JPH03227991A - ジチオジケトピペラジン化合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は血小板凝集抑制作用を有するジチオジケトピペ
ラジン化合物に関する。

従来の技術 本発明に構造類似で同様な作用をもった化合物は知られ
ていない。

発明が解決しようとする課題 本発明の目的は、血小板凝集抑制作用を有する新規な化
合物を提供することにある。

課題を解決するための手段 本発明者らは前記目的の達成のために多数の菌株を土壌
より分離し、その菌株の培養物について種々検討した結
果、ある種の菌株の生産する化合物が強い血小板凝集抑
制作用を有することを見いたし、本発明を完成した。

すなわち、本発明は式 で表される化合物である。

本発明の化合物を生産する菌株は、本発明者らが埼玉県
和光市で採取したアブラ菜より新たに分離した菌株であ
り、微生物の名称Ｅｐｉｃｏｃｃｕｍｐｕｒｐｕｒａｓ
ｃｅｎｓ　Ｆ　−３８２２及び微生物寄託番号「微工研
菌寄第１０６９１号（Ｆ　Ｅ　ＲＭ　Ｐ−１０６９１）
　Ｊとして、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託さ
れている。

この菌株の菌学的性状を以下に示す。

（１）形態的性状 本菌株は、バレイショ・ブドウ糖寒天培地、ツγベック
ードックス寒天培地、オートミール寒天培地、Ｙ　ｐ　
Ｓ’　Ｓ寒天培地などで良好な生育を示すが、分生子の
形成は、バレイショ・ブドウ糖寒天培地及びＬＣＡ培地
上で長期間培養したときにのみ、わずかに認められる。

バレイショ・ブドウ糖寒天培地に生育したコロニーを顕
微鏡下で観察すると、菌糸は隔壁を有し、高度に分枝し
ており、直径は１〜５μｍ１菌糸表面は滑面からやや粗
面を呈している。室温で２〜３週間以上培養すると、コ
ロニーの周縁部に分生子鹿を形成する。分生子柄は菌糸
から群生、又は分生子座上に形成し、３〜８μｍＸ５〜
１８μｍの円筒形から種棒形、θ〜２隔壁を生Ｃる。表
面は滑面、無色から淡褐色で、先端に暗色のアレウロ型
分生子を車止ずる。分生子は黒褐色で直径９〜２５μｍ
の球形から亜球形、縦横に不規則な隔壁を生じ、編目状
にひびのはいった外膜で覆われ、いぼ状を呈している。

（２）培養性状 各種培地上で、２５°Ｃ１１４日間培養した場合の肉眼
による観察結果を第１表に示した。

第 表 （３）生理的性状 ■生育ｐＨ範囲及び最適ｐ　Ｈ 本菌株はＹｐＳｓ寒天培地において、ｐＨ３〜９の範囲
で生育し、最適ｐＨは５〜６である。

■生育温度範囲及び最適温度 本菌株はサブロー培地において、６〜３４°Ｃの範囲で
生育し、最適温度は２２〜２６℃である。

以上の形態的特徴及び培養上の性状から、本菌株がＥｐ
ｉｃｏｃｃｕｍ属に属することが明らかになったので、
前記諸性状を基に、宇田用俊−７椿啓介編１菌類図鑑」
（１９７８年）及びＭ　、　Ｂ　、　Ｅｌｌｉｓ著ｒ　
ＤＥＭＡＴ工ΔＣＥＯＵＳ　ＨＹＰＨＯＭＹＣＥＴＥＳ
Ｊ　（１９７１年）に報告されている既知菌株と比較検
討した。その結果、本菌株はＥｐｉｃｏｃｃｕｍ　ｐｕ
ｒｐｕｒａｓｅｎｓに最も近い性状を示すことが明らか
となり、本菌株をＥｐｉｃｏ−ｃｃｕｍ　ｐｕｒｐｕｒ
ａＳｅｎｓ　Ｆ　−３８２２と命名した。

本発明化合物の生産は、大略一般の発酵生産物を生産す
る場合に準じ、各種の栄養物質を含む培地で本菌株を好
気的条件下で培養することにより行なう。

培地は主として液体培地を用い、炭素源としてはグルコ
ース、シュクロース、廃糖蜜、スターチなどを単独又は
混合して用いる。窒素源としては肉エキス、オートミー
ル、酵母エキス、大豆粉、ポリペプトンなどを単独また
は混合して用いる。

その他、本菌株の生育を助は本発明化合物の生産を促進
する有機物及び無機塩を必要により添加することができ
る。消泡剤としては、アテカノル、シリコンなどを用い
ることができる。

培養方法は振とう培養、通気撹拌培養などの好気培養が
適しており、ｐＨ４〜８．２５〜３５°Ｃで３〜６日間
、望ましくはｐＨ６〜７．２５〜２８°Ｃで４日間培養
する。

この培養により生産された本発明化合物を単離するには
発酵生産物を採取する一般的な方法に準じて行えばよい
。本発明化合物は主に培養炉液中に含有されるので、例
えば次の方法が効果的である。

