ES2809679T3

ES2809679T3 - Moléculas polinucleotídicas para la regulación génica en plantas

Info

Publication number: ES2809679T3
Application number: ES17152830T
Authority: ES
Inventors: Robert D Sammons; Sergey I Ivashuta; Hong Liu; Dafu Wang; Paul C C Feng; Andrei Y Kouranov; Scott E Andersen
Original assignee: Monsanto Technology LLC
Current assignee: Monsanto Technology LLC
Priority date: 2010-03-08
Filing date: 2011-03-08
Publication date: 2021-03-05
Anticipated expiration: 2031-03-08
Also published as: JP5925701B2; KR20130010886A; JP2016182120A; EP2545182A4; US9988634B2; MX2012010479A; CN102822350A; EP3231872A1; EP2545182A1; HUE033056T2; EA029482B1; EA201201264A1; IL221709B; UA115023C2; PH12012501746A1; US9121022B2; US20140057789A1; UY33267A; DK3231872T3; ES2641642T3

Abstract

Un procedimiento para regular la expresión de un gen diana endógeno en plantas en crecimiento, que comprende: aplicar por vía tópica sobre la superficie de dichas plantas en crecimiento: (a) al menos un ARN bicatenario no transcribible que comprende una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en cualquiera de dicho gen diana endógeno o ARN mensajero transcrito a partir de dicho gen diana endógeno; y (b) una cantidad eficaz de un agente químico de transferencia, en el que dicho agente químico de transferencia permite que dicho al menos un ARN bicatenario no transcribible se infiltre al interior de dichas plantas en crecimiento, en el que dicho agente químico de transferencia es un tensioactivo de organosilicona, y mediante lo cual dicho al menos un ARN bicatenario no transcribible regula la expresión de dicho gen diana endógeno.

Description

DESCRIPCIÓN

Moléculas polinucleotídicas para la regulación génica en plantas

Campo de la invención

En el presente documento se desvelan moléculas polinucleotídicas para la regulación de genes en plantas y procedimientos para preparar y utilizar dichas moléculas.

Antecedentes

La ineficacia de los herbicidas para controlar las malezas resistentes es un problema, especialmente cuando dichas malezas crecen en campos de cultivo resistentes a herbicidas que pueden tener una resistencia a herbicidas más baja que la maleza. Las malezas resistentes a herbicidas se identifican por una variedad de modos de acción. La resistencia resultante de la selección de múltiples copias de genes que producen proteínas dirigidas al herbicida en amaranto se describe en Gaines y col. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 107(3):1029-1034. La resistencia resultante de mutaciones en genes que producen proteínas dirigidas a herbicidas en amor de hortelano, lechuga espinaca y raigrás se describe en Baerson y col. (2002) Plant Physiol., 129(3):1265-1275; Preston y col. (2006) Pesticide Biochem. Physiol., 84(3):227-235; y Wakelin y col. (2006) Weed Res. (Oxford), 46(5):432-440. El secuestro vacuolar del glifosato es un mecanismo que se observa en la hierba de caballo resistente al glifosato; véase Ge y col. (2010) Pest Management Sci., 66:576-576. La resistencia resultante de la expresión de enzimas que metabolizan herbicidas en una forma química inactiva en garranchuelos se describe en Hidayat y col. (1997) Pesticide Biochem. Physiol., 57(2):137-146. Reddy y col. (2008) J. Agric. Food Chem., 56(6):2125-2130 describieron la acumulación de ácido aminometilfosfónico en especies vegetales tratadas con glifosato. Kusaba et al., (2004) Curr Opin Biotechnol., 15: 139-143 informaron sobre el uso del ARNi como una herramienta para analizar la función génica y mejora de las plantas. Sin embargo, el único procedimiento para introducir ARN inhibidor en las plantas es el bombardeo de partículas. En el documento WO 03/004649 se describen procedimientos para degradar ARN vírico en células vegetales aplicando ARNbc con suficiente similitud de secuencia con el ARN vírico. El procedimiento descrito para introducir ARNbc en las células vegetales utiliza como abrasivo carburo de silicio (carborundo), un agente físico, y se aplica presión sobre la superficie foliar utilizando el inóculo y el abrasivo.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona moléculas polinucleotídicas y procedimientos para regular genes en plantas, por ejemplo, proporcionando ARN para la regulación sistémica de genes. Varios aspectos de la invención proporcionan moléculas polinucleotídicas y procedimientos para regular genes y transgenes endógenos en una célula vegetal y moléculas polinucleotídicas. Los polinucleótidos, composiciones y procedimientos divulgados en el presente documento son útiles para regular genes endógenos de una plaga o patógeno vegetal. En un aspecto de la invención, el método para regular la expresión de un gen diana endógeno en plantas en crecimiento comprende la aplicación tópica en la superficie de las plantas en crecimiento de: (a) al menos un polinucleótido de ARN bicatenario no transcribible que comprende una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en cualquiera de dicho gen diana endógeno o ARN mensajero transcrito a partir de dicho gen diana endógeno; y (b) una cantidad eficaz de un agente químico de transferencia, en el que dicho agente químico de transferencia permite que dicho al menos un polinucleótido de ARN bicatenario no transcribible se infiltre al interior de dichas plantas en crecimiento, en el que dicho agente químico de transferencia es un tensioactivo de organosilicona, y mediante lo cual dicho al menos un polinucleótido de ARN bicatenario no transcribible regula la expresión de dicho gen diana endógeno.

Las composiciones de esta invención comprenden: (a) una solución de polinucleótidos de ARN bicatenario no transcribible que comprende una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir de dicho gen endógeno; en el que dichos polinucleótidos de ARN bicatenario no transcribible son capaces de hibridar en condiciones fisiológicas en células de dicha planta con dicho gen endógeno o con dicho ARN transcrito a partir de dicho gen endógeno para efectuar el silenciamiento de dicho gen endógeno; y (b) un agente químico de transferencia eficaz para facilitar la transferencia de dichos polipéptidos de ARN bicatenario no transcribible desde la superficie exterior de dicha planta al interior de las células de dicha planta, en el que dicho agente químico de transferencia es un tensioactivo de organosilicona.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 presenta la SEQ ID NO:1, una secuencia de nucleótidos que codifica la EPSPS de palmera amaranto.

10) La Figura 2 presenta la SEQ ID NO:3 que es una secuencia de nucleótidos de un gen Pol III sintetizado.

11) La Figura 3 ilustra la morbilidad de las plantas de palmera amaranto tratadas con un ARNbc. La Figura 3A muestra las plantas 7 días después del tratamiento con glifosato. La Figura 3B muestra plantas tratadas con tensioactivo que se trataron con la solución de ARNbc largo y posteriormente con tratamiento con glifosato después de 72 horas. La Figura 3C muestra plantas tratadas con tensioactivo que se trataron con la solución de ARNbc corto y posteriormente con tratamiento con glifosato después de 72 horas.

12) La Figura 4 ilustra la decoloración en plantas de Nicotiana benthamiana tratadas con una composición de ARNbc.

13) La Figura 5 presenta la SEQ ID NO:2 que es una secuencia de nucleótidos de una fitoeno desaturasa de Nicotiana benthamiana.

14) La Figura 6 ilustra oligonucleótidos de ADNmc antisentido marcados con Alexa Flúor 488 en 5' (SEQ ID NO:15) que se infiltran en hojas de palmera amaranto resistente a glifosato tal como se describe en el Ejemplo 9.

15) La Figura 7 muestra los resultados de ARNm de EPSPS medidos en hojas de palmera amaranto resistente a glifosato tratadas con oligonucleótidos de ADNmc antisentido para EPSPS tal como se describe en el Ejemplo 9. Las barras representan experimentos repetidos para cada uno de los tratamientos N.° 1 - N.° 4 (indicados por los números dentro de los círculos y en referencia a la Tabla 2) y para controles (hojas infiltradas con oligonucleótidos de ADNmc antisentido para una proteína de semilla de cebada, SEQ ID NO:14, tratadas con y sin glifosato).

16) La Figura 8 muestra los resultados de la proteína EPSPS medidos en hojas de palmera amaranto resistente a glifosato tratadas por vía tópica con oligonucleótidos de ADNmc antisentido para EPSPS, tal como se describe en el Ejemplo 9 ; los tratamientos se indican mediante los números dentro de los círculos y en referencia a la Tabla 2.

17) La Figura 9 muestra los resultados de la acumulación de shikimato medida en hojas de palmera amaranto resistente a glifosato tratadas con oligonucleótidos de ADNmc antisentido para EPSPS en dos experimentos, tal como se describe en el Ejemplo 9; los tratamientos se indican mediante los números dentro de los círculos y en referencia a la Tabla 2.

18) La Figura 10 muestra la secuencia de nucleótidos de una fitoeno desaturasa de Nicotiana benthamiana (SEQ ID NO:2).

19) La Figura 11 representa esquemáticamente la ubicación de las secuencias de los oligonucleótidos y polinucleótidos sometidos a ensayo (véase la Tabla 3) en relación con la secuencia de la fitoeno sintasa (SEQ ID NO:16) tal como se describe en el Ejemplo 10.

20) La Figura 12A ilustra la decoloración apical de las hojas de plantas de Nicotiana benthamiana tratadas por vía tópica con tampón (“Control”), con un polinucleótido de ARNbc de 200 unidades monoméricas (meros) con una secuencia de ARN que corresponde al segmento que consiste en los nucleótidos 914 -1113 de la SEQ ID NO:2 (“ARNbc de 200 nt”), y una combinación de oligonucleótidos y polinucleótidos de ADN monocatenario (SEQ ID NO:16, 17, 20, 21, 24, 25 y 26) (“oligos de ADNmc”) tal como se describe en el Ejemplo 10. La Figura 12B ilustra los resultados de un análisis de transferencia Northern de ARN aislado de plantas de Nicotiana benthamiana tratadas con tampón (control), con el polinucleótido de ARNbc de 200 meros y con los oligonucleótidos de ADNmc. También se muestra ARN aislado de plantas que se sometieron a estrés manteniéndolas a 4 grados Celsius y en la oscuridad durante toda la noche antes del tratamiento con los polinucleótidos de ARNbc de 200 meros.

21) La Figura 13 ilustra la decoloración apical de las hojas de plantas de Nicotiana benthamiana tratadas por vía tópica por duplicado con varias combinaciones de polinucleótidos u oligonucleótidos (los números se refieren a los tratamientos enumerados en la Tabla 4) tal como se describe en el Ejemplo 10. Las plantas de control (Tratamiento 13 en la Tabla 4) no se muestran.

22) La Figura 14 ilustra la decoloración apical de las hojas de plantas de Nicotiana benthamiana tratadas por vía tópica con los polinucleótidos indicados en la Tabla 5 tal como se describe en el Ejemplo 10.

23) La Figura 15 ilustra la decoloración apical de las hojas observada en plantas de Nicotiana benthamiana después del tratamiento tópico con el ADNmc antisentido de 21 meros de PDS (SEQ ID NO:34, “PDS antisentido de 21 nt”) o con oligonucleótidos de 22 meros antisentido de PDS sometidos anteriormente a ensayo sin un promotor T7 (SEQ ID NO:22 y 23) (“PDS antisentido”). No se observó o apenas se observó decoloración apical en las hojas después del tratamiento tópico solo con tampón o después del tratamiento tópico con ADNmc sentido de 21 meros de PDS (SEQ ID NO:36, “PDS sentido de 21 nt”) tal como se describe en el Ejemplo 10.

24) La Figura 16 ilustra una alineación de las secuencias de ADN de PDS de palmera amaranto y Nicotiana benthamiana que muestran una identidad de aproximadamente 71% (1252/1762) tal como se describe en el Ejemplo 11.

25) La Figura 17 ilustra la decoloración apical de las hojas observada en plantas de palmera amaranto tratadas por vía tópica con ARNbc de PDS de palmera de 678 pb o 198 pb pero no en plantas de palmera amaranto tratadas por vía tópica con un ARNbc del gen del gusano de la raíz de maíz de 260 pares de bases, tal como se describe en el Ejemplo 11.

26) La Figura 18A ilustra la decoloración apical en hojas, tallos y flores de plantas de Nicotiana benthamiana tratadas por vía tópica primero con una solución de tensioactivo y después con un oligonucleótido de ADNmc de PDS para inducir el silenciamiento sistémico de la fitoeno desaturasa, tal como se describe en el Ejemplo 12. La Figura 18B ilustra la decoloración apical en hojas, tallos y flores de plantas de Nicotiana benthamiana tratadas por vía tópica con un oligonucleótido de ADNmc de PDS para inducir el silenciamiento sistémico de la fitoeno desaturasa, con o sin acondicionamiento con una solución de tensioactivo, tal como se describe en el Ejemplo 12.

27) La Figura 19 ilustra resultados de ensayos en diferentes líneas de palmera amaranto resistentes a glifosato (3 plantas por repetición) tratadas con las condiciones indicadas en la Tabla 6 , tal como se describe en el Ejemplo 13. Las fotografías se tomaron 7 días después del tratamiento con glifosato (experimentos 1 - 6) o 9 días después del tratamiento con glifosato (experimentos 7 - 9).

28) La Figura 20 ilustra la ubicación de dos ARN pequeños identificados como abundantes en las plantas de palmera amaranto tratadas con ARNbc de EPSPS y que se muestran como nucleótidos en cursiva subrayados en las posiciones 564-588 y 743 - 767 de EPSPS de longitud completa (SEQ ID NO:40), tal como se describe en el Ejemplo 14. La secuencia de EPSPS también muestra la ubicación de las cuatro moléculas oligonucleotídicas de ARNbc de EPSPS de tamaño “corto” (texto subrayado, sin cursiva) y los tres polinucleótidos de ARN bicatenario “largos” (texto en negrita, tal como se describe en el Ejemplo 1).

29) La Figura 21A ilustra los resultados del tratamiento de las plantas de palmera amaranto con tensioactivo y posteriormente con ARNbc a una de tres cantidades de aplicación y posteriormente con herbicida, tal como se describe en el Ejemplo 17. La Figura 21B ilustra los resultados del ensayo 1 llevado a cabo con palmera amaranto resistente a glifosato cultivadas a partir de semillas recogidas en el campo, tal como se describe en el Ejemplo 17; las plantas se muestran a los 8 y 30 días después del tratamiento con herbicida.

30) La Figura 22 ilustra los resultados obtenidos con el tratamiento de palmera amaranto con tensioactivo de amina de sebo y sulfato de amonio o con reactivos de transfección, tal como se describe en el Ejemplo 18.

31) La Figura 23 ilustra los resultados de tratar plantas de palmera amaranto resistentes a glifosato con ARNbc de EPSPS o híbridos de ADN/ARN de EPSPS, tal como se describe en el Ejemplo 19.

32) La Figura 24 ilustra los resultados de tratar plantas de palmera amaranto resistentes a glifosato con ARNbc de EPSPS o polinucleótidos de ADNmc de EPSPS, tal como se describe en el Ejemplo 20. La fotografía superior se tomó 8 días después de la pulverización del herbicida y la gráfica inferior (de barras) presenta los resultados puntuados como una lesión por glifosato (GI, glyphosate injury) 8 días después de la pulverización del herbicida.

33) La Figura 25A ilustra doce polinucleótidos de ARNbc correspondientes a segmentos de ADN de aproximadamente 250 pb, cubriendo cada uno de ellos, con una disposición en mosaico (tiling), la secuencia codificante completa y parte de las regiones 5' y 3' no traducidas del gen EPSPS de la Palmera, tal como se describe en el Ejemplo 21; las cuatro moléculas oligonucleotídicas de ARNbc de EPSPS de tamaño “corto”, tal como se describe en el Ejemplo 1 y en la Figura 1, están ubicadas en los segmentos 2, 3, 4 y 8 dispuestos en mosaico, respectivamente, y se muestran como barras gris claro dentro de dichos segmentos. La Figura 25B y la Figura 25C ilustran los resultados del tratamiento de plantas de palmera amaranto resistentes a glifosato con ARNbc diseñado a partir de estos segmentos dispuestos en mosaico o con las cuatro moléculas de ARNbc “cortas” o con tampón.

34) La Figura 26 ilustra los resultados del tratamiento de plantas de palmera amaranto resistentes a glifosato con glifosato y posteriormente con pulverización de Silwet L-77 al 1% y posterior aplicación de ARNbc de EPSPS en tampón que contenía 2 % de sulfato de amonio, tal como se describe en el Ejemplo 22. Las plantas de control sin tratamiento (“ST”) se trataron solamente con pulverización de Silwet L-77 al 1% pero no con herbicida ni ARNbc. Las plantas se fotografiaron y se clasificaron 16 días después del tratamiento.

35) La Figura 27 ilustra los resultados del tratamiento de una población de campo de palmera amaranto resistente a glifosato con gran cantidad de copias con una composición que contenía una cantidad de 20X o 100X de polinucleótidos de ARNbc de EPSPS, tensioactivo, sulfato de amonio y herbicida o con una composición que contenía tensioactivo, sulfato de amonio y herbicida, tal como se describe en el Ejemplo 23. Para cada tratamiento, se trataron dos parcelas duplicadas de 1 pie por 5 pies.

36) La Figura 28 representa la evolución de la decoloración y muerte de las plantas de lechuga tratadas con 1 nanomol de ADNmc por planta (de arriba a abajo) 37, 46 y 60 días después del tratamiento, tal como se describe en el Ejemplo 24.

37) La Figura 29A ilustra el silenciamiento sistémico en plantas de lechuga que se pone de manifiesto por la decoloración observada 4 o 12 días después del tratamiento tópico con polinucleótidos, tal como se describe en el Ejemplo 24. La Figura 29B muestra el silenciamiento sistémico que se pone de manifiesto por la decoloración observada 4 días después del tratamiento tópico con los cuatro ADNmc antisentido individuales (“HL287”, SEQ ID NO:43; “HL288”, SEQ ID NO:44; “HL289”, SEQ ID NO:45; y “HL290”, SEQ ID NO:46) o con una mezcla de los cuatro.

38) La Figura 30 ilustra la decoloración de hojas (panel superior derecho) y flores (panel central derecho) de plantas de tomate tratadas con polinucleótidos de fitoeno desaturasa de tomate, tal como se describe en el Ejemplo 25. La Figura 30 también ilustra el retraso en el crecimiento de las plantas de tomate tratadas con polinucleótidos de PDS (panel inferior).

39) La Figura 31 ilustra la mejora de la actividad herbicida del glifosato en palmera amaranto con poca cantidad de copias de los polinucleótidos de EPSPS mediante polinucleótidos de TIF y que los polinucleótidos de TIF tienen actividad herbicida propia, tal como se describe en el Ejemplo 26. Los polinucleótidos de EPSPS “1, 3, 4” se refieren a ARNbc “cortos” que tienen una cadena antisentido que es capaz de hibridar con el ARNm transcrito a partir del gen EPSPS de palmera amaranto (SEQ ID NO:1) en las posiciones 14-38 (ARNbc-1 corto), 345-369 (ARNbc-3 corto) y 1105-1129 (ARNbc-4 corto), respectivamente, tal como se indica mediante los nucleótidos subrayados en la Figura 1 (véase el Ejemplo 1). EPSPS “5” se refiere a IDT [5] (SEQ ID NO:91-92, tal como se describe en la Tabla 11).

40) La Figura 32 ilustra la mejora de la actividad herbicida del glifosato en palmera amaranto con gran cantidad de copias de los polinucleótidos de EPSPS mediante polinucleótidos de TIF y que los polinucleótidos de TIF tienen actividad herbicida propia, tal como se describe en el Ejemplo 26. Los polinucleótidos de EPSPS “1, 3, 4” se refieren a ARNbc “cortos” que tienen una cadena antisentido que es capaz de hibridar con el ARNm transcrito a partir del gen EPSPS de palmera amaranto (SEQ ID NO:1) en las posiciones 14-38 (ARNbc-1 corto), 345-369 (ARNbc-3 corto) y 1105-1129 (ARNbc-4 corto), respectivamente, tal como se indica mediante los nucleótidos subrayados en la Figura 1 (véase el Ejemplo 1). EPSPS “5” se refiere a IDT [5] (SEQ ID NO:91-92, tal como se describe en la Tabla 11).

41) La Figura 33 ilustra el efecto herbicida sobre la palmera amaranto después del tratamiento con las combinaciones indicadas de herbicidas no polinucleotídicos y polinucleótidos, tal como se describe en el Ejemplo 28.

42) La Figura 34 ilustra una alineación del promotor del locus 1 de PDS (SEQ ID NO:319) y del promotor del locus 2 de PDS (SEQ ID NO:320) de Nicotiana benthamiana, tal como se describe en el Ejemplo 30.

43) La Figura 35 ilustra esquemáticamente los promotores del locus 1 y locus 2 de p Ds de Nicotiana benthamiana y las regiones a las que se dirigen las mezclas de polinucleótidos, tal como se describe en el Ejemplo 30.

44) La Figura 36 ilustra el efecto sobre la altura de la planta en plantas de Nicotiana benthamiana tratadas con un polinucleótido antisentido de PDS (Figura 36A), con polinucleótidos antisentido de EPSPS (Figura 36B) o con polinucleótidos antisentido de RuBisCO (Figura 36C), tal como se describe en el Ejemplo 33.

45) La Figura 37 ilustra el efecto sobre plantas monocotiledóneas de Zea mays (Gaspe), mediante tratamiento tópico con polinucleótidos de ARNbc (“oligo de ADN de EPSPS”) dirigidos al gen EPSPS endógeno o con tampón solo como control, tal como se describe en el Ejemplo 34.

46) La Figura 38 ilustra el efecto de la variación de los contraiones de glifosato sobre la actividad herbicida en plantas de palmera amaranto resistentes a glifosato, tal como se describe en el Ejemplo 35.

47) La Figura 39 ilustra el efecto de las poliaminas espermina (“SPM”) y espermidina (“SPMD”) o del sulfato de amonio (“AMS”) en palmera amaranto resistente a glifosato que contiene 33, 36 o 57 copias de EPSPS, tal como se describe en el Ejemplo 35. “fb 4X WM” significa “con posterior tratamiento con glifosato (3360 g de equivalente ácido por hectárea de herbicida de la marca Roundup® WeatherMAX®)”.

Descripción detallada de la invención

48) A menos que se indique lo contrario, las secuencias de ácido nucleico en el texto de esta memoria descriptiva se proporcionan, cuando se leen de izquierda a derecha, en la dirección 5' a 3'. Las secuencias de ácido nucleico pueden proporcionarse como ADN o como ARN, según se especifique; la divulgación de una necesariamente define a la otra, tal como sabe un experto en la técnica. Cuando un término se proporciona en singular, los inventores también contemplan aspectos de la invención descritos por el plural de dicho término. Polinucleótidos “no transcribibles” significa que los polinucleótidos no comprenden una unidad de transcripción de polimerasa II completa. Tal como se usa en el presente documento, “solución” se refiere a mezclas homogéneas y mezclas no homogéneas tales como suspensiones, coloides, micelas y emulsiones.

Polinucleótidos

49) Tal como se usa en el presente documento, “polinucleótido” se refiere a una molécula de ácido nucleico que contiene múltiples nucleótidos y generalmente se refiere a “oligonucleótidos” (una molécula polinucleotídica de 18-25 nucleótidos de longitud) y polinucleótidos de 26 o más nucleótidos. Las realizaciones de esta invención incluyen composiciones que incluyen oligonucleótidos que tienen una longitud de 18-25 nucleótidos (por ejemplo, 18 meros, 19 meros, 20 meros, 21 meros, 22 meros, 23 meros, 24 meros o 25 meros) o polinucleótidos de longitud media que tienen una longitud de 26 o más nucleótidos (por ejemplo, polinucleótidos de 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, aproximadamente 65, aproximadamente 70, aproximadamente 75, aproximadamente 80, aproximadamente 85, aproximadamente 90, aproximadamente 95, aproximadamente 100, aproximadamente 110, aproximadamente 120, aproximadamente 130, aproximadamente 140, aproximadamente 150, aproximadamente 160, aproximadamente 170, aproximadamente 180, aproximadamente 190, aproximadamente 200, aproximadamente 210, aproximadamente 220, aproximadamente 230, aproximadamente 240, aproximadamente 250, aproximadamente 260, aproximadamente 270, aproximadamente 280, aproximadamente 290 o aproximadamente 300 nucleótidos) o polinucleótidos largos que tienen una longitud mayor que aproximadamente 300 nucleótidos (por ejemplo, polinucleótidos de entre aproximadamente 300 a aproximadamente 400 nucleótidos, entre aproximadamente 400 a aproximadamente 500 nucleótidos, entre aproximadamente 500 a aproximadamente 600 nucleótidos, entre aproximadamente 600 a aproximadamente 700 nucleótidos, entre aproximadamente 700 a aproximadamente 800 nucleótidos, entre aproximadamente 800 a aproximadamente 900 nucleótidos, entre aproximadamente 900 a aproximadamente 1000 nucleótidos, entre aproximadamente 300 a aproximadamente 500 nucleótidos, entre aproximadamente 300 a aproximadamente 600 nucleótidos, entre aproximadamente 300 a aproximadamente 700 nucleótidos, entre aproximadamente 300 a aproximadamente 800 nucleótidos, entre aproximadamente 300 a aproximadamente 900 nucleótidos o aproximadamente 1000 nucleótidos de longitud, o incluso mayores que aproximadamente 1000 nucleótidos de longitud, por ejemplo hasta la longitud completa de un gen diana incluidas las porciones codificantes o no codificantes o las porciones tanto codificantes como no codificantes del gen diana). Cuando un polinucleótido es bicatenario, su longitud puede describirse de forma similar en términos de pares de bases.

51) Los polinucleótidos son ARN bicatenario.

Sin pretender vincularse a ningún mecanismo, se cree que dichos polinucleótidos son, o producirán, ARN monocatenario con al menos un segmento que se hibridará en condiciones fisiológicas en una célula con ARN transcrito del gen objeto de la supresión.

52) En algunas realizaciones, las composiciones de polinucleótidos se formulan con contraiones u otras moléculas que se sabe que se asocian con moléculas de ácido nucleico, por ejemplo, iones de tetraalquilamonio, iones de trialquilamonio, iones de sulfonio, iones de litio y poliaminas tales como espermina, espermidina o putrescina. En algunas realizaciones, las composiciones de polinucleótidos se formulan con un herbicida no polinucleotídico (por ejemplo, los herbicidas químicos desvelados en el presente documento en la sección titulada “Proteínas de tolerancia a herbicidas”) o con un agente de transferencia o agente que potencia la permeabilidad (véase la sección titulada “Agentes y Tratamientos para potenciar la permeabilidad”).

53) Los polinucleótidos se diseñan para inducir la regulación o supresión sistémica de un gen endógeno en una planta y se diseñan para tener una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a la secuencia (que puede ser una secuencia codificante o una secuencia no codificante) de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir de un gen endógeno de una planta. “Esencialmente idéntica” o “esencialmente complementaria” significa que los polinucleótidos (o al menos una cadena de un polinucleótido bicatenario) están diseñados para hibridar en condiciones fisiológicas en células de la planta con el gen endógeno o con ARN transcrito a partir del gen endógeno para producir la regulación o supresión del gen endógeno.

56) Normalmente, los polinucleótidos útiles en esta invención, efectúan la regulación o modulación (por ejemplo, supresión) de la expresión génica durante un período a lo largo de la vida de la planta tratada de al menos 1 semana, o un periodo más prolongado, y normalmente de forma sistémica. Por ejemplo, a los pocos días de tratar a una hoja de planta con una composición de polinucleótidos de esta invención, se pueden detectar ARNip primarios y transitivos en otras hojas laterales y por encima de la hoja tratada y en tejido apical.

57) En la técnica se conocen procedimientos para preparar polinucleótidos. La preparación comercial de oligonucleótidos a menudo proporciona 2 desoxirribonucleótidos en el extremo 3' de la cadena sentido. Las moléculas polinucleotídicas largas pueden sintetizarse a partir de kits disponibles en el mercado, por ejemplo, los kits de Ambion tienen ADN ligado en el extremo 5' que codifica un promotor de polimerasa T7 bacteriano que fabrica cadenas de ARN que pueden ensamblarse en un ARNbc. Alternativamente, se pueden producir moléculas de ADNbc a partir de casetes de expresión en células bacterianas que tienen actividad enzimática de RNasa III regulada o deficiente. Las moléculas polinucleotídicas largas también pueden ensamblarse a partir de múltiples fragmentos de ARN o ADN. En algunas realizaciones se utilizan parámetros de diseño, tales como la puntuación de Reynolds y las reglas de Tuschl conocidas en la técnica para seleccionar secuencias de polinucleótidos eficaces para el silenciamiento génico. En algunas realizaciones, se utiliza el diseño aleatorio o la selección empírica de secuencias de polinucleótidos para seleccionar las secuencias de polinucleótidos eficaces para el silenciamiento génico. En algunas realizaciones la secuencia de un polinucleótido se explora contra el ADN genómico de la planta prevista para minimizar el silenciamiento accidental de otros genes.

