ES2241710T3

ES2241710T3 - Procedimiento para producir proteinas multivalentes de union a antigeno.

Info

Publication number: ES2241710T3
Application number: ES01109203T
Authority: ES
Inventors: Marc D. Whitlow; James F. Wood; Karl Hardman; Robert E. Bird; David Filpula; Michele Rollence
Original assignee: Enzon Inc
Current assignee: Enzon Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1991-11-25
Filing date: 1992-11-20
Publication date: 2005-11-01
Anticipated expiration: 2012-11-20
Also published as: ATE207080T1; ES2165851T3; DK0617706T3; DE69233528D1; AU3178993A; DE69232137T2; EP1136556A1; ATE297465T1; JPH07501451A; EP0617706A4; DE69232137D1; EP0617706B1; DK1136556T3; CA2122732C; EP0617706A1; WO1993011161A1; CA2122732A1; US20060063715A1; DE69233528T2; EP1136556B1

Abstract

Un procedimiento para producir una proteína multivalente de unión a antígeno caracterizado porque comprende: (a) producir una composición que comprende moléculas monocatenarias, comprendiendo cada molécula monocatenaria: (i) un primer polipéptido que comprende la porción de unión de la región variable de una cadena ligera o pesada de un anticuerpo. (ii) un segundo polipéptido que comprende la porción de unión de la región variable de una cadena ligera o pesada de un anticuerpo; y (iii) un ligador peptídico que une el primer y el segundo polipéptidos (i) y (ii) en dicha molécula monocatenaria; (b) disociar dichas moléculas monocatenarias; (c) reasociar dichas moléculas monocatenarias; (d) separar las proteínas multivalentes de unión a antígeno de dichas moléculas monocatenarias; y (e) recuperar dichas proteínas multivalentes

Description

Procedimiento para producir proteínas multivalentes de unión a antígeno.

Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención

Esta invención se refiere a un procedimiento para producir proteínas multivalentes de unión a antígeno.

2. Descripción de la técnica anterior

Los anticuerpos son proteínas generada por el sistema inmunitario para proporcionar una molécula específica capaz de formar un complejo con una molécula invasora denominada antígeno. La Figura 14 muestra la estructura de una molécula de anticuerpo típica. Los anticuerpos naturales poseen dos sitios idénticos de unión a antígeno, ambos específicos de un antígeno concreto. La molécula de anticuerpo "reconoce" el antígeno formando un complejo mediante sus puntos de unión al antígeno con áreas del antígeno denominados epítopos. Los epítopos caben en la arquitectura conformacional de los puntos de unión al antígeno del anticuerpo, lo que permite al anticuerpo unirse al antígeno.

La molécula de anticuerpo está compuesta por dos cadenas polipeptídicas pesadas idénticas y dos ligeras también idénticas, unidas entre sí mediante puentes disulfuro entre las cadenas (Fig. 14). El resto de este análisis sólo se referirá a un par de cadenas ligera/pesada, ya que cada par ligera/pesada es idéntico. Cada cadena ligera y pesada individual se pliega en regiones de aproximadamente 110 aminoácidos y suma una conformación tridimensional conservada. La cadena ligera comprende una región variable (denominada V_{L}) y una región constante (C_{L}), mientras que la cadena pesada comprende una región variable (V_{H}) y tres regiones constantes (C_{H}1, C_{H}2 y C_{H}3). Los pares de regiones se asocian para formar pequeñas estructuras como se muestra en la figura 14. En particular, las regiones variables de las cadenas ligera y pesada, V_{L} y V_{H}, se asocian para formar un área "F_{V}" que contiene el sitio de unión al antígeno.

Las regiones variables de las cadenas ligera y pesada muestran una variabilidad considerable en la estructura y la composición de aminoácidos de una molécula de anticuerpo a otra, mientras que las regiones constantes muestran poca variabilidad. El término "variable", como se usa en esta memoria descriptiva, se refiere a la diversa naturaleza de las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de las cadenas ligera y pesada de los anticuerpos. Cada anticuerpo reconoce y se une a un antígeno a través de su punto de unión, definido por la asociación de las regiones variables de las cadenas ligera y pesada en un área F_{V}. La región variable de la cadena ligera V_{L} y la región variable de la cadena pesada V_{H} de una molécula de anticuerpo concreta poseen secuencias de aminoácidos específicas que permiten al sitio de unión al antígeno asumir una conformación que se una al epítopo del antígeno reconocido por ese anticuerpo concreto.

En las regiones variables existen regiones en las que la secuencia de aminoácidos es extremadamente variable de un anticuerpo a otro, Tres de estas regiones denominadas "hipervariables" o "regiones determinantes de complementariedad" (CDR) se encuentran en cada una de las cadenas ligera y pesada. Las tres CDR de una cadena ligera y las tres CDR de la correspondiente cadena pesada forman el sitio de unión al antígeno.

La escisión de la molécula de anticuerpo natural con la enzima proteolítica papaína genera fragmentos que retienen su sitio de unión al antígeno. Estos fragmentos, habitualmente conocidos como Fab (de fragmento, sitio de unión al antígeno) están compuestos por las regiones C_{L}, V_{L}, C_{H}1 y V_{H} del anticuerpo. En la Fab, la cadena ligera y el fragmento de la cadena pesada están unidos covalentemente por un puente disulfuro.

Los recientes avances en inmunobiología, tecnología de ADN recombinante y en informática han permitido la creación de moléculas polipeptídicas de una cadena que se unen al antígeno. Estas moléculas monocatenarias de unión al antígeno incorporan un polipéptido de unión para unir las regiones variables individuales, V_{L} y V_{H}, en una única cadena polipeptídica. Un procedimiento asistido por ordenador para el diseño de ligador se describe más particularmente en la patente de EE.UU. nº 4.704.692, concedida a Ladner y col., en noviembre, 1987. En la patente de EE.UU. nº 4.946.778 (Ladner y col.), expedida el 7 de agosto de 1990, se puede encontrar una descripción de la teoría y la producción de proteínas monocatenarias de unión a antígeno. Las proteínas monocatenarias de unión a antígeno producidas mediante el procedimiento citado en la patente de EE.UU. 4.946.778 poseen una especificidad y afinidad de unión sustancialmente similares a la del correspondiente fragmento Fab.

Los anticuerpos bifuncionales, o biespecíficos, poseen sitios de unión a antígeno de especificidades diferentes. Los anticuerpos biespecíficos se han generado para liberar células, citotoxinas o fármacos en sitios específicos. Un uso importante ha sido liberar células citotóxicas del huésped, tal como células asesinas naturales o linfocitos T citotóxicos, a objetivos celulares específicos. (U. D. Staerz, O. Kanagawa, M. J. Bevan, Nature 314: 628 (1985); S. Songilvilai, P. J. Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79: 315 (1990)). Otro uso importante ha sido liberar proteínas citotóxicas a objetivos celulares específicos. (V. Raso, T. Griffin, Cancer Res. 41: 2073 (1981); S. Honda, Y. Ichimori, S. Iwasa, Cytotechnology 4: 59 (1990). Otro uso importante ha sido liberar fármacos no proteicos anticancerosos a objetivos celulares específicos. (J. Corvalan, W. Smith, V. Gore, Intl. J. Cancer Suppl. 2:22 (1998); M. Pimm y col., British J. of Cancer 61: 508 (1990)). Tales anticuerpos biespecíficos se han preparado mediante sobrecruzamiento químico (M. Brennan y col., Science 229: 81 (1985)), intercambio de disulfuros, o la producción de híbrido-hibridomas (cuadromas). Los cuadromas se construyen mediante la condensación de hibridomas que secretan dos tipos diferentes de anticuerpos contra dos antígenos diferentes (Kurokawa, T. y col., Biotechnology 7: 1163 (1989)).

Resumen de la invención

Esta invención se refiere al descubrimiento de que formas multivalentes de proteínas monocatenarias de unión a antígeno poseen una utilidad significativa más allá de la de la proteínas monovalentes monocatenarias de unión a antígeno. Una proteína multivalente de unión a antígeno tiene más de un sitio de unión a antígeno. Se ha demostrado o se pronostica que poseen una actividad de unión intensificada, unión di y multiespecífica y otros usos nuevos de las proteínas multivalentes de unión a antígeno.

La presente invención proporciona un procedimiento para producir una proteína multivalente de unión a antígeno que se caracteriza porque comprende:

(a) producir una composición que comprende moléculas monocatenarias, comprendiendo cada molécula monocatenaria:

(i): un primer polipéptido que comprende la porción de unión de la región variable de una cadena ligera o pesada de anticuerpo.

(ii): un segundo polipéptido que comprende la porción de unión de la región variable de una cadena ligera o pesada de anticuerpo; y

(iii): un ligador peptídico que une el primer y el segundo polipéptidos (i) y (ii) en dicha molécula monocatenaria;

(b) disociar dichas moléculas monocatenarias;

(c) reasociar dichas moléculas monocatenarias;

(d) separar las proteínas multivalentes de unión a antígeno de dichas moléculas monocatenarias; y

(e) recuperar dichas proteínas multivalentes.

La disociación puede producirse mediante diálisis contra la solución de disociación. La reasociación puede producirse mediante diálisis contra una solución de replegamiento o un agente de replegamiento. Las moléculas monocatenarias pueden concentrarse antes de separar la proteína multivalente a partir de moléculas monocatenarias. Por ejemplo, la concentración se puede producir desde aproximadamente 0,5 mg/ml de molécula monocatenaria a la concentración a la que comienza la precipitación.

En una forma de realización preferida, una cadena ligera variable de una primera proteína monocatenaria de unión a antígeno se asocia con una cadena pesada variable de una segunda proteína monocatenaria de unión a antígeno.

Habiendo indicado el alcance de la presente invención, a continuación se puede describir adicionalmente e ilustrar en términos más generales.

Una ventaja de usar proteínas multivalentes de unión a antígeno en lugar de moléculas monocatenarias de unión a antígeno o fragmentos Fab reside en la mayor capacidad de unión de la forma multivalente. Esta unión potenciada se produce porque la forma multivalente posee más sitios de unión por molécula. Otra ventaja es la capacidad para usar proteínas multivalentes de unión a antígeno como moléculas de unión multiespecífica.

Una ventaja de usar proteínas multivalentes de unión a antígeno en lugar de anticuerpos enteros es el mayor aclaramiento de las proteínas multivalentes de unión a antígeno del suero debido a su menor tamaño en comparación con los anticuerpos enteros, que puede producir un fondo menor en las técnicas de imagen. Las proteínas multivalentes de unión a antígeno pueden penetrar en tumores sólidos mejor que los anticuerpos monoclonales, lo que tiene como resultado una mejor capacidad de lucha contra el tumor, Asimismo, dado que son más pequeños y carecen del componente Fc de los anticuerpos intactos, las proteínas multivalentes de unión a antígeno que se pueden producir de acuerdo con la presente invención pueden ser menos inmunogénicas que los anticuerpos enteros. El componente Fc de los anticuerpos enteros también contiene sitios de unión para células hepáticas, del bazo y otras y, por tanto, su ausencia debería reducir la acumulación en tejidos no objetivo.

Otra ventaja de las proteínas multivalentes de unión a antígeno es la facilidad con la que se pueden producir y someter a técnicas de ingeniería genética, en comparación con la técnica de fusión de mieloma de la que fueron pioneros Kohler y Milstein, que se usa para producir anticuerpos enteros.

