JPH04506458A - Ｃｄ３特異的組換え抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ２３、形質転換する宿主細胞中で、請求項２０に記載のＤＮＡ配列を発現するこ とよりなる、抗ＣＤ３ＣＤＲグラフト抗体生産物の製造方法。

２４、請求項６に記載の抗体Ｈ鎖をコードするＤＮＡ配列を有するオペロンを発 現ベクター中に作り、そして／または （ｂ）請求項１１または請求項１３に記載の相補的抗体り鎖をコードするＤＮＡ 配列を有するオペロンを発現ベクター中に作り、 （Ｃ）その、または各ベクターを宿主細胞にトラ（ｄ）トランスフェクトした細 胞系を培養して、ＣＤＲグラフト抗体生産物を製造する、ことよりなる、抗ＣＤ ３ＣＤＲグラフト抗体生産物の製造方法。

２５、請求項１に記載の組換え抗体分子、請求項５に記載の人体適応性抗体、請 求項６に記載のＣＤＲグラフト抗体Ｈ鎖、請求項夏！または１３に記載のＣＤＲ グラフトし鎖、または請求項１８に記載のＣＤＲグラフト抗体分子を、薬学的に 受容し得るキャリア、希釈剤、または賦形剤と組み合せた、治療用または診断用 組成物。

２６、有効量の、請求項１に記載の組換え抗体分子、請求項５に記載の人体適応 性分子、請求項６に記載のＣＤＲグラフトＨ鎖、請求項！ｌまたは請求項１３に 記載のＣＤＲグラフトＬ鎖、または請求項１８に記載のＣＤＲグラフト抗体分子 を、ヒトまたは動物に投与することよりなる治療または診断方法。

浄書（内容に変更なし） 明　細　書 本発明は組換え抗体分子（ＲＡＭ）　、詳くは大部分のＴ細胞のＴ細胞レセプタ ー−〇Ｄ３複合体に存在する抗原に特異性を有する人体適応性（ｈｕｍａｎｉｚ ｅｄ）抗体分子（ＲＡＭ）　、組換えＤＮＡ技術に用いるその製造方法、および その治療上の利用に関する。

本出願において、“組換え抗体分子“　（ＲＡＭ）の語は、天然の免疫グロブリ ンまたはそのフラグメントのアナログを含む、組換えＤＮＡ技術の使用よりなる 方法により製造される抗体を記述するのに用いる。“人体適応性抗体分子”　（ ＲＡＭ）の語は、ヒト以外の種からの免疫グロブリンから誘導され、ヒトの免疫 グロブリンから誘導された免疫グロブリン誘導分子部分を残す、抗原結合部位を 有する分子を記述するのに用いる。抗原結合部位は、定常領域に融合された完全 な可変領域、または可変領域中の適当なフレームワーク領域にグラフトされた一 以上の相補性決定領域のいずれかを含む。略号“ＭＡｂ”はモノクローナル抗体 を示すのに用いる。

本記述において引用は文献番号により行う。文献は本、記述の最後に数字の順に 掲げである。

天然の免疫グロブリンは、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’　）’、およびＦｃフラグメント のような、種々のフラグメントを有することが知られており、それらフラグメン トは酵素的解裂により得られる。天然の免疫グロブリンは、通常Ｙ型の分子であ り、それぞれの上腕の末端方向に抗原結合部位を有する。構造の残り、および特 にＹの幹は、免疫グロブリンに伴うエフェクター機能を実現させる。

天然の免疫グロブリンは、分析、診断、およびより限定された範囲で治療に用い られる。しかしそのような使用は、特に治療においては、天然の免疫グロブリン のポリクローナルな性質により妨げられる。治療薬としての免疫グロブリンこの 可能性の実現への顕著なステップは、限定された特異性を有するモノクローナル 抗体の製造技術の発見であった。（文献工）。しかし大部分のＭＡｂは、鰯歯類 動物の牌臓細胞の、鰯歯類動物のミエローマ細胞との融合により製造される。し たがってそれらは本質的に貿歯類動物のタンパク質である。ヒトのＭＡｂの製造 については非常にわずかな報告しかない。

大部分の利用できるＭＡｂは舊歯類動物起源であるので、ヒトには本来抗原的で あり、ＨＡＭＡ　（ヒトの抗マウス抗体）応答と言われる望ましくない免疫応答 を生じさせる。それ故薔歯類ＭＡｂの人の治療薬としての使用は、人体かＭＡｂ に対する免疫的な応答をマウント（ｍｏｕｎｔ）　Ｌ、ＭＡｂを完全に除くか、 または少なくともその有効性を減する。かくて事実上、謡歯類動物起源のＭＡｂ は、ＨＡＭＡ応答かＭＡｂを非有効にし、また望ましくない反応を生じさせるの で、−以上またはユニの治療用に患者に用いられない。

ヒトのでないＭＡｂを、ヒトで抗原性を少さくする提案がそれ故なされている。

そのような技術は“人体適応化”　（ｈｕｍａｎｉｓａｔｉｏｎ）技術と一般に 呼ばれている。これ等の技術は一般に、抗体分子のポリペプチド鎖をコードした ＤＮＡ配列を操作する組み換えＤＮＡ技術の使用を含む。

ＭＡｂの人体適応化の早期における方法は、一つの抗体の完全可変領域を含む抗 原結合部位を、他の抗体から誘導された定常領域に結合するキメラの抗体を製造 することよりなる。そのようなキメラ化行程を行う方法は、ＥＰＯ第１２０６９ ４号（セルチック（株））、ＥＰＯ第１２５０２３号（ジュネンテックおよびシ ティ　オンホーブ）、ＥＰ−Ａ−０１７１４１９６号（レス　デビコーブ、日本 ）、ＥＰ−Ａ−０１７３４９４号（スタンホード大学）、および国際出願８６１ ０１５３３号（セルチック（株））に記載されている。このセルチックの出願（ 国際出願８６１０１５３３号）は、マウスＭＡｂからの可変領域とヒトの免疫グ ロブリンからの定常領域を有する抗体分子を製造する方法を開示する。そのよう な人体適応性キメラ抗体は、しかしながら未だかなりのヒトのでないアミノ酸配 列部分、すなわち完全罪人可変領域を有し、いくらかのＨＡＭＡ応答、特に長期 間投与されると、を引き出す［Ｂｅｇｅｎｔ等、Ｂｒ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ、　６ １巻、４８７ベージ（１９９０）］。

国際出願　８６１０１５３３号もマウスＭＡｂの可変領域、ヒトの免疫グロブリ ンのＣＨＩおよびＣＬＩｊ域、並びにヒトの免疫グロブリンのＦｃ部分の代りの 非免疫グロブリンからのタンパク質、よりなる抗体分子を開示する。

ＥＰ−Ａ−０２３９４００号（ウィンター）に記載された別のアブａ−チでは、 マウスＭＡｂの相補性決定領域（ＣＤＲ）を、ヒトの免疫グロブリンの可変領域 のフレームワーク領域に、長いオリゴヌクレオチドを用いる特定部位の突然変異 誘発により、グラフトする。Ｈ＃ＩおよびＬ鎖可変領域のそれぞれには３つのＣ ＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）がある。そのようなＣＤＲをグラ フトした人体適応性抗体は、人体適応性キメラ抗体より、それらの有する非ヒト アミノ酸配列部分が少いので、ＨＡＭＡ応答を生じる傾向が少い。

ＣＤＲをグラフトした人体適応性ＭＡｂについての最も早い研究は、ＮＰまたは ＮＩＰ抗原のような合成抗原を認識するＭＡｂについて行われた。しかしリゾチ ームを認識するＭＡｂ、およびヒトのＴ細胞上の抗原を認識するラットＭＡｂが ＣＤＲグラフトにより人体適応性化される例はＶｅｒｈｏｅｙｅｎ等（文献２） およびＲｉｅｃｈｍａｎｎ等（文献３）によって示されている。ヒトのＴ細胞上 の抗原に対するＣＤＲをグラフトした抗体の製造は国際出願８９１０７４５２（ メディカル　リサーチ　力ランシル）にも記載されている。

ＲｉｅＣｈｍａｎｆｌｌ等によって、ＣＤＲ領域（Ｋａｂａｔにより定義、文献 ５および６）のみの移転（ｔｒａｎｓｆｅｒ）は、ＣＤＲグラフト化生産物の満 足すべき抗原結合活性を与えるのに十分でないことが見出された。Ｒｉｅｃｈｍ ａｎｎ等は、満足すべき抗原結合活性を有するＣＤＲグラフト化生産物を得るた めには、ヒトの配列の位置２７のセリン残基を、対応するラットのフェニルアラ ニン残基に移す必要があることを見出した。Ｈ鎖の位置２７のこの残基はＣＤＲ １に隣接する構造的ループの内にある。さらにＨ鎖の３０位置で、ヒトのセリン をラットのチロシンに変えた構造物は２７位置でのみセリンをフェニルアラニン に変えた人体適応化抗体に比べ顕著な改良された結合活性を有しなかった。これ らの結果は、ＣＤＲ領域外での、特にＣＤＲ１に隣接するループでの、ヒトの配 列の残基への変化は、より複雑な抗原を認識するＣＤＲグラフト抗体の有効な抗 原結合活性を得るために必要であることを示す。それにしても得られた最良のＣ ＤＲグラフト抗体の結合アフィニティは未だもとのＭＡｂより相当低い。

ごく最近Ｑｕｅｅｎ等（文献６）はネズミ科動物のＭＡｂ（抗Ｔａｃ）のＣＤＲ をヒトの免疫グロブリンのフレームワークおよび定常領域と結合させることによ り、インターロイキン２レセプターに結合する人体適応性抗体の製造を記述して いる。ヒトのフレームワーク領域は抗Ｔａｃ　ＭＡｂ配列との相同を最大限にす るために選択された。さらにコンピュータモデリングを用い、ＣＤＲまたは抗原 と相互作用しやすいフレームワークアミノ酸残基を同定し、マウスアミノ酸を、 人体適応性抗体におけるこれらの位置に用いた。

国際出願９０１０７８６１号においてＱｕｅｅｎ等は人体適応性免疫グロブリン を設計するための四つの基準を提案している。最初の基準は、ヒト　アクセプタ ーとして、人体適応化される非ヒト　ドナー免疫グロブリンと異常に相同的な特 定のヒト免疫グロブリンからのフレームワークを用いるか、または多くのヒトの 抗体からの一致したフレームワークを用いることである。第二の基準は、フレー ムワークの特定の残基でのヒトの配列についてヒトのアクセプター残基が異常で あり、ドナー残基が典型的なら、アクセプターよりはむしろドナーアミノ酸を用 いることである。第三の基準はＣＤＲに直接隣接する位置ではアクセプターより はむしろドナーフレームワークアミノ酸残基を使用することである。第四の基準 は、アミノ酸が、三次元免疫グロブリンモデルにおいてＣＤＲの約３人以内に側 鎖原子を有しており、抗原または人体適応性免疫グロブリンのＣＤＲと相互作用 することかできると予言するフレームワーク位置で、ドナーアミノ酸残基を用い ることである。基準二、三、または四は、基準−に加えて、または代えて適用し 、かつ単独にまたは任意の組合せで適用することが提案されている。

国際出願９０１０７８６１号は単一のＣＤＲグラフト化人体適応性抗体、ＩＬ− ２レセプターのｐ５５Ｔａｃタンパク質に特異性を有する人体適応性抗体、の製 造を詳細に記述している。上記の四つの基準すべての組合せが、この人体適応性 抗体の設計に用いられ、ヒトの抗体ＥＮの可変領域フレームワーク（文献４およ び５）がアクセプターとして用いられている。生じた人体適応性抗体においてド ナーＣＤＲはＫａｂａｔ等（文献４および５）により定義されたとおりであり、 さらに可変領域フレームワークの、Ｈ鎖中の２７．３０．４８．６６．６７．８ ９．９１，９４．１０３．１０４．１０５、および１０７位置、並びにＬ鎖中の ４８．６０、および６３位置で、ヒトのアクセプター残基の代りにマウスドナー 残基を用いている。得られた人体適応性抗体Ｔａｃ抗体はネズミ科動物のＭＡｂ のそれの約１／３の、３ｘｌＯ’Ｍ−’の、ｐ５５に対するアフィニテイを存す ると報告されている。

０ＫＴ３はＴ細胞レセプターＣＤ３複合体における抗原を認識するマウスのＩｇ Ｇ２ａ／ｋＭＡｂであり、世界中の多くの国で急性の同種移植片（ａｌｌｏｇｒ ａｆｔ　）拒絶の治療において免疫抑制剤としての使用が認可されている（　Ｃ ｈａｔｅｎｏｕｎｄ）等（文献７）およびＪｅｆｆｅｒｓ等（文献８））。しか しこのＭＡｂのネズミ科動物の性質のため、主要な反イディオタイプ（ａｎｔｉ −ｉｄｉｏｔｙｐｅ　）成分とのかなりのＨＡＭＡ反応が使用時に生じるかも知 れない。明らかに、この作用な抗体の適当な人体適応化または一他の組み換えＤ ＮＡの操作により、この望ましくないＨＡＭＡ応答を減らし、またはなくし、そ の使用領域を拡げることが大変望ましい。また組み換えＤＮＡ技術をこの作用な 抗体に適用してＲＡＭ生産物を製造するのも望ましい。

さらに我々はＣＤＲグラフト人体適応性抗体分子の製造を研究し、残基のアミノ 酸同一性が、満足すべき結合親和性を有するＣＤＲグラフト生産物を得るのに重 要である、可変領域のフレーワーク内（すなわちＫａｂａｔのＣＤＲおよび可変 領域の構造的ループの外側）の位置のヒラルキ−（ｈｉｅｒａｒｃｈｙ　）を確 認した。このことは、ドナーの免疫グロブリンとアクセプターのフレムワーク間 の相同性レベルに関係なく広く応用される、満足すべきＣＤＲグラフト生産物を 得るための基準を確立することを可能にした。重要であると確認した残基の組は Ｑｕｅｅｎ等（文献６）により確認された残基と一致しない。