58) Las composiciones de polinucleótidos de esta invención son útiles en composiciones, tales como soluciones de moléculas polinucleotídicas, a concentraciones bajas, solas o en combinación con otros componentes (por ejemplo, tensioactivos, sales y herbicidas no polinucleotídicos) en la misma solución o en soluciones aplicadas por separado. Aunque no existe un límite superior en las concentraciones y dosificaciones de moléculas polinucleotídicas que pueden ser útiles en los procedimientos de esta invención, en general se buscará la eficacia de las concentraciones y dosificaciones eficaces más bajas. Las concentraciones pueden ajustarse teniendo en cuenta el volumen de pulverización aplicado sobre las hojas de las plantas. En una realización, un tratamiento útil para plantas herbáceas utilizando moléculas de oligonucleótidos de 25 meros es de aproximadamente 1 nanomol de moléculas de oligonucleótido por planta, por ejemplo, de aproximadamente 0,05 a 1 nanomol por planta. Otras realizaciones para plantas herbáceas incluyen intervalos útiles de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 100 nanomoles o de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 20 nanomoles o de aproximadamente 1 nanomol a aproximadamente 10 nanomoles de polinucleótidos por planta. Las plantas, árboles o viñas muy grandes pueden requerir, en consecuencia, cantidades mayores de polinucleótidos. Cuando se utilizan moléculas de ARNbc largas que pueden procesarse en múltiples oligonucleótidos, se pueden usar concentraciones más bajas. En los ejemplos más adelante para ilustrar realizaciones de la invención, cuando el factor 1X se aplica a moléculas de oligonucleótido se usa arbitrariamente para indicar un tratamiento de 0,8 nanomoles de molécula polinucleotídica por planta; 10X, 8 nanomoles de molécula polinucleotídica por planta; y 100X, 80 nanomoles de molécula de polinucleótido por planta. Por ejemplo, en el ejemplo 23, las plantas se trataron con una solución acuosa que comprende un tratamiento de 100X de ARNbc de EPSPS (264 microgramos u 80 nanomoles) por planta.

Moléculas de ARN monocatenario

59) Las moléculas polinucleotídicas para proporcionar ARN monocatenario pueden proporcionar una regulación sistémica de los genes en una célula vegetal. Más específicamente, la invención también proporciona composiciones y procedimientos para inducir la regulación sistémica (por ejemplo, supresión o silenciamiento sistémico) de un gen diana en una planta mediante las aplicación tópica en la planta de una molécula polinucleotídica con un segmento en una secuencia de nucleótidos esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en el gen diana o el ARN transcrito a partir del gen diana, mediante lo cual la composición se infiltra al interior de la planta e induce la regulación sistémica del gen diana mediante la acción de ARN monocatenario que hibrida con el ARN transcrito, por ejemplo, ARN mensajero. La molécula polinucleotídica puede ser una o más moléculas polinucleotídicas con uno solo segmento de este tipo, múltiples segmentos de este tipo, múltiples segmentos diferentes de este tipo o una combinación de los mismos.

Agentes de transferencia, agentes y tratamientos para potenciar la permeabilidad

60) Las composiciones y procedimientos de esta invención comprenden agentes de transferencia o agentes y tratamientos para potenciar la permeabilidad para acondicionar la superficie del tejido vegetal, por ejemplo, hojas, tallos, raíces, flores o frutas, para la infiltración de las moléculas polinucleotídicas en las células vegetales. La transferencia de polinucleótidos en células vegetales puede facilitarse mediante la aplicación previa o simultánea de un agente de transferencia de polinucleótidos en el tejido vegetal. En algunas realizaciones el agente de transferencia se aplica posteriormente a la aplicación de la composición de polinucleótidos. El agente de transferencia de polinucleótidos posibilita una vía para los polinucleótidos a través de las barreras de cera de la cutícula, estomas y/o pared celular o barreras membranosas y al interior de las células vegetales. Los agentes adecuados para facilitar la transferencia de la composición a una célula vegetal incluyen agentes que aumentan la permeabilidad del exterior de la planta o que aumentan la permeabilidad de las células vegetales para oligonucleótidos o polinucleótidos. Dichos agentes para facilitar la transferencia de la composición a una célula vegetal incluyen un agente químico. Los agentes químicos para acondicionamiento incluyen tensioactivos de organosilicona. Las realizaciones del procedimiento opcionalmente pueden incluir una etapa de incubación, una etapa de neutralización (por ejemplo, para neutralizar un ácido, base o agente de oxidación o para desactivar una enzima), una etapa de aclarado o combinaciones de estas. Las realizaciones de agentes o tratamientos para acondicionar una planta para la infiltración de polinucleótidos incluyen emulsiones, emulsiones inversas, liposomas y otras composiciones similares a micelas. Las realizaciones de agentes o tratamientos para acondicionar una planta para la infiltración de polinucleótidos incluyen contraiones u otras moléculas que se sabe que se asocian con moléculas de ácido nucleico, por ejemplo, iones de amonio inorgánico, iones de alquilamonio, iones de litio, poliaminas tales como espermina, espermidina o putrescina y otros cationes. Los disolventes orgánicos útiles para acondicionar una planta para la infiltración de polinucleótidos incluyen DMSO, DMF, piridina, /V-pirrolidina, hexametilfosforamida, acetonitrilo, dioxano, polipropilenglicol, otros disolventes miscibles con agua o que disolverán fosfonucleótidos en sistemas no acuosos (tales como los que se utilizan en reacciones sintéticas). Se pueden utilizar aceites de origen natural o sintéticos con o sin tensioactivos o emulsionantes, por ejemplo, se pueden utilizar aceites de origen vegetal, aceites de cultivo (tales como los enumerados en el 9o Compendio de Adyuvantes de Herbicidas, disponibles públicamente en línea en www.herbicide.adjuvants.com), por ejemplo, aceites parafínicos, ésteres de ácidos grasos de poliol o aceites con moléculas de cadena corta modificadas con amidas o poliaminas tales como polietilenimina o V-pirrolidina.

61) Dichos agentes para acondicionar una planta para la infiltración de polinucleótidos se aplican a la planta mediante cualquier procedimiento conveniente, por ejemplo, pulverización o revestimiento con un polvo, emulsión, suspensión o solución; de forma similar, las moléculas polinucleotídicas se aplican a la planta mediante cualquier procedimiento conveniente, por ejemplo, pulverización o frotamiento de una solución, emulsión o suspensión.

62) Son tensioactivos útiles los tensioactivos de organosilicona, incluidos los tensioactivos de organosilicona no iónicos, por ejemplo, tensioactivos de etoxilato de trisiloxano o un copolímero de poliéster y silicona tal como un copolímero de heptametil trisiloxano modificado con óxido de polialquileno y aliloxipolipropilenglicol metiléter (disponible en el mercado como tensioactivo Silwet® L-77 que tiene el número CAS 27306-78-1 y el número EPA: CAL.REG.n o . 5905-50073-AA, actualmente comercializado por Momentive Performance Materials, Albany, Nueva York). Cuando se usa el tensioactivo Silwet L-77 como tratamiento de prepulverización de las hojas de plantas u otras superficies, las concentraciones en el intervalo de aproximadamente 0,015 a aproximadamente 2 por ciento en peso (%p) (por ejemplo, de aproximadamente 0,01, 0,015, 0,02, 0,025, 0,03, 0,035, 0,04, 0,045, 0,05, 0,055, 0,06, 0,065, 0,07, 0,075, 0,08, 0,085, 0,09, 0,095, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,5 %p) son eficaces para preparar una hoja u otra superficie vegetal para la transferencia de moléculas polinucleotídicas al interior de células vegetales a partir de una aplicación tópica en la superficie.

64) Los agentes para el acondicionamiento en el laboratorio de una planta para la infiltración de polinucleótidos incluyen, por ejemplo, la aplicación de un agente químico, un tratamiento enzimático, calentamiento o enfriamiento, un tratamiento con presión negativa o positiva o un tratamiento con ultrasonido. Los agentes para acondicionar plantas en un campo incluyen tensioactivos como los descritos anteriormente.

Genes diana y genes esenciales

65) Las composiciones y procedimientos de la invención son útiles para modular la expresión de un gen diana endógeno o transgénico en una célula vegetal. En varias realizaciones, un gen diana incluye una secuencia codificante (codificante de proteína o traducible), una secuencia no codificante (no traducible) o una secuencia tanto codificante como no codificante. Las composiciones de la invención pueden incluir polinucleótidos y oligonucleótidos diseñados para dirigirse a múltiples genes o múltiples segmentos de uno o más genes. El gen diana puede incluir múltiples segmentos consecutivos de un gen diana, múltiples segmentos no consecutivos de un gen diana, múltiples alelos de un gen diana o múltiples genes diana de una o más especies. Los ejemplos de genes diana incluyen genes y transgenes vegetales endógenos expresados en células vegetales. Otros ejemplos de genes diana incluyen genes endógenos de patógenos víricos o genes endógenos de plagas vegetales de invertebrados.

66) Los genes diana pueden incluir genes que codifican proteínas de tolerancia a herbicidas, secuencias no codificantes que incluyen ARN reguladores y genes esenciales, que son genes necesarios para sustentar la vida celular o para permitir la reproducción de un organismo. Las realizaciones de genes esenciales incluyen genes que participan en la replicación del ADN o ARN, transcripción génica, regulación génica mediada por ARN, síntesis proteica, producción de energía y división celular. Un ejemplo de un compendio de genes esenciales se describe en Zhang y col. (2004) Nucleic Acids Res., 32:D271-D272 y está disponible en tubic.tju. edu.cn/deg/; versión DEG 5.4 enumera 777 genes esenciales para Arabidopsis thaliana. Los ejemplos de genes esenciales incluyen el factor de iniciación de la traducción (TIF, translation initiation factor) y la ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa oxigenasa (RuBisCO, ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase oxygenase). Los genes diana pueden incluir genes que codifican factores de transcripción y genes que codifican enzimas implicadas en la biosíntesis o catabolismo de moléculas en plantas tales como, pero sin limitación, aminoácidos, ácidos grasos y otros lípidos, azúcares y otros carbohidratos, polímeros biológicos y metabolitos secundarios incluidos alcaloides, terpenoides, policétidos, péptidos no ribosómicos y metabolitos secundarios de origen biosintético mixto.

Composiciones y Procedimientos

67) Las moléculas de ARN bicatenario de esta invención pueden proporcionarse directamente a la célula vegetal como ARN o pueden proporcionarse indirectamente, por ejemplo, cuando una molécula polinucleotídica en la composición de tratamiento provoca en células de una planta la producción del ARN monocatenario que es capaz de hibridar con el transcrito del gen diana. Tal como se describe anteriormente, las realizaciones y las composiciones de moléculas polinucleotídicas además incluyen uno o más agentes potenciadores de la permeabilidad para facilitar la transferencia de las moléculas polinucleotídicas a una célula vegetal, tales como agentes para acondicionar una planta para la infiltración de polinucleótidos. En aspectos de la invención, los procedimientos incluyen una o más aplicaciones de la composición de polinucleótido y una o más aplicaciones de un agente potenciador de la permeabilidad para acondicionar una planta para la infiltración mediante polinucleótidos.

Procedimientos de silenciamiento transgénico

72) En otro aspecto adicional de la invención, este procedimiento puede utilizarse para silenciar un transgén que se expresa en una planta, proporcionando así un control negativo que es una medición independiente de acontecimientos de una contribución del transgén al rendimiento o efecto de la planta en un rasgo. Impartir un efecto de control negativo puede requerir múltiples tratamientos sucesivos con las moléculas polinucleotídicas de esta invención durante el ciclo de vida de una planta.

Aplicaciones específicas

73) En un aspecto relacionado, las composiciones y procedimientos de la invención también son útiles para silenciar transitoriamente uno o más genes en una célula vegetal o planta entera en crecimiento para producir un fenotipo deseado en respuesta a condiciones de cultivo, estrés ambiental o abiótico o biótico, o a un cambio en la demanda del mercado durante la estación de cultivo o en el ambiente posterior a la cosecha. Por ejemplo, las composiciones y procedimientos de la invención son útiles para suprimir transitoriamente un gen biosintético o catabólico para producir una planta o producto vegetal con un fenotipo deseado, tal como una composición nutricional deseada de un producto vegetal de cultivo, por ejemplo, suprimir un gen FAD2 para producir un perfil de ácido graso deseado en soja o colza u otra semilla de aceite o suprimir genes biosintéticos de lignina tales como COMT y CCOMT para proporcionar plantas forrajeras más fáciles de digerir. De forma similar, las composiciones y procedimientos de la invención son útiles para suprimir transitoriamente una molécula reguladora de ARN tal como un micro ARN (miARN) o un señuelo de miARN endógeno tal como un miARN endógeno, un precursor de miARN o un señuelo de miARN. Las realizaciones de la invención son útiles para suprimir un gen vegetal endógeno que participa en la respuesta a una plaga o patógeno, proporcionando así control de plagas o enfermedades vegetales. Los polinucleótidos, composiciones y procedimientos de suministro divulgados en el presente documento, son útiles además para suprimir un gen diana endógeno de una plaga de invertebrados de una planta, por ejemplo, plagas de lepidópteros o coleópteros que pueden ingerir ARN de la planta, proporcionando así control de plagas vegetales o enfermedades inducidas por plagas, por ejemplo, mediante el uso de un pulverizador tópico para plantas de cultivo, hortalizas o árboles frutales, con moléculas de ADN o ARN dirigidas a un gen esencial invertebrado o un gen de un simbionte de la plaga de invertebrados. Los polinucleótidos, composiciones y procedimientos de suministro divulgados en el presente documento, son útiles además para proporcionar el control de un patógeno vírico, por ejemplo, mediante el uso de un pulverizador antivírico tópico para plantas de cultivo, hortalizas o árboles frutales con moléculas de ADN o ARN dirigidas a un gen vírico.

Composiciones herbicidas y procedimientos

Proteínas de tolerancia a herbicidas

77) Las plantas naturales (no transgénicas) y transgénicas que presentan tolerancia a herbicidas (resistencia), a menudo tienen un gen que codifica una proteína que es responsable de la tolerancia a herbicidas, por ejemplo, un transgén que proporciona la tolerancia, un gen endógeno mutado que proporciona la tolerancia o múltiples copias de un gen endógeno al cual se dirige normalmente un herbicida. Una estrategia de control de dichas plantas es aplicar un agente que suprima o al menos reduzca la expresión del gen que codifica la proteína que imparte la tolerancia a herbicidas. Los ejemplos de proteínas que proporcionan tolerancia a un herbicida incluyen, por ejemplo, una 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS), una glifosato oxidorreductasa (GOX), una glifosato decarboxilasa, una glifosato-W-acetil transferasa (GAT), una dicamba monooxigenasa, una fosfinotricina acetiltransferasa, una ácido 2,2 dicloropropionico deshalogenasa, una ácido acetohidroxi sintasa, una acetolactato sintasa, una haloarilnitrilasa, una acetil-coenzima A carboxilasa, una dihidropteroato sintasa, una fitoeno desaturasa, una protoporfirina IX oxigenasa, una hidroxifenilpiruvato dioxigenasa, una para-aminobenzoato sintasa, una glutamina sintasa, una celulosa sintasa, una beta-tubulina y una serina hidroximetiltransferasa.

78) Los ejemplos de ácidos nucleicos que codifican proteínas que confieren tolerancia a herbicidas incluyen 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasas (EPSPS; véanse, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Números 5,627,061, 5,633,435 RE39247, 6,040,497 y 5,094,945 y las Publicaciones de Solicitudes Internacionales PCT WO04074443 y WO04009761), glifosato oxidorreductasa (GOX; Patente de los Estados Unidos Número 5.463.175), glifosato decarboxilasa (Publicación de Solicitud Internacional PCT WO05003362, Patente de los Estados Unidos Número 7.405.347 y publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos 2004/0177399), glifosato-N-acetil transferasa (GAT; Patente de los Estados Unidos Número 7,714,188) que confieren tolerancia al glifosato; dicamba monooxigenasa que confiere resistencia a herbicidas similares a auxina tales como dicamba (Patente de los Estados Unidos Número 7,105,724); fosfinotricina acetiltransferasa (pat o bar) que confiere tolerancia a la fosfinotricina o al glufosinato (Patente de los Estados Unidos Número 5,646,024); ácido 2,2- dicloropropionico deshalogenasa que confiere tolerancia al ácido 2,2-dicloropropionico (Dalapon) (Publicación de Solicitud Internacional PCT WO9927116); ácido acetohidroxi sintasa o acetolactato sintasa que confieren tolerancia a inhibidores de acetolactato sintasa tales como sulfonilurea, imidazolinona, triazolopirimidina, pirimidiloxibenzoatos y ftalida (Patente de los Estados Unidos Número 6,225,105); haloarilnitrilasa (Bxn) para conferir tolerancia a bromoxinilo (Patente de los Estados Unidos Número 4,810,648); acetil-coenzima A carboxilasa modificada para conferir tolerancia a ciclohexanodiona (setoxidim) y ariloxifenoxipropionato (haloxifop) (Patente de los Estados Unidos Número 6,414,222); dihidropteroato sintasa (sul I) para conferir tolerancia a herbicidas de sulfonamida (Patente de los Estados Unidos Número 5.719.046); polipéptido de fotosistema II de 32 kDa (psbA) para conferir tolerancia a herbicidas de triazina (Hirscberg y col., 1983, Science, 222:1346-1349); antranilato sintasa para conferir tolerancia a 5-metiltriptófano (Patente de los Estados Unidos Número 4,581,847); ácido dihidrodipicolínico sintasa (dap A) para conferir tolerancia a aminoetil cisteína (Publicación de Solicitud Internacional PCT WO8911789); fitoeno desaturasa (crtI) para conferirtolerancia a herbicidas de piridazinona tales como norflurazón (Patente de Japón JP06343473); hidroxifenilpiruvato dioxigenasa, una ácido 4-hidroxifenilacético oxidasa y una 4-hidroxifenilacético 1-hidrolasa (Patente de los Estados Unidos 7,304,209) para conferirtolerancia a herbicidas de ciclopropilisoxazol tales como isoxaflutol (Patente de los Estados Unidos Número 6,268,549); protoporfirinógeno oxidasa I modificada (protox) para conferir tolerancia a inhibidores de protoporfirinógeno oxidasa (Patente de los Estados Unidos Número 5939602); ariloxialcanoato dioxigenasa (AAD-1) para conferir tolerancia a un herbicida que contiene un resto de ariloxialcanoato (WO05107437); una serina hidroximetiltransferasa (publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos 2008/0155716), una glutamina sintasa tolerante a glufosinato (publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos 2009/0018016). Ejemplos de dichos herbicidas incluyen fenoxi auxinas (tales como 2,4- D y diclorprop), piridiloxi auxinas (tales como fluroxipir y triclopir), ariloxifenoxipropionatos (AOPP) inhibidores de acetil-coenzima A carboxilasa (ACCasa) (tales como haloxifop, quizalofop y diclofop) e inhibidores de 5- fenoxiacetato protoporfirinógeno oxidasa IX sustituida (tales como piraflufen y flumiclorac). Las secuencias de nucleótidos de los ácidos nucleicos que codifican proteínas de tolerancia a herbicidas y las secuencias de las proteínas de tolerancia a herbicidas.

79) Aspectos de esta invención proporcionan polinucleótidos y procedimientos que proporcionan directamente o indirectamente a una célula vegetal, ARN bicatenarios que hibridan con ARN que codifica dichas proteínas de tolerancia a herbicidas a un nivel que es letal para las plantas o al menos a un nivel para reducir la tolerancia al herbicida. Debido a la degeneración secuencial del ADN que codifica proteínas de tolerancia a herbicidas, es posible diseñar un polinucleótido para su uso en esta invención que sea específicamente eficaz en una planta específica. Debido a la conservación de dominios de ADN entre múltiples plantas, es posible diseñar un polinucleótido para su uso en esta invención que sea eficaz en una variedad de plantas.

80) En una realización, el polinucleótido se mezcla con el herbicida correspondiente para potenciar la actividad del herbicida proporcionando una actividad herbicida mejorada. En una realización el polinucleótido se utiliza separado del herbicida pero en combinación con una aplicación del herbicida como un pre o postratamiento. En las realizaciones, el tensioactivo de organosilicona se combina de forma ventajosa con el herbicida y el polinucleótido o se combina con uno o el otro cuando las composiciones se aplican de forma secuencial. Las plantas de invernadero pueden tratarse utilizando un pulverizador agrícola o un pulverizador de laboratorio con una boquilla de pulverización 11001XR para suministrar la solución de muestra a una tasa determinada (por ejemplo, 140 l/ha) a 0,25 MPa de presión. En el campo, la solución de tratamiento puede aplicarse con un pulverizador de mochila presurizado con CO2 calibrado para suministrar la tasa apropiada de la composición con una boquilla de pulverización de chorro plano 11015 con un ensamblaje de boquilla simple adaptado (para minimizar el desperdicio) a una presión de pulverización de 0,25 MPa; el pulverizador de boquilla simple proporciona una pulverización eficaz de 60 cm por encima de la copa de 3 a 12 pulgadas de altura de las plantas en crecimiento.

Ejemplo 1

82) Este ejemplo ilustra la utilidad de las moléculas polinucleotídicas de esta invención en el control de malezas resistentes a herbicidas. Se identificó que los genotipos de palmera amaranto resistente a glifosato tenían múltiples copias, por ejemplo, de 4 a más de 100 copias, del gen que codifica la 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) a la cual se dirigen los compuestos de glifosato en los tratamientos con herbicidas.

83) En referencia a la SEQ ID NO:1, tal como se muestra en la Figura 1, se diseñaron cuatro moléculas oligonucleotídicas de ARNbc de tamaño “corto” con una cadena antisentido capaz de hibridarse con ARNm transcrito a partir del gen EPSPS de la palmera amaranto en las posiciones 14-38 (ARNbc-1 corto), en las posiciones 153-177 (ARNbc-2 corto), 345-369 (ARNbc-3 corto) y 1105-1129 (ARNbc-4 corto), tal como se indica mediante los nucleótidos subrayados en la Figura 1. Los cuatro ARNbc cortos diseñados se adquirieron en Integrated DNA Technologies (IDT); los ARNbc tenían un saliente de dos nucleótidos en el extremo 3' de la cadena antisentido y dos desoxinucleótidos como los nucleótidos terminales en el extremo 3' de la cadena sentido.

84) Con referencia a la SEQ ID NO:1 y la Figura 1, se diseñaron tres polinucleótidos de ARN bicatenario “largo” con una cadena capaz de hibridarse con el ARNm transcrito a partir del gen EPSPS de la palmera amaranto en las posiciones 16-170 (ARNbc-1 largo), 451-722 (ARNbc-2 largo) y 1109-1328 (ARNbc-3 largo), tal como se indica mediante los nucleótidos en negrita en la Figura 1. Los tres ARNbc largos diseñados se prepararon utilizando el kit de ARNi de Ambion MEGAscript®, Cat. No. 1626.

85) Se cultivaron clones vegetativos de palmera amaranto resistente a glifosato con 16 copias del gen endógeno que codifica EPSPS (Gaines, y col. (2010) Proceedings of the National Academy of Sciences 107(3): 1029-1034) en macetas de 3,5 pulgadas con mezcla para plántulas SunGro® Redi-earth que contenía 3,5 kg/metro cúbico de fertilizante Osmocote® 14-14-14 en un invernadero con un fotoperíodo de 14 horas y una temperatura diurna de 30 grados centígrados y una temperatura nocturna de 20 grados centígrados; las plantas se regaron con agua desionizada según fuera necesario.

86) Se preparó una solución de pretratamiento de tensioactivo para sumergir las hojas, diluyendo el tensioactivo de organosilicona de la marca Silwet L-77 con agua destilada al 0,1% (v/v). Se preparó una solución de pretratamiento de carburo de silicio al 5% (p/v) mezclando 2 g de carburo de silicio (arena 400) en 40 ml de agua destilada. Se preparó un tampón de tratamiento con 10 mM de fosfato de sodio y tensioactivo de organosilicona Silwet L-77 al 0,01% (v/v) en agua DEPC (Omega Bio-Tek) y se ajustó a un pH de 6,8. Se preparó una solución de ARNbc corto con cantidades equimolares de cada uno de los cuatro ARNbc cortos (identificados anteriormente) en el tampón de tratamiento a una concentración de 0,005 nanomoles de cada ARNbc corto por microlitro. Se preparó una solución de ARNbc largo con cantidades equimolares de cada uno de los tres ARNbc largos en el tampón de tratamiento a una concentración de 0,0006 nanomoles de cada ARNbc largo por microlitro. Se preparó una solución mixta de ARNbc (corto/largo) con 0,005 nanomoles de cada uno de los cuatro ARNbc cortos y 0,0006 nanomoles de cada uno de los tres ARNbc largos por microlitro.

87) Los clones vegetativos de palmera amaranto resistente a glifosato con 16 copias del gen endógeno que codifica EPSPS se pretrataron con la solución de carburo de silicio o la solución de tensioactivo para acondicionar las hojas para transferir o infiltrar los ARNbc. Para el pretratamiento con solución de carburo de silicio se llevó a cabo la abrasión de la hoja frotando suavemente 0,5 ml de la solución de carburo de silicio sobre la superficie superior de una hoja, se aclaró con agua y se secó con papel secante. Para el pretratamiento con la solución de tensioactivo, cuatro hojas maduras originarias, completamente expandidas, se sumergieron en la solución de tensioactivo y se dejaron secar. Después del pretratamiento de la hoja con la solución de carburo de silicio o la solución de tensioactivo, las hojas acondicionadas se trataron con la solución de tampón (como control) o con 40 microlitros de una solución de ARNbc (aplicando 10 microlitros de solución de ARNbc en cada una de las 4 hojas por planta). En el tratamiento con la solución de ARNbc corto, se aplicaron aproximadamente 0,8 nanomoles de moléculas de ARNbc corto (0,2 nanomoles de cada ARNbc corto) a cada planta tratada. En el tratamiento con la solución de ARNbc largo se aplicaron aproximadamente 0,072 nanomoles de moléculas de ARNbc largo (0,024 nanomoles de cada ARNbc largo) a cada planta tratada. En el tratamiento con la solución mixta de ARNbc (corto/largo), se aplicaron aproximadamente 0,8 nanomoles de las moléculas de ARNbc corto y aproximadamente 0,072 nanomoles de las moléculas de ARNbc largo a cada planta tratada. Excepto los controles, todas las plantas se pulverizaron con una solución de herbicida glifosato (1682 g de equivalente ácido por hectárea de herbicida marca Roundup® WeatherMAX®) inmediatamente, 48 o 72 horas después del tratamiento con ARNbc y se evaluaron al menos después de 7 días postratamiento con glifosato. Resultados:

88) Seis plantas de control tratadas con tensioactivo (sin tratamiento con molécula de ARNbc) sobrevivieron al tratamiento con glifosato. Véase la Figura 3A que muestra una fotografía de las plantas 7 días después del tratamiento con glifosato.

89) Dos de cuatro plantas de control tratadas con carburo de silicio abrasivo (sin tratamiento con molécula de ARNbc) murieron a causa del tratamiento con glifosato.

90) Seis plantas tratadas con tensioactivo, que se trataron con glifosato inmediatamente después de la aplicación de la solución mixta de ARNbc (corto/largo), sobrevivieron, pero presentaban retraso en el crecimiento.

91) Seis plantas tratadas con tensioactivo, que se trataron solo con la solución mixta de ARNbc (corto/largo) y sin glifosato, sobrevivieron. Cinco de seis plantas tratadas con tensioactivo, que se trataron con las soluciones mixtas de ARNbc (corto/largo) y posteriormente con tratamiento con glifosato, murieron.

92) Cinco de seis plantas tratadas con tensioactivo, que se trataron con glifosato 48 horas después de la aplicación de la solución mixta de ARNbc (corto/largo), murieron.

93) Tres de cuatro plantas tratadas con carburo de silicio, que se trataron con glifosato 48 horas después de la aplicación de la solución mixta de ARNbc (corto/largo), murieron.

94) Cinco de seis plantas tratadas con tensioactivo, que se trataron con la solución de ARNbc largo y posteriormente con tratamiento con glifosato después de 72 horas, murieron; véase la Figura 3B. Seis de seis plantas tratadas con tensioactivo, que se trataron con la solución de ARNbc corto y posteriormente con tratamiento con glifosato después de 72 horas, murieron; véase la Figura 3C.

