NO310560B1 - Fremgangsmåte for fremstilling av et humanisert OKT 4a antistoff - Google Patents

Abstract

Et CDR-podet antistoff med minst en kjede der rammeverksregionene er hovedsakelig avledet fra et første antistoff (akseptor) og minst én CDR er avledet fra et andre antistoff (donor),idet det CDR-podete antistoffet kan bli bundet til CD4-antigenet, samt fremgangsmåter for fremstilling derav og mikleotid-sekvenser for anvendelse ved fremstilling, sammensetninger inneholdende det og anvendelse i terapi er beskrevet.

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av et antistoffmolekyl som har evne til å bli bundet til CD4 antigenet og nukleotidsekvens.

I foreliggende søknad er forskjellige tidligere referanser sitert. Disse blir referert med et tall angitt i klammer []. Referansene er oppført i numerisk rekkefølge i slutten av beskrivelsen.

I foreliggende oppfinnelse blir "lg" anvendt for å beskrive naturlige immunoglobuliner. Naturlige immunoglobuliner har vært kjent i mange år og omfatter et generelt Y-formet molekyl som har et antigen-bindingssete mot enden av hver øvre arm. Det gjenværende av strukturen, og spesielt stammen til Y, formidler effektorfunksjonene assosiert med lg. Forskjellige fragmenter av lg, så som Fab-, (Fab*^-, Fv- og Fc-fragmenter, som kan bli oppnådd ved enzymatisk spaltning, er også kjente.

Naturlige lg omfatter to tunge kjeder og to lette kjeder, der N-terminalendene til hvert par av tunge og lette kjeder, er assosierte og danner antigenbindingssetene. De C-terminale endene til de tunge kjedene er koblet sammen for dannelse av Fc-delen.

Restbetegnelsene for lg lette og tunge kjeder angitt i foreliggende beskrivelse og krav, er i henhold til nummeringsskjemaet utviklet av Kabat [1] og [2]. Restbetegnelsene korresponderer ikke alltid direkte med den lineære nummereringen av aminosyreresiduene. Den virkelig lineære aminosyresekvensen kan inneholde færre eller ytterligere aminosyreresiduer enn i selve Kabat-nummereringen og dette viser at det har vært innskudd eller delesjoner. Disse innskuddene eller delesjonene kan være tilstede hvor som helst i kjedene. Den riktige nummereringen av residuene kan bli bestemt for et gitt lg ved oppstilling ved regioner med homologi i sekvensen til lg med en "standard" Kabat-nummerert sekvens.

Det ble bestemt fra en studie av aminosyresekvensene til et stort antall lg at de variable domenene, som er beliggende ved de N-terminale endene av kjedene, til både de tunge og lette kjedene, inneholder tre regioner der aminosyresekvensen var hypervariabel. Disse hypervariable regionene er flankert på hver side av regioner som varierte vesentlig mindre i sekvens [1] og [2] . Det ble formodet at de hypervariable regionene er innbefattet i antigenbinding.

I det siste har strukturelle studier ved anvendelse av røntgenkrystallografi og molekylær modellering definert tre regioner i de variable domenene til hver av de tunge og lette kjedene som ser ut til å være involvert i antigenbinding

[47]. Disse tre regionene blir generelt referert til som komplementaritetsbestemmende regioner (CDR). CDR blir brakt sammen av de gjenværende regionene til de variable domenene for å danne idet minste en del av det antigenbindende setet. Disse gjenværende regionene blir generelt referert til som rammeverksregioner.

Noen forskere innenfor dette området, og spesielt Kabat [1] og [2], har referert til de hypervariable regionene som CDR. I denne beskrivelsen vil betegnelsen hypervariabel region bare bli anvendt for å beskrive antigenbindende regioner bestemt ved sekvensanalyse og betegnelsen CDR blir anvendt for å beskrive antigenbindende regioner bestemt ved strukturell analyse.

En sammenligning av de hypervariable regionene, bestemt ved sekvensanalyse og CDR, bestemt ved strukturelle studier, viser at det er et visst, men ikke fullstendig, samsvar mellom disse regionene.

