JPH04505398A - 人体化抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ２０、［請求項１７Ｊ記載のＣＤＲ接木抗体配列の形質転換宿主細胞中における 製造方法。

２１、（ａ）　ｒ請求項１」記載の抗体重鎮をコードするＤＮＡ配列を存するオ ペロンを発現ベクター中に製造する工程、および／または（ｂ）「請求項６また は８」記載の相補性抗体軽鎖をコードするＤＮＡ配列を有するオペロンを発現ベ クター中に製造する工程、（Ｃ）上記ベクターの一方またはそれぞれで宿主細胞 をトランスフェクトする工程、ならびに（ｄ）トランスフェクトした細胞系を培 養してＣＤＲ接木抗体生成物を産生させる工程からなる、ＣＤＲ接木抗体生成物 の製造方法。

２２、「請求項１」記載のＣＤＲ接木抗体重鎖、または「請求項６もしくは８」 記載のＣＤＲ接木軽鎖、または「請求項１３」記載のＣＤＲ接木抗体分子を医薬 的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と配合してなる治療用または診断用組 成物。

２３、「請求項１」記載のＣＤＲ接木重鎮、または「請求項６もしくは８」記載 のＣＤＲ接木軽鎖、または「請求項１３」記載のＣＤＲ接木抗体分子の有効量を ヒトまたは動物対象に投与することからなる治療または診断方法。

明　細　書 本発明は、人体抗体分子、組換えＲＮＡ技術を用いるそれらの製造方法、および それらの治療的利用に関する。

「人体抗体分子」の語は、非ヒト種の免疫グロブリンから誘導される抗原結合部 位を有し、なおヒト免疫グロブリンから誘導される分子の免疫グロブリン由来部 分を残す分子を意味して用いられる。抗原結合部位は通常、抗体分子の結合特異 性を決定し、可変ドメイン中の適当な枠組み上に保持される相補性決定領域（Ｃ ＤＲ）からなる。

軽鎖および重鎮の各可変ドメインに３個のＣＤＲ（ＣＤＲ１゜ＣＤＲ２およびＣ ＤＲ３）がある。

以下の記述中、多数の文献を番号で引用する。文献は、この記述の末尾に番号順 に掲げる。

発明の背景 天然の免疫グロブリンが、酵素的切断によって誘導できる、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’ 　）！　およびＦｃフラグメントのような様々なフラグメントを有することは何 年も前から知られている。天然の免疫グロブリンは一般に、各上腕の末端に向け て抗原結合部位を有するＹ型の分子からなる。その構造の残部、とくにＹ型の幹 部が、免疫グロブリンに関連するエフェクター機能を仲介する。

天然の免疫グロブリンは、アッセイ、診断、および、限られた範囲であるが、治 療に用いられてきた。しかしながら、このような、とくに治療への利用は、最近 まで、天然免疫グロブリンのポリクローナル性によって邪魔されていた。免疫グ ロブリンの治療剤としての可能性の実現に向けられた重要な一歩は、特定の特異 性を有するモノクローナル抗体（Ｍａｂ）の製造方法の発見であった（１）。

しかしながら、大部分のＭＡｂは、げっ歯頚牌臓細胞のげっ歯ミエローマ細胞と の融合細胞であるハイブリドーマによって製造される。したがって、それらは、 本質的にげっ歯頚蛋白質である。ヒトＭＡｂの製造の報告はきわめて少ない。

大部分の利用可能なＭＡｂはげっ歯頚起源であることから、それらはヒトには当 然、抗原性であり、その結果、ＨＡＭＡ　（ヒト抗マウス抗体）応答と呼ばれる 、望ましくない免疫応答を生じることがある。したがって、げっ歯頚ＭＡｂをヒ トの治療剤として使用することには、ヒト対象がこのＭＡｂに対する免疫学的反 応を装備していて、その効果を完全に除去するかまたは少なくとも減弱させると いう事実によって、本来的に限定されることになる。実際、げっ歯頚起源のＭＡ ｂは、ＨＡＭＡ応答か間もなく起こって、ＭＡｂを無効にすると同時に望ましく ない反応を生じるので、患者には、１回または数回の処置以上、使用すべきでは ない。たとえば、Ｔ細胞受容体−ＣＤ３複合体中の抗原を認識するＯＫＴ　３マ ウス［ｇＧ　２ａ／ｋ　ＭＡｂは全世界を通じて多くの国で、急性の同種移植片 拒絶反応の処置に際し免疫抑制剤としての使用が承認されている。

ＣＣｈａｔｅｎｏｕｄら（２）およびＪｅｆｆｅｒｓら（３）　）　、しかしな がら、これおよび他のこの種類のＭＡｂては、そのげっ歯頚起源の性質から、主 要抗−イディオタイプ成分を含めた、重篤なＨＡＭＡ抗体応答が使用時に形成さ れる。この望ましくないＨＡＭＡ応答を減弱または消失させ、これらのきわめて 存用な抗体の使用領域を拡大することが、きわめて望ましいことは明白である。

したがって、非ヒト抗体のヒトでの抗原性を低下させる提案は、これまでにもな されてきた。このような技術は、一般的に、「人体化（ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏ ｎ）　Ｊ技術と呼ぶことができる。これらの技術は通常、抗体分子のポリペプチ ド鎖をコードするＤＮＡ配列を操作するための組換えＤＮＡ技術を包含する。

ＭＡｂを人体化する初期の方法は、ある抗体の全可変ドメインからなる抗原結合 部位を、他の抗体由来の定常ドメインに連結する、キメラ抗体の製造によるもの であった。このようなキメラ化操作の実施方法は、Ｅ　Ｐ　０１２０６９４　（ Ｃｅｌｌｔｅｃｈ　Ｌｉｍ１ｔｅｄ）。

Ｅ　Ｐ　Ｏ１２５０２３（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ　ＩｎｃおよびＣ１ｔｙ　ｏｆＨ ｏｐｅ）、ＥＰ−Ａ−０１７１４９６（Ｒｅｓ、Ｄｅｖ、Ｃｏｒｐ、、日本）　 、ＥＰ−Ａ　−０１７３４９４（Ｓｔａｎｆｏｒｄ大学）およびＷＯ８６／　０ １５３３　（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ　Ｌｉｍ１ｔｅｄ）に記載されている。この最後 のＣｅ１ｌｔｅｃｈの出願（ＷＯ８６１０１５３３）には、マウスＭＡｂ由来の 可変ドメインとヒト免疫グロブリン由来の定常ドメインを有する抗体分子の製造 方法が開示されている。しかしながら、このような人体化キメラ抗体は、まだ、 かなりの部分の非ヒトアミノ酸配列、すなわち完全な非ヒト可変ドメインを含存 し、したかって、とくに長期に投与すると、なおある種のＨＡＭＡ応答を引き起 こすことがあるＣＢｅｇｅｎｅｔら（４）〕。

〕ＥＰ−Ａ−０２３９４０に記載された別のアプローチでは、マウスＭＡｂの相 補性決定領域（ＣＤＲ）が、ヒト免疫グロブリンの可変ドメインの枠組み領域に 、長いオリゴヌクレオチドを用いる特定部位の突然変異誘発によって接木される 。本発明は、この別のアプローチ、すなわちＣＤＲ接木人体化抗体分子に従って 製造される人体化抗体に関する。このようなＣＤＲ接木人体化抗体は、人体化キ メラ抗体に比べて、含有する非ヒトアミノ酸配列の割合がはるかに低いことから 、ＨＡＭＡ応答も著しく起こりにくい。

ＣＤＲ接木によるＭＡｂの人体化の初期の研究は、ＭＡｂ認識合成抗原、たとえ ばＮＰまたはＮＩＰ抗原に対して行われた。しかしながら、リゾチームを認識す るマウスＭＡｂおよびヒトＴ細胞上の抗原を認識するラットＭＡｂをＣＤＲ接木 で人体化した例が、それぞれＶｅｒｈｏｅｙｅｎら（５）およびＲｉｅｃｈｍａ ｎｎら（６）によって記載されている。ヒトＴ細胞上の抗原にＣＤＲ接木された 抗体の製造はＷＯ８９１０７４５２（Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｏ ｕｎｃｉｌ）にも記載されている。

Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ　ら／Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｏｕｎｃｉｌ は、ＣＤＲ領域単独の移入（Ｋａｂａ　ｔ　（７）および（８）によって定義さ れたような〕ではＣＤＲ接木生成物に満足できる結合活性を与えるのに十分でな いことを見出した。Ｒｉｅｃｈｍａｎｎらは、抗原結合活性が改良されたＣＤＲ 接木生成物を得るには、ヒト配列の位置２７におけるセリン残基を相当するラッ トフェニルアラニン残基に変換することが必要なことを明らかにした。重鎮の位 置２７におけるこの残基は、ＣＤＲｌに隣接する構造ループ内にある。さらに重 鎖の位置３０にヒトセリンのラットチロシンへの変化を含有する構築体は、位置 ２７にセリンのフェニルアラニンへの変化だけをもつ人体化抗体には存意な結合 活性への変化゛はなかった。これらの結果は、ＣＤＲ領域の外側のヒト配列、と くにＣＤＲ１に隣接する構造ループの残基への変化が、さらに複雑な抗原を認識 するＣＤＲ接木抗体に有効な抗原結合活性を達成するのに必須であることを示し ている。それでも、得られた最良のＣＤＲ接木抗体の結合親和性は、元のＭＡｂ よりもまだ有意に低かった。

ごく最近になって、Ｑｕｅｅｎら（９）は、マウスＭＡｂ　（抗−Ｔａｃ）のＣ ＤＲを、ヒト免疫グロブリン枠組みおよび定常領域と結合させることによる、イ ンターロイキン−２に結合する人体化抗体の製造を報告した。ヒト枠組み領域は 、抗−Ｔａｃ　ＭＡｂ配列とのホモロジーが最大になるように選択された。さら に、ＣＤＲまたは抗原と相互作用しやずいと思われる枠組みアミノ酸残基を同定 するためにコンピューターモデリングを使用し、人体化抗体のこれらの位置にマ ウスアミノ酸を用いた。

Ｗ０９０１０７８６１に、Ｑｕｅｅｎらは、人体化免疫グロブリンの設計の４つ の基準を提起している。第一の基準は、ヒトアクセプターとして、人体化すべき 非ヒトドナー免疫グロブリンと異常にホモロジーの高い特定のヒト免疫グロブリ ンからの枠組みを使用するか、または多くのヒト抗体からの一致した枠組みを用 いることである。

第二の基準は、ヒトアクセプター残基が異常で、ドナー残基は、枠組みの特定の 残基においてヒト配列に典型的である場合には、アクセプターよりもむしろドナ ーアミノ酸を使用することである。第三の基準は、ＣＤＲに直接隣接する位置に はアクセプターよりもドナーの枠組みアミノ酸残基を使用することである。第四 の基準は、三次元免疫グロブリンモデルにおいてＣＤＲの約３人以内に側鎖原子 をもち、抗原または人体化免疫グロブリンのＣＤＲと相互作用可能なことが予測 される枠組み位置には、ドナーアミノ酸残基を使用することである。基準２，３ または４は基準１に加えて、またはそれに代えて適用され、単一でまたは任意の 組合せで適用できると提案されている。

Ｗ０９０１０７８６１には、単−ＣＤＲ接木人体化抗体、ＩＬ−２受容体のｐ　 ５５　Ｔａｃ蛋白質に特異性を有する人体化抗体の製造が詳細に記載されている 。上述の４つのすべての基準の組合せがこの人体化抗体の設計に採用され、ヒト 抗体Ｅ　ｕ　（７）の可変領域枠組みかアクセプターとして使用された。得られ た人体化抗体では、ドナーＣＤＲはＫａｂａｔら（７および８）によって定義さ れた通りで、さらに、可変領域枠組みの重鎮２７，３０．４８゜６６．６７．８ ９，９１．９４，１０３，１０４゜１０５および１０７位置、ならびに軽鎖の位 置４８゜６０および６３に、ヒトアクセプター残基に代えてマウスドナー残基か 使用された。得られた人体化抗−Ｔａｃ抗体は、３Ｘ１０’Ｍ−’の９５５に対 してマウスＭＡｂの場合の約３分の１の親和性をもつことが報告されている。

本発明者らは、さらにＣＤＲ接木人体化抗体分子の製造について検討し、満足で きる結合親和性を育するＣＤＲ接木生成物を得るために残基のアミノ酸の独自性 が重要な可変領域の枠組み内（すなわち、ＫａｂａｔのＣＤＲおよび可変領域の 構造ループ、両者の外側）の位置の階層体系を同定した。これにより、ドナー免 疫グロブリンとアクセプター枠組みの間のホモロジーのレベルとは無関係に、広 範囲に適用できる、満足できるＣＤＲ接木生成物を得るためのプロトコールを確 立することを可能にした。きわめて重要なものとして本発明者らが同定した残基 のセットは、Ｑｕｅｅｎら（９）によって同定された残基とは一致ししたかって 、本発明は第一の態様においては、重鎮かアクセプターの枠組みとドナーの抗原 結合領域からなる可変領域ドメインを存し、枠組みは位置６，２３および／また は２４．４８および／または４９．７１および／または７３．７５および／また は７６および／または７８ならびに８８および／または９１の少なくとも１つで ドナー残基からなるＣＤＲ接木抗体を提供する。好ましい実施態様においては重 鎮枠組みは、位置２３，２４，４９．７１．７３および７８または位置２３．２ ４および４９においてドナー残基からなる。重鎮枠組みの位置７１．７３および ７８の残基はすべてアクセプターまたはすべてドナー残基のいずれかであること が好ましい。

とくに好ましい実施態様においては、重鎮の枠組みはさらに、位置６．３７．４ ８および９４の一つ、一部またはすべてにおいてドナー残基からなる。また、種 を越えて共通に保存されている重鎮枠組みの位置、すなわち位置２．４，２５． ３６．３９．４７，９３，１０３゜１０４．１０６および１０７の残基がドナー とアクセプター間で保存されていない場合には、さらにドナー残基とすることが とくに好ましい。重鎮枠組みはさらに、位置２．４．６．２５．３６．３７．３ ９．４７．４８゜９３．９４，１０３，１０４．１０６および１０７でドナー残 基からなることが最も好ましい。

加えて、重鎮枠組みは、以下の一つ、一部またはすべての位置がドナー残基であ ってもよい。すなわち、ｌおよび３． ７２および７６． ６９（４８かドナーとアクセプターで異なる場合）、３８および４６　（４８が ドナー残基の場合）、８０および２０（６９がドナー残基の場合）、６７． ８２および１８（６７かドナー残基の場合）、９１． ８８、ならびに ９、ＩＩ、４１．８７，１０８．１１０および１１２の１個または２個以上であ る。

本発明の第一のおよび他の態様においては、アクセプターの枠組みおよびドナー 抗原結合領域からなるＣＤＲ接木抗体生成物について論及する。本発明は一般的 に抗体のＣＤＲ接木に広く適用可能なことが明らかであろう。したがって、ドナ ーおよびアクセプター抗体は、同種の動物、また同じクラスもしくはサブクラス の抗体に由来するものであってもよい。しかしながら、通常は、ドナーおよびア クセプター抗体は異種の動物に由来する。典型的には、ドナー抗体は、非ヒト抗 体たとえばげつ歯頚ＭＡｂ　、アクセプター抗体はヒト抗体に由来する。

第一のおよび他の本発明の態様においては、ドナー抗原結合領域は通常、ドナー 抗体からの少なくとも１個のＣＤＲからなる。通常、ドナー抗原結合領域は、重 鎖および／または軽鎖可変領域のそれぞれの３個のＣＤＲの少なくとも２個、好 ましくはすべてからなる。このＣＤＲは、ＫａｂａｔのＣＤＲ、構造ループＣＤ ＲまたはＫａｂａｔと構造ループＣＤＲの構成物、およびこれらの任意の組合せ からなる。

好ましくは、ＣＤＲ接木重鎮可変ドメインの抗原結合領域は、ＣＤＲ２（残基５ ０〜６５）およびＣＤＲ３Ｃ残基９５〜１ＯＯ）におけるＫａｂａｔ　ＣＤＲな らびにＣＤＲｌ　（残基２６〜３５）におけるＫａｂａｔと構造ループＣＤＲの 構成物に相当するＣＤＲからなることが好ましい。

上述のおよび本明細書の他の記述における残基の名称は、Ｋａｂａｔのナンバリ ングに従って〔（７）および（８）〕番号を付している。したがって、残基の名 称はアミノ酸残基の直線的なナンバリングとは必ずしも一致しない。

