JPH01124392A

JPH01124392A - 生理活性物質ｐｉ３４３０

Info

Publication number: JPH01124392A
Application number: JP62282830A
Authority: JP
Inventors: Akira Kawashima; 朗川嶋; Yuko Yoshimura; 吉村　祐子; Noriyoshi Sakai; 酒井　則義; Kunio Kamigoori; 神郡　邦男; Taku Mizutani; 卓水谷; Sadafumi Omura; 大村　貞文
Original assignee: Taisho Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Taisho Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1987-11-09
Filing date: 1987-11-09
Publication date: 1989-05-17

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は新規の生理活性物質に関する。

従来の技術本発明の生理活性物質は新規の物質であって、これと同
一の理化学的性質を有する物質の存在は、現在まで知ら
れていない。

発明が解決しようとする問題点本発明の目的は、アラキドン酸、アデノシンニリン酸、
コラーゲンによる血小板凝集に対して強い抑制作用を有
する新規の生理活性物質を提供することにある。

問題点を解決するための手段本発明の生理活性物質を生産する菌株は、本発明者らが
宮城県宮城郡松島町の土壌より新たに分および微生物受
託番号「微工研条寄第１５０３号（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１
５０３）　Ｊとして工業技術院微生物工業技術研究所に
寄託されており、この菌株を培養して得られる本発明の
目的物質を生理活性物質Ｐ’ｌ３４３０（以下、’ＰＩ
３４３０．と略称することもある）と命名した。

この菌株の菌学的性状を以下に示す。

１〉形態本菌株は、麦芽エキス寒天培地、バレイショ・ブドウ糖
寒天培地および合成ムコール寒天培地などで中程度に生
育し、分生子の着生も良好である。

麦芽エキス寒天培地に生育したコロニーを顕微鏡で観察
すると、菌糸は透明で隔壁を有し、高度に分枝しており
、分生子柄は主に基底菌糸より分岐し立ら上がり、１３
０〜２７５Ｘ１．８〜２．８μと変化に富み、先端に２
〜６個のフィアライドが輪生状に形成される。

フィアライドは円筒状（１１〜１４×２〜３μ）で先端
は先細り（０，５〜０．８μ）となる。

はじめにフィアライドの頂端にフィアロ型分生子が１個
着生し、培養時間の経過とともに連鎖状となる０分生子
は普通２５〜３５個の連鎖をなしているが、それ以上の
長鎖も観察される。

電子顕微鏡で観察すると、分生子は亜球形からレモン形
で大きさは３．４〜４．２Ｘ２．２〜３．０μであり、
その表面はとげ状を呈している。厚膜胞子の形成は観察
されない。

２）培地上での生育状態各種培地上で２８°Ｃ１１４日間培養したときの肉眼に
よる観察結果を第１表に示す。

第１表３〉生理的、生態的性質（１）最適生育条件本菌株の最適生育条件は、ＹｐＳｓ培地上培地−てｐＨ
６，８〜７．２、温度２０〜２８℃である。

（り生育の範囲本菌株の生育範囲は、ＹｐＳｓ培地においてｐＨ３，８
〜９．３、温度１０〜３０°Ｃである。

０）好気性、嫌気性の区別：　好気性以上の形態的特徴および培養上の性状から本菌株がベニ
シロマイセス属に属することは明らかとなったので、前
記諸性状を基に宇田用俊−１椿啓介編１菌類図鑑Ｊ　（
１９７８年）およびサムソン（Ｒ。

Ａ、　Ｓａｍｓｏｎ　）著の’Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅ
ｓ　ａｎｄ　ｓｏｍｅ　ａｌｌｉｅｄＨｙｐｈｏｍｙｃ
ｅｔｅｓ（Ｓｔｕｄｉｅｓ　Ｍｙｃｏｌ、　、　６．　
（１９７４））Ｊに報告されている多くの既知菌株と比
較検討した結果、本菌株は不完全菌の分類上膜も重要な
特徴とされている分生子の形態およびマイアライドの形
態等がベニシロマイセス・カーネス（Ｐａｃｅｉｌｏｍ
ｙｃａｓＱａｒｎｅｅｓ）に最も近い性状を示すことが
明ら゛かとなった。

しかし、文献記載のベニシロマイセス・カーネスは生育
速度が本菌株に比べ遅く、また、コロニーは培養初期に
白色、培養後期に桃色がかると記述されているが、本菌
株では培養初期、後期とも白色を呈する点で異なる他、
分生子の形状でも若干異なっていた。しかしながら、ベ
ニシロマイセス属の中で分生子表面がとげ状を呈する種
は、ベニシロマイセス・カーネスのみであることから、
本菌株はベニシロマイセス・カーネスかその変種と考え
られるが、決定的な根拠がないのでベニシロマイセス・
エスピー・Ｆ−３４３０と命名した。