I foreliggende søknad blir betegnelsen "antistoff" anvendt for å beskrive lg eller hvilke som helst fragmenter derav, lettkjedede eller tungkjedede monomerer eller dimerer, og enkeltkjedede antistoffer, så som enkeltkjedet Fv der de tung- og lettkjedede variable domenene er koblet med en peptidlinker, om naturlig eller produsert ved rekombinant DNA-teknologi eller på annen måte, forutsatt at antistoffet innbefatter minst et antigenbindende sete. Det gjenværende av antistoffet omfattet ikke bare Ig-avledede proteinsekvenser. Et gen kan blant annet bli konstruert der en DNA-sekvens kodende for en del av en human Ig-kjede er koblet til en DNA-sekvens kodende for aminosyresekvensen til et polypeptid-effektor- eller reportermolekyl. "Antistoff" omfatter dermed hybride antistoffer (se nedenfor).

Forkortelsen "MAb" blir anvendt for å indikere et monoklonalt antistoff produsert av en hybridom eller avledet cellelinje.

Betegnelsen "rekombinant antistoff" blir anvendt for å beskrive et antistoff produsert ved en fremgangsmåte som omfatter anvendelse av rekombinant DNA-teknologi.

Betegnelsen "kimærisk antistoff" blir anvendt for å beskrive et antistoff der de variable domenene i sin helhet er avledet fra et antistoff fra en første pattedyrart og som er blitt kondensert på minst én konstant domene fra et antistoff fra en annen pattedyrart.

Betegnelsen "hybrid antistoff" blir anvendt for å beskrive et protein som omfatter minst den antigenbindende delen av et lg koblet ved ' peptidbinding til minst en del av et annet protein. Det er å bemerke at noen fagfolk vil anvende ordet "kimærisk" for å beskrive slike konstruksjoner, men i foreliggende beskrivelse vil slike konstruksjoner bli referert til som hybride antistoffer og betegnelsen kimæriske antistoffer blir anvendt på samme måte som definert ovenfor. Betegnelsen "CDR-podet antistoff" blir anvendt for å beskrive et antistoff som har minst én, og fortrinnsvis to eller tre, av dets CDR i én eller begge av de variable domenene avledet fra et antistoff fra en første art, idet de gjenværende Ig-avledede delene av antistoffet er avledet fra én eller flere forskjellige antistoffer. De variable domenene kan bli fremstilt ved anvendelse av rekombinant DNA-teknologi eller ved peptidsyntese.

"Ekspresjonsvektor" innbefatter vektorer som kan uttrykke DNA-sekvenser deri, dvs. de kodende sekvensene er operabelt bundet til andre sekvenser som kan tilveiebringe deres ekspresjon. Et nyttig, men ikke alltid nødvendig (dvs. insektsceller), element av en effektiv ekspresjonsvektor er en markørkodende sekvens, dvs. en sekvens som koder for en vektorsekvens som resulterer i en fenotypisk egenskap (f.eks. neomycinresistens, metioninsulfoksiminresistens eller tryptofanprototrofi) av cellene inneholdende proteinet som muliggjør at cellene lett blir identifisert. "Ekspresjonsvektor" er gitt en funksjonell definisjon og en hvilken som helst DNA-sekvens som kan tilveiebringe ekspresjon av en spesifisert innbefattet DNA-kode, er innbefattet i denne betegnelsen som den er anvendt for den spesifiserte sekvensen. Slike vektorer er ofte i form av plasmider. "Plasmid" og "ekspresjonsvektor" blir dermed ofte anvendt om hverandre. Foreliggende oppfinnelse innbefatter slike andre former for ekspresjonsvektorer som har ekvivalente funksjoner og som noen ganger blir kjent innenfor fagområdet, inkludert retroviruser, in vitro-systemer [48] og lignende.

Som tidligere fremholdt, vil DNA-sekvensene bli uttrykt i vertsceller etter at sekvensene er blitt operabelt bundet til (dvs. plassert for å forsikre virkningen av) en ekspresjons-kontrollsekvens. Disse ekspresjonsvektorene er vanligvis replikerbare i vertsorganismene enten som episomer eller som en integrert del av vertens kromosomale DNA.

"Rekombinante vertsceller" refererer til celler som er blitt transformerte med vektorer konstruert ved anvendelse av rekombinante DNA-teknikker. Ved denne transformasjonen kan vertscellen produsere det ønskede produktet i nyttige mengder, istedenfor i mindre mengder, eller vanligvis i mindre enn detekterbare mengder, som man vil vente blir produsert av den utransformerte verten. Antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli produsert av en rekombinant vertscelle i mengder som er nyttige for å utføre ytterligere eksperimentering eller i kommersielle mengder så som omtrent et kilogram eller mere.