Ejemplo 2

95) Este ejemplo ilustra la utilidad de las moléculas polinucleotídicas de esta invención para mejorar el control de malezas sensibles al herbicida glifosato. Las soluciones mixtas de ARNbc (corto/largo) preparadas en el Ejemplo 1, se aplicaron a plantas de yute chino sensibles al glifosato (un total de 40 microlitros aplicados a dos hojas) que se pretrataron con la solución de tensioactivo utilizada en el Ejemplo 1. Las plantas de control se trataron solo con tampón después del pretratamiento con la solución de tensioactivo. 48 horas después del tratamiento con ARNbc, las plantas se trataron con una solución del herbicida glifosato (53 g de equivalente ácido por hectárea del herbicida glifosato de la marca Roundup® WeatherMAX®). Se observó un aumento por duplicado de la actividad del glifosato según se estimó por la observación del crecimiento de la planta (medido como la altura de la planta) en las plantas tratadas con la composición polinucleotídica y el herbicida, en comparación con las plantas de control tratadas con tampón y herbicida. Las plantas tratadas con la composición polinucleotídica y el herbicida sobrevivieron con un retraso grave en el crecimiento; las plantas de control tratadas con tampón y herbicida sobrevivieron y se recuperaron completamente. Se obtuvieron resultados similares con otras malezas sensibles al herbicida glifosato, es decir, amaranto tuberculoso, bledo, ambrosía gigante, lechuga espinaca, tabaco y diente de león sensibles al herbicida glifosato.

Ejemplo 3

96) Este ejemplo ilustra la utilidad de las moléculas polinucleotídicas de esta invención en el control de malezas en cultivos transgénicos resistentes a glifosato. Se trataron plantas transgénicas de alfalfa, colza, maíz, algodón, arroz, soja, caña de azúcar, remolacha azucarera y trigo, que tenían ADN recombinante para expresar una EPSPS bacteriana (véase la Patente de los Estados Unidos RE39.247 para una descripción de los genes de EPSPS “clase II” resistentes a glifosato) con (a) la solución de tensioactivo utilizada en el Ejemplo 1, (b) la solución mixta de ARNbc (corto/largo) preparada en el Ejemplo 1 y (c) una solución de herbicida glifosato (1682 g de equivalente ácido por hectárea de Roundup® WeatherMAX®) 48 horas después del tratamiento con ARNbc. Después de 30 días, todas las plantas de cultivos transgénicos resistentes a glifosato sobrevivieron y no presentaron retraso en el crecimiento.

Ejemplo 4

97) Este ejemplo ilustra la utilidad de las moléculas polinucleotídicas de la invención como agentes herbicidas. Se diseñaron dos moléculas polinucleotídicas de ARNbc para dirigirse a segmentos superpuestos de ARNm que codifican fitoeno desaturasa en tabaco (Nicotiana benthamiana). En referencia a la SEQ ID NO:2 y la Figura 5 , se fabricó un ARNbc dirigido a 192 nt de longitud (se muestra en negrita en la Figura 5) y a 685 nt de longitud (se muestra subrayado en la Figura 5) del ARNm, utilizando un kit de Ambion® MEGAscript®. Se prepararon soluciones de ARNbc por separado. Las hojas de la planta de tabaco se pretrataron con la solución de tensioactivo preparada como en el Ejemplo 1 y después se trataron con una de las soluciones de ARNbc aplicando aproximadamente 0,6 micromoles de ARNbc por planta. El día 9 después del tratamiento con ARNbc, el silenciamiento de la fitoeno desaturasa se puso de manifiesto por la decoloración visible foliar en las hojas apicales; véase la Figura 4. Después de 15 días de tratamiento con ARNbc, una mitad de las plantas tratadas parecía estar muerta y la otra mitad de las plantas tenía decolorada la mayor parte de los tejidos por encima del suelo. El análisis de transferencia Northern indica la presencia de los ARNip correspondientes a los ARNbc utilizados en el tratamiento.

Ejemplo 5

98) Este ejemplo ilustra adicionalmente la utilidad de las moléculas polinucleotídicas de la invención como agentes herbicidas. Se diseñaron moléculas oligonucleotídicas de ARNbc para dirigirse a ARN que codifica EPSPS para cada una de las siguientes plantas: ambrosía común (Ambrosia artemisiifolia), ambrosía gigante (Ambrosia trífida), sorgo de Alepo (Sorghum halepense), rama negra (Conzya bonariensis), cola de zorro (Digitaria insularis), urochloa (Urochloa panicoides), poinsettia silvestre (Euphorbia heterophylla), arrocillo (Echinochloa colona), quínoa blanca (Chenopodium album), almorejo (Setaria viridis), moha (Setaria italic), amor de hortelano (Echinochloa crus-galli), digitaria (Digitaria sanguinalis), cadillo (Xanthium strumarium), alopecuro de campo (Alopecurus myosuroides), avena silvestre (Avena fatua), palo de zorrillo (Senna obtusifolia), bejucos (Ipomoea sp.), correhuela (Convolvulus arvensis), sorgo (Sorghum bicolor), hierba del pollo (Commelina), amor de hombre (Tradescantia sp.), ryegrás (Lolium sp.), pata de ganso (Eleusine indica), cola de caballo (Conzya canadensis), llantén (Plantago lanceolata), palmera amaranto (Amaranthus palmeri), amaranto tuberculoso (Amaranthus tuberculatus), amaranto blanco (Amaranthus albus), amaranto híbrido (Amaranthus hybridus), abrebujo (Amaranthus retroflexus), cáñamo de agua (Amaranthus rudis/tuberculatus), amaranto sudamericano (Amaranthus viridis), amaranto de Thunberg (Amaranthus thumbergii), amaranto espinoso (Amaranthus spinosis), (Amaranthus rubra), (Amaranthus lividus), bledo (Amaranthus graecizans), alegría (Amaranthus chlorostachys), amaranto de Powell (Amaranthus powellii), cenizo (Amaranthus blitoides), rodadora (Kochia scoparia), abrepuño amarillo (Centaurea solstitialis) y abutilón (Abutilon theophrasti). Las hojas de la planta se pretrataron con la solución de tensioactivo preparada como en el Ejemplo 1 y se trataron con las soluciones de ARNbc a un tratamiento de aproximadamente 1 nanomol por planta. Después de 15 días, las plantas tratadas están muertas, moribundas o presentan un retraso en el crecimiento.

Ejemplo 6

99) Este ejemplo ilustra adicionalmente la utilidad de las moléculas polinucleotídicas de la invención como agentes herbicidas. Se diseñaron moléculas oligonucleotídicas de ARNbc para dirigirse a ARN que codifica acetolactato sintasa y fitoeno desaturasa para cada una de las plantas indicadas en el Ejemplo 5. Las hojas de la planta se pretrataron con la solución de tensioactivo preparada como en el Ejemplo 1 y se trataron con las soluciones de ARNbc a un tratamiento de aproximadamente 1 nanomol por planta. Después de 15 días, las plantas tratadas están muertas, moribundas o presentan retraso en el crecimiento.

Ejemplo 7

100) Este ejemplo ilustra adicionalmente la utilidad de las moléculas polinucleotídicas de esta invención como agentes herbicidas. El procedimiento del Ejemplo 4 se repite para proporcionar oligonucleótidos de ARNbc corto diseñados para dirigirse a ARN que codifica cada una de las siguientes proteínas en la palmera amaranto: una 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS), una acetil-coenzima A carboxilasa, una dihidropteroato sintasa, una protoporfirina IX oxigenasa, una hidroxifenilpiruvato dioxigenasa, una glutamina sintasa, proteína D1, un factor de iniciación de la traducción (TIF), una ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa oxigenasa (RuBisCO) y una ATPasa dependiente de ADN (ddATPasa). Las hojas de plantas de palmera amaranto resistentes a glifosato separadas se trataron con la solución de tensioactivo preparada como se indica en el Ejemplo 1 y por separado cada una de las moléculas oligonucleotídicas de ARNbc en la forma del Ejemplo 1 a un tratamiento de 1 nanomol de ARNbc por planta. Después de 30 días, las plantas tratadas están muertas, moribundas o presentan retraso en el crecimiento.

Ejemplo 8

101) Este ejemplo ilustra la utilidad de emplear un gen Pol III sintético en las composiciones y en los procedimientos de esta invención. En referencia a la SEQ ID NO:3 y la Figura 2 , se creó un gen Pol III sintético utilizando elementos de un gen de ARNnp de U6 de Arabidopsis thaliana para proporcionar una molécula de ADNbc con dos copias de elementos RGCCCR (en negrita y subrayado), un elemento de secuencia en dirección 5' (USE, upstream sequence element) que tenía la secuencia “TCCCAc ATCG” (SEQ ID NO:4, en negrita y subrayada), una secuencia TATA (en negrita y subrayada), un nucleótido “G” (en negrita y subrayado), ADN antisentido (en cursiva) correspondiente a un ADN bacteriano que codifica una proteína EPSPS (véase la Patente de los Estados Unidos RE39.247) que confiere resistencia al herbicida glifosato cuando se expresa en plantas de maíz transgénicas, un elemento “AAGATTAGCACGG” (SEQ ID NO:5, en negrita y subrayado) incluido en el ADN antisentido, un elemento “ACGCATAAAAT” (SEQ ID NO:6, en negrita y subrayado) seguido por el ADN sentido (en minúsculas) y un elemento de terminación “TTTTTT” (SEQ ID NO:7, en negrita y subrayado). Se pulverizaron una solución de tensioactivo de organosilicona de la marca Silwet L-77 al 0,1% en peso y una solución de múltiples copias de la molécula de ADNbc sobre las hojas de plantas de maíz con crecimiento espontáneo, resistentes a glifosato, que crecieron en un campo de plantas de soja resistentes a glifosato y posteriormente, 7 días después, se aplicó el tratamiento con el herbicida glifosato de la marca Roundup WeatherMAX®. 15 días después, las plantas de maíz murieron y las plantas de soja siguieron creciendo; las plantas de maíz de control resistentes a glifosato tratadas solo con tensioactivo y herbicida glifosato siguieron creciendo.

Ejemplo 9

102) Este ejemplo ilustra un aspecto de la invención. En este ejemplo, las moléculas polinucleotídicas se aplicaron e infiltraron en tejido vegetal induciendo así la regulación sistémica, es decir, el silenciamiento, de un gen diana (una EPSPS endógena). Más específicamente, una composición que incluye oligonucleótidos de ADN monocatenario (ADNmc) suprimió la expresión de una EPSPS endógena en palmera amaranto tolerante a glifosato (Amaranthus palmeri).

103) Los oligonucleótidos de ADNmc antisentido se diseñaron utilizando el programa informático IDT SciTools (disponible en idtdna.com/Scitools/Applications/Anti-sense/Anti-sense.aspx). Los oligonucleótidos incluían cuatro oligonucleótidos de ADNmc antisentido para EPSPS de Amaranthus palmen (SEQ ID NO:8, 9, 10 y 11), dos oligonucleótidos de ADNmc antisentido químicamente modificados (modificados con fosforotioato) para EPSPS de Amaranthus palmen (SEQ ID NO:12 y 13), un oligonucleótido de ADNmc antisentido control para un gen control, proteína de semilla de cebada (Hordeum vulgare), ID de GenBank X97636 (SEQ ID NO:14) y un oligonucleótido de ADNmc antisentido químicamente modificado (marcado en 5' con Alexa Flúor 488 de Invitrogen) para EPSPS de Amaranthus palmen (SEQ ID NO:15), tal como se indica en la Tabla 1.

Tabla 1: Oligonucleótidos de ADNmc antisentido

104) La absorción de los oligonucleótidos se demostró con los oligonucleótidos de ADNmc marcados con fluorescencia (SEQ ID NO:15), que confirmó que los oligonucleótidos de ADNmc se infiltraron en el tejido de la hoja. Peciolos de hojas arrancadas de palmera amaranto resistente a glifosato se colocaron en solución de sacarosa 200 mM con oligonucleótidos de ADNmc marcados con fluorescencia (SEQ ID NO:15). Las imágenes de la hoja se obtuvieron con un generador de imágenes Bio-Rad PharosFX equipado con un láser de 488 nm de 4 h hasta 48 h después de la absorción a través del peciolo. Las hojas se incubaron con sacarosa 200 mM solo y sirvieron como control. Se observó una absorción vacuolar ligeramente dependiente del tiempo de los oligonucleótidos de ADNmc marcados con fluorescencia (véase la Figura 6). Los oligonucleótidos de ADNmc marcados con fluorescencia se liberaron del tejido vacuolar hacia el interior de las células en tan solo 8 h después del tratamiento y se observó que se acumulaban en el borde de la hoja a las 24 h y 48 h, lo que sugiere un efecto de transpiración.

105) La supresión de EPSPS se demostró con hojas arrancadas de palmera amaranto resistente a glifosato utilizando la técnica de absorción del peciolo. Se colocaron peciolos de hojas arrancadas de palmera amaranto resistente a glifosato en solución de sacarosa 200 mM con oligonucleótidos de acuerdo con los tratamientos indicados en la Tabla 2. Las hojas control se infiltraron con el control antisentido (SEQ ID NO:14) y adicionalmente se trataron con o sin 50 microgramos/ml de glifosato. Se midieron los niveles de ARNm de EPSPS, proteína EPSPS y shikimato después de 48 h de incubación. Para evaluar los efectos de los oligonucleótidos de ADNmc antisentido sobre el ARNm de EPSPS, se aisló el ARN total de la hoja y se llevó a cabo una RT-PCR cuantitativa en tiempo real para comparar los niveles de ARNm de EPSPS. Para evaluar los efectos de los oligonucleótidos de ADNmc antisentido sobre la proteína EPSPS, se aisló la proteína soluble total de la hoja, se separó mediante SDS-PAGE y se midieron los niveles de proteína EPSPS mediante transferencia Western utilizando anticuerpos contra EPSPS_TIPA de maíz. Los efectos de los oligonucleótidos de ADNmc antisentido sobre la acumulación de shikimato, como un indicador de la supresión de la EPSPS, se evaluaron en dos experimentos: en el experimento 1, las hojas tratadas con oligonucleótidos, se incubaron con 50 microgramos/ml de glifosato durante 48 h más mediante absorción de peciolo (las hojas de control se infiltraron con el control antisentido (SEQ ID NO:14) y se trataron adicionalmente con o sin 50 microgramos/ml de glifosato); en el experimento 2, se llevaron a cabo ensayos con discos de hoja en las hojas tratadas con oligonucleótidos y se midieron los niveles de shikimato mediante HPLC (en este caso los controles eran hojas que no se habían tratado con oligonucleótidos pero que se habían incubado con 50 microgramos/ml de glifosato).

Tabla 2: Lista de tratamientos que utilizan los oligonucleótidos de ADNmc antisentido

106) En las Figuras 7, 8 y 9 , respectivamente, se muestran los resultados de los niveles de expresión de ARNm de EPSPS, de la proteína EPSPS y de shikimato. Estos resultados demuestran que el tratamiento con los oligonucleótidos de ADNmc antisentido regularon o suprimieron sistémicamente el gen diana disminuyendo los niveles del transcrito del gen diana (ARNm de EPSPS) o de la proteína (EPSPS) codificada por el gen diana en el tejido vegetal. En este experimento específico, los tratamientos N.° 1 y N.° 6 parecieron ser más eficaces en la supresión de los niveles de ARNm de EPSPS y proteína y en el aumento de la eficacia del glifosato, tal como se pone de manifiesto por la acumulación aumentada de shikimato. Estos resultados también indican que la eficacia del glifosato mejora suprimiendo el ARNm de EPSPS y la proteína en la palmera amaranto resistente a glifosato.

Ejemplo 10

107) Este ejemplo ilustra un aspecto de la invención. En este ejemplo, se trataron plantas en crecimiento con una composición aplicada por vía tópica para inducir el silenciamiento sistémico de un gen diana en una planta que incluye (a) un agente para acondicionar una planta para la infiltración mediante polinucleótidos y (b) polinucleótidos que incluyen al menos una cadena polinucleotídica que incluye al menos un segmento de 18 o más nucleótidos contiguos del gen diana en orientación antisentido o sentido. Más específicamente, se trataron plantas de tabaco (Nicotiana benthamiana) con (a) una solución detensioactivo aplicada por vía tópica para acondicionar la planta para la infiltración mediante polinucleótidos y (b) una composición que incluye oligonucleótidos o polinucleótidos de ADN aplicados por vía tópica que tiene al menos una cadena que incluye al menos un segmento de 18 o más nucleótidos contiguos del gen diana en orientación antisentido o sentido, con lo cual se logró la regulación o supresión sistémica del gen diana (una fitoeno desaturasa, “PDS”).

108) El gen diana utilizado fue una fitoeno desaturasa de Nicotiana benthamiana (SEQ ID NO:2), que se muestra en la Figura 10; se utilizó el segmento que consistía en los nucleótidos 421 - 1120 de la SEQ ID NO:2 (texto subrayado en la Figura 10) para diseñar un polinucleótido de ARNbc de 700 meros (“PDS de 700 meros”) y el segmento que consistía en los nucleótidos 914-1113 de la SEQ ID NO:2 (texto en negrita subrayado en la Figura 10) se utilizó para diseñar un polinucleótido de ARNbc de 200 meros (“PDS de 200 meros”). Las secuencias de otros polinucleótidos u oligonucleótidos utilizados en los tratamientos se indican en la Tabla 3. La Figura 11 representa esquemáticamente la ubicación de las secuencias de estos oligonucleótidos y polinucleótidos en relación con la secuencia de la fitoeno sintasa (SEQ ID NO:2). Como controles no homólogos, se utilizaron secuencias no vegetales obtenidas del gusano de la raíz del maíz (“CRW”, corn rootworm), SEQ ID NO:27, 28, 29 y 30. Algunos de los polinucleótidos incluían una secuencia promotora de T7 (indicada por el texto en minúsculas en la Tabla 3) que es un promotor reconocido por una ARN polimerasa del bacteriófago T7.

109) En todos los ensayos descritos en este ejemplo, se utilizó el siguiente procedimiento. En todos los ensayos se utilizaron plantas de Nicotiana benthamiana de cuatro semanas. Las plantas se trataron con solución de Silwet L-77 al 0,1% recién preparada con ddH2O (agua bidestilada). Durante algunos segundos, dos hojas completamente expandidas por planta (un cotiledón, una hoja verdadera), se sumergieron en la solución de Silwet L-77 y se dejaron secar durante 15-30 minutos antes de la aplicación de la composición polinucleotídica. La concentración final para cada oligonucleótido o polinucleótido fue de 25 microM (en Silwet L-77 al 0,01%, tampón de fosfato de sodio 5 mM, pH 6,8) a menos que se indique lo contrario. Se aplicaron 20 microlitros de la solución a la superficie superior de cada una de las dos hojas pretratadas para proporcionar un total de 40 microlitros (1 nmol de oligonucleótido o polinucleótido) para cada planta. La decoloración de la hoja se observó 3 días postratamiento.

110) La Figura 12A ilustra los resultados de un ensayo donde se aplicaron por separado, a plantas de tabaco, un polinucleótido de ARNbc de 200-meros con una secuencia de ARN correspondiente al segmento “PDS de 200-meros” (nucleótidos 914 - 1113 de la SEQ ID NO:2) y una combinación de oligonucleótidos y polinucleótidos de ADN monocatenario (SEQ ID NO:16, 17, 20, 21, 24, 25 y 26). El polinucleótido de ARNbc de 200-meros se aplicó a una concentración de 0,6 microM. Después del tratamiento tópico con los polinucleótidos y oligonucleótidos, se observó decoloración de las hojas apicales, lo que indicaba la regulación o supresión sistémica del gen diana de fitoeno desaturasa.

111) La Figura 12B ilustra los resultados del análisis de transferencia Northern de ARN aislado de plantas de Nicotiana benthamiana tratadas con tampón (control), con el polinucleótido de ARNbc de 200 meros y con los oligonucleótidos de ADNmc. También se muestra el ARN aislado de plantas que se habían sometido a estrés manteniéndolas a 4 grados centígrados y en la oscuridad durante toda la noche antes del tratamiento con los polinucleótidos de ARNbc de 200 meros.

112) La Figura 13 ilustra los fenotipos observados el día 12 después del tratamiento en otro ensayo del efecto de doce combinaciones de polinucleótidos u oligonucleótidos (véase la Tabla 4). La Tabla 4 también indica observaciones de decoloración visible de las plantas el día 5 después del tratamiento y los resultados de las mediciones de clorofila llevadas a cabo los días 7 y 12 después del tratamiento. Las mediciones de clorofila son un indicador de la supresión del gen diana de fitoeno desaturasa y las mediciones que se llevaron a cabo en 6 lugares del área apical, enfocándose en hojas visiblemente blanqueadas o (en plantas sin decoloración visible) en hojas en ubicaciones equivalentes en las plantas; los valores de medición de clorofila más bajos indicaron supresión de la fitoeno desaturasa. Estos resultados muestran que las combinaciones de oligonucleótidos y polinucleótidos en los tratamientos 2, 3, 4, 8 y 11 fueron eficaces para regular (suprimir) sistemáticamente el gen diana en las plantas tratadas; el tratamiento 1 también produjo la regulación (supresión) sistemática del gen diana en menor medida. El polinucleótido de ARNbc de 200-meros también fue eficaz para regular (suprimir) sistemáticamente el gen diana en las plantas tratadas. Los oligonucleótidos de un gen no homólogo (gusano de la raíz de maíz) (tratamientos 5 y 6) no suprimieron el gen de la fitoeno desaturasa diana. Estos resultados demuestran que los oligonucleótidos y polinucleótidos de ADN monocatenario sentido y antisentido fueron eficaces para regular (suprimir) sistemáticamente el gen diana en las plantas tratadas. En este ejemplo específico, los oligonucleótidos sentido con el promotor de T7 (tratamiento 1) produjeron una supresión sistemática débil del gen de la fitoeno desaturasa, mientras que los oligonucleótidos sentido sin el promotor de T7 (tratamiento 7) no suprimieron el gen de la fitoeno desaturasa. En este ejemplo específico, los oligonucleótidos antisentido con el promotor de T7 (tratamiento 2) así como los oligonucleótidos antisentido sin el promotor de T7 (tratamiento 8), proporcionaron una decoloración intensa, indicando una regulación sistémica intensa del gen diana de la fitoeno desaturasa.

Tabla 4

113) La Tabla 5 muestra seis polinucleótidos: un segmento de 40 meros (“ADNmc sentido de 40 meros de PDS”, SEQ ID NO:31) que consiste en los 40 nucleótidos que están en la posición más en 5' de la “PDS de 700 meros” (nucleótidos 1081 - 1120 de SEQ ID NO:2) y cuatro polinucleótidos de ADN monocatenario antisentido y un polinucleótido de ADN monocatenario sentido sintetizado basándose en la secuencia de “ADNmc sentido de 40 meros de PDS” (SEQ ID NO:31). La Figura 14 ilustra los resultados del tratamiento tópico de plantas de tabaco con los polinucleótidos y oligonucleótidos. Se observó una decoloración intensa de las hojas apicales que indica la regulación o supresión sistémica del gen diana de la fitoeno desaturasa después del tratamiento tópico con el ADNmc antisentido de 21 meros de PDS y el ADNmc antisentido de 33 meros de PDS, así como también después del tratamiento tópico con el polinucleótido de ARNbc de 700 meros amplificado por PCR y purificado en columna (“ARNbc de 700 meros de PDS”), oligonucleótidos de PDS antisentido de 22 meros sometidos a ensayo previamente con un promotor de T7 (SEQ ID NO:20 and 21) (“PDS antisentido de T7”) u oligonucleótidos de PDS antisentido de 22 meros sometidos a ensayo previamente sin un promotor de T7 (SEQ ID NO:22 y 23) (“PDS antisentido”). No se observó, o apenas se observó, decoloración de las hojas apicales después del tratamiento tópico solo con tampón (“tampón”) o después del tratamiento tópico con polinucleótido de ARNbc de 700 meros desnaturalizado por calor (5 minutos a 95 grados centígrados, a continuación conservados en hielo) (“ARNbc de 700 meros de PDS calentado”), el ADNmc antisentido de 15 meros de PDS o el ADNmc antisentido de 18 meros de PDS.

Tabla 5

114) Los resultados de otro ensayo se muestran en la Figura 15, se observó una decoloración intensa de las hojas apicales indicando una regulación o supresión sistémica del gen diana de la fitoeno desaturasa después del tratamiento tópico con el ADNmc antisentido de 21 meros de PDS (SEQ ID NO:34, “PDS antisentido de 21 nt”) o con oligonucleótidos de 22 meros antisentido de PDS sometidos a ensayo previamente sin un promotor de T7 (SEQ ID NO:22 y 23) (“PDS antisentido”). No se observó, o apenas se observó, una decoloración visible de las hojas apicales después del tratamiento tópico solo con tampón (“control: tampón”) o después del tratamiento tópico con ADNmc sentido de 21 meros de PDS (SEQ ID NO:36, ^{“ P d S}sentido de 21 nt”).

Ejemplo 11

115) Este ejemplo ilustra el tratamiento de plantas en crecimiento con una composición aplicada por vía tópica para inducir el silenciamiento sistémico de un gen diana en una planta que incluye (a) un agente para acondicionar una planta a la infiltración de polinucleótidos y (b) polinucleótidos que incluyen al menos una cadena polinucleotídica que incluye al menos un segmento de 18 o más nucleótidos contiguos del gen diana en orientación antisentido o sentido. Más específicamente, este ejemplo demuestra la especificidad diana (especificidad secuencial) de los polinucleótidos.

116) La fitoeno desaturasa (PDS) de palmera amaranto tiene la secuencia

TCAATTTCATCTATTGGAAGTGATTTTTTGGGTCATTCTGTGAGAAATTTCAGTGTTAGTAAAGTTT ATGGAGCAAAGCAAAGAAATGGGCACTGCCCTTTAAAGGTTGTTTGTATAGATTATCCTAGGCCA G AGCTT G AAAGT ACAT CC AATTT CTT GG AAG CC G CCTACTT AT CTT CTACTTTT CG GAATT CG CCTC GTCCTCAGAAGCCATTAGAAGTTGTAATTGCTGGAGCAGGTTTGGCTGGTCTATCCACGGCAAAGT ATTTAGCTGATGCAGGTCACAAACCCATATTGTTGGAAGCACGAGATGTTTTAGGAGGAAAGGTT GCAGCGTGGAAGGATGAGGATGGTGACTGGTATGAGACTGGGCTACATATATTCTTTGGGGCATA TCCAAATGTCCAAAATCTATTTGGAGAACTTGGTATAAATGACCGACTGCAATGGAAGGAGCACT CTATGATTTTTGCAATGCCCAGCAAGCCCGGTGAATTCAGTCGCTTTGATTTTCCCGAAATCCTGCC TGCACCATTAAATGGCATATGGGCAATCCTAAGAAATAATGAAATGCTAACCTGGCCAGAAAAAA TCAAGTTTGCCATTGGCTTGTTGCCTGCTATGGCAGGCGGACAGTCATATGTTGAAGCACAAGATG GTTT G AGT G T CC AAG AGT G G AT G AG AAAAC AAG G AGT ACCCGATCGTGTAACT G AT GATGTGTTT ATTGCCATGTCAAAGGCACTGAACTTCATAAATCCCGATGAACTTTCAATGCAGTGCATCTTGATT GCTCTGAACCGATTCCTGCAGGAGAAACATGGTTCTAAGATGGCCTTCCTAGACGGAAACCCTCCAGAG AGGCTGTGCATGCCTATTGTTAAACACATCGAGTCACTAGGTGGTGAAGTTAAACTTAACTCTCGTATACA AAAGATTCAGTTGGACCAGAGTGGAAGCGTGAAGAGTTTTTTGCTAAATAACGGGAGGGAAATACGAGGA GATGCCTATGTTTTTGCCACCCCAGTTGACATCTTGAAGCTGTTACTACCTGATACTTGGAAGGAA T CAATTT C AT CTATTG G AAGT G ATTTTTTGGGT C ATT CTGT GAG AAATTT CAGT G TTAG T AAAG TTT ATGGAGCAAAGCAAAGAAATGGGCACTGCCCTTTAAAGGTTGTTTGTATAGATTATCCTAGGCCA GAGCTTGAAAGTACATCCAATTTCTTGGAAGCCGCCTACTTATCTTCTACTTTTCGGAATTCGCCTC GTCCTCAGAAGCCATTAGAAGTTGTAATTGCTGGAGCAGGTTTGGCTGGTCTATCCACGGCAAAGT ATTTAGCTGATGCAGGTCACAAACCCATATTGTTGGAAGCACGAGATGTTTTAGGAGGAAAGGTT GCAGCGTGGAAGGATGAGGATGGTGACTGGTATGAGACTGGGCTACATATATTCTTTGGGGCATA TCCAAATGTCCAAAATCTATTTGGAGAACTTGGTATAAATGACCGACTGCAATGGAAGGAGCACT CTATGATTTTTGCAATGCCCAGCAAGCCCGGTGAATTCAGTCGCTTTGATTTTCCCGAAATCCTGCC T GCACCATTAAAT GGCATATGGGCAAT CCTAAGAAATAATGAAATGCT AACCTGGCCAGAAAAAA T CAAGTTT G C C ATTGG CTT GTTGCCTGCTATGGCAGGCG G AC AGT C ATAT GTTG AAG C ACAAG AT G ATCTCATACTTCAAAAAACTTGAGAAATTAGTGGGCGTTCCTGTGATTAATGTTCACATATGGTTT GACAGAAAATTAAAGAATACATATGACCATCTACTCTTCAGCAGGAGTCCTCTTTTGAGTGTCTAT GCTGATATGTCGGAGACATGCAAGGAATATAAGGATCCAAATAGATCCATGCTGGAATTGGTTTTT GCACCCGCGGAGGAATGGATTTCACGAAGCGACACTGATATTATAGAGGCAACAATGAAAGAGCT TGCCAAGCTTTTCCCGGATGAAATCGCTGCCGATGGAAGCAAGGCCAAGATCCTCAAATATCATGT CGTCAAAACTCCAAGGTCGGTTTATAAGACTGTACCGGATTGTGAACCTTGTCGGCCGCTGCAAAG ATC ACC AATAG AG GGTTTCTATTTAG CTG GTG ATTAC AC AAAACAAAAATATTTG GCTTCTATG GA AGGTGCTGTCTTATCTGGGAAGCTTTGTGCACAGGCTATCGTACAGGATTATGATCTGCTGAGTTC TCGAG-CACAAAGAGAATTGGCG (SEQ ID NO:37) se sintetizaron un polinucleótido de ARNbc de 678 pares de bases con una cadena antisentido capaz de hibridarse con el ARN codificado por los nucleótidos en las posiciones 317 - 994 (se muestran como texto subrayado) en la SEQ ID NO:37 y un polinucleótido de ARNbc de 198 pares de bases con una cadena antisentido capaz de hibridarse con el ARN codificado por los nucleótidos en las posiciones 797 - 994 (se muestran como texto en cursiva y subrayado) en la SEQ ID NO:37.

