje získané pomocí ELISA-testu jsou uvedeny níže. Pozitivní rostliny se přenesou do skleníku.

Testování pomocí herbicidu Basta

Pro zhodnocení rezistence vůči herbicidu Basta (Hoechst) se vybere osm zralých rostlin č.170. Na každé rostlině se na jednom listu ze středu rostliny plocha o délce 10 až 14 cm a šířce listu natře 0, 0,4, 1,0 nebo 2,0% (10 ml roztoku obsahujícího 200 g / 1 naředěných na 100 ml deionizovanou vodou) vodným roztokem Basta obsahujícím 2 kapky povrchově aktivního činidla Tween 20 / 100 ml. Pro každou koncentraci se použijí dvě testované rostliny. Jako kontroly se ošetří osm rostlin divokého typu 6N615 přibližně stejného stáří. Všechny rostliny se pozorují po 4 a 7 dnech. Všechny kontrolní rostliny nakonec odumřou. Během zkoumání nevykazuje žádná z rostlin č.170 jakékoli poškození vlivem herbicidu.

Opylení

Všechny palice z vlákniny, první palice, a, pokud se vyskytují, druhé palice na rostlinách č.170 a č.171 se opylí pylem divokého typu 6N615. Nejméně 90 % rostlin je fertilních, pokud se jedná o samičí fertilitu.

Pyl rostlin č.171 se zkříží s genotypy 6N615, 5N984, 5NA89, 6F010, 5NA56, 2N217AF, 2NDO1 a 3N961. Nejméně 90 % rostlin je fertilních, pokud se jedná o samčí fertilitu.

-75CZ 292953 B6

Vyjmutí embryí

Embrya z rostlin č. 171 se „vyjmou“. Čtrnáct až šestnáct dnů po opylení se vrchol palice s 25 až 50 zrny odřízne lupenkovou pilkou od palice. Před odříznutím se opatrně oloupají listové pochvy, aby se odkryla vrchní část palice. Uříznutý konec palice na rostlině se natře fungicidem Captan a listové pochvy se vrátí na původní místo. Semena, která zůstanou na rostlině, se nechají uschnout přirozeným způsobem.

Odříznutá část palice se povrchově sterilizuje 20% preparátem Clorox po dobu 20 minut a promyje třikrát sterilní vodou. Jednotlivá embrya se vyříznou a umístí štítkovou stranou nahoru na médium B5 (Gamborg) obsahující 2 % sacharózy. B5-vitamíny se přidají k médiu po autoklávování. Do každé nádoby GA7 se umístí čtyři embrya a nádoby se inkubují ve tmě. Když dojde ke klíčení, přenesou se nádoby do světlé kultivační místnosti a inkubují se při teplotě 25 °C za použití fotoperiody 16 hodin světla (50 μΕ . m^-2. s~’) a 8 hodin tmy. Klíčivost činí 94 %.

Potomstvo 15 rostlin č.171 a 2 rostlin č.176 se získá za použití standardních postupů vyjmutí embryí a provede se jeho zhodnocení. U všech rostlin se provede test na hmyzu. Rostliny z č.171 se též testují pomocí histochemického GUS-testu. Jak v testu na hmyzu, tak v GUS-testu je poměr segregace transgenů 1 : 1, jak se očekává v případě inzerce jediného lokusu.

Příklad 48

Analýza transgenických rostlin kukuřice ELISA-test

Exprese genu crylA(b) v transgenické kukuřici se monitoruje pomocí biologického testu na hmyzu za použití Ostrinia nubilalis a ELISA-testu pro kvantitativní stanovení množství získaného proteinu crylA(b). Kvantitativní stanovení insekticidního proteinu crylA(b) v listech transgenických rostlin se provede za použití ELISA-testů (enzyme-linked immunosorbant assays), jak popsali Clark M. F., Lister R. M., Bar-Joseph M.: ELISA Technieques. v: Weissbach A., Weissbach H. (eds.) Methods in Enzymology 118: 742 - 766, Academie Press, Florida 1986). Pro stanovení ng insekticidního proteinu na mg rozpustného proteinu ze surových extraktů ze vzorků listů se použijí imunoafinitně purifikované polyklonální králičí a kozí protilátky specifické pro insekticidní proteiny Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki. Citlivost ELISA-testu typu dvojitý sandwich (double sandwich ELISA) činí 1-5 ng insekticidního proteinu na mg rozpustného proteinu za použití 50 pg celkového proteinu na jamku mikrotitrační desky pro ELISA-test.