発明の要旨 したがって本発明は、ドナーの抗ＣＤ３抗体のＨおよび／またはＬ鎖可変領域か ら誘導された抗原結合領域を含み、抗ＣＤ３結合特異性を有し、好ましくは０Ｋ Ｔ３に似た抗ＣＤ３結合親和性を有する、ＲＡＭを提供する。

典型的にはドナーの抗ＣＤ３抗体は薩歯類動物のＭＡｂである。

本発明のＲＡＭは、適当な抗ＣＤ３抗体、典型的には舊歯類動物の抗ＣＤ３　Ｍ Ａｂ、例えばマウスまたはラットの抗ＣＤ３　ＭＡｂからの抗原結合部位を含む 。そのＲＡＭはそのようなＭＡｂのアミノ酸配列の全体または主要部分の組換え 領域を含む。またそのＲＡＭはそのようなＭＡｂの可変領域（ＶＨおよび／また はＶＬ）のみ、または−以上のＣＤＲを含む。特にそのＲＡＭは、後に図１およ び２で具体的に記述する特異的な抗ＣＤ３ＭＡｂ　（ＯＫＴ３）から導かれる、 可変領域、ＣＤＲまたは他の、アミノ酸配列を含む。

好ましくは本発明のＲＡＭは、ＣＤ３に対する特異性を有し、可変領域の少くと も一つの相補性決定領域（ＣＤＲ）　、通常少くとも二つの好ましくはすべての ＣＤＲが、非人抗ＣＤ３抗体、例えば蓄歯類動物の抗ＣＤ３　ＭＡｂ、から導か れる抗原結合部位を有する、人体適応性抗体分子（ＲＡＭ）である。

そのＲＡＭはキメラ抗体またはＣＤＲをグラフトした抗体である。

したがって好ましい態様では、本発明は、フレームワークが６．２３および／ま たは２４．４８および／または４９．７１および／または７３．７５および／ま たは７６および／または７８および／または８８および／または９１の位置の少 くとも−でドナー残基を含む、アクセプターのフレームワークおよびドナーのＣ Ｄ３結合領域よりなる可変領域を育する、抗ＣＤ３のＣＤＲグラフト抗体Ｈ鎖を 提供する。

より好ましくは、好ましい態様のＨ鎖フレームワークは、２３．２４．４９．７ １．７３および７８の位置で、または２３．２４、および４９の位置でドナー残 基を含む。Ｈ＃Ｉフレームワークの７１．７３、および７８位置での残基は、好 ましくは、すべてアクセプター残基であるかすべてドナー残基である。

特に好ましい態様では、Ｈ鎖のフレームワークは、６．３７．４８、および９４ 位置の−、い（つか、またはすべてでドナー残基を、さらに含む。また、種をこ えて一般的に保存されるＨ鎖のフレームワークの位置、すなわち２．４．２５． ３６．４７．９３．１０３．１０４．１０Ｂ、および＋０７で、ドナーとアクセ プターの間で保存されないなら、残基がさらにドナー残基よりなることが特に望 ましい。最も好ましくはＨ鎖フレームワークは、２．４．６．２５．３６．３７ ．３９．４７．４８．９３．９４．１０３．１０４．１０６および１０７の位置 で、さらにドナー残基を含む。

さらにＨ鎖フレームワークは任意的に、ｌおよび３． ７２および７６． ６９（４８かドナーとアクセプターの間で異っているなら）、 ３８および４６（４８がドナー残基なら）、８０および２０（６９がドナー残基 なら）、６７． ８２および１８（６７がドナー残基なら）、Ｌ ８８、および ９１．１１，４１，８７．１０８．１１０および１１２の任意の一以上、の一つ 、いくつか、またはすべての位置でドナー残基を含む。

前記および後記の本発明の好ましい態様において、アクセプターフレームワーク およびドナー抗原結合領域よりなるＣＤＲグラフト抗体生産物に言及する。本発 明は一般に抗ＣＤ３抗体のＣＤＲグラフトに広く応用できることが理解されるで あろう。かくてドナーおよびアクセプター抗体は、同じ種の動物、および同じ抗 体クラス（ｃｌａｓｓ）またはサブクラスから誘導される、抗ＣＤ３抗体であっ てもよい。しかしより普通には、ドナー及びアクセプター抗体は異なる種の動物 から導かれる。典型的にはドナー抗ＣＤ３抗体は蓄線動物ＭＡｂのような罪人の 抗体であり、アクセプター抗体はヒトの抗体である。

本発明のＣＤＲをグラフトした抗体生産物において、ドナ−ＣＤ３結合領域は典 型的にはドナー抗体からの少くとも一つのＣＤＲを含む。通常ドナー抗体結合領 域は、Ｈ鎖およびＬ鎖可変領域それぞれの、少くとも二つの、そして好ましくは 三つすべてのＣＤＲを含む。ＣＤＲは、ＫａｂａｔのＣＤＲ，構造的なループＣ ＤＲ，またはＫａｂａｔおよび構造的ループＣＤＲの複合体、およびこれら三つ の任意の結合よりなる。好ましくはＣＤＲグラフトＨ鎖領域の抗原結合領域は、 ＣＤＲ２（残基５０〜６５）およびＣＤＲ３（残基９５〜１ＯＯ）でＫａｂａｔ のＣＤＲに対応し、ＣＤＲＩ（残基２Ｂ〜３５）てｋａｂａｔおよび構造的ルー プＣＤＲの複合体に対応するＣＤＲよりなる。

本出願において、上にまたは他の場所で与えられる残基の指定はｋａｂａｔのナ ンバリングに従って番号付けをする（文献４および５）。かくて残基の指定はア ミノ酸残基のリニアーな番号付けとは必ずしも直接対応しない。

実際のりニア−なアミノ酸配列は、基本的な可変領域構造の構造要素、フレーム ワークかＣＤＲ，のの短縮または挿入に対応する、厳格なＫａｂａｔの番号付け より、少いまたは付加されたアミノ酸を有する。例えばＱｕｅｅｎ等（文献６） に記載された抗Ｔａｃ抗体のＨ鎖可変領域は、ｋａｂａｔの番号付けにおいてＣ ＤＲ２の残基５２の後に一個のアミノ酸挿入（残基５２ａ）およびフレームワー ク残基８２の後に３つのアミノ酸挿入（残基８２ａ、８２ｂおよび８２ｃ）を含 む。残基の正しいＫａｂａｔの番号付けは、“標準”のＫａｂａｔ番号付は配列 により、抗体の配列の相同領域でのアラインメント（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）によ り、与えられた抗体に対し決定する。

本発明はまた好ましい態様において、フレームワークがｌおよび／または３およ び４６および／または４７位置の少くとも−でドナー残基を含むような、アクセ プターフレームワークおよびドナ−ＣＤ３結合領域よりなる可変領域を有するＣ ＤＲグラフト抗体り鎖を提供する。

好ましくは、この好ましい態様のＣＤＲグラフトＬ鎖は４６および／または４７ 位置でドナー残基を含む。

本発明はまたさらに好ましい態様において、フレームワークが４６．４８．５８ および７１位置の少くとも−でドナー残基を含むような、アクセプターのフレー ムワークおよびドナーのＣＤ３結合領域よりなる可変領域を有するＣＤＲグラフ ト抗体り鎖を提供する。

この後の態様において、より好ましくはフレームワークは、４６．４８．５８お よび７１位置のすべてにおいてドナー残基を含む。

上の好ましい態様の特に好ましい態様において、Ｌ鎖のフレームワークはさらに 、３６．４４．４７．８５、および８７位置でドナー残基を含む。同様に、一般 的に種をこえて保存されるし鎖フレームワークの位置、すなわち２．４．６．３ ５．４９．６２．６４〜６９．９８．９９．１０１および１０２は、ドナーとア クセプターの間で保存されないなら、さらにドナー残基よりなる。最も好ましく はＬ鎖のフレームワークは２．４．６．３５．３６．３８．４４．４７．４９． ６２．６４〜６９．８５．８７．９８．９９．１０１および１０２位置でドナー 残基を含む。

さらに上の好ましい態様のし鎖フレームワークは任意的に、 ｌおよび３． ６３、 ６０（６０と５４が塩橋（ｓａｌｔｂｒｉｄｇｅ）作る可能性あるなら）、 ７０（７０と２４が塩橋を作る可能性があるなら）、７３および２１（４１がド ナーとアクセプター間で異るなら）、 ３７および４５（４７がドナーとアクセプター間で異るなら）、 およびｌ０１１２．４０，８０．１０３、および１０５のうち任意の一以上、 の位置の−、いくつか、又はすべてでドナー残基を含む。

好ましくは、ＣＤＲグラフトＬ鎖可変領域の抗原結合領域は、ＣＤＲＩ（残基２ ４〜３４）、ＣＤＲ２（残基５０〜５６）およびＣＤＲ３（残基８９〜９７）で ＫａｂａｔのＣＤ　Ｒｊ：対応するＣＤＲを含む。

本発明はさらに第４の側面で、少くとも一つのＣＤＲグラフトＨ鎖および上に定 義した少くとも一つのＣＤＲグラフトし鎖を含むＣＤＲグラフト抗体分子を提供 する。

本発明のＣＤＲをグラフトし、人体適応性にした抗体分子および鎖は次のものを 含む。フルレングス（ｆｕｌｌｌｅｎｇｔｈ）のＨ鎖およびＬ鎖を有する完全な 抗体分子、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’　）ｚまたはＦＶフラグメントのような抗体分子 のフラグメント、Ｌ鎖またはＨ４ｌのモノマーまたはダイマー、または単鎖の抗 体、例えば、Ｈ鎖およびＬｍ可変領域がペプチドリンカ−によって結ばれている 単鎖のＦＶ、または抗ＣＤ３結合特異性を有する任意の他のＣＤＲグラフトまた は人体適応性抗体生産物。同様にＣＤＲグラフトＨおよびＬ鎖可変領域は、他の 抗体領域と適当に結合してもよい。

また本発明のＣＤＲグラフトまたは人体適応性のＨ原着しくはＬ鎖または抗体分 子は、エフェクターまたはリポータ−分子ｉそれらに付けてもよい。例えばそれ は、共有結合架橋構造によりそれに付いた、重金属原子をキレートするための大 環、またはりシンのような毒素を有してもよい。あるいは組換えＤＮＡ技術の方 法を用いて、完全な免疫グロブリン分子のＦｃフラグメントまたはＣＨ３領域を 、酵素または毒素分子のような機能性の免疫グロブリンでないタンパク質に置き 換え、あるいはペプチド結合によりそれに付ける、免疫グロブリン分子を作って もよい。

ＣＤＲグラフト抗体生産物の場合、抗体結合領域が導かれるドナー抗体のクラス ／タイプに関係を有する、任意の適当なアクセプター可変領域フレームワーク配 列を用いてもよい。好ましくは用いるアクセプターフレームワークのタイプは、 ドナー抗体と同じ／類似のクラス／タイプである。好都合にはそのフレームワー クは、特にＣＤＲ近くまたは隣接する位置で、ドナー抗体配列との相同性を最大 ／最適にするよう選択する。しかしドナーおよびアクセプター配列間の高レベル の相同は本発明の応用に重要ではない。本発明は、満足すべき結合の性質を得る ために、ドナー残基が重要あるいは望ましいフレームワーク残基の位置のヒラル キー（ｈｉｅｒａｒｃｈｙ）を確認する。本発明は、対応するドナー抗体生産物 、例えば０ＫＴ３生産物に類似の、ある場合にはより良い結合親和性を有するＣ ＤＲグラフト抗体生産物の製造を、作詞に可能にする。好ましくは本発明のＣＤ Ｒグラフト抗体生産物は、少くとも約１０’Ｍ−’、好ましくは少くとも１０　 ”　Ｍ−’オヨヒ特４．：１０’　−１０”Ｍ−’（７）範囲内の結合親和性を 有する。原理的には本発明は、ドナーおよびアクセプター抗体の任意の組合せに 、それらの配列の相同レベルにかかわらず適用できる。任意の特定のドナー−ア クセプター抗体の対に本発明を適用する基準は後で与える。用いられるヒトのフ レームワークの例はＫＯＬ。

ＮＥＷＭＳＲＥ　１．ＥＶＳＬＡＹおよびＰＯＭ（文献４および５）であり、例 えばＫＯＬとＮＥＷＭはＨ鎖に、ＲＥＩはＬ鎖に、ＥＶ、ＬＡＹおよびＰＯＭは Ｈ鎖オヨびＬ鎖の両方に用いる。

本発明の生産物の定常領域も抗体の提案された機能、特に必要とされるエフェク ター機能に関係して、選択する。例えば定常領域は、ヒトのＩｇＡ、ＩｇＥ、Ｉ ｇＧまたはＩｇＭ領域であってもよい。人体適応性分子が治療用途を意図し、抗 体エフェクター機能が必要とされる場合、とくにＩｇＧヒトの定常領域、とくに ＩｇＧ１および１ｇＧ３アイソタイプ、を用いてもよい。あるいは人体適応性抗 体分子か治療目的を意図し、抗体エフェクター機能が必要とされない場合、例え ばＴ細胞レセプターＣＤ３複合体の単なるブロッキングでは、１ｇＧ２および１ ｇＧ４アイソタイプを用いてもよい。

しかし抗体分子の残りは免疫グロブリンからのタンパク質配列のみを含む必要は ない。例えばヒトの免疫グロブリンの部分をコードするＤＮＡ配列を、ペプチド エフェクターまたはリポータ−分子のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列に融 合する遺伝子を構築してもよい。