現実の直線状アミノ酸配列は、枠組みまたはＣＤＲのいずれであれ、基本的な可 変ドメイン構造の短縮化またはそれへの挿入に相当する、厳密な［ａｂａｔのナ ンバリングにおける以外の少ないまたは付加的なアミノ酸を含有することがある 。たとえば、Ｑｕｅｅｎら（９）によって報告された抗−Ｔａｃ抗体の重鎖可変 領域は、Ｋａｂａｔのナンバリングで、ＣＤＲ２の残基５２の次に単一アミノ酸 挿入（残基５２ａ）と枠組み残基８２の次に３個のアミノ酸挿入（残基８２ａ、 ８２ｂおよび８２Ｃ）を含有する。正しいＫａｂａｔのナンバリングは、「標準 的Ｊ　Ｋａｂａｔナン１＜　−の配列との抗体の配列のホモロジー領域における 整合によって、与えられた抗体について決定される。

本発明はまた、第二の態様において、アクセプターの枠組みとドナーの抗原結合 領域からなる可変領域ドメインを軽鎖が存し、この場合枠組みは位置ｌおよび／ または３ならびに４６および／または４７の少なくとも１１！ｉ所でドナー残基 をもつＣＤＲ接木抗体を提供する。第二の態様のＣＤＲ接木軽鎖は位置４６およ び／または４７でドナー残基からなることか好ましい。

本発明はまた、第三の態様において、軽鎖かアクセプターの枠組みとドナーの抗 原結合領域からなる可変領域ドメインを有し、この場合枠組みは位置４６，４８ ゜５８および７１の少なくとも１箇所でドナー残基からなるＣＤＲ接木抗体を提 供する。

第三の態様の好ましい実施態様においては、枠組みは位置４６，４８．５８およ び７Ｉのすべてでドナー残基からなる。

第二および第三の態様のとくに好ましい実施態様においては、枠組みはさらに、 位置３６，４４，４７．８５および８７においてドナー残基からなる。種を越え て共通に保存されている軽鎖枠組の位置、すなわち位置２゜４．６，３５，４９ ，６２．６４〜６９．　９８．　９９゜１０１および１０２は同様に、ドナーと アクセプターの間で保存されていない場合には、さらにドナー残基からなる。最 も好ましい軽鎖枠組みは、さらに、位置２，４゜６．３５，３６，３８，４４， ４７，４９，６２．６４〜６９．８５，８７，９８，９９．１０１および１０２ においてドナー残基からなる。

さらに、第二または第三の態様の枠組みは、以下の位置の一つ、一部またはすべ てにおいて、ドナー残基からなっていてもよい。すなわち、 ｌおよび３． ６３． ６０（６０と５４か潜在的塩橋を形成できる場合）、７０（７０と２４が潜在的 塩橋を形成できる場合）、７３および２１（４７がドナーとアクセプターの間で 異なる場合）、 ３７および４５（４７かドナーとアクセプターの間で異なる場合）、ならびに １０．１２．４０．８０．１０３および１０５の１個または２個以上である。

ＣＤＲ接木重鎮可変ドメインの抗原結合領域は、ＣＤＲ１（残基２４〜３４）、 ＣＤＲ２（残基５０〜５６）、およびＣＤＲ３（残基８９〜９７）におけるＫａ ｂａｔ　ＣＤＲに相当するＣＤＲからなる。

本発明はさらに第四の態様において、本発明の第一および第二または第一および 第三の態様による少なくとも１つのＣＤＲ接木重鎖および少なくとも１つのＣＤ Ｒ接木軽鎖からなるＣＤＲ接木抗体分子を提供する。

本発明の人体化抗体分子および鎖は、完全長の重鎮および軽鎖を有する完全抗体 分子；そのフラグメント、たとえばＦａｂ　、　（Ｆａｂ’　）　２もしくはＦ Ｖフラグメント；軽鎖もしくは重鎮モノマーもしくはダイマー；または、たとえ ば重鎮および軽鎖可変領域かペプチドリンカ−て連結されている単一鎖ＦＶのよ うな単一鎖抗体、または元のドナー抗体と同じ特異性を有する他の任意のＣＤＲ 接木分子からなるものとすることができる。同様にＣＤＲ接木重鎖および軽鎖可 変領域は、適宜、他の抗体ドメインに結合させることができる。

また、本発明の重鎮もしくは軽鎖または人体化抗体分子は、それらにエフェクタ ーまたはレポーター分子を結合させてもよい。たとえば、それは、貴金属原子ま たはトキシンたとえばリシンをキレートするため、それに共有結合橋構造によっ て結合されたマクロサイクルをもっていてもよい。別法として、完全免疫グロブ リン分子のＦｃフラグメントまたはＣＨ３ドメインが、機能的非免疫グロブリン 蛋白質たとえば酵素またはトキシン分子によって置換された、またはそれにペプ チドリンカ−を介して結合された免疫グロブリン分子の製造には、組換えＤＮＡ 技術を使用できる。

抗原結合領域が誘導されるドナー抗体のクラス／タイプに関連して、任意の適当 なアクセプター可変領域枠組み配列か使用できる。使用されるアクセプター枠組 みのタイプは、ドナー抗体と同一／類似のクラス／タイプであることが好ましい 。この枠組みは、ドナー抗体配列とのとくにＣＤＲに近接または隣接した位置で のホモロノーを最大／至適化するように選択するのか便利である。しかしながら 、本発明の応用には、ドナーおよびアクセプターの配列の間の高レベルのホモロ ジーは重要ではない。

本発明は、満足できる結合特性を存するＣＤＲ接木抗体生成物を得るためにドナ ー残基が重要なまたは望ましい枠組み残基位置の階層を確認する。ＣＤＲ接木生 成物は通常、少なくとも１０’Ｍ−’、好ましくは少なくとも約１０’Ｍ−’、 マタ＋１−＜ｌ：１０”　−１０”　Ｍ−’（７）範囲ノ結合親和性を有する。

原則として、本発明は、ドナーおよびアクセプター抗体のいかなる組合せにも、 それらの配列の間のホモロジーのレベルとは無関係に適用できる。

特定のドナー−アクセプター抗体対に本発明を適用する場合のプロトコールを以 下に示す。使用できるヒト枠組みの例には、ＫＯＬ　、　ＮＥＷＭ　、　ＲＥ！ Ｉ　、　ＥＵ　、　ＬＡＹおよびＰＯＭ（４および５）等がある。たとえば重鎖 にはＫＯＬおよびＮＥＷＭ　、軽鎖にはＲＥＩ　、重鎖および軽鎖の両者にはＥ Ｕ　。

ＬＡＹおよびＰＯＭである。

また、本発明の生成物の定常領域ドメインは、提案された抗体の機能、とくに必 要なエフェクター機能に関連して選択される。たとえば、定常領域ドメインはヒ ト［ｇＡ　、　［ｇＥ　、　ｔｇＧまたは［ｇＭ　ドメインとすることができる 。とくに、人体化抗体分子が治療的使用を意図され、抗体エフェクター機能が要 求される場合には、ＩｇＧヒト定常領域ドメイン、とくにｒｇＧ　１およびＩｇ Ｇ　３アイソタイプの領域が使用できる。また、人体化抗体が治療目的を意図す るもので、抗体エフェクター機能は要求されていない場合、たとえばリンホカイ ン活性の単純な遮断の場合には、ＩｇＧ　２および［ｇＧ　４アイソタイプも使 用てきしかしなから、抗体分子の残部は免疫グロブリンからの蛋白質配列のみか らなる必要はない。たとえば、遺伝子は、ヒト免疫グロブリン鎖の部分をコード するＤＮＡか、機能性ポリペプチドたとえばエフェクターまたはレポーター分子 のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列に融合させて構築されてもよい。

ＣＤＲ接木抗体重鎮および軽鎖ならびに抗体分子生成物は、組換えＤＮＡ技術に よって製造されるのが好ましい。

したがって、本発明はさらに他の態様において、ＣＤＲ接木重鎖および軽鎖をコ ードするＤＮＡ配列、このＤＮＡを含有するクローニングおよび発現ベクター、 このＤＮＡ配列で形質転換された宿主細胞、ならびに形質転換宿主細胞中のＤＮ Ａ配・列を発現させることからなるＣＤＲ接木鎖および抗体分子の製造方法も包 含する。

ベクターを構築する一般的方法、トランスフェクション方法および培養方法はそ れ自体よく知られていて、本発明の部分を形成するものではない。このような方 法はたとえば文献１０および１１に示されている。

ドナーのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列は、本技術分野においてよく知ら れた方法によって得られる。たとえば、ドナークローニング配列はゲノムクロー ニング、または適当なハイブリドーマ細胞系からのｃＤＮＡクローニングによっ て得ることができる。陽性クローンは、問題の重鎮および軽鎖に対する適当なプ ローブを用いてスクリーニングできる。ＰＣＲクローニングも使用できる。

アクセプター、たとえばヒトアクセプター配列をコードするＤＮＡは、任意の適 当な方法で得ることかできる。

たとえば、ＫＯ＋５．　ＲＥ［、ＥＵおよびＮＥＷＭのような好ましいヒトアク セプター枠組みをコードするＤＮＡ配列は、本技術分野の研究者に広く利用され ている。

ＣＤＲ接木生成物をコードするＤＮＡ配列を製造するためには、分子生物学の標 準的技術を使用できる。所望のＤＮＡ配列は、全部または一部を、オリゴヌクレ オチド合成技術を用いて合成できる。特定部位の突然変異およびポリメラーゼ連 鎖反応（ＰＣＲ）技術も適宜使用できる。たとえば、Ｊｏｎｅｓら（２０）によ って報告されたようなオリゴヌクレオチド指図合成を使用できる。また、たとえ ばＶｅｒｈｏｅｙｅｎら（５）またはＲｉｅｃｈｍａｎｎら（６）によって記載 されたような既存可変領域の特定オリゴヌクレオチドの突然変異も使用できる。

また、たとえばＱｕｅｅｎら（９）によって記載されたようなＴ、　ＤＮＡポリ メラーゼを用いるギャップオリゴヌクレオチドの酵素的充填も使用できる。

ＣＤＲ接木重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡ配列の発現には、任意の適当な宿 主細胞／ベクター系が使用できる。

とくに、抗体フラグメントたとえばＦａｂおよび（Ｆａｂ’　）２　フラグメン ト、ならびにとくにＦＶフラグメントおよび単一鎖抗体フラグメントたとえば単 一鎖ＦＶの発現には、細菌たとえば大腸菌および他の微生物の系が使用される。

完全抗体分子を含めたもっと大きいＣＤＲ接木抗体生成物の製造には、真核細胞 たとえば哺乳動物宿主細胞発現系か使用される。適当な哺乳動物宿主細胞にはＣ ＨＯ細胞およびミエローマまたはハイブリドーマ細胞系が包含される。

すなわち、本発明はさらに他の態様において、（ａ）本発明の第一の態様による 抗体重鎮をコードするＤＮＡ配列を有するオペロンを、発現ベクター内に作成し 、および／または （ｂ）本発明の第二もしくは第三の態様による相補性抗体軽鎖をコードするＤＮ Ａ配列を有するオペロンを、発現ベクター内に作成し、 （Ｃ）宿主細胞を上記の一方もしくは各ベクターでトランスフェクトし、 （ｄ）トランスフェクトされた細胞系を培養してＣＤＲ接木抗体生成物を産生さ せることからなる、ＣＤＲ接木抗体生成物の製造方法を提供する。

ＣＤＲ接木生成物は、重鎮または軽鎖由来のポリペプチドのみから構成されても よく、この場合には、重鎮または軽鎖ポリペプチドをコードする配列のみか宿主 細胞のトランスフェクトに使用される。重鎮および軽鎖の両者からなる生成物を 製造する場合には、細胞系は２種のベクターでトランスフェクトされる。第一の ベクターには軽鎖由来のポリペプチドをコードするオペロン、第二のベクターに は重鎮由来のポリペプチドをコードするオペロンを含有させることができる。両 ベクターは、コード配列および選択マーカーに関する部分を除けば同一で、可能 な限り各ポリペプチド鎖の同等な発現を確実にすることが好ましい。別法として 、単一のベクターを使用し、このベクターに、軽鎖および重鎮両者に由来するポ リペプチドをコードする配列を包含させることもできる。

軽鎖および重鎮のコード配列中のＤＮＡはｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡまたは その両者で構成されてもよい。しかしながら、重鎮または軽鎖をコードするＤＮ Ａ配列は、少なくとも一部かゲノムＤＮＡであることが好ましく、好ましくはｃ ＤＮＡとゲノムＤＮＡの融合体である。

本発明は、任意の適当な特異性の抗体に適用できる。

しかしなから、本発明は、ｉｎ　ｖｉｖｏ治療または診断に用いられる非ヒト抗 体の人体化に応用するのが育利である。

すなわち、抗体はｉｎ　ｖｉｖｏ治療または診断、たとえば腫瘍の画像化への使 用に適した、部位特異的抗体たとえば腫瘍特異的または細胞表面特異的抗体であ ってよい。細胞表面特異的抗体の例には、抗Ｔ細胞抗体たとえば抗−ＣＤ３、な らびにＣＤ４および接着分子、たとえばＣＲ３゜ＩＣＡＭおよびＥＬＡＭかある 。抗体は、インターロイキン（リンホカイン、成長因子および刺激因子を包含す る）、ホルモンおよび他の生物活性化合物、ならびにこれらのいずれかの受容体 に対する特異性を有するものであってよい。たとえば、抗体は、以下のいずれか 、すなわちインターフェロンα、β、γもしくはδ、［Ｌｌ、［Ｌ２、［Ｌ３゜ もしくは１シ４等、ＴＮＦ　、　Ｇ、Ｃ３Ｆ　、　ＧＭＣＳＦ　、εＰＯ、ｈＧ ）（またはインスリン等に対して特異性をもつことかできる。

本発明はまた、本発明のＣＤＲ接木生成物からなる治療用および診断用組成物、 ならびにこのような組成物の治療および診断における使用を包含する。

したかって、本発明はさらに他の態様において、本発明の前述の態様によるＣＤ Ｒ接木抗体重鎖もしくは軽鎖または分子からなり、医薬的に許容される担体、希 釈剤または賦形剤を配合した治療用または診断用組成物を提供する。

したがってまた、本発明は、本発明の前述の態様によるＣＤＲ接木抗体重鎖もし くは軽鎖または分子の有効量を、ヒトまたは動物対象に投与することからなる治 療または診断方法を提供する。

本発明によるＣＤＲ接木抗体Ｈ鎖およびＬ鎖を得るための好ましいプロトコール を、以下に、このプロトコールが導かれた理論的根拠とともに示す。このプロト コールおよび論理的根拠は、上に述べまた定義された本発明の一般性を損うもの ではない。

プロトコール まず最初に、ドナー抗体の重鎮および軽鎖可変領域をコードするＤＮＡのシクエ ンシングを行い、それらのアミノ酸配列を決定することが必要である。既知アミ ノ酸配列の適当なアクセプター重鎮および軽鎖可変領域を選択することも必要で ある。ついて、アクセプターの配列に基づいて、ＣＤＲ接木接木膜計される。ド ナーとアクセプターのアミノ酸残基が特定の位置において一致し、アクセプター の枠組み残基に変更の必要のない場合かあることに留意すべきである。

１、　最初の工程として、ＣＤＲ中のアクセプター残基をドナー残基で置換する 。この目的では、ＣＤＲは次のように定義されるのか好ましい。

重鎖−ＣＤＲ１：残基２６〜３５ −ＣＤＲ２：残基５０〜６５ −ＣＤＲ３、残基９５〜１０２ 軽鎖−ＣＤＲｌ　：残基２４〜３４ −ＣＤＲ２：残基５０〜５６ −ＣＤＲ３、残基８９〜９７ 枠組み中アクセプターをドナー残基で置換すべき位置は、ついで以下のように選 択する。まず重鎮について、ついで軽鎖に関して述へる。

２、重鎮 ２．１９重鎮の位置２３，２４．４９．７１．７３および７８のすべて、または 位置２３．２４および４９のすべてでドナー残基を選択する（７１．７３および ７８は常にすべてドナーかすべてアクセプターである）。

２．２．　ドナーおよびアクセプターの配列中、以下の位置が同じアミノ酸かど うかをチェックし、異なる場合はドナーを選択することが好ましい。位置は２， ４，６゜２５．３６，３７，３９．４７，４８，９３，９４゜１０３．１０４， １０６および１０７である。