Extrakty z kukuřice se připraví rozmělněním listové tkáně v plastových sáčcích vyložených gázou za použití ručního homogenizátoru s kuličkami (AGDIA, Elkart, Indiana) za přítomnosti extrakčního pufru (50 mM uhličitanu sodného, pH 9,5, 100 mM chloridu sodného, 0,05 % preparátu Triton, 0,05 % povrchově aktivního činidla Tween, 1 mM PMSF a 1 μΜ leupeptinu). Stanovení proteinů se provede za použití proteinového testu Bio-Rad (Richmond, Kalifornie).

Za použití výše uvedeného postupu se analyzuje za použití ELISA-testu přítomnost proteinu crylA(b) ve výše popsaných primárních transformantech kukuřice. Výška těchto rostlin v době analýzy kolísá od přibližně 15 cm do přibližně 90 cm.

-76CZ 292953 B6

Rostlina ng Bt / mg rozpustného proteinu 5/27/91

176-8	0
176-10	700
176-11	760
171-4A	59
171-6	50
171-8	60
171-9	280
171-13	77
171-14A	43
171-14B	60
171-15	55
171-16A	13
171-16B	19
171-18	19
176-30	1160
171-32	980
171-31	166
171-30	370
71-14
list č. 10	26
list č. 1	17
rostlina 171-16
list č. 9	40
list č. 1	120

Test s Ostrinia nubilalis

1. Z rozvinutého listu rostliny kukuřice se nařežou 1 až 4 části o velikosti 4 cm.

2. Každá část listu se umístí na navlhčený list filtračního papíru v petriho misce o rozměrech 50 x 9 mm.

3. Na každou část listu se umístí pět neonatálních larev Ostrinia nubilalis (což odpovídá celkem 5 až 20 larvám na rostlinu).

4. Petriho misky se inkubují při teplotě 29,5 °C.

5. Údaje o poškození listů požerem a mortalitě se zjišťují po 24,48 a 72 hodinách.

Příklad 49

Exprese endotoxinu Bt v potomstvu transformovaných rostlin kukuřice

Transformované rostliny kukuřice jsou plně fertilní a zkříží se s několika genotypy kukuřice. U potomstev z těchto křížení se analyzuje jejich schopnost usmrtit Ostrinia nubilalis ve standardním biologickém testu s Ostrinia nubilalis (popsaném bezprostředně výše), jakož i přítomnost proteinu crylA(b) za použití ELISA-testu, jak je popsáno výše. Schopnost usmrtit Ostrinina nubilalis a produkce proteinu crylA(b) je v korelaci. Segregace těchto znaků u potomstva je v poměru 1:1, což svědčí o inzerci aktivní kopie syntetického genu do jediného místa. Tento poměr 1 : 1 platí jak pro rostliny obsahující konstitutivní promotor / syntetický crylA(b), tak pro rostliny obsahující tkáňově specifický promotor / syntetický crylA(b) (údaje nejsou uvedeny).

-TICZ 292953 B6

Na obrázku 23A je tabulka obsahující malou část z celkového počtu analyzovaného potomstva.

Tato tabulka je reprezentativní pro řadu odlišných křížení.

Za použití listového materiálu (jak je popsáno výše) z transgenického potomstva obsahujícího gen CrylA(b) optimalizovaný pro kukuřici se provedou testy na hmyzu za použití Diatraea saccharalis a Ostrinina nubilalis. Výsledky těchto testů jsou uvedeny na obrázku 23B, a svědčí o tom, že gen CrylA(b) optimalizovaný pro kukuřici poskytuje transformovaným rostlinám rezistenci vůči Diatraea saccharalis a Ostrinina nubilalis.

Příklad 50

Exprese genu crylA(b) v pylu kukuřice

Potomstvo transformovaných rostlin kukuřice obsahujících gen pylový promotor / syntetický crylA(b) získaný z pCIB4431 se pěstuje v polních podmínkách do dosažení zralosti. Pyl se izoluje a analyzuje se na přítomnost proteinu crylA(b) za použití standardních ELISA-testů, jak jsou popsány na libovolném místě. V pylu se detekují vysoké koncentrace proteinu crylA(b). Potomstvo rostlin transformovaných genem promotor 35S / syntetický crylA(b) se pěstuje ve skleníku. Pyl z těchto rostlin se analyzuje za použití ELISA-testu a detekuje se protein crylA(b).

Výsledky jsou uvedeny níže na obrázku 23C. Expresi mohou ovlivnit též různé faktory včetně výběru linií rostlin, rostlinných genotypů, syntetických sekvencí a podobně.