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Breve descripción de las figuras

La presente invención, como se define en las reivindicaciones, se puede entender mejor haciendo referencia al texto y a las siguientes figuras:

Fig. 1A es una representación esquemática bidimensional de dos moléculas idénticas proteicas monocatenarias de unión a antígeno, en la que cada una comprende una región variable de cadena ligera (V_{L}), comprende una región variable de cadena pesada (V_{H}) y un ligador polipeptídico que une las dos regiones. Las moléculas proteicas monocatenarias de unión a antígeno muestran unión a antígeno en sus sitios de unión a antígeno.

Fig. 1B representa una hipotética proteína homodivalente de unión a antígeno formada mediante asociación de los ligadores polipeptídicos de la Fig. 1A (modelo de asociación). La proteína divalente de unión a antígeno se forma mediante la asociación estimulada por concentración de dos moléculas idénticas proteicas monocatenarias de unión a antígeno.

Fig. 1C. representa la proteína divalente hipotética de la Fig. 1B con moléculas de antígeno unidas o cuando ambos sitios de unión a antígeno.

Fig. 2A representa la proteína homovalente hipotética de la Fig. 1B.

Fig. 2B representa tres moléculas proteicas monocatenarias de unión a antígeno asociadas con un hipotético trímero.

Fig. 2C. representa un hipotético tetrámero de cuatro moléculas proteicas monocatenarias de unión a antígeno.

Fig. 3A. Representa dos proteínas monovalentes monocatenarias de unión a antígeno separadas y distintas, una proteína antiA monocatenaria de unión a antígeno y una proteína antiB monocatenaria de unión a antígeno, con diferentes especificidades, uniéndose cada una de forma individual al antígeno A o al antígeno B.

Fig. 3B representa una hipotética proteína heterodivalente biespecífica de unión a antígeno formada a partir de las proteínas monocatenarias de unión a antígeno de la Fig. 3A según el modelo de asociación.

Fig. 3C. representa la hipotética proteína heterodivalente biespecífica de unión a antígeno de la Fig. 3B de unión biespecífica, es decir, de unión a dos antígenos diferentes, A y B.

Fig. 4A. Representa dos moléculas idénticas monocatenarias de unión a antígeno, en la que cada una posee una región variable de la cadena ligera (V_{L}), una región variable de la cadena pesada (V_{H}), y un ligador polipeptídico que une las dos regiones. Las moléculas proteicas monocatenarias de unión a antígeno muestran moléculas idénticas de antígeno en sus sitios de unión al antígeno.

Fig. 4B. representa una proteína homovalente hipotética formada mediante la reorganización de las regiones V_{L} y V_{H} que se muestran en la Fig. 4A (modelo de reorganización). También se muestra el antígeno unido.

Fig. 5A representa dos moléculas proteicas monocatenarias, en al que la primera posee una V_{L} antiB y una V_{H} anti-A y la segunda una V_{L} antiA y V_{H} antiB. La figura muestra la naturaleza no complementaria de las regiones V_{L} y V_{H} en cada molécula proteína monocatenaria.

Fig. 5B muestra una proteína hipotética heterodivalente biespecífica de unión a antígeno formada por la reorganización de dos proteínas monocatenarias de la Figura 5A.

Fig. 5C representa la proteína hipotética heterodivalente de unión a antígeno de la figura 5B con diferentes antígenos A y B ocupando sus respectivos sitios de unión a antígeno.

Fig. 6A. Es una representación esquemática de una proteína hipotética trivalente de unión a antígeno de acuerdo con el modelo de reorganización.

Fig. 6B es una representación esquemática de una proteína hipotética tetravalente de unión a antígeno de acuerdo con el modelo de reorganización.

Fig. 7. es un cromatograma que representa la separación del monómero de la proteína de unión a antígeno CC49/212 del dímero en una columna de cromatografía líquida de alto rendimiento de intercambio de cationes. La columna es una columna de PolyCAT A ácido aspártico (Poly WC, Columbia, MD). El monómero se muestra en el Pico 1, eluyendo a 27,3 min y el dímero se muestra en el Pico 2, eluyendo a 55,52 min.

Fig. 8. es un cromatograma del monómero purificado de la fig. 7. El monómero eluye a 21,94 min, precedido por el dímero (20,135) y el trímero (18,640). Columna de filtración en gel, Protein-Pak 300SW (Waters Associates, Milford, MA).

Fig. 9 es un cromatograma similar del dímero purificado (20,14 min) de la Fig, 7, en la columna HPLC de filtración en gel de la Fig. 8.

Fig. 10A. Es una secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº 11) y nucleotídica (SEC ID Nº 10)de la proteína monocatenaria que comprende la región variable V_{L} 4.4 20, conectada a través del polipéptido ligador a la región V_{H} 4.4.20.

Fig. 10B. Es una secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº 13) y nucleotídica (SEC ID Nº 12) de la proteína monocatenaria que comprende la región variable V_{L}CC49, conectada a través del polipéptido ligador 212 a la región V_{H} 4.4.20.

Fig. 11. es un cromatograma que representa la separación de las formas monómero (27,83 min) y dímero (50,47 min) de la proteína de unión a antígeno CC49/212 mediante intercambio de cationes en una columna de intercambio de cationes PolyCAT A (Poly WC, Columbia, MD).

Fig. 12 muestra la separación del monómero (17,65 min), el dímero (15,79 min), el trímero (14,19 min) y oligómeros superiores (a aproximadamente 13,09 min) de la proteína de unión a antígeno B6.2/212. Esta separación representa los resultados de un tratamiento de 24 horas de una muestra de proteína monocatenaria de unión a antígeno B6.2/212 a una concentración de 1,0 mg/ml. Se usó una columna HPLC de filtración en gel TSK G2000SW, Toyo Soda, Tokyo, Japón.

Fig. 13 muestra los resultados de un tratamiento de 24 horas de una muestra de proteína de unión a antígeno CC49/212, generando monómero, dímero y trímero a 16,91, 14,9 y 13,42 min respectivamente. Se usó la misma columna de filtración en gel TSK que en la Fig. 12.

Fig. 14. muestra una vista esquemática de la estructura de cuatro cadenas de una molécula IgG humana.

Fig. 15A es una secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº 15) y nucleotídica (SEC ID Nº 14) de la proteína monocatenaria de unión a antígeno 4-4-20/212 con un único dominio bisagra de cisteína.

Fig. 15B es una secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº 17) y nucleotídica (SEC ID Nº 6) de la proteína monocatenaria de unión a antígeno 4-4-20/212 con un dos dominios bisagras de cisteína.

Fig. 16 es una secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº 19) y nucleotídica (SEC ID Nº 18) de una proteína divalente monocatenaria de unión a antígeno CC49/212.

Fig. 17 muestra la expresión de la proteína divalente monocatenaria de unión a antígeno CC49/212 de la Fig. 16 a 42ºC en un gel de SDS-PAGE que contiene proteína E. coli total. El carril 1 contienen los patrones de referencia de pesos moleculares. El carril 2 es la cepa productora de E. coli non inducida cultivada a 30ºC. El carril 3 es la proteína divalente monocatenaria de unión a antígeno CC49/212 inducido por el crecimiento a 42ºC. La flecha muestra la banda de proteína divalente monocatenaria de unión a antígeno CC49/212.

Fig. 18 es una representación gráfica de cuatro radioinmunoensayos (RIA) competitivos en los que IgG sin marcar de CC49 (círculos vacíos), proteína monocatenaria de unión a antígeno CC49/212 (círculos llenos) y proteína divalente de unión a antígeno CC49/212 (cuadrados llenos) y proteína monocatenaria de unión a antígeno anti-fluoresceína 4-4-20/212 (cuadrados vacíos) competían contra una IgG de CC49 radio marcada con 125I por la unión al antígeno TAG-72 en un extracto de carcinoma de mama humano.

Fig. 19A es una secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº 21) y nucleotídica (SEC ID Nº 20) de un polipéptido monocatenario que comprende la región V_{L} de 4-4-20 conectada a través del polipéptido de unión 217 a la región V_{H} de CC49.

Fig. 19B es una secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº 23) y nucleotídica (SEC ID Nº 22) de un polipéptido monocatenario que comprende la región V_{L} de CC49 conectada a través del polipéptido de unión 217 a la región V_{H} de 4-410.

Fig. 20 es un cromatograma que representa la purificación de la Fv heterodímero de CC49/4-420 en una columna de cromatografía en líquido de alto rendimiento de intercambio de cationes. La columna es una columna de PolyCAT A ácido aspártico (Poly LC, Columbia, MD). El Fv heterodímero se muestra en el pico 5, eluyendo a 30,10 min.

Fig. 21 es un gel de SDS-PAGE al 4-20% con tinción de azul de coomassie que muestra las proteínas separadas en la Figura 20. El carril 1 contiene las referencias de pesos moleculares. El carril 3 contiene el material de partida antes de la separación. Los carriles 4-8 contienen las fracciones 2, 3, 5, 6 y 7, respectivamente. El carril 9 contiene CC49/212.

Figura 22A es un cromatograma usado para determinar el tamaño molecular de la fracción 2 de la figura 20. S usó una columna HPLC de filtración en gel TSK G3000SW (Toyo Soda, Tokyo, Japón).

Figura 22B es un cromatograma usado para determinar el tamaño molecular de la fracción 5 de la figura 20. S usó una columna HPLC de filtración en gel TSK G3000SW (Toyo Soda, Tokyo, Japón).

Figura 22C es un cromatograma usado para determinar el tamaño molecular de la fracción 6 de la figura 20. S usó una columna HPLC de filtración en gel TSK G3000SW (Toyo Soda, Tokyo, Japón).

Figura 23 muestra un análisis de Scatchard de la afinidad de unión a la fluoresceína del Fv heterodímero CC49 4-4-20 (Fracción 5 de la figura 20).

Figura 24 es una representación gráfica de tres ensayos de inmunoabsorción ligada a enzimas (ELISA) competitivos en los que Fv de CC49 4-420 sin marcar (cuadrados llenos), Fv monocatenario de CC49/212 (cuadrados vacíos) y IgG MOPC-21 (+) competían contra una IgG de CC49 marcada con biotina por la unión al antígeno TAG-72 en un extracto de carcinoma de mama humano. El MOPC-21 es un anticuerpo control que no se une al antígeno TAG-72.

Figura 25 muestra un gel de SDS-PAGE al 4-20% no reductor con tinción de azul de coomassie. Los carriles 1 y 9 contienen las referencias de pesos moleculares. El carril 3 contiene la proteína monocatenaria de unión a antígeno CPPC 4-4-20/212 después de la purificación. Los carriles 4, 5 y 6 contienen la proteína monocatenaria de unión a antígeno CPPC 4-4-20/212 después del tratamiento con DRR y oxidación al aire. El carril 7 contiene la proteína monocatenaria de unión a antígeno 4-4-20/212.

Figura 26 muestra un gel de SDS-PAGE al 4-20% reductor con tinción de azul de coomassie (las muestras se trataron con \beta-mercaptoetanol) antes de cargarse en el gel). Los carriles 1 y 8 contienen las referencias de pesos moleculares. El carril 3 contiene la proteína monocatenaria de unión a antígeno CPPC 4-4-20/212 después del tratamiento con bis-maleinidehexano. El carril 5 contiene el pico 1 de proteína monocatenaria de unión a antígeno CPPC 4-4-20/212 tratada con bis-maleinidehexano. El carril 6 contiene el pico 3 de proteína monocatenaria de unión a antígeno CPPC 4-4-20/212 tratada con bis-maleinidehexano.