I beskrivelser av fremgangsmåtene for isolering av antistoffer fra rekombinante verter, blir betegnelsene "celle" og "cellekultur" anvendt om hverandre for å betegne antistoff-kilden, hvis ikke annet blir angitt. Isolering av antistoff fra "cellene" kan dermed menes enten fra nedsentrifugerte hele celler, eller fra cellekulturen som inneholder både mediet og de suspenderte cellene eller, i tillegg, som det er mulig i tilfelle av myelomcellelinjer, fra asciteskultur.

Naturlige lg er blitt anvendt i analyse, diagnostikk og i en mere begrenset grad, terapi. Slike anvendelser, spesielt i terapi, er derimot blitt forhindret av den polyklonale naturen til naturlige lg. Et betraktelig fremskritt mot realiseringen av potensialet til lg som terapeutiske midler, var oppdagelsen av teknikker for fremstilling av MAb med definert spesifisitet. MAb blir generelt fremstilt ved fusjoner av miltceller fra gnagere med myelomceller fra gnagere, og er derfor vesentlig proteiner fra gnagere. Det eksisterer derimot meget få rapporter for vellykket produksjon av humane MAb.

En serie MAb med spesif isiteter for antigener på T-lymfocytter og undergrupper av T-lymfocytter, er beskrevet i EP-A-0 017 381, EP-A-0 018 794, EP-A-0 019 195, EP-A-0 025 722, EP-A-0 030 450, EP-A-0 030 814 og EP-A-0 033 578.

Pga. at de fleste tilgjengelige MAb bare har gnageropprinnelse, er de naturlig antigene i mennesker og kan derfor gi opphav til en uønsket immunrespons, som én respons betegnet human anti-museantistoff(HAMA)-respons. Anvendelse av gnager MAb som terapeutiske midler i mennesker er derfor fullstendig begrenset av det faktum at det humane individet kan tilveiebringe en immunologisk respons mot MAb og vil enten fjerne det fullstendig eller idet minste redusere effektiviteten derav. MAb av gnageropprinnelse er derfor generelt ikke anbefalt for anvendelse i pasienter i mere enn én eller noen få behandlinger, idet en HAMA-respons kan bli utviklet og gjøre MAb ineffektivt samt gi opphav til uønskede sidereaksjoner.

Det har dermed oppstått forslag for å gjøre ikke-humane MAb mindre antigene i mennesker. Slike teknikker kan generisk bli betegnet "humaniserende" teknikker. Disse teknikkene innbefatter generelt anvendelse av rekombinant DNA-teknologi for å manipulere DNA-sekvenser kodende for polypeptidkjedene til antistoffmolekylet.

I de senere årene har fremskritt innen molekylærbiologi basert på produksjon av forskjellige heterologe polypeptider ved transformasjon av vertsceller med heterologe DNA-sekvenser som koder for produksjon av ønskede produkter, oppstått.

EP-A-0 088 994 (Schering Corporation) beskriver konstruksjon av rekombinante DNA-vektorer som omfatter en ds-DNA-sekvens som koder for den variable domenen av en lett eller en tung kjede til et lg spesifikt for en forutbestemt ligand. ds-DNA-sekvensen er tilveiebrakt med initierings- og terminerings-kodoner ved dets 5'- og 3'-termini, men mangler nukleotider kodende for aminosyrer som er overflødige for den variable domenen. ds-DNA-sekvensen blir anvendt for å transformere bakterielle celler. Foreliggende oppfinnelse betrakter ikke variasjoner i sekvensen til den variable domenen.

EP-A-0 102 634 (Takeda Chemical Industries Limited) beskriver kloning og ekspresjon i bakterielle verts-organismer av gener kodende for hele eller en del av et humant IgE-tungkjedepolypeptid, men betrakter ikke variasjoner i sekvensen til polypeptidet.

EP-A-0 125 023 (Genentech Inc.) foreslår anvendelse av rekombinante DNA-teknikker i bakterielle celler for å produsere lg som er analoge med de som normalt finnes i vertebratsystemer og drar nytte av genmodifikasjonsteknikkene foreslått deri for å konstruere kimæriske antistoffer eller andre modifiserte antistoff-former.