好ましくはＣＤＲクラフトしたＨおよびＬ鎖並びに抗体分子生産物は組み換えＤ ＮＡ技術により製造する。

かくてさらなる側面において本発明は、ＲＡＭ。

ＲＡＭおよびＣＤＲグラフトＨ鎖およびＬＭ用のＤＮＡ配列のコード化、クロー ニングおよびＤＮＡ配列を含む発現ベクター、そのＤＮＡ配列で形質転換する宿 主細胞、形質転換された宿主細胞中でＤＮＡ配列を発現させることよりなるＣＤ Ｒグラフト抗体分子の製造方法、をも含む。

ベクターを組み立てる一般的な方法、トランスフェクション法および培養法はそ れ自体よく知られており、本発明の部分を形成しない。そのような方法は例えば 文献９およびｌＯに示されている。

抗ＣＤ３ドナーアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列は当該技術分野でよく知ら れた方法により得られる。例えば抗ＣＤ３のコーディング配列はゲノムクローニ ング、または適切なハイブリドーマ細胞系からのｃＤＮＡクローニングにより得 られる。例として０ＫＴ３細胞系を以後具体的に記載する。ポジティブなりロー ンは問題となっているＨおよびＬ鎖の遺伝子用の適当なプローブを用いてスクリ ーニングする。ＰＣＲクローニングも用いてよい。

７クセブター、例えばヒトのアクセプター配列のＤＮＡコーディングは任意の適 当な方法で得られる。例えばＫＯＬ、ＲＥＩ、ＥＶおよびＮＥＷＭのような好ま しいヒトのアクセプターフレームワーク用のＤＮＡ配列コーディングは当該技術 分野で研究者に広く利用されている。

分子生物学の標準的な方法を用いて、キメラおよびＣＤＲ生産物のＤＮＡ配列コ ーディングを作る。望ましいＤＮＡ配列はオリゴヌクレオチド合成技術を用いて 、完全にまたは部分的に合成する。特定部位の突然変異誘発およびポリメラーゼ 鎖反応（ＰＣＲ）技術も適宜用いてよい。例えばＪｏｎｅｓ等（文献１７）によ り記載されているオリゴヌクレオチドを指向する合成を用いてもよい。

また例えばＶｅｒｈｏｅｙｅｎ等（文献２）またはＲｉｅｃｈｍａｎｎ等（文献 ３）により記載されている先夜する可変領域の、オリゴヌクレオチドの突然変異 誘発を用いてもよい。まＤＮＡポリメラーゼを用いるギャップのあるオリゴヌク レオチドの酵素的充填を用いてもよい。

任意の適当な宿主細胞／ベクター系を、ＣＤＲグラフトＨおよびＬ鎖のＤＮＡ配 列コーディングの発現に用いる。細菌、例えばＥ、Ｃｏ１１．および他の微生物 系を、特に、ＦＡｂおよび（Ｆａｂ’　）ｘフラグメントのような抗体フラグメ ント、および特にＦＶフラグメントおよび単鎖抗体フラグメント、例えば単鎖Ｆ Ｖの発現に用いる。真核生物、例えば哺乳類の宿主細胞発現系を、特に完全な抗 体分子を含む、大きいＣＤＲグラフト抗体生産物の製造に用いてもよい。適当な 宿主細胞にはＣＨＯ細胞、およびミエローマまたはハイブリドーマ細胞系がある 。

かくて更なる側面によれば本発明は、次の工程よりなる抗ＣＤ３　ＲＡＭを製造 する方法を提供する。

（ａ）可変領域の少くとも一つのＣＤＲがドナー抗ＣＤ３抗体より導かれ、抗体 鎖の残りの免疫グロブリン誘導部分がアクセプター免疫グロブリンから誘導され る抗体ＨＭをコードするＤＮＡ配列を有するオペロンを、発現ベクター中に作り 、 そして／または （ｂ）可変領域の少くとも一つのＣＤＲがドナー抗ＣＤ３抗体から導かれ、抗体 鎖の残りの免疫グロブリン誘導部分がアクセプター免疫グロブリンから導かれる 相補性抗体り鎖をコードするＤＮＡ配列を育するオペロンを発現ベクター中に作 り、 （Ｃ）その、またはそれぞれのベクターで宿主細胞をトラ（ｄ）トランフエクト とした細胞系を培養してＲＡＭを作そのＲＡＭは、ＨおよびＬ鎖誘導ポリペフチ ドのみを含んでおり、その場合、Ｈ鎖またはＬ鎖ポリペプチドをコードする配列 のみを宿主細胞をトランフェクトするのに用いる。

ＨおよびＬの両鎖を含むＲＡＭを製造するため、細胞系は２つのベクターでトラ ンスフェクトする。最初のベクターはＬＭを誘導するペプチドをコードするオペ ロンを存し、２番目のベクターはＨｌＩを誘導するポリペプチドをコードするオ ペロンを有する。それぞれのポリペプチド鎖が同じく発現することをできるだけ 保証するよう、好ましくはベクターは、コードする配列および選択できるマーカ に関する点を除いて、同一である。または単一のベクターを用い、そのベクター は、ＬＭおよびＨｌＩの両方を誘導するポリペプチドをコードする配列を含む。

ＬおよびＨ鎖をコードする配列中のＤＮＡにはｃ　Ｄ　Ｎ　ＡもしくはゲノムＤ ＮＡ、または両者が含まれる。

しかしＨまたはＬ鎖をコードしたＤＮＡ配列は、少くとも部分的に、ゲノムＤＮ Ａを含むことが好ましい。最も好ましくはＨｌまたはＬ鎖をコードした配列は、 ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡの融合である。

本発明はまた、本発明のＲＡＭ、ＲＡＭ、およびＣＤＲグラフトしおよびＨｌお よび分子を含む、治療用および診断用組成物、並びに治療および診断でのそのよ うな組成物の使用を含む。

゛　したがって更なる側面において本発明は、本発明の前に示したＲＡＭ、ＲＡ Ｍ、またはＣＤＲグラフト抗体Ｈ苦しくＬ原著しくは分子を薬学的に受容しつる キャリア、希釈剤または賦形剤と共に含む、治療用または診断用組成物を提供す る。

したがって本発明はまた、本発明の前記側面に従った、ＲＡＭＳＲＡＭ、または ＣＤＲグラフト抗体Ｈ鎖苦しくＬ原著しくは分子の有効量を、人間または動物に 投与することよりなる治療または診断方法を提供する。

本発明のＲＡＭ、ＲＡＭおよびＣＤＲグラフト生産物は、抗ＣＤ３抗体、例えば ０ＫＴ３が使用されており、あるいは将来使用される、任意の治療用途に使用す る。

例えばその生産物は免疫抑制剤として、例えば急性同種移植片拒絶において使用 する。

本発明に従ったＣＤＲグラフト抗体ＨおよびＬ鎖を得る好ましい規準を我々がこ の基準を導いた理由づけと共に下に示す。この規準と理由づけは、以下に記載し 定義するように、本発明の一般性に対する偏見なしに与えらドナー抗体のＨおよ びＬ鎖可変領域のＤＮＡコーディングを配列することが、それらのアミノ酸配列 を決めるために先ず必要である。公知のアミノ酸配列の適当なアクセプターＨお よびＬ鎖可変領域を選ぶことも必要である。ＣＤＲグラフト鎖は次にアクセプタ ー配列をベースにして設計する。いくつかの場合にはドナーおよびアクセプター 残基は、特定の位置で同一であり、アクセプターのフレームワーク残基の変化は 必要でないことが理解されるであろう。

！、最初にドナー残基をＣＤＲ中のアクセプター残基の代りに用いる。このため ＣＤＲは好ましくは次のように定義する。

Ｈ鎖−ＣＤＲＩ：残基２６〜３５ −ＣＤＲ２：残基５０〜６５ −ＣＤＲ３：残基９５〜１０２ Ｌ鎖−ＣＤＲＩ：残基２４〜３４ −ＣＤＲ２：残基５０〜５６ −ＣＤＲ３：残基８９〜９７ ドナー残基をフレームワーク中でアクセプターの代りに用いる位置を次のように 、先ずＨ鎖に関し、続いてＬ鎖に関し選ぶ。

２、　Ｈ鎖 ２．１．Ｈ鎖の２３．２４．４９．７１，７３および７８位置のすへて、または ２３．２４．４９位置のすべて（７Ｌ７３および７８はすべてドナーであるかま たはすべてアクセプターである）でドナー残基を選択する。

２．２１次のものはトナーおよびアクセプター配列の中で同じアミノ酸であるこ とをチェックする。そしてもし好ましくないなら次のドナーを選択する：　２． ４．６．２５．３６．３７．３９．４７．４８．９３、９４、１０３、１０４． １０６および１０７ ２．３．親和性をさらに最適にするために、次のうちの一つ、いくつか、または 任意でドナー残基を選択することを考慮する： ｉｉｉ　４８がドナーおよびアクセプター配列で。

異っているなら、６９を考慮する。

ｉｖ　４８てドナー残基を選ぶなら、３８および４６を考慮する。

ｖ　６９でドナー残基を選ぶなら、８０そして次に２０を考慮する。

ｖｉ　６７ ｖｉｉ　６７でドナーを選ぶなら、８２そして次に１８を考慮する。

１ｉｉ９１ ｉｘ　８８ Ｘ　９．１１，４１．８７．１０８．１１０．３．１．４６．４８．５８および ７Ｉでドナーを選択する。

３．２．　次のものかドナーおよびアクセプター配列で同じアミノ酸であること をチェックする。もし好ましくないなら次のドナーを選択する：２．４．６．３ ５．３８．４４．４７．４９．６２．６４〜６９（包括的）、８５．８７．９８ ．９９．１０１および１０２ ３．３．　親和性をさらに最適にするために、次のうちの一つ、いくつか、また は任意でドナー残基を選択することを考慮する ｉｉｉ　６０、もし６０と５４が塩橋を生成する可能性あるなら、 ｉｖ　７０、もし７０と２４が塩橋を生成する可能性あるなら、 ｖ　７３および２１、もし４７がドナーとアクセプターで異るなら、 ｖｉ　３７および４５、もし４７がドナーとアクセプターで異るなら、 ｖｉ　１０，１２．４０．８０，１０３．１゜５゜ 根拠 ある抗体の結合サイトを別のアクセプターのフレームワークに移すためには、多 くの要素を考慮する必要がある。

ＣＤＲ（相補性決定領域）は抗体可変領域の異った区域の変化性の分析に基き、 ＷｕおよびＫａｂａｔ　（文献４および５）により定義された。ドメイン当り３ つの区域が認識された。Ｌ鎖ではその配列は、２４〜３４．５０〜５６．８９〜 ９７　（Ｋａｂａｔによる数字づけ（文献４）、ＥＵインデックス）包括的であ り、Ｈ鎖ではその配列は３１〜３５．５０〜６５、および９５〜１０２包括的で ある。

抗体構造が利用できるようになった時、これらのＣＤＲ領域は、ＬおよびＨ可変 領域のβバレル（ｂａｒｒｅｌ）フレームワークから伸びるループ領域に主とし て対応することが明らかとなった。Ｈｌの場合、そのループは２６〜３２包括的 であり、Ｈ２の場合にはそのループは５２〜５６、Ｌ２の場合には５０〜５３と いう不一致があった。しかしＨｌを除いてはＣＤＲＩｉ域はループ領域を取り囲 み、βストランドフレームワークに伸びる。Ｈｌではたいていの場合、残基２６ はセリン、２７はフェニルアラニンまたはチロシン、２９はフェニルアラニンで ある傾向かある。溶媒にさらされる表面残基である残基２８および３０は抗原結 合に含まれる。それ故ＨＩＣＤＨの慎重な定義は、ループ領域と超可変成基３３ 〜３５を含むように、残基２６〜３５を含む。

ＣＤＲ−Ｈｌに残基３１から３５選択を用いた、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ等（文献３ ）の例を注意することは重要である。有効な抗原結合を作るために、残基２７も ドナー（ラット）抗体から補充する必要がある。

２．抗原結合に寄与する、ＣＤＲでない残基利用できるＸ線構造を調べることに より、正味の抗原結合に影響を及ぼし、実験により示すことができる、多くの残 基を確認した。これ等の残基は多くのグループに細分できる。２．１．ＣＤＲ近 傍の表面残基（すべての数字づけはＫａｂａｔ等（文献４）のとおり）２．１． ＩＨ鎖 キイとなる残基は２３．７１．および７３である。より少い程度で寄与する他の 残基はｌ、３、および７６である。通常２５は保存するが、差があればネズミ科 動物の残基を用いるべきである。

２．１．２．　ＬＭ ＣＤＨに近い多くの残基、例えば６３．６５．６７および６９を保存する。もし 保存すると、Ｌ鎖中の表面残基は大きい影響を与えない傾向がある。しかしこの 位置のネズミ科動物残基が異常であるなら、ありそうな寄与をより厳密に分析す るのは役に立つであろう。結合に寄与する他の残基は、Ｉおよび３、もし６０お よび７０位置、並びに５４および２４位置の残基がそれぞれ塩橋すなわち６４＋ ５４．７０＋２４を形成することが潜在的に可能なら、６０および７０である。

２．２．ＣＤＲ近傍の包み込み（ｐａｃｋｉｎｇ　）残基２．２．１．Ｈａ キイとなる残基は２４．４９および７８である。他のキイ残基は、トリプトファ ンでなければ３６、アルギニンでなければ９４、グリシンてなければ１０４およ び１０６、スレオニンでなければ１０７である。Ｈ鎖の安定な包み込みにさらに 寄与し、親和性を改良する残基は２．４．６．３８．４６．６７および６９であ る。６７はＣＤＲ残基６３に対して包み込み、この対はマウスであっても、ヒト であってもよい。この領域でしかしより長距離から包み込みに寄与する残基は１ ８．２０．８０．８２および８Ｇである。８２は６７に対し包み込み、そして順 に１８は８２に対して包み込む。８０は６９に対して包み込み、そして順に２０ は８０に対して包み込む。