Příklad 51

Exprese genu crylA(b) fúzovaného s dřeňově preferovaným promotorem pCIB4433 (obrázek 36) je plazmid obsahující gen CrylA(b) optimalizovaný pro kukuřici fúzovaný s dřeňově preferovaným promotorem izolovaným z kukuřice. Tento plazmid se zkonstruuje pomocí ligace tří částí za použití:

1) fragmentu o velikosti 1,8 kb z pCIB4418 rozštěpeného BstEII a BamHI,

2) fragmentu o velikosti 5,9 kb z pBtibl rozštěpeného Nsil a BstEII, pBtinl je popsán kdekoliv v popisu,

3) fragmentu vytvořeného pomocí polymerázové řetězové reakce VI—151. který se získá polymerázovou řetězovou reakcí za použití standardních podmínek uvedených kdekoliv v popisu.

Použitými primery pro polymerázovou řetězovou reakci jsou:

KE150A28: 5' -ATT CGC ATG CAT GTT TCA TTA TC-3'

KE151A28: 5' -GCT GGT ACC ACG GAT CCG TCG CTT CTG TGC AAC AAC

C-3'

Po polymerázové řetězové reakci se DNA zkontroluje na agarózovém gelu kvůli ujištění, že reakce proběhla správně. DNA se izoluje z reakční směsi pro polymerázovou řetězovou reakci za použití standardních podmínek popsaných na libovolném místě a následně se rozštěpí restrikčními enzymy Nsil a BamHI za použití standardních postupů. Po rozštěpení se fragmenty

-78CZ 292953 B6 rozdělí na 2% NuSieve-gelu a požadovaný pás se izoluje, jak je popsáno na libovolném místě.

DNA se použije ve výše popsané ligaci.

Po ligaci (za standardních podmínek) se DNA transformuje do kompetentní buňky Escherichia coli.

Transformace se provádí za použití metody bombardování mikroprojektily, v podstatě jak je popsáno kdekoliv v popisu. Embrya se přenesou 24 hodin po bombardování mikroprojektily do média obsahujícího PPT v množství 10 pg / ml. Výsledný kalus se po čtyřech týdnech přenese do média obsahujícího PPT v množství 40 pg / ml. Rostliny se regenerují bez selekce.

Malý vzorek rostlin (3 až 5) pro každý případ se testuje pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR). K. vyjádření odlišných poloh a vzdáleností embryí vzhledem k zařízení pro bombardování mikroprojektily se přidá další označení. Rostliny se následujícími označeními se dají do skleníku:

JS21A TOP rostliny B.t. PCR-pozitivní JS21A MID rostliny B.t. PCR-pozitivní JS21C BOT rostliny B.t. PCR-pozitivní JS22D MID rostliny B.t. PCR-pozitivní JS23B MID rostliny B.t. PCR-negativní (kontrola)

U vzorků listů z regenerovaných rostlin se testuje v biologickém testu insekticidní aktivita proti Ostrinia nubilalis, jak je popsáno v příkladu 48. Výsledky jsou uvedeny na obrázku 23D.

Pro kvantifikaci množství proteinu CrylA(b) exprimovaného v listech se provede ELISA-test vzorků listů, jak je popsán v příkladu 48. Výsledky jsou uvedeny na obrázku 24E.

Uložení plazmidů

Podle Budapešťské úmluvy byly ve sbírce kultur Agricultural Research Culture Collection (NRRL) (1818 N. University St., Peoria, IL 61604) uloženy následující plazmidy: pCIB4418, pCIB4420, pCIB4429, pCIB4431, pCIB4433, pCIB5601, pCIB3166 a pCIB3171.

Vynález byl popsán na příkladech jeho specifických provedení, je však třeba vzít v úvahu, že umožňuje řadu variací, modifikací a jiných provedení. V souladu s tím je třeba brát v úvahu, že všechny takové variace, modifikace a provedení jsou v duchu vynálezu a spadají do jeho rozsahu.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (39)

1. Nukleotidová sekvence obsahující kódující sekvenci, která kóduje protein zBacillus thuringiensis schopný usmrtit hmyz, přičemž tato kódující sekvence vykazuje alespoň 90% homologii škodující sekvencí obsahující 100 % kukuřicí preferovaných kodónových sekvencí pro tento protein.

2. Nukleotidová sekvence podle nároku 1, kde uvedená kódující sekvence kóduje protein z Bacillus thuringiensis.

3. Nukleotidová sekvence podle nároku 2, kde uvedená kódující sekvence kóduje protein CrylA(b).

4. Nukleotidová sekvence podle nároku 3, kde uvedená kódující sekvence obsahuje sekvenci 3, sekvenci 4, nebo sekvenci znázorněnou na obrázku 7.

