ES2708095T3 - Anticuerpos de CD20 con afinidad de unión a receptor de Fc y función efectora incrementadas - Google Patents

Anticuerpos de CD20 con afinidad de unión a receptor de Fc y función efectora incrementadas Download PDF

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Pablo Umana
Peter Brünker
Koller Claudia Ferrara
Tobias Suter
Ursula Püntener
Ekkehard Mössner
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Abstract

Anticuerpo anti-CD20 de tipo II humanizado que comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende las CDR de SEC ID nº 16, SEC ID nº 26 y SEC ID nº 28, que opcionalmente comprende una isoleucina en la posición 34, según la numeración de Kabat, en comparación con el marco de la región variable de cadena pesada de SEC ID nº 32 y (b) una región variable de cadena ligera que comprende las CDR de SEC ID nº 18, SEC ID nº 19 y SEC ID nº 20 en la que dicho anticuerpo es capaz de competir con el anticuerpo B-Lyl murino para la unión a CD20 y que comprende una región Fc humana glucomanipulada, en la que dicha región Fc ha sido glucomanipulada en una célula huésped manipulada para expresar por lo menos una secuencia de ácido nucleico codificante de un polipéptido con actividad de ß(1,4)-N-acetylglucosaminiltransferasa III, (i) para presentar un menor número de residuos de fucosa en comparación con el anticuerpo no glucomanipulado correspondiente, (ii) para presentar un porcentaje incrementado de oligosacáridos bisectados en la región Fc en comparación con el anticuerpo no glucomanipulado correspondiente, (iii) para presentar una afinidad de unión a receptor de Fc incrementada en comparación con el anticuerpo no glucomanipulado, y (iv) para presentar una función efectora incrementada en comparación con el anticuerpo no glucomanipulado, en la que la función efectora incrementada es una inducción de la señalización directa incrementada de la apoptosis.

Description

DESCRIPCION
Anticuerpos de CD20 con afinidad de union a receptor de Fc y funcion efectora incrementadas
Antecedentes de la invencion
Campo de la invencion
La exposicion se refiere de manera general a moleculas de union a antfgeno (MUA). En realizaciones particulares, la presente exposicion se refiere a anticuerpos monoclonales recombinantes, incluyendo anticuerpos quimericos, primatizados o humanizados espedficos para CD20 humano. Ademas, la presente exposicion se refiere a moleculas de acidos nucleicos codificantes de dichos MUA y a vectores y celulas huesped que comprenden dichas moleculas de acidos nucleicos. La exposicion se refiere ademas a metodos para producir las MUA de la exposicion, y a metodos de utilizacion de dichos m Ua en el tratamiento de enfermedades. Ademas, la presente exposicion se refiere a MUA con glucosilacion modificada que presentan propiedades terapeuticas mejoradas, incluyendo anticuerpos con una union a receptores de Fc incrementada y una funcion efectora incrementada.
La invencion se define en las reivindicaciones. La invencion se refiere a un anticuerpo anti-CD20 de tipo II humanizado que comprende:
(a) una region variable de cadena pesada que comprende las CDR de SEC ID n° 16, SEC ID n° 26 y SEC ID n° 28, que opcionalmente comprende una isoleucina en la posicion 34, segun la numeracion de Kabat, en comparacion con el marco de la region variable de cadena pesada de SEC ID n° 32 y
(b) una region variable de cadena ligera que comprende las CDR de SEC ID n° 18, SEC ID n° 19 y SEC ID n° 20
en la que dicho anticuerpo es capaz de competir con el anticuerpo B-Lyl murino para la union a CD20 y que comprende una region Fc humana glucomanipulada, en la que dicha region Fc ha sido glucomanipulada en una celula huesped manipulada para expresar por lo menos una secuencia de acido nucleico codificante de un polipeptido con actividad de p(1,4)-N-acetylglucosaminiltransferasa III,
(i) para presentar un menor numero de residuos de fucosa en comparacion con el anticuerpo no glucomanipulado correspondiente,
(ii) para presentar un porcentaje incrementado de oligosacaridos bisectados en la region Fc en comparacion con el anticuerpo no glucomanipulado correspondiente,
(iii) para presentar una afinidad de union a receptor de Fc incrementada en comparacion con el anticuerpo no glucomanipulado, y
(iv) para presentar una funcion efectora incrementada en comparacion con el anticuerpo no glucomanipulado, en la que la funcion efectora incrementada es una induccion de la senalizacion directa incrementada de la apoptosis.
Antecedentes de la tecnica
El sistema inmunologico y los anticuerpos anti-CD20
El sistema inmunologico de los vertebrados, incluido el ser humano, consta de varios organos y tipos celulares que han evolucionado para reconocer, unirse y destruir con precision y espedficamente los microorganismos foraneos invasores ("antfgenos"). Los linfocitos resultan cnticos para la funcion correcta del sistema inmunologico. Estas celulas se producen en el timo, el bazo y la medula osea (adulta) y representan aproximadamente 30% de los globulos blancos totales presentes en el sistema circulatorios del ser humano adulto. Existen dos subpoblaciones principales de linfocitos: las celulas T y las celulas B. Las celulas T son responsables de la inmunidad mediada por celulas, mientras que las celulas B son responsables de la produccion de anticuerpos (inmunidad humoral). Sin embargo, en una respuesta inmunologica tfpica, las celulas T y las celulas B funcionan interdependientemente. Las celulas T resultan activadas al unirse el receptor de celulas T a fragmentos de un antfgeno que se encuentran unidos a glucoprotemas del complejo de histocompatibilidad mayor ("CMH") sobre la superficie de una celula presentadora de antfgenos; esta activacion provoca la liberacion de mediadores biologicos ("interleuquinas"), que estimulan a las celulas B a diferenciarse y producir anticuerpos ("inmunoglobulinas") contra el antfgeno.
Cada celula B dentro del huesped expresa un anticuerpo de un tipo y especificidad particulares, y diferentes celulas B expresan anticuerpos espedficos para diferentes antigenos. La proliferacion de las celulas B y la produccion de anticuerpos alcanzan un maximo como reaccion a un foraneo antfgeno, y tfpicamente ambos cesan (o se reducen sustancialmente) tras neutralizar el antfgeno foraneo. Ocasionalmente, sin embargo, la proliferacion de una celula B particular puede continuar sin control; dicha proliferacion puede resultar en un cancer denominado "linfoma de celulas B".
Tanto las celulas T como las celulas B comprenden protemas de superficie celular que pueden utilizarse como "marcadores" para la diferenciacion e identificacion. Una de estas celulas B humanas marcadoras es el antfgeno Bp35 de diferenciacion restringida a linfocitos D, denominado "CD20". CD20 se expresa durante el desarrollo temprano de las celulas pre-B y permanece hasta la diferenciacion de la celula plasmatica. Espedficamente, la molecula CD20 podna regular una etapa en el proceso de activacion que resulta necesaria para el inicio y diferenciacion del ciclo celular, y habitualmente se expresa a niveles muy altos en las celulas B neoplasicas ("tumorales"). Debido a que CD20 se encuentra presente a niveles elevados sobre celulas B "malignas", es decir, aquellas celulas B cuya proliferacion no controlada puede conducir a un linfoma de celulas B, el antigeno de superficie CD20 presenta el potencial de servir como candidato para el "reconocimiento" de los linfomas de celulas B.
En esencia, dicho reconocimiento puede generalizarse de la manera siguiente: se introducen anticuerpos espedficos del antigeno de superficie CD20 de las celulas B en un paciente, mediante inyeccion, por ejemplo. Estos anticuerpos anti-CD20 se unen espedficamente al antigeno de superficie celular CD20 de, aparentemente, celulas normales y celulas B malignas; el anticuerpo anti-CD20 unido al antfgeno de superficie CD20 puede conducir a la destruccion y marcada reduccion de las celulas B neoplasicas. Ademas, algunos agentes qmmicos o marcajes radioactivos que presentan el potencial de destruir el tumor pueden conjugarse con el anticuerpo anti-CD20 de manera que el agente se "administre" espedficamente a, por ejemplo, las celulas B neoplasicas. Con independencia del enfoque, un objetivo principal es destruir el tumor, el enfoque espedfico puede ser determinado por el anticuerpo anti-CD20 particular que se utilice y, de esta manera, los enfoques disponibles para el reconocimiento del antfgeno CD20 pueden variar considerablemente. Los anticuerpos monoclonales (mAb) no conjugados pueden ser medicinas utiles para el tratamiento del cancer, tal como demuestra la autorizacion de la U.S.
Los anticuerpos monoclonales (mAb) no conjugados pueden ser medicinas utiles para el tratamiento del cancer, tal como demuestra la autorizacion de la U.S. Food and Drug Administration del Rituximab (Rituxan™; IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA, y Genentech Inc., San Francisco, CA) para el tratamiento de celulas B CD20-positivas, linfoma no de Hodgkin folicular o de grado bajo, trastuzumab (Herceptin™, Genentech Inc.), para el tratamiento del cancer de mama avanzado (Grillo-Lopez, A.-J. et al., Semin. Oncol 26:66-73 (1999); Goldenberg, M. M., Clin. Ther. 21:309-18, 1999), Gemtuzumab (Mylotarg™, Celltech/Wyeth-Ayerst) para el tratamiento de la leucemia mieloide aguda en recafda, y Alemtuzumab (CAM-PATH™, Millenium Pharmaceuticals/Schering AG) para el tratamiento de la leucemia linfodtica cronica de celulas B. El exito de estos productos se basa no solo en su eficacia, sino tambien en sus excepcionales perfiles de seguridad (Grillo-Lopez A.-J. et al., Semin. Oncol. 26:66-73 (1999); Goldenberg, M. M., Clin Ther. 21:309-18 (1999)). A pesar de los exitos obtenidos con estos farmacos, en la actualidad existe un gran interes en obtener una actividad espedfica mas alta de anticuerpo que la proporcionada tipicamente por la terapia de mAb no conjugado. El anticuerpo monoclonal murino B-Ly1 es otro anticuerpo que es conocido que es espedfico del CD20 humano (Poppema S. y Visser L., Biotest Bulletin 3: 131-139, 1987). Polyak, -M.J. y Deans J.P., Blood 99:3256-3262 (2002) describen el anticuerpo B-Ly1 murino como uno de los 16 anticuerpos anti-CD20. Sin embargo, ninguno de los anticuerpos individualmente dado a conocer ha sido caracterizado estructuralmente por completo y ninguno de ellos ha sido dejado en deposito.
Los resultados de varios estudios sugieren que los mecanismos dependientes del receptor Fc contribuyen sustancialmente a la accion de los anticuerpos citotoxicos contra los tumores, e indican que un anticuerpo optimo contra los tumores se unina preferentemente a receptores Fc de activacion y mmimamente a la pareja inhibidora FcyRIIB (Clynes, R. A., et al., Nature Medicine 6(4):443-446 (2000); Kalergis, A.M., and Ravetch, J. V., J. Exp. Med.
195(12):1653-1659, junio de 2002). Por ejemplo, los resultados de por lo menos un estudio sugieren que el receptor FcYRIIIa en particular se encuentra fuertemente asociado a la eficacia de la terapia de anticuerpos (Cartron G. et al., Blood 99(3):754-757, febrero de 2002). Este estudio demostro que los pacientes homocigoticos para FcYRIIIa presentaban una mejor respuesta frente al Rituximab que los pacientes heterocigoticos. Los autores concluyeron que la superior respuesta se debfa a la mejor union in vivo del anticuerpo a FcyRIIIA, que resultaba en una mejor actividad de ADCC contra las celulas de linfoma (Cartron, G., et al., Blood99(3):754-757 (febrero de 2002)).
Se ha informado de diversos intentos de utilizacion como diana el antfgeno superficial CD20. Se informa de que se administro el anticuerpo monoclonal murino (de raton) 1F5 (un anticuerpo anti-CD20) mediante infusion intravenosa continua a pacientes de linfoma de celulas B. Se informa de que resultaron necesarios niveles extremadamente elevados (>2 gramos) de 1F5 para reducir el numero de celulas tumorales circulantes y los resultados se describen como transitorios. Press et al., Monoclonal Antibody 1F5 (Anti-CD20) Serotherapy of Human B-Cell Lymphomas, Blood 69/2:584-591, 1987. Un problema potencial de este enfoque es que los anticuerpos monoclonales no humanos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales murinos) tfpicamente no presentan la funcionalidad efectora humana, es decir son incapaces, entre otras cosas, de mediar la lisis dependiente del complemento o de lisar celulas diana humanas mediante la toxicidad celular dependiente de anticuerpos o de la fagocitosis mediada por el receptor Fc. Ademas, los anticuerpos monoclonales no humanos pueden ser reconocidos por el huesped humano como protema foranea; por lo tanto, las inyecciones repetidas de dichos anticuerpos foraneos podnan conducir a la induccion de respuestas inmunologicas que provocasen reacciones de hipersensibilidad perjudiciales. Para los anticuerpos monoclonales de tipo murino, lo anterior con frecuencia se denomina respuesta de anticuerpos humanos antirraton, o respuesta "HAMA". Ademas, estos anticuerpos "foraneos" pueden resultar atacados por el sistema inmunologico del huesped de manera que resulten, en efecto, neutralizados antes de alcanzar su sitio diana.
Otro enfoque del que se informa para la mejora de la capacidad de los anticuerpos monoclonales murinos de resultar eficaces en el tratamiento de los trastornos de las celulas B ha sido conjugar un marcaje radioactivo o una toxina con el anticuerpo, de manera que el marcaje o la toxina se localice en el sitio tumoral. Por ejemplo, el anticuerpo 1F5 al que se ha hecho referencia anteriormente ha sido "marcado" con yodo-131 ("131I") y se informa de que ha sido evaluado para su biodistribucion en dos pacientes (ver Eary J.F. (ver Eary J. F. et al., Imaging and Treatment of B-Cell Lymphoma, J. Nuc. Med. 31(8):1257-1268, 1990; ver tambien Press O.W. et al., Treatment of Refractory Non-Hodgkin's Lymphoma with Radiolabeled MB-1 (Anti-CD37) Antibody, J. Clin. One. 7(8):1027-1038, 1989 (indicacion de que en un paciente tratado con IF-5 marcado con 131I se observaba una "respuesta parcial"); Goldenberg D.M. et al., "Targeting, Dosimetry and Radioimmunotherapy of B-Cell Lymphomas with Iodine-131-Labeled LL2 Monoclonal Antibody", J. One. 9(4):548-564, 1991 (se informo de que tres de ocho pacientes que habfan recibido multiples inyecciones hadan desarrollado una respuesta HAMA); Appelbaum F.R., Radiolabeled Monoclonal Antibodies in the Treatment of Non-Hodgkin's Lymphoma, Hem./Onc. Clinics of N. A. 5/5: 1013-1025 (1991) (artmulo de revision); Press, O. W. et al "Radiolabeled-Antibody Therapy of B-Cell Lymphoma with Autologous Bone Marrow Support." New England J. Med. 329/17: 329(17):1219-1223, 1993 (anticuerpo IF5 anti-CD20 marcado con yodo-131 y B1), y Kaminski M.G. New England J. Med. 329/7, 1993) (anticuerpo B1 anti-CD20 marcado con yodo-131, en lo sucesivo "Kaminski"). Tambien se han conjugado toxinas (es decir, agentes quimioterapeuticos, tales como doxorrubicina o mitomicina C) con anticuerpos. Ver, por ejemplo, la solicitud de patente PCT publicada WO n° 92/07466 (publicada el 14 de mayo de 1992).
Se han desarrollado anticuerpos quimericos que comprenden partes de anticuerpos de dos o mas especies diferentes (por ejemplo, raton y ser humano) como alternativa a los anticuerpos "conjugados". Por ejemplo, Liu A.Y. et al., Production of a Mouse-Human Chimeric Monoclonal Antibody to CD20 with Potent Fc-Dependent Biologic Activity", J. Immun. 139(10):3521-3526, 1987, describen un anticuerpo quimerico raton/humano dirigido contra el antfgeno CD20. Ver tambien la publicacion de patente PCT WO n° 88/04936. Por ejemplo, el rituximab (RITUXAN®), un anticuerpo quimerico anti-CD20, ha sido autorizado para el tratamiento del linfoma no de Hodgkin.
Dada la expresion de CD20 por parte de los linfomas de celulas B, este antfgeno puede servir como candidato para el "reconocimiento" de dichos linfomas. En esencia, dicho reconocimiento puede generalizarse de la manera siguiente: se administran en el paciente anticuerpos espedficos para el antfgeno de superficie CD20 sobre las celulas B. Estos anticuerpos anti-CD20 se unen espedficamente al antfgeno CD20 de (aparentemente) tanto celulas normales como B malignas, y el anticuerpo unido a CD20 sobre la superficie celular resulta en la destruccion y reduccion marcada de las celulas B tumorigenicas. Ademas, pueden unirse directa o indirectamente agentes qrnmicos, citotoxinas o agentes radioactivos al anticuerpo anti-CD20, de manera que el agente sea selectivamente "enviado" a las celulas B que expresan antfgeno CD20. En ambos enfoques el objetivo principal es destruir el tumor. El enfoque espedfico depende del anticuerpo anti-CD20 particular que se utilice. De esta manera, resulta evidente que los diversos enfoques para el reconocimiento del antfgeno CD20 pueden variar considerablemente.
El anticuerpo de rituximab (RITUXAN®) es un dominio constante murino gamma-1 humano quimerico manipulado geneticamente que contiene un anticuerpo monoclonal dirigido contra el antfgeno CD20 humano. Dicho anticuerpo quimerico contiene dominios constantes gamma-1 humanos y se identifica mediante el nombre "C2B8" en la patente Us n° 5.736.137 (Andersen et. Al.) publicada el 17 de abril de 1998, asignada a IDEC Pharmaceuticals Corporation. El RITUXAN® ha sido autorizado para el tratamiento de pacientes con linfoma no de Hodgkin de celulas B CD20-positivo de grado bajo o folicular en recafda o refractario. Los estudios in vitro de mecanismo de accion han demostrado que el RITUXAN® muestra citotoxicidad dependiente del complemento humano (CDC) (Reff et. al., Blood 83(2): 435­ 445, 1994). Ademas, muestra una actividad significativa en ensayos que miden la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Se ha demostrado que el RITUXAN® presenta actividad antiproliferativa en ensayos de incorporacion de timidina y una capacidad limitada de inducir apoptosis directamente, mientras que los anticuerpos de CD20 no la presentan (Maloney et al., Blood 88(10): 637a, 1996).
Glucosilacion de anticuerpos
El componente oligosacarido puede afectar significativamente a propiedades relevantes a la eficacia de una glucoprotema terapeutica, incluyendo la estabilidad ffsica, la resistencia al ataque de proteasas, las interacciones con el sistema inmunologico, la farmacocinetica y la actividad biologica espedfica. Estas propiedades pueden depender no solo de la presencia o ausencia, sino tambien de las estructuras espedficas de los oligosacaridos. Pueden realizarse algunas generalizaciones sobre la relacion entre la estructura del oligosacarido y la funcion de la glucoprotema. Por ejemplo, determinadas estructuras oligosacaridas median en la eliminacion rapida de la glucoprotema del flujo sangumeo mediante interacciones con protemas de union a carbohidrato espedficas, mientras que otras pueden unirse a anticuerpos y desencadenar reacciones inmunologicas no deseadas. (Jenkins et al., Nature Biotechnol. 14:975-81 (1996)).
Las celulas de mairnfero son los huespedes preferentes para la produccion de glucoprotemas terapeuticas, debido a su capacidad para glucosilar protemas de la manera mas compatible para la aplicacion en el ser humano (Cumming et al., Glycobiology 1: 115-30 (1991); Jenkins et al., Nature Biotechnol. 14:975-81 (1996)). Las bacterias muy raramente glucosilan las protemas, y al igual que otros tipos de huespedes comunes, tales como levaduras, hongos filamentosos, celulas de insecto y vegetales, proporcionan patrones de glucosilacion asociados a la rapida eliminacion del flujo sangumeo, a interacciones inmunologicas no deseables y en algunos casos espedficos, una actividad biologica reducida. Entre las celulas de mam^era, las celulas de ovario de hamster chino (CHO) han sido las utilizadas mas comunmente durante las ultimas dos decadas. Ademas de proporcionar patrones de glucosilacion adecuados, estas celulas permiten la generacion consistente de lmeas celulares clonales altamente productivas y geneticamente estables. Pueden cultivarse a altas densidades en biorreactores simples utilizando medio libre de suero, y permiten el desarrollo de procesos biologicos seguros y reproducibles. Entre otras celulas animales utilizadas comunmente se incluyen las celulas de rinon de hamster neonato (BHK), celulas de mieloma de raton NS0 y SP2/0. Mas recientemente, tambien se ha sometido a ensayo la produccion de animales transgenicos (Jenkins et al., Nature Biotechnol. 14:975­ 81 (1996)).
Todos los anticuerpos contienen estructuras de carbohidrato en posiciones conservadas en las regiones constantes de cadena pesada, presentando cada isotipo una serie diferente de estructuras de carbohidrato N-ligadas, que afectan variablemente al ensamblaje, secrecion o actividad funcional de la protema (Wright A. y Morrison S.L., Trends Biotech.
15:26-32, 1997). La estructura del carbohidrato N-ligado unido vana considerablemente dependiendo del grado de procesamiento, y puede incluir oligosacaridos ricos en manosa, de multiples ramificaciones, asf como oligosacaridos complejos biantenarios (Wright A. y Morrison S.L., Trends Biotech. 15:26-32, 1997). Tfpicamente se produce un procesamiento heterogeneo de las estructuras de oligosacarido nucleares unidas en un sitio de glucosilacion particular, de manera que incluso existen anticuerpos monoclonales en forma de glucoformas multiples. De manera similar, se ha demostrado que se producen diferencias mayores en la glucosilacion de los anticuerpos en diferentes lmeas celulares, e incluso se observan diferencias menores en una lmea celular dada cultivada bajo diferentes condiciones de cultivo (Lifely M.R. (Lifely M. R. et al., Glycobiology 5(8):813-22, 1995).
Una manera de obtener grandes incrementos de potencia, manteniendo simultaneamente un procedimiento de produccion simple y evitando potencialmente efectos secundarios no deseables significativos, es incrementar las funciones efectoras naturales mediadas por celulas de anticuerpos monoclonales mediante la manipulacion del componente oligosacarido tal como se describe en Umana P. et al., Nature Biotechnol. 17:176-180, 1999 y en la patente US n° 6.602.684.
Los anticuerpos de tipo IgG1, los anticuerpos mas comunmente utilizados en la inmunoterapia del cancer, son glucoprotemas que presentan un sitio de glucosilacion N-ligada conservado en Asn297 en cada dominio CH2. Los dos oligosacaridos complejos biantenarios unidos a Asn297 se encuentran enterrados entre los dominios CH2, formando contactos extensivos con el esqueleto polipeptfdico, y su presencia resulta esencial para que el anticuerpo medie en funciones efectoras, tales como la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) Lifely, M. R., et al., Glycobiology 5:813-822 (1995); Jefferis, R., et al., Immunol Rev. 163:59-76 (1998); Wright, A. y Morrison, S. L., Trends Biotechnol. 15:26-32, 1997).
Se ha demostrado anteriormente que la sobreexpresion en celulas de ovario de hamster chino (CHO) de p(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III ("GnTIN"), una glucosiltransferasa que cataliza la formacion de los oligosacaridos bisectados, incrementa significativamente la actividad in vitro de ADCC de un anticuerpo monoclonal quimerico antineuroblastoma (chCE7) producido por las celulas CHO manipuladas. (ver Umafia P. et al., Nature Biotechnol.
17:176-180, 1999 y publicacion internacional n° WO 99/54342).
El anticuerpo chCE7 pertenece a una clase grande de mAb no conjugados que presentan una afinidad y especificidad para tumores elevadas, aunque presentan una potencia excesivamente baja para resultar clmicamente utiles cuando se producen en las lmeas celulares industriales estandares que carecen del enzima GnTIII (Umana P. et al., Nature Biotechnol. 17:176-180 (1999)). Este estudio fue el primero que demostro que podfan obtenerse grandes incrementos de la actividad de ADCC mediante la manipulacion de las celulas productoras de anticuerpos para que expresasen GnTIII, que tambien condujo a un incremento de la proporcion de oligosacaridos bisectados asociados a region constante (Fc), incluyendo oligosacaridos no fucosilados bisectados, por encima de los niveles presentes en los anticuerpos naturales.
Sigue existiendo una necesidad de enfoques terapeuticos mejorados con diana en el antfgeno CD20 destinados al tratamiento de los linfomas de celulas B en primates, incluyendo, aunque sin limitacion, el ser humano.
Breve descripcion resumida de la invencion
Reconociendo el enorme potencial terapeutico de las moleculas de union a antfgeno (MUA) que presentan la especificidad de union del anticuerpo B-Ly1 murino y que han sido glucomanipuladas para incrementar la afinidad de union a receptores Fc y la funcion efectora, los presentes inventores han desarrollado un metodo para producir dichas MUA. Este metodo implica, entre otras cosas, producir anticuerpos quimericos recombinantes o fragmentos quimericos de los mismos. La eficacia de estas MUA se potencia adicionalmente mediante la manipulacion del perfil de glucosilacion de la region Fc del anticuerpo.
De acuerdo con lo anteriormente expuesto, en un aspecto, la exposicion se refiere a un polinucleotido aislado que comprende: (a) una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste en: SEC ID n° 5, SEC ID n° 6 y SEC ID n° 7. (CDR Vh- 1 ); (b) una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste en: SEC ID n° 21, SEC ID n° 22 y SEC ID n° 23. (CDR Vh- 2 ) y SEC ID n° 24. En otro aspecto, la exposicion se refiere a un polinucleotido aislado que comprende SEC ID n° 8, SEC ID n° 9 y SEC ID n° 10 (CDR Vl). En una realizacion, cualquiera de dichos polinucleotidos codifica un polipeptido de fusion.