117) La fitoeno desaturasa de Nicotiana benthamiana tiene la secuencia

ATGCCCCAAATCGGACTTGTATCTGCTGTTAATTTGAGAGTCCAAGGTAATTCAGCTTATCTTTGGA GCTCGAGGTCTTCGTTGGGAACTGAAAGTCAAGATGTTTGCTTGCAAAGGAATTTGTTATGTTTTG GTAGTAGCGACTCCATGGGGCATAAGTTAAGGATTCGTACTCCAAGTGCCACGACCCGAAGATTG ACAAAGGACTTTAATCCTTTAAAGGTAGTCTGCATTGATTATCCAAGACCAGAGCTAGACAATACA GTTAACTATTTGGAGGCGGCGTTATTATCATCATCGTTTCGTACTTCCTCACGCCCAACTAAACCAT TGGAGATTGTTATTGCTGGTGCAGGTTTGGGTGGTTTGTCTACAGCAAAATATCTGGCAGATGCTG GTCACAAACCGATATTGCTGGAGGCAAGAGATGTCCTAGGTGGGAAGGTAGCTGCATGGAAAGAT GATGATGGAGATTGGTACGAGACTGGGTTGCACATATTCTTTGGGGCTTACCCAAATATGCAGAAC CTGTTTGGAGAACTAGGGATTGATGATCGGTTGCAGTGGAAGGAACATTCAATGATATTTGCGATG CCTAACAAGCCAGGGGAGTTCAGCCGCTTTGATTTTCCTGAAGCTCTTCCTGCGCCATTAAATGGA ATTTTGGCCATACTAAAGAACAACGAAATGCTTACGTGGCCCGAGAAAGTCAAATTTGCTATTGGA CTCTTGCCAGCAATGCTTGGAGGGCAATCTTATGTTGAAGCTCAAGACGGTTTAAGTGTTAAGGAC TGGATGAGAAAGCAAGGTGTGCCTGATAGGGTGACAGATGAGGTGTTCATTGCCATGTCAAAGGC ACTTAACTTCATAAACCCTGACGAGCTTTCGATGCAGTGCATTTTGATTGCTTTGAACAGAT7TGTTC AGGAGAAACATGGTTCAAAAATGGCCTTTTTAGATGGTAACCCTCCTGAGAGACTTTGCATGCCGATTGTG GAA CA TA TTGA G TCA AAAG GTG GC CAA G TCA G ACTA A A CTCA CGAA TAAAAAA GA TCGAGC TGAA TGA G G ATGGAAGTG TCAAA TGTTTTA TA C TGAA TAA TGGCAG TAC AATTAAAG G AG ATG CTTTTGTGTTTG CC A CT CCAGTGGATATCTT GAAGCTT CTTTTGCCTGAAGACTGGAAAGAGATCCCAT ATTTCCAAAAGT T GG AG AAG CT AGT GGGAGTTCCTGTGAT AAAT GTCC AT ATAT GGTTT GAC AG AAAACT G AAGAAC ACATCTGATAATCTGCTCTTCAGCAGAAGCCCGTTGCTCAGTGTGTACGCTGACATGTCTGTTACAT GTAAGGAATATTACAACCCCAATCAGTCTATGTTGGAATTGGTATTTGCACCCGCAGAAGAGTGGA T AAATC GT AGTG ACT CAG AAATTATTG ATG CTACAATGAAG G AACT AG CG AAGCTTTTCC CTG ATG AAATTTCGGCAGATCAGAGCAAAGCAAAAATATTGAAGTATCATGTTGTCAAAACCCCAAGGTCT GTTTATAAAACTGTGCCAGGTTGTGAACCCTGTCGGCCCTTGCAAAGATCCCCTATAGAGGGTTTT TATTTAGCTG GTG ACTAC AC G AAAC AG AAGT ACTTGG CTTC AAT G G AAGGT GCTGTCTT AT CAG GA AAGCTTTGTGCACAAGCTATTGTACAGGATTACGAGTTACTTCTTGGCCGGAGCCAGAAGATGTTG GCAGAAG-CAAGCGTAGTTAGCATAGTGAACTAA (SEQ ID NO:38). Se sintetizaron un polinucleótido de ARNbc de 685 pares de bases con una cadena antisentido capaz de hibridarse con el ARN codificado por los nucleótidos en las posiciones 421 - 1105 (se muestran como texto subrayado) en la SEQ ID NO:38 y un polinucleótido de ARNbc de 192 pares de bases con una cadena antisentido capaz de hibridarse con el ARN codificado por los nucleótidos en las posiciones 914 -1105 (se muestran como texto en cursiva y subrayado) en la SEQ ID NO:38.

118) Se llevó a cabo una alineación de las secuencias de ADN de PDS de palmera amaranto y Nicotiana benthamiana utilizando una alineación por pares global (extensor) y se ilustra en la Figura 16; con este procedimiento las dos secuencias mostraron una identidad de aproximadamente 71 % (1252/1762).

119) Las plantas de palmera amaranto, que tenían 16 copias de EPSPS y 5 - 8 pulgadas de altura, se trataron con solución de Silwet L-77 al 0,1% recién preparada con H2O bidestilada. Durante algunos segundos, cuatro hojas completamente expandidas por planta se sumergieron en la solución de Silwet L-77 y se dejaron secar durante 30 minutos hasta 1 hora antes de la aplicación de la composición polinucleotídica. Se prepararon soluciones individuales de polinucleótidos para cada uno de ARNbc de PDS de palmera de 678 pb, ARNbc de PDS de palmera de 198 pb, ARNbc de PDS de Nicotiana benthamiana de 685 pb y ARNbc de PDS de Nicotiana benthamiana de 192 pb (0,6 micromolar de polinucleótido en Silwet L-77 al 0,01%, tampón de fosfato de sodio 5 mM, pH 6,8). Se aplicaron 10 microlitros de solución de polinucleótido (o tampón como control) sobre la superficie superior de cada una de las cuatro hojas pretratadas por planta, para proporcionar un total de 40 microlitros para cada planta. Las plantas se mantuvieron en una cámara de crecimiento y la decoloración de las hojas se observó 3 días postratamiento. Las plantas tratadas por vía tópica con ARNbc de PDS de palmera de 678 pb o ARNbc de PDS de palmera de 198 pb, mostraron decoloración de las hojas (lo que indica silenciamiento de la fitoeno desaturasa endógena) pero las plantas de palmera amaranto tratadas por vía tópica con ARNbc de PDS de Nicotiana benthamiana de 685 pb o ARNbc de PDS de Nicotiana benthamiana de 192 pb no mostraron decoloración de las hojas. Esta especificidad secuencial demuestra que las composiciones polinucleotídicas y los procedimientos de la invención son útiles para el control selectivo de una especie o taxón dado que tiene una secuencia de gen diana específica, por ejemplo, para el control de plantas con crecimiento espontáneo resistentes a herbicidas que crecen en un campo de plantas de cultivo resistentes al mismo herbicida.

120) En un ensayo distinto, las plantas de palmera amaranto tratadas por vía tópica con ARNbc de PDS de palmera 678 pb (marcadas como “ARNbc de PDS de 700 nt”) o ARNbc de PDS de palmera de 198 pb (marcadas como “ARNbc de PDS de 200 nt”) mostraron decoloración de las hojas (lo que indica el silenciamiento de la fitoeno desaturasa endógena) pero las plantas de palmera amaranto tratadas por vía tópica con un ARNbc de 260 pares de bases de un gen de invertebrado (marcado como “ARNbc de DV49 de 260 nt”, del gusano Diabrotica virgifera de la raíz de maíz) no dieron como resultado un fenotipo de decoloración, indicando que no hubo silenciamiento de la fitoeno desaturasa endógena (Figura 17). Esta especificidad secuencial demuestra que las composiciones polinucleotídicas y los procedimientos de la invención son útiles para el control selectivo de una especie o taxón dado.

Ejemplo 12

121) Este ejemplo describe el uso de una composición aplicada por vía tópica que incluye al menos una cadena polinucleotídica que incluye al menos un segmento de 18 o más nucleótidos contiguos de un gen diana en orientación antisentido o sentido para inducir el silenciamiento sistémico de un gen diana en una planta. Más específicamente, este ejemplo demuestra el uso de un único tratamiento con un oligonucleótido de fitoeno desaturasa (PDS) para inducir el silenciamiento sistémico en diferentes órganos vegetales, incluidos hojas, tallos y flores.

122) En todos los tratamientos se utilizaron plantas de tabaco (Nicotiana benthamiana) de cuatro semanas. Se acondicionaron dos hojas completamente expandidas (un cotiledón, una hoja verdadera) sumergiéndolas durante algunos segundos, en solución de tensioactivo recién preparada (Silwet L-77 al 0,1 % en agua bidestilada) y se dejaron secar durante 15 - 30 minutos. Se aplicaron veinte microlitros de un oligonucleótido de 22 meros de ADN monocatenario (ADNmc) con la secuencia GGCAGTACAATTAAAGGAGATG (SEQ ID NO:39), correspondiente a los nucleótidos en las posiciones 1099 - 1120 de la fitoeno desaturasa de Nicotiana benthamiana (SEQ Id NO:2) como 25 micromolares de solución en Silwet L-77 al 0,01 % en tampón de fosfato de sodio 5 milimolar, pH 6,8 sobre la superficie superior de cada hoja acondicionada para un total de 40 microlitros (1 nanomol de oligonucleótido) por planta. Las plantas de control se trataron con la solución de Silwet sin el oligonucleótido de ADN. Las plantas se observaron para determinar la decoloración 3 días postratamiento. Todas las hojas apicales, los tallos y las flores de las plantas tratadas con el oligonucleótido de ADN mostraron decoloración, indicando el silenciamiento sistémico de PDS (Figura 18A).

123) Se dejó que las flores de las plantas tratadas con ADNmc y control produjeran semillas. Se recogieron semillas de frutas maduras, se pesaron y se dejaron germinar. Los pesos de las semillas eran idénticos (aproximadamente 11 mg por 100 semillas) y la morfología de la semilla parecía similar entre las plantas tratadas con ADNmc y con control. Se observó una cantidad reducida de semillas producidas por fruta y una reducción en la tasa de germinación (4 de 100 semillas germinaron) en las semillas de las plantas tratadas con ADNmc, en comparación con la cantidad de semillas por fruta y tasa de germinación (95 de 100 semillas germinaron) de semillas de plantas de control.

124) En un ensayo distinto utilizando un procedimiento similar, se acondicionaron plantas de tabaco sumergiéndolas en Silwet L-77 al 0,1% en agua bidestilada, se dejaron secar durante 15-30 minutos y se trataron con ADNmc de 22 meros de PDS (SEQ ID NO:39) aplicado como una solución 25 micromolar en Silwet L-77 al 0,01 % en tampón de fosfato de sodio 5 milimolar, pH 6,8, sobre la superficie superior de cada hoja acondicionada para un total de 40 microlitros (1 nanomol de oligonucleótido) por planta. Otras plantas no se acondicionaron con tratamiento de tensioactivo pero se trataron solo con 1 nanomol de ADNmc de 22 meros de PDS (SEQ ID NO:39) aplicado mediante infiltración con una jeringa sin aguja (se muestra en la Figura 18B) o mediante aplicación manual de gotas sobre la superficie de la hoja (no se muestra en la Figura 18B) y como una solución 25 micromolar en Silwet L-77 al 0,01 % en tampón de fosfato de sodio 5 milimolar, pH 6,8 o como una solución 25 micromolar en tampón de fosfato de sodio 5 milimolar, pH 6,8 (sin tensioactivo). Las plantas de control negativo se trataron con la solución tampón Silwet sin el oligonucleótido de ADN. Los resultados se muestran en la Figura 18B. Todas las plantas tratadas solo con aplicación directa del ADNmc de PDS (sin acondicionamiento mediante tratamiento con tensioactivo Silwet L-77), ya sea aplicado por infiltración o por aplicación manual de gotas, mostraron decoloración de las hojas apicales, de los tallos y las flores, indicando el silenciamiento sistémico de PDS.

Ejemplo 13

125) Este ejemplo ilustra procedimientos y composiciones aplicadas por vía tópica para inducir el silenciamiento sistémico que incluye el uso de agentes para acondicionar una planta para la infiltración de polinucleótidos. Más específicamente, este ejemplo describe el uso de polinucleótidos de la invención para controlar la palmera amaranto resistente a herbicidas.

126) Las plantas de palmera amaranto que tienen una cantidad menor (menos de 30) de copias de 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) son susceptibles al tratamiento con ARNbc diseñado para silenciar la EPSPS con posterior tratamiento con glifosato (véanse los detalles en el Ejemplo 1). Sin embargo, las plantas de palmera amaranto que tienen grandes cantidades de copias de EPSPS (es decir, 30 o más copias de EPSPS) son resistentes al tratamiento con glifosato y son un desafío para la gestión de la resistencia a malezas. Por ejemplo, en un ensayo (no se muestran los resultados) en palmera amaranto resistente a glifosato con gran cantidad de copias utilizando tratamientos similares a los descritos en el Ejemplo 1 pero donde se aumentó la dosis de ARNbc hasta diez veces (es decir, 8 nanomoles de los ARNbc cortos descritos en el Ejemplo 1 por planta) o donde se utilizó una formulación de glifosato patentada (herbicida de la marca “Roundup® WeatherMAX®”) combinada con un tensioactivo de amina de sebo, la actividad del glifosato mejoró (estimada mediante la observación del crecimiento de la planta medido por la altura de la planta) pero las plantas resistentes no murieron.

127) Utilizando las condiciones de tratamiento indicadas en la Tabla 6 , tres líneas diferentes de palmera amaranto resistente a glifosato con gran cantidad de copias (3 plantas por repetición) se trataron con ARNbc, en las que el vehículo de suministro de ARNbc, el agente de infiltración o de acondicionamiento y el orden de las etapas se modificaron. Los resultados se muestran en la Figura 19. El tratamiento solocon glifosato “4X” (es decir, tratamiento con 3360 g de equivalente ácido por hectárea de herbicida de la marca Roundup® WeatherMAX® que es cuatro veces mayor a la tasa estándar de aplicación de 840 g de equivalente ácido por hectárea), no causó la muerte de la palmera amaranto con 35 copias (experimento 3) ni con 57 copias (experimento 6).

128) En un conjunto de experimentos (1 - 3, Tabla 6), que incluían sulfato de amonio al 2% en un vehículo de suministro de ARNbc acuoso que comprendía tensioactivo de amina de sebo al 0,1% y glicerol al 10% (experimento 2), se mejoró la eficacia de una dosis 10 veces mayor de ARNbc con posterior aplicación de un glifosato 4X. También se observó una eficacia mejorada de una dosis 10 veces mayor de ARNbc con posterior aplicación de glifosato cuando se incluyó sulfato de amonio en un vehículo de suministro ARNbc sin un tensioactivo de amina de sebo (experimento 8).

129) En otro conjunto de experimentos (4 - 6, Tabla 6), la aplicación del tensioactivo Silwet L-77, antes de la aplicación del ARNbc en un vehículo de suministro que contiene sulfato de amonio, fue eficaz, mientras que la combinación del tensioactivo Silwet L-77 con el ARNbc en el vehículo de suministro de ARNbc que contenía sulfato de amonio no fue eficaz. La aplicación de glifosato (herbicida de la marca “Roundup® WeatherMAX®”) a las 72 horas (experimento 7) fue menos eficaz que la aplicación de glifosato a las 48 horas (experimento 2) después del tratamiento con ARNbc.

Tabla 6

*el glifosato (como la formulación comercial del herbicida de la marca “Roundup® WeatherMAX®, que contiene 660 g/l de sal de glifosato K+ en un portador que incluye la mezcla de tensioactivo de amina de sebo MON56151 de amina de sebo (16-18C) y cocoamina (12-14C) en la relación 55:45) se indica en la cantidad utilizada (donde 1X = 840 g de equivalente ácido por hectárea de herbicida de la marca Roundup® WeatherMAX®, 4X = 3360 g de equivalente ácido por hectárea de herbicida de la marca Roundup® WeatherMAX®) y horas después de la aplicación del ARNbc

Ejemplo 14

130) Este ejemplo ilustra procedimientos y composiciones aplicadas por vía tópica para inducir el silenciamiento sistémico que incluyen el uso de agentes para acondicionar una planta para la infiltración mediante polinucleótidos.

131) Se descubrió que dos ARN pequeños identificados a través de secuenciación de ARN pequeño eran abundantes y exclusivos de plantas de palmera amaranto que se habían tratado con cuatro moléculas oligonucleotídicas de ARNbc de EPSPS de tamaño “corto” tal como se describió en el Ejemplo 1. Estos dos ARN pequeños se mapearon respectivamente en las posiciones nucleotídicas 743 - 764 y 566 - 585 de la EPSPS de longitud completa que tiene la secuencia mostrada en la Figura 20 (SEQ ID NO:40). Se diseñaron dos moléculas oligonucleotídicas de ARNbc de tamaño “corto” de 25 nucleótidos de longitud con una cadena antisentido capaz de hibridarse con el ARNm transcrito a partir del gen EPSPS de palmera amaranto en las posiciones nucleotídicas 743 - 767 (“ARNbc-5 corto”) y 564 - 588 (“ARNbc-6 corto”), tal como se indica mediante los nucleótidos en cursiva subrayados en la SEQ ID NO:40 que se muestra en la Figura 20, que también muestra las cuatro moléculas oligonucleotídicas de ARNbc de EPSPS de tamaño “corto” (texto subrayado sin cursiva) y los tres polinucleótidos de ARN bicatenario “largos” (texto en negrita), tal como se describió en Ejemplo 1.

132) La aplicación de una mezcla de cuatro moléculas oligonucleotídicas de ARNbc de EPSPS de tamaño “corto” (descritas en el Ejemplo 1) con posterior aplicación de glifosato repitiendo el procedimiento de tratamiento descrito en el Ejemplo 1, dio como resultado la muerte de 4 de 4 plantas de palmera amaranto con 16 copias de EPSPS. El uso del mismo procedimiento de tratamiento pero aplicando conjuntamente ARNbc 5 corto y ARNbc 6 corto, dio como resultado la muerte de 0 de 4 plantas de palmera amaranto. La adición de cualquiera o los dos ARNbc 5 corto y ARNbc 6 corto a la mezcla de las cuatro moléculas oligonucleotídicas de ARNbc de EPSPS de tamaño “corto” (descritas en el Ejemplo 1), dio como resultado la muerte de 4 de 4 plantas de palmera amaranto, es decir, no se observó ningún efecto antagonista del ARNbc 5 corto y del ARNbc 6 corto.

Ejemplo 15

133) Este ejemplo ilustra procedimientos y composiciones aplicadas por vía tópica para inducir el silenciamiento sistémico que incluyen el uso de agentes para acondicionar una planta para la infiltración mediante polinucleótidos. Más específicamente, este ejemplo describe el uso de ácido salicílico y polinucleótidos.

134) El ácido salicílico (SA) induce resistencia a virus en el tabaco; véase, por ejemplo, Chivasa y col. (1997) Plant Cell, 19:547 - 557. Las plantas de palmera amaranto resistentes a glifosato que tienen 49 o 63 copias de EPSPS se pretrataron con SA 15 milimolar. Manualmente, se aplicó una solución de las cuatro moléculas oligonucleotídicas de ARNbc de EPSPS de tamaño “corto” (descritas en el Ejemplo 1) 1, 5 o 24 horas después del tratamiento con SA, con posterior pulverización de glifosato 72 horas después (1682 g de equivalente ácido por hectárea de herbicida de la marca Roundup® WeatherMAX®). 7 días después del tratamiento con glifosato, no se observó ninguna mejora de los efectos de los ARNbc y de la actividad de glifosato (estimada observando el crecimiento de la planta medido por la altura de la misma) en ninguno de los tratamientos con SA.

Ejemplo 16

135) Este ejemplo ilustra procedimientos y composiciones aplicadas por vía tópica para inducir el silenciamiento sistémico que incluyen el uso de agentes para acondicionar una planta para la infiltración mediante polinucleótidos. Más específicamente, este ejemplo describe variaciones en cuanto al orden y el momento de la aplicación de los polinucleótidos y la solución de tensioactivo.

136) Estos ensayos se llevaron a cabo en plantas de palmera amaranto con grandes cantidades de copias (56, 63 o 100 copias) de EPSPS, utilizando un protocolo que incluye las siguientes etapas: (1) aplicación de ARNbc (una solución de las cuatro moléculas oligonucleotídicas de ARNbc de EPSPS de tamaño “corto” descritas en el Ejemplo 1) en una solución que contenía tensioactivo de amina de sebo y glicerol; (2) aplicación de tensioactivo de silicona Silwet L-77 al 1 %; y (3) aplicación de glifosato (1682 g de equivalente ácido por hectárea de herbicida de la marca Roundup® WeatherMAX®). Se evaluó la separación del momento de aplicación de los polinucleótidos y la aplicación de Silwet, aplicándose Silwet por pulverización al cabo de 30 minutos, 1 hora o 2 horas después de la aplicación de la solución de ARNbc. En este conjunto de ensayos, los tres momentos diferentes de la aplicación de la solución de Silwet, produjeron resultados similares, es decir, retraso en el crecimiento en la mayoría de las plantas con gran cantidad de copias que se trataron con la solución de ARNbc, tal como se comparó con las plantas de gran cantidad de copias control que se trataron con una solución control que contenía solo tensioactivo de amina de sebo y glicerol.

Ejemplo 17

137) Este ejemplo ilustra procedimientos y composiciones aplicadas por vía tópica para inducir el silenciamiento sistémico que incluyen el uso de agentes para acondicionar una planta para la filtración mediante polinucleótidos. Más específicamente, este ejemplo describe la aplicación de polinucleótidos de la invención mediante pulverización de bajo volumen y el uso de un tensioactivo de silicona y sulfato de amonio.

138) Mediante pulverización de bajo volumen, a la palmera amaranto que tenía 16 copias de EPSPS, se la aplicó una solución de ARNbc (una solución de las cuatro moléculas oligonucleotídicas de ARNbc de EPSPS de tamaño “corto” descritas en el Ejemplo 1) en una solución que contenía sulfato de amonio al 2 %, con posterior pulverización con glifosato (1682 g de equivalente ácido por hectárea del herbicida de la marca Roundup® WeatherMAX®), que produjo la muerte de las plantas de palmera amaranto.

139) Se trataron seis plantas de palmera amaranto por tratamiento con un procedimiento de tres etapas utilizando pulverización de bajo volumen: (1) pulverización de Silwet L-77 al 1%; (2) pulverización de 2 mililitros de una solución de ARNbc que contenía las mismas cantidades de las cuatro moléculas oligonucleotídicas de ARNbc de EPSPS de tamaño “corto” descritas en el Ejemplo 1 a una de 3 dosis (1X o 0,8 nanomoles por planta, 2X o 1,6 nanomoles por planta o 4X o 3,2 nanomoles por planta); y (3) pulverización de glifosato (1682 g de equivalente ácido por hectárea de herbicida de la marca Roundup® WeatherMAX®) a una tasa de 159 litros/acre. Nueve días después de la pulverización con glifosato, las seis plantas que se pulverizaron con 4X (3,2 nanomoles por planta) de ARNbc murieron y las plantas pulverizadas con 2X (1,6 nanomoles por planta) de ARNbc o 1X (0,8 nanomoles por planta) de ARNbc presentaban retraso en el crecimiento (Figura 21A).

140) Se llevaron a cabo varios ensayos en palmera amaranto resistente a glifosato cultivada a partir de semillas recogidas en el campo. Las plantas se trataron con varios protocolos descritos a continuación, tratándose por vía tópica algunas plantas con una solución de ARNbc y tratándose las plantas de control con tampón (vehículo de ARNbc); la aplicación se realizó mediante pulverización de bajo volumen. A menos que se indique lo contrario, la solución de ARNbc contenía las mismas cantidades de las cuatro moléculas oligonucleotídicas de ARNbc de EPSPS de tamaño “corto” descritas en el Ejemplo 1 en tampón a una dosis “4X” (3,2 nanomoles por planta); el tampón consistía en fosfato de sodio 10 milimolar y tensioactivo de organosilicona Silwet L-77 al 0,01 % (v/v) en agua con dietilpirocarbonato (DEPC) (Omega Bio-Tek) y se ajustó a un pH de 6,8; y el herbicida era un herbicida de glifosato aplicado a 840 g de equivalente ácido por hectárea de herbicida de la marca Roundup® WeatherMAX® a una tasa de 159 litros/acre. Los resultados se proporcionan en la Tabla 7.

141) Ensayos 1 y 2: Estos ensayos se llevaron a cabo en palmera amaranto resistente a glifosato cultivada a partir de semillas obtenidas de una muestra de suelo de una explotación agrícola con plantaciones conocidas de palmera amaranto resistente a glifosato. En el ensayo 1, se trataron diez plantas por tratamiento de la siguiente forma: (1) pulverización de Silwet L-77 al 1%; (2) pulverización de 2 mililitros de la solución de ARNbc; y (3) pulverización de glifosato. En el ensayo 2, se trataron dieciocho plantas por tratamiento utilizando el mismo procedimiento que en el ensayo 1.

142) Ensayo 3: Este ensayo comparó tratamientos aplicados a diferentes fases de desarrollo y utilizó plántulas cultivadas a partir de semillas de palmera amaranto de un sitio del Condado de Macon, GA y seleccionadas por su resistencia al glifosato. El tampón incluía sulfato de amonio al 2 %. Se trataron doce plántulas pequeñas (fase de hoja 3) o doce plántulas grandes (fase de hoja 5) por tratamiento de la siguiente forma: (1) pulverización de Silwet L-77 al 1 %; (2) pulverización de 2 mililitros de la solución de ARNbc; y (3) pulverización de glifosato. Este tratamiento proporcionó mejor control (murieron más plantas) en plántulas pequeñas en comparación con plántulas más grandes. El tratamiento con ARNbc causó la muerte de, o provocó retraso en el crecimiento en, más plantas resistentes a glifosato que el tratamiento con tampón y herbicida, aunque 16 días después del tratamiento no todas las plantas tratadas con ARNbc murieron.

143) Ensayos 4 y 5: Estos ensayos utilizaron plantas de palmera amaranto cultivadas a partir de semillas en suelo de una granja de Pemiscot, MO. El tampón incluía sulfato de amonio al 2 %. Se trataron once plántulas pequeñas (fase de hoja 3) por tratamiento de la siguiente forma: (1) pulverización de Silwet L-77 al 1 %; (2) pulverización de 2 mililitros de la solución de ARNbc; y (3) pulverización de glifosato. En el ensayo 5, se trataron doce plantas por tratamiento utilizando el mismo procedimiento que el del ensayo 4.