-79CZ 292953 B6

5. Nukleotidová sekvence podle nároku 3, kde kódující sekvence kóduje protein CrylA(b), který je ve srovnání s nativním proteinem CrylA(b) tepelně stabilní.

6. Nukleotidová sekvence podle nároku 5, kde uvedená kódující sekvence obsahuje sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence znázorněné na obrázku 9. obrázku 11, obrázku 13 a obrázku 15.

7. Nukleotidová sekvence podle nároku 2, kde uvedená kódující sekvence kóduje protein CrylB nebo CrylA(c).

8. Nukleotidová sekvence podle nároku 7, kde uvedená kódující sekvence obsahuje sekvenci, která kóduje protein CrylB, znázorněnou na obrázku 6.

9. Nukleotidová sekvence podle libovolného z nároků 1 až 8, která dále obsahuje první promotor schopný řídit expresi nukleotidové sekvence v rostlinné buňce, operabilně spojený s uvedenou kódující sekvencí.

10. Nukleotidová sekvence podle nároku 9, kde uvedený promotor je schopen řídit expresi připojené kódující sekvence v buňce kukuřice.

11. Nukleotidová sekvence podle nároků 9 nebo 10, kde uvedený promotor je vybrán ze skupiny zahrnující indukovatelné promotory, konstitutivní promotory, časově nebo vývojově regulované promotory, tkáňově preferované a tkáňově specifické promotory.

12. Nukleotidová sekvence podle nároku 11, kde uvedený promotor je vybrán ze skupiny zahrnující promotor CaMV 35S, promotor CaMV 19S, promotor fosfoenolpyruvát-karboxylázy, dřeňově preferovaný promotor a pylově specifický promotor.

13. Nukleotidová sekvence podle nároku 12, kde uvedený promotor je schopen v rostlině řídit pylově specifickou expresi připojeného strukturního genu, přičemž tento promotor je izolován z rostlinného genu kalcium-dependentní fosfát-kinázy, tedy CDPK.

14. Nukleotidová sekvence podle nároku 12, kde uvedený promotor je schopen v rostlině řídit dřeňově preferovanou expresi připojeného strukturního genu, přičemž tento promotor je izolován z rostlinného genu alfa podjednotky tryptofan-syntázy, tedy TrpA.

15. Nukleotidová sekvence podle libovolného z nároků 13 nebo 14, kde uvedený promotor je izolován z jednoděložné rostliny.

16. Nukleotidová sekvence podle nároku 15, kde uvedený promotor je izolován z rostliny kukuřice.

17. Nukleotidová sekvence podle nároku 14, kde uvedeným promotorem je dřeňově preferovaný promotor obsahující sekvenci DNA znázorněnou na obrázku 24.

18. Nukleotidová sekvence podle nároku 13, kde uvedeným promotorem je pylově specifický promotor obsahující sekvenci DNA znázorněnou na obrázku 35.

19. Nukleotidová sekvence podle nároku 9, která dále obsahuje druhý promotor schopný řídit expresi připojené kódující sekvence v rostlinné buňce, operativně spojený s druhou kódující sekvencí.

20. Nukleotidová sekvence podle nároku 19, kde uvedený druhý promotor je promotor uvedený v libovolném z nároků 10 až 18.

-80CZ 292953 B6

21. Nukleotidová sekvence podle nároku 19, kde uvedená druhá kódující sekvence kóduje protein schopný usmrtit hmyz a vykazuje alespoň 90% homologii s kódující sekvencí obsahující 100 % kukuřicí preferovaných kodónových sekvencí pro tento protein.

22. Nukleotidová sekvence podle nároku 21, kde uvedená druhá kódující sekvence kóduje protein z Bacillus thuringiensis.

23. Nukleotidová sekvence podle nároku 22, kde uvedená druhá kódující sekvence kóduje protein CrylA(b).

24. Nukleotidová sekvence podle nároku 19, kde uvedenou druhou kódující sekvencí je markerový gen.

25. Rekombinantní vektor, který obsahuje nukleotidovou sekvenci podle libovolného z nároků 1 až 18.

26. Rekombinantní vektor, který obsahuje nukleotidovou sekvenci podle libovolného z nároků 19 až 24.

27. Rostlina stabilně transformovaná nukleotidovou sekvencí podle libovolného z nároků 1 až 18.

28. Rostlina stabilně transformovaná nukleotidovou sekvencí podle libovolného z nároků 19 až 24.

29. Rostlina podle nároku 27, kde shora uvedená kódující sekvence kóduje protein z Bacillus thuringiensis.

30. Rostlina podle nároku 28, kde alespoň jedna uvedená kódující sekvence kóduje protein z Bacillus thuringiensis.

31. Rostlina podle nároku 30, kde jak první, tak druhá kódující sekvence kóduje protein z Bacillus thuringiensis.

32. Rostlina podle libovolného z nároků 29 až 31, kde proteinem z Bacillus thuringiensis je protein CrylA(b).

33. Rostlina podle nároku 32, ve které je uvedený protein exprimován v množství dostatečném pro kontrolu hmyzu z řádu motýlů nebo brouků.