En un aspecto adicional, la exposicion se refiere a un polinucleotido aislado que comprende la secuencia SEC ID n° 3. En otro aspecto, la exposicion se refiere a un polinucleotido aislado que comprende la SEC ID n° 4. En un aspecto adicional, la exposicion se refiere a un polinucleotido aislado que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las secuencias SEC ID n° 29, SEC ID n° 31, Se c ID n° 33, SEC ID n° 35, SEC ID n° 37, SEC ID n° 39, SEC ID n° 41, SEC ID n° 43, SEC ID n° 45, SEC ID n° 47, SEC ID n° 49, SEC ID n° 51, SEC ID n° 53, SEC ID n° 55, SEC ID n° 57, SEC ID n° 59, SEC ID n° 61, SEC ID n° 63, SEC ID n° 65, SEC ID n° 67, SEC ID n° 69 y SEC ID n° 71. En otro aspecto la invencion se refiere a un polinucleotido aislado que comprende la secuencia SEC ID n° 75. En una realizacion, dichos polinucleotidos codifican polipeptidos de fusion.
La exposicion se refiere ademas a un polinucleotido aislado que comprende una secuencia que presenta una identidad de por lo menos 80% respecto a la secuencia SEC ID n° 3, en el que el polinucleotido aislado codifica un polipeptido de fusion. En un aspecto adicional, la exposicion se refiere a un polinucleotido aislado que comprende una secuencia que presenta una identidad de por lo menos 80% respecto a la secuencia SEC ID n° 4, en el que dicho polinucleotido aislado codifica un polipeptido de fusion. La exposicion se refiere ademas a un polinucleotido aislado que comprende una secuencia que presenta una identidad de por lo menos 80% respecto a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las secuencias SEC ID n° 29, Se c ID n° 31, SEC ID n° 33, SEC ID n° 35, SEC ID n° 37, SEC ID n° 39, SEC ID n° 41, SEC ID n° 43, SEC ID n° 45, SEC ID n° 47, SEC ID n° 49, SEC ID n° 51, SEC ID n° 53, SEC ID n° 55, SEC ID n° 57, SEC ID n° 59, SEC ID n° 61, SEC ID n° 63, SEC ID n° 65, SEC ID n° 67, SEC ID n° 69 y SEC ID n° 71, en el que dicho polinucleotido aislado codifica un polipeptido de fusion. En un aspecto adicional, la exposicion se refiere a un polinucleotido aislado que comprende una secuencia que presenta una identidad de por lo menos 80% respecto a la secuencia SEC ID n° 75, en el que dicho polinucleotido aislado codifica un polipeptido de fusion.
La exposicion se refiere ademas a un polinucleotido que comprende SEC ID n° 11 (cadena pesada completa) o a polinucleotidos que presentan una identidad de 80%, 85%, 90%, 95% o 99% respecto a la SEC ID n° 11. La exposicion se refiere ademas a un polinucleotido que comprende la SEC ID n° 12 (cadena ligera completa) o a polinucleotidos que presentan una identidad de 80%, 85%, 90%, 95% o 99% respecto a la SEC ID n° 12.
La exposicion se refiere ademas a un polinucleotido aislado que codifica un polipeptido quimerico que presenta la secuencia SEC ID n° 1. En una realizacion, el polinucleotido comprende una secuencia codificante de un polipeptido que presenta la secuencia SEC ID n° 1, y una secuencia codificante de un polipeptido que presenta la secuencia de una region Fc de anticuerpo, o un fragmento de la misma, procedente de una especie que no es el raton. La exposicion se refiere ademas a un polinucleotido aislado codificante de un polipeptido quimerico que presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste en las secuencias SEC ID n° 30, Se c ID n° 32, Se c ID n° 34, SEC ID n° 36, SEC ID n° 38, SEC ID n° 40, SEC ID n° 42, SEC ID n° 44, SEC ID n° 46, SEC ID n° 48, SEC ID n° 50, SEC ID n° 52, SEC ID n° 54, SEC ID n° 56, SEC ID n° 58, SEC ID n° 60, SEC ID n° 62, SEC ID n° 64, SEC ID n° 66, SEC ID n° 68, SEC ID n° 70 y SEC ID n° 72. En una realizacion, el polinucleotido comprende una secuencia codificante de un polipeptido que presenta una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste de las secuencias SEC ID n° 30, SEC ID n° 32, SEC ID n° 34, SEC ID n° 36, SEC ID n° 38, SEC ID n° 40, SEC ID n° 42, SEC ID n° 44, SEC ID n° 46, SEC ID n° 48, SEC ID n° 50, SEC ID n° 52, SEC ID n° 54, SEC ID n° 56, SEC ID n° 58, SEC ID n° 60, SEC ID n° 62, SEC ID n° 64, SEC ID n° 66, SEC ID n° 68, SEC ID n° 70 y SEC ID n° 72, y una secuencia codificante de un polipeptido que presenta la secuencia de una region Fc de anticuerpo, o un fragmento de la misma, procedente de una especie que no es el raton.
En todavfa otro aspecto, la exposicion se refiere a un polinucleotido aislado codificante de un polipeptido quimerico que presenta la secuencia SEC ID n° 2. En una realizacion el polinucleotido comprende una secuencia codificante de un polipeptido que presenta la secuencia SEC ID n° 2 y una secuencia codificante de un polipeptido que presenta la secuencia de una region Fc de anticuerpo, o un fragmento del mismo, procedente la exposicion se refiere a un polinucleotido aislado codificante de un polipeptido quimerico que presenta la secuencia SEC ID n° 76. En una realizacion, el polinucleotido comprende una secuencia codificante de un polipeptido que presenta la secuencia SEC ID n° 76, y una secuencia codificante de un polipeptido que presenta la secuencia de una region Fc de anticuerpo, o un fragmento de la misma, procedente de una especie que no es el raton.
La exposicion se refiere ademas a un polinucleotido aislado que comprende una secuencia codificante de un polipeptido que presenta la region Vh del anticuerpo B-Ly1 murino, o variantes funcionales del mismo, y una secuencia codificante de un polipeptido que presenta la secuencia de una region Fc de anticuerpo, o un fragmento de la misma, procedente de una especie que no es el raton. En otro aspecto, la exposicion se refiere a un polinucleotido aislado que comprende una secuencia codificante de un polipeptido que presenta la region Vl del anticuerpo B-Ly1 murino, o variantes funcionales del mismo, y una secuencia codificante de un polipeptido que presenta la secuencia codificante de un polipeptido que presenta la secuencia de una region Fc de anticuerpo, o un fragmento de la misma, procedente de una especie que no es el raton.
La exposicion se refiere ademas a un vector de expresion que comprende cualquiera de los polinucleotidos aislados que se han indicado anteriormente y a una celula huesped que comprende dicho vector de expresion. En un aspecto adicional, la exposicion se refiere a una celula huesped que comprende cualquiera de los polinucleotidos aislados que se han indicado anteriormente.
En un aspecto, la exposicion se refiere a un polipeptido aislado que comprende: (a) una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste en: SEC ID n° 15, SEC ID n° 16 y SEC ID n° 17. (CDR Vh- 1 ); (b) una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste en: SEC ID n° 25, SEC ID n° 26 y SEC ID n° 27 (Cd R Vh- 2 ) y SEC ID n° 28, en el que dicho polipeptido es un polipeptido de fusion. En otro aspecto, la exposicion se refiere a un polinucleotido aislado que comprende SEC ID n° 18, SEC ID n° 19 y SEC ID n° 20 (CDR Vl), en el que dicho polipeptido es un polipeptido de fusion.
La exposicion se refiere ademas a un polipeptido quimerico que comprende la secuencia de SEC ID n° 1 o una variante de la misma. La exposicion se refiere ademas a un polipeptido quimerico que comprende la secuencia de SEC ID n° 2 o una variante de la misma. En una realizacion, cualquiera de dichos polipeptidos comprende ademas una region Fc humana. La exposicion se refiere ademas a un polipeptido quimerico que comprende una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste en las secuencias Se c iD n° 30, SEC ID n° 32, SEC ID n° 34, SEC ID n° 36, SEC ID n° 38, SEC ID n° 40, SEC ID n° 42, SEC ID n° 44, SEC ID n° 46, SEC ID n° 48, SEC ID n° 50, SEC ID n° 52, SEC ID n° 54, SEC ID n° 56, SEC ID n° 58, SEC ID n° 60, SEC ID n° 62, SEC ID n° 64, SEC ID n° 66, SEC ID n° 68, SEC ID n° 70 y SEC ID n° 72, o una variante de las mismas. La exposicion se refiere ademas a un polipeptido quimerico que comprende la secuencia de SEC ID n° 76 o una variante de la misma. En una realizacion, cualquiera de dichos polipeptidos comprende ademas una region Fc humana.
En otro aspecto la exposicion se refiere a un polipeptido que comprende una secuencia derivada del anticuerpo B-Lyl murino y una secuencia derivada de un polipeptido heterologo y a una molecula de union a antfgeno que comprende dicho polipeptido. En una realizacion, la molecula de union a antigeno es un anticuerpo. En una realizacion preferente, el anticuerpo es quimerico. En otra realizacion preferente, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado o primatizado.
En un aspecto adicional, la exposicion se refiere a un polipeptido aislado que comprende la SEC ID n° 13 o una variante de la misma. En otro aspecto, la exposicion se refiere a un polipeptido aislado que comprende la secuencia SEC ID n° 14.
En otro aspecto, la exposicion se refiere a una MUA, que es capaz de competir con el anticuerpo B-Lyl murino para la union a CD20 y que es quimerica. En una realizacion, la MUA es un anticuerpo o un fragmento del mismo. En otra realizacion adicional, la MUA es un anticuerpo recombinante que comprende una region Vh que presenta una secuencia de aminoacidos seleccionada de entre el grupo que consiste en la secuencia SEC ID n° 1, SEC ID n° 30; SEC ID n° 32; SEC ID n° 34; SEC ID n° 36; SEC ID n° 38; SEC ID n° 40; SEC ID n° 42; SEC ID n° 44; SEC ID n° 46; SEC ID n° 48; SEC ID n° 50; SEC ID n° 52; SEC ID n° 54; SEC ID n° 56; SEC ID n° 58; SEC ID n° 60; SEC ID n° 62; SEC ID n° 64; SEC ID n° 66; SEC ID n° 68; SEC ID n° 70 y SEC ID n° 72. En otra realizacion, la MUA es un anticuerpo recombinante que comprende una region Vl que presenta una secuencia de aminoacidos seleccionada de entre el grupo que consiste en la secuencia SEC ID n° 2 y SEC ID n° 76. La MUA es un anticuerpo recombinante que se encuentra humanizado. En todavfa otra realizacion, la MUA es un anticuerpo recombinante que ha sido humanizado. En otra realizacion, la MUA es un anticuerpo recombinante que comprende una region Fc humana. En una realizacion adicional, cualquiera de las MUA comentadas anteriormente puede conjugarse con una fraccion, tal como una toxina o un marcaje radioactivo.
La exposicion se refiere ademas a una MUA tal como se describe en la presente memoria, presentando dicha MUA oligosacaridos modificados. En una realizacion, los oligosacaridos modificados presentan una fucosilacion reducida en comparacion con los oligosacaridos no modificados. En otras realizaciones, los oligosacaridos modificados son hforidos o complejos. En una realizacion adicional, la MUA presenta una proporcion incrementada de oligosacaridos no fucosilados o de oligosacaridos no fucosilados bisectados en la region Fc de dicha molecula. En una realizacion, los oligosacaridos no fucosilados bisectados son hforidos. En una realizacion adicional, los oligosacaridos no fucosilados bisectados son complejos. En una realizacion, por lo menos 20% de los oligosacaridos en la region Fc de dicho polipeptido son no fucosilados o bisectados. En realizaciones mas preferentes, por lo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% o 75% o mas de los oligosacaridos son no fucosilados o no fucosilados bisectados.
La exposicion se refiere ademas a un polinucleotido codificante de cualquiera de las MUA comentadas anteriormente, y a vectores de expresion y celulas que comprenden dicho polinucleotido.
La exposicion se refiere ademas a un metodo para producir una MUA, que es capaz de competir con el anticuerpo B-Lyl murino para la union a CD20 y en el que dicha MUA es quimerica, comprendiendo dicho metodo: (a) cultivar una celula huesped que comprende un polinucleotido que codifica una MUA de la presente invencion en un medio bajo condiciones que permitan la expresion de dicho polinucleotido codificante de dicha MUA, y (b) recuperar dicha AMB a partir del cultivo resultante.
En otro aspecto, la exposicion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende la MUA descrita en la presente memoria. Se encuentra contemplado que la composicion farmaceutica pueda comprender ademas un portador farmaceuticamente aceptable, un adyuvante o una combinacion de los mismos.
En un aspecto adicional, la exposicion se refiere a un metodo para tratar una enfermedad tratable mediante la reduccion marcada de las celulas B. El metodo comprende administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de las MUA de la presente invencion en un sujeto humano que lo necesita. En una realizacion preferente, la enfermedad se trata mediante la administracion de una MUA que es un anticuerpo quimerico o un fragmento quimerico de un anticuerpo.
En todavfa otro aspecto, la exposicion se refiere a una celula huesped manipulada para que exprese por lo menos un acido nucleico codificante de un polipeptido que presenta actividad de GnTIII en una cantidad suficiente para modificar los oligosacaridos en la region Fc de los anticuerpos producidos por la celula huesped, en la que las MUA son capaces de competir con el anticuerpo B-Ly1 murino para la union a CD20 y en la que las MUA son quimericas. En una realizacion, el polipeptido que presenta actividad de GnTIII es un polipeptido de fusion. En otra realizacion, la MUA producida por la celula huesped es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. En una realizacion adicional, la MUA comprende una region equivalente a la region Fc de una IgG humana.
La exposicion se refiere ademas a un polinucleotido aislado que comprende por lo menos una region determinante de complementariedad del anticuerpo B-Ly1 murino, o una variante o forma truncada del mismo que contiene por lo menos los residuos determinantes de especificidad para dicha region determinante de complementariedad, en el que dicho polinucleotido aislado codifica un polipeptido de fusion. Preferentemente, dichos polinucleotidos aislados codifican un polipeptido de fusion que es una molecula de union a antfgeno. En una realizacion, el polinucleotido comprende tres regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo B-Ly1 murino, o variantes o formas truncadas del mismo que contienen por lo menos residuos determinantes de especificidad de cada una de dichas tres regiones determinantes de complementariedad. En otra realizacion, el polinucleotido codifica la region variable entera de la cadena ligera o pesada de un anticuerpo quimerico (por ejemplo, humanizado). La exposicion se refiere ademas a los polipeptidos codificados por dichos polinucleotidos.
En otra realizacion, la exposicion se refiere a una molecula de union a antfgeno que comprende por lo menos una region determinante de complementariedad del anticuerpo B-Ly1 murino, o una variante o forma truncada del mismo que contiene por lo menos los residuos determinantes de especificidad de dicha region determinante de complementariedad, y que comprende una secuencia derivada de un polipeptido heterologo. En una realizacion, la molecula de union a antfgeno comprende tres regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo B-Ly1 murino, o variantes o formas truncadas del mismo que contienen por lo menos los residuos determinantes de especificidad para cada una de dichas tres regiones determinantes de complementariedad. En otro aspecto, la molecula de union a antfgeno comprende la region variable de una cadena ligera o pesada de anticuerpo. En una realizacion particularmente util, la molecula de union a antfgeno es un anticuerpo quimerico, por ejemplo, humanizado. La exposicion se refiere ademas a metodos de preparacion de dichas moleculas ligantes de antfgeno y a la utilizacion de las mismas en el tratamiento de enfermedades, incluyendo los linfomas de las celulas B.
La presente exposicion es el primer caso conocido de manipulacion de un anticuerpo anti-CD20 de tipo II para que presente funciones efectoras incrementadas, tales como la ADCC, conservando simultaneamente una potente capacidad de apoptosis. Por consiguiente, la presente exposicion se refiere a un anticuerpo anti-CD20 de tipo II manipulado que presenta una ADCC incrementada como resultado de dicha manipulacion y sin perdida de capacidad sustancial de inducir apoptosis. En una realizacion, los anticuerpos anti-CD20 de tipo II han sido manipulados para presentar un patron alterado de glucosilacion en la region Fc. En una realizacion particular, la glucosilacion alterada comprende un nivel incrementado de residuos complejos bisectados en la region Fc. En otra realizacion particular, la glucosilacion alterada comprende un numero reducido de residuos fucosa en la region Fc. En otra realizacion, los anticuerpos anti-CD20 de tipo II han sido sometidos a manipulacion del polipeptido. La exposicion se refiere asimismo a metodos de preparacion de dichos anticuerpos de tipo II manipulados y a metodos de utilizacion de dichos anticuerpos en el tratamiento de diversos trastornos de las celulas B, incluyendo los linfomas de celulas B.
La celula huesped de la presente invencion puede seleccionarse del grupo que incluye, aunque sin limitacion, una celula CHO, una celula BHK, una celula NSO, una celula SP2/0, una celula de mieloma YO, una celula de mieloma de raton P3X63, una celula PER, una celula PERC6 o una celula de hibridoma. En una realizacion, la celula huesped de la exposicion comprende ademas un polinucleotido transfectado que comprende un polinucleotido codificante de la region Vl del anticuerpo B-Ly1 murino o variantes del mismo y una secuencia codificante de una region equivalente a la region Fc de una inmunoglobulina humana. En otra realizacion, la celula huesped de la exposicion comprende ademas un polinucleotido transfectado que comprende un polinucleotido codificante de la region Vh del anticuerpo B-Ly1 murino o variantes del mismo y una secuencia codificante de una region equivalente a la region Fc de una inmunoglobulina humana.
En un aspecto adicional, la exposicion se refiere a una celula huesped que produce una MUA que muestra una afinidad de union a receptores Fc incrementada y/o una funcion efectora incrementada como resultado de la modificacion de sus oligosacaridos. En una realizacion, la afinidad de union incrementada es a un receptor Fc, particularmente al receptor FcyRIIIA. La funcion efectora contemplada en la presente invencion puede seleccionarse de entre el grupo que incluye, aunque sin limitacion, citotoxicidad celular mediada por Fc incrementada, union incrementada a celulas Nk , union incrementada a macrofagos, union incrementada a celulas polimorfonucleares, union incrementada a monocitos, senalizacion directa incrementada inductora de apoptosis, maduracion de celulas dendnticas incrementada y cebado incrementado de las celulas T.
En una realizacion adicional, la celula huesped tal como se describe en la presente memoria comprende por lo menos un acido nucleico codificante de un polipeptido que presenta actividad de GnTIII que se encuentra operablemente ligado a un elemento promotor constitutivo.
En otro aspecto, la exposicion se refiere a un metodo para producir una MUA en una celula huesped, que comprende: (a) cultivar una celula huesped manipulada para expresar por lo menos un polinucleotido codificante de un polipeptido de fusion que presente actividad de GnTIII bajo condiciones que permitan la produccion de dicha MUA y que permitan la modificacion de los oligosacaridos presentes en la region Fc de dicha MUA, y (b) aislar dicha MUA, en donde dicha MUA es capaz de competir con el anticuerpo B-Ly1 murino para la union a CD20, y en donde dicha MUA es quimerica. En una realizacion, el polipeptido que presenta actividad de GnTIII es un polipeptido de fusion, que preferentemente comprende el dominio catalttico de GnTIII y el dominio de localizacion en el Golgi de un polipeptido residente en el Golgi heterologo seleccionado del grupo que consiste en el dominio de localizacion de la manosidasa II, el dominio de localizacion de p(1,2)-N-acetiglucosaminiltransferasa I ("GnTI"), el dominio de localizacion de manosidasa I, el dominio de localizacion de p(1,2)-N-acetilglucosaminiltransferasa II ("GnTII") y el dominio de localizacion de la a1-6-fucosiltransferasa nuclear. Preferentemente, el dominio de localizacion en el Golgi es de la manosidasa II o de GnTI.
En un aspecto adicional, la exposicion se refiere a un metodo para modificar el perfil de glucosilacion de una MUA anti-CD20 producida por una celula huesped, que comprende introducir en la celula huesped por lo menos un acido nucleico o vector de expresion de la invencion. En una realizacion, la MUA es un anticuerpo o un fragmento del mismo, comprendiendo preferentemente la region Fc de una IgG. Alternativamente, el polipeptido es una protema de fusion que incluye una region equivalente a una region Fc de una IgG humana.
En un aspecto, la exposicion se refiere a un anticuerpo quimerico recombinante, o a un fragmento del mismo, capaz de competir con el anticuerpo B-Ly1 murino para la union a CD20 y que presenta una fucosilacion reducida.
En otro aspecto, la presente exposicion se refiere a un metodo para modificar la glucosilacion del anticuerpo recombinante o de un fragmento del mismo de la invencion mediante la utilizacion de un polipeptido de fusion que presenta actividad de GnTIII y que comprende el dominio de localizacion de Golgi de un polipeptido residente en el Golgi heterologo. En una realizacion, los polipeptidos de fusion de la invencion comprenden el dominio catalttico de GnTIII. En otra realizacion, el dominio de localizacion en el Golgi se selecciona del grupo que consiste en el dominio de localizacion de la manosidasa II, el dominio de localizacion de GnTI, el dominio de localizacion de la manosidasa I, el dominio de localizacion de GnTII y el dominio de localizacion de la a1-6-fucosiltransferasa nuclear. Preferentemente, el dominio de localizacion en el Golgi es de la manosidasa II o de GnTI.
En una realizacion, el metodo descrito en la presente memoria se refiere a producir un anticuerpo quimerico recombinante, o un fragmento del mismo, con oligosacaridos modificados, en el que dichos oligosacaridos modificados presentan una fucosilacion reducida en comparacion con los oligosacaridos no modificados. Segun la presente exposicion, estos oligosacaridos modificados pueden ser hfbridos o complejos. En otra realizacion, el metodo de la invencion se refiere a la produccion de un anticuerpo quimerico recombinante o un fragmento del mismo que presenta una proporcion incrementada de oligosacaridos no fucosilados bisectados en la region Fc de dicho polipeptido. En una realizacion, los oligosacaridos no fucosilados bisectados son hfbridos. En otra realizacion, los oligosacaridos no fucosilados bisectados son complejos. En una realizacion adicional, el metodo de la invencion se refiere a producir un anticuerpo quimerico recombinante o un fragmento del mismo en el que por lo menos 20% de los oligosacaridos de la region Fc de dicho polipeptido son no fucosilados bisectados. En otra realizacion preferente, por lo menos 30% de los oligosacaridos en la region Fc de dicho polipeptido son no fucosilados bisectados. En otra realizacion preferente, en la que por lo menos 35% de los oligosacaridos en la region Fc de dicho polipeptido son no fucosilados bisectados.
En un aspecto adicional, la exposicion se refiere a un anticuerpo quimerico recombinante o a un fragmento del mismo, que muestra una afinidad de union a receptor Fc incrementada y/o una funcion efectora incrementada como resultado de la modificacion de sus oligosacaridos. En una realizacion, la afinidad de union incrementada es a un receptor activador de Fc. En una realizacion adicional, el receptor Fc es un receptor activador Fcy, particularmente el receptor FcyRIII. La funcion efectora contemplada en la presente invencion puede seleccionarse de entre el grupo que incluye, aunque sin limitacion, citotoxicidad celular mediada por Fc incrementada, union incrementada a celulas NK, union incrementada a macrofagos, union incrementada a celulas polimorfonucleares, union incrementada a monocitos, senalizacion directa incrementada inductora de apoptosis, maduracion de celulas dendnticas incrementada y cebado incrementado de las celulas T.
En otro aspecto, la exposicion se refiere a un fragmento de anticuerpo quimerico recombinante que presenta la especificidad de union del anticuerpo B-Ly1 murino y que contiene la region Fc, que ha sido manipulada para presentar una funcion efectora incrementada, producida mediante cualquiera de los metodos de la presente invencion.
En otro aspecto, la presente exposicion se refiere a una protema de fusion que incluye un polipeptido que presenta la secuencia SEC ID n° 1 y una region equivalente a la region Fc de una inmunoglobulina y manipulada para presentar una funcion efectora incrementada, producida mediante cualquiera de los metodos descritos en la presente memoria.
En otro aspecto, la presente exposicion se refiere a una protema de fusion que incluye un polipeptido que presenta la secuencia SEC ID n° 2 y una region equivalente a la region Fc de una inmunoglobulina y manipulada para presentar una funcion efectora incrementada, producida mediante cualquiera de los metodos descritos en la presente memoria.
En un aspecto, la presente exposicion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende un anticuerpo quimerico recombinante, producido mediante cualquiera de los metodos de la presente invencion, y un portador farmaceuticamente aceptable. En otro aspecto, la presente exposicion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende un fragmento de anticuerpo quimerico recombinante producido mediante cualquiera de los metodos de la presente invencion, y un portador farmaceuticamente aceptable. En otro aspecto, la presente exposicion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende una protema de fusion producida mediante cualquiera de los metodos descritos en la presente memoria, y un portador farmaceuticamente aceptable.
La exposicion se refiere ademas a un metodo de tratamiento de una enfermedad tratable mediante la reduccion marcada de las celulas B, que comprende administrar una cantidad terapeuticamente eficaz del anticuerpo quimerico recombinante o de un fragmento del mismo, producido mediante cualquiera de los metodos descritos en la presente memoria, en un sujeto humano que lo necesita.
Breve descripcion de las figuras
FIG 1. Secuencia de nucleotidos (SEC ID n° 3) y de aminoacidos (SEC ID n° 1) de la region Vh de B-Ly1 murino. FIG 2. Secuencia de nucleotidos (SEC ID n° 4) y de aminoacidos (SEC ID n° 2) de la region Vl de B-Ly1 murino. FIG 3. Union de Rituximab® y de ch-B_Ly1 (A) a CD20 sobre celulas B de linfoma de Raji.
FIG 4. Reduccion marcada de las celulas B por Rituximab® (O) y ch-B_Lyl (A) en sangre completa de tres clases diferentes de genotipo FcYRIIIa-158V/F: (A) sangre completa de un donante F/F, homocigotico para el receptor de menor afinidad, (B) sangre completa de un donante F/V, heterocigotico para el receptor de afinidad, y (C) sangre completa de un donante V/V, homocigotico para el receptor de afinidad mas alta.
FIG 5. Secuencia de nucleotidos (SEC ID n° 11) y de aminoacidos (SEC ID n° 13) de la cadena pesada de un anticuerpo anti-CD20 quimerico.
FIG 6. Secuencia de nucleotidos (SEC ID n° 12) y de aminoacidos (SEC ID n° 14) de la cadena ligera de un anticuerpo anti-CD20 quimerico.
FIG 7. Secuencias de nucleotidos y de aminoacidos de las CDR del anticuerpo B-Ly1 murino. (A) CDR predichas para la region Vh . (B) CDR predichas para la region Vl .