Descripción detallada de las formas de realización preferidas

Esta invención se refiere al descubrimiento de que formas multivalentes de proteínas monocatenarias de unión a antígeno poseen una utilidad significativa más allá de la de la proteínas monovalentes monocatenarias de unión a antígeno. Una proteína multivalente de unión a antígeno tiene más de un sitio de unión a antígeno. Para los propósitos de esta solicitud, "valente" se refiere a los numerosos sitios de unión al antígeno. Por tanto, una proteína bivalente se refiere a una proteína con dos sitios de unión. Se ha demostrado o se pronostica que poseen una actividad de unión intensificada, unión bi y multiespecífica y otros usos nuevos de las proteínas multivalentes de unión a antígeno. La presente invención está dirigida al procedimiento anterior de producir una proteína multivalente de unión al antígeno.

Para los presentes propósitos, el término "multivalente" quiere decir cualquier ensamblaje covalente o no covalentemente unido, de dos o más proteínas monocatenarias, teniendo el ensamblaje más de un sitio de unión al antígeno. Las proteínas monocatenarias que componen el ensamblaje pueden poseer actividad de unión al antígeno, o pueden carecer de actividad de unión al antígeno de forma individual pero ser capaces de ensamblarse en proteínas multivalentes activas de unión a antígeno. El término "multivalente" abarca bivalente, trivalente, tetravalente, etc. Se ha pronosticado que las formas multivalentes bivalentes anteriores pueden ser útiles para ciertas aplicaciones.

Una forma preferida de la proteína multivalente de unión a antígeno comprende proteínas bivalentes, incluidas formas heterobivalentes y homobivalentes. El término "bivalente" quiere decir un ensamblaje de proteínas monocatenarias asociadas entre sí para formar dos sitios de unión a antígeno. El término "heterobivalente" indica proteínas multivalentes de unión a antígeno que son moléculas biespecíficas capaces de unirse a dos determinantes antigénicos distintos. Por tanto, las proteínas heterobivalentes poseen dos sitios de unión a antígeno que tienen especificidades de unión diferentes. El término "homobivalente" indica que los dos sitios de unión son para el mismo determinante antigénico.

En la presente memoria los términos "molécula monocatenaria" o "proteína monocatenaria" se usan de forma intercambiable. Estructuralmente se defines como que comprenden la porción de unión de un primer polipéptido de la región variable de un anticuerpo, asociada con la poción de unión de un segundo polipéptido de la región variable de un anticuerpo, estando los dos polipéptidos unidos por un péptido de unión que une los primero y segundo polipéptidos en una única cadena polipeptídica. Por tanto, la única cadena polipeptídica comprende un par de regiones variables conectadas por un ligador polipeptídico. Las regiones pueden asociarse para formar un sitio funcional de unión a antígeno, como es el caso en el que las regiones comprenden un par de regiones variables de la cadena ligera y de la cadena variable con las regiones determinantes de la complementariedad (CRD) adecuadamente emparejadas. En este caso, la proteína monocatenaria se denomina "proteína monocatenaria de unión a antígeno" o "molécula monocatenaria de unión a antígeno".

Como alternativa, las regiones variables pueden tener CRD emparejadas de un modo no natural o pueden ambas derivar del mismo tipo de cadena de anticuerpo, bien ligera o bien pesada, en cuyo caso la molécula monocatenaria resultante puede no exhibir un sitio funcional de unión a antígeno. La molécula proteica monocatenaria de unión a antígeno se describe con más detalle en la patente de EE.UU. nº 4.946.778 (Ladner y col.)

Sin pretender estar limitado por ninguna teoría concreta, los inventores han especulado con varios modelos que podrían explicar igualmente el fenómeno de las multivalencias. Los modelos de los inventores se presentan en la presente memoria descriptiva únicamente a modo de ilustración. La invención es útil y funciona con independencia del mecanismo exacto de multivalencia.

La figura 1 representa el primer modelo hipotético para la creación de una proteína multivalente, el modelo de "Asociación" de la figura 1A muestra dos proteínas monocatenarias monovalentes de unión a antígeno, cada una compuesta por una V_{L}, una V_{H} y un polipéptido de unión que las une covalentemente. Cada proteína monocatenaria monovalente de unión a antígeno se representa con un sitio de unión a antígeno idéntico que contiene el antígeno. La figura 1B muestra la simple asociación de las dos proteínas monocatenaria de unión a antígeno para crear la forma bivalente de la proteína multivalente. Se ha postulado la hipótesis de que simples fuerzas hidrofóbicas entre las proteínas monovalentes son responsables de su asociación de esta manera. El origen de las proteínas multivalentes puede seguirse hasta su dependencia de la concentración. Las unidades monovalentes retienen su asociación original entre las regiones
V_{H} y V_{L}. La figura 1C muestra la proteína homobivalente recién formada uniendo dos moléculas antigénicas de forma simultánea. Las proteínas homobivalentes de unión a antígeno son necesariamente monoespecíficas para un antígeno.

Las proteínas homovalentes se representan en las Fig. 2A a 2C, formadas de acuerdo con el modelo de Asociación. La fig 1ª representa una proteína homobivalente, la fig. 2B una proteína trivalente y la fig. 2C una proteína tetravalente. Por supuesto deben tenerse en cuenta las limitaciones de las imágenes bidimensionales de objetos tridimensionales. Por
tanto, la organización espacial real de las proteínas multivalente cabe esperar que varíe algo con respecto a estas figuras.

Una proteína heterobivalente de unión a antígeno posee dos sitios de unión diferentes, teniendo los sitios diferentes especificidades de unión. Las figuras 3A a 3C representan la vía del modelo de Asociación para la creación de una proteína heterobivalente. La figura 3A muestra dos proteínas monocatenarias monovalentes de unión a antígeno, proteína monocatenaria anti-A de unión a antígeno y proteína monocatenaria anti-B de unión a antígeno, en las que los antígenos de tipo A y B ocupan los respectivos sitios de unión. La figura 3B representa la proteína heterobivalente formada por la simple asociación de las proteínas monovalentes originales. La figura 3C muestra la proteína heterobivalente con los antígenos A y B unidos en los sitios de unión a antígeno. Por tanto, la figura 3C muestra la unión de la proteína heterobivalente de un modo biespecífico.

Un modelo alternativo para la formación de proteínas multivalentes de unión a antígeno se muestra en las figuras 4 a 6. Este modelo de "Reorganización" por el contacto con agentes de disociación tales como clorhidrato de guanidina, urea, o alcoholes tales como etanol, bien solos o combinados. Las combinaciones y los intervalos de concentraciones relevantes de los agentes de disociación se citan en el análisis dedicado a los agentes de disociación y en el Ejemplo 2. La posterior reasociación de las regiones disociadas permite la recombinación de la región variable diferente de las proteínas monocatenarias originales, como se representa en la figura 4B. La proteína homobivalente de unión a antígeno de la figura 4B se forma a partir de las proteínas monocatenarias originales de unión a antígeno que se muestran en la figura 4A, la proteína bivalente recombinada con la V_{L} y la V_{H} de las proteínas monocatenarias monovalentes originales. L proteína homobivalente de la figura 4B es una proteína bivalente monoespecífica completamente funcional, que muestra unión activa a dos moléculas antigénicas.

Las figuras 5A-5C muestran la formación de proteínas heterobivalentes de unión a antígeno a través del modelo de Reorganización. La figura 5A muestra un par de proteínas monocatenarias, cada una de las cuales con una V_{L} con regiones determinantes de la complementariedad (CRD) que no coinciden con las de la V_{H} asociada. Estas proteínas monocatenarias tienen una capacidad reducida, o ninguna capacidad, para unirse al antígeno a causa de la naturaleza mixta de sus sitios de unión a antígeno y, por tanto, están hechas específicamente para ensamblarse en proteínas multivalentes a través de esta vía. La figura 5B muestra la proteína heterobivalente de unión a antígeno formada donde las regiones V_{H} y V_{L} de las proteínas parentales se comparten entre las mitades de a proteína heterobivalente. La figura 5C muestra la unión de dos moléculas antigénicas diferentes a la proteína heterobivalente biespecífica funcional resultante. El modelo de reorganización también explica la generación de proteínas multivalentes de un orden superior al bivalente, como se puede apreciar que más de un par de proteínas monocatenarias se pueden reensamblar de este modo. Estas se representan en las figuras 6A y 6B.

Una de la principales utilidades de la proteína multivalente de unión a antígeno reside en la forma heterobivalente, en la que una especificidad es para un tipo de hapteno o antígeno y la segunda especificidad en para un segundo tipo de hapteno o antígeno. Una molécula multivalente con dos especifidades de unión distintas posee muchos posibles usos. Por ejemplo, un sitio de unión a antígeno puede ser específico para un epítopo de superficie celular de una célula diana, tal como una célula tumoral u otra célula no deseada. El otro sitio de unión a antígeno puede ser específico para un epítopo de superficie celular de una célula efectora, tal como la proteína CD3 de una célula T citotóxica. De este modo, la proteína heterobivalente de unión a antígeno puede guiar hacia una célula citotóxica a una clase concreta de células a las que se prefiere atacar.

Otros usos de las proteínas heterobivalentes de unión a antígeno son la dirección y destrucción específicas de coágulos de sangre por una molécula biespecífica con especificidad por el activador del plasminógeno tisular (tPA) y la fibrina; la dirección específica de enzimas activadoras del profármaco contra células tumorales por parte de una molécula biespecífica con especificidad por células y enzimas tumorales; y la dirección específica de proteínas citotóxicas hacia las células tumorales por parte de una biespecífica con especificidad por células tumorales y una proteína citotóxica. Esta lista es únicamente ilustrativa.

Las proteínas multivalentes de unión a antígeno también se pueden usar en purificación y biosensores. La purificación por afinidad es posible fijando la proteína multivalente de unión a antígeno a un soporte, con los sitios de unión a antígeno expuestos y en contacto con la molécula ligando a separar y, por tanto, a purificar. Los biosensores generan una señal detectable tras la unión de un antígeno específico a una molécula de unión a antígeno, con el posterior procesamiento de la señal. Las proteínas multivalentes de unión a antígeno, cuando se usan como moléculas de unión a antígeno en biosensores, pueden cambiar su conformación tras la unión, generando de este modo una señal que se puede detectar.

Esencialmente todos los usos para los que en la técnica anterior se han previsto los anticuerpos monoclonales o policlonales, o fragmentos de los mismos, pueden abordarse con proteínas multivalentes que se pueden producir según la presente invención. Estos usos incluyen formas marcadas detectables de la proteína multivalente, Los tipos de marcadores son bien conocidos para los expertos habituales en la técnica. Entre ellos se incluyen radiomarcaje, marcaje quimioluminiscente, marcaje fluorocrómico y marcaje cromofórico. Otros usos incluyen la obtención de imágenes de la estructura interna de un animal incluido un ser humano) mediante la administración de una cantidad eficaz de una forma marcada de la proteína multivalente y midiendo la radiación detectable asociada con el animal. También se incluyen inmunoensayos mejorados, incluyendo el inmunoensayo de tipo sándwich, el inmunoensayo competitivo y otros inmunoensayos en los que el anticuerpo marcado se puede sustituir con la proteína multivalente de unión a antígeno.