２．３．　さらに親和性を至適化するために、以下の一つまたは一部の位置でド ナー残基の選択を考慮する。

ｉｉｉ、４８がドナーとアクセプターの配列間で異なる場合は、６９を考慮する ｉｖ、４８でドナー残基を選んだ場合は、３８および４６を考慮する ■、　６９でドナー残基を選んだ場合は、８０ついで２０を考慮する ｖｉ、６７ ｖｉｉ、　６７でドナー残基を選んだ場合は、８２ついて１８を考慮する ｘ、９，１１，４１，８７，１０８，１１０，１１２３、軽鎖 ３．１．　４６．４８．５８および７１てドナーを選択する ３、２、　ドナーとアクセプター配列間で以下の位置が同しアミノ酸かどうかを チェックし、異なる場合には、ドナーを選択することが好ましい。その位置は、 ２，４゜６．３５，３８，４４，４７，４９．６２．６４〜６９（前後を含む） 、８５．８７，９８，９９．１０１および１０２である。

３．３．　さらに親和性を至適化するために、以下の一つまたは一部の位置でド ナー残基の選択を考慮する。

ｉｉｉ、　６０と５４が潜在的塩橋を形成できる場合にはｉＶ、７０と２４が潜 在的塩橋を形成できる場合にはｖ、７３．およびドナーとアクセプター間で４７ が異なる場合には２１ ｖｉ、３７．およびドナーとアクセプター間で４７が異なる場合には４５ ｖｉｉ、１０，１２，４０，８０，１０３，１０５理論的根拠 抗体の結合部位を異なるアクセプターの枠組み中に移すためには、考慮が必要な 多くの因子がある。

１、　ＣＤＨの範囲 ＣＤＲ（相補性決定領域）は、抗体可変領域の様々な領域における変動性の解析 に基づいてＷｕ　＆　Ｋａｂａｔ　（４および５）によって定義された。各ドメ インについて３個のＣＤＲが確認された。軽鎖では、この配列は２４〜３４゜５ ０〜５６．８９〜９７（前後を含む）であり〔番号（よＫａｂａｔ（４）による 、Ｅｕインデックス〕、重鎮では、この配列は３１〜３５．５０〜６５および９ ５〜１０２（前後を含む）である。

抗体の構造か利用可能になったとき、これらのＣＤＲ領域は概して、軽鎖および 重鎮のβバレル枠組みから伸びるループ領域に相当することが明らかになった。

Ｈｌについてはループか２６〜３２（前後を含む）であった点て、Ｈ２ｔｌ”＋ Ｌループは５２〜５６、Ｌ２では５０〜５３で不一致はあった。しかしながら、 Ｈｌの例外を除いて、ＣＤＲ領域はループ領域を包含し、β鎖枠組みに及んでい た。Ｈｌては２６はセリンの傾向にあり、２７はフェニルアラニンまたはチロシ ン、残基２９は大抵の場合フェニルアラニンである。溶媒に曝露される表面残基 である残基２８および２９は抗原の結合に関与する可能性がある。したかって、 ＨＩＣＤＲの慎重な定義には、ループ領域および超可変成基３３〜３５の両者を 包含させるため、残基２６〜３５が包含されることになる。

ＣＤＲ−Ｈｌに残基３１〜３５の選択を用いたＲｉｅｃｈ−ｍａｎｎら（３）の 例は興味がある。効率的な抗原結合を生成するためには、残基２７もドナー（ラ ット）抗体から供給する必要がある。

抗原結合に寄与する非ＣＤＲ残基 入手可能なＸ線構造の調査によって、本発明者らは、正味抗原績に対して影響し 、それが実験で確認できる多数の残基を同定してきた。これらの残基は、多くの 群に細別できる。

２．１．　ＣＤＲの近隣の表面残基（Ｋａｂａｔら（７）におけるすへての番号 〕 ２．１．１．　重鎖−鍵残基は２３．７１および７３である。寄与の程度が低い 他の残基に１．３および７６かある。最後に、２５は通常保存されているが、異 なる場合にはマウスの残基を使用すべきである。

２、１．２．　軽鎖−ＣＤＲに近い多くの残基、たとえば６３゜６５．６７およ び６９は保存されている。保存されていれば、軽鎖のこの表面残基が大きな影響 をもっことはないと思われる。しかしなから、これらの位置におけるマウスの残 基か異常であれば、起こり得る寄与についてさらに詳細に解析することが有利で あろう。同じ（結合に寄与する他の残基はｌと３であり、また６ｏと７０も、こ れらの位置における残基がそれぞれ５４および２４と、すなわち６０＋５４．７ ０＋２４て塩橋を形成できる可能性がある場合には、結合に寄与する。

２．２．　ＣＤＲ付近のバッキング残基２．２．１．　重鎖−鍵残基は２４．４ ９および７８である。

他の鍵残基は、トリプトファンでなければ３６、アルギニンでなければ９４、グ リシンでなければ１０４および１０６、スレオニンでなければ１０７である。重 鎮の安定なバッキングにさらに寄与し、したかって親和性を改善する可能性があ る残基は、２，４，６．３８，４６゜６７および６９である。６７はＣＤＲ残基 ６３に対して充填され、この対は両者ともマウスかヒトのいずれかである。最後 に、この領域におけるバッキングに寄与するが、もっと長い範囲からの残基に１ ８．２０，８０．８２および８６かある。８２は６７に対して充填され、一方、 １８は８２に対して充填される。８０は６９に対して充填され、一方、２０は８ ０に対して充填される。８６は３８および４６とＨ結合ネットワークを形成する 。マウス−ヒトの差の多くはたとえばＬｅｕ−１１ｅのように小さなものである か、正しい充填に副次的な影響を与え、これがＣＤＲの変化した配置への翻訳を 招くことがあり得る。

２、２．２．　Ｌ鎖−鍵残基は４８．５８および７１である。

他の鍵残基は、グルタミンでなければ６、トリプトファンでなければ３５、フェ ニルアラニンもしくは千ロジンでなければ６２、グリシンでなければ６４，６６ ．６８゜９９および１０１、ならびにスレニオンでなければ１０２である。さら に寄与がある残基には、２，４゜３７．４５および４７がある。最後に、残基７ ３および２１および１９は、副次的な性質の長距離のバッキング寄与を生じるこ とがある。

２．３．　重鎮と軽鎖の間の可変ドメインインターフェースにおける残基−軽鎖 でも重鎮でも、非ＣＤＲインターフェース残基の大部分は保存されている。保存 残基が性質、たとえば大きさまたは電荷の異なる残基で置換されていれば、マウ ス残基としての保持を考慮しなければならない。

２．３．１．　重鎖−考慮が必要な残基は、バリンてはなく、もっと大きな側鎖 容量または電荷もしくは極性を有する場合の残基３７である。他の残基には、グ ルタミンてなければ３９、ロイシンでなければ４５、トリプトファンでなければ ４７、フェニルアラニンもしくはチロシンでなければ９１、アラニンでなければ ９３、ならびにトリプトファンでなければ１０３かある。残基８９もインターフ ェースにあるか、側鎖が大きな影響を与えるような位置ではない。

２、３．２．　軽鎖−考慮が必要な残基は、チロシンでなければ３６、グルタミ ンでなければ３８、プロリンでなければ４４．４６、チロシンでなければ４９、 残基８５、チロシンでなければ残基８７、ならびにフェニルアラニンでなければ ９８である。

２．４．　可変一定常領域インターフェース−可変領域と定常領域の間の屈曲角 は、可変領域内の鍵残基の定常領域に対するバッキングの変化によって影響され 、これはＶＬとＶＨの相互の位置関係に影響する。したがって、これらの残基が 定常領域と接触しているらしいということは価値がない。重鎮においては、可変 領域と接触する可能性のある表面残基はマウスとヒトの抗体の間で保存されてい て、したがって可変領域接触残基はＶ−Ｃ相互作用に影響することが考えられる 。軽鎖では、定常領域接触点の番号に見出されるアミノ酸は変動し、■およびＣ 領域は重鎮の場合のような接近した位置関係にはない。

したかって、軽鎖Ｖ−Ｃインターフェースの影響は小さいものと思われる。

２、４．１．　重鎖一定常残基は７．　１１．　４１．　８７゜１０８．１１０ ，１１２である。

２．４．２．　軽鎖−軽鎖内で接触する可能性のある残基は１０．１２，４０， ８０，８３．１０３および１０５である。

上述の解析と、多数の異なる抗体のＣＤＲ接木における本発明者らのかなりの実 際の実験経験から、上に示したようなプロトコールか導かれた。

次に本発明を、以下の添付図面１〜１３を参照しながら説明するが、これは単に 本発明を例示するものである。

図面の簡単な説明 図１は、ＯＫＴ　３の軽鎖のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示し、 図２は、ＯＫＴ　３の重鎮のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示し、 図３は、ＯＫＴ　３の軽鎖可変領域アミノ酸配列を、ヒト抗体ＲＥＩの軽鎖可変 領域のアミノ酸配列と整合した図であり、 図４は、ＯＫＴ　３の重鎮可変領域アミノ酸配列を、ヒト抗体ＫＯＬの重鎮可変 領域のアミノ酸配列と整合した図であり、 図５は、ＯＫＴ　３．　ＫＯＬおよび各種の相当するＣＤＲグラフトの重鎮可変 領域アミノ酸配列を示し、図６は、ＯＫＴ　３．　ＲＥ［および各種の相当する ＣＤＲグラフトの軽鎖可変領域アミノ酸配列を示し、図７は、各種の接木ＯＫＴ 　３抗体についての結合アッセイの結果のグラフを示し、 図８は、各種接木ＯＫＴ　３抗体についての遮断アッセイの結果のグラフを示し 、 図９は、遮断アッセイの結果の類似のグラフを示し、図１０は、結合および遮断 の両アッセイの結果についての類似のグラフを示し、 図１１は、さらに結合アッセイおよび遮断アッセイ両者の結果についての類似の グラフを示し、図１２は、最小限接木したＯＫＴ　３抗体について、０ＫＴ３マ ウス対照標準と比較した競合アッセイの結果のグラフを示し、 図１３は、完全に接木したＯＫＴ　３抗体について、マウス対照標準と比較した 競合アッセイの結果の類似のグラ抗体０ＫＴ３を産生するハイブリドーマ細胞は 叶ｔｈ。

によって提供され（シードロット：４８８２．ｌ）、グルタミンおよび５％牛脂 仔血清補充、抗生物質無添加ダルベツコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖 させ、評価のための過増殖上清とＲＮＡ抽出のための細胞の両者か得られるよう に分割した。過増殖上清は２５０μｇ／ｍｌのマウスＩ　ｇＧ　２　ａ／カッパ ー抗体を含有することを示した。上清は、マウスラムダ軽鎖ならびにｒｇＧｌ。

７ｇＧ２．ＩｇＧ３．ＴｇＡおよびＩｇＭ重鎖について陰性であった。上清２０ ｍ１を検定して、存在する抗体が０ＫＴ３であることを確認した。

２、　分子生物学操作 基本的な分子生物学的操作はＭａｎｉａｔｉｓら（９）に記載された通りとした が、場合により僅から改変を行った。

ＤＮＡのシクエンシングはＳａｎｇｅｒら（１１）およびＡｍｅｒｓｈａｍ　Ｉ ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｐｌｃシクエンシングハンドブックの記載に従って 実施した。特定部位の突然変異は、ＫＨａｍｅｒら（１２）およびＡｎｇｌｉａ ｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｌｔｄ。

ハンドブックの記載によった。ＣＯ８細胞の発現および代謝標識研究はＷｈｉｔ ｔｌｅら（１３）の記載の通りに実施した。

３、　研究アッセイ ３．１．　アッセンブリーアッセイ アッセンブリーアッセイは、トランスフェクトしたＣＯ８細胞からの上清につい て、存在する無傷なＩｇＧの量を測定するために実施した。

３、１．１．　マウス０ＫＴ３遺伝子でトランスフェクトしたＣＯ８細胞 ＣｏＳ細胞上清中の無傷なマウスＩｇＧのアッセンブリーアッセイは、以下のフ ォーマットによるＥＬ［ＳＡとした。

９６ウエルのマイクロタイタープレートをＦ（ａｂ’　）ｚヤギ抗−マウスＩｇ Ｇ　ＦＣでコートした。プレートを水洗し、サンプルを室温で１時間添加した。

プレートを洗浄し、次に、Ｆ（ａｂ’　）２ヤギ抗−マウスＩ　ｇ　Ｇ　Ｆ（ａ ｂ’　）２（ＨＲＰＯ接合）を加えた。反応を明らかにするため、基質を添加し た。標準としてはＵＰＣ１０，マウスＩｇＧ２ａミエローマを使用した。

３、１．２．　キメラまたはＣＤＲ接木０ＫＴ３遺伝子でトランスフェクトした ＣＯ３およびＣＨＯ細胞ＣＯ３細胞上清中のキメラまたはＣＤＲ接木抗体のアッ センブリーアッセイは、以下のフォーマットのＥＬＩＳＡによった。

９６ウエルのマイクロタイタープレートをＦ（ａｂ’　）ｚヤギ抗−ヒトＩｇＧ 　Ｆｃでコートした。プレートを洗浄し、サンプルを加えて室温で１時間インキ ュベートした。

プレートを洗浄し、モノクローナルマウス抗−ヒトカッパー鎖を室温で１時間添 加した。プレートを洗浄し、Ｆ（ａｂ’　）ｚヤギ抗−マウスＩ　ｇＧ　Ｆ　ｃ 　（ＨＲＰＯ接合）を添加した。反応を明らかにするために酵素基質を加えた。

標準としてはキメラＢ７２．３　（１ｇＧ４）（１３）を使用した。このアッセ イにおけるモノクローナル抗−カツバー鎖の使用は、接木抗体をキメラ標準から 読むことを可能にする。

３．２．　抗原結合活性のアッセイ ＣＯ８細胞上清からの物質を、直接アッセイでＣＤ３陽性細胞に対する○ＫＴ３ 抗原結合活性について検定した。操作は、次の通りである。

ＨＵＴ７８細胞（ヒトＴ細胞系、ＣＤ３陽性）を培養液中に維持した。ＨＵＴ７ ８細胞の単層を、ポリーＬ−リジンおよびグルタルアルデヒドを用いて９６ウエ ルＥＬＩＳＡプレート上に調製した。サンプルをこの単層に、室温で１時間添加 した。

プレートはＰＢＳを用いて穏やかに洗浄した。

Ｆ（ａｂ’　）２ヤギ抗−ヒトＩｇＧ　Ｆｃ（ＨＲＰＯ接合）またはＦ（ａｂ’ 　）２ヤギ抗−マウスＩ　ｇＧ　Ｆ　ｃ　（ＨＲＰＯ接合）を適宜、人体化また はマウスサンプルに加えた。反応を明らかにするため、基質を添加した。細胞ベ ースのアッセイのための陰性コントロールはキメラＢ７２．３とした。陽性コン トロールは、入手可能な場合は、マウスＯｒｔｈｏｍｕｎｅ　ＯＫ　Ｔ　３また はキメラ０ＫＴ３とした。この細胞ベースの検定は実施が困難で、ＣＤＲ接木０ ＫＴ３用には別のもっと感度が高く、実施が容易なアッセイを開発した。

この系では、ＣＯ３細胞によって産生されたＣＤＲ接木０ＫＴ３を、ＣＤ３陽性 ＨＰＢ−ＡＬＬ　（ヒト末梢血急性リンパ球白血病）細胞系への結合能について 試験した。これらの細胞へのマウス０ＫＴ３の結合のその遮断能についても試験 した。結合は以下の操作によって測定した。ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞は組織培養から 収穫した。細胞を、様々な希釈度の試験抗体、陽性コントロール抗体または陰性 コントロール抗体と４°Ｃで１時間インキュベートシた。細胞を１回洗浄し、４ °Ｃて１時間Ｆ［ＴＣ−標識ヤギ抗−ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的、マウス吸収）と インキュベートした。細胞を２回洗浄し、細胞蛍光法で解析した。直接結合の陽 性コントロールとしてキメラ０ＫＴ３を使用した。細胞を模擬トランスフェクト ＣＯ３細胞上滑と、ついて陰性コントロールを与えるＦＩＴＣ−標識ヤギ抗−ヒ トＩｇＧとインキュベートした。ＣＤＲ接木０ＫＴ３のマウス０ＫＴ３結合を遮 断する能力を試験するために、ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞を様々な希釈度の試験抗体ま たは対照抗体と４°Ｃで１時間インキュベートした。固定したＦ［ＴＣ０ＫＴ３ の飽和量を添加した。サンプルを４°Ｃで１時間インキュベートし、２回洗浄し 、細胞蛍光法で解析した。最大結合を測定するために陽性コントロールとしてＦ ＩＴＣ−標識０ＫＴ３を使用した。非標識マウス０ＫＴ３は遮断に対する対照標 準として働いた。陰性コントロールは、模擬トランスフェクト細胞上清を加えた または加えない非染色細胞とした。ＣＤＲ接木０ＫＴ３軽鎖のＣＤ３−陽性細胞 の結合能およびマウス０ＫＴ３の結合遮断能は、最初、キメラ０ＫＴ３の重鎖と 混合して試験した。キメラ０ＫＴ３の重鎖は、マウス０ＫＴ３可変領域とヒトＩ ｇＧ４定常領域から構成される。キメラ重鎖遺伝子は、ＣＤＲ接木遺伝子に使用 したのと同じ発現ベクター中で発現させる。ＣＤＲ接木軽鎖発現ベクターとキメ ラＨ鎖発現ベクターをＣＯ３細胞にトランスフェクトさせた。完全なキメラ○Ｋ Ｔ３の抗体（キメラ軽鎖およびキメラ重鎖）は、ＣＤ３陽性細胞への結合および これらの細胞へのマウス０ＫＴ３の結合の遮断の完全な能力を有することが見出 された。