８６は３８および４６とＨ結合ネットワークを形成する。

マウス−ヒトの差の多くは小さい、例えばＬｅｕ−１１ｅ、ＬかしＣＤＲの新し い位置づけに転換する正しい包み込みに小さい影響を及ぼす。

２．２．２．Ｌ鎖 キイとなる残基は４８．５８および７１である、他のキイ残基は、グルタミンで なければ６であり、トリプトファンでなければ３５であり、フェニルアラニンま たはトリプシンでなければ６２であり、グリシンでなければ６４．６６．６８． ９９および１０１であり、スレオニンでなければ１０２である。さらに寄与する 残基は２．４．３７．４５および４７である。最後に残基７３および２１並びに １９は、重要でない性質につき長距離包み込み寄与をする。

２３、ＨおよびＬ錫量の可変領域接触面での残基しおよびＨａの両方においてＣ ＤＲでない接触面残基の大部分は保存される。もし保存される残基を異った性質 、例えば大きさまたは電荷、の残基により置き換えるなら、ネズミ科動物残基と しての保存用に考慮すべきである。

２．３．１．Ｈ鎖 考慮すべき残基は、もしその残基がバリンではなく、大きい側鎖の体積を存する か、または電荷若しくは極性を有するなら、３７である。他の残基は、グルタミ ンでなければ３９、ロイシンでなければ４５、トリプトファンでなければ４７、 フェニルアラニンまたはチロシンでなければ９１、アラニンでなければ９３、お よびトリプトファンでなければ１０３である。残基８９も接触面にあるか、側鎖 が大きい効果を有する位置にはない。

２．３．２．Ｌ鎖 考慮すべき残基は、チロシンでなければ３６、グルタミンでなければ３８、プロ リンでなければ４４，４６、チロシンでなければ４９、残基８５、チロシンでな ければ残基８７、フェニルアラニンでなければ９８である。

２．４．　可変一定常領域接触面 可変および定常領域間のエルボ（ｅｌｂｏｗ　）角は、ｖＬおよびＶＨの相互位 置に影響する、定常領域に対する可変領域のキイ残基の包み込みの変化により、 影響される。

それ故定常領域と接触しそうな残基に注意する価値かある。Ｈ鎖では、可変領域 と接触する可能性のある表面残基は、マウスおよびヒトの間で保存され、それ故 可変領域接触残基はＶ−Ｃ相互作用に影響する。Ｌ鎖では、多くの定常領域接触 点で見出されるアミノ酸は変化し、■およびＣ領域はＨ鎖のように近接していな い。それ故り鎖Ｖ−Ｃ接触面に影響は小さい。

２、４．　１．　Ｈ鎖 接触残基は７．１１．４１．８７．１０８．１１０、】１２である。

２．４．２．Ｌ鎖 り鎖では接触可能性のある残基は１０，１２．４０．８０．８３．１０３および １０５である。

多くの異った抗体のＣＤＲグラフトにおける我々の実際的な実験といっしょにし た上記の分析は、上に与えた規準へと我々を導いた。

本発明を添付図面１〜１３を参照して、例としてのみ、記述する。

図面の簡単な説明 図１は０ＫＴ３　ＩＪｊｌのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。

図２は０ＫＴ３　Ｈ鎖のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。

図３は、ヒト抗体ＲＥＩのＬ可変領域のと共に、０ＫＴ３Ｌ可変領域アミノ酸配 列のアライメント（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　）を示す。

図４は、ヒト抗体ＫＯＬのＨ可変領域のと共に、０ＫＴ３　Ｈ可変領域アミノ酸 配列のアラインメントを示す。

図５は、０ＫＴ３、ＫＯＬ、および種々の対応するＣＤＲグラフトのＨ可変領域 アミノ酸配列を示す。

（ｉｉｆｆ６は０ＫＴ３、ＲＥ　Ｉ、　およびｌＩ’ｒの、ｔｔＥｔ６ｃＤＲグ ラフトのＬ可変領域アミノ酸配列を示す。

図７は種々のグラフト化０ＫＴ３抗体に対する結合分析の結果のグラフを示す。

図８は種々のグラフト化０ＫＴ３抗体に対するブロッキング分析の結果のグラフ を示す。

図９はブロッキング分析の結果の同様のグラフを示す。

図１Ｏは結合分析とブロッキング分析の結果の同様なグラフを示す。

図１１は結合分析とブロッキング分析の結果の異なる同様なグラフを示す。

図１２は０ＫＴ３ネズミ科動物規準スタンダードと比較した、ごくわずかにグラ フトした０ＫＴ３に対する競合（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ　）分析結果のグラフ を示す。

図１３は完全グラフト化０ＫＴ３抗体をネズミ科動物規準スタンダードと比較し た競合分析の同様なグラフを示す。

１、インカミング（ｉｎｃｏｍｉｎｇ）細胞抗体０ＫＴ３を作るハイブリドーマ 細胞は、オルソ（シード　ロフト　４８８２．１）により提供され、グルタミン ２５％の胎児子牛血清を補った抗生物質を含まないＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇ ｌｅｓ培地（ＤＭＥＭ）で生長させ、評価用の過生長Ｃｏｖｅｒｇｒｏｖｔｎ　 ）上清液、およびＲＮＡ抽出用の細胞を供給するために分けた。その過生長上溝 液は、２５０　μｇ／ｍｌのネズミ科動物１ｇ０２ａ／に抗体を含むことが示さ れた。その過生長上清液はネズミ科動物λＬ鎖およびＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂ、Ｉ ｇＧ３、ＩｇＡおよびＩｇＭ　Ｈ鎖に対し陰性であった。２０ｍ１を確認した。

２、分子生物学的方法 基本的な分子生物学的方法は、Ｍａｎｉａｔｉｓ等（文献９）に記載の通りであ り、いくつかの場合には微細な改変を加えた。ＤＮＡ塩基配列決定は、Ｓａｎｇ ｅｒ等（文献１１）およびアメリカンインターナショナルＰＬｃシークエンシン グハンドブックに記載の如く行った。特定部位の突然変異誘発はにｒａｎｇｅｒ 等（文献１２）およびＡｎｇｌｉａｎ　Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇＹ＠ハンド ブックに記載の通りに行った。

ＣＯ８細胞発現および代謝ラベリング研究はＷｈｉｔｔｌｅ等（文献）記載の如 く行った。

３、リサーチ　アッセイ ３．１．　アッセンブリーアッセイ アッセンブリーアッセイはトランスフェクトされたコス細胞からの上清液につい て行い、存在する無傷のＩｇＧの量を決めた。

３．１．１．　マウス０ＫＴ３遺伝子でトランスフェクトされたコス細胞 コス細胞上清液中の損われていないマウスＩｇＧのアッセンブリーアッセイは次 のホーマットによりＥＬＩＳＡであった： ９６ウエルマイクロチツタープレートをＦ（ａｂ’）ｔヤギ抗マウスＩｇＧ　Ｆ ｃでコートした。そのプレートを水中で洗い、サンプルを１時間室温で加えた。

そのプレートを洗い、Ｆ　（ａｂ’　）！ヤギ抗マウスＩｇＧＦ　（ａｂ’　） ２　（ＨＲＰＯコンジュゲート）を次に加えた。基質を加え反応させた。ＴＪＰ ＣＩＯ、マウスＩｇＧ２のミエローマ、を標準として用いた。

３．１．２．　キメラおよびＣＤＲグラフト０ＫＴ３遺伝子でトランスフェクト されたコスおよびＣＨＯ細胞ＣＯ３細胞上清液中のキメラおよびＣＤＲグラフト 抗体に対するアッセンブリィ−アッセイは次のホーマットによるＥＬＩＳＡであ った。

９６ウエルマイクロチツタープレートをＦ（ａｂ’）ｚヤギ抗ヒトＩｇＧ　Ｆｃ でコートした。そのプレートを洗い、サンプルを加え、１時間室温でインキュベ ートした。そのプレートを洗い、モノクローナルマウス抗ヒトに鎖を１時間室温 で加えた。

そのプレートを洗いＦ　（ａｂ’　）ｘヤギ抗マウスＩｇＧ　Ｆｃ　（ＨＲＰＯ コンジュゲート）を加えた。酵素基質を加えて反応させた。キメラＢ７２．３　 （１ｇＧ４）（文献１３）をスタンダードとして用いた。このアッセイでモノク ローナル抗に鎖を用いるとグラフト抗体がキメラスタンダードから読める。

３．２．　抗原結合活性アッセイ ＣＯ８細胞上清液からの材料を、ＣＤ３陽性セルへの０ＫＴ３抗原結抗原性に関 して直接法でアッセイした。

その方法は次のとうりである： ＨＵＴＴ８細胞１：）Ｔｍ胞系、ＣＤ３陽性）　１Ｆｉｌ中で保持した。ＨＵＴ ７８細胞の単層を、ポリーＬ−リシンおよびグルタルアルデヒドを用いて、９６ ウエルＥＬＩＳＡプレート上に調製した。サンプルをその単層に１時間室温で加 えた。

そのプレートをＰＢＳを用いておだやかに洗った。

Ｆ　（ａｂ’　）、ヤギ抗ヒトＩｇＧ　Ｆｃ　（ＨＲＰＣ）ｌンジュゲート）ま たはＦ（ａｂ’）ｓヤギ抗マウスＩｇＧＦｃ　（ＨＲＰＯコンジュゲート）を適 宜に人体適応化またはマウスサンプルに加えた。基質を加え反応させた。

細胞をベースにする（　ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ’）アッセイ用のネガティブコン トロールはキメラＢ７２．３であった。ポジティブコントロールは、マウスＯｒ ｔｈｏｍｕｎｅ　ＯＫ　Ｔ　３または、利用できる時にはキメラ０ＫＴ３であっ た。この細胞をベースにするアッセイは実施するのが困難であり、より感度かよ く、より実施か容易なＣＤＲグラフト○ＫＴ３用の別のアッセイを開発した。

この系ではコス細胞により作られたＣＤＲグラフト０ＫＴ３を、ＣＤ３陽性ＨＰ Ｂ−ＡＬＬ　（ヒト末梢血液急性リンパ球白血病）細胞系に結合する能力につき 、試験した。ネズミ科動物０ＫＴ３のこれらの細胞への結合を妨害する能力につ いても試験した。結合は次の方法により測定した。ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞を組織培 養から収獲した。細胞を４℃で１時間、種々の希釈度の試験抗体、ポジティブコ ントロール抗体、またネガティブコントロール抗体とともにインキュベートした 。その細胞を一度洗い、４℃で１時間Ｆ　ＩＴＣでラベルしたヤギ抗ヒトＩｇＧ （Ｆｃ−特異的、マウス吸収（ａｂｓｏｒｂｅｄ）　）と共にインキュベートし た。その細胞を２度洗い、サイトフルオログラフィで分析した。キメラ０ＫＴ３ を直接結合用ポジティブコントロールとして用いた。細胞をモック（ｍｏｃｋ） 　）ランスフエクトしたコス細胞上清液とともに次にＦ　ＩＴＣでラベルしたヤ ギ抗ヒトＩｇＧとともにインキュベートし、ネガティブコントロールを与えた。

ネズミ科動物０ＫＴ３結合を妨害するＣＤＲ−グラフト０ＫＴ３の能力を試験す るために、ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞を４°Ｃで１時間、種々の希釈の試験抗体または コントロール抗体とインキュベートした。ＦＩＴＣ０ＫＴ３の一定の飽和量を加 えた。そのサンプルを１時間４℃でインキュベートし、２度洗い、サイトフルオ ログラフィで分析した。Ｆ　ＩＴＣでラベルした０ＫＴ３をポジティブコントロ ールとして用い、最大の結合を測定した。ラベルしないネズミ科動物０ＫＴ３が ブロッキングの基準スタンダードとして役立った。ネガティブコントロールは、 モック　トランスフェクトした細胞上溝液といっしょのあるいは上清液のない、 汚れていない細胞であった。

ＣＤ３陽性細胞を結合し、ネズミ科動物０ＫＴ３の結合を妨害するＣＤＲグラフ ト０ＫＴ３Ｌ鎖の能力は、最初にキメラ０ＫＴ３Ｈ鎖との組合せで試験した。キ メラ０ＫＴ３Ｈ鎖はネズミ科動物０ＫＴ３可変領域とヒトＩｇＧ４定常領域より なる。キメラＨ鎖遺伝子は、ＣＤＲグラフト遺伝子に用いた同じ発現ベクター中 で発現する。ＣＤＲでグラフトＬ鎖発現ベクターとキメラＨ鎖発現ベクターはＣ Ｏ８細胞といっしょにトランスフェクトした。十分にキメラ化した０ＫＴ３抗体 （キメラＬ鎖およびキメラＨ鎖）は、ＣＤ３陽性細胞に結合し、ネズミ科動物０ ＫＴ３のこれらの細胞への結合を妨害することか十分可能であることを見出した 。

３．３．　比結合親和性（ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ａｆｆｉｎｉｔ ｙ）の測定 ＣＤＲグラフト抗ＣＤ３モノクローナル抗体の比結合親和性を、ＨＰＢ−ＡＬＬ ヒトＴ細胞系をＣＤ３抗原源として、公知の結合親和性のフルオレセインを結合 したネズミ科動物０ＫＴ３　（Ｆ　ｌ−０ＫＴ３）をトレーサ抗体として用い、 競合結合（文献６）により測定した。