生理活性物質ＰＩ３４３０の生産は、大略、−般の醗酵
生産物を生産する場合に準じ、各種栄養物質を含む培地
でベニシロマイセス・エスピー・Ｆ−３４３０を好気的
条件下で培養することにより行なう。

培地は主として液体培地を用い、次素源としてはグルコ
ース、シュクロース、糖蜜、スターチなどを単独か、ま
たは混合して用いる。窒素源としては肉エキス、酵母エ
キス、大豆粉、ポリペプトンなどを単独か、または混合
して用いる。

その細末菌株の生育を助は生理活性物質ＰＩ３４３０の
生産を促進する有機物および無機塩を適当に添加するこ
とができる。消泡剤としては、アデカノール、シリコン
など常用の消泡剤を用いることができる。

培養方法は振とう培養、通気攪拌培養などの好気的培養
が適しておりｐＨ４〜８．２５〜３０℃で２〜６日間、
望ましくはｐＨ６，８〜７．０．２５〜２８℃で５日間
培養する。

この培養により生産されたＰＩ３４３０を単離するには
、醗酵生産物を採取する一般的な方法に準じて行えばよ
い。

生理活性物質ＰＩ３４３０は主に培養源液中に含有され
るので、たとえば次の方法が効果的である。

すなわち、培養終了後遠心分離または濾過により培養濾
液を得、この濾液を吸着樹脂、た゛とえば、ダイヤイオ
ンＨＰ−２０（商品名：三菱化成工業社製）に吸着させ
たのち、低級アルコール、アセトンなどの有機溶媒でＰ
Ｉ３４３０を溶出させる。この溶出液を濃縮後、酢酸エ
チル、ベンゼン、クロロホルムなどの非水溶性有機溶媒
に転溶し、これを濃縮してシロップ状とする。このシロ
ップを再度酢酸エチル、ベンゼン、クロロホルムなどの
有機溶媒に溶解し、セファデックスＬＨ−２０（商品名
：ファルマシア社製）を用いたゲル濾過および高速液体
クロマトグラフィーに付することにより、ＰＩ３４３０
を精製、単離することができる。

以上の精製方法で単離されたＰＩ３４３０は、下記の理
化学的性質を有している。

（ａ）元素分析値Ｃ：６４．３５％、Ｈ：９．１２％、Ｎ：４．６９％（
ｂ）分子量Ｆ　Ａ　Ｂ　−Ｍ　Ｓ　：　ｍ／ｚ　２９８（Ｍ＋　Ｈ
）”（ｃ）分子式　　Ｃ，＊Ｈ，ｙＯ，Ｎ（ｄ）比旋光度［αコ”−−２２４’ （ｃ＝０．５．クロト１ホルム中〉（ｅ）紫外線吸収スペクトルアセトニトリル中で測定した結果を第１図に示す。

（ｆ）赤外線吸収スペクトルクロロホルム中で測定した結果を第２図に示す。

（ｇ＞　１Ｈ−ＮＭＲスペクトル重クロロホルム中２００ＭＨｚで測定した結果を第３図
に示す。

（ｈ）溶剤に対する溶解性水に不溶。メタノール、エタノール、６９エチル、ベン
ゼン、クロロホルム、ｎ−ヘキサンに可溶。

（ｉ）呈色反応ニンヒドリン、塩化第二鉄反応：陰性ヨード反応、バニリン−硫酸、アニスアルデヒド−硫酸：陽性（ｊ）塩基性、酸性、中性の区別中性（ｌｃ）物質の色無色発明の効果本発明の生理活性物質ＰＩ３４３０は、アラキドン酸、
アデノシンニリン酸、コラーゲンによる血小板凝集に対
し優れた抑制作用を有する新規の生理活性物質であり、
血栓症などの治療薬として有用である。

実施例以下、実施例および試験例を挙げ本発明を具体的に説明
する。

実施例（１）５Ｎ容ジャーファーメンタ−容器に、グルコース
４％、ポリペプトン１％から成る培地３ｐ。

をいれて、オートクレーブで滅菌した。これと同じ組成
の培地で３０°Ｃ３日間振とう培養したベニシロマイセ
ス・エスピー・Ｆ−３４３０菌液ヲ前記滅菌培地に２％
接種し、２８°Ｃで５日間攪拌通気培養した。

培養終了後、ジャーノアメンタ−８台分２４２の培養液
を合わせて濾過し、菌体と濾液に分けた。

得られた濾液を吸着樹脂［ダイヤイオンＨＰ−２０（商
品名：　三菱化成工業社製）　１５００ｍｇ　］に吸着
させた後、精製水３！で洗浄し、次いでアセトン２００
０ｍｇで活性物質を溶出した。溶出液は減圧濃縮し、得
られた残渣を５００ｍｇの酢酸エチルにて抽出し、濃縮
乾固することによりシロップ状液２ｇを得た。