144) Ensayo 6: Este ensayo utilizó plantas de palmera amaranto cultivadas a partir de semillas en suelo de la granja “Ivy2”. El tampón incluía sulfato de amonio al 2 %. Se trataron dieciocho plántulas pequeñas (fase de hoja 3) por tratamiento de la siguiente forma: (1) pulverización de Silwet L-77 al 1 %; (2) aplicación de 2 mililitros de la solución de ARNbc, manualmente o mediante pulverización; y (3) pulverización de glifosato. En este ensayo el procedimiento de aplicación (manualmente o mediante pulverización) proporcionó resultados similares.

145) Ensayo 7: Este ensayo utilizó plántulas de palmera amaranto en la fase de hoja 3 a 4 cultivadas a partir de semillas f 3 seleccionadas por su resistencia al glifosato y por ser más resistentes al glifosato que las plantas de los ensayos 1 - 6. El tampón incluía sulfato de amonio al 2 %. Se trataron dieciocho plantas por tratamiento de la siguiente forma: (1) pulverización de Silwet L-77 al 1 %; (2) pulverización de 2 mililitros de la solución de ARNbc; y (3) pulverización de glifosato.

Tabla 7

Ejemplo 18

146) Este ejemplo ilustra procedimientos y composiciones aplicadas por vía tópica para inducir el silenciamiento sistémico que incluyen el uso de agentes para acondicionar una planta para la infiltración mediante polinucleótidos.

147) En este ensayo, la solución de ARNbc contenía las mismas cantidades de las cuatro moléculas oligonucleotídicas de ARNbc de EPSPS de tamaño “corto” descritas en el Ejemplo 1 a una dosis “10X” (8 nanomoles por planta) en una solución que contenía tensioactivo de amina de sebo al 0,2 % y sulfato de amonio al 2 % (identificada en la Figura 22 como “amina de sebo/AMS”) o uno de los siguiente reactivos de transfección: (a) una poliamina (JetPRIME™, Polyplus-transfection SA, Illkirch, Francia), (b) una nanopartícula magnética (SilenceMag, OZ Biosciences, Marsella, Francia), (c) un péptido (nanopartícula N-TERTM, Sigma-Aldrich, St. Louis, ^{M o ),}(d) un lípido (siPORT™ NeoFXTM, Ambion, Foster City, CA) o (e) un lípido/polímero catiónico (TransIT®, Mirus Bio, Madison, WI). Las plantas se trataron de la siguiente forma: (1) aplicación manual de la solución de ARNbc; (2) pulverización de Silwet L-77 al 1%; y (3) pulverización con glifosato aplicado a 840 g de equivalente ácido por hectárea de herbicida de la marca Roundup® WeatherMAX® a una tasa de 159 litros/acre. Cuando este protocolo se utiliza con ARNbc en la solución de tensioactivo de amina de sebo/sulfato de amonio, la palmera amaranto resistente a glifosato que tiene 35 copias de EPSPS, muere. Los resultados se muestran en la Figura 22. Se observó retraso en el crecimiento o muerte de las plantas en las plantas tratadas con ARNbc en soluciones que contenían poliamina (JetPRIME™), péptido (nanopartícula N-TERTM), lípido/polímero catiónico (TransIT®) o tensioactivo de amina de sebo/sulfato de amonio.

Ejemplo 19

148) Este ejemplo ilustra procedimientos que utilizan composiciones que incluyen polinucleótidos aplicados por vía tópica para inducir el silenciamiento sistémico en una planta. Más específicamente, este ejemplo describe el uso de diferentes tipos de polinucleótidos para inducir el silenciamiento sistémico.

149) Se adquirieron ADN monocatenarios (ADNmc) sentido y ARN monocatenarios (ARNmc) antisentido correspondientes al gen de EPSPS de la palmera amaranto en las posiciones 14 - 38, posiciones 153 - 177, 345 - 369 y 1105 -1129 (indicadas por los nucleótidos subrayados en la Figura 1) de Integrated ADN Technologies. Los ADNmc sentido y los ARNmc antisentido se emparejaron calentando la misma cantidad de moles de ADNmc y ARNmc mezclados a 95 grados centígrados durante 5 minutos y se enfriaron lentamente durante 1,5-2 horas hasta alcanzar temperatura ambiente para proporcionar los híbridos de ADN/ARN.

150) En los ensayos, se utilizaron plantas de palmera amaranto resistentes a glifosato de 16 copias utilizando este procedimiento: (1) pulverización de Silwet L-77 al 1 %; (2) aplicación manual sobre cuatro hojas maduras de cada planta para un total de 0,8 nanomoles de los ARNbc de EPSPS de palmera (tal como se describió en el Ejemplo 1) o de los híbridos de ADN/ARN de EPSPS de palmera; y (3) pulverización con glifosato aplicada a 840 g de equivalente ácido por hectárea de herbicida de la marca Roundup® WeatherMAX® a una tasa de 159 litros/acre.

151) Los resultados se representan en la Figura 23. Siete días después de la pulverización del herbicida, 4 de 6 plantas tratadas con ARNbc murieron y las 2 restantes estaban moribundas, mientras que las plantas pulverizadas con el híbrido de ADN/ARN presentaban retraso en el crecimiento (lesión por glifosato) en comparación con las plantas de control.

Ejemplo 20

152) Este ejemplo ilustra procedimientos que utilizan composiciones que incluyen polinucleótidos aplicados por vía tópica para inducir el silenciamiento sistémico en una planta. Más específicamente, este ejemplo describe el uso de tipos diferentes de polinucleótidos para inducir el silenciamiento sistémico.

153) En este ensayo, se utilizaron seis plantas de palmera amaranto resistentes a glifosato que tenían 16 copias de EPSPS por tratamiento. Manualmente, se aplicó un tratamiento de 0,8 nanomoles de ARNbc (“1X”) por planta, un tratamiento con una cantidad diez veces mayor (tratamiento de 8 nanomoles por planta, “10X”) de polinucleótidos de ADNmc (descritos en el Ejemplo 19) y tampón solo como control a plantas distintas en tampón que contenía sulfato de amonio al 2 % con posterior pulverización con glifosato a las 48 horas aplicado a 840 g de equivalente ácido por hectárea de herbicida de la marca Roundup® WeatherMAX® a una tasa de 159 litros/acre. La Figura 24 muestra los resultados. Ambos tratamientos con los polinucleótidos proporcionaron un mejor control de la palmera amaranto en comparación con plantas tratadas solo con tampón y herbicida. De las plantas tratadas con el tratamiento 10X ADNmc, dos de seis murieron y las cuatro restantes presentaron un retraso del crecimiento del 30%. De las plantas tratadas con el tratamiento con 1X ARNbc, las seis plantas murieron 8 días después de la pulverización de WM o 10 días después del tratamiento con ARNbc.

Ejemplo 21

154) Este ejemplo ilustra procedimientos que utilizan composiciones que incluyen polinucleótidos aplicados por vía tópica para inducir el silenciamiento sistémico en una planta. Más específicamente, este ejemplo describe la selección de una secuencia polinucleotídica para inducir el silenciamiento sistémico en una planta.

155) Se diseñaron doce ARNbc, cada uno de ellos con aproximadamente 250 pb y con una cadena del ARNbc correspondiente a la de las secuencias de ADN en mosaico de EPSPS de las SEQ ID NO:41-52 (Tabla 8) para cubrir, con una disposición en mosaico, la secuencia codificante completa y parte de las regiones 5' y 3' no traducidas del gen EPSPS de la palmera amaranto, tal como se muestra en la Figura 25A.

Tabla 8

156) Las cuatro moléculas oligonucleotídicas de ARNbc de EPSPS de tamaño “corto”, tales como las descritas en el Ejemplo 1 y en la Figura 1, están ubicadas en los segmentos 2, 3, 4 y 8 dispuestos en mosaico respectivamente y se muestran como barras de color gris claro dentro de dichos segmentos. Los polinucleótidos se sintetizaron mediante transcripción in vitro utilizando un vector pBR322 con los polinucleótidos de EPSPS insertados en los sitios de clonación EcoRI y BamHI; el ADN plasmídico se aisló con los kits de Qiagen Maxi prep y se digirió con las enzimas de restricción EcoRI y BamHI. La solución de ADN digerido se utilizó en el tratamiento de las plantas sin purificación adicional.

157) Las plantas de palmera amaranto resistentes a glifosato que tenían 16 copias de EPSPS se trataron de la siguiente forma: pulverización con Silwet L-77 al 1 %; (2) aplicación manual de una solución de ARNbc (que contenía polinucleótidos seleccionados de los doce segmentos dispuestos en mosaico de las cuatro moléculas de ARNbc “corto” descritas en el Ejemplo 1 a la tasa de 0,01 nanomol ADN/planta) o tampón como control; y (3) pulverización con glifosato 48 horas después aplicado a 840 g de equivalente ácido por hectárea de herbicida de la marca Roundup® WeatherMAX® a una tasa de 159 litros/acre. Se observó la altura por encima del suelo de las plantas tratadas 11 días después del tratamiento con herbicida; a las plantas que estaban muertas o muriendo se les asignó una altura de cero. Los resultados se muestran en las Figuras 25B y 25C. Las combinaciones de polinucleótidos de ARNbc que mostraron la mayor eficacia en este ensayo incluyeron las cuatro moléculas de ARNbc “corto” descritas en el Ejemplo 1, la combinación de los segmentos 2, 5, 8 y 11 dispuestos en mosaico y la combinación de los segmentos 7, 8 y 9 dispuestos en mosaico.

Ejemplo 22

158) Este ejemplo ilustra procedimientos que utilizan composiciones que incluyen polinucleótidos aplicados por vía tópica para inducir el silenciamiento sistémico en una planta. Más específicamente, este ejemplo describe la aplicación tópica de polinucleótidos con posterior aplicación de herbicida a una planta.

159) En un ensayo, las plantas de palmera amaranto resistentes a glifosato que tenían 16 copias de EPSPS, se pulverizaron con glifosato aplicado a 840 g de equivalente ácido por hectárea de herbicida de la marca Roundup® WeatherMAX® a una tasa de 159 litros/acre. Dos o 24 horas después de la aplicación de herbicida, las plantas se trataron con pulverización con Silwet L-77 al 1 %. De quince a 20 minutos después del tratamiento con Silwet, las plantas se trataron mediante aplicación manual con 0,8 nanomoles (“1X”) por planta de las cuatro moléculas oligonucleotídicas de ARNbc de EPSPS de tamaño “corto”, tal como se describieron en el Ejemplo 1, en tampón que contenía sulfato de amonio al 2 % o en tampón que contenía sulfato de amonio al 2 %. En este ensayo, las plantas de control no tratadas (“NT”) se trataron solo con pulverización de Silwet L-77 al 1 % pero no con herbicida o ARNbc. Los resultados se muestran en la Figura 26. En este ensayo, la aplicación de Silwet al 1 % dio como resultado una actividad de glifosato mejorada del 60 % cuando se aplicó 2 horas después de la pulverización del herbicida y del 20 % cuando se aplicó 24 horas después de la pulverización del herbicida. En este ensayo, la aplicación de Silwet al 1 % con posterior aplicación de ARNbc de EPSPS dio como resultado una actividad de glifosato mejorada de al menos el 80 % cuando se aplicó 2 horas después de la pulverización del herbicida y del 20 % cuando se aplicó 24 horas después de la pulverización del herbicida.

160) En otro ensayo, las plantas de palmera amaranto cultivadas a partir de semillas en suelo de una granja en Macon, GA, se pulverizaron con glifosato aplicado a 840 g de equivalente ácido por hectárea de herbicida de la marca Roundup® WeatherMAX® a una tasa de 159 litros/acre. Tres días después del tratamiento con herbicida, 9 de las 40 plantas murieron y 3 presentaron un retraso grave en el crecimiento. Las plantas supervivientes se pulverizaron con Silwet L-77 al 1 %, con posterior aplicación tópica manual de 8 nanomoles (“10X”) por planta de las cuatro moléculas oligonucleotídicas de ARNbc de EPSPS de tamaño “corto”, tal como se describieron en el Ejemplo 1 o de tampón como control. Tres días después, 3 plantas más en el grupo de las tratadas con ARNbc, murieron y 2 plantas más en el grupo de las tratadas con tampón murieron. En este punto (6 días después del tratamiento original con herbicida y 3 días después del tratamiento con Silwet/ARNbc o tampón), la mitad de las plantas supervivientes en cada grupo se pulverizó con una segunda aplicación de glifosato (aplicado a la misma dosis que la de la primera aplicación). Dos semanas después de este segundo tratamiento con herbicida, las plantas restantes tratadas con ARNbc mostraron un 80 % de lesión y las plantas restantes tratadas con tampón mostraron un 40 % de lesión.

Ejemplo 23

161) Este ejemplo ilustra procedimientos que utilizan composiciones que incluyen polinucleótidos aplicados por vía tópica para inducir el silenciamiento sistémico en una planta. Más específicamente, este ejemplo describe una aplicación tópica de una sola etapa de una sola composición que incluye polinucleótidos, tensioactivo y herbicida para controlar malezas resistentes a herbicidas.

162) Este ensayo se llevó a cabo en una población de campo de plantas de palmera amaranto resistentes a glifosato que se sabía que tenían cantidades muy grandes de copias de EPSPS (Gaines y col. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 107:1029-1034 informaron que las plantas de este sitio de estudio tenían de 5 a más de 160 copias de EPSPS). Los polinucleótidos utilizados en este ensayo eran una mezcla equimolar de las cuatro moléculas oligonucleotídicas de ARNbc de EPSPS de tamaño “corto”, tal como se describieron en Ejemplo 1.

163) Plantas de cuatro a seis pulgadas de altura se pulverizaron en un área de tratamiento de 1 pie por 5 pies en un solo tratamiento con 264 microgramos (“100X”) o 52,8 microgramos (“20X”) de los ARNbc de EPSPS en una solución que también contenía tensioactivo Silwet L-77 al 1 %, sulfato de amonio al 2 % y glifosato (aplicado a 1682 g de equivalente ácido por hectárea de herbicida de la marca Roundup® WeatherMAX® a una tasa de 159 litros/acre). Para la comparación, se pulverizaron otras plantas en áreas de tratamiento de 1 pie por 5 pies con glifosato (en una solución que también contenía tensioactivo Silwet L-77 al 1 % y sulfato de amonio al 2 %) aplicado a la misma tasa.

164) Los resultados se muestran en la Figura 27. El tratamiento de las plantas solo con glifosato (aplicado a 1682 g de equivalente ácido por hectárea de herbicida de la marca Roundup® WeatherMAX® a una tasa de 159 litros/acre) en una solución que también contenía Silwet L-77 y sulfato de amonio dio como resultado un control de aproximadamente 70 % (muerte de las plantas). El tratamiento de una etapa utilizando una composición que contenía 20X de los polinucleótidos de ARNbc de EPSPS, tensioactivo, sulfato de amonio y herbicida dio como resultado un control de aproximadamente 80 - 85 % de la palmera amaranto resistente a glifosato, que es la tasa de control aproximada obtenida mediante pulverización con glifosato aplicado a 6720 g de equivalente ácido por hectárea de herbicida de la marca Roundup® WeatherMAX® a una tasa de 159 litros/acre (es decir, 8 veces la tasa de aplicación estándar de aproximadamente 840 g de equivalente ácido por hectárea de herbicida de la marca Roundup® WeatherMAX® a una tasa de 159 litros/acre). El tratamiento de una etapa utilizando una composición que contenía 100X de los polinucleótidos de ARNbc de EPSPS, tensioactivo, sulfato de amonio y herbicida dio como resultado un control de aproximadamente 90 - 95 % de la palmera amaranto resistente a glifosato, que es la tasa de control aproximada obtenida mediante pulverización con glifosato aplicado a 13440 g de equivalente ácido por hectárea de herbicida de la marca Roundup® WeatherMAX® a una tasa de 159 litros/acre (es decir, 16 veces la tasa de aplicación estándar de aproximadamente 840 g de equivalente ácido por hectárea de herbicida de la marca Roundup® WeatherMAX® a una tasa de 159 litros/acre).

Ejemplo 24

165) Este ejemplo ilustra un procedimiento para inducir la regulación sistémica de un gen diana en una hortaliza mediante la aplicación tópica a la hortaliza de una molécula polinucleotídica que incluye un segmento con una secuencia nucleotídica esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en el gen diana o el ARN transcrito a partir del gen diana, por lo cual la molécula se infiltra en el interior de la hortaliza e induce la regulación sistémica del gen diana. En este ejemplo, se trataron hortalizas en crecimiento con una composición aplicada por vía tópica para inducir el silenciamiento sistémico de un gen diana en una hortaliza o planta de cultivo frutal que incluye (a) un agente para acondicionar una planta para la infiltración de polinucleótidos y (b) polinucleótidos que incluyen al menos una cadena polinucleotídica que incluye al menos un segmento de 18 o más nucleótidos contiguos del gen diana en orientación antisentido o sentido. Más específicamente, este ejemplo demuestra el uso de polinucleótidos aplicados por vía tópica para inducir el silenciamiento sistémico de un gen de fitoeno desaturasa (PDS) en una hortaliza, es decir, lechuga (Lactuca sativa).

166) La PDS de la lechuga tiene la secuencia

ATGTCT CTGTTT G G AAAT GTTTCT GC C ATT AACT C AAGT G GAAAGT G-TATAGT AAT G AAT CTTT CAA GCACACAAAT CACTT CAAG AGATT GTTT CAAGATTACCTC AGGGCAAAAAG AT -GTTTTGTCATTTG GATGCTGTGATGCTATGGGTAACAGATTGCAATTCCCAAGTGCTCGTTCTTTTACACCAA-GATCAA AG AAG AAT GT CTCCCCT CTAAAG GTAGTTTG T GTT G ATTAT CC AAGAC C AG AT CTT GAT AACAC AT CTAATTTCTTGGAAGCTGCTCACTTGTCTTCAACCTTCAGAACTTCCCCACGCCCATCTAAGCCATT GAAGATTGTAATTGCTGGTGCAGGTTTAGCTGGTTTATCAACTGCTAAGTATTTAGCTGATGCAGG TCACAAGCCAATTTTACTAGAAGCAAGAGATGTTCTTGGTGGAAAGGTGGCAGCTTGGAAAGATG AT GAT G GAG ATT G GTAT GAG ACAG GTTTAC AC AT ATT CTTT G G AGCTTACC C AAATGT ACAAAATT T ATTTGG AGAGCT AGGAATT AAT GAT AGATT ACAGTGGAAGG AGCATTCT AT GAT ATTTGCAATGC CAAATAAGCCTGGAGAATTTAGTAGGTTTGACTTCCCAGATGTTTTACCTGCACCATTGAATGGAA TTTTTGCTATATTGAGGAACAATGAAATGCTGACGTGGCCTGAGAAAGTGAAGTTTGCAATTGGGC TGTTGCCTGCAATGTTAGGTGGACAGGCTTATGTTGAGGCCCAAGATGGGCTTAGTGTTCAGGACT G GATG AG AAAG CAAG GTATAC CTG ATC G AGTTACT ACTG AAGTG TTTATTG C AATGTC AAAAG C A TTAAACTTTAT AAAT C C AG AT G AACTTT C AAT GC AAT GT ATT CT C ATT G CT CT AAACCGTTTT CTT C AGGAAAAGCATGGTTCCAAGATGGCATTTTTAGATGGGAGCCCACCAGAAAGACTTTGCAAGCCA ATTGTTGACCACATCGAGTCACTCGGTGGCCAAGTCAGAGTCAACTCACGAATACAAAAAATTGA GTTAAACAAAGACGGAACTGTCCGGAACTTTCTATTGAGTGATGGGAATGTTCTAGAAGCTGATGC TTATGTTTTCGCTACCCCTGTTGACATTCTCAAGCTTCTTTTACCCGAAGAATGGAAACCAATTCCA T ATTT C AAAAAATTAGAGAAGTTAGTCGGTGTTCCT GTT ATAAACGTT C AT ATATGGTTT G ACAG A AAGCTGAAAAACACATATGATCACTTACTTTTCAGTAGGTCACCTCTGCTGAGTGTGTATGCTGAC ATGT C AGT GAC AT GTAAG G AAT ATT AT GAT CC G AATAAG T CAAT GTTG G AGTT G GTT CTT G CTC C A GCT GAGG AATGG ATTTCAAG AAGT G ACACT GAT ATTATT GATGCAAC AAT G AGT GAACTTT CAAG G CTTTTTCCT GAT G AAATT GCAGCTGAT CAAAGT AAAG CAAAAAT C TT G AAATAT AAAGTT GTTAA AACACCAAGGTCTGTTTATAAAACTGTTCCAGATTGTGAACCATGTCGACCCCTACAAAGATCTCC AATTCAAGGATTTTATTTATCTGGTGATTATACTAAACAAAAGTATTTGGCTTCAATGGGGGGTGC T GTTTT ATCTG G AAAAATTT GTGC ACAAGCTATTTT AC AAG ATT AT G AG ATGCTT GCTAC A (SEQIDNO:53). Se sintetizaron ADN monocatenarios polinucleotídicos de 21-45 nucleótidos de longitud con las siguientes secuencias: taatacgactcactatagggtttggagcttacccaaATGtac (“HL286”, orientación sentido, SEQ ID NO:54), taatacgactcactatagggaggccacgtcagcatttcattgttc (“HL287”, orientación antisentido, SEQ ID NO:55), ccattcaATGgtgcaggtaaaac ( “HL288”, orientación antisentido, SEQ ID NO:56), catagaATGctccttccactg (“HL289”, orientación antisentido, SEQ ID NO:57) y caaataaattttgtacatttgggtaagctccaa (“HL290”, orientación antisentido, SEQ ID NO:58). Se preparó una solución de ADNmc con una misma mezcla de los cinco polinucleótidos en Silwet L-77 al 0,01 % en tampón de fosfato de sodio 5 milimolar, pH 6,8.

167) En los ensayos se utilizó la variedad de lechuga LS49 “Green Tower”. Durante algunos segundos, dos hojas completamente expandidas se sumergieron en una solución recién preparada de Silwet L-77 al 0,1 % en agua bidestilada. Las hojas se dejaron secar durante 15-30 minutos. A continuación, cada planta se trató aplicando 20 microlitros de solución de ADNmc sobre la superficie superior de dos hojas tratadas con Silwet (en total 40 microlitros por planta). La Tabla 9 indica las condiciones del ensayo utilizadas y la decoloración observada de plantas tratadas por vía tópica con polinucleótidos de ADNmc. La Figura 28 representa (de arriba a abajo) la evolución de la decoloración y muerte de las plantas de lechuga tratadas con ADNmc 1 nanomol por planta, 37, 46 y 60 días después del tratamiento.

Tabla 9

168) Los ensayos se repitieron con 2 o 4 nanomoles de ADNmc aplicados por planta. La Figura 29A muestra el silenciamiento sistémico puesto de manifiesto por la decoloración observada 4 o 12 días después del tratamiento tópico con los polinucleótidos.

169) Los ensayos se repitieron utilizando cada ADNmc individual antisentido (“HL287”, SEQ ID NO:55; “HL288”, SEQ ID NO:56; “HL289”, SeQ ID NO:57; y “HL290”, SEQ ID NO:58) aplicándose 8 nanomoles de polinucleótido por planta; las plantas de control positivo se trataron con una mezcla de los cuatro ADNmc individuales antisentido a 2 nanomoles cada uno (para un total de 8 nanomoles de polinucleótido aplicados por planta) y las plantas de control negativo se trataron solo con tampón. La Figura 29B muestra el silenciamiento sistémico puesto de manifiesto por la decoloración observada 4 días después del tratamiento tópico con los ADNmc antisentido.

Ejemplo 25

170) Este ejemplo ilustra un aspecto de la invención. En este ejemplo, se trataron plantas en crecimiento con una composición aplicada por vía tópica para inducir el silenciamiento sistémico de un gen diana en una planta que incluye (a) un agente para acondicionar una planta para la infiltración mediante polinucleótidos y (b) polinucleótidos que incluyen al menos una cadena polinucleotídica que incluye al menos un segmento de 18 o más nucleótidos contiguos del gen diana en orientación antisentido o sentido. Más específicamente, este ejemplo demuestra el uso de polinucleótidos aplicados por vía tópica para inducir el silenciamiento sistémico de un gen de fitoeno desaturasa (PDS) en un cultivo de hortalizas, es decir, tomate (Solanum lycopersicum).

171) La PDS del tomate tiene la secuencia

GGGTTTATCTCGCAAGTGTGGCTATGGTGGGACGTGTCAAATTTTGGATTGTAGCCAAACATGAGA TTTGATTTAAAGGGAATTGGCCAAATCACCGAAAGCAGGCATCTTCATCATAAATTAGTTTGTTTA TTT ATACAGAATTATACGCTTTTACTAGTT.ATAGC ATTCGGT ATCTTTTTCTGGGT.AACTGCCA A AC

C ACCAG AAATTTC A AGTTTCC ATTT AACTCTTCA ACTTCAACCC A ACC A AATTT ATTTGCTT AATTG TGCAGA ACC ACTCCCT AT ATCTTCT AGCTCCTTTC ATTCGTTCCG ACTA A A ATGCCTC A A ATTCC AC TTGTTTCTGCTGTTAACTTGAGAGTCCAAGGTAGTTCAGCTTATCTTTGGAGCTCGAGGTCGTCTTC TTTGGGAACTGAAAGTCGAGATGGTTGCTTGCAAAGGAATTCGTTATGTTTTGCTGGTAGCGAATC AATGGGTCATAAGTTAAAGATTCGTACTCCCCATGCCACGACCAGAAGATTGGTTAAGGACTTGG GGCCTTT A A AGGTCGT ATGCATTG ATT ATCCA AG ACC AGAGCTGGAC A AT AC AGTTAACT ATTTGG AGGCTGCATTTTTATCATCAACGTTCCGTGCTTCTCCGCGCCCAACTAAACCATTGGAGATTGTTAT TGCTGGTGCAGGTTTGGGTGGTTTGTCTACAGCAAAATATTTGGCAGATGCTGGTCACAAACCGAT ACTGCTGGAGGCAAGGGATGTTCTAGGTGGAAAGGTAGCTGCATGGAAAGATGATGATGGAGATT GGTACGAGACTGGTTTGCATATATTCTTTGGGGCTTACCCAAATATTCAGAACCTGTTTGGAGAAT TAGGGATTAACGATCGATTGCAATGGAAGGAACATTCAATGATATTTGCAATGCCAAGCAAGCCA GGAGAATTCAGCCGCTTTGATTTCTCCGAAGCTTTACCCGCTCCTTTAAATGGAATTTTAGCCATCT

TAAAGAATAACGAAATGCTTACATGGCCAGAGAAAGTCAAATTTGCAATTGGACTCTTGCCAGCA ATGCTTGGAGGGCAATCTTATGTTGAAGCTCAAGATGGGATAAGTGTTAAGGACTGGATGAGAAA GCAAGGTGTGCCGGACAGGGTGACAGATGAGGTGTTCATTGCTATGTCAAAGGCACTCAACTTTAT AAACCCTGACGAACTTTCAATGCAGTGCATTTTGATCGCATTGAACAGGTTTCTTCAGGAGAAACA TGGTTCAAAAATGGCCTTTTTAGATGGTAATCCTCCTGAGAGACTTTGCATGCCGATTGTTGAACA CATTGAGTC AAAAGGTGGCC AAGTG AGACTGAACTC ACGAATAAAAAAGATTGAGGTGAATGAGG ATGGAAGTGTCAAGAGTTTTATACTGAGTGACGGTAGTGCAATCGAGGGAGATGCTTTTGTGTTTG CCGCTCCAGTGGATATTTTCAAGCTTCTATTGCCTGAAGACTGGAAAGAGATTCCATATTTCCAAA AGTTGGAG AAGTT AGTCGG AGT ACCTGTGAT AAATGT AC AT AT ATGGTTTGACAGAAAACTGAAG AACACATATGATCATTTGCTCTTCAGCAGAAGCTCACTGC’TCAGTGTGTATGCTGACATGTCTGTTA

C ATGT AAGGAATATTAC AACCCC A ATC AGTCTATGTTGGAATTGGTTTTTGC ACCTGC AG A AGAGT GGAT ATCTCGCAGCGACTCAGAAATT ATTGATGCAACGATGAAGGAACTAGCAACGCTTTTTCCTG ATGAAATTTCAGCAGATCAAAGCAAAGCAAAAATATTGAAGTACCATGTTGTCAAAACTCCGAGG TCTGTTTAT A AA ACTGTGCC AGGTTGTG AACCCTGTCGGCCTTr ACA A AG ATCCCC AAT AG AGGGG

TTTTATTTAGCCGGTGACTACACGAAACAGAAATACTTGGCTTCAATGGAAGGCGCTGTCTTATCA

GG A A AGCTTTGTGCTCA AGCT ATTGT ACAGGATT ATGAGTT ACTTGTTGG ACGT AGCC’A A A A(í A AG TTGTCGGAAGCAAGCGTAGTTTAGCTTTGTGGTTATTATTTAGCTTCTGTACACTAAATTTATGATG CAAGAAGCGTTGTACACAACATATAGAAGAAGAGTGCGAGGTGAAGCAAGTAGGAGAAATGTTA GGAAAGCTCCTATACAAAAGGATGGCATGTTGAAGATTAGCATCTTTTTAATCCCAAGTTTAAATA T AA AGC AT ATTTT ATGT ACC ACTTTCTTT ATCTGGGGTTTGTAATCCCTTT AT ATCTTT ATGCA ATCT

TTACGTrAG'ITAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACTCGA (SEQ ID NO:59).