FIG 8. Perfil de MALDI-TOF de un anticuerpo B-Ly1 quimerico glucomanipulado. (A) Tabla que muestra los porcentajes de picos espedficos, (B) espectro de B-Ly1 quimerico glucomanipulado, (C) espectro de B-Ly1 quimerico glucomanipulado tratado con Endo-H.
FIG 9. Union de diferentes anticuerpos anti-CD20 humanizados a celulas B Raji. Las diferencias entre el constructo B-HH2 y los constructos B-HL8 y B-HL11 se localizan en las regiones de marco 1 y 2, siendo las tres CDR identicas. B-HL8 y B-HL1 presentan secuencias FR1 y FR2 que se derivan de la clase VH3 humana, mientras que el marco completo de B-HH2 se deriva de la clase VH1 humana. B-HL11 es un derivado de B-HL8 con la mutacion unica Glu1Gln, siendo Gln el residuo aminoacido en el constructo B-HH2. Lo anterior significa que el intercambio Glu-Gln no altera la afinidad o la intensidad de la union. Las otras diferencias entre B-HH2 y B-HL8 son: 14 residuos de FR, de entre los que uno o mas influira sobre el comportamiento de union a antfgeno de este anticuerpo.
FIG 10. Union del anticuerpo anti-CD20 humanizado BHL4-KV a celulas diana Raji. El constructo B-HL4 se derivada del anticuerpo B-HH2 mediante la sustitucion del FR1 de B-HH2 por el de la secuencia VH1_45 de la lmea germinal humana. Este constructo muestra una capacidad de union a antfgeno muy reducida, a pesar de presentar aminoacidos diferentes unicamente en tres posiciones en FR1. Estos residuos se encuentran situados en las posiciones 2, 14 y 30 segun la numeracion de Kabat. De estos, la posicion 30 aparentemente es la posicion con mas influencia, debido a que es parte de la definicion de Chothia de la CDR1.
FIG 11. Comparacion entre el comportamiento de union de B-HH1, B-HH2 y B-HH3 y el anticuerpo parental B-ly1. Los datos muestran que todos los anticuerpos muestran un valor de EC50 similar, aunque el constructo B-HH1 se une con una intensidad/estequiometna menor que las variantes B-HH2 y B-HH3. B-HH1 puede distinguirse de B-HH2 y de B-HH3 por sus regiones CDR1 y CDR2 parcialmente humanas (definicion de Kabat), asf como el polimorfismo Ala/Thr en la posicion 28 (numeracion de Kabat). Esto indica que la posicion 28, la CDR1 completa y/o la CDR2 completa resultan importantes para la interaccion anticuerpo/antfgeno.
FIG 12. Comparacion entre B-HL1, B-HH1 y el anticuerpo parental de B-ly1. Los datos mostraron la ausencia de cualquier actividad de union en el constructo B-HL1, y aproximadamente la mitad de la intensidad/estequiometna de union de B-HH1 que B-ly1. Tanto B-HL1 como B-HH1 han sido disenados basandose en marcos aceptores derivados de la clase VH-1 humana. Entre otras diferencias, la posicion 71 (numeracion de Kabat) del constructo B-HL1 es una diferencia notable, que indica su importancia putativa para la union de antfgeno.
FIG 13. Analisis fluorocitometrico de la capacidad del anticuerpo anti-CD20 de union a su antfgeno. Los datos mostraron que los constructos B-HL2 y B-HL3 no presentaban actividad de union a CD-20.
FIG 14. Apoptosis de los anticuerpos anti-CD20 en celulas Z-138 MCL.
FIG 15. Apoptosis por anticuerpos anti-CD20. Datos del ensayo: se sembraron 5x105 celulas/pocillo en placas de 24 pocillos (5x105 celulas/ml) en medio de cultivo. Se anadieron a los pocillos 10 mg del anticuerpo respectivo, PBS como control negativo o camptotecina (CPT) 5 mM como control positivo. Las muestras se incubaron durante la noche (16 horas), se tineron con AnnV-FITC y se analizaron mediante FACS. El ensayo se realizo por triplicado. (*): Se ha restado la senal de PBS solo (PBS solo proporciono una senal de 8% y 2%, AnnV+, para las celulas PR-1 y Z-138, respectivamente). Los anticuerpos utilizados fueron: C2B8 (quimerico, no glucomanipulado); BHH2-KV! (Humanizado, no glucomanippulado). Nota: este ensayo no implica la adicion de celulas efectoras adicionales, unicamente dianas mas anticuerpo o controles.
FIG 16. Eliminacion de celulas diana por parte de anticuerpos anti-CD20 con celulas inmunologicas efectoras. Datos del ensayo: Datos del ensayo: marcada reduccion de las celulas B en la incubacion durante la noche de sangre completa normal, y analisis para CD19+/CD3+ mediante FACS. ADCC utilizando PBMC como efectoras, 4 horas de incubacion: proporcion de efectora:diana de 25:1, eliminacion de la diana medida mediante retencion de calcema respecto a la lisis con detergente (100%) y a la lisis sin anticuerpo (0%). Anticuerpos utilizados: C2B8 (quimerico, forma no glucomanipulada), BHH2-KV1-wt (forma humanizada no glucomanipulada de BHH2-KV1), BHH2-KV1-GE (forma humanizada no glucomanipulada de BHH2-KV1).
FIG 17. Perfil de EM-MALDI/TOF de Fc-oligosacaridos liberados con PNGasa F de anticuerpo IgG1 B-ly1 anti-CD20 humano no modificado no glucomanipulado humanizado con BHH2-KV1.
FIG 18. Perfil de EM-MALDI/TOF de Fc-oligosacaridos liberados con PNGasaF de anticuerpo 1gG1 B-ly1 anti-CD20 humano glucomanipulado humanizado con BHH2-KV1g1. La glucomanipulacion se realizo mediante coexpresion en celulas huesped de genes de anticuerpo y del gen codificante de enzima con actividad catalftica de p-1,4-N-acetilglucosaminiltransferasa III (Gnt-III).
FIG 19. Perfil de EM-MALDI/TOF de Fc-oligosacaridos liberados con PNGasaF de anticuerpo IgG1 B-ly1 anti-CD20 humano glucomanipulado humanizado con BHH2-KV1g2. La glucomanipulacion se realizo mediante coexpresion en celulas huesped de genes de anticuerpo y genes codificantes de enzima con actividad catalftica de p-1,4-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnT-III) y codificante de enzima con actividad catalftica de a-manosidasa II del Golgi. FIG 20. Union de anticuerpos no glucomanipulados y glucomanipulados a receptor FcYRIIIa expresado sobre la superficie de celulas CHO-CD16 recombinantes.
FIG 21. Apoptosis de anticuerpos anti-CD20 no manipulados con Fc y manipulados con Fc sobre celulas Z-138 MCL. Datos del ensayo: se sembraron 5x105 celulas/pocillo en placas de 24 pocillos (5x105 celulas/ml) en medio de cultivo. Se anadieron a los pocillos 10 mg del Ab respectivo, PBS para el control negativo. Las muestras se incubaron durante la noche (16 horas), se tineron con AnnV-FITC y se analizaron mediante FACS. El ensayo se realizo por triplicado. Anticuerpos utilizados: C2B8=Rituximab (forma no glucomanipulada quimerica, igual a la forma comercial), BHH2-KV1 (forma no glucomanipulada humanizada, ver la fig. 6 para el perfil de glucosilacion), BHH2-KV1g1 (forma glucomanipulada humanizada, ver la figura 7 para el perfil de glucosilacion), BHH2-KV1g2 (forma glucomanipulada humanizada, ver la fig. 8 para el perfil de glucosilacion) Nota: este ensayo no implica la adicion de celulas efectoras adicionales, unicamente dianas mas anticuerpo o controles. (*): se ha restado la senal de PBS solo.
Descripcion detallada de la invencion
Los terminos se utilizan en la presente memoria tal como se utilizan generalmente en la tecnica, a menos que se definan de otra manera a continuacion.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "anticuerpo" pretende incluir moleculas de anticuerpo completo, incluyendo anticuerpos monoclonales, policlonales y multiespedficos (por ejemplo, biespedficos), asf como fragmentos de anticuerpo que presentan la region Fc y que conservan la especificidad de union, y protemas de fusion que incluyen una region equivalente a la region Fc de una inmunoglobulina y que conservan la especificidad de union. Tambien se encuentran comprendidos los anticuerpos humanizados, primatizados y quimericos.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresion "region Fc" pretende referirse a una region C-terminal de una cadena pesada de IgG. Aunque los ftmites de la region Fc de una cadena pesada de IgG pueden variar ligeramente, la region Fc de cadena pesada de IgG humana habitualmente se define que se extiende desde el residuo aminoacido en la posicion Cys226 hasta el extremo carboxilo-terminal.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "region equivalente a la region Fc de una inmunoglobulina" pretende incluir las variantes alelicas naturales de la region Fc de una inmunoglobulina, asf como las variantes que presentan alteraciones que producen sustituciones, adiciones o deleciones pero que no reducen sustancialmente la capacidad de la inmunoglobulina de mediar en funciones efectoras (tales como la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos). Por ejemplo, pueden delecionarse uno o mas aminoacidos del extremo N-terminal o C-terminal de la region Fc de una inmunoglobulina sin perdida sustancial de funcion biologica. Dichas variantes pueden seleccionarse segun reglas generales conocidas de la tecnica, de manera que presente un efecto mmimo sobre la actividad (Ver, p.ej., Bowie, J. U. et al., Science 247:1306-10 (1990).
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresion "molecula de union a antfgeno" se refiere, en su sentido mas amplio, a una molecula que se une espedficamente a un determinante antigenico. Mas espedficamente, una "molecula de union a antfgeno que se une a CD20" es una molecula que se une espedficamente a una fosfoprotema no glucosilada de superficie celular de 35.000 daltons, denominada tfpicamente antfgeno Bp35 de diferenciacion restringida de los linfocitos B humanos, denominado comunmente CD20. La expresion "se une espedficamente" se refiere a que la union es selectiva para el antfgeno y puede diferenciarse de interacciones no deseadas o no espedficas.
Tal como se utiliza en la presente memoria, los terminos "fusion" y "quimerico", cuando se utilizan en referencia a polipeptidos tales como las MUA, se refieren a polipeptidos que comprenden secuencias de aminoacidos derivadas de dos o mas polipeptidos heterologos, tales como partes de anticuerpos de diferentes especies. Para las MUA quimericas, por ejemplo, los componentes no ligantes de antfgeno pueden derivarse de una amplia diversidad de especies, incluyendo primates, tales como los chimpances y los seres humanos. La region constante de la MUA quimerica mas preferentemente es sustancialmente identica a la region constante de un anticuerpo humano natural; la region variable del anticuerpo quimerico mas preferentemente es sustancialmente identica a la de un anticuerpo anti-CD20 recombinante que presenta la secuencia de aminoacidos de la region variable B-Ly1 murina. Los anticuerpos humanizados resultan ser una forma particularmente preferente de anticuerpo de fusion o quimerico.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresion "polipeptido que presenta actividad de GnTIII" se refiere a polipeptidos que son capaces de catalizar la adicion de un residuo N-acetilglucosamina (GlcNAc) en enlace p-1-4 al manosido p-ligado del nucleo trimanosilo de los oligosacaridos N-ligados. Lo anterior incluye los polipeptidos de fusion que muestran una actividad enzimatica similar, aunque no necesariamente identica, a una actividad de p(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III, tambien conocida como p-1,4-manosilglucoprotema 4-beta-N-acetilgluocsaminiltransferasa (EC 2.4.1.144), segun el comite de nomenclatura de la International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB), segun medicion en un ensayo biologico particular, con o sin dependencia de la dosis. En el caso en exista dependencia de la dosis, no es necesario que sea identica a la de GnTIII, sino sustancialmente similar a la dependencia de dosis para una actividad dada en comparacion con la de GnTIII (es decir, el polipeptido candidato muestra una actividad mayor o no mas de aproximadamente 25 veces menos y, preferentemente, no mas de aproximadamente diez veces menos actividad, y mas preferentemente, no mas de aproximadamente tres veces menos actividad que GnTIII).
Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "variante" (o "analogo") se refiere a un polipeptido que difiere de un polipeptido espedficamente indicado de la invencion por inserciones, deleciones y sustituciones de aminoacidos, creadas utilizando, por ejemplo, tecnicas de ADN recombinante. Entre las variantes de las MUA de la presente invencion se incluyen moleculas ligantes de antfgeno quimericas, primatizadas o humanizadas en las que uno o varios de los residuos aminoacidos se modifican mediante sustitucion, adicion y/o delecion de manera que no afecten sustancialmente a la afinidad de union a antfgeno (por ejemplo, un CD20). Pueden encontrarse una orientacion para determinar que residuos aminoacidos pueden sustituirse, anadirse o delecionarse sin eliminar actividades de interes, comparando la secuencia del polipeptido particular con la de peptidos homologos y minimizando el numero de cambios de la secuencia de aminoacidos realizados en regiones de elevada homologfa (regiones conservadas) o sustituyendo aminoacidos por una secuencia de consenso.
Alternativamente, pueden sintetizarse variantes recombinantes codificantes dichos polipeptidos o polipeptidos similares o seleccionarse utilizando la "redundancia" del codigo genetico. Pueden introducirse diversas sustituciones de codones, tales como cambios silenciosos que producen diversos sitios de restriccion, para optimizar la clonacion en un plasmido o vector vmco o la expresion en un sistema procariotico o eucariotico particular. Las mutaciones en la secuencia polinucleotido pueden reflejarse en el polipeptido o dominios de otros peptidos anadidos al polipeptido para modificar las propiedades de cualquier parte del polipeptido, para modificar caractensticas tales como las afinidades de union de ligando, las afinidades entre cadenas o la tasa de degradacion/renovacion.
Preferentemente, las "sustituciones" de aminoacidos son el resultado de sustituir un aminoacido por otro aminoacido que presenta propiedades estructurales y/o qrnmicas similares, es decir, sustituciones conservadoras de aminoacidos. Pueden realizarse sustituciones "conservadoras" de aminoacidos basandose en la similitud de polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipatica de los residuos implicados. Por ejemplo, entre los aminoacidos no polares (hidrofobicos) se incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano y metionina; entre los aminoacidos neutros polares se incluyen glicina, serina, treonina, cistema, tirosina, asparagina y glutamina; entre los aminoacidos cargados positivamente (basicos) se incluyen arginina, lisina e histidina, y entre los aminoacidos cargados negativamente (acidos) se incluyen el acido aspartico y el acido glutamico. Las "inserciones" o "deleciones" preferentemente son de entre aproximadamente 1 y 20 aminoacidos, preferentemente de entre 1 y 10 aminoacidos. La variacion permitida puede determinarse experimentalmente mediante la realizacion sistematica de inserciones, deleciones o sustituciones de aminoacidos en una molecula de polipeptido utilizando tecnicas de ADN recombinante y sometiendo a ensayo las variantes recombinantes resultantes para la actividad.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "humanizado" se utiliza para referirse a una molecula de union a antfgeno derivada de una molecula de union a antfgeno no humana, por ejemplo, un anticuerpo murino, que conserva o que conserva sustancialmente las propiedades de union a antfgeno de la molecula parental pero que es menos inmunogenica en el ser humano. Esto puede conseguirse mediante diversos metodos, incluyendo: (a) la injertacion de los dominios variables no humanos enteros en regiones constantes humanas para generar anticuerpos quimericos, (b) injertar unicamente las CDR no humanas en las regiones de marco y constantes humanas con o sin conservacion de los residuos de marco cnticos (por ejemplo aquellos que resultan importantes para conservan una buena afinidad de union de antfgeno o funciones de anticuerpo), o (c) trasplantar los dominios variables no humanos enteros aunque "cubriendolos" con una seccion de tipo humano mediante sustitucion de los residuos superficiales. Dichos metodos se dan a conocer en Jones et al., Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci, 81:6851-6855 (1984); Morrison y Oi, Adv.
Immunol., 44:65-92, 1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536, 1988); Padlan, Molec. Immun., 28:489-498, 1991); Padlan, Molec. Immun., 31(3):169-217, 1994).
Existen generalmente 3 regiones determinantes de complementariedad, o CDR (CDR1, CDR2 y CDR3) en cada uno de los dominios variables de cadena pesada y de cadena ligera de un anticuerpo, que se encuentran flanqueados por cuatro subregiones de marco (es decir, FR1, FR2, FR3 y FR4) en cada uno de los dominios variables de cadena pesada y de cadena ligera de un anticuerpo: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Puede encontrarse un comentario de anticuerpos humanizados en, entre otros, la patente US n° 6.632.927 y publicado en la solicitud de patente US n° 2003/0175269.
De manera similar, tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "primatizado" se utiliza para referirse a una molecula de union a antigeno derivada de una molecula de union a antfgeno no de primate, por ejemplo un anticuerpo murino, que conserva o que conserva sustancialmente las propiedades de union a antfgeno de la molecula parental pero que es menos inmunogenica en primates.
En el caso de que existan dos o mas definiciones de una expresion que se utilicen y/o se encuentren aceptadas en la tecnica, la definicion del termino utilizada en la presente memoria pretendera incluir la totalidad de dichos significados, a menos que se indique explfcitamente lo contrario. Un ejemplo espedfico es la utilizacion de la expresion "region determinante de complementariedad" ("CDR") para describir los sitios de union a antfgeno no contiguos presentes dentro de la region variable de los polipeptidos tanto de cadena pesada como de cadena ligera. Dicha region particular ha sido descrita por Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 1983) y por Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987, Sin embargo, la aplicacion de cualquiera de las definiciones para referirse a una CDR de un anticuerpo o variantes de la misma pretende encontrarse comprendida dentro del alcance de la expresion segun se define y se utiliza en la presente memoria. Los residuos aminoacidos apropiados que comprenden las RDC tal como se definen en cada una de las referencias citadas se proporcionan a continuacion, en la Tabla 1, a modo comparativo. Los numeros de residuo exactos comprendidos en una CDR particular variaran dependiendo de la secuencia y del tamano de la CDR. El experto en la materia podra determinar rutinariamente que residuos se encuentran comprendidos en una CDR particular dada la secuencia de aminoacidos de la region variable del anticuerpo.
TABLA 1. Definiciones de CDR1
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Kabat et al. tambien definieron un sistema de numeracion para las secuencias de dominio variable que resulta aplicable a cualquier anticuerpo. El experto ordinario en la materia puede asignar inequvocamente este sistema de "numeracion Kabat" a cualquier secuencia de dominio variable sin basarse en ningun dato experimental mas alla de la secuencia misma. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresion "numeracion de Kabat" se refiere al sistema de numeracion proporcionado en Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1993). A menos que se indique lo contrario, las referencias a la numeracion de posiciones espedficas de residuo aminoacido en una MUA se realizan segun el sistema de numeracion Kabat. Las secuencias del listado de secuencias (es decir, SEC ID n° 1 a SEC ID n° 78) no han sido numeradas segun el sistema de numeracion Kabat.
La mencion de un acido nucleico o polinucleotido que presenta una secuencia de nucleotidos por lo menos, por ejemplo, 95% "identica" a una secuencia de nucleotidos de referencia de la presente exposicion pretende hacer referencia a que la secuencia de nucleotidos del polinucleotido es identica a la secuencia de referencia, excepto en que la secuencia polinucleotida puede incluir hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 nucleotidos de la secuencia de nucleotidos de referencia. En otras palabras, para obtener un polinucleotido que presente una secuencia de nucleotidos por lo menos 95% identica a la secuencia de nucleotidos de referencia, hasta 5% de los nucleotidos en la secuencia de referencia pueden delecionarse o sustituirse por otro nucleotido, o un numero de nucleotidos de hasta 5% del numero total de nucleotidos en la secuencia de referencia puede insertarse en la secuencia de referencia. La secuencia de pregunta puede ser la secuencia entera mostrada en la fig. 24 o en la fig. 25.
En la practica, puede determinarse convencionalmente utilizando programas informaticos conocidos si cualquier molecula de acidos nucleicos o polipeptido particular es identica por lo menos al 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% a una secuencia de nucleotidos o a una secuencia polipeptfdica de la presente exposicion. Un metodo preferente para determinar la mejor correspondencia global entre una secuencia de pregunta (una secuencia de la presente invencion) y una secuencia de la invencion, tambien denominado alineacion global de secuencias, puede determinarse utilizando el programa informatico FASTDB, basado en el algoritmo de Brutlag et al., Comp. App. Biosci. En otro ejemplo, se compara una secuencia de la invencion de 90 residuos con una secuencia pregunta de 100 residuos. En una alineacion de secuencias, las secuencias-pregunta y sujeto son secuencias de ADN. Puede compararse una secuencia de ARN convirtiendo las U en Ts. El resultado de dicha alineacion global de secuencias se proporciona en forma de porcentaje de identidad. Los parametros preferentes utilizados en una alineacion FASTDB de secuencias de ADN para calcular el porcentaje de identidad son: Matriz=Unitaria, k-tuplo=4, Penalizacion por desapareamiento=1, Penalizacion por union=30, Longitud de grupo de aleatorizacion=0, Puntuacion de corte=1, Penalizacion por hueco=5, Penalizacion segun tamano del hueco=0,05, Tamano de ventana=500 o la longitud de la secuencia de nucleotidos sujeto, la que sea mas corta.
En el caso de que la secuencia objeto sea mas corta que la secuencia de pregunta debido a deleciones 5' o 3', no debido a deleciones internas, debe realizarse una correccion manual de los resultados. Esto se debe a que el programa FASTDB no considera los truncados 5' y 3' de la secuencia sujeto al calcular el porcentaje de identidad. Para las secuencias sujeto truncadas en los extremos 5' o 3', respecto a la secuencia pregunta, se corrige el porcentaje de identidad mediante el calculo del numero de bases de la secuencia pregunta que se encuentran situados 5' y 3' respecto de la secuencia sujeto, que no se encuentran apareados/alineados, como porcentaje del numero total de bases de la secuencia pregunta. Si un nucleotido es correspondiente/ha sido alineado se determina a partir de los resultados de la alineacion de secuencias de FASTDB. A continuacion, dicho porcentaje se resta del porcentaje de identidad, calculado por el programa FASTDB anteriormente indicado utilizando los parametros especificados, a fin de llegar a una puntuacion final de porcentaje de identidad. Esta puntuacion corregida es la que se utiliza para los fines de la presente invencion. Solo las bases fuera de las bases 5' y 3' de la secuencia sujeto, tal como es mostrada por la alineacion de FASTDB, que no son correspondientes/no se encuentran alineadas con la secuencia de pregunta, se calculan para los fines de ajuste manual de la puntuacion de porcentaje de identidad.
Por ejemplo, se alinea una secuencia objeto de 90 bases con una secuencia de pregunta de 100 bases para determinar el porcentaje de identidad. Las deleciones ocurren en el extremo 5' de la secuencia sujeto y, por lo tanto, la alineacion de FASTDB no muestra una correspondencia/alineacion de las primeras 10 bases en el extremo 5'. Las 10 bases no apareadas representan el 10% de la secuencia (numero de bases en los extremos 5' y 3' no correspondientes/numero total de bases en la secuencia de pregunta) de manera que se resta 10% de la puntuacion de porcentaje de identidad calculada por el programa FASTDB. En el caso de que las 90 bases fueran perfectamente correspondientes, el porcentaje final de identidad sena de 90%. En otro ejemplo, se compara una secuencia objeto de 90 bases con una secuencia de pregunta de 100 bases. En esta ocasion, las deleciones eran deleciones internas de manera que no hay bases en el lado 5' o 3' de la secuencia sujeto que no son correspondientes/no estan alineadas con la secuencia de pregunta. En este caso el porcentaje de identidad calculado por FASTDB no es corregido manualmente. Nuevamente, solo las bases en el lado 5' y 3' de la secuencia sujeto que no son correspondientes/no se encuentran alineadas con la secuencia de pregunta son corregidas manualmente. No resulta necesario realizar otras correcciones manuales para los fines de la presente exposicion.
Por un polipeptido que presenta una secuencia de aminoacidos por lo menos, por ejemplo, 95% "identicas" a una secuencia de aminoacidos problema descrita en la presente memoria pretende hacerse referencia a que la secuencia de aminoacidos del polipeptido de la invencion es identica a la secuencia de pregunta, excepto en que la secuencia del polipeptido sujeto puede incluir hasta cinco alteraciones de aminoacidos por cada 100 aminoacidos de la secuencia de aminoacidos de pregunta. En otras palabras, con el fin de obtener un polipeptido que presente una secuencia de aminoacidos identica por lo menos al 95% a una secuencia de aminoacidos problema, hasta 5% de los residuos aminoacidos en la secuencia de la invencion pueden insertarse, delecionarse o sustituirse por otro aminoacido. Estas alteraciones de la secuencia de referencia pueden producirse en posiciones amino- o carboxi-terminales de la secuencia de aminoacidos de referencia o en cualquier sitio entre dichas posiciones terminales, dispersas individualmente entre los residuos en la secuencia de referencia o en uno o mas grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.
Como cuestion practica, si cualquier polipeptido particular es por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% identico a un polipeptido de referencia puede determinarse convencionalmente utilizando programas informaticos conocidos. Un metodo preferente para determinar la mejor correspondencia global entre una secuencia de pregunta (una secuencia de la presente invencion) y una secuencia de la invencion, tambien denominado alineacion global de secuencias, puede determinarse utilizando el programa informatico FASTDB, basado en el algoritmo de Brutlag et al., Comp. App. Biosci. En otro ejemplo, se compara una secuencia de la invencion de 90 residuos con una secuencia pregunta de 100 residuos. En una alineacion de secuencias, las secuencias de pregunta y sujeto son ambas secuencias de nucleotidos o son ambas secuencias de aminoacidos. El resultado de dicha alineacion global de secuencias se proporciona en forma de porcentaje de identidad. Los parametros preferentes que se utilizan en una alineacion de aminoacidos de FASTDB son: Matriz=PAM 0, k-tuplo=2, penalizacion de no correspondencia=1, penalizacion de union=20, longitud del grupo de aleatorizacion=0, puntuacion de corte=1, tamano de ventana=longitud de secuencia, penalizacion de hueco=5, penalizacion de tamano de hueco=0,05, tamano de ventana=500 o la longitud de la secuencia de aminoacidos sujeto, la mas corta de entre los dos valores
En el caso de que la secuencia de la invencion sea mas corta que la secuencia de pregunta debido a deleciones N- o C-terminales, no debido a deleciones internas, debe realizarse una correccion manual de los resultados. Lo anterior se debe a que el programa FASTDB no incluye truncados N- y C-terminales de la secuencia de la invencion al calcular el porcentaje de identidad global. Para las secuencias sujeto truncadas en los extremos N- y C-terminal, respecto a la secuencia de pregunta, el porcentaje de identidad se corrige mediante el calculo del numero de residuos de la secuencia de pregunta que se encuentran en posicion N- y C-terminal respecto a la secuencia objeto, que no son correspondientes/desalineadas con un residuo objeto correspondiente, como porcentaje del numero total de bases de la secuencia de pregunta. Se determina si un nucleotido es correspondiente/alineado a partir de los resultados de la alineacion de secuencias de FASTDB. A continuacion, dicho porcentaje se resta del porcentaje de identidad, calculado por el programa FASTDB anteriormente indicado utilizando los parametros especificados, a fin de llegar a una puntuacion final de porcentaje de identidad. Esta puntuacion corregida es la utilizada para los fines de la presente invencion. Unicamente las bases mas alla de los extremos N-terminal y C-terminal de la secuencia sujeto, que son no correspondientes/desalineadas respecto a la secuencia de pregunta, se consideran para los fines de ajustar manualmente la puntuacion de porcentaje de identidad. Es decir, solo las posiciones de residuo de pregunta mas alla de los residuos N-terminales y C-terminales mas alejados de la secuencia sujeto.