Un procedimiento para producir proteínas multivalentes de unión a antígeno implica separar las proteínas multivalentes de una composición de producción que comprende proteínas tanto multivalentes como monocatenarias, como se representa en el Ejemplo 1. El procedimiento comprende producir una composición de proteínas multivalentes y monocatenarias, separar las proteínas multivalentes de las proteínas monocatenarias y recuperar las proteínas multivalentes.

Más particularmente, un procedimiento preferido para producir proteínas multivalentes de unión a antígeno según la presente invención comprende las etapas de producir moléculas de proteína monocatenaria, disociar dichas moléculas monocatenarias, reasociar las moléculas monocatenarias de modo que una fracción significativa de la composición resultante incluya formas multivalentes de las proteínas monocatenarias de unión a antígeno, separar las proteínas multivalentes de unión a antígeno de las proteínas monocatenarias y recuperar las proteínas multivalentes. Este procedimiento se ilustra con más detalle en el Ejemplo 2. Para los propósitos de este procedimiento, el término "producir una composición que comprenda moléculas monocatenarias" puede indicar la producción real de estas moléculas. El término también puede incluir su obtención de cualquier fuente comercial o institucional en la que estén disponibles. El uso del término "producir proteínas monocatenarias" quiere decir la producción de proteínas monocatenarias mediante cualquier procedimiento, aunque preferentemente de acuerdo con el procedimiento indicado en la patente de EE.UU. nº 4.946.778 (Ladner y col.). En pocas palabras, la patente se refiere a una molécula de unión a antígeno de una cadena polipeptídica que posee especificidad y afinidad de unión sustancialmente similar a la especificidad y afinidad de unión de las regiones variables de las cadenas ligera y pesada agregadas de un anticuerpo, y, por tanto, a secuencias genéticas que la codifican y a procedimientos de ADN recombinante para producir tales moléculas y usos de tales moléculas, la proteína monocatenaria producida por la metodología de Ladner y col. comprende dos regiones unidas por un polipéptido de unión. Las dos regiones se denominan regiones V_{H} y V_{L} y cada región comprende una mitad de un sitio de unión a antígeno funcional.

El término "disociar dichas moléculas monocatenarias" quiere decir producir la separación física de las dos regiones variables de la proteína monocatenaria sin causar la desnaturalización de las regiones variables.

En la presente memoria descriptiva se definen los "Agentes de disociación" como aquéllos en los que se incluyen todos los agentes capaces de disociar las regiones variables, como se ha definido anteriormente. En el contexto de esta invención, el término incluye los agentes alcohólicos bien conocidos (incluido el etanol), clorhidrato de guanidina (GuHCl) y urea. Otros serán evidentes para los expertos habituales en la técnica, incluyendo detergentes y agentes similares capaces de interrumpir las interacciones que mantienen la conformación de las proteínas. En la forma de realización preferida, se usa una combinación de GuHCl y etanol (EtOH) como agente de disociación. Un intervalo preferido para etanol y GuHCl es de 0 a 50% de EtOH, v/v, 0 a 2,0 moles por litro (M) de GuHCl. Un intervalo más preferido es de 10-30% de EtOH y de 0,5-1m0 M de GuHCl y un intervalo más preferido es del 20% de EtOH y 0,5 M de GuHCl. Un tampón de disociación preferido contienen clorhidrato de guanidina 0,5M, 20% de etanol, TRIS 0,05M y CaCl_{2} 0,01M, pH 8,0.

El uso del término "reasociar dichas moléculas monocatenarias" se quiere describir la reasociación de las regiones variables poniéndolas en contacto con una solución tampón que permite la reasociación. Tal tampón se usa preferentemente en la presente invención y se caracteriza porque está compuesto por MOPS 0,04M, acetato cálcico 0,10M, pH 7,5. Otros tampones que permiten la reasociación de las regiones V_{L} y V_{H} entran dentro de la pericia de un experto habitual en la técnica.

La separación de la proteína multivalente de las moléculas monocatenarias se produce mediante el uso de técnicas estándar conocidas en la técnica, en particular se incluye la cromatografía de intercambio de cationes o de filtración en gel.

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La cromatografía de intercambio de cationes es la técnica cromatográfica líquida general de cromatografía de intercambio iónico que utiliza columnas de aniones bien conocida para los expertos habituales en la técnica. En esta invención, los cationes intercambiados son las moléculas proteicas monocatenarias y multivalentes. Dado que las proteínas multivalentes tendrán algún múltiplo de la carga neta de la molécula monocatenaria, las proteínas multivalentes quedan retenidas con más fuerza y, por tanto, se separan de las moléculas monocatenarias. El intercambiador de cationes preferido de la presente invención es una columna de ácido poliaspártico, como se muestra en la figura 7. La figura 7 representa la separación de proteínas monocatenarias (pico 1, 27,32 min) de las proteínas bivalentes (pico 2, 55,54 min). Los expertos en la técnica sabrán que la invención no se limita a ningún tipo concreto de cromatografía en columna, mientras es capaz de separar las dos formas de moléculas proteicas.

La cromatografía por filtración en gel es el uso de un material similar al gel para separar proteínas según su peso molecular. Un "gel" es una matriz de agua y un polímero, tal como agarosa o acrilamida polimerizada. La presente invención abarca el uso de HPLC (cromatografía líquida de alto rendimiento) por filtración en gel, como apreciará el experto habitual en la técnica. La figura 8 es un cromatograma que representa el uso de una columna de filtración en gel de Waters Associates Protein Pak 300 SW para separar las proteínas monovalentes monocatenarias de las proteínas multivalentes, incluidos los monómeros (21,940 min), las proteínas bivalentes (20,135 min) y las proteínas trivalentes (18,640 min).

La recuperación de las proteínas multivalentes de unión a antígeno se lleva a cabo mediante procedimientos de recogida estándar bien conocidos en las técnicas química y bioquímica. En el contexto de la presente invención, la recuperación de las proteínas multivalentes comprende preferentemente la recolección de las fracciones eluidas que contiene el pico de interés, bien de la columna de intercambio de cationes o de la columna de HPLC por filtración en gel. La recolección de las fracciones manual y automática es bien conocida para el experto habitual en la técnica. El posterior procesamiento puede implicar la liofilización del eluato para producir un sólido estable o para purificaciones posteriores.

Al producir proteínas multivalentes de unión a antígeno también se puede comenzar con proteínas monocatenarias purificadas a una concentración menor, y después aumentar la concentración hasta que se forma alguna fracción significativa de proteínas multivalentes. A continuación, se separan y recuperan las proteínas multivalentes. Las concentraciones que conducen a la formación de proteínas multivalentes de este modo son de 0,5 miligramos por mililitro (mg/ml) a la concentración a la que se comienza a formar el precipitado.

El uso del término "sustancialmente libre" cuando se usa para describir una composición de moléculas proteicas multivalentes y monocatenarias de unión a antígeno quiere decir ausencia de un pico significativo correspondiente a la molécula monocatenaria cuando la composición se analiza mediante cromatografía de intercambio de cationes, como se describe en el Ejemplo 1 i mediante cromatografía por filtración en gel, como se describe en el Ejemplo 2.

Mediante el uso del término "composición acuosa" se quiere decir cualquier composición de moléculas monocatenarias y proteínas multivalentes que incluyen una porción de agua. En el mismo contexto, la frase "un exceso de proteína multivalente de unión a antígeno sobre moléculas monocatenarias" indica que la composición comprende más del 50% de proteína multivalente de unión a antígeno.

El uso del término "sobrecruzamiento" se refiere a medios químicos por los cuales se pueden producir proteínas multivalentes de unión a antígeno a partir de moléculas proteicas monovalentes de unión a antígeno. Por ejemplo, la incorporación de un grupo químico sulfhidrilo susceptible de sobrecruzamiento como un residuo de cisteína en las proteínas monocatenarias permite el sobrecruzamiento mediante reducción leve del grupo sulfhidrilo. Las proteínas multivalentes tanto monoespecíficas como biespecíficas se puede producir a partir de proteínas monocatenarias mediante sobrecruzamiento de los grupos de cisteína libres de dos o más proteínas monocatenarias, lo que produce que se forme un enlace químico covalente entre las proteínas individuales. Mediante ingeniería genética se han introducido cisteínas libres en el extremo C de la proteína monocatenaria de unión a antígeno, como se ha analizado en el Ejemplo 5 y el Ejemplo 8. Estas cisteínas libres pueden después sobrecruzarse para formar proteínas multivalentes de unión a antígeno.

Se pueden producir proteínas monocatenarias que comprendan: (a) un primer polipéptido que comprende la porción de unión a la región variable de una cadena ligera de un anticuerpo; (b) un segundo polipéptido que comprende la porción de unión a la región variable de una cadena ligera de un anticuerpo; y (c) un péptido de unión que une dichos primero y segundo polipéptidos (a) y (b) en dicha proteína monocatenaria. También es posible una proteína monocatenaria que comprenda las regiones variables de la cadena pesada. También se contemplan las secuencias genéticas que codifican estas moléculas. Dado que estas proteínas están compuestas por regiones variables similares, no necesariamente poseen ninguna capacidad de unión a antígeno.

También es posible una secuencia de ADN que codifique una proteína bivalente biespecífica de unión a antígeno. En el Ejemplo 4 y el Ejemplo 7 se comentan con detalle las secuencias de las Figuras 10A y 10B que permiten a un experto habitual en la técnica construir una molécula heterobivalente de unión a antígeno. La Figura 10ª es una lista de secuencias de aminoácidos y de nucleótidos de la proteína monocatenaria que comprende la región V_{L} de 4-4-20 conectada a través del polipéptido de unión 212 a la región V_{H} de CC49. La figura 10B es una lista similar de la proteína monocatenaria que comprende la región V_{L} de CC49 de 4-4-20 conectada a través del polipéptido de unión 212 a la región V_{H} de 4-4-20. Al someter una composición que incluya estas moléculas monocatenarias a condiciones de disociación y posterior reasociación tiene como resultado la producción de una proteína bivalente con dos especificidades de unión diferentes.

La síntesis de las secuencias de ADN es bien conocida en la técnica, y posible a través de al menos dos vías. En primer lugar, se sabe bien que las secuencias de ADN pueden sintetizarse mediante el uso de sintetizadores automáticos de ADN de novo, una vez que se conoce la información de la secuencia primaria. Como alternativa, es posible obtener una secuencia de ADN que codifique una proteína multivalente monocatenaria de unión a antígeno mediante la eliminación de los codones de terminación del extremo de un gen que codifique una proteína monocatenaria de unión a antígeno e insertando a continuación un ligador y un gen que codifique una segunda proteína monocatenaria de unión a antígeno. El Ejemplo 6 demuestra la construcción de una secuencia de ADN que codifique una proteína bivalente monocatenaria de unión a antígeno. También se contemplan otros procedimientos para construir genéticamente proteínas multivalentes monocatenaria de unión a antígeno.

Habiendo descrito esta invención en general, se entenderá mejor en referencia a ciertos ejemplos específicos que se incluyen a modo de ilustración.