ＦＴ−ＯＫＴ３トレーサ抗体の結合親和性を、ＦＴ−ＯＫＴａ量を増加させて、 ＨＰＢ−ＡＬＬ（５Ｘ１０Ｍと共に、５％胎児子牛血清を有するＰＢＳ中で、６ ０分４℃でインキュベートする。直接結合アッセイにより測定した。細胞を洗い 、定量的なミクロビーブスタンダード（流動細胞計測法スタンダード、リサーチ トライアングルパーク、ＮＣ）でキャリプレードしたＦ　Ａ　ＣＳ　ｃａｆｉ流 動細胞計測器（ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）で測定した。

抗体分子当りのケイ光強度（Ｆ／Ｐ比）を、所定の数のマウスＩｇＧ抗体結合サ イトを有するミクロビーブ（シンブリーセルーラビーヅ（ｓｉｍｐｌｙ　ｃｅｌ ｌｕｌａｒ　ｂｅａｄｓ）流動細胞計測法スタンダード）を用いて測定した。Ｆ ＺＰ比はＦｌ−、−０ＫＴ３で飽和したビーブのケイ光強度を、ビーヅ当りの結 合サイトの数で割ったものである。結合した、およびフリーのＦ１１０ＫＴ３の 量は、細胞あたりの平均ケイ光強度から計算し、結合／フリー比を結合した抗体 のモル数に対しプロットした。直線適合性を用いて結合の親和性を決定した（傾 斜の絶対値）。

競合結合の場合、競合抗体の増加する量をＦＩ−ＯＫＴ３のほぼ飽和量に加え、 ５ｘ　ｌ　Ｏ−’ＨＰＢ−ＡＬＬと共に、５％胎児子牛血清を有する２００μｌ のＰＢＳ中で、６０分、４℃でインキュベートした。細胞のケイ光強度を定量的 にミクロビーブスタンダードでキャリプレートしたＦＡＣ３ｃ、、流動細胞計測 器で測定した。

結合したおよびフリーのＦＩ−ＯＫＴ３の濃度を計算した。競合する抗体の親和 性を、式 ％式％） （式中　Ｋ、はネズミ科動物０ＫＴ３の親和性、Ｋ１はコンペティターＸの親和 性、［コは、結合／フリー結合がＲ／２　（Ｒは結合／フリー結合の最大）であ る競合抗体の濃度である。

４、ｃＤＥＮ　ライブラリーの作製 ４．１．　ｍＲＡＮ調製とｃＤＮＡ合成０ＫＴ３を製造する細胞を上記の如く生 長させ、１．２Ｘ１０”の細胞を収獲し、グアニジニウム／ＬｉＣ１抽出方法を 用いて“ｍＲＡＮを抽出した。ｃＤＮＡを、オリゴ−ｄＴをプライマーとし、全 長のｃＤＮＡを作り出すことにより製造した。そのｃＤＮＡをメチル化し、Ｅｃ ｏＲＩリンカ−をクローニングのために付加した。

４．２．　ライブラリー作製 ｃＤＮＡライブラリーをＥｃｏＲｒで切ったｐＳＰベクターＤＮＡに連結し、５ ′　リン酸塩基を子牛の腸のホスファターゼで除去した（Ｅ　ｃ　ｏＲＩ／ＣＩ 　Ｐ）。その連結（ｌｉｇａｔｉｏｎ）は、高形質転換効率大腸菌（Ｅ、ｃｏｌ ｉ）ＨＢ１０１に形質転換するために用いた。ｃＤＮＡライブラリーを作製した 。ＬＭ用に３６００のコロニーを選別し、Ｈ鎖用に１００００コロニーを選別し た。

５、スクリーニング ＨまたはＬ鎖プローブに陽性なＥ、ｃｏｌｉコロニーを、ＬＭｉの場合、マウス に定常領域の配列に相補的である５°ＴＣＣＡＧＡＴＧＴＴＡＡＣＴＧＣＴＣＡ Ｃ，Ｈ鎖の場合、マウスＩｇＧ２ａ定常ＣＨＩ領域の配列に相補的な５’　ＣＡ ＧＧＧＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＧＧＡＴＡＧＡＣ、オリゴヌクレオチドを用いて、 オリゴヌクレオチドスクリーニングにより確認した。１２のＬ鎖と９のＨＭクロ ーンを確認し、第二ラウンドスクリーニング用に採取した。スクリーニングの第 二ラウンドからの陽性クローンを生長させ、ＤＮＡを作った。遺伝子挿入物の大 きさはゲルで電気泳動で見積り、フルレングスのｃＤＮＡを含むことのできる大 きさの挿入物を、ＤＮＡ塩基配列決定用にＭ１３にサブクローン（ｓｕｂｃｌｏ ｎｅ）　シた。

６、ＤＮＡ塩基配列決定 ＨおよびＬＭ用の４つのサイズクラス（ｓｉｚｅ　ｃｌａｓｓ）を代表するクロ ーンをＭ１３で得た。全長のｃＤＮＡの５′非翻訳領域、シグナル配列、可変領 域、および３゛非翻訳領域についてＤＮＡ配列［図１　（ａ）および２（ａ）］ を得て、対応するアミノ酸配列を予言した［図１　（ｂ）および２　（ｂ）　］ 。１図１ａ）において非翻訳ＤＮＡ領域は大文字で示し、図１および２において シグナル配列はアンダーラインしである。

７、　ｃＤＮＡ発現ベクターの構築 セルチック発現ベクターはプラスミド ｐＥＥ６ｈＣＭＶ（文献１４）ベースにしている。発現されるへき遺伝子の挿入 用のポリリンカーは、ヒトのサイトメガロウィルス（ｈＣＭＶ）の主要直後期プ ロモーター／エンハンサ−の後に導入した。トランスフェクトされる真核生物細 胞中のプラスミドの選択用のマーカー遺伝子は、ｐＥＥｈＣＭＶのユニークＢａ ｍＨＩサイト中にＢａｍＨＩカセットとして挿入できる。例えばｎｅｏｖ−カー はｐＥＥ６　ｈＣＭＶ　ｎｅｏを提供する。問題の遺伝子を挿入する前にｎｅｏ およびｇｐｔマーカーを挿入するのが通常のプラクティスであり、一方ＧＳマー カーはカセット中に内部ＥｃｏＲＩサイトが存在するので最後に挿入する。その 選択可能なマーカーは、そのベクターがコス細胞トランジェント（ｔｒａｎｓｉ ｅｎｔ）発現系で発現できるよう、複製の源を供給するＳＶ４０レート（ｌａｔ ｅ）プロモータから発現される。

マウス配列は、ＥｃｏＲＩ断片として上記のＭ１３をベースにするベクターから 削除され、Ｈ鎖については１）ＥＥ６−ｈＣＭＶ−ｎｅｏに、Ｌ鎖についてはＥ Ｅ６−ｈＣＭＶ−ｇｐ　ｔにクロー：／され、ベク９−ｐＪＡ１３６およびｐＪ Ａ１３５をそれぞれ生じる。

８、ニス細胞中でのｃＤＮＡの発現 プラスミドｐＪＡ１３５およびｐＪＡ１３６はコス細胞にいっしょにトランスフ ェクトされ、トランジェント発現実験からの上清液は、Ｔ細胞に富むリンパ球に 結合した集合した抗体を含むことを示した。２ＳＳメチオニンを用いた代謝ラベ リング実験はＨおよびＬ鎖の発現および集合を示した。

９、　キメラ遺伝子の作成 キメラ遺伝子の作成は以、前に記載した戦略［Ｗｈｉｔｔｌｅ等（文献１３）］ に従った。可変領域の３°末端近くの制限部位を確認し、マウス可変領域の残り のためのオリゴヌクレオチドアダプターコーディングおよび選んだ定常領域への 付着のための適当な制限部位を付着させるのに用いた。

９．１．Ｌ鎖遺伝子構築 マウスのし鎖のｃＤＮＡ配列は可変領域の３′末端近くにＡｖａ　Ｉサイトを有 する［図１（ａ）］。可可変域の配列の大部分は３９６　ｂｐ、ＥｃｏＲＩ−Ａ ｖａＩ断片として分離した。オリゴヌクレオチドアダプターは、ＡｖａＩサイト から、ヒトの定常領域の５′領域を含み、定常領域に前もって巧みに処理しであ るユニークＮａｒｌまで、それを含めて、可変領域の３°領域の残りを置き換え るよう設計した。

Ｈｉｎｄ［［Ｉサイトを、リンカ−挿入のマーカーとして働かすために導入した 。

そのリンカ−はＶＬフラグメントに連結し、４１３ｂｐ　ＥｃｏＲＩ−Ｎａｒｌ をアダブト（ａｄａｐｔｅｄ）　したフラグメントは、連結混合物から精製した 。

定常領域はＭ１３クローンＮＷ３６１から、Ｎａｒｌ−ＢａｍＨＩフラグメント として分離し、３つの方法の反応で、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ／ＣＩＰ　ｐＳＰ ６５処理ベクター中に、可変領域ＤＮＡと連結し、プラスミドＪＡ１４３を得た 。クローンはＥ、ｃｏｌｉに形質転換後分離し、リンカ−および接続点（ｊｕｎ ｃｔｉｏｎ）配列は、Ｈｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩサイトの存在およびＤＮＡ塩基配列 決定法により確認した。

９．２．Ｌ鎖遺伝子構築−バージョン２最初のキメラＬ鎖遺伝子の構築により、 可変一定常領域接続点で、マウスおよびヒト　アミノ酸配列の融合物を作った。

０ＫＴ３Ｌ鎖の場合、キメラ接続点でのアミノ酸は −Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−［１ｅ−Ａｓｎ−Ａｒｇ／　−／Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ　 −Ａｌａ可変　定常 である。配列のこの配置は、Ｖ−〇接続点でアスパラギン（Ａｓｎ）結合（Ｎ− 結合）グリゴシル化の可能性あるサイトを導入した。それ故ヒトの定常領域の最 初のアミノ酸であるスレオニン（Ｔｈｒ）を、マウスの定常領域からの等価なア ミノ酸、アラニン（Ａｌａ）で置き換える、キメラＬ鎖オリゴヌクレオチドアダ プターの第２のバージョンをデザインした。２つのキメラＬ鎖遺伝子を区別する ために、内部（ｉｎｔｅｒｎａｌ）Ｈｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩサイトはこのアダプタ ーに含めなかった。

可変領域フラグメントは３７６　ｂｐ　ＥｃｏＲＩ　−Ａｖａｌフラグメントと して分離した。そのオリゴヌクレオチドリンカーはＮａｒｌ　ｃｕｔ　ｐＮＷ３ ６１に連結し、次にアダブトした（ａｄａｐｔｅｄ）　９６　ｂ　ｐ定常領域を 、ＥｃｏＲＩで改変ｐＮＷ３６１を再切断した後に、分離した。可変領域断片お よび改変定常領域断片を、ＥｃｏＲＩ／ＣＩＰで処理したｐＥＥ６ｈＣＭＶｎｅ 。

に直接連結し、ｐＪＡ１３７を得た。

調べたすべてのクローンは最初正しくない方位に挿入物を有していた。それ故挿 入物を再分離し、再クローンして挿入物をほぼ正確にし、プラスミドｐＪＡ１４ １を得た。正しい方向に挿入物を有する数個のクローンを得て、アダプター配列 をＤＮＡ塩基配列法により確認した。

９．３．Ｈ鎖遺伝子構築 ９．３．１．Ｈ鎖遺伝子アイソタイプの選択Ｈ鎖用に選択した定常領域アイソタ イプはヒトのＩｇＧ４であった。

９．３．２　遺伝子構築 ＨｊｌｌｃＤＮＡ配列は可変領域の３°末端近くにＢａｎ１サイトを示した［図 ２　（ａ）　］。

可可変域の配列の大部分を４２６ｂｐ、ＥｃｏＲＩ／ＣＩＰ／ＢａｎＴ断片とし て分離した。オリゴヌクレオチドアダプターは、Ｂａｎ　Ｉサイトから、定常領 域の最初の２つのアミノ酸に、前もって巧みに処理しであるユニークＨｉｎｄｌ Ｉ［サイトまで、そのサイトを含めて置き換えるよう設計した。

そのリンカ−をＶ、断片に連結し、ＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ［［Ｉアダブト（ａｄ ａｐｔｅｄ）断片を連結混合物から精製した。

その可変領域を、イントロン断片を除去するＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄ［ＩＩで ｐＪＡ９１を切断し、ｖＨで置き換えることにより、定常領域に連結し、ｐＪＡ １４２を得た。

Ｅ、Ｃｏ１１　ＪＭＩＯＩに形質転換後、クローンを分離し、リンカ−および接 続点配列をＤＮＡ塩基配列法により確認した。（注意。ヒントＩＩＩサイトはク ローニングで失くなる）。

１０、キメラ発現ベクターの構築 １０．１．　ｎｅｏおよびｇｐｔベクターキメラＬ鎖（バージョンｌ）をｐＪＡ １４３からＥｃｏＲＩ断片として除去し、ＥｃｏＲＩ／ＣＩＰで処理したｐＥＥ ６ｈＣＭＶｎｅｏ発現ベクターにクローンし、ｐＪＡ１４５を得た。正しい方位 に挿入物を有するクローンを、制限マツピングにより確認した。キメラＬ鎖（バ ージョン２）は上記のように構築した。

キメラＨ鎖遺伝子はｐＪＡ１４２から２．５ｋｂｐＥｃｏＲ［／ＢａｍＨ１断片 として分離し、ｐＥＥ６ｈＣＭＶｇｐｔ１７）誘導体１’あ６ＥｃｏＲＩ／Ｂｃ Ｉ［／ＣＩＰ処理ベクター断片にクローンし、ｐＪＡ１４４を得た。