Por ejemplo, se alinea una secuencia de la invencion de 90 aminoacidos con una secuencia de pregunta de 100 residuos para determinar el porcentaje de identidad. La delecion se produce en el extremo N-terminal de la secuencia de la invencion y, por lo tanto, la alineacion de FASTD no muestra una correspondencia/alineacion de los primeros 10 residuos en el extremo N-terminal. Las 10 bases no apareadas representan 10% de la secuencia (numero de bases en los extremos N-terminal y C-terminal no correspondientes/numero total de bases de la secuencia de pregunta), de manera que se resta 10% de la puntuacion de porcentaje de identidad calculada por el programa FASTDB. En el caso de que los 90 residuos fueran perfectamente correspondientes, el porcentaje final de identidad sena de 90%. En otro ejemplo, se compara una secuencia objeto de 90 residuos con una secuencia de pregunta de 100 residuos. En este caso las deleciones son deleciones internas, de manera que no hay residuos en los extremos N-terminal o C-terminal de la secuencia sujeto que no sean correspondientes/alineadas con la secuencia de pregunta. En este caso el porcentaje de identidad calculado por FASTDB no es corregido manualmente. Nuevamente, unicamente las posiciones de residuos en los extremos N-terminal y C-terminal de la secuencia sujeto, tal como se muestran en la alineacion de FASTDB, que no son correspondientes/alineadas con la secuencia de pregunta se corrigen manualmente. No debe realizarse ninguna otra correccion manual para los fines de la presente invencion.
Tal como se utiliza en la presente memoria, un acido nucleico que "se hibrida bajo condiciones restrictivas" a una secuencia de acidos nucleicos de la invencion se refiere a un polinucleotido que se hibrida en una incubacion durante la noche a 42°C en una solucion que comprende formamida al 50%, 5x SSC (NaCl 750 mM, citrato sodico 75 mM), fosfato sodico 50 mM (pH 7,6), 5x solucion de Denhardt, dextran sulfato al 10% y 20 pg/ml de ADN de esperma de salmon sonicado desnaturalizado, seguido del lavado de los filtros en 0,1x SSC a aproximadamente 65°C.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresion "dominio de localizacion en el Golgi" se refiere a la secuencia de aminoacidos de un polipeptido residente en el Golgi que es responsable del anclaje del polipeptido en una localizacion dentro del complejo de Golgi. Generalmente, los dominios de localizacion comprenden "colas" aminoterminales de un enzima.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresion "funcion efectora" se refiere a aquellas actividades biologicas atribuibles a la region Fc (una region Fc de secuencia nativa o una region Fc de secuencia de aminoacidos variante) de un anticuerpo. Entre los ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo se incluyen, aunque sin limitacion, afinidad de union a receptores Fc, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP), secrecion de citoquinas, incorporacion de antfgenos mediada por complejo inmunologico por celulas presentadoras de antfgeno, regulacion negativa de receptores de superficie celular, etc.
Tal como se utiliza en la presente memoria, las expresiones "manipular", "manipulado", "manipulacion" y "manipulacion mediante glucosilacion" se considera que incluyen cualquier manipulacion del patron de glucosilacion de un polipeptido o fragmento de polipeptido natural o recombinante. La manipulacion mediante glucosilacion incluye la manipulacion metabolica de la maquinaria de glucosilacion de una celula, incluyendo manipulaciones geneticas de las rutas de smtesis de oligosacaridos para conseguir la glucosilacion alterada de glucoprotemas expresadas en las celulas. Ademas, la manipulacion mediante glucosilacion incluye los efectos de mutaciones y del medio celular sobre la glucosilacion.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresion "celula huesped" comprende cualquier tipo de sistema celular que pueda manipularse para generar los polipeptidos y moleculas de union a antfgeno de la presente invencion. En una realizacion, la celula huesped se manipula para producir la produccion de una molecula de union a antfgeno con glucoformas modificadas. En una realizacion preferente, la molecula de union a antfgeno es un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o protema de fusion. En determinadas realizaciones, las celulas huesped han sido manipuladas adicionalmente para expresar niveles incrementadas de uno o mas polipeptidos que presentan actividad GnTIII. Entre las celulas huesped se incluyen celulas en cultivo, por ejemplo, celulas de mairnfero en cultivo, tales como celulas CHO, celulas BHK, celulas NS0, celulas SP2/0, celulas de mieloma YO, celulas de mieloma de raton P3X63, celulas PER, celulas PER.C6 o celulas de hibridoma, celulas de levadura, celulas de insecto y celulas vegetales, entre otros, aunque tambien celulas comprendidas dentro de un animal transgenico, planta transgenica o tejido vegetal o animal en cultivo.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresion "citotoxicidad celular mediada por Fc" incluye la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos y la citotoxicidad celular mediada por una protema de fusion a Fc soluble que contiene una region Fc humana. Es un mecanismo inmunologico que conduce a la lisis de "celulas diana de anticuerpo" por "celulas efectoras inmunologicas humanas", en el que:
Las "celulas efectoras inmunologicas humanas" se refiere a una poblacion de leucocitos que expresan receptores de Fc sobre la superficie, mediante la que se unen a la region Fc de los anticuerpos o de las protemas de fusion de Fc y llevan a cabo funciones efectoras. Dicha poblacion puede incluir, aunque sin limitacion, celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC, por sus siglas en ingles) y/o celulas asesinas naturales (NK).
Las "celulas reconocidas por anticuerpos" son celulas a las que se unen anticuerpos o protemas de fusion con Fc. Los anticuerpos o protemas de fusion con Fc se unen a las celulas diana mediante la parte de la protema N-terminal respecto a la region Fc.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresion "citotoxicidad celular mediada por Fc incrementada" se define como un incremento del numero de "celulas reconocidas por anticuerpos" que resultan lisadas en un tiempo dado, a una concentracion dada de anticuerpo, o de protemas de fusion con Fc, en el medio circundante a las celulas diana, mediante el mecanismo de citotoxicidad celular mediada por Fc definido anteriormente, y/o una reduccion de la concentracion de anticuerpo o de protema de fusion con Fc, en el medio circundante a las celulas diana, necesario para conseguir la lisis de un numero dado de "celulas reconocidas por anticuerpos", en un tiempo dado, mediante el mecanismo de citotoxicidad celular mediada por Fc. El incremento de la citotoxicidad celular mediada por Fc es respecto a la citotoxicidad celular mediada por el mismo anticuerpo, o protema de fusion con Fc, producido por el mismo tipo de celulas huesped, utilizando los mismos metodos estandares de produccion, purificacion, formulacion y almacenamiento, que son conocidos por el experto en la materia, pero que no ha sido producido por celulas huesped manipuladas para expresar la glucosiltransferasa GnTIII mediante los metodos descritos en la presente memoria.
La expresion "anticuerpo que presenta citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC)" se refiere a un anticuerpo, tal como se define dicha expresion en la presente memoria, que presenta una ADCC incrementada segun se determina mediante cualquier metodo adecuado conocido por el experto ordinario en la materia. Un ensayo ADCC in vitro aceptado es el siguiente:
1) el ensayo utiliza celulas diana que es conocido que expresan el antfgeno diana reconocido por la region ligante de antfgeno del anticuerpo,
2) el ensayo utiliza celulas mononucleares de sangre periferica humana (CMSP) aisladas a partir de sangre de un donante sano seleccionado aleatoriamente, como celulas efectoras,
3) el ensayo se lleva a cabo siguiendo el protocolo siguiente:
i) se afslan las CMSP utilizando procedimientos estandares de centrifugacion en gradiente de densidad y se suspenden a una densidad de 5x106 celulas/ml en medio de cultivo celular RPMI,
ii) se cultivan las celulas diana mediante metodos de cultivo de tejido estandares, se recolectan de la fase de crecimiento exponencial con una viabilidad superior al 90%, se lavan en medio de cultivo celular RPMI, se marcan con 100 pCuries de 51Cr, se lavan dos veces con medio de cultivo celular, y se resuspenden en medio de cultivo celular a una densidad de 10i) *5 celulas/ml,
iii) se transfieren 100 microlitros de la suspension final de celulas diana anteriormente indicada a cada pocillo de una placa de microtitulacion de 96 pocillos,
iv) el anticuerpo se diluye en serie de 4.000 ng/ml a 0,04 ng/ml en medio de cultivo celular y se anaden 50 microlitros de las soluciones de anticuerpo resultantes a las celulas diana en la placa de microtitulacion de 96 pocillos, llevando a cabo ensayos por triplicado de concentraciones del anticuerpo que cubren el intervalo completo de concentraciones anteriormente indicado,
v) para los controles de liberacion maxima (MR), 3 pocillos adicionales en la placa que contiene las celulas diana marcadas reciben 50 microlitros de una solucion acuosa al 2% (v/v) de detergente no ionico (Nonidet, Sigma, St. Louis) en lugar de la solucion de anticuerpo (punto iv, anteriormente), vi) para los controles de liberacion espontanea (SR), 3 pocillos adicionales en la placa que contiene las celulas diana marcadas reciben 50 microlitros de medio de cultivo celular RPMI en lugar de la solucion de anticuerpos (punto iv, anteriormente),
vii) la placa de microtitulacion de 96 pocillos seguidamente se centrifuga a 50xg durante 1 minuto y se incuba durante 1 hora a 4°C,
viii) se anaden 50 microlitros de la suspension de CMSP (punto i), anteriormente) a cada pocillo, dando lugar a una proporcion de efector:celula diana de 25:1 y las placas se introducen en un incubador bajo una atmosfera con 5% de CO2 a 37°C durante 4 horas,
ix) el sobrenadante libre de celulas de cada pocillo se recolecta y la radioactividad liberada experimentalmente (ER) se cuantifica utilizando un contador gamma,
x) se calcula el porcentaje de lisis espedfica para cada concentracion de anticuerpo segun la formula (ER-MR)/(MR-SR) x 100, en la que ER es la radioactividad media cuantificada (ver el punto ix), anteriormente) para dicha concentracion de anticuerpo, MR es la radioactividad media cuantificada (ver el punto ix), anteriormente) para los controles MR (ver el punto v), anteriormente), y SR es la radioactividad media cuantificada (ver el punto ix), anteriormente) para los controles SR (ver el punto vi), anteriormente).
4) la expresion "ADCC incrementada" se define como un incremento del porcentaje maximo de lisis espedfica observada dentro del intervalo de concentraciones de anticuerpo sometido a ensayo anteriormente, y/o una reduccion de la concentracion de anticuerpo necesaria para alcanzar la mitad del porcentaje maximo de lisis espedfica observado dentro del intervalo de concentraciones de anticuerpo sometidas a ensayo anteriormente. El incremento de la ADCC es relativo a la ADCC, que se ha medido utilizando el ensayo anteriormente indicado, mediada por el mismo anticuerpo, producido por el mismo tipo de celulas huesped, utilizando los mismos metodos estandares de produccion, purificacion, formulacion y almacenamiento conocidos por el experto en la materia, pero que no ha sido producido por las celulas huesped manipuladas para sobreexpresar GnTIII.
En un aspecto, la presente exposicion se refiere a moleculas de union a antigeno que presentan la especificidad de union del anticuerpo B-Lyl murino y al descubrimiento de que sus funciones efectoras pueden potenciarse mediante la alteracion de la glucosilacion. En una realizacion, la molecula de union a antigeno es un anticuerpo quimerico. En una realizacion preferente, la exposicion se refiere a un anticuerpo quimerico o un fragmento del mismo, que comprende los CDR mostrados en la figura 7. Espedficamente, en una realizacion preferente, la exposicion se refiere a un polinucleotido aislado que comprende (a) una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste en: SEC ID n° 5, SEC ID n° 6 y SEC ID n° 7. (CDR Vh-i ); (b) una secuencia seleccionada de entre el grupo que consiste en: SEC ID n° 21, SEC ID n° 22 y SEC ID n° 23. (Cd R Vh- 2 ) y SEC ID n° 24. En otra realizacion preferente, la exposicion se refiere a un polinucleotido aislado que comprende SEC ID n° 8, SEC ID 9 y SEC ID n° 10. (CDR Vl). En una realizacion, cualquiera de dichos polinucleotidos codifica un polipeptido de fusion.
En otra realizacion, la molecula de union a antigeno comprende el dominio Vh del anticuerpo B-Ly1 murino mostrado en la figura 1, o una variante del mismo, y un polipeptido no murino. En otra realizacion preferente, la invencion se refiere a una molecula de union a antigeno que comprende el dominio Vl del anticuerpo B-Ly1 murino mostrado en la figura 2, o una variante del mismo, y un polipeptido no murino.
En otro aspecto, la exposicion se refiere a moleculas de union a antfgeno que comprenden una o mas CDR truncadas de Bly-1. Dichas CDR truncadas contienen, como irnnimo, los residuos aminoacidos determinantes de especificidad para la CDR dada. La expresion "residuo determinante de especificidad" se refiere a aquellos residuos que se encuentran directamente implicados en la interaccion con el antfgeno. En general, solo aproximadamente un quinto a un tercio de los residuos en una CDR dada participa en la union a un antfgeno. Los residuos determinantes de especificidad en una CDR particular pueden identificarse, por ejemplo, mediante computacion de contactos interatomicos obtenidos del modelado tridimensional y la determinacion de la variabilidad de secuencia en una posicion de residuo dada de acuerdo con los metodos descritos en Padlan et al., FASEB J. 9(1):133-139, 1995.
De acuerdo con lo anteriormente expuesto, la exposicion se refiere ademas a un polinucleotido aislado que comprende por lo menos una region determinante de complementariedad del anticuerpo B-Ly1 murino, o una variante o forma truncada del mismo que contiene por lo menos los residuos determinantes de especificidad de dicha region determinante de complementariedad, en el que dicho polinucleotido aislado codifica un polipeptido de fusion. Preferentemente, dichos polinucleotidos aislados codifican un polipeptido de fusion que es una molecula de union a antfgeno. En una realizacion, el polinucleotido comprende tres regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo B-Ly1 murino, o variantes o formas truncadas del mismo que contienen por lo menos residuos determinantes de especificidad de cada una de dichas tres regiones determinantes de complementariedad. En otra realizacion, el polinucleotido codifica la region variable entera de la cadena ligera o pesada de un anticuerpo quimerico (por ejemplo, humanizado). La exposicion se refiere ademas a los polipeptidos codificados por dichos polinucleotidos.
En otra realizacion, la exposicion se refiere a una molecula de union a antfgeno que comprende por lo menos una region determinante de complementariedad del anticuerpo B-Ly1 murino, o una variante o forma truncada del mismo que contiene por lo menos los residuos determinantes de especificidad de dicha region determinante de complementariedad, y que comprende una secuencia derivada de un polipeptido heterologo. En una realizacion, la molecula de union a antfgeno comprende tres regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo B-Ly1 murino, o variantes o formas truncadas del mismo que contienen por lo menos los residuos determinantes de especificidad para cada una de dichas tres regiones determinantes de complementariedad. En otro aspecto, la molecula de union a antfgeno comprende la region variable de una cadena ligera o pesada de anticuerpo. En una realizacion particularmente util, la molecula de union a antfgeno es un anticuerpo quimerico, por ejemplo humanizado. La exposicion se refiere ademas a metodos de preparacion de dichas moleculas de union a antfgeno y la utilizacion de las mismas en el tratamiento de enfermedades, incluyendo los linfomas de celulas B.
Es conocido que operan varios mecanismos en la eficacia terapeutica de los anticuerpos anti-CD20, entre ellos la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y la induccion de la parada del crecimiento o apoptosis. Por ejemplo, la mayor parte de la evidencia experimental indica que el Rituximab funciona mediante mecanismos efectores convencionales medidos mediante ensayos de CDC y ADCC. De manera similar, se ha demostrado que la resistencia de las diferentes celulas de linfoma frente al Rituximab in vivo es una funcion de su sensibilidad a la CDC in vitro. En contraste, el modo de accion in vivo de otro anticuerpo que ha sido autorizado para el uso terapeutico, B1, no requiere ni complemento ni actividad de celulas asesinas naturales (NK). Por el contrario, la eficacia de B1 in vivo se debe a su capacidad de inducir una potente apoptosis.
En general, los anticuerpos monoclonales anti-CD20 se clasifican en dos categonas diferentes basandose en su mecanismo de accion en la erradicacion de las celulas de linfoma. Los anticuerpos anti-CD20 de tipo I utilizan principalmente el complemento para eliminar las celulas diana, mientras que los anticuerpos de tipo II funcionan mediante diferentes mecanismos, principalmente la apoptosis. El Rituximab y 1F5 son ejemplos de anticuerpos anti-CD20 de tipo I, mientras que B1 es un ejemplo de un anticuerpo de tipo II. Ver, p.ej., Cragg, M.S. y Glennie, M.J., Blood 103(7):2738-2743 (abril de 2004); Teeling, J.L. et al., Blood 104(6):1793. 1800 (septiembre de 2004).
La presente exposicion es el primer caso conocido de manipulacion de un anticuerpo anti-CD20 de tipo II para que presente funciones efectoras incrementadas, tales como la ADCC, conservando simultaneamente una potente capacidad de apoptosis. Por consiguiente, la presente exposicion se refiere a un anticuerpo anti-CD20 de tipo II manipulado que presenta una ADCC incrementada como resultado de dicha manipulacion y sin perdida de capacidad sustancial de inducir apoptosis. En una realizacion, los anticuerpos anti-CD20 de tipo II han sido manipulados para presentar un patron alterado de glucosilacion en la region Fc. En una realizacion particular, la glucosilacion alterada comprende un nivel incrementado de residuos complejos bisectados en la region Fc. En otra realizacion particular, la glucosilacion alterada comprende un numero reducido de residuos fucosa en la region Fc. Ver la patente US Appl. Pub. n° 20040093621, de Shitara et al. En otra realizacion, los anticuerpos anti-CD20 de tipo II han sido sometidos a la manipulacion polipeptfdica, tal como se ensena en la patente US n° 6.737.056 de Presta o la solicitud de patente US n° de pub. 20040185045 (Macrogenics) o en la solicitud de patente US n° de pub. 20040132101 (Xencor).
La exposicion se refiere ademas a metodos para generar dichos anticuerpos de tipo II manipulados y a metodos de utilizacion de dichos anticuerpos en el tratamiento de diversos trastornos de las celulas B, incluyendo los linfomas de celulas B.
Se han descrito anticuerpos quimericos de raton/humanos. Ver, por ejemplo, Morrison S. L. et al., PNAS I1:6851-6854 (noviembre de 1984); publicacion de patente europea n° 173494; Boulianna G. L et al., Nature 312:642 (diciembre de 1984); Neubeiger M. S. et al., Nature 314:268 (marzo de 1985); publicacion de patente europea n° 125023; Tan et al., J. Immunol. 135:8564 (noviembre de 1985); Sun L. K et al., Hybridoma 5(1):517, 1986); Sahagan et al., J. Immunol.
137:1066-1074 (1986). Ver, de manera general, Muron, Nature 312:597 (diciembre de 1984); Dickson, Genetic Engineering News 5(3) (marzo de 1985); Marx, Science 229:455 (agosto de 1985); and Morrison, Science 229:1202­ 1207 (septiembre de 1985). Robinson et al., en la publicacion de patente PCT n° WO/88104936 describe un anticuerpo quimerico con region constante humana y region variable murina, que presenta especificidad para un epftopo de CD20; la parte murina del anticuerpo quimerico de las referencias de Robinson se derivan del anticuerpo monoclonal de raton 2H7 (gamma 2b, kappa). Aunque la referencia indica que el anticuerpo quimerico descrito es un "candidato prioritario" para el tratamiento de los trastornos de las celulas B, esta afirmacion puede considerarse no mas que una sugerencia para el experto para que determine si la sugerencia es exacta o no para dicho anticuerpo particular, en particular debido a que la referencia no dispone de ningun datos para apoyar su afirmacion de eficacia terapeutica, y especialmente, de datos en los que se utilicen mairnferos superiores, tales como primates o seres humanos.
Se encuentran disponibles en la tecnica metodologfas para generar anticuerpos quimericos. Por ejemplo, las cadenas ligera y pesada pueden expresarse separadamente utilizando, por ejemplo, cadenas ligeras de inmunoglobulina y cadenas pesadas de inmunoglobulina en plasmidos separados, o en un unico vector (por ejemplo, policistronico). A continuacion, pueden purificarse y ensamblarse in vitro para formar anticuerpos completos; se han descrito metodologfas para llevar a cabo dicho ensamblaje. Ver, por ejemplo, Scharff M., Harvey Lectures 69:125, 1974. Tambien se han descrito parametros de reaccion in vitro para la formacion de anticuerpos IgG a partir de cadenas ligeras y pesadas aisladas reducidas. Ver, por ejemplo, Sears et al., Biochem. 16(9):2016-25, 1977.
En una realizacion particularmente preferente, la MUA quimerica descrita en la presente memoria es un anticuerpo humanizado. Los metodos para humanizar anticuerpos no humanos son conocidos de la tecnica. Por ejemplo, pueden prepararse MUA humanizadas descritas en la presente memoria, segun los metodos de la patente US n° 5.225.539, de Winter; la patente US n° 6.180.370, de Queen et al., o la patente US n° 6.632.927, de Adair et al.
Preferentemente, en un anticuerpo humanizado se ha introducido uno o mas residuos aminoacidos procedentes de una fuente que es no humana. Estos residuos aminoacidos no humanos con frecuencia se denominan residuos "importados", que tfpicamente se obtienen de un dominio variable "importado". La humanizacion esencialmente puede llevarse a cabo siguiendo el metodo de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature 321:522-525, 1986; Riechmann et al., Nature 332:323-327, 1988; Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536, 1988) mediante la sustitucion de secuencias de la region hipervariable por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. De acuerdo con lo anterior, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quimericos (patente US n° 4.816.567), en los que se ha sustituido una parte sustancialmente inferior a un dominio variable humano intacto por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la practica, los anticuerpos humanizados tipicamente son anticuerpos humanos en los que algunos residuos de la region hipervariable y posiblemente algunos residuos de FR son sustituidos por residuos procedentes de sitios analogos en anticuerpos de roedor. Los anticuerpos anti-CD20 humanizados de la invencion comprenden regiones constantes de una inmunoglobulina humana.
La eleccion de los dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, que deben utilizarse en la preparacion de anticuerpos humanizados resulta muy importante para reducir la antigenicidad. Segun el metodo denominado "de ajuste optimo", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se criba frente a la biblioteca completa de secuencias de dominio variable humanas conocidas. La secuencia humana que es mas similar a la del roedor seguidamente se acepta como la region marco (FR) humana para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901, 1987). Otro metodo para seleccionar la secuencia marco humana es comparar la secuencia de cada subregion individual del marco de roedor completo (es decir, FR1, FR2, FR3 y FR4) o alguna combinacion de las subregiones individuales (por ejemplo FR1 y FR2) con una biblioteca de secuencias de una region variable humana conocida que corresponden a dicha subregion de marco (por ejemplo segun se determina a partir de la numeracion Kabat) y elegir la secuencia humana para cada subregion o combinacion que sea mas similar a la de roedor (Leung, solicitud publicada de patente US n° 2003/0040606A1, publicada el 27 de febrero de 2003). Otro metodo utiliza una region marco particular derivada de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. Puede utilizarse el mismo marco para varios anticuerpos humanizados diferentes (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285, 1992; Presta et al., J. Immunol.
151:2623, 1993).
Tambien es importante que los anticuerpos se humanicen conservando la elevada afinidad para el antfgeno y otras propiedades biologicas favorables. Para alcanzar este objetivo, segun un metodo preferente, se preparan anticuerpos humanizados mediante un procedimiento de analisis de las secuencias parentales y diversos productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Los modelos tridimensionales de inmunoglobulinas se encuentran disponibles comunmente y resultaran familiares para el experto en la materia. Se encuentran disponibles programas informaticos que ilustran y muestran estructuras conformacionales tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulinas candidatas seleccionadas. La inspeccion de estos resultados permite el analisis del papel probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el analisis de residuos que influyen sobre la capacidad de la inmunoglobulina candidata de unirse a su antfgeno. De esta manera, los residuos de Fr pueden seleccionarse y combinarse con el receptor e importar secuencias de manera que se consiga la caractenstica de anticuerpo deseada, tal como una afinidad incrementada para el antfgeno o antfgenos diana. En general, los residuos de la region hipervariable se encuentran directa y mas sustancialmente implicados en la influencia sobre la union de los antfgenos.
En otra realizacion, las moleculas de union a antfgeno descritas en la presente memoria se manipulan para que presenten una afinidad de union incrementada segun, por ejemplo, los metodos dados a conocer en la patente US n° de pub. n° 20040132066, de Balint et al.
En una realizacion, la molecula de union a antfgeno descrita en la presente memoria se conjuga con una fraccion adicional, tal como un marcaje radioactivo o una toxina. Dichas MUA conjugadas pueden producirse mediante numerosos metodos que son bien conocidos de la tecnica.