Ejemplo 1 Producción de proteínas multivalentes de unión a antígeno durante la purificación

En la producción de proteínas multivalentes de unión a antígeno se usó el mismo sistema de producción de E. coli recombinante que para la anterior producción de proteínas monocatenarias de unión a antígeno. Véase Bird y col., Science 242: 423 (1988). Este sistema de producción produjo entre un 2 y un 20% de la proteína total de E. coli como proteína de unión a antígeno. Para la recuperación de la proteína, la pasta celular congelada de tres fermentaciones de 10 litros (600-900 g) se descongeló durante la noche a 4ºC y se resuspendió suavemente a 4ºC en TrisHCL 50 mM, EDTA 1,0 mM. KCl 100 mM, PMSF 0,1 mM, a pH 8,0 (tampón de lisis), usando 10 litros de tampón de lisis por cada kilogramo de pasta celular húmeda. Cuando estaba resuspendido del todo, la mezcla fresca se pasó tres veces a través de un homogeneizador celular Manton-Gaulin para lisar del todo las células. Dado que el homogeneizador celular aumentó la temperatura del lisado celular a 25 \pm 5ºC, el lisado celular se enfrió a 5 \pm 2ºC con un muelle de enfriamiento de Lauda/Brinkman después de cada pase. La lisis completa se verificó mediante inspección visual con un microscopio.

EL lisado celular se centrifugó a 24.300 g durante 30 minutos a 6ºC usando una centrífuga Sorvall RC-5B. Se conservó el precipitado que contenía la proteína insoluble de unión a antígeno y se desechó el sobrenadante. El precipitado se lavó raspando suavemente de los tubos de centrífuga y resuspendiéndolo en 5 litros de tampón de lisis/kg de pasta celular húmeda. La suspensión resultante de 3,0 a 4,5 litros se centrifugó de nuevo a 24.300 g durante 30 minutos a 6ºC y se desechó el sobrenadante. Este lavado del precipitado elimina las proteínas solubles de E. coli u se puede repetir hasta cinco veces. En cualquier momento durante este procedimiento de lavado, el material se puede guardar en forma de un precipitado congelado a -20ºC. Se puede conseguir un ahorro de tiempo sustancial en las etapas de lavado mediante el uso de un aparato de flujo tangencial Pellicon equipado con filtros microporosos de 0,22 \mum, en lugar de centrifugar.

El precipitado lavado se solubilizó a 4ºC en clorhidrato de guanidina 6M recién preparado, Tris HCl 50 mM, CaCl_{2} 10 mM, KCl 50 mM, a pH 8,0 (tampón de disociación), usando 9 ml/g de precipitado. Si es necesario se pueden usar unos pocos pulsos rápidos de un homogeneizador tisular Heat Systems Ultrasonics para completar la solubilización. La suspensión resultante se centrifugó a 24.300 g durante 45 min a 6ºC y se desechó el precipitado. La densidad óptica del sobrenadante se determinó a 280 nm y si la DO_{280} estaba por encima de 30, se añadió más tampón de disociación para obtener una DO_{280} de aproximadamente 25.

El sobrenadante se diluyó lentamente en tampón de replegamiento frío (4-7ºC) (Tris HCl 50 mM, CaCl_{2} 10 mM, KCl 50 mM, a pH 8,0) hasta alcanzar una dilución de 1:10 (Volumen final 10-20 litros). El replegamiento se produce en aproximadamente dieciocho horas en estas condiciones. Los mejores resultados se obtienen cuando el extracto de GuHCl se añade lentamente al tampón de replegamiento en un periodo de 2 horas, mezclando suavemente. La solución se dejó reposar durante un periodo de al menos 20 horas y a esta solución se añadió etanol al 95% de forma que la concentración final de etanol fue de aproximadamente un 20%. Esta solución se dejó en reposo hasta que el material floculado precipitó en el fondo, normalmente durante no menos de sesenta minutos. La solución se filtró a través de un Millipore Millipak 200 de 0,2 \mum. Esta etapa de filtración puede venir precedida, opcionalmente, por una etapa de centrifugación. El filtrado se concentró a 1-2 litros usando un cartucho espiral de Amicon con un cartucho de MWCO 10.000, de nuevo a 4ºC.

La muestra de proteína de unión a antígeno bruta concentrada se sometió a diálisis contra Tampón A (NOPS 60 mM, acetato de Ca 0,5 mM, a pH 6,0-6,4) hasta que se redujo la conductividad a la del Tampón A. A continuación, la muestra se cargó en una columna PolyCAT A de ácido poliaspártico de 21,5 x 250 mm, fabricada por Poly LC de Columbia, Maryland. Si en esta columna se cargan más de 60 mg de proteína, la resolución comienza a deteriorarse; por tanto, la muestra bruta concentrada a menudo debe dividirse en varias procesados PolyCAT A. La mayoría de las proteínas de unión a antígeno poseen un coeficiente de extinción de aproximadamente 2,0 ml mg^{-1} cm^{-1} a 280 nm, y esto se puede usar para determinar la concentración de proteínas. La muestra de proteína de unión a antígeno eluyó de la columna PolyCAT A con un gradiente lineal de 50 min del tampón A al Tampón B (véase la Tabla 1). Cuando se usa este gradiente, la mayoría de las proteínas monocatenarias eluyen entre 20 y 26 minutos. Esto corresponde a una composición del disolvente de elución de aproximadamente un 70% de Tampón A y un 30% de Tampón B. La mayoría de las proteínas bivalentes de unión a antígeno eluyen después de 45 minutos, lo que corresponde a alrededor de un 90% de Tampón B.

La figura 7 es un cromatograma que representa la separación de una proteína monocatenaria de proteína bivalente CC49/212 usando el procedimiento del intercambiador de cationes que se acaba de describir. El pico 1, 27,32 minutos, representa la fracción monomérica monocatenaria. El pico 2, 55,52 minutos, representa la fracción de proteína bivalente.

La figura 8 es un cromatograma de la proteína monomérica monocatenaria de unión a antígeno purificada CC49/212 (fracción 7 de la fig. 7) en una columna de filtración en gel Waters Protein Pak 300 SW. Se muestra el monómero, con contaminantes minoritario de dímeros y trímeros. La figura 9 es un cromatograma de la proteína bivalente de unión a antígeno purificada CC49/212 (fracción 15 de la fig. 7) en la misma columna de filtración en gel Waters Protein Pak 300 SW usada en la Fig. 8.

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Este procedimiento de purificación proporcionó proteínas multivalentes de unión a antígeno con una pureza mayor al 95% según SDS-PAGE y HPLC de exclusión por tamaño. El punto isoeléctrico de la proteína multivalente de unión a antígeno concreta que se está purificando puede dictar modificaciones del procedimiento anterior. De las proteínas monoméricas monocatenarias que se han purificado hasta la fecha. Todas han tenido un punto isoeléctrico (pI) entre 8,0 y 9,5. Sin embargo, es posible que se produzca una proteína multivalente de unión a antígeno con u pI inferior a 7,0. En ese caso, puede ser necesaria una columna de intercambio aniónico para la purificación.

El grupo del Dr. Jeffrey Scholm, Laboratory of Tumor Immunology and Biology, National Cancer Institute, desarrolló el anticuerpo monoclonal CC49. Se une de forma específica al antígeno tumoral del pan-carcinoma TAG-72. Véase Murano, R. y col., Cancer Research 48: 4588-4596 (1988).

Para determinar las propiedades de unión de las proteínas bivalentes y monoméricas CC49/212 de unión a antígeno, se estableció un radioinmunoensayo (RIA) competitivo en el que la IgG de CC49 (con dos sitios de unión a antígeno) radiomarcada con ^{125}I competía contra la IgG de CC49 sin marcar, o proteína de unión a antígeno CC49/212 monovalente (fracción 7 de la figura 7) o bivalente (fracción 15 de la figura 7) por la unión al antígeno TAG-72 en un extracto de carcinoma de mama humano. (Véase la figura 8). Este RIA competitico mostró que la proteína bivalente de unión a antígeno competía igual de bien por el antígeno que la IgG, mientras oye la proteína monovalente monocatenaria de unión a antígeno necesitaba una concentración de proteínas 10 veces mayor para desplazar a la IgG. Por tanto, la proteína monovalente de unión a antígeno compite con una afinidad aproximadamente 10 veces menor por el antígeno de lo oye lo hace la IgG bivalente o la proteína bivalente de unión a antígeno. La figura 18 también muestra el resultado del RIA de competición de una proteína monocatenaria de unión a antígeno no específica del TAG-72, la antifluoresceína 4-410/212, que no compite por la unión.

Ejemplo 2 Procedimiento para preparar proteínas multivalentes de unión a antígeno usando agentes de disociación A. Procedimiento usando HCl de guanidina y etanol

Se produjeron proteínas multivalentes de unión a antígeno a partir de proteínas monocatenarias purificadas del siguiente modo. En primer lugar, la proteína monocatenaria purificada a una concentración de 0,25-4 mg/ml se sometió a diálisis contra 0,5 moles/litro (M) de clorhidrato de guanidina (GuHCl), etanol al 20% (EtOH) en TRIS 0,05M, KCl 0,05M, CaCl2 0,01M, tampón a un pH de 8,0. Se piensa que esta combinación de agentes de disociación altera la interfaz V_{L} / V_{H}, permitiendo que la V_{H} de una primera molécula monocatenaria entre en contacto con la V_{L} de una segunda molécula monocatenaria. El GuHCl y el ETOH se pueden sustituir por otros agentes de disociación, tales como urea y alcoholes como isopropanol o metanol. Tras la diálisis inicial, la proteína se sometió a diálisis contra el tampón de carga para la etapa final de purificación mediante HPLC. Para separar el monómero proteico monocatenario de las proteínas multivalentes de unión a antígeno se pueden usar dos protocolos de purificación distintos, cromatografía por intercambio de cationes y por filtración en gel. En el primer procedimiento, los monómeros y las proteínas multivalentes de unión a antígeno se separaron usando cromatografía HPLC de intercambio de cationes en una columna de poliaspartato (PolyCAT A). Este es un procedimiento similar al usado en la purificación final de las proteínas de unión a antígeno descritas en el Ejemplo 1. El tampón de carga fue MOPS 0,06M, acetato de calcio 0,001M a pH 6,4. En el segundo procedimiento, los monómeros y las proteínas multivalentes de unión a antígeno se separaron usando cromatografía HPLC por filtración en gel con un tampón de carga de MOPS 0,04M, acetato de calcio 0,10 M a pH 7,5. La cromatografía por filtración en gel separa proteínas según su tamaño molecular.

Una vez que se ha cargado la muestra de proteína de unión a antígeno en la columna HPLC de intercambio de cationes, se usó un gradiente lineal entre el tampón de carga (MOPS 0,04 M a 0,06 M, acetato de calcio de 0,000 M a 0,001 M, glicerol al 0-10%, pH 6,0 a 6,4) y un segundo tampón (MOPS 0,04 M a 0,06 M, acetato de calcio de 0,01 M a 0,02 M, glicerol al 0-10%, pH 7,5). Era muy importante haber dializado ampliamente la muestra de proteína de unión a antígeno antes de cargarla en la columna. Normalmente, la conductividad de la muestra se controla frente al tampón de diálisis. La diálisis continúa hasta que la conductividad disminuye por debajo de 600 \mus. La figura 11 muestra la separación de las formas monoméricas (27,83 min) u bivalentes (50,47 min) de la proteína de unión a antígeno CC49/212 mediante intercambio de cationes. Las condiciones cromatográficas para esta separación fueron las siguientes: columna de PolyCAT A, 200 x 4,6 mm, a 0,62 ml/min; tampón de carga y segundo tampón como en el Ejemplo 1; programa de gradientes desde 100% del tampón de carga A hasta 0% de tampón de carga A en 48 minutos; la muestra fue CC49/212, 1,66 mg/ml; volumen de inyección 0,2 ml. Las fracciones se recogieron de los dos picos de un cromatograma similar y se identificaron como proteínas monoméricas y bivalentes usando cromatografía HPLC por filtración en gel como se describe a continuación.