３．３．　相対的結合親和性の測定 ＣＤＲ接木抗−ＣＤ３モノクローナル抗体の相対的結合親和性は、ＣＤ３抗原の ソースとしてＨＰＢ−ＡＬＬヒトＴ細胞系を用い、トレーサー抗体として結合親 和性既知のフルオレセイン接合マウス０ＫＴ３　（Ｆｌ−ＯＫＴ３）を用いて、 競合結合（６）によって測定した。Ｆｌ−ＯＫＴ３）レーサー抗体の結合親和性 は、Ｆｌ−ＯＫＴ３の量を増大させて、５％牛脂仔血清含有ＰＢＳ中ＨＰＢ−Ａ ＬＬ　（５Ｘ１０’　）　と４℃で６０分間インキュベートする直接結合アッセ イによって決定された。細胞を洗浄し、蛍光強度を、定量的マイクロビーズ標準 （Ｆｌｏｗ　Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　５ｔａｎｄａｒｄｓ、　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　 Ｔｒｉａｎｇｌｅ　Ｐａｒｋ。

ＮＣ）で検量したＦＡＣ３ｃａｎ流動細胞計測計で測定した。

抗体分子あたりの蛍光強度（Ｆ／Ｐ比）は既定数のマウスＩｇＧ抗体結合部位を 有するマイクロビーズ（ＳｉｍｐｌｙＣｅｌｌｕｌａｒビーズ、　Ｆｌｏｗ　Ｃ ｙｔｏｍｅｔｒｙ　５ｔａｎｄａｒｄｓ）を使用して定量した。Ｆ／Ｐは、Ｆｌ −ＯＫＴ３で飽和したビーズの蛍光強度をビーズあたりの結合部位の数で除した 値に等しい。結合および遊離Ｆｌ−ＯＫＴ３の量は、細胞あたりの平均蛍光強度 から計算し、結合／遊離の比を゛結合抗体のモル数に対してプロットした。結合 の親和性の決定には直線フィツト（傾斜の絶対値）を使用した。

競合結合のためには、競合抗体の量を増加させて亜飽和用量のＦ　１−ＯＫＴ３ に加え、５％牛脂仔血清含有ＰＢＳ２００ｍｌ中５ｘ　１０’　ＨＰＢ−ＡＬＬ とともに４°Ｃで６０分間インキュベートした。細胞の蛍光強度は、定量用マイ クロビーズ標準で検量したＦＡＣＳｃａｎ流動細胞計測計上で測定した。結合お よび遊離Ｆ　１−ＯＫＴ３の濃度を計算した。競合抗体の親和性は、式〔Ｘ）− （ＯＫＴ３）＝　（１／に、　）−（１／に、）（式中、Ｋ、はマウス０ＫＴ３ の親和性、Ｋ８はコンペテイターＸの親和性、〔〕は結合／遊離結合がＲ／２で ある時点でのコンペティター抗体の濃度であり、Ｒは最大結合／遊離結合である ）から計算できた。

４、ｃＤＮＡライブラリーの構築 ４．１．　ｍＲＮＡの調製とｃＤＮＡの合成０ＫＴ３産生細胞を上述のように増 殖させ、１．２×１０”の細胞を収穫し、ｍＲＮＡはグアニジニウム／ＬｉＣｔ 抽出操作を用いて抽出した。ｃＤＮＡはオリゴ−ｄＴからプライミングによって 調製し、完全長ｃＤＮＡを発生させた。ｃＤＮＡをメチル化し、クローニングの ためにＥｃｏＲＩ　リンカ−を添加した。

４．２．　ライブラリーの構築 ｃＤＮＡライブラリーは、予めＥｃｏＲ［で切断し、牛膓ホスファターゼで５′ リン酸基を除去したｐｓｐｅｓベクターＤＮＡにリゲートした（ＥｃｏＲ［／　 ＣＩ　Ｐ　）。リゲ−ジョンは、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　ＨＢ　１０１を高い 形質転換で形質転換するために使用した。ｃＤＮＡライブラリーを調製した。３ ．６００のコロニーについてＬ［−１１０，０００コロニーについてＨ鎖をスク リーニングした。

１５、スクリーニング 重鎮または軽鎖プローブのいずれかに陽性の大腸菌コロニーは、軽鎖については 、マウスカッパ一定常領域における配列と相補性のオリゴヌクレオチド：　５’ 　ＴＣＣＡＧＡＴＧＴＴＡＡＣＴＧＣＴＣＡＣ，重鎖については、マウスＩｇＧ ２ａ定常ＣＨＩドメイン領域における配列と相補性の５’　ＣＡＧＧＧＧＣＣＡ ＧＴＧＧＡＴＧＧＡＴＡＧＡＣを用いるオリゴヌクレオチドスクリーニングによ って同定した。１２個の軽鎖および９個の重鎮クローンか同定され、第２ラウン ドのスクリーニングを行った。第２ラウンドのスクリーニングからの陽性クロー ンを生育させ、ＤＮＡを調製した。遺伝子挿入体のサイズをゲル電気泳動で評価 し、完全長ｃＤＮＡを含有できるサイズの挿入体はＤＮＡスクリーニングのため にＭ１３中にサフ゛クローニングした。

６、ＤＮＡシクエンシング 重鎮および軽鎖の両者について４つのサイズのクラスを示すクローンがＭ１３中 に得られた。５′非翻訳領域のＤＮＡ配列、シグナル配列、可変領域および３′ 非翻が得られ、相当するアミノ酸配列が予測された〔図１（ｂ）および２　（ｂ ）　）　。図１　（ａ）では非翻訳ＤＮＡ領域を大文字で示し、図１および２と も、シグナル配列には下線を付した。

７、ｃＤＮＡ発現ベクターの構渠 Ｃｅ１ｌｔｅｃｈ発現ベクターはプラスミドｐＥＥ６ｈＣＭＶ（１４）をベース とするものである。発現すべき遺伝子の挿入のためのポリリンカーは、ヒトサイ トメガロウィルス（ｈＣＭＶ）の主要直接初期プロモーター／エンハンサ−の後 に導入させた。トランスフェクトした真核細胞中のプラスミドの選択のためのマ ーカー遺伝子は、ｐＥＥ６ｈＣＭＶの唯一のＢａｍ旧部位にＢａｍ　Ｈｌカセッ トとして挿入できる。たとえば、ｎｅｏマーカーはｐＥＥ６ｈ　ＣＭ　Ｖ　ｎｅ ｏを与える。興味ある遺伝子の挿入に先立ってｎｅｏおよびｇｐｔマーカーを挿 入するのが通常のやり方であるが、一方、ＧＳマーカーは、カセット内に内部Ｅ ｃｏＲ１部位が存在するので最後に挿入される。

選択マーカーはＳＶ４０後期プロモーターから発現さ−はＣＯ８細胞の一時的発 現システムにおける発現にも使用できる。

マウスの配列は上述のＭ１３ベースベクターからＥｃｏＲｒフラグメントとして 切り取り、１１Ｍでは１）ＥＥ６−　ｈ　ＣＭＶ−ｎｅｏ　、軽鎖ではｐＥＥ６ −ｈＣＭＶ−ｇｐｔ中にクローン化して、それぞれベクターｐＪＡ１３６および ｐＪＡ１３５を得た。

８、ｃＤＮＡのＣＯ３細胞中での発現 プラスミドｐＪＡ１３５とｐＪＡ１３６をＣＯ８細胞にコトランスフェクトし、 一時的発現実験からの１清に、Ｔ細胞濃縮リンパ球に結合した集合抗体の含有を 認めた。

３５３−メチオニンを用いた代謝標識実験により、重鎮と軽鎖の発現および集合 か示された。

９、　キメラ遺伝子の構築 キメラ遺伝子の構築は、以前に記載された策略ＣＷｈｉｔｔｌｅら（１３））に 従った。可変ドメイン配列の３′末端近くの制限部位が同定され、マウス可変領 域の残部および選ばれた定常領域への結合のための適当な制Ｆ１１部位をコード するオリゴヌクレオチドアダプターを結合させるために使用する。

９．１．　Ｌ鎖遺伝子の構築 マウスＬ鎖ｃＤＮＡ配列は、可変領域〔図１（ａ））の３′末端近くにＡｖａ１ 部位を含有する。可変領域の配列の大部分は３９６ｂｐ　ＥｃｏＲＩ　−Ａｖａ Ｉフラグメントとして単離された。オリゴヌクレオチドアダプターはＡｖａ１部 位からの可変領域の３′領域の残部を置換し、予め定常領域に工作された唯一の Ｎａｒ［部位までを包含するヒト定常領域の５′末端を含むように設計された。

Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ部位はリンカ−の挿入のためのマーカーとして働くように導入 された。

リンカ−はｖＬフラグメントにリゲートし、４１３ｂｐら精製した。

Ｍ１３クローンＮＷ３６１からＮａｒ　［−Ｂａｍ旧フラグメントとして定常領 域を単離し、これを３工程反応でＥｃｏＲ［／Ｂａｍ　Ｈ１／　ＣＩ　Ｐ　ｐ　 Ｓ　Ｐ　６５処理ベクター中可変領域ＤＮＡとリゲートしてプラスミドＪＡ　ｌ 　４３を得た。大腸菌中に形質転換後クローンを単離し、リンカ−および連結配 列を、Ｈｉｎｄ　ＩＩ［部位の存在およびＤＮＡシクエンシングで確認した。

９．２．軽鎖遺伝子の構築−変法２ 第一のキメラ軽鎖遺伝子の構築は、マウスおよびヒトアミノ酸配列の可変一定常 領域連結での融合を生じる。

０ＫＴ３のＬ鎖の場合、キメラ連結部でのアミノ酸は、Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−［１ｅ −Ａｓｎ−Ａｒｇ／　−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｌａ可変　定常 である。この配列の調整は、Ｖ−Ｃ連結部にアスパラギン（Ａｓｎ　）連結（Ｎ 一連結）グリコシレージ３ンの可能な部位を導入する。したがって、キメラ軽鎖 オリゴヌクレオチドアダプターの第二の形式は、ヒト定常領域の最初のアミノ酸 を、マウス定常領域からの相当するアミノ酸、アラニン（Ａｌａ）によって置換 されるように設計した。

このアダプターには、２個のキメラＬ鎖遺伝子を識別するために、内部Ｈｉｎｄ 　ＩＩＩ部位は包含されなかった。

可逆領域フラグメントは３７６　ｂｐ　ＥｃｏＲｌ　−Ａｖａ［フラグメントと して単離した。オリゴヌクレオチドリンカ−はＮａｒ［切断ｐＮＷ３６１にリゲ ートし、ついで修飾ｐＮＷ３６１をＥｃｏＲ［て再切断したのち適応３９６ｂｐ 定常領域を単離した。可変領域フラグメントと修飾定常領域フラグメントを直接 、ＥｃｏＲ［／　ＣＩ　Ｐ処理ｐＥＥ６ｈＣＭＶｎｅｏ中にリゲートし、ｐＪＡ １３７を得た。最初は調べたクローンはすべて、挿入は正しくない方向で行われ ていた。したかって、挿入体を再単離し、挿入体か回転するように再クローン化 してプラスミドｐＪＡ１４１を得た。挿入体を正しい方向でもつ数個のクローン が得られ、そのひとつのアダプター配列はＤＮＡシクエンシングによって確認さ れた。

９．３．　重鎮遺伝子の構築 ９、３．１．　重鎮遺伝子アイソタイプの選択Ｈ鎖のために選択された定常領域 アイソタイプはヒトＩｇＧ４とした。

９、３．２．　遺伝子構築 ＨｊＪｌｃＤＮＡ配列は、可変領域〔図２　（ａ）　）の３′末端近くにＢａｎ 　Ｉ部位を示した。可変領域の配列の大部分は４２６　ｂｐ　ＥｃｏＲＩ　／　 ＣＩ　Ｐ／Ｂａｎ　Ｉフラグメントとして単離された。オリゴヌクレオチドアダ プターは、Ｂａｎ　Ｉ部位から、予め定常領域の最初の２個のアミノ酸へ操作し た唯一の旧ｎｄ　Ｉ［［部までそれを含めて可変領域の３′領域の残部を置換す るように設計された。

リンカ−を■８フラグメントにリゲートし、ＥｃｏＲ［−Ｈｌｎｄ　［［［適応 フラグメントをリゲーション混合物から精製した。

可変領域は、ｐＪＡ９１をＥｃｏＲｒとＨｉｎｄ　ｌｆｒテ切断し、イントロン フラグメントを除去し、それをＶ□で置換して定常領域にリゲートして、ｐＪＡ １４２を得た。大腸菌ＪＭＩＯＩに形質転換したのちクローンを単離し、連結配 列はＤＮＡシクエンシングで確認した（注：　Ｈｉｎｄｒｒ［部位はクローニン グ時に失われる）。

ｌＯｌ　キメラ発現ベクターの構築 １０、１．　ｎｅｏおよびｇｐｔベクターキメラ軽鎖（形式１）をｐＪＡ１４３ からＥｃｏＲＩフラグメントとして除去し、ＥｃｏＲ［／　ＣＩ　Ｐ処理ｐＥＥ ６ｈＣＭＶｎｅｏ発現ベクター中にクローン化して、ｐＪＡ１４５を得た。正し い方向に挿入体をもつクローンを制限地図の作成によって同定した。

キメラ軽鎖（形式２）は上述のようにして構築した。

キメラ重鎖遺伝子はｐＪＡ１４２から２．５　Ｋｂｐ　ＥｃｏＲ［／Ｂａｍ旧フ ラグメントとして、ｐＥＥ６ｈＣＭＶｇｐｔ　（７）誘導体のＥｃｏＲ［／　Ｂ ｃｌ　Ｉ　／　ＣＩ　Ｐ処理ベクターフラグメント中にクローン化してプラスミ ドｐＪＡ１４４を得た。

ｌｏ、２ｉ　ａｓ分離ベクター ｐＪＡ１４１およびｐＪＡ１４４のＧＳ形式は、ｎｅ。

およびｇｐｔカセットをプラスミドのＢａｍ　Ｈｒ／　Ｓａｌ　ｒ　／　ＣＩＰ 処理によって置換し、ベクターのフラグメントを単離し、プラスミドｐＲＯ４９ からのＧＳ含有フラグメントにリゲートして構築し、軽鎖ベクターｐＪＡ１７９ および重鎮ベクターｐＪＡ１８０を得た。

１０．３．　ＧＳ単一ベクターの構築 ｃＬ（キメラ軽鎖）、ｃＨ（キメラ重鎖）およびＧＳ遺伝子を１個のプラスミド に、ｃＬ−ｃＨ−ＧＳ、またはｃＨ−ｃＬ−ＧＳの順序に含有し、遺伝子の転写 は頭尾から尾部、たとえばｃＬ＞ｃＨ＞ＧＳである単一ベクター構築体が構成さ れた。これらのプラスミドはＩ）ＪＡ１７９またはｐＪＡ１８０をＢａｍ　ＩＩ ／　ＣＩ　Ｐで処理し、Ｂｇｌ　Ｉｔ／Ｈｉｎｄ　［［Ｉｈ　ＣＭＶプロモータ ーカセット中、ｐＪＡ１４１からの旧ｎｄ　ＩＩＩ／　Ｂａｍ旧フラグメントと ともにｐＪＡ１８０にリゲートしてｃＨ−ｃＬ−ＧＳプラスミドｐＪＡ１８２を 得るか、またはｐＪＡ１４４からの旧ｎｄ　ＩＩＩ／Ｂａｍ旧フラグメントとと もにｐＪＡ１７９にリゲートしてｃＬ−ｃＨ−ＯＳプラスミドｐＪＡ１８１を得 ることにより作成した。