１０．２．　ＧＳ　セパレート　ベクターｐＪＡ１４１およびｐＪＡ１４４のＧ Ｓ）（−ジョンを、プラスミドのＢａｍＨＩ／５ａｌｌ　／ＣＩＰ処理、ベクタ ー断片の分離、およびプラスミドｐＲＯ４９からのＧＳ含有断片への連結により 、ｎｅｏおよびｇｐｔカセットを置き換えることで、構築し、Ｌ鎖ベクターｐＪ Ａ１７９およびＨｊＪ［ベクターｐＪＡ１８０を得た。

１０．３．ＧＳシングルベクター ｃＬ（キメラライト）、ｃＨ（キメラライトＧＳ遺伝子を、一つのプラスミド上 に、ｃＬ−ｃＨ−ＧＳまたはｃＨ−ｃＬ−ＧＳの順に存し、遺伝子の転写が頭− 尾、例えばｃＬ＞ｃＨ＞ＧＳであるシングルベクターを構築した。これ等のプラ スミドは、ｐＪＡ１７９またはｐＪＡ１８０を、ＢａｍＨＩ／ＣＩＰで処理し、 Ｂｇ［［Ｉ　／Ｈｉ　ｎｄｌ［Ｉ　ｈＣＭＶプロモーターカセット中で、ｐＪＡ １４１からｐＪＡ１８０へのＨｉｎｄｌｌｒ　／ＢａｍＨＩ断片といっしょに連 結し、ｃＨ−ｃＬ−ＧＳプラスミドを得るか、あるいはｐＪＡ１４４からｐＪＡ １７９へのＨｉｎｄｌｌＩ　／ＢａｍＨＩ断片といっしょに連結し、ｃＬ−ｃＨ −ＧＳプラスミドを得るかの方法により作った。

１１、キメラ遺伝子の発現 １１．１．　ゴス細胞中での発現 キメラ抗体プラスミドｐＪＡ１４５　（ｃＬ）およびｐＪＡ　ｌ　４４　（ｃＨ ）をニスセル中にいっしょにトランスフェクトし、トランジェント（ｔｒａｎｓ ｉｅｎｔ）発現実験からの上清液はＨＶＴ７８ヒｌ−Ｔ細胞系に結合した集合抗 体を含むことか示された。２ｓＳメチオニンを用いた代謝ラベリング実験はＨお よびＬ鎖の発現および集合を示した。しかし還元した（ｒｅｄｕｃｅｄ）ゲル上 に見られるし鎖の移動度は、グリコジル化の可能性ある位置かグリコジル化され ていることを示唆した。ツニカマイシン存在下でのゴス細胞中での発現は、コン トロールキメラ抗体および０ＫＴ３マウスＬ鎖で示されたものへ、Ｌ鎖の大きさ が減少していることを示した。それ故ＪＡ１４１は構成され発現された。この場 合し鎖はツニカマイシン存在下または不存在下で異常な移動度、または大きさの 変化を示さなかった。キメラし鎖のこの第２のバージョンは、キメラＨ（ｃＨ） 鎖と共同して発現した時、ＨＶＴ７８細胞に良好な結合を示す抗体を生産した。

両者の場合に抗原結合はマウス抗体のそれと同等であった。

１１．２．　チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中での発現 安定な細胞系を、プラスミドｐＪＡ１４１／ｐＪＡ１４４から、並びにｐＪＡ１ ７９／ｐＪＡ１８０、ｐＪＡ１８１、およびｐＪＡ１８２から、ＣＨＯ細胞中へ のトランスフェクションにより作った。

１２、　ＣＤＲグラフト 採用したアプローチは、十分なマウス残基をヒトの可変領域フレームワークに導 入し、マウスおよびキメラ抗体と同等の抗原結合活性を生み出すよう試みること であった。

１２．１．　可変領域分析 抗体および抗体−抗原複合体の構造についての小データベースを調べることによ り、少数の抗体残基のみか抗原と直接接触することか明らかである。他の残基は 、接触する残基を好ましい立体配置に位置させることによりそしてまた個々の可 変領域の安定な包み込み（ｐａｃｋｉｎｇ）、およびＬおよびＨ鎖可変領域の安 定な相互作用を引き起すことにより、抗原結合に寄与する。

移転（ｔｒａｎｓｆｅｒ）用に選択する残基は多くの方法で確認することができ る。

（ａ）抗体のＸ線結晶構造を調べることにより、抗原結合表面は、Ｂバレル（１ ）ａｒｒｅｌ）フレームワークから伸びる一連のループ、ドメイン当り３つ、に 主として位置する。

（ｂ）抗体の分析により、超可変性の可変配列領域［ＷｕおよびＫａｂａｔ　（ 文献５）により相補性決定領域（ＣＤＲ）と名づけられた］を確認できる。すべ てでないが大ていの場合、これ等のＣＤＲは上に言及したループ領域に対応する か、少し向うに広がっている。

（Ｃ）　（ａ）または（ｂ）によって確認されない残基は、抗原結合サイトのト ポロジーに影響することより、または個々の可変領域の安定な包み込みを導き、 可変領域間相互作用を安定化させることにより、直接または間接に、抗原結合に 寄与する。これらの残基は、公知の構造に与えられた抗体の配列を重ね、それら の寄与に対するキイとなる残基を観察することにより、あるいは配列アラインメ ント分析し、“特異な′残基を観察し、それらの構造上の位置と有り得る効果を 調べることにより確認する。

１２．１．１．　ＬｔｉＪＩ 図３はヒトのフレームワーク領域ＲＥＩおよび０ＫＴ３Ｌｌの配列のアラインメ ントを示す。抗原結合領域に対応すると信じられる構造上のループ（Ｌｏｏｐ） およびＣＤ　Ｒ（ＫＡＢＡＴ）　＋：、　ハ印ヲつけテいル。１３．　１　（、 Ｃ）に記載するように抗原結合に寄与する多くの他の残基にも印をつけである。

図３の配列の上で、残基タイプはＸ線結晶学分析により解明された構造を調べる ことにより導かれた、それぞれの残基側鎖の空間的な位置を示す。

この残基タイプの名称の略号は次の通りである。

Ｎ−ＣＤＲに近い（Ｘ線構造から） Ｐ−バッキング　Ｂ−理められバッキングされないＳ−表面　Ｅ−さらされてい る Ｉ−界面　＊−界面 一バッキング／部分的にさらす ？−マウスの配列として残す必要のある非ＣＤＲ残基図３でアンダーラインした 残基はアミノ酸である。

ＲＥＩは、Ｌ鎖がに鎖であり、に可変領域はλＬ可変領域、例えばＫＯＬ　（下 を参照）より、マウスの配列と、より高い相同性を示すので、選んだ。ＲＥＩは 、Ｌ鎖のＸ線構造か、個々の残基の構造解析ができるように決定されているので 、他のにＬ鎖に優先して選んだ。

１２．１．２．　Ｈ鎖 同様に図４はヒトのフレームワーク領域ＫＯＬおよび０ＫＴ３　Ｈ可変領域配列 のアラインメントを示す。抗原結合領域に対応すると信じられる構造上のループ およびＣＤＲには印がつけである。１２．１（Ｃ）に記載するように抗原結合に 寄与する多くの他の残基にも印がつけである。残基タイプの略号および図４で用 いる他の表示は図３で用いたのと同じである。

ＫＯＬは、Ｘ線構造が、例えばＮＥＷＭより、より良く解析されており、０ＫＴ ３のＨ可変領域の配列アラインメントがＮＥＷＭより、ＫＯＬにわずかによい相 同性を示すので、Ｈ鎖フレームワークとして選んだ。

１２．２．　可変遺伝子の設計 可変領域はマウスの可変領域至適コドン法［ＧｒａｎｔｈａｍおよびＰｅｒｒｉ ｎ　（文献１５）コを用いて設計し、８７２．３シグナル配列［Ｗｈｉｔｔｌｅ 等（文献１３）］を用いた。その配列は上に記載したキメラ遺伝子と同じ方法で 、定常領域に付着するよう設計した。いくつかの構造物は、遺伝子中でシグナル 配列の５°に直接結合するＫｏｚａｋ　：７ンセンサス配列［Ｋｏｚａｋ　ｆ　 ｂ文献１６）コを含有する。この配列モチーフは真核生物での翻訳開始に育益な 役割を果すと信じられる。

１２．３．　遺伝子構築 可変領域を構築するために種々の戦略を利用できる。

その配列は、Ｊｏｎｅｓ等（文献１７）に類似の方法でオリゴヌクレオチドを用 いることにより、またはＶｅｒｈｕｅｙｅｎ等（文献２）に類似の方法でオリゴ ヌクレオチドの突然変異誘発によるすへてのＣＤＲまたはループ域の同時置換に より、組み立てられる。同戦略を用い、構築のリストを表１および２、図４およ び５に示す。いくつかの場合に、突然変異誘発のアプローチは改造しつつある遺 伝子中での削除Ｃｄｅｌｅｔｉｏｎ＞および再配列（ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎ ｔ）をもたらし、一方組み立て（ａｓｓｅｍｂｌｙ）アプローチの成功は、オリ ゴヌクレオチドの特性に非常に鋭敏であることに注目した。

１３　発現ベクターの構築 遺伝子はＭ１３および５Ｐ６５をベースとするインターメジエート（ｉｎｔｅｒ ｍｅｄｉａｔｅ）ベクターから分離し、Ｌｔｉｌの場合にはｐＥＥ６ｈＣＭＶｎ ｅｏに、Ｈ鎖の場合にはｐＥＥ６ｈＣＭＶｇｐｔに、上に記載したキメラ遺伝子 の場合と類似の方法でクローンした。

″　１　ＣＤＲグラフト遺伝Ｔ−構造物コード　マウス配列の内容　１１築方法 　ＫＯＺＡＫ配列Ｌｌｌｌ　すべてヒトフレームワークｕ１１２１　２６−３２ ．５０−５６．９１−９６　包括的　ＳＤＮおよび遺伝子アブセンブリ−＋　ｎ 、ｄ。

１２ＬＡ　２６−３２．５ｏ−５６，９１−９６包括的　部分的遺伝子アッセン ブリー　ｎ、ｄ、　＋◆１．３．４６．４７ １２１Ｂ　２６−３２．５０−５６．９１−９６　包括的　部分的遺伝子アッセ ンブリー　ｔｚ、ｄ、＋牟４６．４７ ２２１　２４−２４．５０・５６．９１・９６　包括的　部分的遺伝子アブセン ブリ−中　＋２２ＬＡ　Ｚ４・３４．５０−５６．９１・９６　包括的　部分的 遺伝子アブセンブリ−＋　＋＋１．３．　ｋ６．４７ ２２１Ｂ　２４・３４．５０−５６．９１−９６　包括的　部分的遺伝子アッセ ンブリ−令　十÷１．３ ２２１Ｃ２４−３４，５０−５６，９１−９６包括的　部分的遺伝子アッセンブ リー　◆　◆ＩＩＩ　すべでヒトフレームワークＫＯＬ１２１　２６−３２．５ ０−５６．９５．ＬＯＯＢ　包括的　遺伝Ｔアッセンブリー　ｎ、ｄ、　＋１３ １　２６−３２．５０−５１！ｌ、　９５−１００！ｌ　包括的　遺伝子アッセ ンブリー　ａ、ｄ、　＋１４１　２６−３２．５０−６５．９５−１００３　包 括的　部分的遺伝Ｔアッセンブリー　＋　ｎ４゜３２１　２６−３５．５０−５ ６．９５−１００Ｂ　包括的　部分的遺伝子アッセンブリー　＋　ｎ４゜３３１ 　２６−３５．５０−５１１．９５−１００３　包括的　部分的遺伝Ｔアブセン ブリ−中遺伝子アッセンブリー ３４１　２６−３５．５０−６５．９５・１００Ｂ　包括的　ＳＤＭ部分的遺伝 子アッセンブリー ３リム　２６−３５．５０−６５．９５−１００Ｂ　包括的　遺伝子アッセンブ リー　ｎ、ｄ、　＋＋６．２３．２４．４１１．４９．７Ｌ、　７３．７６゜７ ８、１１８．９１　（÷６３−　ヒト　）１１！ｔｌＢ　２６−３５．５０−６ ５．９５−１ｏｏ！ｌ　包括的　遺伝Ｔアッセンブリー　ｎ−ｄ、　十＋　４Ｊ 　４９．７１．７３．７６、７Ｂ、　５ｉｌｌ、　９１（＋６３＋　ヒト　） 符号 ｎ、ｄ、行わなかった ＳＤＭ　特定部位の突然変異誘発 遺伝子アッセンブリー　オリゴヌクレオチドから全体５　に組み立てた可変領域 部分的遺伝子アッセンブリー ＳＤＭ及びアセンブリーによって本来的に創製される他の遺伝子あるいは可変領 域の１部分のオリゴヌクレオチドアセンブリーによって本来的に創製される他の 遺伝子からの制限断片、及びＳＤＭと遺伝子アセンブリーによって本来的に創製 される他の遺伝子からの制限断片を用いた再構築を組合わせることによる可変領 域アセンブリー。

１４、　ＣＤＲグラフト遺伝子の発現 １４．１．　グラフトＬ　（ｇＬ）鎖と、マウスＨ鎖（ｍＨ）またはキメラＨ［ （ｃＨ）よりなる抗体の製造ｍＨまたはｃＨと共同したすべてのｇＬ鎖は相当な 量の抗体を作った。ＡＴＧに対して５′の位置でのＫｏｚａｋコンセンサス配列 の挿入（ＫｇＬ構造物）は、しかし正味の発現で２〜５倍の改良をもたらした。