すなわち、培養終了後、遠心分離又は濾過により培養炉
液を得、この炉液を吸着樹脂に吸着させた後、低級アル
コール、アセトンなどの有機溶媒で本発明化合物を溶出
させる。この溶出液を濃縮後、酢酸エチル、ヘンゼン、
クロロホルムなどの非水溶性溶媒に転溶し、これを濃縮
してシロップ状とする。このシロップを再度ベンゼン、
酢酸エチル、アセトン、メタノール、クロロホルムなど
の有機溶媒に溶解し、シリカゲルカラムクロマトグラフ
ィー、ゲル？濾過カラムクロマトグラフィー及び高速液
体カラムクロマトグラフィーに付すことにより、本発明
化合物を精製、単離することができる。

発明の効果 本発明化合物は、アラキドン酸、アデノシンニリン酸、
コラーゲンによる血小板凝集に対し、優れた抑制作用を
有するので、血栓症の治療薬として有用である。

実施例 以下、実施例及び試験例を挙げて本発明を具体的に説明
する。

（実施例） （１）内容量５Ｉ！、のジャーファーメンタ−容器に、
グルコース２％、ポリペプトン０．５％、酵母エキス０
．２％、硫酸マグネシウム０．０５％、リン酸−力ノウ
ム０．１％からなる培地３Ｉ１．を入れ滅菌した。

これと同じ組成の培地で３０°Ｃ１３日間往復振とう培
養した本菌株の菌液を、前記滅菌培地に３．３％植菌し
、２８°Ｃ１４日間撹拌通気培養した。

培養終了後、培養′液１２Ｊ２を濾過し、菌体と炉液に
分けた。炉液をダイアイオンＨＰ−２０（吸着樹脂の商
品名、三菱化成工業社製）に吸着させた後、精製水ＩＪ
２で洗浄後、メタノール１りで活性物質を溶出した。溶
出液よりメタノールを留去後、残渣を５００−の酢酸エ
チルで２回抽出した。

酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで脱水後、濃縮乾固
し、粗粉末２．５ｇを得た。

（２）　（１）で得られた粗粉末２．５ｇを５ｍｅのク
ロロホルムに溶解し、シリカゲルを充填したカラム（溶
媒：クロロホルム、容量２５０ｄ　）に吸着させた。

クロロホルム５００ｉで洗浄後、クロロポルム−メタノ
ール（９９：１）、クロロホルム−メタノール（９８：
２）で順次溶出を行い、これらの両分を除いた。次にク
ロロホルム−メタノール（９５：５）で溶出を行い、こ
れを集めて濃縮乾固することにより粗粉末８９７ｍｇを
得た。

得られた粗粉末を、クロロホルム−メタノール（１：　
１）で調製した七ファデックスＬ　Ｈ−２０（商品名、
ファルマシア社製：容量３０Ｍ）にてゲル濾過を行い、
活性画分を集め濃縮乾固し７１４ｍｇの黄白色粉末を得
た。

（３）　（２）で得た黄白色粉末７１４ｍｇをジメチル
スルホキシドに溶解し、以下の条件で行った高速液体ク
ロマトグラフィーの試料とした。

カラムサイズ゛：２０φＸ　２５ｃｍ 担体　　　　：　ＯＤＳシリカゲル （ＹＭＣ−ＡＱ山村科学社製） 溶媒組成　　ニアセトニトリル２４％ 水　　　　７５％ デトラヒドロフラン１％ 流速　　　　：　１１．４ｍＱ　／　ｍｉｎ温度　　　
　＝５０°Ｃ 検出波長　　：　ＵＶ２１５ｎｍ 装置　　　　：ウォーターズＭ　−６００保持時間１３
〜１５分の画分を分取し、本発明化合物の白色粉末２０
ｍｇを得た。

［理化学的性質］ （ａ）元素分析値（Ｃ１−Ｈ＋　ａ　Ｏｔ　Ｎ　＊　Ｓ
　＊として）理論値；　Ｃ４９，３２％、Ｈ４，１１％
、　Ｎ　６．３９％。

８１４．６１％ 実測値、　Ｃ４９，１２％、　Ｈ３，９９％、　Ｎ　６
．５０％。

８１４．１１％ （ｂ）分子量：４３９　　（Ｍ＋Ｈ）”（ＣＩ−マスス
ペクトルによる） （ｃ）融点：２１５〜２２０°Ｃ（分解）（ｄ）比旋光
度： ［α］： ４０ｍ （ｃ＝０．０１゜ ＤＭＳＯ） （ｅ）紫外線吸収スペクトル アセトニトリル中にて測定すると２０２ｎｍにε−７３
００。