１１、キメラ遺伝子の発現 １１．１．　ＣＯ３細胞中での発現 キメラ抗体プラスミドｐＪＡ１４５　（ｃＬ）およびｐＪＡ　ｌ　４４　（ｃＨ ）をＣＯ８細胞中にコトランスフエクトし、一時的発現実験から上清にはＨＵＴ ７８ヒトＴ−細胞系に結合した集合体を含むことが示された。２５３−メチオニ ンを用いた代謝標識実験では重鎮と軽鎖の発現および集合を示した。しかしなが ら、還元ゲル上で認められた軽鎖の移動性は潜在的グリコシレージョン部位のグ リコジル化が示唆された。ツニカマイシンの存在下におけるＣＯ３細胞における 発現は、軽鎖のサイズの、対照キメラ抗体および０ＫＴ３マウス軽鎖について認 められるサイズへの低下を示した。したがって、Ｊ　Ａ　１４１が構築され、発 現された。この場合、軽鎖は、ツニカマイシンの存在下または不存在下に、異常 な移動性もサイズの変移も示さなかった。このキメラ軽鎖の第二の形式は、キメ ラ重（ｃＨ）鎖とともに発現させた場合、ＨＵＴ７８細胞に良好な結合を示す抗 体を産生じた。いずれの場合も、抗原結合は、マウス抗体のそれと同等であった 。

１１．２．　チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中での発現 安定な細胞系がプラスミドｐＪＡ１４１／ｐＪＡ１４４からおよびｐＪＡｌ　７ ９／ｐＪＡｌ　８０．ｐＪＡｌ　８１ならびにｐＪＡ１８２から、ＣＨＯ細胞中 へのトランスフェクションによって調製された。

１２、ＣＤＲ接木（グラフティング） 採用したアプローチは、マウスおよびキメラ抗体に匹敵する抗原結合活性を発生 させるため、ヒト可変領域枠組みに十分なマウス残基の導入を試みることであっ た。

１２．１．　可変領域解析 抗体および抗原−抗体複合体の構造の小さなデーターペースの調査からは、わず かに少数の抗体残基が抗原と直接接触することか明らかである。他の残基は、接 触残基を好ましいコンフィギユレーションに配置し、また個値の可変ドメインの 安定な充填およびＬ鎖とＨ鎖の可変ドメインの安定な相互作用を誘導することに よって、抗原結合性に寄与するものと考えられる。移入のために選ばれた残基は 多くの方法で確認される。

（ａ）　抗体のＸ線結晶構造の調査により、抗原結合表面は、β−バレル枠組み から伸びる、ドメインあたり３個の、一連のループ上に主に位置できる。

（ｂ）　抗体の解析により、超可変性の可変ドメイン配列領域ＣＷｕ　＆　Ｋａ ｂａｔ　（５）により相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれた〕が確認できる。す べてではないが大抵、これらのＣＤＲは上述のループ領域に相当するが、それを わずかに超えている。

（Ｃ）　（ａ）または（ｂ）で確認されない残基は、抗原結合部位の局部配置に 影響するか、または個々の可変ドメインの安定な充填の誘導および可変ドメイン 間相互作用の安定化によって、直接または間接に、抗原結合に寄与している可能 性がある。これらの残基は、与えられた抗体の配列を既知の構造上に重ね合わせ て鍵残基のそれらへの寄与をみるか、または配列整合解析によって「特異体質」 残基に注目し、ついでそれらの構造的位置と考えられる効果を調べることによっ て、同定できる。

１２、１．１．　軽鎖 図３には、ヒト枠組み領域ＲＥＩと０ＫＴ３の軽鎖可変領域についての配列整合 を示す。抗原結合領域に相当すると確信される構造ループ（ＬＯＯＰ）およびＣ ＤＲ（Ｋａｂａｔ　）に印をしである。１３．１（Ｃ）に記載したように抗原の 結合に寄与すると思われる多数の他の残基にも印を付す。図３の配列の上の残基 型は、Ｘ線結晶構造解析で解かれた構造を調べて誘導された各残基の側鎖の空間 的位置を示している。この残基型の記号は次の意味を有する。

Ｎ　：　ＣＤＲに接近（Ｘ線構造から）Ｐ：充填 Ｂ：埋蔵非充填 Ｓ：表面 Ｅ：曝露 ■＝インタフェース ６　：インタフェースー充填／部分曝露？：マウス配列として残されることが必 要かもしれない非ＣＤＲ残基 図３で下線を施した残基はアミノ酸である。ＲＥＩはヒト枠組みとして選択した 。軽鎖はカッパー鎖で、カッパー可変領域はマウス配列と、ラムダ軽鎖可変領域 たとえばＫＯＬ　（下記参照）よりも高いホモロジーを示すからである。ＲＥＩ は他のカッパー軽鎖よりも優先して選択された。軽鎖はそのＸ線構造が決定され 、個々の残基の構造的検討か可能であったからである。

１２．１．２．　重鎮 同様に、図４には、ヒト枠組み領域ＫＯＬおよび０ＫＴ３の重鎖可変領域につい ての配列の整合を示す。抗原結合領域に相当すると確信される構造ループとＣＤ Ｒには印を付しである。また、１２．１（Ｃ）に記載したように抗原結合に同じ く寄与すると考えられる多数の他の残基にも印を付す。図４に使用した残基型の 記号および他の指示は、図３に使用したものと同じである。ＫＯＬが重鎮枠組み として選択されたのは、Ｘ線構造がたとえばＮＥＷＭよりも良好な分解能で決定 されていたこと、また０ＫＴ３の重鎮領域の配列整合でＮＥＷＭに対するよりＫ ＯＬ方がわずかに高いホモロジーを示したからである。

１２．２．　可変部遺伝子の設計 可変領域ドメインは、マウス可変領域至適コドン利用ＣＧｒａｎｔｈａｍ　＆　 Ｐｅｒｒｉｎ　（１５）　）によって設計し、８７２．３シグナル配列ＣＷｈｉ ｔｔｌｅら（１３））を使用した。

これらの配列は、上述のキメラ遺伝子の場合と同じ方法で、定常領域に結合する ように設計された。一部の構築体は、遺伝子中のシグナル配列の５′に直接連結 したＫｏｚａｋ　コンセンサス配列（Ｋｏｚａｋ　（１６）　）を含有した。

この配列の基調は、真核生物中での翻訳開始に有益な役割をもつことと考えられ る。

１２．３．　遺伝子構築 可変領域を作るには様々な策略が利用できる。配列はＪｏｎｅｓら（１７）に類 似の様式でオリゴヌクレオチドを用いて、またはＶｅｒｈｏｅｙｅｎら（２）に 類似の様式でのオリゴヌクレオチドの特定部位の特定の突然変異誘発によって組 立てることができる。両者の策略を使用した。構築体の一覧を表１および２．な らびに図４および５に示す。いくつかのケースで、突然変異によるアプローチが 改造すべき遺伝子に欠失や再記を招いたこと、また一方、集合アプローチの成功 はオリゴヌクレオチドの質にきわめて敏感であったことが注目された。

１３、発現ベクターの構築 遺伝子はＭ２Ｓまたは５Ｐ６５ベースの中間体ベクターから単離し、軽鎖につい てはｐ　Ｅ　Ｅ　６　ｈ　ＣＭＶｎｅｏに、重鎖についてはｐ　Ｅ　Ｅ　６　ｈ 　ＣＭＶｇｐｔに、上述のキメラ遺伝子の場合と同様な様式でクローン化した。

表Ｉ　ＣＤＲ叫印ｌ 記号　マウス配列の　構築方法　Ｋｏｚａｋ含有　配列 −＋ Ｌ鎖　すべてヒト枠組みＲＥｌ １２１　２６−３２．５Ｏ−５ａ９１−９６　（前後を含む）　ＳＸｊＭ　ｇｅ ｎｅａｓｓａｔｌｙ　＋　ｎ、ｄ。

１２１Ａ　２６−３２．５０−５６．９１−９６　（〃）　Ｐａｒｔｉａｌｇｅ ｎｅａｓｓｅｍｂｌｙ　ｎ、ｄ、　＋＋１．　＆　４６．４７ １２１Ｂ２６−３Ｚ５０’５ａ９１−９６　（〃）　Ｐａｒｔｉａｌｇｅｎｅａ ｓｓｅｍｂｌｙ　ｎ、ｄ、　＋＋４ａ　４７ ２２１　２４−２４５０−５６．９１−９６　（〃）　Ｐａｒｔｉａｌｇｅｎｅ ａｓｓｅｓｔｌｙ　＋　＋２２１Ａ２４−３４５０−５６．９１−９６　（’　 ）　Ｐａｒｔｉａｌｇｅｎｅａｓｓｅｍｂｌｙ　＋　＋＋１．３．４６．４７ ２２１Ｂ２４−３４５０−５６．９１−９６　（”　）　Ｐａｒｔｉａｌｇｅｎ ｅａｓｓａｎｂｌｙ　＋　＋＋１，３ ２２ＩＣ２４−３４５０−５６，９１−９６（〃）　Ｐａｒｔｉａｌｇｅｎｅａ ｓｓａｎｂｌｙ　＋　＋１２１２６−３２．５Ｏ−５ａ９５−１００Ｂ　（龍□ ）　Ｇｅｎｅａｓｓｄｌｙ　ｎ、ｄ、　＋１３１　２６−３Ｚ５０−５＆９５− １００Ｂ　（〃）　Ｇｅｎｅａｓｓｅｍｌｙ　ｎ、ｄ、　＋１４１　２６−３２ ．５０−４９５−１α）Ｂ　（〃）　Ｐａｒｔｉａｌｇｅｎｅａｓｓｅｍｌｙ　 ＋　ｎ、ｔＪ。

３２１　２６−３ａ５０−５ａ９５−１００Ｂ　（”　）　Ｐａｒｔｉａｌｇｅ ｎｅａｓｓｅｍｂｌｙ　＋　ｎ、ｄ。

３３１　２６−３５．５０−５＆９５−１００Ｂ　（〃）　Ｐａｒｔｉａｌｇｅ ｎｅａｓｓｅｍｂｌｙ　＋Ｇｅｎｅ　ａｓｓｅｍｂｌｙ　＋ ３４１　２６−３５．［９５−１００８Ｃ”　）　５ＩＰ（＋Ｐａｒｔｉａｌ　 ｇｅｎｅ　ａｓｓｅｍｂｌｙ　＋３４１Ａ　２６−：％５０−６！ａ９５−１０ ０Ｂ　（”　）　Ｇｅｎｅａｓｓｅｍｂｌｙ　ｎ、ｄ、　＋＋６．２３，２４． ａ　４９，７１．７＆７６゜７８．８＆９１（刊追−ヒト） ３４１Ｂ　２＆−３５，５０−６５，９５−１００Ｂ　（前後を含む）　Ｇｅｎ ｅａｓｓａｎｂｌｙ　ｎ、ｃＬ　＋＋４＆　４９．７１．’７３．７ａ７８８＆ ９１（＋６３＋ヒト） 注 ｎ、　ｄ、　行われていない ＳＤＭ　特定部位の突然変異誘発 Ｇｅｎｅ　ａｓｓｅｍｂｌｙ　可変領域はすべてオリゴヌクレオチドから組立て られた Ｐａｒｔｉａｌ　ｇｅｎｅ　ａｓｓｅｍｂｌｙ　可変領域はＳＤＭとｇｅｎｅａ ｓｓｅｍｂｌｙ　によって最初に創製した他の遺伝子からの制限フラグメントの 組合わせ、または可変領域の一部はオリゴヌクレオチドからの集合でＳＤＭとｇ ｅｎｅ　ａｓｓｅｍｂｌｙによって最初に創成した他の遺伝子からの制限フラグ メントとの再構築で組立てられた １４、ＣＤＲ接木遺伝子の発現 １４．１．　７ウス重（ｍＨ）またはキメラＨ（ｃＨ）鎖と接木された軽（ｇＬ ）鎖からなる抗体の製造すべてのｇＬ鎖は、ｍＨまたはｃＨとともに適度の量の 抗体を産生じた。しかしながら、ＡＴＧに対し５′の位置に（ｋｇＬｔｌｌ１体 ）　Ｋｏｚａｋのコンセンサス配列を挿入すると、正味発現に２〜５倍の改善を 生じた。拡大した一連の実験で、発現のレベルはｋｇＬ／ｃＨまたはｋｇＬ／ｍ Ｈの組合わせで約２００　ｎｇ／ｍｌから約５００ｎｇ／ｍｌに上昇した。

ＨＵＴ７８細胞上の細胞への直接結合を測定した場合、ループ長に基づくマウス 配列を包含するように設計された構築体（ｇＬ　１２１）はｍＨまたはｃＨと会 合して活くマウス配列を包含するように設計された構築体（ｇＬ２２１）はｍＨ またはｃＨとともにある程度の弱い結合を示した。しかしなから、枠組み残基１ ，３，４６．４７を１２．１の項に既述した趣旨に基づいてヒトからマウス０Ｋ Ｔ３同等残基に変更したところ、１２１Ａおよび２２１Ａと命名された新しい構 築体の両者をｃＨと共発現させた場合、抗原結合か認められた。これらの残基の 効果をさらに詳細に調べたところ、ｇＬ２２１Ｂ遺伝子の生成物はｃＨとともに 検知可能な結合活性はほとんど示さないことから、残基１および３は主要な寄与 残基ではないことが明らかである。マウスの配列が４６と４７にあるｇＬ２２１ ｃ　の軽鎖生成物は、ｃＨと会合して良好な結合活性を示す。

１４．２．　７ウス軽（ｍＬ）またキメラＬ（ｃＬ）鎖と接木された重（ｇＨ） 鎖からなる抗体の製造ｇＨ遺伝子の発現はｇＬの場合よりも達成かより困難なこ とが明らかにされた。最初に、Ｋｏｚａｋ配列の挿入はｇＨ遺伝子の発現には著 しい影響は与えないようであった。発現はわずかに改善されるようであるか、接 木軽鎖の場合にみられたのと同程度ではなかった。

また、ＣＤＲ１にループ選択（アミノ酸２６〜３２）を用い、たとえばｇＨ１２ １，１３１，１４１とした場合、期待された量の物質の産生を示すことは難しい ことかわかり、これらの構築体については何の結論もひき出せない。

さらに、ｇＨ３４１遺伝子とｃＬまたはｍＬの共発現は一定せず、ｃＨ／ｃＬま たはｍ　Ｈ／　ｍ　Ｌの組合わせの場合よりも抗体の産生量は低い傾向を示す。

ｇＨ３４１への変更によるｇＨ３４１ＡおよびｇＨ３４１Ｂの製造では発現レベ ルの改善かみられる。

これは、可変領域におけるマウス配列分画の全体的増加、または残基がフェニル アラニン（Ｐｈｅ）からヒトアミノ酸バリン（Ｖａｔ　）に戻り、ヒト枠組みの 残部との内部充填の問題の可能性が回避された位置６３での変更によるものであ ろう。この配置はｇＨ３３１およびｇＨ３２１でも起こっている。

ｇＨ３２１またはｇＨ３３１をｃＬと一緒に発現させた場合、抗体は産生された が、抗体結合活性は検出されなかった。さらに保存的なｇＨ３４１遺伝子を使用 した場合には、ｃＬまたはｍＬと一緒で抗原結合は検出できたが、その活性はバ ックグランドのレベルかられずかに高いのみであった。

１２．１の議論に基づいてさらにマウス残基を置換すると抗原結合が明らかに示 された。ｌ（ｇＨ３４１ＡおよびｋｇＨ３４１ＢをｃＬとともに発現させると抗 体が産生した。

１４．３．　完全ＣＤＲ接木抗体の製造ｋｇＬ２２１Ａ遺伝子をｋｇＨ３４１， ｋｇＨ３４１Ａまたはｋｇ８３４１Ｂと共発現させた。ｋｇＨ２２１Ａ／ｋｇＨ ３４１の組合わせは、正常ＣＯ８細胞発現では、きわめてわずかな物質しか産生 しなかった。ｋｇＬ２２１Ａ／ｋｇＨ３４１ＡまたはｋｇＨ２２１Ａ／ｋｇＨ３ ４１Ｂの組合わせては、ｇ　Ｌ　／　ｃ　Ｈに類似の抗体量が製造された。