Una diversidad de radionucleidos es aplicable a la presente exposicion y al experto en la materia se le atribuye la capacidad de determinar facilmente que radionucleido resulta mas apropiado bajo una diversidad de circunstancias. Por ejemplo, el 131yodo es un radionucleido bien conocido que se utiliza para la inmunoterapia dirigida. Sin embargo, la utilidad clmica del 131yodo puede encontrarse limitada por varios factores, entre ellos: una vida media ffsica de ocho dfas, el deshalogenado del anticuerpo yodado tanto en la sangre como en los sitios tumorales, y las caractensticas de emision (por ejemplo, un componente gamma elevado) que pueden resultar suboptimas para una deposicion localizada de la dosis en el tumor. Con la llegada de agentes quelantes superiores, la oportunidad de unir grupos quelantes metalicos a protemas ha incrementado las oportunidades de utilizar otros radionucleidos, tales como 111indio e 90itrio. El 90itrio proporciona varios beneficios para la utilizacion en aplicaciones radioinmunoterapeuticas: la vida media de 64 horas del 90itrio es suficientemente larga para permitir la acumulacion del anticuerpo en el tumor y, al contrario que, por ejemplo, el 131yodo, el 90itrio es un emisor beta puro de alta energfa sin irradiacion gamma acompanante durante su descomposicion, con un alcance en el tejido de entre 100 y 1.000 diametros celulares. Ademas, la cantidad minima de radiacion penetrante permite la administracion ambulatoria de anticuerpos marcados con 90itrio. Ademas, la internalizacion del anticuerpo marcado no resulta necesaria para la eliminacion celular, y la emision local de radiacion ionizante debena resultar letal para las celulas tumorales contiguas que no presentan el antfgeno diana.
Las dosis eficaces de tratamiento unico (es decir, las cantidades terapeuticamente eficaces) de anticuerpos anti-CD20 marcados con 90itrio se encuentran comprendidas entre aproximadamente 5 y aproximadamente 75 mCi, mas preferentemente entre aproximadamente 10 y aproximadamente 40 mCi. Las dosis eficaces no ablativas de medula en un tratamiento unico de anticuerpos anti-CD20 marcados con131yodo se encuentran comprendidas entre aproximadamente 5 y aproximadamente 70 mCi, mas preferentemente entre aproximadamente 5 y aproximadamente 40 mCi. Las dosis eficaces ablativas en un tratamiento unico (es decir, que pueden requerir el trasplante de medula osea autologa) de anticuerpos anti-CD20 marcados con 131yodo se encuentran comprendidas entre aproximadamente 30 y aproximadamente 600 mCi, mas preferentemente entre aproximadamente 50 y menos de aproximadamente 500 mCi. Junto con un anticuerpo anti-CD20 quimerico, debido a la semivida en circulacion mas prolongada en comparacion con los anticuerpos murinos, las dosis eficaces no ablativas de medula en un unico tratamiento eficaz de anticuerpos anti-CD20 quimericos marcados con 131yodo se encuentran comprendidas entre aproximadamente 5 y aproximadamente 400 mCi, mas preferentemente son inferiores a aproximadamente 30 mCi. El criterio para la obtencion de imagenes para, por ejemplo, el marcaje de 111indio, es tipicamente de menos de aproximadamente 5 mCi.
Con respecto a los anticuerpos anti-CD20 marcados radioactivamente, la terapia con los mismos tambien puede realizarse en un tratamiento terapeutico unico o en tratamientos multiples. Debido al componente radionucleido, resulta preferente que, antes del tratamiento, se "recolecten" celulas madre perifericas ("CMP") o de medula osea ("MO") para los pacientes que experimenten toxicidad potencialmente letal de la medula osea debida a la radiacion. La MO y/o las CMP se recolectan utilizando tecnicas estandares, y despues se purgan y se congelan para la posible reinfusion. Ademas, resulta mas preferente que antes del tratamiento se realice un estudio de dosimetria diagnostica utilizando un anticuerpo marcado diagnostico (por ejemplo, utilizando indio-111), un proposito del cual es garantizar que el anticuerpo terapeuticamente marcado (por ejemplo utilizando itrio-90) no resulte innecesariamente "concentrado" en cualquier organo o tejido normal.
En una realization preferente, la presente exposition se refiere a un polinucleotido aislado que comprende una secuencia que codifica un polipeptido que presenta una secuencia de aminoacidos mostrada en la Tabla 3, posteriormente. La exposicion se refiere ademas a un acido nucleico aislado que comprende una secuencia que es por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% identica a una secuencia de nucleotidos mostrada en la Tabla 2, posteriormente. En otra realizacion, la exposicion se refiere a un acido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica un polipeptido que presenta una secuencia de aminoacidos que es por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% identica a la secuencia de aminoacidos en la Tabla 3. La exposicion comprende ademas un acido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica un polipeptido que presenta la secuencia de aminoacidos de cualquiera de los constructos en la Tabla 3 con sustituciones de aminoacidos conservadoras.
TABLA 2
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TABLA 3
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En otra realizacion preferente, la presente exposicion se refiere a un polinucleotido aislado que comprende una secuencia que codifica un polipeptido que presenta la secuencia de aminoacidos mostrada en la fig. 1 o en la fig. 2. La exposicion se refiere ademas a un acido nucleico aislado que comprende una secuencia que es por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% identica a la secuencia de nucleotidos mostrada en la fig. 5 o en la fig. 6. En otra realizacion, la exposicion se refiere a un acido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica un polipeptido que presenta una secuencia de aminoacidos que es por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% identica a la secuencia de aminoacidos de la fig. 5 o en la fig. 6. La exposicion comprende ademas un acido nucleico que comprende una secuencia que codifica un polipeptido que presenta cualquiera de las secuencias de aminoacidos fig. 1, fig. 2, fig. 5 o en la fig. 6 con sustituciones de aminoacidos conservadoras.
En otra realizacion, la presente exposicion se refiere a un vector de expresion y/o a una celula huesped, que comprende uno o mas polinucleotidos aislados indicados en la presente memoria.
Generalmente, puede utilizarse cualquier tipo de lmea celular en cultivo para expresar la MUA de la presente invencion. En una realizacion preferente, se utilizan celulas CHO, celulas BHK, celulas NS0, celulas SP2/0, celulas de mieloma YO, celulas de mieloma de raton P3X63, celulas PER, celulas PER.C6 o celulas de hibridoma, otras celulas de mamifero, celulas de levadura, celulas de insecto o celulas vegetales como la lmea celular de fondo para generar las celulas huesped manipuladas indicadas en la presente memoria.
La eficacia terapeutica de las MUA indicadas en la presente memoria puede potenciarse mediante la produccion de las mismas en una celula huesped que expresa ademas un polinucleotido codificante de un polipeptido que presenta actividad de GnTIII. En una realizacion preferente, el polipeptido que presenta actividad de GnTIII es un polipeptido de fusion que comprende el dominio de localizacion en Golgi de un polipeptido residente en el Golgi. En otra realizacion preferente, la expresion de las MUA de la presente invencion en una celula huesped que expresa un polinucleotido codificante de un polipeptido que presenta actividad de GnTIII resulta en MUA con afinidad de union a receptores Fc incrementada y una funcion efectora incrementada. De acuerdo con lo anterior, en una realizacion, la presente exposicion se refiere a una celula huesped que comprende: (a) un acido nucleico aislado que comprende una secuencia codificante de un polipeptido que presenta actividad de GnTIII, y (b) un polinucleotido aislado codificante de una MUA indicada en la presente memoria, tal como un anticuerpo quimerico o humanizado que se une a CD20 humano. En una realizacion preferente, el polipeptido que presenta actividad de GnTIII es un polipeptido de fusion que comprende el dominio catalrtico de GnTIII y el dominio de localizacion en Golgi es el dominio de localizacion de la manosidasa II. Los metodos para generar dichos polipeptidos de fusion y la utilizacion de los mismos para producir anticuerpos con funciones efectoras incrementadas se dan a conocer en la solicitud provisional de patente n° de n° 60/495.412.
En otra realizacion preferente, la MUA quimerica es un anticuerpo quimerico o un fragmento del mismo, que presenta la especificidad de union del anticuerpo B-LY1 murino. En una realizacion particularmente preferente, el anticuerpo quimerico comprende un Fc humano. En otra realizacion preferente, el anticuerpo ha sido primatizado o humanizado.
En una realizacion, puede expresarse uno o varios polinucleotidos codificantes de una MUA de la presente exposicion, bajo el control de un promotor constitutivo o, alternativamente, un sistema de expresion regulada. Entre los sistemas de expresion regulada adecuados se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, un sistema de expresion regulado por tetraciclina, un sistema de expresion inducible por ecdisona, un sistema de expresion con interruptor lac, un sistema de expresion inducible por glucocorticoide, un sistema promotor inducible por la temperatura y un sistema de expresion inducible por metal metalonema. En el caso de que el sistema de la celula huesped comprenda varios acidos nucleicos diferentes codificantes de una MUA indicada en la presente memoria, algunos de ellos pueden expresarse bajo el control de un promotor constitutivo, mientras que otras se expresan bajo el control de un promotor regulado. El nivel maximo de expresion se considera que es el nivel mas alto posible de expresion estable de polipeptido que no presenta un efecto adverso significativo sobre la tasa de crecimiento celular, y se determinara mediante experimentacion rutinaria. Los niveles de expresion se determinan mediante metodos generalmente conocidos de la tecnica, incluyendo el analisis de transferencia western utilizando un anticuerpo espedfico para la MUA o un anticuerpo espedfico para un peptido-etiqueta fusionado a la MUA, y el analisis de transferencia northern. En una alternativa adicional, el polinucleotido puede ligarse operativamente a un gen informador; los niveles de expresion de una MUA quimerica que presenta sustancialmente la misma especificidad de union que el anticuerpo B-Ly1 murino se determinan mediante la medicion de una senal correlacionada con el nivel de expresion del gen informador. El gen informador puede transcribirse conjuntamente con el acido o acido nucleicos codificantes de dicho polipeptido de fusion en forma de una unica molecula de ARNm; sus secuencias codificantes respectivas pueden unirse mediante un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) o mediante un intensificador de traduccion independiente de caperuza (CITE). El gen informador puede traducirse conjuntamente con por lo menos un acido nucleico codificante de una MUA quimerica que presenta sustancialmente la misma especificidad de union del anticuerpo B-Ly1 murino, de manera que se forma una unica cadena polipeptidica. Los acidos nucleicos codificantes de las MUA indicadas en la presente memoria pueden ligarse operativamente al gen informador bajo el control de un unico promotor, de manera que el acido nucleico codificante del polipeptido de fusion y el gen informador se transcriben en una molecula de ARN que se procesa alternativamente para formar dos moleculas separadas de ARN mensajero (ARNm): uno de los ARNm resultantes se traduce en dicha protema formadora, y el otro se traduce en dicho polipeptido de fusion.
Pueden utilizarse metodos que son bien conocidos por el experto en la materia para construir vectores de expresion que contienen la secuencia codificante de una MUA que presenta sustancialmente la misma especificidad de union que el anticuerpo B-Ly1 murino junto con las senales de control transcripcional/traduccional apropiadas. Entre estos metodos se incluyen las tecnicas in vitro de ADN recombinante, las tecnicas sinteticas y la recombinacion in vivo/recombinacion genetica. Ver, por ejemplo, las tecnicas descritas en Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. 1989, y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates y Wiley Interscience, N.Y., 1989.
Puede utilizarse una diversidad de sistemas de huesped-vector de expresion para expresar la secuencia codificante de las MUA de la presente invencion. Preferentemente se utilizan celulas de mairnfero como sistemas de celula huesped transfectados con plasmido de ADN recombinante o vectores de expresion de ADN cosmido que contienen la secuencia codificante de la protema de interes y la secuencia codificante del polipeptido de fusion. Mas preferentemente, se utilizan como sistema de celula huesped celulas CHO, celulas BHK, celulas NS0, celulas SP2/0, celulas de mieloma YO, celulas de mieloma de raton P3X63, celulas PER, celulas PER.C6 o celulas de hibridoma, otras celulas de m ai^ero , celulas de levadura, celulas de insecto o celulas vegetales. Se describen algunos ejemplos de sistemas de expresion y metodos de seleccion en las referencias siguientes, y referencias contenidas en las mismas: Borth et al., Biotechnol. Bioen. 71(4):266-73, 2000-2001, en: Werner et al., Arineimittelforschung/Drug Res.
48(8):870-80, 1998, en: Andersen y Krummen, Curr. Op. Biotechnol. 13:117-123 (2002), en: Chadd y Chamow, Curr. Op. Biotechnol. 12:188-194, 2001, y en Giddings, Curr. Op. Biotechnol. 12: 450-454, 2001). En realizaciones alternativas, pueden contemplarse otros sistemas de celula huesped eucariotica, incluyendo celulas de levadura transformadas con vectores de expresion de levadura recombinantes que contienen la secuencia codificante de una MUA de la presente invencion, sistemas de celulas de insecto infectadas con vectores de expresion de virus recombinante (por ejemplo baculovirus) que contienen la secuencia codificante de una MUA quimerica que presenta sustancialmente la misma especificidad de union que el anticuerpo B-Ly1 murino; sistemas de celulas vegetales infectados con vectores de expresion de virus recombinante (por ejemplo el virus del mosaico de la coliflor, VMCa; el virus del mosaico del tabaco, VMT) o transformados con vectores de expresion plasmidos recombinantes (por ejemplo el plasmido Ti) que contienen la secuencia codificante de la MUA de la invencion; o sistemas de celulas animales infectados con vectores de expresion virus recombinante (por ejemplo adenovirus, virus vaccinia), incluyendo lmeas celulares manipuladas para que contengan multiples copias del Ad N codificante de una MUA quimerica que presenta sustancialmente la misma especificidad de union que el anticuerpo B-Ly1 murino establemente amplificado (CHO/dhfr) o inestablemente amplificado en cromosomas dobles diminutos (por ejemplo lmeas celulares murinas). En una realizacion, el vector que comprende el polinucleotido o polinucleotidos codificantes de la MUA de la invencion es policistronico. Ademas, en una realizacion la MUA comentada anteriormente es un anticuerpo o un fragmento del mismo. En una realizacion preferente la MUA es un anticuerpo humanizado.
Para los metodos de la presente exposicion, se prefiere generalmente la expresion estable a la expresion transitoria debido a que tfpicamente consigue resultados mas reproducibles y tambien permite mas facilmente la produccion a gran escala. En lugar de utilizar vectores de expresion que contienen ongenes vmcos de replicacion, las celulas huesped pueden transformarse con los acidos nucleicos codificantes respectivos controlados por los elementos de control de la expresion apropiados (por ejemplo promotor, intensificador, secuencias, terminadoras de transcripcion, sitios de poliadenilacion, etc.) y un marcador seleccionable. Tras la introduccion del ADN foraneo, las celulas manipuladas pueden dejarse en cultivo durante 1 a 2 dfas en un medio enriquecido, y despues pasarse a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plasmido recombinante proporciona resistencia a la seleccion y permite la seleccion de celulas que han integrado establemente el plasmido en sus cromosomas y que crecen para formar focos que, a su vez, pueden clonarse y expandirse para formar lmeas celulares.
Existen varios sistemas de seleccion que pueden utilizarse, incluyendo, aunque sin limitacion, los genes de la timidina quinasa del virus herpes simplex (Wigler et al., Cell 11:223, 1977), de la hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa (Szybalska y Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026, 1962), y de la adenina fosforibosiltransferasa (Lowy et al., Cell 22:817, 1980), que pueden utilizarse en celulas tk', hgprt o aprt, respectivamente. Ademas, puede utilizarse una resistencia antimetabolito como base de seleccion para los genes dhfr, que proporciona resistencia al metotrexato (Wigler et al., Natl. Acad. Sci. USA 77:3567, 1989; O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527, 1981), gpt, que proporciona resistencia al acido micofenolico (Mulligan y Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072, 1981), neo, que proporciona resistencia al aminoglucosido G-418 (Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1, 1981), e higro, que proporciona resistencia a la higromicina (Santerre et al., Gene 30:147, 1984). Recientemente, se han descrito genes seleccionables adicionales, por ejemplo trpB, que permite que las celulas utilicen indol en lugar de triptofano; hisD, que permite que las celulas utilicen histinol en lugar de histidina (Hartman y Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8047, 1988), el sistema de glutamina sintasa, y la ODC (ornitina descarboxilasa), que proporciona resistencia al inhibidor de la ornitina descarboxilasa, la 2-(difluorometil)-DL-ornitina, DFMO (McConlogue, en: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, editor, 1987).
La presente exposicion se refiere asimismo a un metodo para modificar el perfil de glucosilacion de las MUA indicadas en la presente memoria que son producidas por una celula huesped, que comprende expresar en dicha celula huesped un acido nucleico codificante de una MUA de la exposicion y un acido nucleico codificante de un polipeptido con actividad de GnTIII, o un vector que comprende dichos acidos nucleicos. Preferentemente, el polipeptido modificado es IgG o un fragmento de la misma que comprende la region Fc. En una realizacion particularmente preferente, la MUA es un anticuerpo humanizado o un fragmento del mismo.
Las MUA modificadas producidas por las celulas huesped de la invencion muestran una afinidad de union de receptor Fc incrementada y/o una funcion efectora incrementada como resultado de la modificacion. En una realizacion particularmente preferente, la MUA es un anticuerpo humanizado o un fragmento del mismo que contiene la region Fc. Preferentemente la afinidad de union de receptor Fc incrementada es union incrementada a un receptor activador Fcy, tal como el receptor FcYRIIIa. La funcion efectora incrementada preferentemente es un incremento de uno o mas de los siguientes: citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo incrementada, fagocitosis celular dependiente de anticuerpo (ADCP) incrementada, secrecion de citoquinas incrementada, incorporacion incrementada de antfgenos por parte de celulas presentadoras de antfgeno mediada por complejo inmunologico, citotoxicidad celular mediada por Fc incrementada, union incrementada a celulas NK, union incrementada a macrofagos, union incrementada a celulas polimorfonucleares (PMN), union incrementada a monocitos, entrecruzamiento incrementado de anticuerpos unidos a diana, senalizacion directa incrementada inductora de apoptosis, maduracion de celulas dendnticas incrementada y cebado de celulas T incrementado.
La presente exposicion se refiere asimismo a un metodo para producir una MUA indicada en la presente memoria, que presenta oligosacaridos modificados en una celula huesped, que comprende: (a) cultivar una celula huesped manipulada para que exprese por lo menos un acido nucleico codificante de un polipeptido que presenta actividad de GnTIII bajo condiciones que permiten la produccion de una MUA segun la presente exposicion, en la que dicho polipeptido que presenta actividad de GnTIII se expresa en una cantidad suficiente para modificar los oligosacaridos en la region Fc de dicha MUA producida por dicha celula huesped, y (b) aislar dicha MUA. En una realizacion preferente, el polipeptido que presenta actividad de GnTIII es un polipeptido de fusion que comprende el dominio catalttico de GnTIII. En una realizacion particularmente preferente, el polipeptido de fusion comprende ademas el dominio de localizacion en Golgi de un polipeptido residente en el Golgi.
Preferentemente, el dominio de localizacion en Golgi es el dominio de localizacion de la manosidasa II o de GnTI. Alternativamente, el dominio de localizacion en Golgi se selecciona del grupo que consiste en: el dominio de localizacion de la manosidasa I, el dominio de localizacion de GnTII, y el dominio de localizacion de la a 1-6-fucosiltransferasa nuclear. Las MUA producidas mediante los metodos de la presente invencion presentan una afinidad de union de receptores Fc incrementada y/o una funcion efectora incrementada. Preferentemente, la funcion efectora incrementada es una o mas de las siguientes: citotoxicidad celular mediada por Fc incrementada (incluyendo la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos incrementada), fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) incrementada, secrecion incrementada de citoquinas, incorporacion de antfgeno mediada por complejo inmunologico incrementada, union incrementada a celulas NK, union incrementada a macrofagos, union incrementada a monocitos, union incrementada a celulas polimorfonucleares, senalizacion directa incrementada inductora de apoptosis, entrecruzamiento incrementado de anticuerpos unidos a diana, maduracion incrementada de celulas dendnticas o cebador de celulas T incrementada. La afinidad de union a receptores Fc incrementada preferentemente es union incrementada a receptores activadores de Fc, tales como FcYRIIIa. En una realizacion particularmente preferente, la MUA es un anticuerpo humanizado o un fragmento del mismo.
En otra realizacion, la presente exposicion se refiere a una MUA quimerica que presenta sustancialmente la misma especificidad de union del anticuerpo B-Ly1 murino producido mediante los metodos descritos en la presente memoria, que presenta una proporcion incrementada de oligosacaridos bisectados en la region Fc de dicho polipeptido. Se encuentra contemplado que dicha MUA comprenda anticuerpos o fragmentos de los mismos que comprendan la region Fc. En una realizacion preferente la MUA es un anticuerpo humanizado. En una realizacion, el porcentaje de oligosacaridos bisectados en la region Fc de la MUA es de por lo menos 50%, mas preferentemente de por lo menos 60%, por lo menos 70%, por lo menos 80%, o por lo menos 90%, y mas preferentemente de por lo menos 90% a 95% de los oligosacaridos totales. En todavfa otra realizacion, la MUA producida mediante los metodos descritos en la presente memoria presenta una proporcion incrementada de oligosacaridos no fucosilados en la region Fc como resultado de la modificacion de sus oligosacaridos mediante los metodos de la presente invencion. En una realizacion, el porcentaje de oligosacaridos no fucosilados es de por lo menos 50%, preferentemente de por lo menos 60% a 70%, mas preferentemente de por lo menos 75%. Los oligosacaridos no fucosilados pueden ser de tipo hnbrido o de tipo complejo. En una realizacion particularmente preferente, la MUA producida mediante las celulas huesped y metodos de la invencion presenta una proporcion incrementada de oligosacaridos no fucosilados bisectados en la region Fc. Los oligosacaridos no fucosilados bisectados pueden ser hfbridos o complejos. Espedficamente, los metodos de la presente invencion pueden utilizarse para producir MUA en las que por lo menos 15%, mas preferentemente por lo menos 20%, mas preferentemente por lo menos 25%, mas preferentemente por lo menos 30%, mas preferentemente por lo menos 35% de los oligosacaridos en la region Fc de la MUA son bisectados, no fucosilados. Los metodos descritos en la presente memoria tambien pueden utilizarse para producir polipeptidos en los que por lo menos 15%, mas preferentemente por lo menos 20%, mas preferentemente por lo menos 25%, mas preferentemente por lo menos 30%, mas preferentemente por lo menos 35% de los oligosacaridos en la region Fc del polipeptido son bisectados hforidos no fucosilados.
En otra realizacion, la presente exposicion se refiere a una MUA quimerica que presenta sustancialmente la misma especificidad de union del anticuerpo B-Ly1 murino que ha sido manipulado para que presente una funcion efectora incrementada y/o una afinidad de union a receptores Fc incrementada, producido mediante los metodos descritos en la presente memoria. Preferentemente, la funcion efectora incrementada es una o mas de las siguientes: citotoxicidad celular mediada por Fc incrementada (incluyendo la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos incrementada), fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) incrementada, secrecion incrementada de citoquinas, incorporacion de antigeno mediada por complejo inmunologico incrementada, union incrementada a celulas NK, union incrementada a macrofagos, union incrementada a monocitos, union incrementada a celulas polimorfonucleares, senalizacion directa incrementada inductora de apoptosis, entrecruzamiento incrementado de anticuerpos unidos a diana, maduracion incrementada de celulas dendnticas o cebador de celulas T incrementada. En una realizacion preferente, la afinidad de union de receptores Fc incrementada es la union incrementada a un receptor activador de Fc, mas preferentemente FcYRIIIa. En una realizacion, la MUA es un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo que contiene la region Fc, o una protema de fusion que incluye una region equivalente a la region Fc de una inmunoglobulina. En una realizacion particularmente preferente, la MUA es un anticuerpo humanizado.
La presente exposicion se refiere asimismo a composiciones farmaceuticas que comprenden las MUA descritas en la presente memoria y un portador farmaceuticamente aceptable.
La presente exposicion se refiere asimismo a la utilizacion de dichas composiciones farmaceuticas en el metodo de tratamiento del cancer. Espedficamente, la presente exposicion se refiere a un metodo para el tratamiento del cancer, que comprende administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de la composicion farmaceutica descrita en la presente memoria.
La presente exposicion proporciona asimismo metodos para la generacion y utilizacion de sistemas de celulas huesped para la produccion de glucoformas de las MUA descritas en la presente memoria, que presentan una afinidad de union a receptores Fc incrementada, preferentemente una union a receptores activadores de Fc incrementada, y/o que presentan funciones efectoras incrementadas, incluyendo citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos. La metodologfa de glucomanipulacion que puede utilizarse con las MUA descritas en la presente memoria ha sido descrita en mayor detalle en la patente US n° 6.602.684 y en la solicitud provisional de patente US n° 60/441.307 y en el documento n° WO 2004/065540.
Las MUA de la presente exposicion alternativamente pueden glucomanipularse para que presenten un numero reducido de residuos de fucosa en la region Fc segun las tecnicas dadas a conocer en el documento EP n° 1176195 A1.
Generacion de lineas celulares para la produccion de proteinas con un patron de glucosilacion alterado
La presente exposicion describe sistemas de expresion de celulas huesped para la generacion de las MUA descritas en la presente memoria que presentan patrones de glucosilacion modificados. En particular, la presente exposicion describe sistemas de celulas huesped para la generacion de glucoformas de las MUA descritas en la presente memoria que presentan un valor terapeutico mejorado. Por lo tanto, la invencion proporciona sistemas de expresion de celulas huesped seleccionados o manipulados para que expresen un polipeptido que presenta actividad de GnTIII. En una realizacion, el polipeptido que presenta actividad de GnTIII es un polipeptido de fusion que comprende el dominio de localizacion en Golgi de un polipeptido residente en Golgi heterologo. Espedficamente, dichos sistemas de expresion de celulas huesped pueden manipularse para que comprendan una molecula de acido nucleico recombinante codiciante de un polipeptido que presenta GnTIII, operativamente ligado a un sistema promotor constitutivo o regulado.
En una realizacion espedfica, la presente exposicion se refiere a una celula huesped que ha sido manipulada para expresar por lo menos un acido nucleico codificante de un polipeptido de fusion que presenta actividad de GnTIII y que comprende el dominio de localizacion en Golgi de un polipeptido residente en Golgi heterologo. En un aspecto, la celula huesped se manipula con una molecula de acido nucleico que comprende por lo menos un gen codificante de un polipeptido de fusion que presenta actividad de GnTIII y que comprende el dominio de localizacion en Golgi de un polipeptido residente en Golgi heterologo.