２２０ｎｍ（ｓｈ）にＥ　−５８００の吸収極大波長を
示す。

（ｆ）’Ｈ−ＮＭＲスペクトル 重ジメチルスルホキシド中、 結果は以下のとおり。

６、８８（ＬＨ，ｄｄ、　Ｊ＝２Ｈｚ、　１０Ｈｚ＞　
。

６、０５（ＩＨ，ｄ、Ｊ４０Ｈｚ）　、　４．７３（Ｉ
Ｌｄｄ、Ｊ４．６７（ＬＨ，ｄｄ、Ｊ＝８Ｈｚ、２Ｈｚ
＞。

４、４３（ＬＨ，ｄｄ、　Ｊ＝８Ｈｚ、　５）（ｚ）　
。

３．９６（ＩＨ，ｄｄ、、Ｔ−１３Ｈｚ、８Ｈｚ）。

３、７６（ＩＨ，ｄｄｄ、　Ｊ＝１０Ｈｚ、　５Ｈｚ、
　２Ｈｚ）　。

３、３３（ＩＨ，ｄｄｄ、　Ｊ＝１３Ｈｚ、　１２Ｈｚ
、　６Ｈｚ）　。

３、１８（ＩＨ，ｄｄ、　Ｊ＝８Ｈｚ、　３Ｈｚ）　。

３、０２（ＬＨ，ｄｄｄ、　Ｊ４５Ｈｚ、　８Ｈｚ、　
２Ｈｚ＞　。

２、８６（ＩＨ，ｄｄ、　Ｊ＝１４Ｈｚ、　１２Ｈｚ）
　。

２、７９（ＩＨ，ｄｄ、　、Ｔ＝１５１（ｚ、　３Ｈｚ
＞　。

２、６９（１１（、ｄｄ、　Ｊ４７Ｈｚ、　１０Ｈｚ）
　。

２、５５（１）（、ｄｄ、　Ｊ＝１７Ｈｚ、　５Ｈｚ＞
　。

２．５１（ＩＨ，ｄｄ、Ｊ＝１４Ｈｚ、６Ｈｚ）４００
ＭＨｚで測定した ５Ｈｚ、２Ｈｚ＞。

１ （ｇ　）”ｃ　−ＮＭ　Ｒスペクトル 重ジメチルスルポキシド中、１００ＭＨｚで測定した結
果は以下のとおり。

２０８．３（ｓ）　　１９４．９（ｓ）　　１６４．０
（ｓ）　　１６２．３（ｓ）１５１．２（ｄ）　　１２
８．６（ｄ）　　７６．１（ｓ）　　７５．３（ｓ）７
０．５（ｄ）　　　　　６８．２（ｄ）　　　　　６５
．９（ｄ）　　　　　６５．７（ｄ）６３．７（ｄ）　
　４８．１（ｄ）　　４６．３（ｄ）　　４３．６（ｔ
）３２．４（ｔ）　　２９．７（ｔ） （ｈ）溶剤に対する溶解性 不溶：　水 可溶ニジメチルスルホキシド （ｉ）呈色反応 陰性：ニンヒドリン、第２塩化鉄反応 陽性：ヨード反応、四酢酸鉛 （ｊ）塩基性、酸性、中性の区別：中性（ｋ）物質の色
と形状二白色粉末 ２ （試験例）　血小板凝集抑制作用 （１）血小板の調製法 体重２．０〜２．５ｋｇの雄家兎の総頚動脈より採血し
、血液量の１０分の１容の３．８％クエン酸ナトリウム
溶液を加えて軽く混和し、１３００Ｘｇで２分間遠心分
離した上清を多血小板血漿（以下、ｒＰＲＰ」という）
とした。沈渣を更に１６００Ｘｇで１０分間遠心分離し
て得られた上清を乏血小板血漿（以下、’Ｐ　Ｐ　ＰＪ
という）とした。

（２）凝集惹起剤の調製法 あらかじめアラキドン酸（シグマ社製）はエタノールで
、アデノシンニリン酸又はコラーゲン（京都第一化学社
製、アグリバック）は生理食塩水で所要濃度に希釈し、
前記成分を個別に含む凝集惹起剤を調製した。

（３）血小板凝集阻害活性測定法 ２００所のＰＲＰを採り、ＰＰＰとの吸光度の差を一定
にした後、ジメチルスルホキシドにて所要濃度に調製し
た本発明化合物をＰＲＰに加え、撹拌した。

対照はジメチルスルホキシドのみを使用した。

次いで、上記凝集惹起剤（最終濃度：アラキドン酸の場
合０．１ｍＭ、アデノシンニリン酸の場合１０μＭ、コ
ラーゲンの場合１０ｑ／＋ｍＪ！　）を添加し、吸光度
の変化を二元バイオサイエンス社プレイドレット　アグ
リゲーション　トレーサー　４Ａ型血小板凝集計を用い
、ポーン等の比濁法［Ｂｏｒｎ、　Ｊ、　Ｐｈｙｓｉｏ
ｌ、、第１６８巻第１７８ページ（１９６８年）］によ
り測定し、本発明化合物の５０％血小板凝集阻害濃度（
ＩＣ，。値）を求めた。

その結果を第２表に示した。

第　　２　　表

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で表されるジチオジケトピペラジン化合物。