いくつかの実験では、ｋｇＨ２２１，Ａ／ｇＨ３４１またはｋｇＨ２２１Ａ／ｋ ｇＨ３４１の組合わせで抗原結合活性は検出できなかったが、発現レベルはきわ めて低かった。

ｋｇＬ２２１Ａ／ｋｇＨ３４１ＡまたはｋｇＨ２２１Ａ／ｋｇＨ３４１Ｂの組合 わせを発現させた場合には抗原結合が検出された。ｋｇＬ２２１Ａ／ｋｇＨ３４ １Ａの組合わせから産生じた抗体の場合、抗原結合はキメラ抗体の場合にきわめ て類似していた。

上述の結果の解析は以下に述べる。

１５、ＣＤＲ接木の結果の考察 完全人体化抗体の設計においては、その目的は、ヒト抗体枠組み上に、抗原結合 を付与する最小数のマウスアミノ酸を移入することであった。

１５．１．　軽鎖 １５．１．１．　ＣＤＲの範囲 軽鎖の場合、他の抗体の構造的研究から抗原接触残基を含有することか知られて いるループを決定する領域と、Ｋａｂａｔら（４および５）によって相補性決定 領域（ＣＤＲ）として定義された超可交配列とは、ＣＤＲ２ては同一である。Ｃ ＤＲＩでは、超可変領域は残基２４〜３４（前後を含む）に及ぶのに対し、構造 ループは２６〜３２（前後を含む）の範囲である。０ＫＴ３の場合には、アミノ 酸２４にマウス配列ではセリン、ヒト枠組みＲＥＩではグルタミンという、１個 のアミノ酸の差か２つの選択の間にあるにすぎない。ＣＤＲ３では、ループは残 基９１〜９６（前後を含む）に及ぶのに対し、Ｋａｂａｔの超可変部は残基８９ 〜９７（前後を含む）の範囲である。

０ＫＴ３の場合、アミノ酸８９．９０および９７は０ＫＴ３とＲＥＩの間で同一 である（図ｉ）。ＣＤＲＩについてループ選択（ｇＬ　ｌ　２１）およびＫａｂ ａｔ選択（ｇＬ２２１）に基づく構築体を作成し、ｍＨまたはｃＨと共発現させ た場合、ｇＬ１２１では抗原結合活性を示す証拠は見出せなかったのに対し、ｇ Ｌ２２１では痕跡の活性が検出できた。これは、１個の余分のマウス残基を接木 可変領域に置くことが何らかの検出可能な効果をもつことを示唆している。両遺 伝子構築体とも一時的発現システムにおいてかなり良好に発現した。

１５．１．２．　枠組み残基 残りの枠組み残基について、ついでさらに検討した。

とくに、ＣＤＲに類似した他の抗体のＸ線解析から知られる特定のアミノ酸、お よび０ＫＴ３が最高のホモロジーを示すマウス亜群（亜群ＶＤで一致した枠組み と０ＫＴ３て異なるアミノ酸について検討した。４個の位置１゜３．４６および ４７を同定し、各位置についてヒトアミノ酸をマウスアミノ酸で置換してそれら の寄与の可能性を検討した。すなわち、ｇＬ２２１Ａ　（ｇＬ２２１＋ＤＩＱ、 Ｑ３Ｖ、Ｌ４６Ｒ，Ｌ４７Ｗ、図３および表１参照）を作成し、Ｅ　Ｅ　６　ｈ 　ＣＭＶｎｅｏ中にクローン化し、ｃＨ（ｐＪＡ　ｌ　４４）と共発現させた。

得られた抗体はよく発現し、良好な結合活性を示した。類似の遺伝子ｇＬ２２１ Ｂ　（ｇＬ２２１＋ＤＩＱ、Ｑ３Ｖ）およびｇＬ２２１Ｃ（ｇＬ２２１＋Ｌ４６ Ｒ，Ｌ４７Ｗ）を作成し、同様に試験し、両遺伝子をｃＨと共発現させて抗体を 産生させたが、ｇＬ２２１ｃ／ｃＨの組合せのみが良好な抗原結合を示した。ｇ Ｌ１２１Ａ　（ｇＬ１２１＋ＤＩＱ。

Ｑ３Ｖ、Ｌ４６Ｒ，Ｌ４７Ｗ）遺伝子を作成し、ｃＨと共発現した場合、同じく 抗原に結合する抗体が産生された。

１５．２．　重鎮 １５．２．１．　ＣＤＲの範囲 重鎮については、ループと超可変部の解析はＣＤＲ３でのみ一致する。ＣＤＲ１ では、ループ領域は残基２６〜３２（前後を含む）に及ぶのに対し、一方、Ｋａ ｂａｔ　ＣＤＲは残基３１〜３５（前後を含む）の範囲である。ＣＤＲ２では、 ループ領域は５０〜５８（前後を含む）であり、一方、超可変領域はアミノ酸５ ０〜６５（前後を含む）をカバーする。したがって、人体化重鎮は、抗体ＫＯＬ からの枠組みを用い、これらのＣＤＲ選択の様々な組合わせで、また残基５６〜 ５８の周辺のＣＤＲ２ルー・ブについては終点の定義に関して不確定を点かある のでＣＤＲ２を５０〜５６（前後を含む）を短く選択した場合を含めて、構築し た。この遺伝子を最初、ｍＬまたはｃＬと共発現させた。ｇＨ遺伝子のＣＤＲＩ ループ選択をたとえばｇＨ１２１，ｇＨ１３１，ｇＨ１４１とした場合、培養上 溝中にはきわめてわずかな抗体しか産生しなかった。遊離のＬＭは検出されなか ったことから、抗体は作成され細胞の内部で集合したが、このＨ鎖はある点で異 常で、多分正しくないフォールディングが起こり、したがって抗体は内部的に崩 壊されるものと推察される。５ｓＳ−標識研究による実験では痕跡量の抗体が検 出できた場合があった。

正味の抗体は産生されなかったので、これらの構築体の解析はさらに実施しなか った。

しかしながら、ＣＤＲＩについてループ選択とＫａｂａｔ選択の組合わせを試験 しくマウスアミノ酸２６〜３５゜前後を含む）、残基３１　（Ｓｅｒ　ｔ−Ａｒ ｇ　ヘ）　、３３　（ＡｌａをＴｈｒへ）、および３５（Ｔｙｒを旧Ｓへ）をヒ ト残基からマウス残基に変化させて最初のシリーズと比較したところ、ｇＨ３２ １，ｋｇＨ３３１およびｋｇＨ３４１についてｃＬと共発現させた場合、抗体が 産生じた。発現は一般的に低かったが、その遺伝子のシグナル配列のＡＴＧに対 し５′にＫｏｚａｋコンセンサス配列を挿入することにより顕著な改善が可能て あった。ｇＬ遺伝子の場合、このような挿入で正味抗体の産生が２〜５倍に増加 した例である。しかしなから、ｇＨ３４１／ｍＬまたはｋｇＨ３４１／ｃＬの場 合には、最低の抗原結合活性しか認められなかった。ｋｇＨ３４１遺伝子をｋｇ Ｌ２２１Ａと共発現させた場合、抗体の正味収率は、抗原結合アッセイにおける バックグランドレベル以上のシグナルを与えるほど高くはなかった。

１５．２．２．　枠組み残基 軽鎖の場合と同様、重鎮の枠組みを再検討した。軽鎖に比べてマウスとヒト重鎮 可変ドメイン間の初期ホモロジーが低いことによると思われるが、より多くのア ミノ酸位置に興味のあることが明らかにされた。ｇＨ３４１に比べて１１または ８個のヒト残基をそれぞれマウス残基で置換し、またＣＤＲ残基６３をヒトアミ ノ酸に戻して、多分、ドメイン充填が改善された２種の遺伝子ｋｇＨ３４１Ａお よびｋｇＨ３４１Ｂを構築した。いずれもｃＬまたはｋｇＬ２２１Ａと混合した 場合に抗原結合を示し、すべての１１の変化をもつｋｇＨ３４１Ａ遺伝子か優れ た選択であることを示している。

１５、３．　当面の結論 すなわち、０ＫＴ３については、抗原結合能を人体化抗体に移入するために、Ｋ ａｂａｔの超可変性または構造ループ選択によって定められるＣＤＲ領域の外側 にも、軽鎖および重鎮の両者でマウスの残基が必要であることか明らかにされた 。軽鎖では余分の残基の数が少ないか、これはマウスとヒトのカッパー可変領域 の間の初期のホモロジーか高いことによるものと考えられる。

変化のうちの７つ（軽鎖からの１および３と重鎮からの６．２３，７１．７３お よび７６）は、他の抗体の構造についての部分的に露出しているまたは抗体表面 上にあるとの知識から予想される。この場合、軽鎖の１および３は絶対にマウス 配列である必要はないこと、また重鎮についてはｇＨ３４１Ｂ　Ｈ鎖の２２１Ａ 軽鎖との組合わせは弱い結合活性しか生じないことが明らかにされている。した がって、マウス抗体の場合と類似の結合親和性を維持するためには、６，２３お よび２４の変化の存在か重要である。したがって、ｌ（ｇＨ３４１Ａ遺伝子の他 の８個のマウス残基のｋｇＨ３４１と比較した個々の寄与をさらに研究すること が重要であった。

１６、その他のＣＤＲ接木実験 さらにＣＤＲ接木Ｈ鎖遺伝子を実質的に上述のようにして製造した。表２に示す ように、その他の重鎮遺伝子はｇｈ３４１（プラスミドｐＪＡ１７８）およびｇ Ｈ３４１Ａ（プラスミドｐＪＡ１８５）に基づくもので、指示したように６．２ ３．２４，４８，４９，６３゜７１．７３．７６．７８．８８および９１にはマ ウス０ＫＴ３またはヒトＫＯＬ残基のいずれかを有する。これらのその他の実験 に使用したＣＤＲ接木軽鎖遺伝子は、上述のようにｇＬ２２１．ｇＬ２２１Ａお よびｇＬ２２１Ｃであった。

に、完全接木生成物については図１３に示す。これらの結果は、基本的接木生成 物が０ＫＴ３マウス対照標準に比べて無視できる程度の結合親和性しが示さない のに対し、［完全接木」生成物は０ＫＴ３マウス対照標準の場合にきわめて類似 する結合能を有することを示している。

結合および遮断アッセイの結果は次の事項を示している。

ＪＡＩ９８およびＪＡ２０７構築体は最良の結合特性を有し、両者ともキメラお よび完全接木ｇＨ３４１Ａ生成物と実質的に等しい類似の結合能を育すると思わ れる。

これは、位置８８および９１ならびに位置７６が０ＫＴ３の結合能の維持にはあ まり重要でないこと、一方、位置６，２３．２４，４８．４９．７１．７３およ び７８の少なくとも一部はより重要であることを示している。

これは、ＪＡ２０９およびＪＡ１９９が、互いに類似の結合能をもつが、ＪＡ１ ９８およびＪＡ２０７構築体よりも結合能は低いことによっても支持される。こ れは、ＪＡ１９９およびＪＡ２０９構築体ではそれぞれすべてがまたは一部がヒ トである位置７１．７３および７８においてマウス残基をもっことの重要性を示 している。

さらに、ＪＡ２０５およびＪＡ１８３構築体について得られた結果と比較すると 、ＪＡ２０５がらＪＡ１８３構築体にいくと結合が低下することが認められる。

これは、ＪＡ２０５とＪＡ１８３で異なる唯一の位置、位置２３にマウス残基を 維持することの重要性を示している。

これらの結果および他の結果から、本発明者らは、ｇＨ３４１Ａ（ＪＡ１８５） 構築体中に用いられた１１個のマウス枠組み残基中、６，２３，２４．４８およ び４９のすへて、および最大の結合親和性のためには多分、７１．７３および７ ８て、マウス残基を維持することが重要であるとの結論を導いている。

類似の実験を、ＣＤ４　（ＯＫＴ４）、ＩＣＡＭ−１（Ｒ６−５）、ＴＡＧ７２ 　（８７２，３）、およびＴＮＦα（６１Ｅ７１，１０１．４．ｈＴＮＦｌ、ｈ ＴＮＦ２およびｈＴＮＦ３）に対して特異性を存する抗体を含めた多数のげっ書 類抗体のＣＤＲ接木について実施した。

抗○ＫＴ４Ａ　ＣＤＲ接木重鎖および軽鎖遺伝子を、ＣＤＲ接木０ＫＴ３につい て例１に上述したと実質的に同様にして、製造し、発現し、試験した。０ＫＴ４ ＡのＣＤＲ接木は、本出願と同日に出願された、名称「人体化抗体」の０ｒｔｈ ｏ特許出願ＰＣＴ／ＧＢ９０．、、、。

に詳細に記載されている。この叶ｔｈｏ特許出願ＰＣＴ／ＧＢ９０．、、、、、 、の開示は参考として本明細書に導入する。多数のＣＤＲ接木○ＫＴ４抗体が製 造された。

現時点で好ましいＣＤＲ接木０ＫＴ４Ａは接木軽鎖ＬＣＤＲ２と接木型ＭＨＣＤ ＲＩＯの組合わせである。

接木り鎖に使用したヒトアクセプター枠組みはＲＥＩであった。好ましいＬＣＤ Ｒ２の軽鎖は、構造ループＣＤＲに加えて、位置３３，３４，３８．４９および ８９にヒトからマウスへの変化を有する。これらの変化させた位置のうち、位置 ３３．３４および８９は、本発明の好ましい拡大されたＣＤＲ内に存在する（位 置３３および３４はＣＤＲｌ内に、位置８９はＣＤＲａ内に）。位置３８および ４９におけるヒトからマウスへの変化は、本発明により、アミノ酸残基は好まし くはドナーのマウスアミノ酸残基である位置に相当するものである。

ドナーマウス軽鎖可変ドメインとＲＥＩヒトアクセプター軽鎖可変ドメインのア ミノ酸配列の比較によりさらに、位置４６．４８および７１のすべて、ならびに 位置２．４，６，３５，３６．４４．４７．６２．６４〜６９．８５．８７，９ ８．９９および１０１と１０２のすべてで同一であることが明らかにされた。し かしながら、ＬＣＤＲ２の位置５８のアミノ酸残基は、ヒトＲＥＩ枠組みで、本 発明によれば好ましいと思われるマウス０ＫＴ４残基ではない。

重鎮 接木重鎮に用いられたヒトアクセプター枠組みはＫＯしてあった。

好ましいＣＤＲ接木ＨＣＤＲＩＯ重鎖は、構造ループＣＤＲに加えて、位置２４ ．３５，５７，５８．６０．８８および９１にヒトからマウスへの変更かある。

これらの位置のうち、位置３５（ＣＤＲＩ）および位置５７，５８．６０　（Ｃ ＤＲ２）は本発明の好ましい拡大されたＣＤＲ内にある。また位置２４における ヒトからマウスへの変化は、本発明によりアミノ酸残基かドナーマウス残基であ る位置に相当する。さらに、位置８８および９１におけるヒトからマウスへの変 化は、アミノ酸残基がドナーマウス残基であってもよい位置に相当する。

さらに、マウス０ＫＴ４ＡとヒトＫＯＬの重鎮の可変アミノ酸配列の比較から、 マウスおよびヒト残基は、位置２３，４９．７１．７３および７８のすべて、な らびに位置２．　４．　６．　２５．　３６．　３７．　３９．　４７゜４８． ９３．９４，１０３，１０４，１０６および１０７のすべてで同一であることが 明らかにされた。

しタカッテ、０ＫＴ４Ａ　ＣＤＲ接木重鎮ＨＣＤＲ１０ハ本発明のとくに好まし い実施態様に相当する。

例　３ 抗−ムシン特異的マウス抗体、Ｂ７３．２のＣＤＲ接木抗−ムシン特異的マウス モノクローナル抗体８７２．３をコードする遺伝子のクローニングおよびＢ７２ ．３マウス−ヒトキメラ抗体の製造は以前に記載されている（１３およびＷＯ８ ９１０１７８３）。Ｂ７２．３のＣＤＲ−接木形式は次のようにして調製された 。