（２〉前項（１）で得られたシロップ状液をアセトン５
ｄに溶解し、不溶物を濾過により除去した後、セファデ
ックスＬＨ−２０（商品名：ファルマシア社製、８５０
ａｅ　）を用い、アセトンでゲル濾過を行なった。４０
０〜５００ｄに溶出してくる活性画分を集め、減圧濃縮
してシロップ状物質８００ｍｇを得た。

〈３）前項（２）で得られたシロップ状液をアセトニト
リル３ｄに溶解し、以下の条件で行なった高速液体クロ
マトグラフィーの試料にした。

カラムサイス°　２０φＸ　２５０ｍｍ担体　　　　　
ＯＤＳシリガゲル（デイベロジル　骨材化学社製）溶媒組成　　　４７％アセトニトリル５３％水流速　　　　　１２ｍｅ／ｍｉｎ温度　　　　　５０°Ｃ検出波長　　　２１５ｎｍ装置　　　　　日本分光）・ライローターＶ型保持時間
４９〜５２分の画分を分取し、３３０ｍｇの生理活性物
質ＰＩ３４３０を得た。

元素分析値（Ｃ、、Ｈ□０．Ｎとして）実測値（％）：
　Ｃ６４，３５、Ｈ９，１２、Ｎ　４．６９理論値（％
）：　Ｃ６４，６５，Ｈ９，０９、Ｎ　４．７１試験例
　〈血小板凝集阻害作用）（１）血小板の調製法体重２．０〜２．５ｋｇの雄家兎の総頚動脈より採血し
、血液量の１０分の１容の３．８％クエン酸すトリウム
溶液を加えて軽く混和し、１３００Ｘｇで２分間遠心分
離した上清を多血小板血漿（以下’ＰＲＰ。

という）とした、沈澱をさらに１６００Ｘｇで１０分間
遠心分離して得られた上清を乏血小板血漿（以下’ＰＰ
Ｐ、という）とした。

（り凝集惹起剤の調製法あらかじめ、アラキドン酸くシグマ社製）は、エタノー
ルで、アデノシンニリン酸またはフラーゲン（京都第一
化学社製：アグリバック）は生理食塩水で所要濃度に希
釈し、前記成分を個別に含む凝集惹起剤を調製した。

０）血小板凝集阻害活性測定法２００４のＰＲＰを採り、ＰＰＰとの吸光度の差を一定
にした後、メタノールにて所要濃度に調製したＰＩ３４
３０をＰＲＰに加え、攪拌した。対照はメタノールのみ
を使用した０次いで、上記凝集惹起剤（最終濃度：アラ
キドン酸の場合０．１ｍＭ、アデノシンニリン酸の場合
１０μＭ１コラーゲンの場合１０μｇ／ｍｆ）を添加し
吸光度の変化を二元バイオサイエンス社プレイトレット
アグリゲーショジトレーサー４Ａ型血小板凝集計を用い
、ボーン等の比濁法［Ｂｏｒｎ、　Ｊ、　Ｐｈｙｓｉｏ
ｌ、　、　１６８．１７８（１９６８）］により４１１
１定し、ＰＩ３４３０の５０％血小板凝集阻害濃度（Ｉ
　Ｃｓ。値〉を求めた。

その結果を第２表に示す。

第２表

【図面の簡単な説明】

第１図はアセトニトリル中で測定した生理活性物質ＰＩ
３４３０の紫外線吸収スペクトル、第２図はクロロホル
ム中で測定した生理活性物質ＰＩ３４３０の赤外線吸収
スペクトル、第３図は重クロロホルム中、２００ＭＨｚ
で測定した生理活性物質ＰＩ３４３０の１Ｈ−ＮＭＲス
ペクトルを示す。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）下記の理化学的性質を有する生理活性物質ＰＩ３
４３０（ａ）元素分析値Ｃ：６４．３５％、Ｈ：９．１２％、Ｎ：４．６９％（ｂ）分子量ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｚ２９８（Ｍ＋Ｈ）＾＋（ｃ）分子式Ｃ＿１＿６Ｈ＿２＿７Ｏ＿４Ｎ（ｄ）比旋光度［α］＾２＾０＿Ｄ＝−２２４° （ｃ＝０．５、クロロホルム）（ｅ）紫外線吸収スペクトルアセトニトリル中で測定した結果を第１図に示す。（ｆ）赤外線吸収スペクトルクロロホルム中で測定した結果を第２図に示す。（ｇ）＾１Ｈ−ＮＭＲスペクトル重クロロホルム中、２００ＭＨｚで測定した結果を第３
図に示す。（ｈ）溶剤に対する溶解性水に不溶。メタノール、エタノール、酢酸エチル、ベン
ゼン、クロロホルム、ｎ−ヘキサンに可溶。（ｉ）呈色反応ニンヒドリン、塩化第二鉄反応：陰性ヨード、バニリン−硫酸、アニスアルデヒド−硫酸反応
：陽性（ｊ）塩基性、酸性、中性の区別中性（ｋ）物質の色無色