34. Rostlina podle nároku 33, ve které je protein exprimován v množství dostatečném pro kontrolu hmyzu vybraného ze skupiny zahrnující Ostrinia nubilalis, Diatraea saccharalis, různé druhy rodu Papaiema, osenice, různé druhy rodu Spodoptera, travaříky, drátovce a mšice.

35. Potomstvo transgenické rostliny podle libovolného z nároků 27 až 34, které obsahuje ve svém genomu stabilně integrovanou nukleotidovou sekvenci nebo její části obsahující první promotor schopný řídit expresi nukleotidové sekvence v rostlinné buňce, operabilně spojený s kódující sekvencí, která kóduje protein z Bacillus thuringiensis schopný usmrtit hmyz, přičemž tyto kódující sekvence vykazuje alespoň 90% homologii s nukleotidovou sekvencí obsahující 100% kukuřicí preferovaných kodónových sekvencí pro tento protein, takže tato kódující sekvence exprimuje uvedený protein v množství dostatečném pro ochranu rostliny proti hmyzím škůdcům.

-81 CZ 292953 B6

36. Způsob vytvoření kódující sekvence insekticidního proteinu z Bacillus thuringiensis pro kukuřici, přičemž tyto kódující sekvence vykazuje alespoň 90% homologii s kódující sekvencí obsahující 100 % kukuřicí preferovaných kodónových sekvencí pro tento protein, vyznačující se tí m , že se stanoví sekvence aminokyselin předem určeného insekticidního proteinu z Bacillus thuringiensis, a kódující sekvence proteinu se změní nahrazením odpovídajících nativních kodonů kodony, které jsou nejvíce preferované v kukuřici tak, že tato kódující sekvence pro kukuřici vykazuje alespoň 90% homologii škodující sekvencí čistě pro kukuřici, obsahující 100 % kukuřicí preferovaných kodónových sekvencí pro tento protein.

37. Způsob ochrany rostliny kukuřice proti alespoň jednomu hmyzímu škůdci, vyznačující se tí m, že se rostlina kukuřice stabilně transformuje alespoň jednou nukleotidovou sekvencí podle libovolného z nároků 1 až 24, přičemž tato kódující sekvence kóduje insekticidní protein, takže tato transformovaná rostlina kukuřice exprimuje insekticidní protein v množství dostatečném pro ochranu rostliny proti škůdci.

38. Rostlina stabilně transformovaná nukleotidovou sekvencí, přičemž tato nukleotidová sekvence obsahuje kódující sekvenci pro kukuřici a tato kódující sekvence vykazuje alespoň 90% homologii škodující sekvencí obsahující 100% kukuřicí preferovaných kodónových sekvencí pro insekticidní protein z Bacillus thuringiensis, přičemž tento protein je v této transformované rostlině exprimován v množství alespoň stonásobně vyšším než při expresi proteinu za použití nativní kódující sekvence.

39. Způsob vytvoření potomstva transgenické rostliny kukuřice obsahujícího ve svém genomu stabilně integrovanou kódující sekvenci pro insekticidní protein z Bacillus thuringiensis, vyznačující se tím, že se (a) připraví nukleotidová sekvence obsahující první promotor schopný řídit expresi nukleotidové sekvence v rostlinné buňce, operabilně spojený s kódující sekvencí, která kóduje protein schopný usmrtit hmyz, přičemž tato kódující sekvence vykazuje alespoň 90% homologii s kódující sekvencí obsahující 100 % kukuřicí preferovaných kodónových sekvencí pro tento protein, (b) nukleotidová sekvence připravená podle stupně (a) se introdukuje do rostliny, takže se tato nukleotidová sekvence nebo její části funkčně integrují do rostlinného genomu a exprimují uvedený protein v množství dostatečném pro ochranu rostliny proti hmyzím škůdcům, a (c) rostlina získaná ve stupni (b) se kříží s několika genotypy kukuřice pro získání potomka obsahujícího ve svém genomu stabilně integrovanou kódující sekvenci pro insekticidní protein optimalizovanou pro kukuřici tak, že je tento insekticidní protein exprimován v množství dostatečném pro ochranu rostliny proti hmyzím škůdcům.