（ａ）　Ｂ７２．３軽鎖 この軽鎖のＣＤＲ−接木は、マウスＣＤＲのヒト軽鎖ＲＥＩの枠組み中へ直接移 入によって達成された。移送された領域は次の通りであった。

得られた接木軽鎖の活性は、Ｒ７２，３ｃＨ／Ｂ７２．３ｃＬおよびＢ　７２． ３　ｃ　Ｈ／Ｂ　７２．３　ｇＬの組合わせのＣＯ３細胞中共発現によって評価 した。

上清について、抗体濃度と、ムシンでコートしたマイクロタイタープレートに結 合する能力を検定した。得られた結果は、Ｒ７２，３ｃＨ鎖、Ｒ７２，３ｃＬお よびＲ７２，３ｇＬとの組合わせは類似の結合性を示した。

マウスＢ７２．３とＲＥＩ重鎖アミノ酸配列の比較から、残基は位置４６．５８ および７１で同一であるが、位置４８は異なることが明らかである。

したがって、位１ｔ４８におけるヒト残基のドナーマウス残基への変化はさらに 、本発明によるＣＤＲ接木軽鎖（８７２，３ｇＬ）の結合特性を改善すると考え られる。

（ｂ）　８７２．３重鎖 ｉ、　枠組みの選択 最初、ヒト枠組みの選択が必要であった。単純に問題は次の通りであった。結晶 構造が既知であった抗体からの枠組み領域の使用が必要か、または選択は何らか の他の基準に基づいて実施できるか、てあった。

８７２．３重鎖の場合、構造の知識は重要ではあったが、ドナーとレセプターの 枠組みの間の全体的ホモロジーが最大になった場合、マウスからのＣＤＨのヒト 枠組みへの移入は容易になる筈である。８７２．３重鎖配列をヒト重鎮について のＫａｂａｔの場合（４）と比較すると、８７２．３のＫＯＬおよびＮＥＷＭ　 （これらについては結晶構造が利用できる）とのホモロジーは低かったがＥＵの 重鎮とはきわめて高いホモロジーを示した。この基盤により、ＥＵをＣＤＲ接木 のために選択し、以下の残基をＣＤＲとして移入した。

また、ＥＵのＦＲ４領域は、どの他のヒト（またはマウス）抗体のそれとも類似 しなかったことが注目された。

その結果、接木重鎮遺伝子では、これも［コンセンサスフヒト配列を生じるよう に変化させた（予備的実験で、ＥＵ　ＥＲ４配列を含存する接木重鎮遺伝子は一 時的発現系での発現がきわめて貧弱であることが示された）。

ｉｉ、接木重鎮遺伝子による結果 すべてのヒト枠組み領域をｇＬまたはｃＬ遺伝子とともに含有する接木重鎮遺伝 子の発現では、ムシンへの結合能はほとんどない接木抗体が産生じた。接木抗体 はキメラ抗体の活性の約１％の活性を示した。しかしながら、これらの実験では 、接木抗体の活性はｐｉ（２〜３．５に曝露することによってＲ７２，３の約１ ０％まで増大できることか明らかにされた。

この観察は、酸処理をしないで、接木抗体の活性を改善できる方法の手がかりを 提供した。酸への曝露は酸性残基（ｐＫａは、アスパラギン酸で３．８６．　グ ルタミン酸で４．２５）のプロトン化をもたらし、一方これがＣＤＲループの構 造を変化させ、また抗原への接近の改善を可能にするものと推測される。８７２ ．３（１３）とＥＵ（４およびＳ）の配列の比較すると、マウスからヒト枠組み になっても、ただ２個の位置で酸性残基が導入されるという変化があるのみであ ることは明白であった。これらの位置は残基７３と８１であって、それぞれＫか らＥ、ＱからＥへの変化がそれぞれ起こった。

これらの位置のいずれが重要かは、ＫＯＬ抗体の結晶構造を調べることによって 決定された。ＫＯＬの重鎮では、位置８１はいずれのＣＤＲループから遠く離れ ている。しかしながら、位置７３は重鎖のＣＤＲｌおよび３の両者に接近し、こ の位置では、この領域におけるＫからＥへの変化か抗原結合に有害な影響を与え るであろうことが推察できた。

ｌ自、８７２．３ｇＨ遺伝子における枠組みの変化上述の解析に基づいてＲ７３ はリジン（Ｋ）に変異させた。この変化は、接木Ａｂのムシンへの結合能に劇的 な影響を与えることが見出された。さらに突然変異ｇＨ／ｇＬの組合わせによっ て製造した接木Ｂ７２．３のムシンへの結合能は、Ｒ７２，３キメラ抗体の場合 と類似して上記実験の過程で、重鎮の枠組み領域に他の変化も作成した。使用し たアッセイの精度の範囲内で、単独でも組合わせでも有益な変化は認められなか った。

■、　その他 接木Ａｂのムシンに結合する能力の測定に用いられたすべてのアッセイは、また 全体として、位置７３における枠組みの単一の変化が８７２．３に類似の結合特 性をもつ抗体の生成に十分であることを示している。

Ｒ７２，３マウスおよびＥＵの重鎮配列の比較から、マウスとヒト残基は位置２ ３，２４．７１および７８で同一なことが明らかである。

すなわち、突然変異ＣＤＲ接木接木８７２宣３明の好ましい実施態様に相当する 。

例　４ マウス抗−ＩＣＡＭ−　１モノクローナル抗体のＣＤＲ接木分子間付着分子１　 （ＩＣＡＭ−　１　）に対して特異性を有するマウス抗体，　Ｒ６−５−Ｄ６　 （ＥＰｏ　３　１　４　８　６　３）を前例に記載したと実質的に同様にして、 ＣＤＲ接木した。この操作は、係属中の出願、英国特許出願第９００９５４９． ８号にきわめて詳細に記載されている。

この開示は参考として本明細書に導入する。

重鎮および軽鎖の両者に、アクセプター枠組みとしてはヒトＥＵ枠組みを用いた 。現時点でまず選ばれるＣＤＲ接木抗体は、接木軽鎖ｇＬ２２１Ａと接木重鎖ｇ Ｈ３４，ＩＤの共発現によって得られ、ＩＣＡＭ−１に対して、相当するマウス −ヒトキメラ抗体の場合の約７５％の結合親和性を存する。

軽鎖 ｇＬ２２１Ａは位置２４〜３４　（ＣＤＲＩ）、５０〜５６　（ＣＤＲ２）およ び８９〜９７　（ＣＤＲ３）にマウスＣＤＲを存する。さらに、数個の枠組み残 基もマウスアミノ酸である。これらの残基は、これらの残基のドメイン充填およ び抗原結合領域の安定化への寄与の可能性を考慮して選択された。マウスとして 維持された残基は、位置２，３．４８　（？）、６０．８４．８５および８７で ある。マウス抗−ＩＣＡＭ　１およびヒトＥＵの軽鎖アミノ酸配列の間の比較か ら、マウスおよびヒト残基は、位置４６．５８および７１で同一なことが明らか である。

重鎮 ｇＨ３４１Ｄは位置２６〜３５　（ＣＤＲＩ）、５０〜５６　（ＣＤＲ２）およ び９４〜１００Ｂ　（ＣＤＲ３）にマウスＣＤＲを有する。さらに、ｇＨ３４１ Ｄ中に用いられたマウス残基は、位置２４．４８，６９．７１゜７３．８０．８ ８および９１であった。マウス抗−１ｃＡＭｌとヒトＥＵ重鎖の比較から、アミ ノ酸配列は位置２３゜４９および７８て同一である。

例　５ 多数のマウス抗−ＴＮＦαモノクローナル抗体を、前例に上述したと実質的に同 様にして、ＣＤＲ接木した。

これらの抗体には６１Ｅ７１．ｈＴＮＦｌ、ｈＴＮＦ３および１０１．４の名称 のマウスモノクローナル抗体が包含される。これらの各抗体のＣＤＲ接木の簡単 な要約を以下に掲げる。

１Ｅ７１ 上述（例１，１２．１の項）したと類似の解析を６１Ｅ７１について行い、重鎮 にマウスと同様維持されている可能性のある残基として、２３，２４，４８，４ ９゜６８．６９，７１．７３．７５および８８を同定した。

この抗体、ならびにｈＴＮＦＳおよび１０１．４抗体のＣＤＲ接木のために選ば れたヒト枠組みは、軽鎖ではＲＥｌ２重鎖ではＫＯＬとした。３種の遺伝子を組 立て、その第一のものは、マウス残基として２３．４８，４９゜７１および７３ を含存した（ｇＨ３４１（６）　）。第二の遺伝子はまたマウス残基として７５ と８８も有しくｇＨ３４１（８）　）　、一方、第三の遺伝子はさらに６８．６ ９．７５および８８にマウスの残基を有していた（ｇＨ３４１（１０））。それ ぞれを、最低の接木軽鎖（ＣＤＲのみ）であるｇＬ２２１と共発現した。ｇＬ２ ２１／ｇＨ３４１（６）およびｇ　Ｌ　２２１　／　ｇ、Ｈ３４１（８）抗体は いずれも、マウス６１Ｅ７１と同様にＴＮＦに結合した。ｇＬ２２１／ｇＨ３４ １（１０）は発現せず、この組合わせについてこれ以上取り上げなかった。

次に、ｇＬ２２１／ｇＨ３４１（６）抗体はＬ９２９細胞中、抗体がＬ９２９細 胞上のＴＮＦ受容体に対して溶液中のＴＮＦへの結合に代わって競合する競合ア ッセイで評価した。このアッセイでは、ｇＬ　２２１／ｇＨ３４１（６）抗体は マウス６１Ｅ７１の約１０％の活性ｈＴＮＦ　１はヒトＴＮＦ上のエピトープを 認識するモノクローナル抗体である。重鎮および軽鎖可変ドメインの両者のＣＤ Ｒ接木にＥＵヒト枠組みを使用した。

見幕 ＣＤＲ接木重鎮（ｇｈＴＮＦ　１）には、位置２６〜３５　（ＣＤＲＩ）、５０ 〜６５　（ＣＤＲ２）および９５〜１０２　（ＣＤＲ３）にマウスＣＤＲを使用 した。マウス残基は枠組みの位置４８．６７．６９，７１．７３゜７６．８９， ９１．９４および１０８にも使用した。ＴＮＦＩとＥＵヒト重鎖残基の比較から 、これらは位置２３．２４．２９および７８において同一なことか明らＲは位置 ２４〜３４　（ＣＤＲＩ）、５０〜５６（ＣＤＲ２）および８９〜９７（ＣＤＲ ，３）に使用した。

さらにマウス残基は、枠組みの位置３，４２，４８，４９．８３，１０６および １０８にも使用した。ｈＴＮＦｌマウスおよびＥＵヒト軽鎖残基の比較から、こ れらは位置４６．５８および７１において同一なことか明らかである。

接木ｈＴＮＦ　１重鎖をキメラ軽鎖と共発現し、生成物の結合能を、キメラ軽鎖 ／キメラ重鎖生成物の場合と、ＴＮＦ結合アッセイで比較した。接木重鎮生成物 は、完全キメラ生成物よりもわずかに良好なＴＮＦに対する結合能を有するよう に思われた。

同様に、接木重鎖／接木軽鎖生成物を共発現し、完全キメラ生成物と比較し、後 者の生成物ときわめて類似した結合特性を存することを見出した。

ＴＮＦ３ ｈＴＮＦ３はヒトＴＮＦ−α上のエピトープを認識する。ｈＴＮＦ３の配列は、 ６１Ｅ７１と比較すると、軽鎖および重鎮可変領域中にわずかに２１Ｌか異なる 残基かない。１０個か軽鎖（２個がＣＤＲ中５０．９６で、８個が枠組み中１． １９，４０．４５．４６．４７゜１０３および１０６）、１１個が重鎮（３個が ＣＤＲ領域内５２．６０および９５で、８個が枠組み中１．１０゜３８．４０． ６７．７３．８７および１０５）にある。

６１Ｅ７１およびｈＴＮＦ３キメラ抗体の軽鎖と重鎖は交換しても、直接結合ア ッセイにおいて活性の低下は認められない。しかしながら、６１Ｅ７１は、ＴＮ Ｆ−αに対するＬ９２９細胞上のＴＮＦ受容体での競合をｈＴＮＦ３と比較する と、ｌオーダー低い。６１Ｅ７１ＣＤＲ接木データに基づいて、ｇＬ２２１およ びｇＨ３４１（マウスとして、＋２３．２４．４８，４９．７１および７３）遺 伝子をｈＴＮＦ３のために組立て試験したところ、得られた接木抗体はＴＮＦ− αとよく結合するが、Ｌ９２９アッセイにおける競合はきわめて貧弱である。

この場合も、０ＫＴ３プログラムで確認された枠組み残基はこの抗体の競合結合 能を改良することが可能である。

１０１．４ １０１．４はヒトＴＮＦ−αを認識できる別のマウスモノクローナル抗体である 。この抗体の重鎮はＫＯＬと良好なホモロジーを示し、したがってＣＤＲ接木は 、軽鎖についてはＲＥ　ｌ、重鎮についてはＫＯＬに基づいて行われた。数種の 接木重鎮遺伝子をＣＤＲについては保存的選択で構築しくｇＨ３４１）　、非Ｃ ＤＲ残基の位置７３．７８もしくは７７〜７９（前後を含む）の１個もしくは少 数をマウスアミノ酸とした。これらをｃＬまたはｇＬ’２２１と共発現させた。

いずれの場合も、キメラ抗体に匹敵するＴＮＦへの結合が認められ、ｃＬと共発 現させた場合には得られた抗体はＬ９２９アッセイでよく競合することができる 。しかしながら、ｇＬ２２１とては、得られた抗体は、Ｌ９２９細胞上ＴＮＦ受 容体に対するＴＮＦとの競合が少なくとも１オーダー低い値を示す。

重鎮の他の位置、たとえば２３と２４の両者または７６におけるマウス残基は、 接木抗体のＬ９２９アッセイでの競合能に改善を与えないことが明らかにされた 。

本発明によれば、インターロイキンたとえばＩＬ−１や癌胎児性抗原（ＣＥＡ） のような癌マーカーに対して特異性を有する抗体、たとえばモノクローナル抗体 Ａ３Ｂ７（２１）を含めた多数の他の抗体のＣＤＲ接木が成功している。上述の 例は単に例示のために示したものであって、本発明の範囲の限定を意図するもの ではないことに注意すべきである。上述の方法には、本発明の精神および範囲か ら逸脱することなく、多くの変更および修飾か可能である。

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１３５、　４２１５゜ １６、Ｗａｌｌｉｃｋ、Ｓ、Ｃ，、Ｋａｂａｔ、Ｅ、Ａ、、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、 Ｓ、Ｌ、。

１９８８、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１　６　Ｂ、１　０　９　９゜１７、Ｂｅｂｂ ｉｎｇｔｏｎ、　Ｃ，Ｒ，、公告国際特許出願ＷＯ３９１０１０３６゜ １８、Ｇｒａｎｔｈａｎ　＆　Ｐｅｒｒｉｎ、ｌ　９８６．　Ｉｍｍｕｎｏｌｏ ｇｙＴｏｄａｙ、ヱ、１６０゜ １９、　Ｋｏｚａｋ、Ｍ、、　１　９８　７．　Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１ ９６゜９４７゜ ２０、　Ｊｏｎｅｓ、−Ｔ、Ｐ、、Ｄｅａｒ、Ｐ、Ｈ，、Ｆｏｏｔｅ、Ｊ、、Ｎ ｅｕｂｅｒ−ｇｅｒ、Ｍ、Ｓ、、Ｗｉｎｔｅｒ、Ｇ、１　９８６．Ｎａｔｕｒｅ 、３２　１゜５２２゜ ２１、Ｈａｒｗｏｏｄ　ら、Ｂｒ、Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ、　５４．　７５〜Ｌ２ （１９８６）。