La cromatografía HPLC por filtración en gel (columna TSK G2000SW de Toyo Soda, Tokyo, Japón) se usó para identificar y separar proteínas monoméricas monocatenarias y multivalentes de unión a antígeno. Este procedimiento ha sido descrito por Fukano y col., J. Chromatography 166: 47 (1978). La multimerización (creación de proteína multivalente a partir de proteína monomérica monocatenaria) se realizó mediante tratamiento con GuHCl 0,5 M y EtOH al 20% durante los tiempos indicados en la Tabla 2ª, seguido por diálisis en el tampón de cromatografía. La figura 12 muestra la separación de proteínas monoméricas (17,65 min), bivalentes (15,79 min), trivalentes (14,19 min) y oligómeros superiores /a aproximadamente 13,09 min) de la proteína de unión a antígeno B6.2/212. La proteína monocatenaria de unión a antígeno B6.2/212 se describe en Colcher, D., y col., J. Nat. Cancer Inst. 82: 1191-1197 (1990)). Esta separación representa los resultados de un tratamiento de multimerización de 24 horas de una muestra de proteína de unión a antígeno B6.2/212 de 1,0 mg/ml. El tampón de HPLC usado fue MOPS 0,04 M, acetato de calcio 0,10 M, azida sódica 0,04%, pH 7,5.

La figura 13 muestra los resultados de un tratamiento de 24 horas de una muestra de proteína de unión a antígeno CC49/212 de 4,0 mg/ml, generando proteínas monoméricas, bivalentes y trivalentes a 16,91, 14,9 y 13,42 min respectivamente. El tampón de HPLC usado fue MOPS 40 mM, acetato de calcio 100 mM, pH 7,35. El tratamiento de multimerización se realizó a los tiempos que se indican en la Tabla 2.

Los resultados del Ejemplo 2A se muestran en la tabla 2A. La tabla 2A muestra el porcentaje de formas bivalentes y otras multivalentes antes y después del tratamiento con etanol al 20% y GuHCl 0,5M. A menos que se indique otra cosa, los porcentajes se determinaron usando un paquete de software de integración de datos automático.

TABLA 2A Resumen de la generación de formas bivalentes y multivalentes superiores de las proteínas B6.2/212 y CC49/212 usando clorhidrato de guanidina y etanol

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B. Procedimiento usando urea y etanol

Se produjeron proteínas multivalentes de unión a antígeno a partir de proteínas monocatenarias purificadas del siguiente modo. En primer lugar, la proteína monocatenaria purificada a una concentración de 0,25-1 mg/ml se sometió a diálisis contra urea 2M, etanol al 20% (EtOH) en tampón TRIS 50 mM, durante los tiempos que se indican en la Tabla 2B. Se piensa que esta combinación de agentes de disociación altera la interfaz V_{L} / V_{H}, permitiendo que la V_{H} de una primera molécula monocatenaria entre en contacto con la V_{L} de una segunda molécula monocatenaria. El ETOH se puede sustituir por otros agentes de disociación, tales como isopropanol o metanol. Tras la diálisis inicial, la proteína se sometió a diálisis contra el tampón de carga para la etapa final de purificación mediante HPLC.

Para separar e identificar el monómero proteico monocatenario y las proteínas multivalentes de unión a antígeno se usó cromatografía HPLC filtración en gel. Este procedimiento ha sido descrito por Fukano y col., J. Chromatography 166: 47 (1978).

Los resultados del Ejemplo 2B se muestran en la tabla 2B. La tabla 2B muestra el porcentaje de formas bivalentes y otras multivalentes antes y después del tratamiento con etanol al 20% y urea. Los porcentajes se determinaron usando un paquete de software de integración de datos automático.

TABLA 2B Resumen de la generación de formas bivalentes y multivalentes superiores de las proteínas B6.2/212 y CC49/212 usando urea y etanol

3

Ejemplo 3 Determinación de las constantes de unión

Se han construido tres proteínas antifluoresceína monocatenarias de unión a antígeno sobre la base del anticuerpo monoclonal antifluoresceína 4-4-20. Las tres proteínas 4-4-20 monocatenarias de unión a antígeno difieren en el polipéptido de unión que conecta las regiones V_{L} y V_{H} de la proteína. Los tres ligadores usados fueron 202', 212 y 216 (véase la Tabla 3). Se produjeron formas bivalentes y superiores de la proteína de unión a antígeno 4-4-20 mediante la concentración de la proteína monomérica monocatenaria de unión a antígeno purificada en el tampón de carga de intercambio de cationes (MOPS 0,06 m, acetato de calcio 0,001 M, pH 6,4) a 5 mg/ml. Las formas monoméricas y bivalentes de las proteínas de unión a antígeno 4-4-20 se separaron mediante HPLC de intercambio de cationes (columna de poliaspartato) usando un gradiente lineal de 50 min entre el tampón de carga (MOPS 0,06 m, acetato de calcio 0,001 M, pH 6,4) y un segundo tampón (MOPS 0,06 m, acetato de calcio 0,002 M, pH 7,5). Se separaron dos muestras de 0,02 ml y en casa carrera se recogieron las fracciones de los picos de proteínas bivalentes y monoméricas. La cantidad de proteína recogida en cada fracción se determinó a partir de la absorbancia a 278 nm con respecto a la primera separación. Antes de recoger las fracciones de la segunda separación, a cada tubo para las fracciones se le añadió una cantidad suficiente de fluoresceína 1,03 x 10^{3} M, de forma que cuando se recogieron las fracciones existía una proporción molar entre la proteína y la fluoresceína de 1 a 1. La adición de fluoresceína estabilizó la forma bivalente de las proteínas de unión a antígeno 4-4-20. Estas muestras se conservaron a 2ºC (en hielo).

Para cada una de estas muestras se determinaron los índices de disociación siguiendo los procedimientos descritos por Herron, J. N., en Fluorescence Hapten: An Immunological Probe, E. W. Voss, Ed., CRC Press, Boca Ratón, FL (1984). Primero se diluyó una muestra con tampón HEPES 20 mM a pH 8,0 a 5,0 x 10^{-8} M de proteína de unión a antígeno 4-4-20. A una cubeta en un espectrofotómetro equilibrado a 2ºC se añadieron 560 \mul de la muestra con la proteína de unión a antígeno 4-4-20 a 5,0 x 10^{-8} M y se leyó la fluorescencia. A la cubeta se añadieron 140 \mul de fluoresceinamida a 1,02 x 10^{-5} M y se leyó la fluorescencia cada minuto durante 25 minutos (véase la Tabla 4).

También se determinaron las constantes de unión (K_{a}) para los monómeros proteicos monocatenarios de unión a antígeno 4-4-20 diluidos en tampón HEPES 20 mM a pH 8,0 en ausencia de fluoresceína (véase la Tabla 4).

En estos experimentos, los polipéptidos de unión tienen una longitud diferente. Los ligadores 202', 212 y 216 tienen 12, 14 y 18 residuos de longitud, respectivamente. Estos experimentos muestran que hay dos efectos de la longitud del ligador sobre las proteínas de unión a antígeno 4-4-20: primero, cuanto más corto es el ligador, más fracción de proteína bivalente se forma; segundo, los índices de disociación de la fluoresceína de las proteínas monoméricas monocatenarias de unión a antígeno se ven más afectadas por la longitud del ligador que los índices de disociación de las proteínas bivalentes de unión a antígeno. Con los ligadores más cortos 202' y 212, las proteínas bivalentes de unión a antígeno tienen velocidades de disociación más lentas que los monómeros. Por tanto, es posible que los ligadores que proporcionan una producción óptima y óptimas afinidades de unión para las proteínas monoméricas y bivalentes de unión a antígeno sean diferentes. Los ligadores más largos pueden ser más adecuados para las proteínas monoméricas monocatenarias de unión a antígeno y los ligadores más cortos pueden ser más adecuados para las proteínas multivalentes de unión a antígeno.

4

(1) SEC ID Nº 1

(2) SEC ID Nº 2

(3) SEC ID Nº 3

(4) SEC ID Nº 4

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5

Ejemplo 4 Construcción genética de un fragmento mixto de proteína bivalente de unión a antígeno

Las construcciones genéticas para una determinada proteína heterobivalente de unión a antígeno según el modelo de Reorganización se muestran en las figuras 10A y 10B. La figura 10A es una lista de secuencias de aminoácidos y nucleótidos del constructo V_{L} de 4-4-20/ V_{H} de CC49/212, que codifica una proteína monocatenaria con una V_{L} de 4-4-20 unido a través de un polipéptido de unión 212 a una V_{H} de CC49. La Figura 10B es una lista similar que muestra el constructo V_{L} de CC49/ V_{H} de 4-4-20/212, que codifica una proteína monocatenaria con una V_{L} de CC49 unida a través de un polipéptido de unión 212 a una V_{H} de 4-4-20. Estas proteínas monocatenarias pueden recombinarse según el modelo de Reorganización para generar una proteína heterobivalente que comprende un sitio de unión a antígeno de CC49 unido a un sitio de unión a antígeno de 4-420, como se muestra en la Figura 5B.

"V_{L} de 4-4-20" quiere decir la región variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal de ratón 4-4-20 (Bird, R. E: y col., Science 242: 423 (1988)). El número "212" se refiere a un polipéptido de unión específico de 14 residuos que une la V_{L} de 4-4-20 y la V_{H} de CC49. Véase Bedzyk, W. D. y col., J. Biol. Chem. 265: 18615-18620 (1990). "V_{H} de CC49" es la región variable de la cadena pesada del anticuerpo CC49, que se une al antígeno TAG-72. El anticuerpo CC49 fue desarrollado en The National Institutes of Health, por Schlom y col. Generation and Characterization of B,72.3 Second Generation Monoclonal Antibodies Reactive with the Tumor-associated Glycoprotein 72 Antigen, Cancer Research 48: 4588-4596 (1988).

La inserción de las secuencias que se muestran en las figuras 10A y 10B mediante metodología de ADN recombinante en un vector plasmídico adecuado permitirá al experto en la técnica transformar un huésped adecuado para la posterior expresión de las proteínas monocatenarias. Véase Maniatis y col. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, pág. 104, Cold Spring Harbor Laboratory (1982), para las técnicas recombinantes generales para llevar a cabo los objetivos anteriores; véase también la patente de EE.UU. 4.946.778 (Ladner y col.) para obtener una descripción completa de los procedimientos para producir moléculas proteicas monocatenarias mediante tecnología de ADN recombinante.