広範なシリーズの実験を通じて、発現レベルは、Ｋ　ｇ　Ｌ　／　ｃ　Ｈまたは ＫｇＬ／ｍＨの組合せで、約２００ｎｇ／ｍｌから約５００ｎｇ／ｍｌに増加し た。

ＨＶＴ細胞上での抗体への直接の結合を測定すると、ループ長をベースにしてマ ウスの配列を含むよう設計した構造物（ｇＬ　１２１）は、ｍＨまたはｃＨと共 同して活性な抗体に導かなかった。ＫａｂａｔＣＤＲをベースにしてマウスの配 列を含むよう設計した構造物（ｇＬ２２１）は、ｍＨまたはｃＨと共同して、幾 分かの弱い結合を示した。しかしフレームワーク残基１，３．４６．４７を、ヒ トから、１２．１節で略述した議論に基づくネズミ科動物０ＫＴａ相当物（ｅｑ ｕｉｒａｌｅｎｔ）に変えると、１２１Ａおよび２２１Ａと名づける新しい構造 物の両方かｃＨと共に発現した時、抗体結合を示した。これらの残基の影響をよ り詳細に調べたところ、残基ｌおよび３は、ｇＬ遺伝子の生産物がｃＨと共同し て検出できる結合活性をほとんど示さないので、主たる寄与残基ではないようで ある。マウスの配列が４６および４７で存在するｇＬ２２１Ｃのし鎖生産物はｃ Ｈと共同して良好な結合活性を示す。

１４．２．　グラフトＨ（ｇＨ）鎖と、マウスＬ鎖（ｍＬ）またはキメラＬ鎖（ ｃＬ）よりなる抗体の製造ｇＨ遺伝子の発現は、ｇＬの場合より達成するのがよ り困難であることがわかった。第一に、Ｋｏｚａｋ配列の含有は、ｇＨ遺伝子の 発現に顕著な効果を及ぼさないらしい。発現はわずかに改良されるが、グラフト し鎖で見られたのと同じ程度には及ばないよってある。

また、ＣＤＲ１に対するループ選択（ｌｏｏｐ　ｃｈｏｉｃｅ）（アミノ酸２６ 〜３２を用いた場合、例えばｇＨ１２１，１３１，１４１１期待した量の物質の 生産を示すことは困難であることかわかりこれらの構造物についての結論を引き 出すことはできない。

さらにｃＬまたはｍＨとのｇＨ遺伝子の共発現は変化しやすく、ｃＨ／ｃＬまた はｍ　Ｈ／　ｍ　Ｌより少い量の抗体を作る傾向かあった。ｇＨ３４１Ａおよび ｇＨ３４１Ｂを作るためのｇＨ３４１への改変は発現レベールの改良をもたらし た。

これは、可変領域でのマウスの配列の割合の一般的な増加のため、あるいは残基 がフェニルアラニン（Ｐｈｅ）からヒトのアミノ酸バリン（Ｖａｌ）にもどり、 ヒトのフレームワークの残りとの内部バッキングの問題を回避する、位置６３で の変更のためのいずれかによる。この配列はｇＨ３３１およびｇＨ３２１でも起 る。

ｇＨ３２１およびｇＨ３３１を、ｃＬと共同して発現させた場合、抗体を生産さ れたが、抗体結合活性は検出されなかった。より保存的（ｃｏｎｓｅｒｖａｔ　 １ｖｅ）なｇＨ３４１を用いた場合、抗原結合はｃＬまたはｍＬと共同して検出 されたが、その活性はバックグランドレベルのぎりぎり上にすぎなかった。１２ ．１での議論に基いてさらにマウスの残基を置換すると、ＫｇＨ３４１Ａおよび ＫｇＨ３４１ＢをｃＬと共同して発現させた場合、作られた抗体について抗原結 合を明らかに示した。

１４．３．　完全にＣＤＲグラフトした抗体の製造ＫｇＬ２２１Ａ遺伝子をＫｇ Ｈ３４１，ＫｇＨ３４１Ａ、またはＫｇＨ３４１Ｂと共に発現させた。ＫｇＨ２ ２１Ａ／ＫｇＨ３４１の組合せの場合、通常のコス細胞発現では非常にわずかな 物質しか製造されなかった。

ＫｇＬ２２１Ａ／ＫｇＨ３４１ＡまたはＫｇＨ２２１Ａ／ＫｇＨ３４１Ｂの組合 せの場合、ｇ　Ｌ　／　ｃ　Ｈに似た抗体量が製造された。いくつかの実験では 、発現レベルは非常に低くかったが、ＫｇＨ２２１Ａ／ｇＨ３４１またはＫｇＨ ２２１Ａ／ＫｇＨ３４１の組合せで抗原結合活性は検出されなかった。ＫｇＬ２ ２１Ａ／ＫｇＨ３４１ＡまたはＫｇＨ２２１Ａ／ＫｇＨ３４１Ｂの組合せを発現 させた場合、抗原結合が検出された。ＫｇＬ２２１Ａ／ＫｇＨ３４１Ａの組合せ から製造される抗体の場合、抗原結合はキメラ抗体の抗原結合とたいへん似てい る。

上の結果の分析は下に示す。

１５、　ＣＤＲグラフトの結果の議論 完全に人体適応化した抗体の設計においては、目的は、抗原結合を与えるマウス のアミノ酸の最低数を、ヒトの抗体フレームワークに移すことであった。

１５．１．Ｌ鎖 １５．１．ｌ　ＣＤＲの範囲 ＬＭｉの場合、他の抗体の構造研究から抗原接触残基を含むことか知られたルー プの境界を定める区域、およびＫａｂａｔ等の（文献４および５）により相補性 決定領域（ＣＤＲ）として定義されたこれらの超可交配列は、ＣＤＲ２と同等で ある。ＣＤＲＩの場合、超可受領域は残基２４〜３４（包括的）から伸びるか、 構造的ループは２６〜３２（包括的）から伸びる。０ＫＴ３の場合、二つの選択 できるものの間にはアミノ酸２４てのたった一つのアミノ酸の相違しかなく、そ こではマウス配列はセリンであり、ヒトのフレームワークＲＥＩはグルタミンを 有する。ＣＤＲ３の場合、ループは残基９１〜９６（包括的）から伸び、Ｋａｂ ａｔの超可変性は残基８９〜９７（包括的）から伸びる。０ＫＴ３の場合、アミ ノ酸８９．９０および９７は、０ＫＴ３とＲＥＩで同じである（図３）。ＣＤＲ ｌについてのループ選択（ｇＬ１２１）およびＫａｂａｔ選択（ｇＬ２２１）に 基づく構造物を作り、ｍＨまたはｃＨと共に発現させた場合、抗原結合活性の証 拠はｇＬ１２１の場合見出せなかったが、ｇＬ２２１ではわずかな活性が検出で き、グラフトした可変領域での単一の余分のマウス残基は、いくらかの検出でき る効果を存することを示唆する。両遺伝子構造物はトランジェント（ｔｒａｎｓ ｉｅｎｔ）発現系ではかなり良く発現した。

１５．１．２．　フレームワーク残基 残りのフレームワーク残基、特に他の抗体のＸ線分析からＣＤＲに近いことが知 られたアミノ酸、および０ＫＴ３がもっとも相同性を示すマウスサブグループ（ サブグループＶｌ）のコンセンサスフレームワークから０ＫＴ３において相異を 示すアミノ酸、をさらに調べた。４つの位ｆｔｌ、３．４６および４７を確認し 、それらの可能な寄与を、それぞれの位置でヒトのアミノ酸をマウスのアミノ酸 で置換することにより調べた。

それ故ｇＬ２２１Ａ　（ｇＬ２２１Ａ＋ＤＩＱ、Ｑ３Ｖ、Ｌ４６Ｒ，Ｌ４７Ｗ、 図３および表１を参照）を作り、ＥＥ　６　ｈＣＭＶｎ　ｅ　ｏにクローンし、 ｃＨ（ｐＪＡ１４４）と共に発現させた。生じた抗体はよく発現し、良好な結合 活性を示した。関連した遺伝子ｇＬ２２１Ｂ（ｇＬ２２１＋ＤＩＱ、Ｑ３Ｖ）お よびｇＬ２２１ｃ（ｇＬ２２１＋Ｌ４６Ｒ，Ｌ４７Ｗ）を作り、同様に試験した 場合、両遺伝子はｃＨと共に発現させた時抗体を製造したが、ｇＬ２２１ｃ／ｃ Ｈの組合せのみが良好な抗原結合を示した。ｇＬＩ２１Ａ（ｇＬ１２１＋ＤＩＱ 、Ｑ３Ｖ、Ｌ４６Ｒ，Ｌ４７Ｗ）遺伝子を作り、ｃＨと共に発現させた場合、抗 原に結合する抗体が製造された。

１５．２．　Ｈｌ １５．２．１．　ＣＤＲの範囲 ＨＭの場合、ループおよび超可変性分析はＣＤＲ３でのみ一致する。ＣＤＲｌで はループ領域は残基２６〜３２（包括的）から伸び、一方ＫａｂａｔのＣＤＲは 残基３１〜３５（包括的）から伸びる。ＣＤＲ２ではループ領域は５０〜５８（ 包括的）からであるが超可受領域はアミノ酸５０〜６５（包括的）をカバーする 。それ故、抗体ＫＯＬからのフレームワークを用い、これらのＣＤＲ選択の様々 な組合せて人体適応性Ｈ鎖を構築した。ＣＤＲ選択は、残基５６〜５８あたりの ＣＤＲ２についての最後の点の明確さに関し幾分かの不確実性があるので、５０ 〜５６（包括的）のＣＤＲ２についての短い選択を含めた。その遺伝子はｍＬま たはｃＬと最初にともに発現させた。ＣＤＲＩについてのループ選択を有するｇ Ｈ遺伝子、例えばｇＨ１２１、ｇＨｌ　３１．ｇＨｌ　４１の場合、非常に少い 抗体しか培養上溝液に製造されなかった。

フリーのＬ鎖は検出されなかったので、抗体は作られつつあり、細胞内部に集合 したが、ＨＭが何らかの点で変型であり（たぶん誤って折り重なっている）、そ のため抗体は内部的に品質が低下しているものと推定される。

いくつかの実験では、３１３ラベリング試験で微量の抗体が検出された。

正味の抗体が製造されないので、これらの構造物の分析をさらに行うことはでき ない。しかしループ選択とＣＤＲ１についてＫａｂａｔ選択との組合せを試験し くマウスアミノ酸２６〜３５（包括的））、残基３１（ＳｅｔをＡｒｇへ）、３ ３　（ＡｌａをＴｈｒに）、そして３５（ＴｙｒをＨｉｓへ）をヒトの残基から マウスの残基へ変え、最初のシリーズと比較した時、ｃＬと共に発現するｇＨ３ ２１，ＫｇＨ３３１およびＫｇＨ３４１の場合抗体が製造された。

発現は一般に低く、遺伝子のシグナル配列のＡＴＧに対しＫｏｚａｋコンセンサ ス配列５′の挿入によっても、そのような挿入が正味の抗体製造の２〜５倍の増 加をもたらすｇＬ遺伝子の場合とは異なり、顕著に改善されなかった。しかしｇ Ｈ３４１／ｍＬまたはＫｇＨ３４１／ｃＬの場合にのみ、最低の抗原結合活性が 示された。

ＫｇＨ３４１遺伝子をＫｇＬ２２１Ａと共に発現させた場合、抗体の正味の収量 は低いので抗原結合アッセイにおけるバックグラウンドレベル以上のシグナルを 与えなかった。

１５．２．２．　フレームワーク残基 り鎖の場合と同様に、Ｈ鎖フレームワークを再び調べた。たぶん、Ｌ鎖と比較し てマウスとヒトのＨ可変領域間の最初の相同性が低いため、より多くのアミノ酸 の位置が重要であることがわかった。ｇＨ３４１に比較して１１または８のヒト の残基をそれぞれマウスの残基に置換し、ＣＤＲ２残基については６３をドメイ ンバッキングを改良するためにヒトのアミノ酸に戻し、二つの遺伝子ＫｇＨ３４ １ＡおよびＫｇＨ３４１Ｂを構築した。両者はｃＬまたはＫｇＬ２２１Ａと組合 せた時抗原結合性を示し、すべての１１を変化させたＫｇＨ３４１Ａは優れた選 択であるよってある。

■５．３　仮の結論 抗原結合能力を人体適応性抗体に移すために、Ｋａｂａｔの超可変性により定義 されるＣＤＲ領域または構造的ループ選択の外側にマウスの残基がＬ鎖でもＨ鎖 でも必要であることが０ＫＴ３について示された。多分マウスおよびヒトのに可 変領域間の高い最初の相同性のため、２．３の余分の残基か必要である。変化の うち７つ（Ｌ鎖からのｌ、３およびＨ鎖からの６．２３．７１．７３．７６）は 、他の抗体構造の知識から、部分的にさらされているか抗体表面にあることが予 言される。Ｌ鎖中の残基ｌ、３はマウス配列である必要は必ずしもなく、Ｈ鎖の 場合２２１ＡＬ鎖と組合せたｇＨ３４１ＢＨｉｍは弱い結合性のみを生み出すこ とがここに示された。それ故６．２３．２４の変化の存在がネズミ科動物抗体の それと類似の結合親和性を維持するために重要である。それ故ＫｇＨ３４１と比 較してＫｇＨ３４１Ａの他の８つのマウスの残基の個々の寄与をさらに研究する ことが重要で追加の、ＣＤＲグラフトＨ鎖遺伝子を実質的に上記の如く製造した 。表２と関連して、追加のＨ鎖遺伝子は、示したように６．２３．２４．４８． ４９．６３．７１゜７３．７６．７８．８８および９１で、マウスＯＫＴ　３ま たはヒトＫＯＬ残基を有するｇｈ３４１（プラスミドｐＪＡ１７８）およびｇＨ ３４１Ａ（プラスミドｐＪＡ１８５）をベースにした。この更なる実験に用いた ＣＤＲグラフトＬ鎖遺伝子は上に記載したようにｇＬ２２１゜ｇＬ２２１Ａ、ｇ Ｌ２２１ＢおよびｇＬ２２１ｃであった。