ｌ　ＧＡＡＴＴＣＣＣＡＡＡＧＡＣＡＡＡ　ｔ　ａ　ｔｔｔｃ　ａ　ｔ　Ｃｃｌ 　ｔｔｔ　Ｃａ　ｔ　ｔｌｏｇ　ｇｔｃｔｃｃａｇｃａ　ａｔｃａｔｇｔｃｔｇ 　ｃａｔｃｔｃｃａｇｇ　ｇｇａｇａａｇｇｔｃ　ａｃｃａｔｇａｃｃｔ１５１ 　ｇｃａｇｔｇｃｃａｇ　ｃｔｃａａｇｔｇｔａ　ａｇｔｔａｃａｔｇａ　ａｃ ｔｇｇｔａｃｃａ　ｇｃａｇａａｇｔｃａ２０１　ｇｇｃａｃｃｔｃｃｃ　ｃｃ ａａａａｇａｔｇ　ｇａｔｔｔａｔｇａｃ　ａｃａｔｃｃａａａｃ　ｔｇｇｃｔ ｔｃｔｇｇ４５１、ａｇｔｔａａｃａｔｃ　ｔｇｇａｇｇｔｇｃｃ　ｔｃａｇｔ ｃｇｔｇｔ　ｇｃｔｔｃｔｔｇａａ　ｃａａｃｔｔｃｔａｃ５０：Ｌ　ｃｃｃａ ａａｇａｃａ　ｔｅａａｔｇｔｃａａ　ｇｔｇｇａａｇａｔｔ　ｑａｔｇｇｃａ ｇｔｇ　ａａｃｇａｃａａａａ５５１　ｔｇｇｃｇｔｃｃｔｇ　ａａｃａｇｔｔ ｇｇａ　ｃｔｇａｔｃａｇｇａ　ｃａｇｃａａａｇａｃ　ａｇｃａｃｃｔａｃａ ６０１　ｇｃａｔｇａｇｃａｇ　ｃａｃｃｃｔｃａｃｇ　ｔｔｇａｃｃａａｇｇ 　ａｃｇａｇｔａｔｇａ　ａｃｇａｃａｔａａｃ６５１　ａｇｃｔａｔａｃｅｔ 　ｇｔｇａｇｇｃｃａｃ　ｔｃａｃａａｇａｃａ　ｔｃａａｃｔｔｃａｃ　ｃｃ ａｔｔｇｔｃａａ７０１　ｇａｇｃｔｔｃａａｃ　ａｇｇａａｔｇａｇｔ　ｇｔ ＴＡＧＡＧＡＣＡ、ＡＡＧＧＴＣＣＴＧＡ　ＧＡＣＧＣＣＡＣＣＡ５１　ＶＳＹ ＫＮＷＹＱＱＫ　５ＧＴＳＰＫＲＷＴＹ　ＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰ入ＨＦＲＧＳＧ ＳＧＴ　ＳＹＳＬＴＩＳＧＭＥｌｏｌ　ＡＥＤＭＴＹＹＣＱ　ＱＷＳＳＮＰＦＴ ＦＧ　５ＧＴＫＬＥＸＮＲ）、ＤＴＡＰＴＶＳＩＦＰ　ＰＳＳＥＱＬＴＳＧＧ１ ５１　ＡＳＷＣＦＬＮＮＦ　ＹＰＫＤＩ）ｆＶＫＷ’Ｋ　よりＧＳＥＲＱＮＧＶ 　ＬＮＳＷＴＤＱＤＳＫ　ＤＳＴＹＳＭＳＳＴＬ２０１　ＴＬＴＸＤＥＹＥＲＨ Ｎ５ＹＴＣＥＡＴ）ＤＫ　ＴＳＴＳＰ工ＶＫＳＦ　ＮＲＮＥＣ責ｒ：＃　１／Ｌ Ｊ １ＧＡＡＴＴＣＣＣＣＴ　ＣＴＣＣＡＣＡＧＡＣＡＣＴＧＡＡＡＡＣＴ　ＣＴＧ ＡＣ′ｒＣＡＡＣに匹辺込へＺ逗１５５１　人λ譚υｕリュＡＡＡＡＡＧＧＡＡ ＴＴＣＤＮＡ配列から推測される０ＫＴ３重鎖蛋白質配列３５１　ＡＪ’工］： ＲＴＸＳＫＰ　ＫＧＳＶＲＡＰＱＴ／Ｙ　ＶＬＰＰＰＥＥＤｆＴ　ＫＫＱＶＴＬ Ｔ口！’Ｖ　ＴＤＦＭＰＥＭＹＶＮ’ＮＮ　Ｎ　ＮＮ 残基タイプ　ＳＢｓｐＳＰＥＳｓｓＢＳｂＳｓｉＳｓｓＰＳＰＳＰｓＰＳｇｓａ 相☆ｐ＊Ｐｉ−工５ｓＳｅＣＤＲＩ　（ルーフ）　會☆舎會★☆☆ＣＤＲＩ　（ ＫＡＢＡＴｌ　會脅☆☆舎會倫會☆會★残基タイフ　★工５ｉＰｐｘａａｓａｓ ｓｓＳＢＥｓａＰｓＰＳＢＳＳＥｓＰｓｐｓＰｓｓａａｓＳＰｅＰｂ★會★☆會 会☆　ＣＤＲ２（ル−フγに入ＢＡＴ）☆索☆彎☆＊　ＣＤＲコ　（ル−フ） 會★倫★☆☆會＊書　ＣＲＤコ　（ＫＡｊｌ入Ｔ）ＮＮＮ　２３　２６　３２　 ３５Ｎ３９　４コ残基タイプ　５ＥＳＰｓ　−５ＢｓｓＳ　−５ＳＳｓＳｐＳｐ ＳＰｓＰＳＥｂＳＢｓｓＢｅＰｉＰ工ｐｉａｓｓｓ☆☆☆☆☆☆　ＣＤＲ１（ル ー乃 ☆嚢☆嚢嚢ＣＤＲ１（ＫＡＢＡＴ） ５２ａ　６０　６５　ＮＮ　Ｎ　Ｂ２ａｂｃ　８９”Ａ基９　イア’　エエａＩ ｐｐｐ−ｓｓｓｓｓｓｓｓ−ｐｓ−ｐｓｓｓｂｓｐｓａｓｓｓｓａｓｐ−ｐｓｐ ｓｓＢｓｓｓ−ａＰｂ★★☆★★会會會會☆☆☆　ＣＤＲ２（／ｌ／−７）會嚢 ★會會☆會☆★嚢☆會★☆☆☆☆☆★　ＣＤＲ２（ＫＡＥＡＴ）９２Ｎ　１０７ 　１１３ 残基タイプ　ｐｉｐ工Ｅｉｓｓｓｓｉｉｉｓｓｓｂｉｂｉ☆Ｅ工Ｐ工Ｐ＊５ｐＳ ＢＳＳＯｋｔ３ｖｈ　ＹＹＣＡＲＹＹＤＤＨＹ、、、、、、−ＣＬＤＹＷＧＱＧ ＴＴＬＴＶＳＳ★會會會☆☆會會☆★會☆★★☆☆★　ＣＲＤ３　（ＫＡＢＡＴ ／／レーア）ＯＫＴ　３　ＨＥＡＶＹ　ｔｉｃ　Ｄ　Ｒ接木Ｌ　ｇｈ３４１およ び誘導体 １　２６　コ５　３９　４３ ｑＨ３４１ｋ　ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲ５ＬＲＬＳＣＫＡ　ＱＡＰＧ Ｋ　ＪＡＩＩ３５ｇＨ３４１ｃ　ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲ５ＬＲＬＳ ＣＫＡ　ＱＡＰＧＫ　ＪＡ１８４４４　５０　６５　８：１ ９Ｈ３４１Ａ　ＧＬｙ工ＧＰ　ＲＲＦＴ工ＳよりＫＳＫｊＴ、ｉ％ＦＬＱＭＤｓ ＬＲＪｊｕ８５ｇＨ３４１ｃ　ＧＬＥＷＶＡ　ＲＦＴ正ＲＤＮＳＫＮＴＬＦＬＱ ＫＤＳＬＲＪＡ１８４ＫＯＬ　ＧＬＥＷＶＡ工ＩＷＤＤＧＳＤＱＨＹＡＩ）ＳＶ ＫＧＲＦＴ工ＳＲＤＮＳＫＮＴＬＦＬＱＭＤＳＬＲ筺ｉ門　日ｒｉｉ１ ８４　９５　１０２　１１：１ ０ｋｔ３ｖｈ　５ＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＹＹＤＤＨＹ、、、、、、−ＣＬＤＹＷ ＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳｇＨ］４１Ｅ　ＰＥＤＴＧＶＹＦＣＡＲ、、、、、、、Ｃ ＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ　ＪＡ１９ＢｇＨ：３４１＊　ＰＥＤＴＧＶＹＦＣ ＡＲ、、、、、、ＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ　ＪＡ２０７ｑＨ３４１Ｄ　ＰＥ ＤＴＧＶＹＦＣＡＲ、、、、、、ＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ　ＪＡ１９７ｇＨ ３４１ｃ　ＰＥＤＴＧＶＹＦＣＡＲ、、、、、、ＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ　 ＪＡ１８４ｇＨ３４１Ｂ　ＰＥＤＴＡＶＹＹ：ＣＡＲＹ　ＤＹ、、、、、、、Ｃ ＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ　ＪＡｌＢ：１ｑＨコ４１＊　ＰＥＤＴＧＶＹＦＣ ＡＲ、、、、、、、ＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ　ＪＡ２０８ＯＫ　Ｔ　３軽量 ｃＤＲ接木 １・　ｇＬ２２１および誘導体 ＲＥ工　ＡＰＫＬＬＩＹＥＡＳＮＬＱＡＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＦＴ 工ＳＳＬＱＰＥＩＭＡＴ０ｋｔ３ｖｌ　ＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＦＴＦＧＳＧＴＫ ＬＩＪＮＲｑＬ２２１Ｂ　ＹＹｃ刈促近「ＦＧＱＧＴＫＬＱｒＴＲＣＤＲには下 線を付す 遺伝子中に包含される枠組み残基には二重の下線をイ寸す蛍光強度 遮断アッセイ （平均チャネル−ＨＰＢＡｕＭＡ胞） 抗体　（ｎ９　／管　） Ｆｉｇ、９ Ｆｉｇ、１０　０ＫＴ３−　接木型ｇ結合ｒ、ｙセイ接木重鎖遮断アッセイ 抗体　（ｎｇ／管） Ｆｉｇ、　１１　０にＴ３−　接重鎮結合アンセイ抗体　（ｎｇ／管） ＯにＴ３　接木重鎮遮断アッセイ 抗体　い９Ｉ管） 結合／遊離 要約書 アクセプターの枠組みとドナー抗原結合領域からなるＣＤＲ接木抗体の重鎮及び 軽鎖であって、その重鎮が位置（６，２３）および／または（２４，４８）およ び／または（４９，７１）および／または（７３，７５）および／または（７６ ）および／または（７８）および（８８）および／または（９１）の少なくとも ひとつにドナー残基を有し、そしてその軽鎖が位置（１）および／もしくは（３ ）ならびに（４６）および／もしくは（４７）の少なくともひとつまたは位置（ ４６，４８゜５８）および（７１）の少なくともひとつにドナー残基を有する。

ＣＤＲ接木抗体は、非ヒトたとえばげっ歯頚ドナーとヒトアクセプター枠組みを 有する人体化抗体であることが好ましく、ｉｎ　ｖｉｖｏ治療及び診断に用いる ことができる。ＣＤＲ接木抗体を得るために用いることのできる一般的プロトロ ールが記載されている。

国際調査報告 １＋ｎｅｎｔｌｌｌｅｌＩＩＩＡ＠１１ｅｓｌｌａｅＮＬ　ＰＣＴ／ＧＯ９０７ ０２０１７国際調査報告 ＰＣＴ／ＧＯ９０１０２０１７ Ｓ＾　４３０８０

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. １．アクセプターの枠組みとドナーの抗原結合領域からなる可変領域ドメインを 有するＣＤＲ接木抗体重鎖において、枠組みは、位置６，２３および／または２ ４，４８および／または４９，７１および／または７３，７５および／または７ ６および／または７８ならびに８８および／または９１の少なくともひとつはド ナー残基であるＣＤＲ接木抗体重鎖。
2. ２．位置２３，２４，４９，７１，７３および７８，または位置２３，２４およ び４９はドナー残基である「請求項１」記載のＣＤＲ接木抗体重鎖。
3. ３．位置２，４，６，２５，３６，３７，３９，４７，４８，９３，９４，１０ ３，１０４，１０６および１０７はドナー残基である「請求項１」記載のＣＤＲ 接木重鎖。
4. ４．位置１および３，６９（４８がドナーとアクセプター間で異なる場合），３ ８および４６（４８がドナー残基の場合），６７，８２および１８（６７がドナ ー残基の場合），９１，のひとつ、一部またはすべて、ならびに９，１１，４１ ，８７，１０８，１１０および１１２のいずれかひとつもしくは２つ以上がドナ ー残基である「請求項２または３」記載のＣＤＲ接木重鎖。
5. ５．位置２６〜３５，５０〜６５および９５〜１００はドナーのＣＤＲである「 請求項１〜４」のいずれかに記載のＣＤＲ接木重鎖。
6. ６．アクセプターの枠組みとドナーの抗原結合領域からなる可変領域ドメインを 有するＣＤＲ接木抗体軽鎖において、枠組みは、位置１および／または３ならび に４６および／または４７の少なくともひとつはドナー残基であるＣＤＲ接木抗 体軽鎖。
7. ７．位置４６および４７はドナー残基である「請求項６」記載のＣＤＲ接木抗体 軽鎖。
8. ８．アクセプターの枠組みとドナーの抗原結合領域からなる可変領域ドメインを 有するＣＤＲ接木抗体軽鎖において、枠組みは、位置４６，４８，５８および７ １の少なくともひとつはドナー残基であるＣＤＲ接木抗体軽鎖。
9. ９．位置４６，４８，５８および７１はドナー残基である「請求項８」記載のＣ ＤＲ接木抗体軽鎖。
10. １０．位置２，４，６，３５，３６，３８，４４，４７，４９，６２，６４〜６ ９，８５，８７，９８，９９，１０１および１０２はドナー残基である「請求項 ８または９」記載のＣＤＲ接木抗体軽鎖。
11. １１．位置１および３，６３，６０（６０と５４が潜在的塩橋を形成できる場合 ），７０（７０と２４が潜在的塩橋を形成できる場合），７３および２１（４７ がドナーとアクセプター間で異なる場合），３７および４５（４７がドナーとア クセプター間で異なる場合）のひとつ、一部またはすべて、ならびに１０，１２ ，４０，８３，１０３および１０５のいずれかひとつもしくは２つ以上がドナー 残基である「請求項９または１０」記載のＣＤＲ接木抗体軽鎖。
12. １２．位置２４〜３４，５０〜５６および８９〜９７はドナーのＣＤＲである「 請求項６〜１１」のいずれかに記載のＣＤＲ接木軽鎖。
13. １３．「請求項１〜５」のいずれかに記載の少なくとも１個のＣＤＲ接木重鎖と 「請求項６〜１２」のいずれかに記載の少なくとも１個のＣＤＲ接木軽鎖からな るＣＤＲ接木抗体分子。
14. １４．部位特異的抗体分子である「請求項１３」記載のＣＤＲ接木抗体分子。
15. １５．インターロイキン、ホルモンもしくは他の生物活性化合物またはそれらの 受容体に対する特異性をもつ「請求項１３」記載のＣＤＲ接木抗体分子。
16. １６．ヒトアクセプター残基と非ヒトドナー残基からなる「請求項１〜１５」の いずれかに記載のＣＤＲ接木抗体重鎖もしくは軽鎖または分子。
17. １７．「請求項１」記載のＣＤＲ接木重鎖または「請求項６もしくは８」記載の ＣＤＲ接木軽鎖をコードするＤＮＡ配列。
18. １８．「請求項１７」記載のＤＮＡ配列を含有するクローニングまたは発現ベク ター。
19. １９．「請求項１７」記載のＤＮＡ配列で形質転換した宿主細胞。
20. ２０．「請求項１７」記載のＣＤＲ接木抗体配列の形質転換宿主細胞中における 製造方法。
21. ２１．（ａ）「請求項１」記載の抗体重鎖をコードするＤＮＡ配列を有するオペ ロンを発現ベクター中に製造する工程、および／または（ｂ）「請求項６または ８」記載の相補性抗体軽鎖をコードするＤＮＡ配列を有するオペロンを発現ベク ター中に製造する工程、（ｃ）上記ベクターの一方またはそれぞれで宿主細胞を トランスフェクトする工程、ならびに（ｄ）トランスフェクトした細胞系を培養 してＣＤＲ接木抗体生成物を産生させる工程からなる、ＣＤＲ接木抗体生成物の 製造方法。
22. ２２．「請求項１」記載のＣＤＲ接木抗体重鎖、または「請求項６もしくは８」 記載のＣＤＲ接木軽鎖、または「請求項１３」記載のＣＤＲ接木抗体分子を医薬 的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と配合してなる治療用または診断用組 成物。
23. ２３．「請求項１」記載のＣＤＲ接木重鎖、または「請求項６もしくは８」記載 のＣＤＲ接木軽鎖、または「請求項１３」記載のＣＤＲ接木抗体分子の有効量を ヒトまたは動物対象に投与することからなる治療または診断方法。