Para producir proteínas multivalentes de unión a antígeno a partir de las dos proteínas monocatenarias, V_{L} 4-4-20-212/ V_{H} CC49 y V_{L} CC49/212/ V_{H} 4-4-20, las dos proteínas monocatenarias se dializan en GuHCl 0,5M/EtOH al 20% y se combinan en una única solución bien antes o bien después de la diálisis. Las proteínas multivalentes se producen y se separan como se ha descrito en el Ejemplo 2.

Ejemplo 5 Preparación de proteínas multivalentes de unión a antígeno mediante sobrecruzamiento químico

Con el fin de producir un sobrecruzamiento químico en la proteína, mediante ingeniería genética se introdujeron cisteínas libres en el extremo C de la proteína monocatenaria de unión a antígeno 4-4-20/212. El diseño se realizó sobre la base de la región bisagra encontrada en los anticuerpos entre las regiones CH1 y CH2. Para intentar reducir la antigenicidad en seres humanos, se escogió la secuencia bisagra de la clase de IgG más habitual, la IgG1. Se analizó la estructura Fab del 4-4-20 y se determinó que la secuencia del extremo C GluH216-ProH217-ArgH218 era parte de la región CH1 y que la región bisagra entre CH1 y CH2 comienza con ArgH218 o GlyH219 en el anticuerpo de ratón IgG2A 4-4-20. La figura 14 muestra la estructura de una IgG humana. La región bisagra está indicada en general. Por tanto, la región bisagra de IgG1 humana empezaría con LysH218 o SerH219. (Véase la Tabla 5).

El residuo en el extremo C en la mayoría de las proteínas monocatenarias de unión a antígeno descrito hasta la fecha es el aminoácido serina. En el diseño de la región bisagra, la serina del extremo terminal en la proteína monocatenaria de unión a antígeno 4-4-20/212 se hizo la primera serina de la bisagra y el segundo residuo de la región bisagra se cambió de una cisteína a serina. Esa cisteína de la región bisagra normalmente forma un puente disulfuro con la cisteína del extremo C en la cadena ligera.

TABLA 5

IGg2A de ratón^{1}	EPRGPTIKP CPPCLC-
IgG1 humana^{2}	AEPK SCDKTHTCPPC-
SCA*^{3}	- -VTVS
SCA* diseño de la región bisagra^{4} - -VTVSSDKTHTC
SCA* diseño de la región bisagra^{5} - -VTVSSDKTHTCPPC

* proteína monocatenaria de unión a antígeno
(1) SEC ID Nº 5
(2) SEC ID Nº 6
(3) SEC ID Nº 7
(4) SECI ID Nº 8
(5) SEC ID Nº 9

Existen posibles ventajas del hecho de tener dos cisteínas en el extremo C, porque podrían formar un puente disulfuro intramolecular, lo que facilita la recuperación de la proteína mediante la protección de los azufres frente a la oxidación. Las regiones bisagra se añadieron mediante la introducción de un sitio de restricción BstE II en el extremo 3' del gen que codifica al proteína monocatenaria de unión a antígeno 4-4-20/212 (véanse las figuras 15A-15B).

La proteína monomérica monocatenaria de unión a antígeno que contiene la cisteína en el extremo C se puede purificar usando los procedimientos normales de purificación de proteínas monocatenarias de unión a antígeno, con modificaciones minoritarias para proteger los sulfhidrilos libres. El sobrecruzamiento se podría conseguir de una de dos formas. Primero, la proteína monocatenaria de unión a antígeno purificada se podía tratar con un agente reductor leve, tal como ditiotreitol, después se deja oxidar al aire para formar un puente disulfuro entre las proteínas monocatenarias de unión a antígeno individuales. Este tipo de química ha tenido éxito en la producción de heterodímeros a partir de anticuerpos enteros (Nisosoff y col., Quantitative Estimation of the Hybridization of Rabbit Antibodies, Nature 4826: 355-359 (1962); Brennan y col., Preparation of Biespecific Antibodies by Chemical Recombination of Monoclonal Immunoglobulin G1 Fragments, Science 229: 81-83 (1985)). Segundo, se pueden usar agentes químicos de sobrecruzamiento tal como bismaleimidihexano para producir el sobrecruzamiento de dos proteínas monocatenarias de unión a antígeno por sus cisteínas en el extremo C. Véase Partis y col., J. Prot. Chem. 2: 263:277 (1983).

Ejemplo 6 Construcción genética de proteínas bivalentes de unión a antígeno

Las proteínas bivalentes de unión a antígeno se pueden construir genéticamente y expresarse después en E. coli u otros sistemas de expresión conocidos. Esto se puede conseguir mediante la eliminación genética de los codones de terminación en el extremo de un gen que codifica una proteína monomérica monocatenaria de unión a antígeno e insertando un ligador y un gen que codifica una segunda proteína monocatenaria de unión a antígeno. Los inventores han construido un gen para una proteína bivalente de unión a antígeno CC49/212 de este modo (véase la Figura 16). El gen de CC49/212 en el plásmido de expresión original está en los fragmentos de restricción Aat II a Bam H1 (véase Bird y col., Single-Chain Antigen Binding Proteins, Science 242: 423-426 (1988); y Whitlow y col., Single-Chain Fv proteins and Their Fusion Proteins, Methods 2: 97-105 (1991)). Los dos codones de terminación en el sitio Bam H1 en el C terminal del gen de la proteína de unión a antígeno CC49/212 sw sustituyó con un único residuo ligador (Ser) y un sitio de restricción Aat II. El plásmido resultante se cortó con Act II y el fragmento de restricción de AatII purificado se ligó en el punto de corte de Aat II del plásmido de expresión de la proteína monocatenaria de unión a antígeno CC49/212. El plásmido de expresión de la proteína monocatenaria bivalente de unión a antígeno CC49/212 resultante de transfectó a un huésped de expresión E. coli que contenía el gen para el represor sensible a la temperatura c1857. La expresión de la proteína monocatenaria de unión a antígeno en este sistema está inducida por la elevación de la temperatura desde 30ºC a 42ºC. La figura 17 muestra la expresión de la proteína monocatenaria bivalente de unión a antígeno CC49/212 de la figura 16 a 42ºC en un gel de SDS-PAGE que contiene la proteína total de E. coli. El carril 1 contiene los pesos moleculares de referencia. El carril 2 es la cepa de E. coli de producción no inducida cultivada a 30ºC. El carril 3 es la proteína monocatenaria bivalente de unión a antígeno CC49/212 inducida por el crecimiento a 42ºC. La flecha muestra la banda de la proteína monocatenaria bivalente de unión a antígeno CC49/212 expresada.

Ejemplo 7 Construcción, purificación y análisis del Fv heterodímero de 4-4-20/CC49 con ligadores 217

Los objetivos de este experimento consistían en producir, purificar y analizar la actividad de un nuevo Fv heterodímero que se uniría a la fluoresceína a al antígeno TAG-72 del pan carcinoma. El diseño consistía en dos cadenas polipeptídicas que se asociaban para formar el Fv heterodímero activo. Cada cadena polipeptídica se puede describir como una Fv monocatenaria mixta (sFv mixta). La primera sFv mixta (GX 8952) comprendía una región variable de cadena ligera (V_{L}) de 4-4-20 y una región variable de cadena pesada (V_{H}) de CC-49 conectadas por un polipéptido de unión 217 (figura 19A). La segunda sFv mixta (GX 8953) comprendía una V_{L} de CC49 y una V_{H} de 4-4-20 conectadas por un polipéptido de unión 217 (figura 19B). La secuencia del polipéptido de unión 217 se muestra en la Tabla 3. La construcción de heterodímeros análogos al CC49/4-4-20 conectados por polipéptido de unión 212 es como se describe en el Ejemplo 4.

Resultados A. Purificación

Una fermentación de 10 litros de cada sFv mixta se cultivó en medio con sales-glucosa digeridos con caseína a 32ºC hasta una densidad óptica a 600 nm de 15 a 20. La expresión de sFv mixto se indujo elevando la temperatura a 42ºC durante una hora. En una centrífuga se colocaron 277 g (peso celular húmedo) de la cepa de E.coli GX 8952 y 233 g (peso celular húmedo) de la cepa de E.coli GX 8953 a 7000 g durante 10 minutos. Los precipitados celulares se guardaron y se desechó el sobrenadante. Los precipitados celulares se congelaron a -20ºC para su almacenamiento.

A los precipitados celulares de sFv mixtos, que previamente se habían descongelado y combinado para dar 510 g de peso celular húmedo total, se añadieron 2,55 litros de "tampón de lisis/lavado" (Tris 50 mM/NaCl 200 mM/ EDTA 1 mM, pH 8,0). Tras la suspensión completa de las células, se pasaron a través de un homogeneizador Gaulin a 9000 psi y a 4ºC. Tras este primer pase, se incrementó la temperatura a 23ºC. La temperatura se disminuyó de inmediato a 0ºC usando hielo seco y metanol. La suspensión celular se pasó a través del homogeneizador Gaulin una segunda vez y se centrifugó a 8000 rpm con un rotor Dupont GS-3 durante 60 minutos. Tras la centrifugación se desechó el sobrenadante y los precipitados se resuspendieron en 2,5 l de ``tampón de lisis/lavado) a 4ºC. Esta suspensión se centrifugó durante 45 minutos a 8000 rpm con el rotor Dupont GS-3. De nuevo se desechó el sobrenadante y se pesó el precipitado. El peso del precipitado fue 136,1 g.

Al precipitado lavado se añadieron 1300 ml de clorhidrato de guanidina 6M/Tris 50 mM/KCl 50 mM/CaCl2 10 mM a pH 8,0 a 4ºC. Para acelerar la solubilización se usó un mezclador superior. Tras una hora de mezclado, el extracto heterodimérico de GuHCl se centrifugó durante 45 minutos a 8000 rpm y se desechó el precipitado. Lentamente los 1425 ml del extracto de GuHCl 6M con el Fv heterodímero (16 ml/min) se añadieron a 14,1 litros de "Tampón de replegamiento" (Tris 50 mM/KCl 50 mM/CaCl_{2} 10 mM a pH 8,0) mezclando de forma constante a 4ºC para dar una dilución aproximada de 1:10. El replegamiento se produjo durante la noche a 4ºC.

Tras 17 horas de replegamiento, se comprobó la actividad anti-fluoresceína mediante ensayo de inactivación al 40% y se calculó la cantidad de proteína activa. Mediante el ensayo de inactivación al 40% se encontraron 150 g de heterodímero Fv activo total, suponiendo un peso molecular de 54.000.

A los 15 litros de heterodímero replegado se añadieron 4 litros de etanol 190 PROOF previamente enfriado (4ºC) mezclando durante 3 horas. La mezcla reposó durante la noche a 4ºC. Tras este tratamiento durante la noche se produjo la precipitación en el fondo de un precipitado floculento. La solución casi transparente se filtró a través de un filtro Millipak-200 (0,22 \mu) para no alterar el precipitado. Un ensayo de inactivación al 40% mostró la recuperación del 10% de la actividad anti-fluoresceína en el filtrado.

La muestra filtrada del heterodímero se dializó, con un sistema Pellicon que contenía membranas MWCO de 10.000 dalton, con "tampón de diálisis" MOPS 40 mM/acetato de calcio 0,5 mM (AcCa), pH 6,4 a 4ºC. Se requirieron 20 litros de tampón de diálisis antes de que la conductividad del producto retenido fuera igual a la del tampón de diálisis (\sim 500\muS). Tras la diálisis, la muestra del heterodímero se filtró con un filtro Millipak-200 0,22 \mu. Después de esta etapa, un ensayo de inactivación al 40% mostró que había 8,8 mg de proteína activa.