172) Se sintetizó un polinucleótido de ARNbc de 201 nucleótidos con una cadena antisentido capaz de hibridar con el ARN codificado por la secuencia TCGCAGCGACTCAGAAATTATTGATGCAACGATGAAGGAACTAGCAACGCTTTTTCCTGATGAAAT TTCAGCAGATCAAAGCAAAGCAAAAATATTGAAGTACCATGTTGTCAAAACTCCGAGGTCTGTTTA TAAAACTGTGCCAGGTTGTGAACCCTGTCGGCCTTTACAAAGATCCCCAATAGAGGGGTTTTATTTAG (SEQ ID NO:60) que corresponde a los nucleótidos en las posiciones 1724 - 1923 del ARNm transcrito a partir de la secuencia del gen de PDS del tomate (SEQ ID NO:59) mediante RT PCR utilizando cebadores oligonucleotídicos con las secuencias TAATACGACTCACTATAGGGTCGCAGCGACTCAGAAATTATTG (SEQ ID NO:61, cebador sentido) y TAATACGACTCACTATAGGGGTAAAGGCCGACAGGGTTCACAACC (SEQ ID NO:62, cebador antisentido). Se preparó una solución de ARNbc de 2,5 micromolar con el polinucleótido de ARNbc de 201 nucleótidos (SEQ ID NO:60) en Silwet L-77 al 0,01 % en tampón de fosfato de sodio 5 milimolar, pH 6,8.

173) Plántulas de tomate de tres semanas se trataron de la siguiente forma. Durante algunos segundos, dos hojas completamente expandidas se sumergieron en una solución recién preparada de Silwet L-77 al 0,1 % en agua bidestilada. Las hojas se dejaron secar durante 30 minutos a 1 hora. A continuación, cada planta se trató mediante la aplicación de 20 microlitros de solución de ARNbc sobre la superficie superior de dos hojas tratadas con Silwet (en total 40 microlitros por planta). Las plantas de control se trataron con tampón. Las plantas se mantuvieron en una cámara de crecimiento para su observación. La Figura 30 muestra el silenciamiento sistémico del gen PDS diana, tal como se pone de manifiesto por la decoloración de las plantas tratadas con ARNbc 30 días después del tratamiento tópico. Las plantas tratadas con ARNbc presentaban un retraso grave en el crecimiento en comparación con las plantas de control.

Ejemplo 26

174) Este ejemplo ilustra una mejora en composiciones herbicidas adaptadas para revestimiento tópico sobre la superficie exterior de una planta en crecimiento donde el agente letal para plantas incluye polinucleótidos que tienen una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a secuencias de uno o más genes vegetales o a la secuencia del ADN transcrito a partir de los genes vegetales. Los polinucleótidos efectúan la supresión sistémica del gen vegetal en órganos o tejidos vegetales distintos a los que recibieron la aplicación tópica del polinucleótido. Más específicamente, este ejemplo ilustra una composición herbicida adaptada al revestimiento tópico sobre la superficie exterior de una planta en crecimiento, que comprende tensioactivo y al menos un agente letal para plantas que incluye combinaciones de polinucleótidos que tienen una secuencia dirigida al gen 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS), un factor de iniciación de la transcripción (TIF) y ATPasa dependiente de ADN (ddATPasa) en palmera amaranto.

175) La composición herbicida incluye al menos uno de los siguientes polinucleótidos de ARN bicatenario de 21 pares de bases:

(1) nDsRNA1: cadena sentido CUACCAUCAACAAUGGUGUCC (SEQ ID NO: 63) y cadena antisentido GGACACCAUUGUUGAUGGUAG (SEQ ID NO: 64)

(2) nDsRNA3: cadena sentido GUCGACAACUUGCUGUAUAGU (SEQ ID NO: 65) y cadena antisentido ACUAUACAGCAAGUUGUCGAC (SEQ ID NO: 66)

(3) nDsRNA4: cadena sentido GGUCACCUGGACAGAGAAUAG (SEQ ID NO: 67) y cadena antisentido CUAUUCUCUGUCCAGGUGACC (SEQ ID NO: 68)

(4) nDsNA5: cadena sentido AAUGCCAGAUGUUGCUAUGAC (SEQ ID NO: 69) y cadena antisentido GUCAUAGCAACAUCUGGCAUU (SEQ ID NO: 70)

176) Una mezcla de múltiples polinucleótidos es ventajosa para prevenir la selección de resistencia en las plantas tratadas. En una realización, la composición herbicida incluye una mezcla de los cuatro polinucleótidos de ARNbc mencionados anteriormente que tienen las SEQ ID NO: 63-70. En otra realización, la composición herbicida incluye polinucleótidos de ADN monocatenario con secuencias desoxirribonucleotídicas que corresponden a una o más de las secuencias de ARNbc SEQ ID NO: 63-70. En otra realización, la composición herbicida incluye híbridos de ARN/ADN con secuencias nucleotídicas que corresponden a una o más de las secuencias de ARNbc SEQ ID NO: 63 70. En otra realización, la composición herbicida incluye polinucleótidos de ARNbc donde los 2' hidroxilos se metilan para proporcionar estabilidad.

177) La composición herbicida incluye un tensioactivo tal como Silwet L-77 (u otros tensioactivos eficaces tales como los proporcionados en el Ejemplo 36). Opcionalmente, la composición herbicida puede incluir uno o más aditivos tales como una sal, agente quelante o un humectante (tales como los proporcionados en el Ejemplo 35) para mejorar el rendimiento herbicida, por ejemplo, potenciando la transferencia de polinucleótidos hacia el interior de la planta, potenciando la eficacia de los polinucleótidos o potenciando la actividad herbicida del herbicida no polinucleotídico.

178) Opcionalmente, la composición herbicida incluye polinucleótidos diseñados para regular múltiples genes en la planta. En una realización, la composición herbicida incluye polinucleótidos que tienen una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un segundo gen o a la secuencia del ARN transcrito a partir del segundo gen, en donde la regulación del segundo gen proporciona una mejora sinérgica de la actividad herbicida de la composición.

179) En una realización, la composición herbicida incluye polinucleótidos que tienen una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia del gen endógeno de 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) de la palmera amaranto o a la secuencia del ARN transcrito a partir del gen endógeno de EPSPS, así como también polinucleótidos que tienen una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia del gen endógeno del factor de iniciación de la traducción (TIF) de la palmera o a la secuencia del ARN transcrito a partir del gen endógeno de TIF. El factor de iniciación de la traducción (TIF) es una proteína cloroplástica codificada en el núcleo que es esencial para iniciar la síntesis proteica y se expresa en toda la planta. La especie Arabidopsis thaliana tiene un ortólogo denominado AT1G17220,1 (descrito en la base de datos disponible al público The Arabidopsis Information Resource que se encuentra en línea en www.arabidopsis.org/servlets/TairObject?type=locus&name=AT1G17220) y con el número de registro del GenBank GI:186478573, que se ha identificado como una proteína localizada en el cloroplasto con similitud al factor de iniciación de la traducción 2 bacteriano; véase además Miura y col. (2007) Plant Cell, 19:1313-1328 para una descripción de este gen. Las secuencias de TIF se identificaron a partir de la palmera amaranto (Amaranthus palmeri); se identificó que un gen de TIF tiene la secuencia de SEQ ID NO:71. En la Tabla 10 se muestran ejemplos de polinucleótidos para la supresión de este gen de TIF en la especie Amaranthus palmeri.

Tabla 10

180) En una realización, la composición herbicida incluye una mezcla de al menos dos de los polinucleótidos de ARNbc de EPSPS mencionados anteriormente que tienen las SEQ ID NO: 63-70 y también al menos un polinucleótido que tiene una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia del gen endógeno del factor de iniciación de la traducción (TIF) de palmera o a la secuencia del ARN transcrito a partir del gen endógeno de TIF, tales como los proporcionados en la Tabla 10. En una realización específica, la composición herbicida incluye una mezcla de los cuatro polinucleótidos de ARNbc de EPSPS que tienen las SEQ ID NO: 63-70 y un polinucleótido de ARN bicatenario de TIF de 160 pares de bases que tiene la secuencia sentido de

UUCGAGUAAUGGGAAAUUGGAUAAUGUAGAGGAGAGGAAGAAGGUUAUUGAUUCAUUGGAUGAGGUAUUAG AAAAGGCCGAGAGAUUAGAAACGGCGAACUUACAAGCAGAUAAUAGAAAGGAUAGCACAAAUGUAAAUAAACC GUCUCCGAGUGUAAGU (SEQ ID NO. 73) y la secuencia antisentido de ACUUACACUCGGAGACGGUUUAUUUACAUUUGUGCUAUCCUUUCUAUUAUCUGCUUGUAAGUUCGCCGUUU CUAAUCUCUCGGCCUUUUCUAAUACCUCAUCCAAUGAAUCAAUAACCUUCUUCCUCUCCUCUACAUUAUCCAA UUUCCCAUUACUCGAA (SEQ ID NO. 74).

181) En algunas realizaciones, los polinucleótidos se diseñan para regular múltiples genes diana, dando como resultado un efecto sinérgico sobre la actividad herbicida. Por ejemplo, se obtuvo un efecto sinérgico sobre la actividad herbicida mediante el tratamiento de una planta con polinucleótidos diseñados para suprimir un factor de iniciación de la traducción (TIF) y la 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) con posterior tratamiento con el herbicida glifosato no polinucleotídico.

182) Los polinucleótidos indicados en la Tabla 11 se produjeron mediante síntesis o mediante transcripción in vitro.

183) Las soluciones de los polinucleótidos se prepararon y aplicaron a las hojas de la palmera amaranto utilizando los protocolos descritos en la Tabla 12.

Tabla 12

84) Las combinaciones de polinucleótidos se analizaron tal como se indica en la Tabla 13.

Tabla 13

*cuando se indica más de una cantidad de copias, las plantas tratadas eran una mezcla de cantidades de copias **DDT = días después del tratamiento; “0% de control” significa que no se observaron diferencias entre las plantas tratadas y las de control; el % de retraso en el crecimiento se calcula como [100 - (promedio de altura de las plantas de ensayo/promedio de altura de las plantas de control)*100]

185) Se diseñaron secuencias polinucleotídicas de ARN bicatenario de 25 meros para la supresión del gen TIF en Amaranthus palmen tal como se indica en la Tabla 14.

Tabla 14

186) Los polinucleótidos de ARNbc de TIF de 25 meros se analizaron en palmera amaranto resistente a glifosato con alta cantidad de copias (112) y baja cantidad de copias (16) de EPSPS.

187) Las plantas con alta cantidad de copias se trataron con una mezcla de 4 ARNbc cortos de EPSPS (ARNbc-1 corto, ARNbc-3 corto, ARNbc-4 corto, tal como se describió en el Ejemplo 1 e IDT [5] (SEQ ID NO:91-92, tal como se describió en la Tabla 11) a 11,5 gramos/acre y un ARNbc de TIF individual a 5,8 gramos/acre o con cada ARNbc de TIF individual de 25 meros a 5,8 gramos/acre; las soluciones de polinucleótidos se formularon en tampón de fosfato de sodio 10 milimolar (pH 6,8) que contenía sulfato de amonio al 2 % y Silwet L-77 al 1 %. Treinta minutos después del tratamiento con los polinucleótidos, las plantas se pulverizaron, o no, con glifosato (1682 g de equivalente ácido por hectárea de herbicida de la marca Roundup® WeatherMAX®).

188) Las plantas con baja cantidad de copias, se trataron con una mezcla de 4 ARNbc cortos de EPSPS (ARNbc-1 corto, ARNbc-3 corto, ARNbc-4 corto, tal como se describió en el Ejemplo 1 e IDT [5] (SEQ ID NO:91-92 tal como se describió en la Tabla 11)) a 0,23 gramos/acre y un ARNbc de TIF individual a 5,8 gramos/acre o con cada ARNbc de TIF individual de 25 meros a 5,8 gramos/acre; las soluciones de polinucleótidos se formularon en tampón de fosfato de sodio 10 milimolar (pH 6,8) que contenía sulfato de amonio al 2 % y Silwet L-77 al 1 %. Treinta minutos después del tratamiento con los polinucleótidos, las plantas se pulverizaron, o no, con glifosato (1682 g de equivalente ácido por hectárea de herbicida de la marca Roundup® WeatherMAX®).

189) Los resultados se representan en las Figuras 31 y 32 y muestran que los polinucleótidos de TIF potencian la actividad de los polinucleótidos de EPSPS y que los polinucleótidos de TIF tienen actividad herbicida propia.

Ejemplo 27

190) Los aspectos de la invención incluyen composiciones polinucleotídicas y procedimientos de uso para potenciar la actividad de un herbicida no polinucleotídico en una planta. Por ejemplo, una composición polinucleotídica diseñada para regular un gen diana herbicida o un gen de desactivación del herbicida o un gen de respuesta al estrés o una combinación de dichos genes diana, se aplica a una maleza o a una planta con crecimiento espontáneo, simultáneamente o posteriormente o antes de la aplicación de un herbicida no polinucleotídico (por lo general, un herbicida químico convencional), dando como resultado la mejora de la actividad del herbicida no polinucleotídico. La combinación de una composición polinucleotídica con un herbicida no polinucleotídico (por ejemplo, un herbicida químico convencional) proporciona un efecto sinérgico, es decir, el efecto herbicida de la combinación es mayor que la suma del efecto herbicida de la composición polinucleotídica y del efecto herbicida del herbicida no polinucleotídico.

191) En la Tabla 15 se proporcionan ejemplos de herbicidas químicos convencionales y sus genes diana herbicidas correspondientes.

Tabla 15

192) En la Tabla 16 se proporcionan ejemplos de herbicidas químicos convencionales y sus genes de desactivación del herbicida correspondientes.

Tabla 16

Ejemplo 28

193) Este ejemplo ilustra un procedimiento para inducir la regulación sistémica de un gen diana endógeno en una planta en crecimiento que incluye revestir por vía tópica hojas de la planta en crecimiento con polinucleótidos que tienen una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en el gen diana endógeno o en el ARN mensajero transcrito a partir de gen diana endógeno, por lo cual los polinucleótidos se infiltran al interior de la planta en crecimiento e inducen la regulación sistémica del gen diana endógeno.

194) Se diseñaron polinucleótidos de ARN bicatenario o ADNmc antisentido para los genes dirigidos al herbicida 5 enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS), fitoeno desaturasa (PDS), protoporfirina IX oxigenasa (PPO), fenilalanina amoníaco liasa (PAL), hidroxifenilpiruvato dioxigenasa (HPPD), acetil-coenzima A carboxilasa (ACCasa), acetolactato sintasa (ALS) y glutamina sintasa (GS). Para cada gen dirigido a herbicida, se aplicó una solución que contenía una mezcla de 8 polinucleótidos de ADNmc antisentido en sulfato de amonio al 2 % en tampón de fosfato de sodio 10 milimolar, pH 6,8, a una tasa de 2,32 g/acre con posterior aplicación de Silwet L-77 al 0,5 % por pulverización (10 galones/acre). En la Tabla 17 se indican los polinucleótidos analizados y las observaciones del fenotipo resultante.

Tabla 17

195) Se investigaron la actividad herbicida de los polinucleótidos de ADNmc que se dirigen a las enzimas 4-hidroxifenilpiruvato (HPPD) y protoporfirinógeno oxidasa (PPO), y un factor de iniciación de transcripción (TIF) y su efecto sobre la actividad herbicida cuando se usan en combinación con los herbicidas mesotriona, fomesafén y atrazina en palmera amaranto. Los polinucleótidos utilizados en este experimento eran 8 oligonucleótidos de ADNmc antisentido de HPPD (SEQ ID NO:141-148), 8 oligonucleótidos antisentido de PPO (SEQ ID NO:125-132) y 8 oligonucleótidos de ADNmc antisentido de TIF (SEQ ID NO:75-82, véase el Ejemplo 26).

196) En un invernadero se cultivaron plantas de palmera amaranto (Amaranthus palmen) sensibles a glifosato en macetas cuadradas de 4 pulgadas con mezcla para plántulas Sun Gro® Redi-Earth que contenía 3,5 kg/metro cúbico de fertilizante Osmocote® 14-14-14, con un fotoperíodo de 14 h y una temperatura diurna de 30 grados centígrados y una temperatura nocturna de 20 grados centígrados. Las plantas se sub-irrigaron según fue necesario.

197) Las plantas de 10 a 15 cm de altura se pretrataron manualmente con 40 microlitros (se trataron 4 hojas maduras completamente expandidas con 10 microlitros de solución por hoja en cada planta) de una solución de tampóntensioactivo (como control; Silwet L-77 al 0,5 % y sulfato de amonio al 2 %) o con una mezcla de tampón-tensioactivo -polinucleótido de ADNmc de los oligonucleótidos antisentido dirigidos a HPPD, PPO o TIF. Algunas plantas se dejaron sin tratamiento y se usaron como controles. Veinticuatro horas después, las plantas sin tratamiento, las plantas tratadas con tampón-tensioactivo y las plantas tratadas con tampón-tensioactivo-ADNmc, se trataron utilizando un pulverizador agrícola equipado con una boquilla 9501E y calibrado para administrar 93 litros de solución por hectárea con un inhibidor de HPPd , mesotriona (4 libras de principio activo por galón;) o con un inhibidor de PPO, fomesafén (2 libras de principio activo por galón) o con un inhibidor de Fotosistema II, atrazina (90 % de principio activo) tal como se indica en la Tabla 18. Se añadió concentrado de aceite de cultivo (CAC) a 1 % a todos los tratamientos con herbicida. Para poder detectar cualquier mejora en la actividad herbicida con la mezcla oligonucleotídica, se usó una tasa baja de cada herbicida (mesotriona: 13 g por acre, equivalente a 1/8X de la tasa de campo recomendada; fomesafén: 16 g por acre, equivalente a 1/22X de la tasa de campo recomendada; y atrazina: 170 g por acre, equivalente a 1/8X de la tasa de campo recomendada).

Tabla 18

198) La altura de las plantas se determinó cuatro días después del tratamiento con herbicida. Se recogieron los datos de un experimento con cuatro repeticiones por tratamiento. En la Tabla 19 y en la Figura 33 se muestran los resultados (expresados como altura de las plantas de palmera amaranto según fue afectada por la solución de tampóntensioactivo, ADNmc y combinaciones de tratamientos con herbicida). Las plantas tratadas con oligonucleótidos de ADNmc antisentido de HPPD, oligonucleótidos de ADNmc antisentido de PPO y oligonucleótidos de ADNmc antisentido de TIF, mostraron retraso en el crecimiento, midiendo 125, 153 y 115 mm, respectivamente, mientras que las plantas tratadas con tampón-tensioactivo (control) midieron 185 mm (Figura 33). El tratamiento con oligonucleótidos de ADNmc antisentido de HPPD, oligonucleótidos de ADNmc antisentido de PPO y oligonucleótidos de ADNmc antisentido de TIF respectivamente, causó una reducción del crecimiento de 32 %, 18 % y 38 % con respecto al control con tampón-tensioactivo.

199) No se observaron diferencias importantes en la altura de las plantas entre plantas tratadas con tampóntensioactivo y posteriormente con herbicida y plantas tratadas solo con herbicida. Las plantas tratadas con oligonucleótidos de ADNmc antisentido de HPPD y posteriormente con mesotriona, mostraron la mayor reducción en el crecimiento de la planta, midiendo 100 mm, una reducción del 46 % en comparación con las plantas tratadas con tampón-tensioactivo. Las plantas tratadas con oligonucleótidos de ADNmc antisentido de PPO y posteriormente con fomesafén midieron 126 mm, una reducción del 32 % en comparación con las plantas tratadas con tampóntensioactivo. Las plantas tratadas con oligonucleótidos de ADNmc antisentido de TIF y posteriormente con atrazina, midieron 121 mm, una reducción del 34 % en comparación con las plantas tratadas con tampón-tensioactivo.

Tabla 19

Ejemplo 29

200) Este ejemplo ilustra secuencias de polinucleótidos de ARN bicatenario analizadas, diseñadas para determinar el efecto de la secuencia analizada sobre el fenotipo observable de diferentes genes esenciales. Para cada gen esencial, se aplicó una solución que contenía el polinucleótido de ARNbc en sulfato de amonio al 2 % en tampón de fosfato de sodio 10 milimolar, pH 6,8, a la palmera amaranto a una tasa de 240 picomoles por planta con posterior aplicación de Silwet L-77 al 0,5 % por pulverización (10 galones/acre). En la Tabla 20 se muestran los polinucleótidos analizados y las observaciones del fenotipo resultante.

Ejemplo 30

201) Este ejemplo ilustra polinucleótidos diseñados para dirigirse a una región de homología secuencial baja específica y son útiles, por ejemplo, para seleccionar un alelo específico de un gen diana o un gen de una especie específica. Los polinucleótidos diseñados para dirigirse a secuencias no codificantes son útiles para regular ARN no codificantes que participan en regulaciones génicas, por ejemplo, regular ARN no codificantes que se procesan en ARNip en una vía regulada por iARN. La Figura 34 muestra una alineación del promotor de locus 1 de PDS de Nicotiana benthamiana (SEQ ID NO:319) y del promotor de locus 2 de PDS (SEQ ID NO:320); en el caso del locus 1 que contiene múltiples sitios de inicio de la transcripción, la secuencia promotora usada en esta alineación es la que tiene el sitio de inicio de la transcripción más en posición 5'. Se descubrió que los genes PDS1 y PDS2 de Nicotiana benthamiana tienen baja homología secuencial en la región promotora pero alta homología secuencial en la región codificante.

202) En la Tabla 21 se muestran polinucleótidos diseñados para dirigirse a partes diferentes de los promotores de PDS1 y PDS2.

203) Se analizaron seis combinaciones diferentes de polinucleótidos (1 nanomol/planta de cada polinucleótido aplicado) tal como se indica en la Tabla 21 y se ilustra en la Figura 35, en plantas de Nicotiana benthamiana de 4 semanas usando un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 12. Las soluciones polinucleotídicas se prepararon en Silwet L-77 al 0,01 % (v/v) y sulfato de amonio al 2 % (p/v) en fosfato de sodio 5 milimolar, pH 6,8. Durante algunos segundos, dos hojas completamente expandidas por planta, se sumergieron en solución de Silwet L-77 al 0,1 % recién preparada con H2O bidestilada y se dejaron secar. Aproximadamente 30 minutos después, se aplicaron 20 microlitros de solución polinucleotídica a cada una de las dos hojas pretratadas. Las plantas de control positivo se trataron de forma similar con un oligonucleótido de ADN dirigido a un segmento conservado de la región codificante de PDS1 y PDS2; las plantas de control negativo se trataron de forma similar con un oligonucleótido de ADN diseñado para silenciar la proteína verde fluorescente (GFP). Las seis combinaciones de polinucleótidos diseñados para dirigirse a las regiones promotoras de PDS1 o PDS2, indujeron el silenciamiento sistémico en las plantas tratadas tal como se puso de manifiesto por la decoloración. El tratamiento con polinucleótidos de ARNbc o ADNbc de aproximadamente 200 pb y dirigidos a las regiones promotoras de PDS1 o PDS2, también indujo el silenciamiento sistémico en las plantas tratadas tal como se puso de manifiesto por la decoloración.

204) Se identificaron las siguientes secuencias genómicas adicionales (incluidos el promotor y la secuencia del intrón y exón transcrita) indicadas en la Tabla 22 para los genes de Amaranthus palmen para su uso en el diseño de polinucleótidos para aplicación tópica:

Tabla 22

Ejemplo 31

205) Este ejemplo ilustra una secuencia polinucleotídica que regula la expresión génica en más de una especie vegetal. Se identificaron dos regiones altamente conservadas en secuencias de EPSPS de diferentes especies de malezas y se muestran como las secuencias “Región 1” y “Región 2” en la Tabla 23.

Tabla 23

206) En la Tabla 24 se muestran secuencias de polinucleótidos de ARNbc de 21,22, 24, 35, 45 y 55 meros, diseñadas basándose en la secuencia consenso de EPSPS para la región 2, TNGANGTcAAcATGAAcAAaATGCCaGATGTNGCNATGACNcTtGCNGTNGTTGC (SEQ ID NO:263).

Tabla 24

207) Los polinucleótidos de ARNbc consenso de EPSPS se sintetizaron mediante transcripción in vitro y se aplicaron por vía tópica como preparaciones de ARN en bruto. Malezas resistentes a glifosato (palmera amaranto y hierba de caballo de 16 copias) se trataron con los seis ARNbc consenso individuales (21, 22, 24, 35, 45, 55 meros); malezas no resistentes a glifosato (amaranto tuberculoso, palo de zorrillo, digitaria, bejuco colorado, quínoa blanca, poinsettia silvestre) se trataron con los tres ARNbc consenso individuales más cortos (21,22, 24 meros). Después del tratamiento con los polinucleótidos, las plantas resistentes a glifosato se trataron con glifosato (1682 g de equivalente ácido por hectárea de herbicida de la marca Roundup® WeatherMAX®) y las plantas no resistentes a glifosato se trataron con glifosato (105 g de equivalente ácido por hectárea de herbicida de la marca Roundup® WeatherMAX®). Después de 7 días de tratamiento, se descubrió que los seis polinucleótidos de ARNbc consenso de la región 2 de EPSPS, proporcionaban 100 % de control (plantas muertas) de palmera amaranto resistente a glifosato; las plantas de palmera amaranto de control tratadas solo con glifosato no murieron. Después de 7 días de tratamiento, se descubrió que los tres polinucleótidos de ARNbc consenso más cortos (21, 22, 24 meros) de la región 2 de EPSPS evaluados individualmente, proporcionaban 95%, 80% y 65% de control (combinación de plantas muertas y con lesiones), respectivamente, de amaranto tuberculoso; las plantas de amaranto tuberculoso tratadas solo con glifosato proporcionaron aproximadamente un 40 % de control (combinación de plantas muertas y lesionadas); y una mezcla de los tres polinucleótidos de ARNbc consenso más cortos (21,22, 24 meros) proporcionó aproximadamente el mismo control que el glifosato solo. Los polinucleótidos de ARNbc consenso de la región 2 de EPSPS no causaron ningún efecto observable sobre las otras especies de maleza (amaranto tuberculoso, palo de zorrillo, digitaria, bejuco colorado, quínoa blanca, poinsettia silvestre) analizadas.

Ejemplo 32

208) Este ejemplo ilustra el uso de un tratamiento tópico con polinucleótidos para silenciar transitoriamente un gen en una planta para producir un fenotipo deseado. El silenciamiento de polifenol oxidasa en tejidos vegetales inhibe el pardeamiento de los tejidos vegetales cortados o lesionados, un rasgo valioso para frutas y hortalizas donde la resistencia al pardeamiento es un rasgo deseable.

209) Se diseñaron oligonucleótidos de ADN antisentido con las secuencias que se muestran en la Tabla 25 para dirigirlos a tres genes de polifenol oxidasa (PPO1, PPO2 y PPO3) de lechuga; el texto subrayado indica la secuencia de T7 que se incluyó en los polinucleótidos antisentido.