Generalmente, puede utilizarse cualquier tipo de lmea celular en cultivo, incluyendo las lineas celulares comentadas anteriormente, como fondo para manipular las lrneas de celulas huesped descritas en la presente memoria. En una realizacion preferente, se utilizan celulas CHO, celulas BHK, celulas NS0, celulas SP2/0, celulas de mieloma YO, celulas de mieloma de raton P3X63, celulas PER, celulas PER.C6 o celulas de hibridoma, otras celulas de mamffero, celulas de levadura, celulas de insecto o celulas vegetales como la lmea celular de fondo para generar las celulas huesped manipuladas indicadas en la presente memoria.
Se encuentra contemplado que la exposicion comprenda cualesquiera celulas huesped manipuladas que expresen un polipeptido que presenta actividad de GnTIII, incluyendo un polipeptido de fusion que comprende el dominio de localizacion en Golgi de un polipeptido residente en Golgi heterologo tal como se define en la presente memoria.
Puede expresarse uno o varios acidos nucleicos codificantes de un polipeptido que presenta actividad de GnTIII, bajo el control de un promotor constitutivo o, alternativamente, un sistema de expresion regulada. Dichos sistemas son bien conocidos de la tecnica, e incluyen los sistemas comentados anteriormente. En el caso de que varios acidos nucleicos diferentes codificantes de polipeptidos de fusion que presentan actividad de GnTIII y que comprenden el dominio de localizacion en Golgi de un polipeptido residente en Golgi heterologo se encuentren dentro del sistema de celulas huesped, algunos de ellos pueden expresarse bajo el control de un promotor constitutivo, mientras que otros se expresan bajo el control de un promotor regulado. Los niveles de expresion de los polipeptidos de fusion que presentan actividad de GnTIII se determinan mediante metodos generalmente conocidos de la tecnica, incluyendo el analisis de transferencia Western, el analisis de transferencia northern, el analisis de expresion de genes informadores o la medicion de la actividad de GnTIII. Alternativamente, puede utilizarse una lectina que se una a productos biosinteticos de GnTIII, por ejemplo, la lectina E-PHA. Alternativamente, puede utilizarse un ensayo funcional que mide la union incrementada del receptor Fc o la funcion efectora incrementada mediada por anticuerpos producidos por las celulas manipuladas con el acido nucleico codificante de un polipeptido con actividad de GnTIII.
Identificacion de transfectantes o transformantes que expresan la proteina que presenta un patron de glucosilacion modificado
Las celulas huesped que contienen la secuencia codificante de una MUA quimerica que presenta sustancialmente la misma especificidad de union que el anticuerpo B-Ly1 murino y que expresan los productos genicos biologicamente activos pueden identificarse mediante por lo menos cuatro enfoques generales: (a) hibridacion ADN-ADN o ADN-ARN, (b) presencia o ausencia de funciones genicas "marcadoras", (c) evaluacion del nivel de transcripcion segun se mide a partir de la expresion de los transcritos de ARNm respectivos en la celula huesped, (d) deteccion del producto genico segun medicion mediante inmunoensayo o a partir de su actividad biologica.
En el primer enfoque, la presente de la secuencia codificante de una MUA quimerica que presenta sustancialmente la misma especificidad de union del anticuerpo Bly-1 murino y la secuencia codificante del polipeptido que presenta actividad de GnTIII pueden detectarse mediante hibridacion ADN-ADN o ADN-ARN utilizando sondas que comprenden secuencias de nucleotidos que son homologas a las secuencias codificantes respectivas, respectivamente, o partes o derivados de las mismas.
En el primer enfoque, la presente de la secuencia codificante de una MUA quimerica que presenta sustancialmente la misma especificidad de union del anticuerpo Bly-1 murino y la secuencia codificante del polipeptido que presenta actividad de GnTIII pueden detectarse mediante hibridacion ADN-ADN o ADN-ARN utilizando sondas que comprenden secuencias de nucleotidos que son homologas a las secuencias codificantes respectivas, respectivamente, o partes o derivados de las mismas. Por ejemplo, en el caso de que la secuencia codificante de la MUA descrita en la presente memoria, o un fragmento de la misma, y la secuencia codificante del polipeptido que presenta actividad de GnTIII se inserte dentro de una secuencia genica marcadora del vector, pueden identificarse los recombinantes que contienen las secuencias codificantes respectivas, a partir de la ausencia de la funcion del gen marcador. Alternativamente, puede situarse un gen marcador en tandem con las secuencias codificantes bajo el control del mismo promotor o de promotores diferentes utilizados para controlar la expresion de las secuencias codificantes. La expresion del marcador en respuesta a la induccion o la seleccion indica la expresion de la secuencia codificante de la MUA de la invencion y la secuencia codificante del polipeptido que presenta actividad de GnTIII.
En el tercer enfoque, puede evaluarse mediante ensayos de hibridacion la actividad transcripcional de la region codificante de la MUA de la invencion, o de un fragmento de la misma, y la secuencia codificante del polipeptido que presenta actividad de GnTIII. Por ejemplo, puede aislarse ARN y analizarse mediante transferencia northern utilizando una sonda homologa a las secuencias codificantes de la MUA de la invencion, o de un fragmento de la misma, y la secuencia codificante del polipeptido que presenta actividad de GnTIII o partes particulares de la misma. Alternativamente, pueden extraerse los acidos nucleicos totales de la celula huesped y someterse a ensayo para la hibridacion a dichas sondas.
En el cuarto enfoque, la expresion de los productos proteicos puede evaluarse inmunologicamente, por ejemplo, mediante transferencias western, inmunoensayos tales como la radioinmunoprecipitacion o inmunoensayos ligados a enzima. El ensayo definitivo del exito del sistema de expresion, sin embargo, implica la deteccion de los productos genicos biologicamente activos.
Generacion y utilizacion de MUA con funcion efectora incrementada, incluyendo citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos
En realizaciones preferentes, la presente exposicion describe glucoformas de MUA quimericas que presentan sustancialmente la misma especificidad de union del anticuerpo B-Lyl murino y que presentan una funcion efectora incrementada, incluyendo citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos. La manipulacion por glucosilacion de los anticuerpos ha sido descrita anteriormente. Ver, por ejemplo, la patente US n° 6.602.684.
Los ensayos clmicos con anticuerpos monoclonales (mAb) no conjugados para el tratamiento de algunos tipos de cancer recientemente han proporcionado resultados esperanzadores. Dillman, Cancer Biother. & Radiopharm. 12:223­ 25, 1997; Deo et al., Immunology Today 18:127, 1997. Se ha autorizado una IgG1 no conjugada quimerica para el linfoma no de Hodking de celulas B foliculares o de grado bajo Dillman, Cancer Biother. & Radiopharm. 12:223-25, 1997, mientras que otro mAb no conjugado, una IgG1 humanizada que reconoce tumores de mama solidos, tambien ha mostrado resultados prometedores en ensayos clmicos de fase III (Deo et al., Immunology Today 18:127, 1997). Los antfgenos de dichos dos mAb se expresan a nivel elevado en sus celulas tumorales respectivas y los anticuerpos median en la potente destruccion tumoral por celulas efectoras in vitro e in vivo. En contraste, muchos otros mAb no conjugados con fines especificidades tumorales no pueden inducir funciones efectoras de suficiente potencia para resultar clmicamente utiles. (Frost et al., Cancer 80:317-33, 1997; Surfus et al., J. Immunother. 19:184-91 (1996). Para algunos de dichos mAb mas debiles, actualmente se esta sometiendo a ensayo una terapia complementaria de citoquinas. La adicion de citoquinas puede estimular citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) mediante el incremento de la actividad y numero de linfocitos circulantes. (Frost et al., Cancer 80:317-33, 1997; Surfus et al., J. Immunother. 19:184-91 (1996). La ADCC, un ataque lftico sobre las celulas diana de anticuerpos resulta inducida con la union de los receptores de leucocitos a la region constante (Fc) de los anticuerpos (Deo et al., Immunology Today 18:127, 1997).
Un enfoque diferente, aunque complementario, para incrementar la actividad ADCC de las IgG1 no conjugadas es manipular la region Fc del anticuerpo. Los estudios de ingeniena de protemas han demostrado que las FcyR interactuan con la region bisagra inferior del dominio CH2 de IgG (Lund et al., J. Immunol. 157:4963-69 (1996). Sin embargo, la union de FcyR tambien requiere la presencia de oligosacaridos unidos covalentemente a la Asn 297 conservada presente en la region CH2 (Lund et al., J. Immunol. 157:4963-69, 1996; Wright y Morrison, Trends Biotech.
15:26-31, 1997), sugiriendo que oligosacarido y polipeptido, ambos, contribuyen directamente al sitio de interaccion o que el oligosacarido resulta necesario para mantener una conformacion activa del polipeptido con CH2. La modificacion de la estructura del oligosacarido, por lo tanto, podna explorarse como medio para incrementar la afinidad de la interaccion.
Una molecula de IgG porta dos oligosacaridos N-ligados en su region Fc, uno en cada cadena pesada. Al igual que cualquier glucoprotema, un anticuerpo se produce como poblacion de glucoformas que comparten el mismo esqueleto polipeptfdico pero que presentan diferentes oligosacaridos unidos a los sitios de glucosilacion. Los oligosacaridos normalmente presentes en la region Fc de la IgG serica son de tipo bisectado complejo (Wormald et al., Biochemistry 36:130-38, 1997), con un nivel bajo de acido sialico terminal y de N-acetilglucosamina (GlcNAc) bisectada, y un grado variable de galactosilacion terminal y de fucosilacion nuclear. Algunos estudios sugieren que la estructura de carbohidrato minima necesaria para la union de FcyR se encuentra dentro del nucleo del oligosacarido (Lund et al., J. Immunol. 157:4963-69, 1996).
Las lmeas celulares derivadas del raton y del hamster utilizadas en la industria y en la universidad para la produccion de mAb terapeuticos no conjugados normalmente unen los determinantes oligosacaridos necesarios a los sitios Fc. Las IgG expresadas en dichas lmeas celulares no presentan, sin embargo, el GlcNAc bisectado observado en cantidades bajas en las IgG sericas (Lifely et al., Glycobiology 318:813-22, 1995). En contraste, recientemente se ha observado que una IgG1 humanizada producida por mieloma de rata (CAMPATH-1H) portaba una GlcNAc bisectada en algunas de sus glucoformas (Lifely et al., Glycobiology 318:813-22, 1995). El anticuerpo derivado de celulas de rata alcanzaba una actividad ADCC in vitro maxima similar a la de los anticuerpos CAMPATH-1H producidos en lmeas celulares estandares, aunque a concentraciones de anticuerpo significativamente mas bajas.
El antfgeno CAMPATH normalmente se encuentra presente a niveles elevados sobre las celulas de linfoma y dicho mAb quimerico presenta una elevada actividad de ADCC en ausencia de un GlcNAc bisectante (Lifely et al., Glycobiology 318:813-22, 1995). En la ruta de glucosilacion N-ligada, un GlcNAc bisectado resulta anadido por GnTIII (Schachter, Biochem. Cell Biol. 64:163-81 (1986).
Algunos estudios anteriores utilizaron una unica lmea celular CHO productora de anticuerpos, que previamente habfa sido manipulada para expresar, de una manera regulada externamente, diferentes niveles de un enzima de gen GnTIII clonado (Umana P. et al., Nature Biotechnol. 17:176-180 (1999)). Este enfoque establecio por primera vez una correlacion rigurosa entre la expresion de GnTIII y la actividad ADCC del anticuerpo modificado. De esta manera, la invencion contempla un anticuerpo quimerico recombinante o un fragmento del mismo con la especificidad de union del anticuerpo B-Ly1 murino, que presenta una glucosilacion alterada resultante de la actividad de GnTIII incrementada. La actividad de GnTIII incrementada resulta en un incremento del porcentaje de oligosacaridos bisectados, asf como en una reduccion del porcentaje de residuos fucosa en la region Fc de la MUA. Este anticuerpo, o fragmento del mismo, presenta una afinidad de union a receptor Fc incrementada y una funcion efectora incrementada. Ademas, la invencion se refiere al fragmento de anticuerpo y protemas de fusion que comprenden una region que es equivalente a la region Fc de las inmunoglobulinas.
Aplicaciones terapeuticas de las MUA producidas segun los metodos de la exposicion
Las MUA descritas en la presente memoria pueden utilizarse por sf solas para reconocer y eliminar las celulas tumorales in vivo. Las MUA tambien pueden utilizarse junto con un agente terapeutico apropiado para tratar el carcinoma humano. Por ejemplo, las MUA pueden utilizarse en combinacion con metodos de tratamiento estandares o convencionales, tales como la quimioterapia o la terapia de radiacion, o pueden conjugarse o unirse a un farmaco terapeutico, o toxina, asf como a un linfocito o a un factor de crecimiento inhibidor tumoral, para la administracion del agente terapeutico en el sitio del carcinoma. Los conjugados de las MUA de la presente invencion que son de importancia primordial son: (1) las inmunotoxinas (conjugados de la MUA y un grupo citotoxico), y (2) MUA marcadas (por ejemplo, marcadas radioactivamente, marcadas enzimaticamente o marcadas con fluorocromos) en las que el marcaje proporciona un medio para identificar los complejos inmunologicos que incluyen la MUA marcada. Las MUA tambien pueden utilizarse para inducir la lisis mediante el procedimiento natural del complemento, y para interaccionar con celulas citotoxicas dependientes de anticuerpos presentes normalmente.
La fraccion citotoxica de la inmunotoxina puede ser un farmaco citotoxico o una toxina enzimaticamente activa de origen bacteriano o vegetal, o un fragmento enzimaticamente activo ("cadena A") de dicha toxina. Las toxinas enzimaticamente activas y fragmentos de las mismas utilizadas son la cadena A difterica, los fragmentos activos no ligantes de la toxina difterica, la cadena A de la exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), la cadena A de la ricina, la cadena A de la abrina, la cadena A de la modeccina, la alfasarcina, las protemas de Aleurites fordii, las protemas diantina, las protemas de Phytolacca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), el inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogellina, restrictocina, fenomicina y enomicina. En otra realizacion, las MUA se conjugan con farmacos anticancer de molecula pequena. Los conjugados de la MUA y dichos grupos citotoxicos se preparan utilizando una diversidad de protemas bifuncionales que son agentes de acoplamiento. Son ejemplos de estos reactivos: SPDP, IT, derivados bifuncionales de los imidoesteres tales como HCl de adipimidato de dimetilo, esteres activos tales como suberato de disuccinimidilo, aldetndos tales como glutaraldetndo, compuestos bis-azido tales como bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina, derivados bis-diazonio tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina, diisocianatos tales como 2,6-diisocianato de tolileno y compuestos fluor bis-activos tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno. La parte lisante de una toxina puede unirse al fragmento Fab de las MUA. Son conocidas de la tecnica algunas toxinas apropiadas adicionales, tal como se pone de manifiesto en, por ejemplo, la solicitud publicada de patente US n° 2002/0128448.
En una realizacion, una MUA glucomanipulada quimerica que presenta sustancialmente la misma especificidad de union del anticuerpo B-Ly1 murino se conjuga con la cadena A de la ricina. Mas ventajosamente, la cadena A de la ricina se desglucosila y se produce por medios recombinantes. Un metodo ventajoso de preparar la inmunotoxina ricina se describe en Vitetta et al., Science 238:1098, 1987.
En el caso de que los conjugados se utilicen para eliminar celulas cancerosas humanas in vitro con fines diagnosticos, tfpicamente se anaden al medio de cultivo celular a una concentracion de por lo menos aproximadamente 10 nM. La formulacion y modo de administracion para el uso in vitro no resultan cnticos. Normalmente se utilizan las formulaciones acuosas que resultan compatibles con medio de cultivo o de perfusion. La citotoxicidad puede leerse mediante tecnicas convencionales para la determinacion de la presencia o grado del cancer.
Tal como se ha comentado anteriormente, puede prepararse un radiofarmaceutico citotoxico para tratar el cancer mediante conjugacion de un isotopo radioactivo (por ejemplo, I, Y, Pr) con una MUA glucomanipulada quimerica que presenta sustancialmente la misma especificidad de union que el anticuerpo B-Ly1 murino. La expresion "fraccion citotoxica" tal como se utiliza en la presente memoria pretende incluir dichos isotopos.
En otra realizacion, se rellenan liposomas con un farmaco citotoxico y los liposomas se recubren con las MUA descritas en la presente memoria. Debido a que existen muchas moleculas de CD20 sobre la superficie de la celula B maligna, este metodo permite la administracion de grandes cantidades de farmaco al tipo celular correcto.
Las tecnicas para conjugar dichos agentes terapeuticos con anticuerpos son bien conocidas (ver, por ejemplo, Amon et al., "Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy", en: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), paginas 243 a 56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", en: Controlled Drug Delivery (2a ed.), Robinson et al. (editores), paginas 623 a 653 (Marcel Dekker, Inc., 1987), Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", en: Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (editores), paginas 475 a 506, 1985, y Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev. 62:119-58, 1982).
Entre todavfa otras aplicaciones terapeuticas para las MUA indicadas en la presente memoria se incluyen la conjugacion o union, por ejemplo mediante tecnicas de ADN recombinante, a un enzima capaz de convertir un profarmaco en un farmaco citotoxico, y la utilizacion de este conjugado de anticuerpo-enzima en combinacion con el profarmaco para convertir el profarmaco en un agente citotoxico en el sitio tumoral (ver, por ejemplo, Senter et al., "Anti-Tumor Effects of Antibody-alkaline Phosphatase", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4842-46 (1988); "Enhancement of the in vitro and in vivo Antitumor Activites of Phosphorylated Mitocycin C and Etoposide Derivatives by Monoclonal Antibody-Alkaline Phosphatase Conjugates", Cancer Research 49:5789-5792 (1989); y Senter, "Activation of Prodrugs by Antibody-Enzyme Conjugates:A New Approach to Cancer Therapy," FASEB J. 4:189-193 (1990)).
Todavfa otro uso terapeutico para las MUA descritas en la presente memoria implica la utilizacion, en forma no conjugada, en presencia del complemento, o como parte de un conjugado de anticuerpo-farmaco o de anticuerpotoxina, para eliminar celulas tumorales de la medula osea de pacientes de cancer. Segun este enfoque, puede purgarse medula osea autologa ex vivo mediante tratamiento con el anticuerpo e infusionarse la medula de vuelta en el paciente (ver, por ejemplo, Ramsay et al., "Bone Marrow Purging Using Monoclonal Antibodies", J. Clin. Immunol.
8(2):81-88, 1988).
Ademas, se encuentra contemplado que la exposicion comprenda dominios de union a antfgeno que comprenden inmunotoxina de cadena sencilla, que permiten sustancialmente la misma especificidad de union que el anticuerpo B-Ly1 murino (por ejemplo, polipeptidos que comprenden las CDR del anticuerpo B-Ly1 murino) y que ademas comprenden un polipeptido toxina. Las inmunotoxinas de cadena sencilla de la invencion pueden utilizarse para tratar el carcinoma humano in vivo.
De manera similar, puede utilizarse una protema de fusion que comprende por lo menos la region ligante de antfgeno de una MUA de la invencion a por lo menos una parte funcionalmente activa de una segunda protema que presenta actividad antitumoral, por ejemplo, una linfoquina u oncostatina, para el tratamiento del carcinoma humano in vivo.
La presente exposicion describe un metodo para eliminar selectivamente las celulas tumorales que expresan CD20. Este metodo comprende hacer reaccionar el inmunoconjugado (por ejemplo, la inmunotoxina) descrita en la presente memoria con dichas celulas tumorales. Estas celulas tumorales pueden ser de un carcinoma humano.
Ademas, la presente exposicion describe un metodo de tratamiento de los carcinomas (por ejemplo, los carcinomas humanos) in vivo. Dicho metodo comprende administrar en un sujeto una cantidad farmaceuticamente eficaz de una composicion que contiene por lo menos uno de los inmunoconjugados (por ejemplo, la inmunotoxina) indicados en el mismo.
En un aspecto adicional, la exposicion se refiere a un metodo mejorado para tratar los trastornos proliferativos de las celulas B, incluyendo el linfoma de celulas B, asf como una enfermedad autoinmunologica producida en su totalidad o en parte por autoanticuerpos patogenicos, basandose en la reduccion marcada de las celulas B, que comprende administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de una MUA descrita en la presente memoria en un sujeto humano que lo necesita.
En una realizacion preferente, la MUA es un anticuerpo anti-CD20 glucomanipulado con una especificidad de union sustancialmente igual a la del anticuerpo B-Ly1 murino. En otra realizacion preferente, el anticuerpo ha sido humanizado. sEntre los ejemplos de enfermedades o trastornos autoinmunologicos se incluyen, aunque sin limitacion, trombocitopenias de tipo inmunologico, tales como la purpura trombocitopenica idiopatica aguda y la purpura trombocitopenica idiopatica cronica; la dermatomiositis, la corea de Sydenham, la nefritis lupus, la fiebre reumatoidea, los smdromes poliglandulares, la purpura de Henoch-Schonlein, la nefritis post-estreptococica, el eritema nodoso, la arteritis de Takayasu, la enfermedad de Addison, el eritema multiforme, la poliarteritis nodosa, la espondilitis anquilosante, el smdrome de Goodpasture, la tromboangitis obliterante, la cirrosis biliar primaria, la tiroiditis de Hashimoto, la tirotoxicosis, la hepatitis activa cronica, la polimiositis/dermatomiositis, la policondritis, el penfigo vulgar, la granulomatosis de Wegener, la nefropatfa membranosa, la esclerosis lateral amiotrofica, la tabes dorsal, la polimialgia, la anemia perniciosa, la glomerulonefritis de progresion rapida y la alveolitis fibrosante; las respuestas inflamatorias, tales como las enfermedades inflamatorias de la piel, incluyendo la soriasis y la dermatitis (por ejemplo la dermatitis atopica), el escleroderma sistemico y la esclerosis; las respuestas asociadas a la enfermedad intestinal inflamatoria (tales como la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa); el smdrome del distres respiratorio (incluyendo el smdrome del distres respiratorio adulto, ARDS); la dermatitis, la meningitis, la encefalitis, la uveftis, la colitis, la glomerulonefritis; las condiciones alergicas tales como el eccema y el asma, y otras condiciones que implican la infiltracion de celulas T y las respuestas inflamatorias cronicas, la ateroesclerosis, la deficiencia de adhesion leucocitaria, la artritis reumatoide, el lupus eritematoso sistemico (SLE), la diabetes mellitus (por ejemplo la diabetes mellitus de tipo 1 o la diabetes mellitus insulino-dependiente), la esclerosis multiple, el smdrome de Reynaud, la tiroiditis autoinmunologica, la encefalomielitis alergica, el smdrome de Sjorgen, la diabetes de aparicion juvenil, y las respuestas inmunologicas asociadas a la hipersensibilidad aguda y retardada mediada por citoquinas y linfocitos T tfpicamente presente en la tuberculosis, sarcoidosis, polimiositis, granulomatosis y vasculitis; la anemia perniciosa (enfermedad de Addison), enfermedades que implican la diapedesis de los leucocitos; el trastorno inflamatorio del sistema nervioso central (SNC), el smdrome del dano organico multiple, la anemia hemolftica (incluyendo, aunque sin limitacion, la crioglobinemia o la anemia positiva de Coombs), la miastenia grave, las enfermedades mediadas por un complejo antfgeno-anticuerpo, la enfermedad antiglomerular de la membrana basal, el smdrome antifosfolfpidico, la neuritis alergica, la enfermedad de Graves, el smdrome miastenico de Lambert-Eaton, el pemfigoide bulloso, el pemfigo, las poliendocrinopatfas autoinmunologicas, la enfermedad de Reiter, el smdrome del hombre ngido, la enfermedad de Behcet, la arteritis de celulas gigantes, la nefritis de complejo inmunologico, la nefropatfa de IgA, las polineuropatfas de las IgM, la purpura trombocitopenica inmunologica (ITP) o la trombocitopenia autoinmunologica, etc. En este aspecto de la exposicion, las MUA de la invencion se utilizan para reducir marcadamente el numero de celulas B normales en la sangre durante un tiempo prolongado.
Segun la practica de la presente exposicion, el sujeto puede ser humano, equino, porcino, bovino, murino, canino, felino y aviar. Otros animales de sangre caliente tambien se encuentran incluidos en la presente memoria.
La exposicion describe ademas metodos para inhibir el crecimiento de celulas tumorales humanas, para tratar un tumor en un sujeto, y para tratar una enfermedad de tipo proliferativo en un sujeto. Estos metodos comprenden administrar en el sujeto una cantidad eficaz de la composicion de la invencion.
Por lo tanto, resulta evidente que la presente exposicion comprende composiciones farmaceuticas, combinaciones y metodos para tratar carcinomas humanos, tales como el linfoma de celulas B. Por ejemplo, la exposicion incluye composiciones farmaceuticas para la utilizacion en el tratamiento de carcinomas humanos, que comprende una cantidad farmaceuticamente activa de un anticuerpo de la presente invencion y un portador farmaceuticamente aceptable.
Las composiciones de MUA de la invencion pueden administrarse mediante modos convencionales de administracion, incluyendo, aunque sin limitacion, las vfas intravenosa, intraperitoneal, oral, intralinfatica o la administracion directamente en el tumor. Resulta preferente la administracion intravenosa.
En un aspecto de la exposicion, se preparan formulaciones terapeuticas que contienen las MUA indicadas en la presente memoria para el almacenamiento mediante la mezcla de un anticuerpo que presenta el grado deseado de pureza con portadores, excipientes o estabilizantes opcionales farmaceuticamente aceptable (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edicion, Osol A. 1990), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los diluyentes, portadores, excipientes o estabilizadores aceptables resultan no toxicos para el receptor a las dosis y concentraciones utilizadas, e incluyen tampones, tales como fosfato, citrato y otros acidos organicos; antioxidantes, incluyendo acido ascorbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio, cloruro de hexametonio, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, fenol, alcohol butflico o bendlico; alquilparabenos, tales como metilparabeno o propilparabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol, 3-pentanol y m-cresol); polipeptidos de bajo peso molecular (inferior a aproximadamente 10 residuos); protemas, tales como albumina serica, gelatina, o inmunoglobulinas; polfmeros hidrofflicos, tales como polivinilpirrolidona; aminoacidos, tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacaridos, disacaridos, y otros carbohidratos, incluyendo glucosa, manosa, o dextrinas; agentes quelantes, tales como EDTA; azucares, tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como sodio; complejos metalicos (por ejemplo complejos de Znprotema) y/o surfactantes no ionicos, tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG).