La muestra de heterodímero bruto se cargó en una columna de intercambio de cationes PolyCAT A a 20 ml/min. La columna se equilibró previamente con MOPS 60 mM/acetato de calcio 20 mM , pH 6,4 a 4ºC (tampón A). Tras la carga, la columna se lavó con 150 ml de "Tampón A" a 15 ml/min. Se realizó un gradiente lineal de 50 min a 15 ml/min usando "Tampón A" y "Tampón B" (MOPS 60 mM/acetato de calcio 20 mM , pH 7,5 a 4ºC). Las condiciones del gradiente se presentan en la Tabla 6. El "Tampón C" comprende con MOPS 60 mM, CaCl_{2} 100 mM, pH 7,5.

TABLA 6

Tiempo	%A	%B	%C	Flujo
0:00	100,0	0,0	0,0	15 ml/min
50:00	0,0	100,0	0,0	15 ml/min
52:00	0,0	100,0	0,0	15 ml/min
54:00	0,0	0,0	100,0	15 ml/min
58:00	0,0	0,0	100,0	15 ml/min
60:00	100,0	0,0	0,0	15 ml/min

Se recogieron fracciones de aproximadamente 50 ml y se analizaron para determinar su actividad, pureza y el peso molecular mediante cromatografía de exclusión por tamaño. Las fracciones no se recolectaron mediante picos, por lo que es probable que se produzca contaminación entre picos. Se combinaron las fracciones 3 a 7 (Volumen total 218 ml), se concentraron a 50 ml y se sometieron a diálisis contra 4 litros de MOPS 60 mM/acetato de calcio 0,5 mM , pH 6,4 a 4ºC durante la noche. El grupo dializado se filtró a través de un filtro de 0,22 \mu, y se comprobó la absorbancia a 280 nm. El filtrado se cargó en la columna PolyCAT A, equilibrada con MOPS 60 mM/acetato de calcio 1 mM , pH 6,4 a 4ºC, a un caudal de 10 ml/min. El tampón B se modificó a MOPS 60 mM/acetato de calcio 10 mM , pH 7,5 a 4ºC. El gradiente se procesó como en la Tabla 6. Las fracciones se recolectaron por picos y se analizaron para determinar su actividad, pureza y peso molecular. El cromatograma se muestra en la Figura 20. La identificación y análisis de las fracciones se presentan en la Tabla 7.

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TABLA 7 Análisis de la fracción de la proteína heterodímero Fv

Nº de fracción	Lectura A280	Volumen total (ml)	Tiempo de elución
			HPLC-SE (min)
2	0,161	36	20,525
3	0,067	40
4	0,033	40
5	0,178	45	19,133
6	0,234	50	19,163
7	0,069	50
8	0,055	40

Las fracciones 2 a 7 y el material de partida se analizaron mediante electroforesis en gel SDS, 4-20%. En la figura 21 se presenta una foto y la descripción del gel.

B. Resultados de la HPLC de exclusión por tamaño

Las fracciones 2, 5 y 6 corresponden a los tres picos principales en la Figura 20 y, por tanto, se escogieron para su análisis mediante HPLC de exclusión por tamaño. La fracción 2 corresponde al pico que corre en la columna de tamaño de la HPLC a 20,525 minutos, que está en la posición monomérica (Figura 22A). Las fracciones 5 y 6 (30,1 y 33,455 minutos, respectivamente, en la figura 20) corren en la columna de tamaño de la HPLC /figuras 22B y 22C) a 19,133 y 19,163 minutos, respectivamente (véase la Tabla 7). Por tanto, ambos picos podrían considerarse dímeros. Se realizaron ensayos de inactivación al 40% en todas las fracciones de esta purificación. Sólo la fracción 5 dio una actividad significativa. En la fracción 5 se recuperaron 2,4 mg de Fv heterodímero activo de 4-4-20 CC49, según el análisis de Scatchard que se describe a continuación.

C. Secuenciación del extremo N de las fracciones

La fracción del FV heterodímero activo debería contener ambas cadenas polipeptídicas. El análisis de la secuencia del extremo N mostró que las fracciones 5 y b6 mostraban secuencias en el extremo N consistentes con la presencia de ambos polipéptidos CC49 y 4-4-20 y la fracción 2 mostró una única secuencia correspondiente solamente al polipéptido CC49/212/4-4-20. Los inventores creen que la fracción 6 estaba contaminada con la fracción 5 (véase la figura 10), ya que sólo la fracción 5 presentaba una actividad significativa.

D. Actividad antifluoresceína mediante análisis de Scatchard

Se determinaron las constantes de asociación (Ka) a la fluoresceína para las fracciones 5 y 6 con un ensayo de inactivación por fluorescencia descrito por Herron, J. N., en Fluorescence Hapten: An Immunological Probe, E. W. Voss, Ed., CRC Press, Boca Ratón, FL (1984). Cada muestra se diluyó hasta aproximadamente 5,0 x 10^{-8} M con tampón HEPES 20 mM a pH 8,0. A una cubeta de un espectrofotómetro de fluorescencia equilibrado a temperatura ambiente se añadieron 590 \mul de la muestra a 5,0 x 10^{-8} M. En una segunda cubeta se añadieron 590 \mul de tampón HEPES 20 mM a pH 8,0 y se registró la fluorescencia. Esto se repitió hasta haber añadido 140 \mul de fluoresceína. El resultado del análisis de Scatchard para la fracción 5 muestra una constante de unión de 1,16 x 10^{9} M^{-1} para la fracción nº 5 (véase la figura 23). Esta es muy parecida a la constante de sFv de 4-4-20/CC49 de 1,1 x 10^{9} M^{-1} (véase Pantoliano y col., Biochemistry 30: 10117-10125 (1991)). La intersección R en el análisis de Scatchard representa la fracción de material activo. Para la fracción 5, el 61% del material era activo. El gráfico del análisis de Scatchard de la fracción 6 muestra una constante de unión de 3,3 x 10^{8} M^{-1} y un 14% activo. Es muy probable que la actividad presente en la fracción 6 sea contaminante de la fracción 5.

E. Actividad anti-TAG-42 mediante ELISA competitivo

Para determinar las propiedades de unión de la Fv de CC49/4-4-20 (fracción 5) y del sFv de CC49/212, se estableció un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) competitivo en el que una IgG de CC49 marcada con biotina competía con la Fv de CC49/4-4-20 sin marcar y la sFv de CC49/212 por la unión al antígeno TAG-72 en un extracto de carcinoma de mama humano (véase la figura 24).

La cantidad de IgG cc49 marcada con biotina se determinó usando un complejo preformado con avidina y biotina acoplada a peroxidasa de rábano y diclorhidrato de O-fenilendiamina (OPD). La reacción se detuvo con H_{2}SO_{4} 4N (ácido sulfúrico) después de 10 minutos y la densidad óptica se leyó a 490 nm. Este ELISA competitivo mostró que la Fv bivalente de CC49/4-4-20 se une al antígeno TAG-72. La Fv bivalente de CC49/4-4-20 necesitó una concentración de proteínas 200 veces mayor para desplazar a la IgG que la Fv monocatenaria.

Ejemplo 8 Sobrecruzamiento de dímeros de unión a antígeno

Los inventores han producido el sobrecruzamiento químico de dímeros de proteína de unión a antígeno 4-4-20/212 con la extensión de las dos cisteínas del extremo C (proteína monocatenaria de unión a antígeno de CPPC 4-4-20/212) de dos formas. En el Ejemplo 5, los inventores describen el diseño y la construcción genética de la proteína monocatenaria de unión a antígeno de CPPC 4-4-20/212 (diseño de la región bisagra 2 del la Tabla 5). La figura 15B muestra las secuencias de ácido nucleico y proteínas de esta proteína. Tras purificar la proteína monocatenaria de unión a antígeno de CPPC 4-4-20/212 mediante los procedimientos descritos en Whitlow y Filpula, Meth. Enzymol. 2: 97 (1991), los dímeros se formaron mediante dos procedimientos. Primero, las cisteínas libres se redujeron levemente con ditiotreitol (DTT) y después se dejaron formar puentes disulfuro entre las dos moléculas mediante oxidación al aire. Segundo, el agente de sobrecruzamiento químico, bis-maleimidihexano, se usó para producir dímeros mediante sobrecruzamiento de las cisteínas libres de dos proteínas monocatenarias de unión a antígeno de CPPC 4-4-20/212.

Una solución de 0,1 mg/ml de la proteína monocatenaria de unión a antígeno de CPPC 4-4-20/212 se redujo levemente usando tampón DTT 1mM, HEPES 50 mM, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, a pH 8,0 a 4ºC. Las muestras se dializaron contra HEPES 50 mM, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, a pH 8,0 a 4ºC durante la noche para permitir la oxidación de los sulfhidrilos libres en los puentes disulfuro intermoleculares. La figura 25 muestra un gel no reductor de SDS-PAGE tras la oxidación al aire; muestra que aproximadamente el 10% de la proteína CPPC 4-4-20/212 formaba dímeros con pesos moleculares de alrededor de 55.000 dalton.

Una solución de 0,1 mg/ml de la proteína monocatenaria de unión a antígeno de CPPC 4-4-20/212 se trató con bis-maleimidihexano 2 mM. Al contrario que la formación de puentes disulfuro entre dos cisteínas libres en el ejemplo anterior, el material de sobrecruzamiento bis-maleimidihexano debería ser estable para agentes reductores tales como \beta-mercaptoetanol. La figura 26 muestra que aproximadamente el 5% del material tratado produjo dímeros con un peso molecular de 55.000 dalton en un gel reductos de SDS-PAGE (las muestras se trataron con \beta-mercaptoetanol antes de cargarlos en el gel). Los inventores además purificaron la proteína CPPC 4-4-20/212 tratada con bis- maleimidihexano en una columna intercambiadora de cationes PolyCAT A después de someter a la proteína a diálisis extensa contra el tampón A. La figura 26 muestra que los inventores fueron capaces de intensificar la fracción que contenía el dímero hasta aproximadamente un 15%.

Claims

1. Un procedimiento para producir una proteína multivalente de unión a antígeno caracterizado porque comprende:

(i): un primer polipéptido que comprende la porción de unión de la región variable de una cadena ligera o pesada de un anticuerpo.

(ii): un segundo polipéptido que comprende la porción de unión de la región variable de una cadena ligera o pesada de un anticuerpo; y

(b) disociar dichas moléculas monocatenarias;

(c) reasociar dichas moléculas monocatenarias;

(e) recuperar dichas proteínas multivalentes

2. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha disociación está causada por la diálisis contra una solución de disociación.

3. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha reasociación está causada por la diálisis contra una solución de replegamiento o un agente de replegamiento.

4. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que dichas moléculas monocatenarias se concentran antes de separar dicha proteína multivalente de dichas moléculas monocatenarias.

5. Un procedimiento según la reivindicación 4, en el que dicha concentración se produce de aproximadamente 0,5 mg/ml de moléculas monocatenarias a la concentración a la que comienza la precipitación.

6. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la región variable de la cadena ligera de una primera proteína monocatenaria de unión a antígeno se asocia con una región variable de la cadena pesada de una segunda proteína monocatenaria de unión a antígeno.