210) Se trataron plantas de lechuga de tres semanas (variedad SVR3603 L4) de la siguiente forma. Dos hojas originarias (hojas que son más viejas y que tienen ~60 % de su tamaño en la madurez) de cada planta, se pretrataron con Silwet-L-77 al 0,1% (v/v) y se dejaron secar (~15 minutos). A cada hoja se aplicaron en pequeñas gotas 20 microlitros de una mezcla de los polinucleótidos antisentido de polifenol oxidasa en una solución de Silwet L-77 al 0,01 % (v/v) y sulfato de amonio al 2 % (p/v) en fosfato de sodio 5 milimolar, pH 6,8; cada planta se trató con 6,7 nanomoles de cada uno de los tres polinucleótidos HH07, HH09 y HH11 (para un total de 20 nanomoles por planta). Las plantas de control se trataron con un polinucleótido HH02-05 no relacionado (antisentido para fitoeno desaturasa) o solo con tampón (Silwet L-77 al 0,01 % (v/v) y sulfato de amonio al 2 % (p/v) en fosfato de sodio 5 milimolar, pH 6,8).

211) Aproximadamente, 3 semanas después del tratamiento con los polinucleótidos tópicos, las hojas de lechuga “no tratadas” (es decir, las que no fueron tratadas con los polinucleótidos tópicos) se cortaron debajo del agua del cogollo de la lechuga y se incubaron en un recipiente con jasmonato de metilo 1,33 milimolar en etanol al 5 %. Las hojas se inspeccionaron para determinar el pardeamiento de las nervaduras centrales y se fotografiaron cada 24 horas. Se tomaron muestras de las plantas restantes y se congelaron para análisis de ARN pequeño y ARNm.

212) Las plantas tratadas con los polinucleótidos antisentido de polifenol oxidasa HH07, HH09 y HH11 mostraron reducción significativa en el pardeamiento en las nervaduras centrales después del tratamiento con jasmonato de metilo. Las plantas tratadas con HH02-05 (antisentido para fitoeno desaturasa) como control mostraron una leve reducción en el pardeamiento de las nervaduras centrales en comparación con las de control tratadas con tampón.

Ejemplo 33

213) Este ejemplo ilustra una composición herbicida adaptada para el revestimiento tópico sobre la superficie exterior de una planta en crecimiento que comprende tensioactivo y al menos un agente letal para la planta, la mejora en la que el agente letal para la planta incluye polinucleótidos que tienen una secuencia esencialmente idéntica o complementaria a la secuencia de un gen vegetal o a la secuencia del ARN transcrito del gen vegetal, efectuando los polinucleótidos la supresión sistémica del gen vegetal. Más específicamente, este ejemplo ilustra una composición herbicida adaptada para el revestimiento tópico sobre la superficie exterior de una planta en crecimiento que comprende tensioactivo y al menos un agente letal para la planta, la mejora en la que el agente letal para la planta incluye polinucleótidos que producen la supresión de los genes endógenos de fitoeno desaturasa (PDS), 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) o ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa oxigenasa (RuBisCO) de Nicotiana benthamiana. Este ejemplo también ilustra el uso de polinucleótidos aplicados por vía tópica para suprimir en una planta un gen expresado a alto nivel (ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa oxigenasa).

214) Se diseñó un polinucleótido antisentido con la secuencia CATCTCCTTTAATTGTACTGC (SEQ ID NO:34) para el gen endógeno de fitoeno desaturasa (PDS) de Nicotiana benthamiana, que tiene los fragmentos de secuencia de ADNc

AT G C CCC AAAT CGGACTTGTATCTGCTGTTAATTT G AG AGT CCAAGG TAATT C AG CTTAT CTTTGG A GCTCGAGGTCTTCGTTGGGAACTGAAAGTCAAGATGTTTGCTTGCAAAGGAATTTGTTATGTTTTG GTAGTAGCGACTCCATGGGGCATAAGTTAAGGATTCGTACTCCAAGTGCCACGACCCGAAGATTG ACAAAGGACTTTAATCCTTTAAAGGTAGTCTGCATTGATTATCCAAGACCAGAGCTAGACAATACA GTTAACT ATTTG G AG GC G G CGTTATTATC ATC ATC G TTTC G TACTTCCTC ACGC CCAAC TAAAC C AT TG G AG ATTGTTATTG CTGGTGC AG GTTTGG GTG GTTTGTCTACAG C AAAATATCTG G C AG ATG CTG GTCACAAACCGATATTGGTGGAGGCAAGAGATGTCCTAGGTGGGAAGGTAGCTGCATGGAAAGAT GATGATGGAGATTGGTACGAGACTGGGTTGCACATATTCTTTGGGGCTTACCCAAATATGCAGAAC CTGTTTGGAGAACTAGGGATTGATGATCGGTTGCAGTGGAAGGAACATTCAATGATATTTGCGATG CCTAACAAGCCAGGGGAGTTCAGCCGCTTTGATTTTCCTGAAGCTCTTCCTGCGCCATTAAATGGA ATTTTGGCCATACTAAAGAACAACGAAATGCTTACGTGGCCCGAGAAAGTCAAATTTGCTATTGGA CTCTTGCCAGCAATGCTTGGAGGGCAATCTTATGTTGAAGCTCAAGACGGTTTAAGTGTTAAGGAC TG G ATG AG AAAGC AAG GTGTG CCTG ATAG GG TG AC AG ATG AG GTGTTC ATTG C CATGTC AAAG G C ACTTAACTTCATAAACCCTGACGAGCTTTCGATGCAGTGCATTTTGATTGCTTTGAACAGATTTCTT CAGGAGAAACATGGTTCAAAAATGGCCTTTTTAGATGGTAACCCTCCTGAGAGACTTTGCATGCCG ATT GT GGAACAT ATT GAGT CAAAAGGTGGCCAAGT CAG ACTAAACT CACGAAT AAAAAAGATCG A G CT GAAT G AG G ATG G AAGT GT CAAATGTTTT ATACT G AATAATGGC AGT ACAATT AAAGG AGAT G CTTTTGTGTTTGCCACTCCAGTGGATATCTTGAAGCTTCTTTTGCCTGAAGACTGGAAAGAGATCCC ATATTTCCAAAAGTTGGAGAAGCTAGTGGGAGTTCCTGTGATAAATGTCCATATATGGTTTGACAG AAAACTGAAGAACACATCTGATAATCTGCTCTTCAGCAGAAGCCCGTTGCTCAGTGTGTACGCTGA CATGTCTGTTACATGTAAGGAATATTACAACCCCAATCAGTCTATGTTGGAATTGGTATTTGCACC CGCAGAAGAGTGGATAAATCGTAGTGACTCAGAAATTATTGATGCTACAATGAAGGAACTAGCGA AGCTTTTCCCTGATGAAATTTCGGCAGATCAGAGCAAAGCAAAAATATTGAAGTATCATGTTGTCA AAACCCCAAGGTCTGTTTATAAAACTGTGCCAGGTTGTGAACCCTGTCGGCCCTTGCAAAGATCCC CTATAGAGGGTTTTTATTTAGCTGGTGACTACACGAAACAGAAGTACTTGGCTTCAATGGAAGGTG CTGTCTTATCAGGAAAGCTTTGTGCACAAGCTATTGTACAGGATTACGAGTTACTTCTTGGCCGGA GCCAGAAGATGTTGGCAGAAGCAAGCGTAGTTAGCATAGTGAACTAA (SEQ ID NO:38) Se diseñaron polinucleótidos antisentido con las secuencias CTGTGATCATCATATGTATCA (SEQ ID NO:279), CCTTAACTCTCCAGCTAGCAA (SEQ ID NO:280), CAGCCCGCAAATGTTTCATTC (SEQ ID NO:281), GCCGTCAATGGCCGCATTGCT (SEQ ID NO:282), TCCTTCCCTCAGAAAGGGCAG (SEQ ID NO:283) y TTGCCTCATGCTGCTAATCTG (SEQ ID NO:284) para el gen endógeno de 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) de Nicotiana benthamiana, basándose en la secuencia de ADNc de EPSPS de Nicotiana benthamiana

C T T A T A T G T G C T T A A G C C T A A C G T G C A C C C G G C C C C T T A A C C C C A G C A G T T T T C A A T C T A C C T A C C G T C T C T A C C A T T T T C T T C T A G T T G G T G A A A A T T T C T A A C T T T G A G A A A A C A A G C C A A A G T T T T T G T T T C T A A G A A C G C A A A A T G A G T G A A A T T T T T T G C A G C A A T G G C A C A G A T T A G C A G C A T G A G G C A A G G G AT AC AG ACCCCT ^AATCTTAATTCCT ATTTTCCT ^{A A}AACCC ^AAAAGGTTCC_1-CTTTTTTCGC ATTCT ^AT C T T C T T T G G A T C A A A G A A A A T A A C C C A A A A T T C A G C A A A A T C T T T G T G G G T G T G T A A G A A A G A T T C A G T T T T G A G G G T G G C A A A G T C A C C T T T T A G G A T T T G T G C A T C A G T G G C C A C T G C A C A G A A G C C C A A C G A G A T T G T G C T G C A A C C C A T C A A A G A T A T A T C A G G C A C T G T T A A A T T G C C T G G T T C T A A A T C C C T T T C C A A C C G T A T T C T C C T T C T T G C T G C C C T T T C T G A G G G A A G G A C T G T T G T T G A C A A T T T A C T G A G T A G T G A T G A C A T T C A T T A C A T G C T T G G T G C G T T G A A A A C A C T T G G A C T T C A T G T A G A A G A T G A C A A T G A A A A C C A A C G A G C A A T T G T G G A A G G T T G T G G T G G G C A G T T T C C T G T C G G C G A G A A G T C T G A G G A A G A A A T C C A A C T A T T C C T T G G A A A T G C A G G A A C A G C A A T G C G G C C A T T G A C G G C A G C A G T T A C T G T A G C T G G A G G A C A T T C A A G A T A T G T A C T T G A T G G A G T T C C T A G G A T G A G A G A G A G A C C G A T

(SEQ ID NO:285),

C A C T G A C G T T G G A T T A G A G G T A G G C T C C T T A T A T G T G C T T A A G C C T A A C G T G C A G C C G G C C C C C A A C C C C A G C A G T T T T C A A T C T A C C T A C C G T C T C T A C C A T T T T C T T A T A G T A G T T G A A A A T T T C T A A C T T T G A G A A A A C A A G C C A A A G T T T T G T T T C T A A G A A C A C A A A G G G A G T G A A A T T T T T T G C A G C A A T G G C A C A G A T T A G C A G C A T G A G G C A A G G G A T A C A G A C C C C T A A T Í ’ T T A A T T C C T A T T T T C C T A A A A C C C A A A A G G T T C C T C T T T T T T C G C A T T C T A T C T T C A T T G G A T C A A A G A A A A T A A C C C A A A A T T C A G C A A A A T C 1 T T G T G G G T G T G T A A G A A A G A T T C A G T T T T G A G C j G T G G C A A A G T C A C C T T T 1 ’ A G G A I T T G T G C A T C A G T G G C C A C T G C A C A G A A G C C T A A C G A G A T T G T G C T G C A A C C T A T C A A A G A T A T A T C A G G C A C T G T T A A A T T A C C T G G T T C T A A A T C C C T T T C C A A T C G T A T T C T C C T T C T T G C T G C C C T T T C T G A G G G A A G G A C T G T T G T T G A C A A T T T A C T G A G T A G T G A T G A C A T T C A T T A C A T G C T T G G T G C A T T G A A A A C A c t t g g a c t t c a t g t a g a a g a t g a c a a t g a a a a c c a a c g a g c a a t c g t a g a a g g t t g t g g t g g g c a G T T T C C T G T C G G C A A G A A G T C T G A G G A A G A A A T C C A A C T A T T C C T T G G A A A T G C A G G A A C A G C A A T G C G G C C A T T G A C G G C A G C A G T T A C T G T A G C T G G T G G A C A T T C T A G A T A T G T A C T T G A T G G A G T T C ^{C T A G G A T}(SEQ ID NO:286), ^y

AAATT CTTGGTTCGAGGAGGT CAGAAGT ACAAGT CT CCTGG AAAAGCAT AT GTT GAAGG AGATGC CTCAAGTGCTAGCTACTTTTTGGCGGGTGCAGCTGTCACAGGTGGAACTGTCACTGTTGAAGGTTG TGGAACAAGCAGTTTACAGGGGGATGTTAAGTTTGCTGAGGTCCTCGAAAAGATGGGGGCAGAAG TTACATGGACAGAGAACAGTGTCACGGTTAAAGGACCTCCAAGGAACTCTTCTGGAATGAAACAT TTGCGGGCTGTTGACGTTAACATGAACAAAATGCCAGATGTTGCCATGACTCTTGCTGTAGTTGCA CTTTTTGCTGATAGTCCTACTGCCATAAGAGATGTTGCTAGCTGGAGAGTTAAGGAAACTGAGCGG ATGATTGCCATATGCACAGAACTTAGGAAGTTGGGTGCAACAGTTGTAGAAGGGCCAGACTACTG CATAATCACTCCACCTGAAAAGTTAAAAGTAGCGGAAATTGATACATATGATGATCACAGAATGG CCATGGCTTTCTCTCTTGCGGCTTGTGCTGATGTTCCAGTCACCATTAAGGACCCCGGTTGTACTCG CAAAAC CTTC C CCAACTACTTTGAC GTTCTC C AG C AGTATTCC AAG C ATTAAAC C ACTTTCC ATTAA G AATTTT GAAAAAG AG AGACTTT GACAACAAT GGT GT CAT ACCGGAAGAG AAAAGCTTT GATCCA AGCTTT CAACTCCTTTT CATTTGTCAT GT GAT G AT CATTGT ATTT GTT GAAGTT GAGCTGCTTTT CTT TTGTC C AG AAG AC AT G TATGG ATACTATT ACT ATATAGTTAAG GT G AACT CAGCA (SEQ ID NO:287). Se diseñaron polinucleótidos antisentido con las secuencias CCACATGGTCCAGTATCTGCC (AK195, RBCS_1-2-3-4, SEQ ID NO:288), CAAGCAAGGAACCCATCCATT (AK196, RBCS_1-2-3-4, SEQ ID NO:289), GGCCACACCTGCATGCATTGC (AK197, RBCS_1-2-3-4, SEQ ID NO:290), GTGTTCACGGTAGACAAATCC (AK198, RBCS_1-2, SEQ ID NO:291), TGCACTGCACTTGACGCACGT (AK199, RBCS_1-2, SEQ ID NO:292), AACTGATGCATTGCACTTGAC (AK200, RBCS_3-4, SEQ ID NO:293), CAAATCAGGAAGGTATGAGAG (AK201, RBCS_3-4, SEQ ID NO:294) y TGTCAAGGTTTTGTTTCCTGG (AK202, RBCS_3-4, SEQ ID NO:295) para el gen endógeno de ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa oxigenasa (RuBisCO) de Nicotiana benthamiana , basándose en los fragmentos de secuencia de ADNc 2A de cadena pequeña de RuBisCO cloroplástico de Nicotiana benthamiana

GCAATGGCTTCCTCAGTTCTTTCCTCAGCAGCAGTTGCCACCCGCAGCAATGTTGCTCAAGCTAAC ATGGTTGCACCTTTCACAGGTCTTAAGTCTGCTGCCTCATTCCCTGTTTCAAGAAAGCAAAACCTTG ACATCACTTCCATTGCCAGCAACGGCGGAAGAGTGCAATGCATGCAGGTGTGGrCACCAATTAAC ATGAAGAAGTATGAGACTCTCTCATACCTTCCCGATTTGAGCCAGGAGCAATTGCTCTCCGAAATT GAGTACCTTTTGAAGAATGGATGGGTTCCTTGCTTGGAATTCGAGACTGAGAAAGGATTTGTCTAC CGTGAACACCACAAGTCACCAGGATACTATGATGGCAGATACTGGACCATGTGGAAGCTACCTAT GTTCGGATGCACTGATGCCACCCAAGTGTTGGCTGAGGTGGGAGAGGCGAAGAAGGAATACCCAC AGGCCTGGGTCCGTATCATTGGATTTGACAACGTGCGTCAAGTGCAGTGCATCAGTTTCATTGCCT CCAAGCCTGACGGCTAC (SEQ ID NO:296),

ACAATGGCTTCCTCAGTTCTTTCCTCAGCAGCAGTTGCCACCCGCAGCAATGTTGCTCAAGCTAAC ATGGTTGCACCTTTCACTGGTCTTAAGTCAGCTGCCTTTTTCCCTGTTTCAAGGAAGCAAAACCTTG ACATCACTTCCATTGCCAGCAACGGCGGAAGAGTGCAATGCATGCAGGTGTGGCCACCAATTAAC AAGAAGAAGTACGAGACTCTCTCATACCTTCCTGATCTGAGCGTGGAGCAATTGCTTAGCGAAATT GAGTACCTCTTGAAAAATGGATGGGTTCCTTGCTTGGAATTCGAGACTGAGCGCGGATTTGTCTAC CGTGAACACCACAAGTCACCGGGATACTATGACGGCAGATACTGGACCATGTGGAAGTTGCCTAT GTTCGGATGCACTGATGCCACCCAAGTGTTGGCCGAGGTGGAAGAGGCGAAGAAGGCATACCCAC AGGCCTGGATCCGTATTATTGGATTCGACAACGTGCGTCAAGTGCAGTGCATCAGTTTCATTGCCT ACAAGCCAGAAGGCTAC (SEQ ID NO:297),

CAAGCCAACATGGTTGCACCCTTCACTGGCCTCAAGTCCGCCTCCTCCTTCCCTGTTACCAGGAAA

c ^{a a a a c c t t g a c a t t a c c t c c a t t g c t a g c a a t g g t g g a a g a g t t c a a t g c a t g c a g g t g t g g c c a}CCAATTAACATGAAGAAGTACGAGACACTCTCATACCTTCCTGATTTGAGCCAGGAGCAATTGCTT AGTGAAGTTGAGTACCTTTTGAAAAATGGATGGGTTCCTTGCTTGGAATTCGAGACTGAGCGTGGA TTCGTCTACCGTGAACACCACAACTCACCAGGATACTACGATGGCAGATACTGGACCATGTGGAA GTTGCCCATG1 TCGGG'I GCACTG ATGCCACTCAGGTGTTGGCTGAGGTCGAGGAGGCAAAG AAGG

c t t a c c c a c a a g c c t g g g t t a g a a t c a t t g g a t t c g a c a a c g t c c g t c a a g t g c a a t g c a t c a g t t TTATCGCCTCCAAGCCAGAAGGCTAC (SEQ ID NO:298),y

GGCTCAGTTATGTCCTCAGCTGCCGCTGTTTCCACCGGCGCCAATGCTGTTCAAGCCAGCATGGTC GCACCCTTCACTGGCCTCAAGGCCGCCTCCTCCTTCCCGGTTTCCAGGAAACAAAACCTTGACATT ACTTCCATTGCTAGAAATGGTGGAAGAGTCCAATGCATÜCAGGTGTGGCCGCCAATTAACAAGAA GAAGTACGAGACACTCTCATACCTTCCTGATTTGAGCGTGGAGCAATTGCTTAGCGAAATTGAGTA

CCTTTTGAAAAATGGATGGGTTCCTTGCTTGGAATTCGAGACTGAGCATGGATTCGTCTACCGTGA ACACCACCACTCACCAGGATACTACGATGGCAGATACTGGACGATGTGGAAGTTGCCCATGTTCG GGTGCACCGATGCCACTCAGGTCTTGGCTGAGGTAGAGGAGGCCAAGAAGGCTTACCCACAAGCC TGGGTCAGAATCATTGGATTCGACAACGTCCGTCAAGTGCAATGCATCAGTTTCATCGCCTACAAG

^CCCGAAGGCTAT(SEQ ID NO:299).

215) Las plantas de Nicotiana benthamiana se trataron utilizando un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 12. La solución polinucleotídica (o de polinucleótidos mezclados en el caso de EPSPS y RuBisCO) se preparó en Silwet L-77 al 0,01 % (v/v) y sulfato de amonio al 2 % (p/v) en fosfato de sodio 5 milimolar, pH 6,8. Durante algunos segundos, dos hojas completamente expandidas por planta, se sumergieron en una solución de Silwet L-77 al 0,1 % recién preparada con H2O bidestilada y se dejaron secar. Aproximadamente 30 minutos después, se aplicaron 20 microlitros de solución polinucleotídica a cada una de las dos hojas pretratadas. Para PDS, cada una de las 5 plantas recibió 25 nanomoles del polinucleótido antisentido de PDS (SEQ ID NO:34); para EPSPS, cada una de las 5 plantas recibió 50 nanomoles de cada polinucleótido antisentido de EPSPS (SEQ ID NO:279-284); y para RuBisCO, cada una de las 5 plantas recibió 50 nanomoles de cada polinucleótido antisentido de RuBisCO (SEq ID NO:288-295). Las plantas de control emparejadas se trataron con tampón (Silwet L-77 al 0,01 % (v/v) y sulfato de amonio al 2 % (p/v) en fosfato de sodio 5 milimolar, pH 6,8). Los resultados se midieron como la altura de la planta después de 12 días (PDS y EPSPS) o 10 días (RuBisCO) del tratamiento y se muestran en las Figuras 36A - 36B. Las plantas tratadas con el polinucleótido antisentido de PDS mostraron retraso grave en el crecimiento (Figura 36A) y decoloración. Las plantas tratadas con el polinucleótido antisentido de EPSPS mostraron retraso grave en el crecimiento (Figura 36B) y daños importantes en los tejidos del meristemo y del tallo. Las plantas tratadas con los polinucleótidos antisentido de RuBisCO mostraron retraso grave en el crecimiento (Figura 36c ) y tejidos apicales deformes.

216) Se diseñó un segundo conjunto de experimentos para investigar los efectos del silenciamiento de un componente de la vía de silenciamiento de iARN endógeno en una planta. Las proteínas Argonauta (AGO) son componentes del complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC, RNA-induced silencing complex) que une pequeños ARN en el proceso de silenciamiento de iARN. Se esperaría que la supresión de Argonauta redujera el efecto fenotípico observado causado por un proceso de silenciamiento con iARN. Se diseñaron polinucleótidos antisentido de a GO1 con las secuencias GGAGGCAAAATACGAGCCTCA (HL510, SEQ ID NO:300), CACTAATCTTAATACCAAACT (HL511, SEQ ID NO:301), TATGGGTCATTAGCATAGGCATTAT (HL512, SEQ ID NO:302), TCTCAAGAATATCACGCTCCC (HL513, SEQ ID NO:303), CCCTTGGGGACGCTGGCAGGTCAC (HL514, SEQ ID NO:304), TAATACGACTCACTATAGGGGGAGAGAGCTAGATCTTTTG (HL515, SEQ ID NO:305), TAATACGACTCACTATAGGCACAGTATTTCTTCCTCCAACC (HL516, SEQ ID NO:306), TTGCTCATCTTAAATACATGT (HL517, SEQ ID NO:307), TCATCTTAAATACATGTTTTGTCA (HL518, SEQ ID NO:308), TTATCTTCAGGGATACATTAGC (HL519, SEQ ID NO:309), AATACTGCTTGCTCATCTTAAATA (HL520, SEQ ID NO:310), GACAATTCCAAGTTCAGTTTC (HL521, SEQ ID NO:311), CCGTTTTAGATCACCATAAAGAGA (HL522, SEQ ID NO:312), TTGTCTGGTAATATCACAATC (HL523, SEQ ID NO:313) para el gen endógeno de Argonauta-1 (AGO1) de Nicotiana benthamiana, basándose en dos secuencias de ADNc parcial de AGO1-2 de Nicotiana benthamiana, a t g g t g a g g a a g a g g a g a a c t g a g t t a c c t g g t t c t g g t g a g a g c t c t g g g t c t c a a g a a a c t g g C G G A C A G G G T C G T G G C C A G C A I C C A C A G C A G C I ' G C A C C A A G C T A C C T C C C A G A C T C C A l ' A 1 C A A A C T G C A A T G A C T A C T C A G C C A A T A C C T T A T G C A A G A C C A A C T ' G A A A C A ' T C C T C C G A A G C T G G T T C C T C A T C T C A G C C A C C T G A G C A G G C A G C T C T A C A A G T G A C A C A A C A G T T C C A G C A A C T T G C T T T G C A A C A A G A A G C G G C T A C A A C G C A A G C A G T T C C A C C T G C A T C A A G C A A A T T A C T A A G G T T T C C C C T G C G T C C A G G G A A G G G G A G C A A T G G T A T G A G A T G C A T A G T C A A A G C C A A T C A C T T C T T C G C A G A G C T G C C T G A C A A A G A C T T G C A C C A G T A T G A T G T C A C A A T T T C T C C A G A G G T G T C A T C A C G T G G C G T C A A C C G T G C T G T C A T G G C G C A A C T G G T G A A G C T G T A C C A A G A A T C T C A T C T T G G G A A G A G A C T T C C A G C A T A T G A T G G A A G G A A A A G T C T A T A C A C T G C A G G G C C C C T T C C A T T T G T T C A A A A A G A C T T C A A A A T A A C T C T T A T T G A T G A T G A G G A T G G G C C T G G T G G T G C T A G A A G G G A A A G G G A A T T T A A A G T T G T G A T C A A A T T G G C T G C C C G T G C T G A T C T T C A T C A C T T G G G A A T G T T T T T A G A A G G G A A A C A G G C T G A T G C A C C T C A A G A G G C G C T T C A A G T T C T G G A T A T T G T T C T G C G T G A G T T G C C A A C A T C T A G G T T T T G T C C T G T G G G T C G T T C T T T C T A T T C C C G T G A T T T A G G G C G A A A G C A A C C A T T G G G T G A A G G T T T A G A A A G T T G G C G T G G G T T C T A T C A A A G C A T T C G C C C C A C A C A A A T G G G C T T A T C A C T G A A C A T C G A T A T G T C T T C C A C T G C A T T C A T T G A G C C A C T G C C A G T C A T T G A T T T T G T G A C A C A G C T T C T G A A C C G A G A T G T G C C A T C T A G A C C A C 1 G I d G A T G C T G G C C G 1 G T A A A G A r A A A A A A A G C l ’C 1 G A G A G 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217) Las plantas de Nicotiana benthamiana se trataron utilizando un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 12. La solución polinucleotídica (o de polinucleótidos mezclados en el caso de AGO1) se preparó en Silwet L-77 al 0,01 % (v/v) y sulfato de amonio al 2 % (p/v) en fosfato de sodio 5 milimolar, pH 6,8. Durante algunos segundos, dos hojas completamente expandidas por planta se sumergieron en una solución de Silwet L-77 al 0,1 % recién preparada con H2O bidestilada y se dejaron secar. Aproximadamente 30 minutos después, a cada una de las dos hojas pretratadas se aplicaron 20 microlitros de solución polinucleotídica. Para PDS, cada una de las 5 plantas recibió 25 nanomoles del polinucleótido antisentido de PDS (SEQ ID NO:34); para AGO1, cada una de las 5 plantas recibió 50 nanomoles de cada uno de los 14 polinucleótidos antisentido de a GO1 (SEQ ID NO:300-313); para los tratamientos combinados con PDS y AGO, cada una de las 5 plantas recibió 25 nanomoles del polinucleótido antisentido de PDS (SEQ ID NO:34) y 50 nanomoles de cada uno de los 14 polinucleótidos antisentido de AGO1 (SEQ ID NO:300-313) aplicados en hojas distintas. Las plantas de control emparejadas se trataron con tampón (Silwet L-77 al 0,01 % (v/v) y sulfato de amonio al 2 % (p/v) en fosfato de sodio 5 milimolar, pH 6,8). No se observaron diferencias entre las plantas tratadas con los polinucleótidos antisentido de AGO1 y las plantas tratadas solo con tampón. Las plantas tratadas con el polinucleótido antisentido de PDS mostraron decoloración sistémica. Las plantas tratadas con el polinucleótido antisentido de PDS y los polinucleótidos antisentido de AGO1 aplicados por separado, no presentaron decoloración sistémica, indicando que la supresión de AGO1 bloqueó la propagación sistémica de la señal de silenciamiento.

Ejemplo 34

218) Este ejemplo ilustra un procedimiento para inducir la regulación sistémica de un gen diana endógeno en una planta en crecimiento, que comprende revestir por vía tópica sobre hojas de dicha planta en crecimiento polinucleótidos que tienen una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en dicho gen diana endógeno o en el ARN mensajero transcrito a partir de dicho gen diana endógeno, con lo cual dichos polinucleótidos se infiltran al interior de dicha planta en crecimiento e inducen la regulación sistémica de dicho gen diana endógeno. Más específicamente, este ejemplo ilustra el uso de una composición que comprende tensioactivo y polinucleótidos para inducir al menos transitoriamente la regulación sistémica del gen endógeno de 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) de Zea mays.