Se describen formulaciones de MUA anti-CD20 ejemplares en el documento n° WO 98/56418. Esta publicacion describe una formulacion multidosis lfquida que comprende 40 mg/ml de Rituximab, acetato 25 mM, trehalosa 150 mM, alcohol bendlico al 0,9%, polisorbato 20 al 0,02% a pH 5,0, que presenta una vida de almacenamiento minima de dos anos a una temperatura de entre 2°C y 8°C. Otra formulacion anti-CD20 de interes comprende 10 mg/ml de Rituximab en 9,0 mg/ml de cloruro sodico, 7,35 mg/ml de citrato sodico dihidrato, 0,7 mg/ml de polisorbato 80 y agua esteril para inyeccion, pH 6,5. En la presente invencion, el RITUXAN® se sustituye por una MUA indicada en la presente memoria.
Las formulaciones liofilizadas adaptadas para la administracion subcutanea se describen en el documento n° WO 97/04801. Dichas formulaciones liofilizadas pueden reconstituirse con un diluyente adecuado hasta una concentracion elevada de protemas y la formulacion reconstituida puede administrarse subcutaneamente en el mairnfero que debe tratarse en la presente memoria.
La formulacion en la presente memoria tambien puede contener mas de un compuesto activo, segun resulte necesario para la indicacion particular bajo tratamiento, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no presente efectos mutuos adversos. Por ejemplo, puede resultar deseable proporcionar adicionalmente un agente citotoxico, un agente quimioterapeutico, una citoquina o un agente inmunosupresor (por ejemplo, uno que actua sobre las celula T, tal como la ciclosporina, o un anticuerpo que se una a celulas T, por ejemplo uno que se una a LFA-1). La cantidad eficaz de este otro agente depende de la cantidad e antagonista presente en la formulacion, del tipo de enfermedad o trastorno o del tratamiento, y de otros factores comentados anteriormente. Estos generalmente se utilizan a las mismas dosis y por vfas de administracion iguales a las utilizadas anteriormente en la presente memoria, o de entre aproximadamente 1% y 99% de las dosis utilizadas hasta el momento.
Los ingredientes activos tambien pueden encapsularse en microcapsulas preparadas mediante, por ejemplo, tecnicas de coacervado o mediante polimerizacion interfacial, por ejemplo, microcapsulas de hdiroximetilcelulosa o de gelatina y microcapsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de administracion coloidales de farmaco (por ejemplo liposomas, microesferas de albumina, microemulsiones, nanopartmulas y nanocapsulas) o en macroemulsiones. Dichas tecnicas se dan a conocer en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edicion, Osol A., editor, (editor), 1980.
Pueden prepararse preparaciones de liberacion sostenida. Entre los ejemplos adecuados de preparaciones de liberacion sostenida se incluyen las matrices semipermeables de polfmeros hidrofobicos solidos que contienen el antagonista, las cuales se encuentran en la forma de artmulos conformados, por ejemplo, pelmulas o microcapsulas.
Entre los ejemplos de matrices de liberacion sostenida se incluyen poliesteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietilmetacrilato) o poli(alcohol vimlico), polilactidos (patente US n° 3.773.919), copoUmeros de acido L-glutamico y Y-etil-L-glutamato, acetato de etilenvinilo no degradable, copolfmeros degradables de acido lactico-acido glicolico, tales como LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas de copolfmero de acido lactico-acido glicolico y acetato de leuprolido) y acido poli-D-(-)-3-hidroxibutmco.
Las formulaciones que deben utilizarse para la administracion in vivo deben ser esteriles. Esto puede conseguirse mediante filtracion a traves de membranas de filtracion esteril.
Las composiciones de la invencion pueden encontrarse en una diversidad de formas de dosificacion, incluyendo, aunque sin limitacion, soluciones lfquidas o suspensiones, tabletas, pMdoras, polvos, supositorios, microcapsulas polimericas o microvesfculas, lisosomas y soluciones inyectables o infusionables. La forma preferente depende del modo de administracion y de la aplicacion terapeutica.
Las composiciones descritas en la presente memoria tambien incluyen preferentemente portadores farmaceuticamente aceptables convencionales y adyuvantes conocidos de la tecnica, tales como la albumina serica humana, intercambiadores ionicos, alumina, lecitina, sustancias tamponadoras, tales como fosfatos, glicina, acido ascorbico, sorbato de potasio y sales o electrolitos, tales como sulfato de protamina.
El modo de administracion y el regimen de dosificacion mas eficaces para las composiciones farmaceuticas de la presente invencion dependen de la severidad y curso de la enfermedad, de la salud y respuesta al tratamiento del paciente y del criterio del medico responsable. De acuerdo con lo anteriormente expuesto, las dosis de las composiciones deben titularse respecto al paciente individual. Sin embargo, una dosis eficaz de las composiciones de la presente invencion generalmente se encontrara comprendida en el intervalo de entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 2.000 mg/kg.
Las moleculas descritas en la presente memoria pueden encontrarse en una diversidad de formas de dosificacion, incluyendo, aunque sin limitacion, soluciones lfquidas o suspensiones, tabletas, pfldoras, polvos, supositorios, microcapsulas polimericas o microvesfculas, liposomas y soluciones inyectables o infusionables. La forma preferente depende del modo de administracion y de la aplicacion terapeutica.
La composicion que comprende una MUA de la presente invencion se formula, se dosifica y se administra de un modo consistente con la buena praxis medica. Entre los factores a considerar en el presente contexto se incluyen la enfermedad o trastorno particular bajo tratamiento, el mairnfero particular tratado, la condicion clmica del paciente individual, la causa de la enfermedad o trastorno, el sitio de administracion del agente, el metodo de administracion, la programacion de la administracion y otros factores conocidos por el medico clmico. La cantidad terapeuticamente eficaz del antagonista que debe administrarse se encontrara regulada por dichas consideraciones.
A modo general, la cantidad terapeuticamente eficaz del anticuerpo administrado parenteralmente por dosis se encontrar comprendida en el intervalo de entre aproximadamente 0,1 y 20 mg/kg de peso corporal del paciente al dfa, encontrandose comprendido el intervalo tfpico inicial de antagonista utilizado en el intervalo de entre aproximadamente 2 y 10 mg/kg.
En una realizacion preferente, la MUA es un anticuerpo, preferentemente un anticuerpo humanizado. Las dosis adecuadas para dicho anticuerpo no conjugado son, por ejemplo, de entre aproximadamente 20 mg/m2 y aproximadamente 1.000 mg/m2. En una realizacion, la dosis del anticuerpo difiere de la recomendada actualmente para el RITUXAN®. Por ejemplo, puede administrarse en el paciente una o mas dosis de sustancialmente menos de 375 mg/m2 del anticuerpo, por ejemplo, en el caso de que la dosis se encuentre comprendida en el intervalo de entre aproximadamente 20 mg/m2 y aproximadamente 250 mg/m2, por ejemplo, entre aproximadamente 50 mg/m2 y aproximadamente 200 mg/m2.
Ademas, puede administrarse una o mas dosis iniciales del anticuerpo, seguido de una o mas dosis posteriores, en donde la dosis en mg/m2 del anticuerpo en la dosis o dosis posteriores excede la dosis en mg/m2 del anticuerpo en la dosis inicial o dosis iniciales del anticuerpo. Por ejemplo, la dosis inicial puede encontrarse comprendida en el intervalo de entre aproximadamente 20 mg/m2 y aproximadamente 250 mg/m2 (por ejemplo, entre aproximadamente 50 mg/m2 y aproximadamente 200 mg/m2) y la dosis posterior puede encontrarse comprendida en el intervalo de entre aproximadamente 250 mg/m2 y aproximadamente 1.000 mg/m2.
Sin embargo, tal como se ha indicado anteriormente, estas cantidades sugeridas de las MUA se encuentran muy supeditadas al criterio terapeutico. El factor clave en la seleccion de una dosis y programacion apropiadas es el resultado obtenido, tal como se ha indicado anteriormente. Por ejemplo, pueden resultar necesarias dosis relativamente mas altas inicialmente para el tratamiento de enfermedades continuas y agudas. Para obtener los resultados mas eficaces, dependiendo de la enfermedad o trastorno, el antagonista se administra tan pronto como se observe el primer indicio, diagnostico, aparicion o incidencia de la enfermedad o trastorno, o durante remisiones de la enfermedad o trastorno.
La MUA descrita en la presente memoria se administra mediante cualquier medio, incluyendo las v^as parenteral, subcutanea, intraperitoneal, intrapulmonar e intranasal y, si se desea para el tratamiento inmunosupresor local, por via intralesional. Entre las infusiones parenterales se incluyen las vfas intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutanea. Ademas, el antagonista puede administrate convenientemente mediante infusion de pulsos, p.ej., con dosis decrecientes del antagonista. Preferentemente, la administracion se proporciona mediante inyecciones, mas preferentemente inyecciones intravenosas o subcutaneas, dependiendo en parte de si la administracion es breve o cronica.
Pueden administrarse otros compuestos, tales como agentes citotoxicos, agentes quimioterapeuticos, agentes inmunosupresores y/o citoquinas con los antagonistas en la presente memoria. La administracion combinada incluye la coadministracion utilizando formulaciones separadas o una unica formulacion farmaceutica, y la administracion consecutiva en cualquier orden, en donde preferentemente transcurre un periodo de tiempo durante el que ambos (o todos) los agentes activos ejercen simultaneamente sus actividades biologicas.
Resulta evidente que la dosis de la composicion de la exposicion necesaria para conseguir curaciones puede reducirse adicionalmente mediante la optimizacion de la programacion.
Segun la practica de la exposicion, el portador farmaceutico puede ser un portador lipfdico. El portador lipfdico puede ser un fosfolfpido. Ademas, el portador lipfdico puede ser un acido graso. Ademas, el portador lipfdico puede ser un detergente. Tal como se utiliza en la presente memoria, un detergente es cualquier sustancia que altera la tension superficial de un lfquido, generalmente reduciendola.
En un ejemplo de la exposicion, el detergente puede ser un detergente no ionico. Entre los ejemplos de detergentes no ionicos se incluyen, aunque sin limitacion, polisorbato 80 (tambien conocido como Tween 80 o monooleato de polioxietilensorbitan), Brij y Triton (por ejemplo Triton WR-1339 y Triton A-20).
Alternativamente, el detergente puede ser un detergente ionico. Un ejemplo de un detergente ionico incluye, aunque sin limitacion, bromuro de alquiltrimetilamonio.
Ademas, segun la exposicion, el portador lipfdico puede ser un liposoma. Tal como se utiliza en la presente solicitud, un "liposoma" es cualquier vesfcula unida a membrana que contiene cualquier molecula de la invencion o combinaciones de las mismas.
Los ejemplos, posteriormente, explican la invencion en mayor detalle. Las preparaciones y ejemplos siguientes se proporcionan para permitir que el experto en la materia entienda mas claramente y ponga en practica la invencion.
Ejemplos
[OBSERVACION: A menos que se indique lo contrario, las referencias a la numeracion de posiciones espedficas de residuos aminoacidos en los Ejemplos, a continuacion, siguen el sistema de numeracion de Kabat].
EJEMPLO 1
Materiales y metodos:
Clonacion y expresion del anticuerpo B-Ly1 recombinante
Se cultivaron celulas de hibridoma que expresaban B-Ly1, en RPMI que conterna FBS al 10% y L-glutamina 4 mM. Se recolectaron 6x106 celulas con una viabilidad >90% y se aislo el ARN total utilizando un kit Qiagen RNeasy midi. Los ADNc codificantes de las cadenas ligera y pesada variables de B-Lyl se amplificaron por RT-PCR. La reaccion de RT-PCR se llevo a cabo utilizando las condiciones siguientes: 30 minutos a 50°C para la smtesis de la primera cadena de ADNc, 15 minutos a 95°C para la desnaturalizacion inicial, 30 ciclos de 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 45°C, 1,5 minutos a 72°C, y una etapa de elongacion final de 10 minutos a 72°C. El tamano esperado de los productos de PCR se confirmo mediante electroforesis en gel. Los productos de PCR se clonaron en vectores de E. coli adecuados y la secuenciacion del ADN confirmo que se habfan aislado los genes codificantes de las cadenas ligera y pesada variables.
Para la construccion de los vectores de expresion de B-Ly1 quimericos, se fusionaron secuencias de senal sinteticas y sitios de restriccion apropiados a las cadenas variables mediante reacciones de PCR adicionales. Tras una confirmacion final de la secuencia de ADN correcta de las cadenas variables, se combinaron con las regiones constantes de la IgG1 humana correspondiente. Tras construir los genes, se clonaron bajo el control del promotor MPSV y cadena arriba de un sitio poliA sintetico, utilizando dos vectores separados, uno para cada cadena, resultando en los plasmidos pETR1808 (vector de expresion de cadena pesada) y pETR1813 (vector de expresion de cadena ligera). Cada vector portaba una secuencia OriP del VEB.
Se produjo B-Lyl quimerico mediante cotransfeccion de celulas HEK293-EBNA con los vectores pETR1808 y pETR1813 utilizando un enfoque de transfeccion con fosfato de calcio. Se transfectaron celulas HEK293-EBNA en crecimiento exponencial mediante el metodo del fosfato de calcio. Las celulas se cultivaron como cultivos monocapa adherentes en matraces T utilizando medio de cultivo DMEM complementado con FCS al 10%, y se transfectaron una vez hadan alcanzado una confluencia de entre 50% y 80%. Para la transfeccion de un matraz T75, se sembraron 8 millones de celulas 24 horas antes de la transfeccion en 14 ml de medio de cultivo DMEM suplementado con FCS (al 10% v/v final), 250 pg/ml de neomicina y las celulas se introdujeron a 37°C en un incubador con una atmosfera de 5% de CO2 durante la noche. Para la transfeccion de cada matraz T75, se preparo una solucion de ADN, CaCb y agua mediante la mezcla de 47 pg de ADN total de vector plasmido dividido igualmente entre los vectores de expresion de cadena ligera y de cadena pesada, 235 pl de una solucion de CaCb 1 M, y adicion de agua hasta un volumen final de 469 pl. A esta solucion se anadieron 469 pl de HEPES 50 mM, NaCl 280 mM, solucion de Na2HPO41,5 mM a pH 7,05, se mezclo inmediatamente durante 10 segundos y se dejo reposar a temperatura ambiente durante 20 segundos. La suspension se diluyo con 12 ml de DMEM suplementado con FCS al 2%, y se anadio a T75 en lugar del medio existente. Las celulas se incubaron a 37°C, 5% de CO2, durante aproximadamente 17 a 20 horas, despues el medio se sustituyo con 12 ml de DMEM, FCS al 10%. Para la produccion de anticuerpo no modificado "chB-Ly1", las celulas se transfectaron unicamente con vectores de expresion de los anticuerpo pETR1808 y pETR1813 en una proporcion 1:1. Para la produccion del anticuerpo glucomanipulado "chB-LY1-ge", las celulas se cotransfectaron con cuatro plasmidos, dos para la expresion de anticuerpos (pETR1808 y pETR1813), uno para la expresion de polipeptido GnTIII de fusion (pETR1519) y uno para la expresion de manosidasa II (pCLF9) a una proporcion de 4:4:1:1, respectivamente. El dfa 5 despues de la transfeccion, se recolecto el sobrenadante, se centrifugo durante 5 minutos a 1.200 rpm, seguido de una segunda centrifugacion durante 10 minutos a 4.000 rpm y se almaceno a 4°C.
Se purifico chB-Ly1 y chB-Ly1-ge a partir del sobrenadante de cultivo utilizando tres etapas cromatograficas secuenciales, cromatograffa de protema A, cromatograffa de intercambio cationico y una etapa de cromatograffa por exclusion de tamanos en una columna Superdex 200 (Amersham Pharmacia) intercambiando el tampon por solucion salina tamponada con fosfato y recogiendo el pico de anticuerpo monomerico de esta ultima etapa. Se estimo la concentracion de anticuerpo utilizando un espectrofotometro a partir de la absorbancia a 280 nm.
Analisis de oligosacaridos
Los oligosacaridos se liberaron enzimaticamente de los anticuerpos mediante digestion con PNGasaF, encontrandose los anticuerpos inmovilizados sobre una membrana de PVDF o en solucion.
La solucion digerida resultante que contema los oligosacaridos liberados se preparo directamente para el analisis de EM MALDI/TOF o se digirio adicionalmente con glucosidasa EndoH antes de la preparacion de las muestras para el analisis de EM MALDI/TOF.
Metodo de liberacion de oligosacarido para anticuerpos inmovilizados en membrana de PVDF
Se humectaron los pocillos de una placa de 96 pocillos preparada con una membrana de PVDF (Immobilon P, Millipore, Bedford, Massachusetts) con 100 pl de metanol y el lfquido se paso a traves de la membrana de PVDF utilizando vado aplicado al colector de vado Multiscreen (Millipore, Bedford, Massachusetts). Las membranas de PVDF se lavaron tres veces con 300 pl de agua. A continuacion, los pocillos se lavaron con 50 pl de tampon RCM (urea 8 M, Tris 360 mM, EDTA 3,2 mM, pH 8,6). Se cargaron entre 30 y 40 pg de anticuerpo en un pocillo que contema 10 pl de tampon RCM. El lfquido en el pocillo se paso a traves de la membrana mediante la aplicacion de un vado, y la membrana posteriormente se lavo dos veces con 50 pl de tampon RCM. La reduccion de los puentes disulfuro se llevo a cabo mediante la adicion de 50 pl de ditiotreitol 0,1 M en RCM e incubacion a 37°C durante 1 hora.
Tras la reduccion, se aplico un vado para eliminar la solucion de ditiotreitol del pocillo. Los pocillos se lavaron tres veces con 300 pl de agua antes de llevar a cabo la carboximetilacion de los residuos de cistema mediante la adicion de 50 pl de acido yodoacetico 0,1 M en tampon RCM y la incubacion a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 min.
Tras la carboximetilacion, se aspiraron los pocillos con vado y posteriormente se lavaron tres veces con 300 pl de agua. A continuacion, se bloqueo la membrana de PVDF para evitar la adsorcion de la endoglucosidasa, mediante la incubacion de 100 pl de una solucion acuosa al 1% de polivinilpirrolidona 360 a temperatura ambiente durante 1 hora. Seguidamente se elimino el reactivo de bloqueo mediante vado suave seguido de tres lavados con 300 pl de agua.
Los oligosacaridos N-ligados se liberaron mediante la adicion de 2,5 mU de peptido-N-glucosidasa F (N-glicanasa recombinante, GLYKO, Novato, CA) y 0,1 mU de sialidasa (GLYKO, Novato, CA) para eliminar cualquier residuo monosacarido cargado potencial, en un volumen final de 25 pl en NaHCO320 mM, pH 7,0). Se llevo a cabo la digestion durante 3 horas a 37°C.
Metodo de liberacion de oligosacaridos para anticuerpos en solucion
Se mezclaron entre 40 y 50 |jg de anticuerpo con 2,5 mU de PNGasaF (Glyko, U.S.A.) en Tris 2 mM, pH 7,0, en un volumen final de 25 microlitros, y la mezcla se incubo durante 3 horas a 37°C.
Utilizacion de la digestion con endoglucosidasa H de oligosacaridos liberados con PNGasaF para la asignacion de estructuras de oligosacaridos bisectados hfbridos a los picos de oligosacaridos neutros en EM-MALDI/TOF.
Los oligosacaridos liberados con PNGasaF se digirieron posteriormente con endoglucosidasa H (EC 3.2.1.96). Para la digestion con EndoH, se anadieron 15 mU de EndoH (Roche, Suiza) al digerido con PNGasaF (metodo de anticuerpo en solucion, anteriormente), proporcionando un volumen final de 30 microlitros, y la mezcla se incubo durante 3 horas a 37°C. La EndoH corta entre los residuos de N-acetilglucosamina del nucleo quitobiosa de los oligosacaridos N-ligados. El enzima unicamente puede digerir oligomanosa y la mayona de glicanos de tipo hfbrido, mientras que nos oligosacaridos de tipo complejo no resultan hidrolizados.
Preparacion de muestras para EM-MALDI/TOF
Se incubaron los digeridos enzimaticos que conteman los oligosacaridos liberados durante 3 horas adicionales a temperatura ambiente tras la adicion de acido acetico hasta una concentracion final de 150 mM, y posteriormente se pasaron a traves de 0,6 ml de resina de intercambio cationico (resina AG50W-X8, forma hidrogeno, malla 100 a 200, BioRad, Suiza) empaquetada en una columna de cromatograffa micro-bio-spin (BioRad, Suiza) para eliminar los cationes y las protemas. Se aplico un microlitro de la muestra resultante a una placa diana de acero inoxidable y se mezclo en la placa con 1 j l de matriz sDHB. La matriz sDHB se preparo mediante la disolucion de 2 mg de acido 2,5-dihidroxibenzoico mas 0,1 mg de acido 5-metoxisalidlico en 1 ml de etanol/cloruro sodico acuoso 10 mM 1:1 (v/v). Las muestras se secaron al aire, se aplicaron 0,2 j l de etanol y las muestras finalmente se dejaron recristalizar al aire.
EM-MALDI/TOF
El espectrometro de masas MALDI-TOF utilizado para obtener los espectros de masas fue un Voyager Elite (Perspective Biosystems). El instrumento se opero en la configuracion lineal, con una aceleracion de 20 kV y un retardo de 80 ns. Se realizo una calibracion externa con estandares oligosacaridos para la asignacion de masas de los iones. Los espectros de 200 pulsos de laser se sumaron para obtener el espectro final.
Reduccion marcada de las celulas B de sangre completa
Se distribuyeron alfcuotas de 495 j l de sangre heparinizada de un donante sano en tubos de poliestireno de 5 ml; se anadieron 5 j l de muestras de anticuerpo concentradas 100 veces (concentracion final: 1 a 1.000 ng/ml) o de PBS, y los tubos se incubaron a 37°C. Tras 24 horas, se transfirieron 50 j l de sangre a un tubo nuevo y se tineron con anti-CD3-FITC, anti-19-PE y anti-CD45-CyChrome (Becton-Dickinson) durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Antes del analisis, se anadieron 500 j l de tampon FACS (PBS que contema FCS al 2% y EDTA 5 mM) a los tubos. La fluorescencia de CD3-FITC y de CD19-PE de las muestras de sangre se analizo mediante citometna de flujo fijando un umbral en CD45-CyChrome. Se determino la reduccion marcada de las celulas B dibujando un grafico de la proporcion entre celulas B CD19+ y celulas T CD3+.
Union de los anticuerpos anti-CD20 a celulas Raji
Se transfirieron 500.000 en 180 j l de tampon FACS (PBS que contema FCS al 2% y EDTA 5 mM) a 5 ml de tubos de poliestireno y se anadieron 20 j l de muestra de anticuerpo anti-CD20 concentrado 10 veces (concentracion final: 1 a 5.000 ng/ml) o PBS solo, y los tubos se incubaron a 4°C durante 30 minutos. Posteriormente, se lavaron las muestras dos veces con tampon FACS y se peletizaron a 300xg durante 3 minutos. Se separo el sobrenadante mediante aspiracion y se introdujeron las celulas en 100 j l de tampon FACS y 1 j l de fragmentos F(ab')2-FITC espedficos anti-Fc (Jackson Immuno Research Laboratories, USA) y los tubos se incubaron a 4°C durante 30 minutos. Las muestras se lavaron dos veces con tampon FACS y se introdujeron en 500 j l de tampon FACS que contema 0,5 jg/m l de PI para el analisis mediante citometna de flujo. La union se determino dibujando un grafico de la media geometrica de la fluorescencia frente a las concentraciones de anticuerpo.
EJEMPLO 2
Enfoque de aceptor de homologia elevada
Se llevo a cabo una busqueda del marco de anticuerpo aceptor de homologfa elevada mediante el alineamiento de la secuencia de la protema B-Ly1 de raton con una coleccion de secuencias de lmea germinal humana y seleccionando la secuencia humana que mostraba la identidad de secuencia mas elevada. En este analisis se selecciono la secuencia VH1_10 de la base de datos VBase como la secuencia de marco aceptor de cadena pesada, y se selecciono la secuencia VK_2_40 como el marco aceptor para la cadena ligera. En estos dos marcos aceptores se injertaron las tres regiones determinantes de complementariedad (CDR, por sus siglas en ingles) de los dominios variables de cadenas pesada y ligera de raton. Debido a que la region del marco 4 no es parte de la region variable del gen V de la lmea germinal, el alineamiento para esta posicion se realizo individualmente. Se selecciono la region JH4 para la cadena pesada, y se selecciono la region JK4 para la cadena ligera. El modelado molecular del dominio de inmunoglobulina disenado revelo un punto que potencialmente requena los residuos aminoacidos murinos en lugar de los humanos en el exterior de la CDR. La reintroduccion de residuos aminoacidos murinos en el marco humano generana las denominadas retromutaciones. Por ejemplo, el residuo aminoacido aceptor humano en la posicion Kabat 27 se retromuto a un residuo tirosina. Se disenaron variantes de anticuerpo humanizado que inclrnan u omiffan las retromutaciones. La cadena ligera de anticuerpo humanizado no requirio ninguna retromutacion. Tras disenar las secuencias de las protemas, se sintetizaron las secuencias de ADN codificantes de las mismas, tal como se detalla posteriormente.
Enfoque de marco mixto
Con el fin de evitar la introduccion de retromutaciones en posiciones de residuos aminoacidos cnticos (cnticos para conservar una buena afinidad de union a anffgeno o funciones del anticuerpo) del marco aceptor humano, se investigo si podfan sustituirse la region marco 1 completa (FR1) o las regiones marco 1 (FR1) y 2 (FR2) por secuencias de anticuerpo humano que ya presentaban los residuos donantes, o residuos funcionalmente equivalentes, en aquellas posiciones importantes en la secuencia de la lmea germinal humana natural. Con este fin, se alinearon individualmente los marcos 1 y 2 de VH de la secuencia de B-Ly1 de raton con las secuencias de la lmea germinal humana. No resultaba importante la identidad de secuencia mas elevada y no se utilizo para seleccionar los marcos aceptores, sino que, por el contrario, se supuso que resultaba mas importante hacer corresponder varios residuos cnticos. Aquellos residuos cnticos comprendfan los residuos 24, 71 y 94 (numeracion Kabat) y tambien aquellos residuos en las posiciones 27, 28 y 30 (numeracion Kabat), que se encuentran fuera de la definicion de CDR1 segun Kabat, sino que con frecuencia se encuentran implicados en la union de anffgenos. La secuencia IMGT de VH3_3_15 se selecciono como una adecuada. Tras disenar las secuencias de las protemas, se sintetizaron las secuencias de ADN codificantes de las mismas, tal como se detalla posteriormente. Utilizando este enfoque, no resultaron necesarias retromutaciones ni para la cadena ligera ni para la cadena pesada para conservar buenos niveles de union a anffgenos.