表　２ ０に７３ＨＩＣＤＲグラフト １、ｇＨ３４１および誘導物 ｇ）ｆ３１ａｌ　Ｅ　Ｓ　Ｓ　Ｖ　Ａ　Ｆ　Ｉ　Ｉ　ＨＬ　Ｇ　ＦＪＡ１７Ｂｇ ｌ（３４１６Ｋ　Ａ　Ｉ　Ｇ　Ｖ　Ｔ　Ｋ　！ｉ　Ａ　Ｇ　ＦＪＡ２０７ｇＨ３ ４１會　Ｋ’Ａ　Ｉ　Ｇ　Ｖ　ｍｌ　ＨＭ　！　ＣＦＪ７Ｌ２０９ｇＨ３４１Ｄ 　Ｋ　Ａ　Ｉ　Ｇ　Ｖ　Ｔ　Ｋ　ｊｌ　Ｌ　Ｇ　ＦＪＡ１９７１＄３４１會　Ｋ 　Ａ　Ｉ　Ｇ　Ｖ　ｉＬ　Ｎ　Ｎ　Ｌ　Ｇ　ＦＪＡＬ９９ｇＨ３４１ｃ　史−− ３−−３Ｖ　Ａ　Ｆ鼠Ｎ　ＨＬ　Ｇ　ＦＪＡ１１１４ｇＨ３４１會　ｑ　Ｓ　Ａ 　Ｉ　Ｇ　Ｖ　τ　Ｋ　５　Ａ　Ｇ　ＦＪＡ２０４＄３＆ｌ＊　Ｅ　５　Ａ　Ｔ 　Ｇ　Ｖ　：　に　−５Ａ　Ｇ　ｒＪａ２０６ｇＨ３４１會　Ｑ　Ｓ　Ａ　Ｉ　 Ｇ　”ｉ　Ｔ　Ｋ　Ｎ　Ａ　Ｇ　ｒＪＡ２０１１ＫＯＬ　Ｅ　５ＳＶ　Ａ　ＲＮ ＮＬにＦｏＫＴ３ＬＩＣＤＲグラフト ２、　３Ｌ２２１および誘導物 残基番号　１　３　４６　４７ ０ＫＴ３ｖｌ　免−」−一１−！ ＧＬ２２１　Ｄ　ｑ　Ｌ　Ｌｌ）ａ２２１ｇＬ２２Ｌ＾Ｖ　ＲＵｔｌＡ２２ＬＡ ｇＬ２２１！ｌ　虹−Δ　Ｌ　ＬＯＡ２２１ＢＧＬ２２１ＣＤ　Ｑ　ＲｕＤ＾２ ２１Ｃ旺Ｉ　ＤＱＬＬ ネズミ科鋤物Ｕはアンダーラインした ＣＤＲグラフトＨおよびＬ鎖遺伝子はニス細胞中で、様々な組合せでお互いと共 に、また上に記載した対応するネズミ科動物およびキメラＨおよびＬ鎖遺伝子と 共に、発現させた。生成した抗体生産物を、次に上記したＨＰＢ−ＡＬＬ細胞と の結合およびブロッキングアッセイで分析した。

ｇＬ２２１Ｌ鎖と共に発現した種々のグラフトＨ鎖についての分析結果を図７お よび８（ＪＡ１８４、ＪＡＩ８５、ＪＡ１９７およびＪＡ１９８構造物の場合、 表２を参照）、図９（ＪＡ１８３、ＪＡ１８４、ＪＡ１８５およびＪＡ１９７構 造物の場合）、図１０（キメラ、ＪＡ１８５、ＪＡ１９９、ＪＡ２０４、ＪＡ２ ０５、ＪＡ２０７、ＪＡ２０８、およびＪＡ２０９の構造物の場合）、および図 １１（ＪＡ１８３、ＪＡ　１８４、ＪＡ１８５、ＪＡ１９８、ＪＡ２０３、ＪＡ ２０５およびＪＡ２０６構造物の場合）に示した。

可変フレームワークにおいて、ヒトのネズミ科動物への変化のない基本的なグラ フト生産物、すなわちｇｈ３４１（ＪＡ１７８）と共に発現したｇＬ２２１、お よびグラフトＨ鎖フレームワーク中で大部分のヒトのネズミ科動物への変化を有 する“完全グラフト”生産物、すなわちｇｈ３４１Ａ　（ＪＡ１８５）と共に発 現したｇＬ２２１Ｃを、ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞を用い、ネズミ科動物０Ｋ７３基準 スタンダードに対する競合分析で比結合親和性をアッセイした。用いたアッセイ は上に３．３節で記載したとおりてあった。得られた結果を基本的グラフト生産 物について図１２に、完全グラフト生産物について図１３に示す。これ等の結果 は、基本的なグラフト生産物は０ＫＴ３ネズミ科動物基準スタンダードと比へ比 較的良くない結合能力を有し、一方“完全にグラフトした”生産物は、０ＫＴ３ ネズミ科動物基準スタンダードのそれに非常に似た結合能力を有することを示す 。

結合およびブロッキング分析は次のことを示す。ＪＡ１９８およびＪＡ２０７構 造物は最良の結合特性と類似の結合能力を有するようであり、両者は実質的にキ メラおよび完全にグラフトしたｇＨ３４１Ａ生産物と同じである。これは、位置 ８８および９１、並びに位置７６は０ＫＴ３結合能力を維持するのに非常に重要 ではなく、一方、位ｒＩｔ６．２３．２４．４８．４９．７１．７３および７８ のうちの少くともいくつかが重要であることを示す。

これは、ＪＡ２０９およびＪＡ　１９９が、互いに同様の結合能力を存するか、 ＪＡＩ９８およびＪＡ２０７構造物より低い結合能力を有するという発見により 支持される。これは、ＪＡ１９９およびＪＡ２０９構造物では完全かまたは部分 的にヒトである位置７１．７３、および７８で、マウスの残基を有することの重 要性を示す。

さらにＪＡ２０５およびＪＡ１８３構造物について得られた結果を比較して、Ｊ Ａ２０５からＪＡ　１８３構造物に行く結合の減少か存在することかわかる。こ れは位置２３、ＪＡ２０５とＪＡ１８３の間で変化した唯一の位置、てマウス残 基を保持することの重要性を示す。

これらのおよび他の結果は、ｇＨ３４１Ａ　（ＪＡ　ｌ　８５）構造物で用いた １１のマウスのフレームワーク残基のうち、位置６．２３．２４．４８、および ４９のすべて、そして最大のアフィニティのためには位置７１．７３、および７ ８でマウス残基を保持することが重要であるこの結論に我々を導いた。

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ＣＤＲグラフト人体適応性抗体を調製するためのプロトコールが示されており、 そこでは、ＣＤＲ非ヒト抗体残基に加えて、重鎮可変領域の２３．２４．４９． ７１，７３及び７８の位置及び軽鎖可変領域の４６．４８．５８及び７１の位置 で好ましく用いられる。組換え、特に人体適応性抗ＣＤ３抗体はｉｎ　ｖｉｖｏ 治療及び診断に用いられる。

手続補正書山発） 平成３年　９月１９日

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. １．ドナーの抗ＣＤ３抗体のＨおよび／またはＬ鎖可変領域から誘導された抗原 結合領域を含み、抗ＣＤ３結合特異性を有する組み換え抗体分子。
2. ２．ＯＫＴ３に類似の抗ＣＤ３結合親和性を有する、請求項１に記載の組換え抗 体分子。
3. ３．キメラ抗体である、請求項１または２に記載の組換え抗体分子。
4. ４．ＣＤＲグラフト抗体である請求項１または２に記載の組換え抗体分子。
5. ５．人体適応性抗体分子である、任意の先行請求項に記載の組換え抗体分子。
6. ６．アクセプターのフレームワークとドナーのＣＤ３結合領域を含み該フレーム ワークが位置６、２３および／または２４、４８および／または４９、７１およ び／または７３、７５および／または７６および／または７８および８８および ／または９１の少なくとも一でドナー残基を含む、可変領域を有する、請求項４ に記載のＣＤＲ−グラフト抗体Ｈ鎖。
7. ７．位置２３、２４、４９、７１、７３および７８、または位置２３、２４およ び４９で、ドナー残基を含む、請求項６に記載のＣＤＲグラフトＨ鎖。
8. ８．位置２、４、６、２５、３６、３７、３９、４７、４８、９３、９４、１０ ３、１０４、１０６および１０７でドナー残基を含む、請求項７に記載のＣＤＲ グラフトＨ鎖。
9. ９．位置 １および３、 ６９（４８がドナーとアクセプター間で異るなら）３８および４６（４８がドナ ー残基なら）６７、 ８２および１８（６７がドナー残基なら）９１、および ９、１１、４１、８７、１０８、１１０および１１２の任意の一以上 の一つ、いくつかまたはすべてでドナー残基を含む請求項７または８に記載のＣ ＤＲグラフトＨ鎖。
10. １０．位置２６〜３５、５０〜６５および９５〜１００でドナーＣＤＲを含む、 請求項４または６〜９の任意の−に記載のＣＤＲグラフトＨ鎖。
11. １１．アクセプターのフレームワークとドナーの抗原結合領域を含み、該フレー ムワークが位置１および／または３および４６および／または４７の任意の−で ドナー残基を含む、可変領域を有する請求項４に記載のＣＤＲグラフト抗体Ｌ鎖 。
12. １２．位置４６および４７でドナー残基を含む、請求項１１に記載のＣＤＲグラ フトＬ鎖。
13. １３．アクセプターのフレームワークとドナーの抗原結合領域を含み、該フレー ムワークは位置４６、４８、５８および７１の少くとも−でドナー残基を含む、 可変領域を有する、請求項４に記載のＣＤＲグラフト抗体Ｌ鎖。
14. １４．位置４６、４８、５８および７１でドナー残基を含む、請求項１３に記載 のＣＤＲグラフトＬ鎖。
15. １５．位置２、４、６、３５、３６、３８、４４、４７、４９、６２、６４〜６ ９、８５、８７、９８、９９、１０１および１０２でドナー残基を含む、請求項 １１または１３に記載のＣＤＲグラフトＬ鎖。
16. １６．位置 １および３、 ６３、 ６０（６０および５４が塩橋を生成できる可能性あるなら）、 ７０（７０および２４が塩橋を生成できる可能性あるなら）、 ７３および２１（４７がドナーとアクセプター間で異るなら）、 ３７および４５（４７がドナーとアクセプター間で異るなら）、 そして、１０、１２、４０、８３、１０３および１０５の任意の一以上 の一つ、いくつかまたはすべてでドナー残基を含む、請求項１１、１３、または １５の任意の一に記載のＣＤＲグラフトＬ鎖。
17. １７．位置２４〜３４、５０〜５６および８９〜９７でドナーＣＤＲを含む、請 求項４または１１〜１６の任意の一に記載のＣＤＲＬ鎖。
18. １８．請求項６〜１０の任意の−に記載の少くとも−のＣＤＲグラフトＨ鎖、お よび請求項１１〜１７の任意の−に記載の少くとも−のＣＤＲグラフトＬ鎖を含 む、ＣＤＲグラフト抗体分子。
19. １９．ヒトアクセプター残基と非ヒトドナー残基を含む、請求項６〜１８の任意 の一に記載のＣＤＲグラフト抗体ＨまたはＬ鎖。
20. ２０．請求項１に記載の組換え抗体、請求項５に記載の人体適応性抗体、請求項 ６に記載のＣＤＲグラフトＨ鎖、または請求項１１若しくは請求項１３に記載の ＣＤＲグラフトＬ鎖をコードするＤＮＡ配列。
21. ２１．請求項２０に記載のＤＮＡ配列を含むクローニングまたは発現ベクター。
22. ２２．請求項２０に記載のＤＮＡ配列で形質転換した宿主細胞。
23. ２３．形質転換する宿主細胞中で、請求項２０に記載のＤＮＡ配列を発現するこ とよりなる、抗ＣＤ３ＣＤＲグラフト抗体生産物の製造方法。
24. ２４．（ａ）請求項６に記載の抗体Ｈ鎖をコードするＤＮＡ配列を有するオペロ ンを発現ベクター中に作り、そして／または （ｂ）請求項１１または請求項１３に記載の相補的抗体Ｌ鎖をコードするＤＮＡ 配列を有するオペロンを発現ベクター中に作り、 （ｃ）その、または各ベクターを宿主細胞にトランスフェクトし、 そして （ｄ）トランスフェクトした細胞系を培養して、ＣＤＲグラフト抗体生産物を製 造する、ことよりなる、抗ＣＤ３ＣＤＲグラフト抗体生産物の製造方法。
25. ２５．請求項１に記載の組換え抗体分子、請求項５に記載の人体適応性抗体、請 求項６に記載のＣＤＲグラフト抗体Ｈ鎖、請求項１１または１３に記載のＣＤＲ グラフトＬ鎖、または請求項１８に記載のＣＤＲグラフト抗体分子を、薬学的に 受容し得るキャリア、希釈剤、または賦形剤と組み合せた、治療用または診断用 組成物。
26. ２６．有効量の、請求項１に記載の組換え抗体分子、請求項５に記載の人体適応 性分子、請求項６に記載のＣＤＲグラフトＨ鎖、請求項１１または請求項１３に 記載のＣＤＲグラフトＬ鎖、または請求項１８に記載のＣＤＲグラフト抗体分子 を、ヒトまたは動物に投与することよりなる治療または診断方法。