219) Una secuencia genómica del gen endógeno de 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) de Zea mays se identificó como ACCTACTTCCCCCTCGCCCCTCTCATGGTCTCTCTCGCGCCCAGATCTGCTACTA-GACGGCACCGCT GCAGCGCGTCGTGTCGCGGGGGTTGGTGGCAGGCAGCGAGAGCTTGCCGTTCCTCTCTCT-CAGTTG TCAGGTCCTAGGCTCACCTCACCGGCTCCCAGCCCGCTTCTATTTCTTCCTCCCCGACCCCGTGCAG GTGGCAGTCCAGTCCACGCCACCAACCGCGAGGCGAACCAAACCAACCCACTCTCCCCAACCCCG CGCGCCCAGGCCGCCCGCCCTACCAACCATCGGCGTCGGCAATGGCGGCCATGGCGACCAAGGCC GCCGCGGGCACCGTGTCGCTGGACCTCGCCGCGCCGCCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGTGCA GGCGGGTGCCGAGGAGATCGTGCTGCAGCCCATCAAGGAGATCTCCGGCACCGTCAAGCTGCCGG GGTCCAAGTCGCTTTCCAACCGGATCCTCCTGCTCGCCGCCCTGTCCGAGGTGAGCGATTTTGGTG CTTGCTGCGCTGCCCTGTCT CACT G CTACCT AAAT GTTTT G CCT GTC GAAT ACC ATG G ATT CTCG GT GTAATCCATCTCACGATCAGATGCACCGCATGTCGCATGCCTAGCTCTCTCTAATTTGTCTAGTAGT TTGTATACGGATTAATATTGATAAATCGGTACCGCAAAAGCTAGGTGTAAATAAACACTAGAAAA TTGGATGTTCCCCTATCGGCCTGTACTCGGCTACTCGTTCTTGTGATGGCATGCTGTCTCTTCTTGGT GTTTGGTGAACAACCTTATGAAATTTGGGCGCAAAGAACTCGCCCTCAAGGGTTGATCTTATGCCA TCGTC ATG ATAAAC AGTG G AG CAC G G AC G AT CCTTT ACGTTGTTTTT AACAAACTTT GTC AGAAAA CTAGCATCATTAACTTCTTAATGACGATTTCACAACAAAAAAAGGTAACCTCGCTACTAACATAAC AAAAT ACTT GTT GCTTATT AATT AT ATGTTTTTT AATCTTTGAT CAGGGGACAACAGT GGTTG ATAA CCTGTTGAACAGTGAGGATGTCCACTACATGCTCGGGGCCTTGAGGACTCTTGGTCTCTCTGTCGA AGCGGACAAAGCTGCCAAAAGAGCTGTAGTTGTTGGCTGTGGTGGAAAGTTCCCAGTTGAGGATT CTAAAGAGGAAGTGCAGCTCTTCTTGGGGAATGCTGGAACTGCAATGCGGCCATTGACAGCAGCT GTTACTGCTGCTGGTGGAAATGCAACGTATGTTTCCTCTCTTTCTCTCTACAATACTTGCTGGAGTT AGTAT GAAACCCAT GGGT AT GT CT AGTGGCTT AT GGT GT ATTGGTTTTT GAACTT CAGTT ACGTG CT TGATGGAGTACCAAGAATGAGGGAGAGACCCATTGGCGACTTGGTTGTCGGATTGAAGCAGCTTG GTGCAGATGTTGATTGTTTCCTTGGCACTGACTGCCCACCTGTTCGTGTCAATGGAATCGGAGGGC TACCTGGTGG CAAGGTTAG CTACTAAGG G CC AC ATGTTAC ATTCTTCTGTAAATGGT AC AACTATT GTCGAGCTTTTGCATTTGTAAGGAAAGCATT GATT GAT CT GAATTT GATGCT ACACCACAAAAT AT CCTACAAATGGTCATCCCTAACTAGCAAACAATGAAGTAATACTTGGCATGTGTTTATCAAATTAA TTTCCATCTTCTGGGGCATTGCCTGTTTTCTAGTCTAATAGCATTTGTTTTTAGCATTAATTAGCTCT TACAATTGTTATGTTCTACAGGTCAAGCTGTCTGGCTCCATCAGCAGTCAGTACTTGAGTGCCTTGC TGATGGCTGCTCCTTTGGCTCTTGGGGATGTGGAGATTGAAATCATTGATAAATTAATCTCCATTCC CTACGTCGAAAT GACATT G AGATT GATGGAGCGTTTT GGT GT GAAAGCAGAGCATT CT GATAGCTG G G AC AGATT CTAC ATT AAGG G AG GT CAAAAAT ACAAGT AAGCT CTGTAAT GTATTTC ACT ACTTT G ATGC CAAT GTTT CAGTTTT CAGTTTT CCAAACAGTC G C ATC AAT ATTTG AATAG ATGC ACTGTAG A AAAAAAAT CATT GCAG GG AAAAACT AGTACT G AGTATTTTG ACT G TAAATT ATTTTAC C AGT C G G A ATATAGTC AGTCTATTG G AGTCAAG AG CGTG AAC C GAAATAGC CAGTT AATT AT CCC ATT ATAC AG AGGACAACCATGTATACTATTGAAACTTGGTTTATAAGAGAATCTAGGTAGCTGGACTCGTAGCTG CTTGGCATGGATACCTTCTTATCTTTAGGAAAAGACACTTGATTTTTTTTTTCTGTGGCCCTCTATG ATGTGT G AACCT G CTTCTCT ATT G CTTTAG AAG G ATATATCTATGTCGTTATG C AAC AT G CTTC CCT TAGCCATTTGTACTGAAATCAGTTTCATAAGTTCGTTAGTGGTTCCCTAAACGAAACCTTGTTTTTC TTTGCAATCAACAGGTCCCCTAAAAATGCCTATGTTGAAGGTGATGCCTCAAGCGCAAGCTATTTC TTGGCTGGTGCTGCAATTACTGGAGGGACTGTGACTGTGGAAGGTTGTGGCACCACCAGTTTGCAG GTAAAG ATTTCTTGG CTG GTGCTAC AATAACTG CTTTTG TCTTTTTG GTTTCAG CATTGTTCTC AG A GTCACTAAATAACATTATCATCTGCAAATGTCAAATAGACATACTTAGGTGAATTCATGTAACCGT TTCCTTAC AAATTT GCTGAAACCT CAGGGT GAT GT GAAGTTT GCT G AGGT ACTGGAGAT GAT GGG A GCGAAGGTTACATGGACCGAGACTAGCGTAACTGTTACTGGCCCACCGCGGGAGCCATTTGGGAG GAAACACCTCAAGGCGATTGATGTCAACATGAACAAGATGCCTGATGTCGCCATGACTCTTGCTGT GGTTGCCCTCTTTGCCGATGGCCCGACAGCCATCAGAGACGGTAAAACATTCTCAGCCCTACAACC ATGCCTCTTCTACATCACTACTTGACAAGACTAAAAACTATTGGCTCGTTGGCAGTGGCTTCCTGG AGAGTAAAGGAGACCGAGAGGATGGTTGCGATCCGGACGGAGCTAACCAAGGTAAGGCTACATA CTTCACATGTCTCACGTCGTCTTTCCATAGCTCGCTGCCTCTTAGCGGCTTGCCTGCGGTCGCTCCA TCCTCGGTTGCTGTCTGTGTTTTCCACAGCTGGGAGCATCTGTTGAGGAAGGGCCGGACTACTGCA TCATCACGCCGCCGGAGAAGCTGAACGTGACGGCGATCGACACGTACGACGACCACAGGATGGCC ATGGCCTTCTCCCTTGCCGCCTGTGCCGAGGTCCCCGTGACCATCCGGGACCCTGGGTGCACCCGG AAGACCTTCCCCGACTACTTCGATGTGCTGAGCACTTTCGTCAAGAATTAATAAAGCGTGCGATAC TACCACGCAGCTTGATTGAAGTGATAGGCTTGTGCTGAGGAAATACATTTCTTTTGTTCTGTTTTTT CTCTTTCACGGGATTAAGTTTTGAGTCTGTAACGTTAGTTGTTTGTAGCAAGTTTCTATTTCGGATC TTAAGTTTGTGCACTGTAAGCCAAATTTCATTTCAAGAGTGGTTCGTTGGAATAATAAGAATAATA AATTACGTTTCAGTGGCTGTCAAGCCTGCTGCTACGTTTTAGGAGATGGCATTAGACATTCATCAT CAAC AAC AAT AAAACCTTTT AG C CT C AAAC AAT AATAGT GAAGTTATTTTTTAGTCC TAAAC AAGT T GC ATT AG GAT ATAGTT AAAAC ACAAAAG AAGCTAAAGTTAGG GTTTAG ACAT GTGGAT ATTG TTT TCCAT (SEQ ID NO:316) con una reg¡ón 5’ no traducida ubicada en las posiciones nucleotídicas 1 - 306 y una región 3’ no traducida ubicada en las posiciones nucleotídicas 3490 - 3907. La secuencia de ADNc de EPSPS se identificó como ACCTACTTCCCCCTCGCCCCTCTCATGGTCTCTCTCGCGCCCAGATCTGCTACTAGACGGCACCGCT GCAGCGCGTCGTGTCGCGGGGGTTGGTGGCAGGCAGCGAGAGCTTGCCGTTCCTCTCTCTCAGTTG TCAGGTCCTAGGCTCACCTCACCGGCTCCCAGCCCGCTTCTATTTCTTCCTCCCCGACCCCGTGCAG GTGGCAGTCCAGTCCACGCCACCAACCGCGAGGCGAACCAAACCAACCCACTCTCCCCAACCCCG CGCGCCCAGGCCGCCCGCCCTACCAACCATCGGCGTCGGCAATGGCGGCCATGGCGACCAAGGCC GCCGCGGGCACCGTGTCGCTGGACCTCGCCGCGCCGCCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGTGCA GGCGGGTGCCGAGGAGATCGTGCTGCAGCCCATCAAGGAGATCTCCGGCACCGTCAAGCTGCCGG GGTCCAAGTCGCTTTCCAACCGGATCCTCCTGCTCGCCGCCCTGTCCGAGGGGACAACAGTGGTTG ATAACCTGTTGAACAGTGAGGATGTCCACTACATGCTCGGGGCCTTGAGGACTCTTGGTCTCTCTG TCGAAGCGGACAAAGCTGCCAAAAGAGCTGTAGTTGTTGGCTGTGGTGGAAAGTTCCCAGTTGAG GATTCTAAAGAGGAAGTGCAGCTCTTCTTGGGGAATGCTGGAACTGCAATGCGGCCATTGACAGC AGCTGTTACTGCTGCTGGTGGAAATGCAACTTACGTGCTTGATGGAGTACCAAGAATGAGGGAGA GACCCATTGGCGACTTGGTTGTCGGATTGAAGCAGCTTGGTGCAGATGTTGATTGTTTCCTTGGCA CTGACTGCCCACCTGTTCGTGTCAATGGAATCGGAGGGCTACCTGGTGGCAAGGTCAAGCTGTCTG GCTCCATCAGCAGTCAGTACTTGAGTGCCTTGCTGATGGCTGCTCCTTTGGCTCTTGGGGATGTGG AGATT GAAATCATT GATAAATT AATCTCCATTCCCTACGT CG AAAT G ACATT GAG ATT GATGGAGC GTTTTGGTGT G AAAGCAGAGCATTCTGAT AGCT GGGACAG ATT CT ACATT AAGGGAG GT CAAAAA TACAAGTCCCCTAAAAATGCCTATGTTGAAGGTGATGCCTCAAGCGCAAGCTATTTCTTGGCTGGT GCTGCAATTACTGGAGGGACTGTGACTGTGGAAGGTTGTGGCACCACCAGTTTGCAGGGTGATGT GAAGTTTGCTGAGGTACTGGAGATGATGGGAGCGAAGGTTACATGGACCGAGACTAGCGTAACTG TTACTGGCCCACCGCGGGAGCCATTTGGGAGGAAACACCTCAAGGCGATTGATGTCAACATGAAC AAGATGCCTGATGTCGCCATGACTCTTGCTGTGGTTGCCCTCTTTGCCGATGGCCCGACAGCCATC AGAGACGTGGCTTCCTGGAGAGTAAAGGAGACCGAGAGGATGGTTGCGATCCGGACGGAGCTAA CCAAGCTGGGAGCATCTGTTGAGGAAGGGCCGGACTACTGCATCATCACGCCGCCGGAGAAGCTG AACGTGACGGCGATCGACACGTACGACGACCACAGGATGGCCATGGCCTTCTCCCTTGCCGCCTGT GCCGAGGTCCCCGTGACCATCCGGGACCCTGGGTGCACCCGGAAGACCTTCCCCGACTACTTCGAT GTGCTGAGCACTTTCGTCAAGAATTAATAAAGCGTGCGATACTACCACGCAGCTTGATTGAAGTGA TAGGCTTGTGCTGAGGAAATACATTTCTTTTGTTCTGTTTTTTCTCTTTCACGGGATTAAGTTTTGAG TCTGT AAC GTTAGTT GTTT GTAG C AAGTTT CTATTTCG G AT CTTAAGTTT GTG CACT GTAAG CC AAA TTT CATTT CAAGAGTGGTTCGTTGGAAT AATAAG AAT AAT AAATT ACGTTT CAGTGGCT GTCAAGC CTGCTGCTACGTTTTAGGAGATGGCATTAGACATTCATCATCAACAACAATAAAACCTTTTAGCCT CAAAC AATAAT AGT GAAGTT ATTTTTT AG TCCT AAAC AAGTT G C ATT AGG ATATAGTT AAAAC ACA AAAG AAGCTAAAGTT AGG GTTT AG ACAT GTG GAT ATT GTTTT CC AT (SEQ ID NO:317) Se diseñó un polinucleótido de ARN bicatenario de 240 pares de bases con una cadena correspondiente a la secuencia de ADN TACTTGAGTGCCTTGCTGATGGCTGCTCCTTTGGCTCTTGGGGATGTGGAGATTGAAATCATTGATA AATTAATCTCCATTCCGTACGTCGAAATGACATTGAGATTGATGGAGCGTTTTGGTGTGAAAGCAG AG C ATTCTG ATAG CTGG G ACAG ATT CT ACATT AAG G G AGGTC AAAAATAC AAGTC C C CTAAAAAT GCCTATGTTGAAGGTGATGCCTCAAGCGCAAGCTATTTCTTG (SEQ ID NO:318) ^{q u e}corresponde a un segmento de 240 nucleótidos ubicado en las posiciones nucleotídicas 937 - 1176 de la secuencia de ADNc de EPSPS.

220) Semillas de Zea mays (Gaspe) se hicieron germinar sobre papel de germinación. Las plántulas se transfirieron a macetas de 4 pulgadas y las plantas se cultivaron en una cámara de cultivo. Se trataron por vía tópica con polinucleótidos 3 plantas de 17 días y tres plantas se usaron como controles. Dos hojas inferiores de cada planta se marcaron y después se pretrataron sumergiéndolas en una solución de Silwet L-77 al 0,1 %. Aproximadamente 30 minutos después del pretratamiento con tensioactivo, se aplicaron 20 microlitros de solución de tratamiento sobre el lado superior de cada una de las dos hojas pretratadas. La solución de tratamiento consistía en una mezcla de 100 microlitros de solución tampón 2X, 90 microlitros de agua, 10 microlitros de una solución de 4,6 microgramos/microlitro de ARNbc de EPSPS (con una cadena correspondiente a la SEQ ID NO:318); la solución tampón 2X era una mezcla de 200 microlitros de Silwet L-77 al 0,1 %, 200 microlitros de fosfato de sodio 50 milimolar, 146 microlitros de fosfato de amonio al 34% y 454 microlitros de agua. Después de 8 días de tratamiento, dos de las tres plantas tratadas con los polinucleótidos presentaban retraso en el crecimiento con hojas apicales muertas o dañadas (similar al fenotipo observado en plantas de Nicotiana benthamiana tratadas de forma similar con polinucleótidos de EPSPS), mientras que las tres plantas de control presentaban un crecimiento y una morfología normales (Figura 37).

Ejemplo 35

221) Se investigó la eficacia de diferentes sustancias (incluidas sales, un agente quelante, un humectante y poliaminas) como agentes de transferencia de polinucleótidos o como potenciadores de agentes de transferencia de polinucleótidos conocidos. Anteriormente, el sulfato de amonio había demostrado que potenciaba la infiltración de polinucleótidos en las plantas (véase, por ejemplo, el Ejemplo 13). En la Tabla 26 se muestra el efecto sobre la actividad herbicida (presentada como porcentaje del control/muerte de la maleza y como la altura de la planta) del sulfato de amonio y de EDTA como aditivos para soluciones de pulverización Silwet L-77 al 1 % de polinucleótidos (ARN) aplicados por vía tópica sobre plantas de palmera amaranto resistentes a glifosato. En este experimento específico, se descubrió que el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) al 0,004 % actúa de forma similar al sulfato de amonio al 2 % en la solución de pulverización, mejorando la eficacia de los polinucleótidos y potenciando la actividad herbicida del glifosato.

Tabla 26

222) En la Tabla 27 se muestra el efecto sobre la actividad herbicida (presentada como porcentaje de control/muerte de la maleza y como la altura de la planta) de varias sales incluidas sales inorgánicas (cloruro de sodio, sulfato de sodio, sulfato de amonio, cloruro de amonio) y sales orgánicas (cloruro de tetrametilamonio, cloruro de tetraetilamonio, bromuro de tetrapropilamonio y bromuro de tetrabutilfosfonio) como aditivos para soluciones de Silwet L-77 al 1 % para pulverización de polinucleótidos (ARN) aplicados por vía tópica sobre plantas de palmera amaranto resistentes a glifosato. En este experimento específico, se descubrió que el cloruro de amonio y el bromuro de tetrabutilfosfonio actúan de forma similar al sulfato de amonio en la solución de pulverización, mejorando la eficacia de los polinucleótidos y potenciando la actividad herbicida del glifosato.

Tabla 27

223) En la Tabla 28 se muestra el efecto del humectante glicerina sobre la actividad herbicida (presentada como porcentaje del control/muerte de la maleza y como la altura de la planta) de polinucleótidos (ARN) aplicados por vía tópica sobre plantas de palmera amaranto resistentes a glifosato. Se descubrió que la glicerina mejoraba la eficacia de los polinucleótidos, potenciando la actividad herbicida del glifosato.

Tabla 28

224) En la Figura 38 se muestra el efecto de la variación de los contraiones de glifosato sobre la actividad herbicida (presentada como un porcentaje del control/muerte de la maleza y como la altura de la planta) de polinucleótidos (ARN) aplicados por vía tópica sobre plantas de palmera amaranto resistentes a glifosato. Se preparó una mezcla de polinucleótidos de EPSPS (IDT [1] (SEQ ID NO:83-84), IDT [2] (SEQ ID NO:85-86), IDT [3] (SEQ ID NO:87-88) e IDT [4] (SEQ ID NO:89-90)) en Silwet L-77 al 0,5 %, sulfato de amonio al 2 % en tampón de fosfato de sodio 10 milimolar, pH 6,8 con portador Roundup® WeatherMax® al 0,2 % (MON56151 tensioactivo de amina de sebo mezcla de amina de sebo (16-18C) y cocoamina (12-14C) en la relación de 55:45) y 1682 g de equivalente ácido por hectárea de una de las sales de glifosato; K+ glifosato, isopropilamonio glifosato o monoetanolamonio glifosato a 215 litros/acre mediante pulverizador Milli en 3 copias de palmera amaranto resistente a glifosato de 4-6 pulgadas que contenían 16 copias de EPSPS. La altura de la planta se puntuó 21 días después del tratamiento con glifosato. En la Tabla 29 se proporcionan los resultados (presentados como porcentaje del control/muerte de la maleza y como la altura de la planta). Las sales de isopropilamonio y monoetanolamonio de glifosato proporcionaron mejor actividad herbicida en comparación con la sal de potasio.

Tabla 29

225) Se investigó el efecto de los cationes de poliamina de espermina (A/,W’-6/s(3-aminopropil)butano-1,4-diamina) y espermidina (A/-(3-aminopropil)butano-1,4-diamina) sobre la actividad herbicida de polinucleótidos (ARN) aplicados por vía tópica sobre plantas de palmera amaranto resistentes a glifosato. Las soluciones polinucleotídicas se prepararon utilizando una mezcla de las mismas cantidades de las cuatro moléculas oligonucleotídicas de ARNbc de tamaño “corto” descritas en el Ejemplo 1, que tienen una cadena antisentido diseñada para hibridarse con el ARNm transcrito a partir del gen de EPSPS de la palmera amaranto (SEQ ID NO:1) en las posiciones 14-38 (ARNbc-1 corto), posiciones 153-177 (ARNbc-2 corto), 345-369 (ARNbc-3 corto) y 1105-1129 (ARNbc-4 corto) tal como se indica mediante los nucleótidos subrayados en la Figura 1; los ARNbc tenían un saliente de dos nucleótidos en el extremo 3' de la cadena antisentido y en el extremo 3' de la cadena sentido tenían, como nucleótidos terminales, dos desoxinucleótidos. Las soluciones de polinucleótidos de ARNbc se prepararon con espermina o espermidina 1 o 10 milimolar o con sulfato de amonio al 2%, en un tampón de fosfato de sodio 10 milimolar (pH 6,8). Las soluciones de control (sin polinucleótidos) se prepararon con espermina o espermidina 1 o 10 milimolar o con sulfato de amonio al 2%, en un tampón de fosfato de sodio 10 milimolar (pH 6,8). Las plantas de palmera amaranto resistentes a glifosato (33, 36 o 57 copias de EPSPS) se prepulverizaron con Silwet L-77 al 1 %. Las soluciones de polinucleótido de ARNbc (11,6 gramos/acre) o las soluciones tampón se aplicaron en forma de gotas con una pipeta en cuatro hojas inferiores completamente expandidas de palmera amaranto resistente a glifosato. Dos días después del tratamiento con polinucleótidos las plantas se pulverizaron con glifosato (3360 g de equivalente ácido por hectárea de herbicida de la marca Roundup® WeatherMAx®). Las plantas se fotografiaron 14 días después del tratamiento con glifosato; los resultados se muestran en la Figura 39. El tratamiento con ARNbc y con espermina 10 milimolar con posterior tratamiento con glifosato, causó la muerte de la palmera amaranto resistente a glifosato con 33 copias de EPSPS, la lesionó gravemente y produjo retraso en el crecimiento en la palmera amaranto resistente a glifosato con 36 copias de EPSPS. El tratamiento solo con espermidina 10 mM produjo retraso en el crecimiento en la palmera amaranto resistente a glifosato con 33 copias. En este experimento particular, ni la espermina ni la espermidina a 1 o 10 milimolar tuvieron el mismo rendimiento que el sulfato de amonio al 2%.

Ejemplo 36

226) Se evaluó la eficacia de diferentes tensioactivos como agentes de transferencia de polinucleótidos en soluciones de polinucleótidos para pulverización aplicadas a la palmera amaranto resistente a glifosato. Se adquirieron tensioactivos Break-Thru de Evonik Industries; se adquirieron tensioactivos Silwet de Momentive. Las soluciones para pulverización se prepararon el mismo día de la pulverización. Se añadió una mezcla de polinucleótidos de EPSPS (IDT [1] (SEQ ID NO:83-84), IDT [3] (SEQ ID NO:87-88) e IDT [4] (SEQ ID NO:89-90)) a las soluciones de pulverización, 15 a 50 minutos antes de la pulverización y utilizando un pulverizador común de bajo volumen muerto (“milli”), se aplicaron de 1 a 2 mililitros a plantas de palmera amaranto resistentes a glifosato de una a cuatro pulgadas (R-22) cultivadas a partir de esquejes. Se aplicó un total de entre 10 y 225 microgramos de polinucleótidos a cada planta, dependiendo del experimento; por lo general, se aplicó un total de 23 microgramos de polinucleótidos por planta. Las plantas tratadas se colocaron en un invernadero con una programación fijada de temperatura de 26,7/21,1 grados centígrados o 29,4/21,1 grados centígrados durante 14/10 horas y luz complementaria. Después de 2 a 3 días, las plantas se pulverizaron con glifosato (“2X Wmax” o 1682 g de equivalente ácido por hectárea de herbicida de la marca Roundup® WeatherMAX®) con un pulverizador común (10 galones/acre) y se volvieron a colocar en el invernadero. La cantidad de control (lesión visual) con respecto a los tratamientos sin pulverización, la altura de las plantas y las fotografías de la palmera amaranto se tomaron a diferentes intervalos de tiempo de hasta 21 días después del tratamiento con glifosato. El peso fresco del material vegetal por encima del suelo se recogió en el último punto temporal. A cada tratamiento se le otorgó una puntuación global de lesión de la planta entre 0 y 3 basándose en el análisis combinado de Control, Altura, Peso fresco y Fenotipo vegetal visual, donde “3“ es actividad herbicida intensa, “2” es actividad moderada, “1” es actividad leve y “0” es sin actividad observada después de la corrección de cualquier lesión observada causada con el tratamiento solo con glifosato; los resultados se muestran en la Tabla 30.

227) Las propiedades físicas de los diferentes tensioactivos también se investigaron y se muestran en la Tabla 30. El mismo día de la medición, se prepararon setenta mililitros de solución detensioactivo (tensioactivo al 0,5% en solución acuosa que contenía sulfato de amonio al 2 %, tampón (fosfato de potasio 20 milimolar, pH 6,8), con o sin adición de un polinucleótido de EPSPS (IDT [2] (SEQ ID NO:85-86), 0,09 miligramos/mililitro). La tensión superficial dinámica se midió a temperatura ambiente (22 a 23 grados centígrados) en un tensiómetro Kruss BP100 utilizando el procedimiento de presión máxima de burbujeo, representando gráficamente la tensión superficial con respecto a la edad de la superficie. El instrumento se programó para detectar automáticamente la superficie y sumergir el capilar hasta una profundidad de 10 mm. Se registraron las mediciones de tensión superficial de tres edades de superficie (aproximadamente 20, 500 y 1250 ms). La tensión superficial en dinas por cm se indicó en el intervalo de 1250 ms como una aproximación de la tensión superficial estática y el cambio entre 20 y 500 ms se indicó como una estimación de la tensión superficial dinámica. Los valores de equilibrio hidrófilo-lipófilo (HLP, hydrophile-lipophile balance) de los tensioactivos se obtuvieron a partir de referencias detensioactivo e información del producto.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para regular la expresión de un gen diana endógeno en plantas en crecimiento, que comprende: aplicar por vía tópica sobre la superficie de dichas plantas en crecimiento:

(a) al menos un ARN bicatenario no transcribible que comprende una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos en cualquiera de dicho gen diana endógeno o ARN mensajero transcrito a partir de dicho gen diana endógeno; y

(b) una cantidad eficaz de un agente químico de transferencia, en el que dicho agente químico de transferencia permite que dicho al menos un ARN bicatenario no transcribible se infiltre al interior de dichas plantas en crecimiento, en el que dicho agente químico de transferencia es un tensioactivo de organosilicona, y mediante lo cual dicho al menos un ARN bicatenario no transcribible regula la expresión de dicho gen diana endógeno.

2. Una composición que comprende:

(a) una solución de ARN bicatenario no transcribible que comprende una secuencia esencialmente idéntica o esencialmente complementaria a una secuencia de 18 o más nucleótidos contiguos de un gen endógeno de una planta o a la secuencia de ARN transcrita a partir de dicho gen endógeno; en el que dicho ARN bicatenario no transcribible es capaz de hibridarse en condiciones fisiológicas en las células de dicha planta con dicho gen endógeno o con dicho ARN transcrito a partir de dicho gen endógeno para efectuar el silenciamiento de dicho gen endógeno; y

(b) un agente químico de transferencia eficaz para facilitar la transferencia de dicho ARN bicatenario no transcribible desde la superficie exterior de dicha planta al interior de las células de dicha planta, en el que dicho agente químico de transferencia es un tensioactivo de organosilicona.

3. El procedimiento de la reivindicación 1,

en el que dicha expresión de dicho gen diana endógeno se regula en células vegetales distintas de las que han recibido la aplicación tópica;

en el que dicho gen diana endógeno se regula por vía sistémica en al menos un órgano vegetal;

en el que dichos polinucleótidos no transcribibles se dirigen a diferentes segmentos de un gen endógeno o a diferentes genes endógenos;

en el que dichas plantas se cultivan en un campo abierto;

en el que dichas plantas se cultivan en un invernadero;

en el que dichas plantas también se pulverizan con un herbicida no polinucleotídico; o una combinación de uno o más de los mismos.

4. La composición de la reivindicación 2,

en la que dicho tensioactivo de organosilicona es un copolímero de poliéter y silicona; en la que dicho copolímero de poliéter y silicona es un copolímero de heptametil trisiloxano modificado con óxido de polialquileno y aliloxipolipropilenglicol metiléter (disponible como tensioactivo Silwet® L-77); comprendiendo además una molécula herbicida no polinucleotídica; o una combinación de los mismos.