Smtesis de los genes de anticuerpo
Tras disenar la secuencia de aminoacidos de la region V del anticuerpo humanizado, debfa generarse la secuencia de ADN. Se encontraron los datos de secuencias de ADN de las regiones marco individuales en las bases de datos de secuencias de lmea germinal humanas. Se obtuvo la secuencia de ADN de las regiones CDR de los datos de ADNc murino correspondiente. Con estas secuencias, se ensamblo virtualmente la secuencia completa de ADN. Con estos datos de secuencia de ADN, se introdujeron sitios de restriccion diagnosticos en la secuencia virtual, mediante la introduccion de mutaciones silenciosas, creando sitios de reconocimiento para las endonucleasas de restriccion. Para obtener la cadena de ADN ffsica, se llevo a cabo la smtesis genica (por ejemplo, Wheeler et al., 1995). En este metodo, se disenaron oligonucleotidos a partir de genes de interes, de manera que, se derivo una serie de oligonucleotidos a partir de la cadena codificante y otra serie a partir de la cadena no codificante. Los extremos 3' y 5' de cada oligonucleotido (excepto el primero y el ultimo en la fila) siempre muestran secuencias complementarias a dos cebadores derivados de la cadena opuesta. Al introducir estos oligonucleotidos en un tampon de reaccion adecuado para cualquier polimerasa termoestable, y anadir Mg2+, dNTPs y una ADN polimerasa, se extendio cada oligonucleotido desde su extremo 3'. El extremo 3' recien formado de un cebador seguidamente se hibrido con el siguiente cebador de la cadena opuesta, y extiende su secuencia adicionalmente bajo condiciones adecuadas para la elongacion de la cadena de ADN dependiente de molde. El producto final se clono en un vector convencional para la propagacion en E. coli.
Produccion de anticuerpos
Se anadieron secuencias-lfder de cadenas pesada y ligera humanas (para la secrecion) cadena arriba de las secuencias de region variable anteriormente indicadas y estas seguidamente se unieron cadena arriba de las secuencias de cadenas pesada y ligera constantes kappa de IgG1 humana, respectivamente, utilizando tecnicas estandares de biologfa molecular. Las secuencias de ADN de cadenas pesada y ligera de anticuerpo completo se subclonaron en vectores de expresion de mairnfero (uno para la cadena ligera y uno para la cadena pesada) bajo el control del promotor MPSV y cadena arriba del sitio poliA sintetico, conteniendo cada vector una secuencia OriP del VEB, tal como se describe en el Ejemplo 1, anteriormente. Se produjeron anticuerpos tal como se ha descrito en el Ejemplo 1, anteriormente, es decir, mediante cotransfeccion de HEK293-EBNA con los vectores de expresion de cadenas pesada y ligera de anticuerpo de m ai^ero, recolectando el medio de cultivo condicionado 5 a 7 dfas despues de la transfeccion y purificando los anticuerpos secretados mediante cromatograffa de afinidad de protema A, seguido de cromatograffa de intercambio cationico y una etapa cromatografica final de exclusion por tamano para aislar los anticuerpos IgG1 monomericos puros. Los anticuerpos se formularon en fosfato sodico 25 mM, cloruro sodico 125 mM, solucion de glicina 100 mM de pH 6,7. Las variantes glucomanipuladas de las variantes de anticuerpo humanizado se produjeron mediante cotransfeccion de los vectores de expresion de anticuerpo conjuntamente con un vector de expresion de glucosiltransferasa GnT-III, o conjuntamente con un vector de expresion GnT-III mas un vector de expresion de manosidasa II del Golgi, tal como se describe para el anticuerpo quimerico en el Ejemplo 1, anteriormente. Se purificaron los anticuerpos glucomanipulados y se formularon tal como se ha descrito anteriormente para los anticuerpos no glucomanipulados. Los oligosacaridos unidos a la region Fc de los anticuerpos se analizaron mediante EM-MALDI/TOF tal como se indica posteriormente.
Analisis de oligosacaridos
Metodo de liberacion de oligosacaridos para anticuerpos en solucion Se mezclaron entre 40 y 50 |jg de anticuerpo con 2,5 mU de PNGasaF (Glyko, U.S.A.) en Tris 2 mM, pH 7,0, en un volumen final de 25 microlitros, y la mezcla se incubo durante 3 horas a 37°C.
Preparacion de muestras para EM-MALDI/TOF
Se incubaron los digeridos enzimaticos que conteman los oligosacaridos liberados durante 3 horas adicionales a temperatura ambiente tras la adicion de acido acetico hasta una concentracion final de 150 mM, y posteriormente se pasaron a traves de 0,6 ml de resina de intercambio cationico (resina AG50W-X8, forma hidrogeno, malla 100 a 200, BioRad, Suiza) empaquetada en una columna de cromatograffa micro-bio-spin (BioRad, Suiza) para eliminar los cationes y las protemas. Se aplico un microlitro de la muestra resultante a una placa diana de acero inoxidable y se mezclo en la placa con 1 j l de matriz sDHB. La matriz sDHB se preparo mediante la disolucion de 2 mg de acido 5-dihidroxibenzoico mas 0,1 mg de acido 5-metoxisalidlico en 1 ml de etanol/cloruro sodico acuoso 10 mM 1:1 (v/v). Las muestras se secaron al aire, se aplicaron 0,2 j l de etanol y las muestras finalmente se dejaron recristalizar al aire.
EM-MALDI/TOF
El espectrometro de masas MALDI-TOF utilizado para obtener los espectros de masas fue un Voyager Elite (Perspective Biosystems). El instrumento se opero en la configuracion lineal, con una aceleracion de 20 kV y un retardo de 80 ns. Se realizo una calibracion externa con estandares oligosacaridos para la asignacion de masas de los iones. Los espectros de 200 pulsos de laser se sumaron para obtener el espectro final.
Ensayo de union de antigenos
Las variantes de anticuerpo humanizado monomerico purificado se sometieron a ensayo para la union a CD20 humano en celulas diana de linfoma de celulas B Raji utilizando un ensayo de tipo citometna de flujo, tal como se ha descrito para el anticuerpo B-Ly1 quimerico en el Ejemplo 1, anteriormente.
Union de glucovariantes de IgG1 monomerico a celulas NK y linea celular CHO que expresa FcvRIIIA
Se aislaron celulas NK humanas a partir de celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) recien aisladas aplicando una seleccion negativa enriqueciendo para las celulas positivas para CD16 y para CD56 (MACS System, Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach/Alemania). La pureza determinada a partir de la expresion de c D56 se encontraba comprendida entre 88% y 95%. Se incubaron en PBS sin iones de calcio ni de magnesio celulas NK recien aisladas (3x105 celulas/ml) durante 20 minutos a 37°C para eliminar las IgG asociadas a celulas NK. Las celulas se incubaron a una densidad de 106 celulas/ml a diferentes concentraciones de anticuerpo anti-CD20 (0, 0,1, 0,3, 1, 3, 10 jg/m l) en PBS, BSA al 0,1%). Tras varios lavados, se detecto la union de anticuerpos mediante incubacion con F(ab')2 conjugado con FITC-IgG espedfica de F(ab')2 antihumano de cabra 1:200 (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA/USA) y CD56 antihumano-PE (BD Biosciences, Allschwil/Suiza). Se anadieron fragmentos F(ab')23G8 anti-FcyRIIIA (Ancell, Bayport, MN/USA) a una concentracion de 10 jg/m l para competir con la union de las glucovariantes de anticuerpo (3 jg/ml). La intensidad de fluorescencia referente a las variantes de anticuerpo unidas se determino para las celulas positivas para CD56 en un FACSCalibur (BD Biosciences, Allschwil/Suiza). Se transfectaron celulas CHO mediante electroporacion (280 V, 950 jF , 0,4 cm) con un vector de expresion codificante de las cadenas a y y de FcyRIIIA-Va1158. Se seleccionaron los transfectantes mediante la adicion de 6 jg/m l de puromicina y los clones estables se analizaron mediante FACS utilizando 10 j l de anticuerpo monoclonal 3G8 anti-FcyRIII conjugado con FITC (BD Biosciences, Allschwil/Suiza) para 106 celulas. La union de IgG1 a celulas CHO expresantes de FcyRIIIA-Val158 se llevo a cabo analogamente a la union de celulas NK tal como se ha indicado anteriormente.
Ensayo de la ADCC
Se utilizaron celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) como celulas efectoras y se prepararon utilizando Histopaque-1077 (Sigma Diagnostics Inc., St. Louis, MO63178, USA) y siguiendo esencialmente las instrucciones del fabricante. Brevemente, se extrajo sangre venosa con jeringas heparinizadas de voluntarios. Se diluyo la sangre 1:0,75-1,3 con PBS (que no contema Ca++ o Mg++) y se aplico en capas sobre Histopaque-1077. Se centrifugo el gradiente a 400xg durante 30 min a temperatura ambiente (TA) sin frenos. Se recolecto la interfase que contema las CMSP y se lavo con PBS (50 ml para celulas de dos gradientes) y se recolectaron mediante centrifugacion a 300xg durante 10 minutos a TA. Tras la resuspension del pellet con PBS, se contaron las CMSP y se lavaron una segunda vez mediante centrifugacion a 200xg durante 10 minutos a TA. A continuacion, se resuspendieron las celulas en el medio apropiado para los procedimientos posteriores.
La proporcion de efector a diana utilizada para los ensayos de ADCC era de 25:1 y de 10:1 para las celulas PBMC y NK, respectivamente. Las celulas efectoras se prepararon en medio AIM-V a la densidad apropiada con el fin de anadir 50 |jl por pocillo de placas de 96 pocillos de fondo redondo. Las celulas diana eran celulas de linfoma B humanas (por ejemplo, celulas Raji) cultivadas en DMEM que contema FCS al 10%. Las celulas diana se lavaron en PBS, se contaron y se resuspendieron en AIM-V a una densidad de 0,3 millones por ml con el fin de anadir 30.000 celulas en 10 j l por micropocillo. Los anticuerpos se diluyeron en AIM-V, se anadieron en 50 j l a las celulas diana presembradas y se dejo que se uniesen a las dianas durante 10 minutos a TA. A continuacion, se anadieron las celulas efectoras y la placa se incubo durante 4 horas a 37°C en una atmosfera humidificada que contema 5% de CO2. Se evaluo la eliminacion de las celulas diana mediante medicion de la liberacion de lactato deshidrogenasa (LDH) de celulas danadas utilizando el kit de deteccion de citotoxicidad (Roche Diagnostics, Rotkreuz, Suiza). Tras la incubacion de 4 horas, las placas se centrifugaron a 800xg. Se transfirieron 100 j l del sobrenadante de cada pocillo a una nueva placa de 96 pocillos de fondo plano transparente. Se anadieron 100 j l de tampon sustrato de color del kit a cada pocillo. Se determinaron los valores de Vmax en un lector de ELISA a 490 nm durante por lo menos 10 minutos utilizando software SOFT max PRO (Molecular Devices, Sunnyvale, CA94089, USA). Se determino la liberacion espontanea de LDH a partir de los pocillos que conteman unicamente diana y celulas efectoras pero no anticuerpos. Se determino la liberacion maxima de pocillos que conteman unicamente celulas diana y T riton X-100 al 1 %. Se calculo el porcentaje de eliminacion mediada por anticuerpos espedficos, de la manera siguiente: ((x-SR)/(MR-SR)*100, en donde x es la media de Vmax a una concentracion de anticuerpo espedfica, SR es la media de la Vmax de la liberacion espontanea y MR es la media de la Vmax de la liberacion maxima.
Ensayo de citotoxicidad dependiente del complemento
Se contaron las celulas diana, se lavaron con PBS, se resuspendieron en AIM-V (Invitrogen) a razon de 1 millon de celulas por ml. Se sembraron 50 j l de celulas por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo plano. Se prepararon diluciones de los anticuerpos en AIM-V y se anadieron en alfcuotas de 50 j l a las celulas. Se dejo que los anticuerpos se uniesen a las celulas durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se descongelo inmediatamente complemento serico humano (Quidel), se diluyo 3 veces con AIM-V y se anadio en alfcuotas de 50 j l a los pocillos. Se preparo complemento de conejo (Cedarlane Laboratories) tal como describe el fabricante, se diluyo 3 veces con AIM-V y se anadio en alfcuotas de 50 j l a los pocillos. Como control, se calentaron fuentes de complemento durante 30 min a 56°C antes de la adicion al ensayo.
Las placas de ensayo se incubaron durante 2 h a 37°C. Se determino la eliminacion de las celulas mediante la medicion de la liberacion de LDH. Brevemente, las placas se centrifugaron a 300xg durante 3 minutos. Se transfirieron 50 j l de sobrenadante por pocillo a una nueva placa de 96 pocillos y se anadieron 50 j l del reactivo de ensayo del kit de citotoxicidad (Roche). Una medicion cinetica con el lector ELISA determino la Vmax correspondiente a la concentracion de LDH en el sobrenadante. Se determino la liberacion maxima mediante incubacion de las celulas en presencia de Triton X-100 al 1%.
Ensayo de reduccion marcada de celulas B de sangre completa
Se llevo a cabo la reduccion marcada de las celulas B normales de sangre completa con los anticuerpos anti-CD20 tal como se ha descrito en el Ejemplo 1, anteriormente.
Ensayo de apoptosis
Se sometio a ensayo la potencia apoptotica de los anticuerpos mediante la incubacion del anticuerpo a una concentracion de 10 jg/m l (condiciones saturantes respecto a la union de antigeno) con las celulas diana (a una concentracion de celulas diana de 5x105 celulas/ml) durante la noche (16 a 24 horas). Las muestras se tineron con AnnV-FITC y se analizaron mediante FACS. El ensayo se realizo por triplicado.
La deteccion se llevo a cabo mediante citometna de flujo mediante el seguimiento de la apariencia de marcadores apoptoticos tales como la anexina V y fosfatidilserina. El control negativo (sin induccion de apoptosis) no contema anticuerpos, sino unicamente solucion salina tamponada con fosfato. El control positivo (apoptosis maxima) contema 5 micromolar del inductor fuerte de apoptosis camptotecina (CPT).
Resultados y comentarios
La comparacion entre la union al antfgeno CD20 humano de las variantes de anticuerpo B-HH1, B-HH2, B-HH3, acomplejadas con la cadena ligera de B-Ly1 quimerico (mVL, tal como se ha descrito en el Ejemplo 1, anteriormente) o con la cadena ligera de B-Ly1 humanizado (KV1), y el anticuerpo chB-ly1 quimerico parental (descrito en el Ejemplo 1, anteriormente) muestra que todos los anticuerpos presentan un valor de EC50 similar, pero que el constructo B-HH1 se une con una intensidad/estequiometna mas baja que las variantes B-HH2 y B-HH3 (figura 11). B-HH1 puede distinguirse de B-HH2 y de B-HH3 por sus regiones c DR1 y CDR2 parcialmente humanas (definicion de Kabat), asf como el polimorfismo Ala/Thr en la posicion 28 (numeracion de Kabat). Esto indica que la posicion 28, la CDR1 completa y/o la CDR2 completa resultan importantes para la interaccion anticuerpo/antfgeno.
La comparacion entre B-HL1, B-HH1 y el anticuerpo parental chB-ly1 quimerico mostro la ausencia de actividad de union en el constructo B-HL1, y aproximadamente la mitad de intensidad/estequiometna de union en comparacion con B-ly1 (figura 12). Tanto B-HL1 como B-HH1 estan disenados basandose en los marcos aceptores derivados de la clase VH1 humana. Entre otras diferencias, la posicion 71 (numeracion Kabat: la posicion 71 de Kabat corresponde a la posicion 72 de la secuencia SEC ID n° 48) del constructo B-HL1 es una diferencia notable, indicando su importancia putativa para la union de antfgenos.
Al comparar los datos de union de antfgeno de las figuras 9 a 13, las variantes BHH2-KV1, BHLB-KV1 y BHL11-KV1 muestran la mejor afinidad de union, entre las diferentes variantes de anticuerpo humanizado sometidas a ensayo, para la CD20 humana sobre la superficie de las celulas humanas. Las diferencias entre B-HH2, por una parte, y B-HL8 y B-HL11, por la otra, se localizan en las regiones FR1 y FR2 unicamente, siendo identicas las tres CDR (comparar, por ejemplo, las SEC ID n° 32, 56 y 60, que no estan numeradas segun Kabat pero la numeracion de Kabat de las cuales puede ser facilmente determinada por el experto ordinario en la materia). B-HL8 y B-HL11 presentan secuencias FR1 y FR2 que se derivan de la clase VH3 humana, mientras que el marco completo de B-HH2 se deriva de la clase VH1 humana. B-HL11 es un derivado de B-HL8 con la unica mutacion Glu1Gln (la posicion 1 es la misma tanto en la numeracion Kabat como en el sistema convencional de numeracion utilizado en el listado de secuencias), mientras que Gln es el residuo aminoacido en el constructo B-HH2. Esto significa que el intercambio Glu1Gln no altera ni la afinidad ni la intensidad de union. Las otras diferencias entre B-HH2 y B-HL8 son 14 residuos del marco, de entre los que uno o mas presentara una influencia sobre el comportamiento de union a antfgeno de este anticuerpo.
El constructo B-HL4 se deriva del anticuerpo B-HH2 mediante la sustitucion del FR1 del B-HH2 por el FR1 de la secuencia VH1_45 de la lmea germinal humana. Este constructo muestra una capacidad de union a antigeno que se ha reducido mucho, a pesar de presentar diferentes aminoacidos en solo tres posiciones dentro del FR1. Estos residuos se encuentran localizados en las posiciones 2, 14 y 30 (numeracion Kabat). De estas, la posicion 30 podna ser una posicion influyente, debido a que es parte de la definicion de Chothia de la CDR1. El analisis global de todas las curvas de union de las figuras 9 a 13 indica que los residuos siguientes de la cadena pesada de B-ly1 humanizado (numeracion Kabat) resultan importantes para la union a CD20: N35 (extremo de CDR1 de Kabat), CDR1 de Kabat completo, CDR2 de Kabat completo y CDR3 de Kabat completo, residuos A71 y R94 (en este caso, R94 no puede sustituirse por una treonina) e Y27. A28 y S30 tambien contribuyen en menor grado. Ademas, la CDR3 de Kabat y todos los residuos canonicos resultan importantes para la union a antfgeno. No se introdujeron retromutaciones en la cadena ligera humanizada, que presentaba las CDR1, CDR2 y CDR3 de Kabat injertadas. Para la induccion de apoptosis (figuras 14, 15 y 21), la variante mas potente era la variante de B-ly1 humana BHH2-KV1 (todavfa mas potente que chB-ly1 original y mucho mas potente que un anticuerpo con una secuencia identica al Rituximab, C2B8). Otras variantes humanizadas (derivados de BHL8) que pueden recuperar la apoptosis incrementada son: B-HL12 a B-HL17 (ver la Tabla) y BHHI (marcos mixtos) y BHH9 ("marcos mixtos" con una retromutacion, S30T). Las posiciones 9 y 48 (numeracion Kabat) pueden entrar en contacto con el antfgeno. Las variantes BHH4 a BHH7 son otras variantes humanizadas de B-ly1 que no introducen secuencias no humanas adicionales.
Son propiedades importantes del anticuerpo B-ly1 humanizado son que es un anticuerpo anti-CD20 de tipo II segun se define en Cragg M.S. y Glennie M.J., Blood 103(7):2738-2743 (abril de 2001). Por lo tanto, no indujo, tras la union a CD20, ninguna resistencia significativa a la extraccion con detergentes no ionicos de CD20 de la superficie de celulas humanas CD20+, utilizando el ensayo descrito para este fin en Polyak M.J. y Deans J.P., Blood 99(9):3256-3262, 2002. Definitivamente indujo significativamente menos resistencia a la extraccion con detergente no ionico de CD20 que del anticuerpo C2B8 (otro anticuerpo anti-CD20 con secuencia identica al Rituximab (ver la publicacion de patente US n° 2003/0003097, de Reff). Tal como se esperaba de un anticuerpo anti-CD20 de tipo II, el B-ly1 humanizado no presentaba ninguna actividad significativa de lisis mediada por el complemento y claramente una actividad de lisis mediada por el complemento mas alta que la del anticuerpo anti-CD20 C2B8 (IgG1 quimerica con secuencia identica al Rituximab). Otra propiedad importante del anticuerpo B-ly1 humanizado era que resultaba muy potente en el ensayo de agregacion homotipica. En este ensayo, se incubaron celulas humanas CD20-positivas, celulas Daudi, en medio de cultivo celular durante hasta 24 horas a 37°C en una atmosfera con 5% de CO2 en un incubador de celulas de mairnfero, tal como se describe en detalle en (referencia de Deans), con el anticuerpo a una concentracion de 1 microgramo por ml y en paralelo a una concentracion de 5 microgramos por ml. A tftulo de comparacion, se realizo una incubacion paralela, de control, de las celulas bajo condiciones identicas, aunque utilizando el anticuerpo anti-CD20 C2B8. En diferentes puntos del tiempo, incluyendo las 8 horas y las 24 horas de incubacion, las celulas se inspeccionaron visualmente utilizando un microscopio. Se encontro que el anticuerpo B-ly1 humanizado conduda a una fuerte agregacion homotipica, con agregados significativamente mas grandes que los inducidos por la adicion del anticuerpo de control C2B8. Ademas, y consistentemente con que el anticuerpo fuese anti-CD20 de tipo II, indujo niveles mas altos de apoptosis al incubar celulas humanas CD20-positivas con el anticuerpo B-ly1 humanizado en comparacion con un control bajo condiciones identicas utilizando el anticuerpo IgG1 quimerico C2B8 con secuencia identica al Rituximab.
Se produjeron variantes glucomanipuladas de los anticuerpos humanizados mediante coexpresion de la glucosiltransferasa GnTIII, conjuntamente con los genes de anticuerpo, en celulas de marnffero. Esto condujo a un incremento de la fraccion de oligosacaridos no fucosilados unidos a la region Fc de los anticuerpos, incluyendo oligosacaridos no fucosilados biantenarios, tal como se ha descrito en la patente WO n° 2004/065540 (figuras 17 a 19). Los anticuerpos glucomanipulados presentaban niveles significativamente mas altos de union a receptores FcyRIII

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Anticuerpo anti-CD20 de tipo II humanizado que comprende:
(a) una region variable de cadena pesada que comprende las CDR de SEC ID n° 16, SEC ID n° 26 y SEC ID n° 28, que opcionalmente comprende una isoleucina en la posicion 34, segun la numeracion de Kabat, en comparacion con el marco de la region variable de cadena pesada de SEC ID n° 32 y
(b) una region variable de cadena ligera que comprende las CDR de SEC ID n° 18, SEC ID n° 19 y SEC ID n° 20
en la que dicho anticuerpo es capaz de competir con el anticuerpo B-Lyl murino para la union a CD20 y que comprende una region Fc humana glucomanipulada, en la que dicha region Fc ha sido glucomanipulada en una celula huesped manipulada para expresar por lo menos una secuencia de acido nucleico codificante de un polipeptido con actividad de p(1,4)-N-acetylglucosaminiltransferasa III, (i) para presentar un menor numero de residuos de fucosa en comparacion con el anticuerpo no glucomanipulado correspondiente,
(ii) para presentar un porcentaje incrementado de oligosacaridos bisectados en la region Fc en comparacion con el anticuerpo no glucomanipulado correspondiente,
(iii) para presentar una afinidad de union a receptor de Fc incrementada en comparacion con el anticuerpo no glucomanipulado, y
(iv) para presentar una funcion efectora incrementada en comparacion con el anticuerpo no glucomanipulado, en la que la funcion efectora incrementada es una induccion de la senalizacion directa incrementada de la apoptosis.
2. Anticuerpo segun la reivindicacion 1, que comprende la region variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID n° 32 y la SEC ID n° 40.
3. Anticuerpo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 que comprende la region variable de cadena ligera de SEC ID n° 76.
4. Celula huesped que produce un anticuerpo anti-CD20 de tipo II humanizado segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, la cual comprende un polinucleotido que comprende una secuencia que presenta una identidad de por lo menos 80% respecto a un polinucleotido codificante de una region variable de cadena pesada segun la reivindicacion 2 y a un polinucleotido codificante de una region variable de cadena ligera segun la reivindicacion 3, o a un vector policistronico que comprende dichos polinucleotidos, y en la que dicha celula huesped se manipula para expresar por lo menos una secuencia de acido nucleico codificante de un polipeptido que presenta actividad de p(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa.
5. Celula huesped segun la reivindicacion 4, en la que dicho polipeptido que presenta actividad de p(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III es un polipeptido de fusion que comprende ademas un dominio de localizacion en Golgi de un polipeptido residente en el Golgi heterologo.
6. Celula huesped segun la reivindicacion 5, en la que dicho dominio de localizacion en el Golgi se selecciona de entre el dominio de localizacion de la manosidasa II, el dominio de localizacion de la p(1,2)-N-acetilglucosaminiltransferasa I, p(1,2)-N-acetilglucosaminiltransferasa II, manosidasa I o a1,6-fucosiltransferasa nuclear.
7. Metodo para producir un anticuerpo anti-CD20 de tipo II humanizado segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, comprendiendo dicho metodo:
(a) cultivar la celula huesped segun cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 en un medio bajo condiciones que permiten la expresion de dicho polinucleotido codificante de dicho anticuerpo, y
(b) recuperar dicho anticuerpo a partir del cultivo resultante.
8. Anticuerpo anti-CD20 de tipo II humanizado, en el que dicho anticuerpo es obtenible a partir de la celula huesped segun cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 o el metodo segun la reivindicacion 7.
9. Composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo segun las reivindicaciones 1 a 3 o 8 y un portador farmaceuticamente aceptable.
10. Composicion farmaceutica que comprende el anticuerpo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o 8 para la utilizacion en un metodo de tratamiento del cancer.
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