Det antas at forslagene angitt i ovennevnte Genentech-søknad ikke førte til ekspresjon av noen signifikante mengder av Ig-polypeptidkjedene og heller ikke til produksjon av Ig-aktivitet eller sekresjon og oppstilling av kjedene til ønskede kimæriske antistoffer.

De senere teknikker som er fremkommet som muliggjør stabil introduksjon av Ig-gen-DNA inn i pattedyrceller [3] til [5] , har muliggjort anvendelsen av in vitro mutagenese og DNA-transfeksjon for å konstruere rekombinante antistoffer med nye egenskaper.

Det er derimot kjent at funksjonen av et antistoffmolekyl er avhengig av dets tredimensjonale struktur som igjen er avhengig av dets primære aminosyresekvens. Forandring av aminosyresekvensen til et antistoff kan dermed påvirke aktiviteten negativt. En forandring i DNA-sekvensen kodende for antistoffet kan tilveiebringe muligheten av at cellen inneholdende DNA-sekvensen, uttrykker, utskiller eller oppstiller antistoffet.

Det er derfor ikke i det hele tatt klart at det vil være mulig å produsere funksjonelle endrede antistoffer ved rekombinante DNA-teknikker. Kollegaer av foreliggende oppfinnere har derimot angitt en fremgangsmåte hvorved hybride antistoffer der begge delene av proteinene er funksjonelle, kan bli utskilt. Denne fremgangsmåten er beskrevet i international patentsøknad nr. PCT/GB85/00392. Ovennevnte PCT-søknad viser bare produksjonen av hybride antistoffer der fullstendige variable domener blir kodet av den første delen av DNA-sekvensen. Den viser ikke hybride antistoffer der sekvensen av den variable domenen er blitt endret.

EP-A-0 239 400 beskriver en fremgangsmåte der CDR fra et muse-MAb er blitt podet på rammeverksregionen til de variable domenene til et humant lg ved seterettet mutagenese ved anvendelse av lange oligonukleotider. Oppfinnerne hentyder til muligheten av også å endre den naturlige aminosyresekvensen til rammeverksregionene.

Det tidligste arbeidet angående endring av MAb ved CDR-podning, ble utført på MAb som gjenkjenner syntetiske antigener, så som NP- eller NIP-antigener. Eksempler hvorpå et muse-MAb som gjenkjenner lysozym og et rotte-MAb som gjenkjenner et antigen på humane T-celler, ble humanisert ved CDR-podning, er blitt beskrevet [6] og [7].

Referanse [7] viser at overføring av CDR alene (som beskrevet i artikkelen) ikke var tilstrekkelig for å tilveiebringe tilfredsstillende antigenbindingsaktivitet i det CDR-podete produktet. Referanse [7] viser at det var nødvendig å omdanne en serinrest i posisjon 27 i den humane sekvensen til den tilsvarende rottefenylalaninresten for å oppnå et CDR-podet produkt som har tilfredsstillende antigenbindende aktivitet. Dette residuet i posisjon 27 i den tunge kjeden er innenfor den strukturelle løkken ved siden av CDR1. En ytterligere konstruksjon som i tillegg inneholdt et humant serin med rottetyrosinforandring i posisjon 30 i den tunge kjeden, hadde ikke en signifikant endret bindingsaktivitet i forhold til det CDR-podete antistoffet med serin til fenylalanin-forandringen i posisjon 27 alene. Disse resultatene viser at, for CDR-podete antistoffer som gjenkjenner mere komplekse antigener, forandringer til residuer av den humane sekvensen utenfor CDR-regionene, spesielt i løkken ved siden av CDR1, kan være nødvendig for å oppnå effektiv antigenbindingsaktivitet.

Teknikker har også nylig blitt beskrevet for endring av et anti-TAC-monoklonalt antistoff ved CDR-podning. Humane rammeverksregioner ble valgt for å maksimalisere homologien med anti-TAC-antistoffsekvensen, mens flere ytterligere aminosyrer utenfor CDR ble opprettholdt. Anti-TAC-antistoffet endret på denne måten har en affinitet for p55-kjeden til human interleukin-2 i omtrent én tredjedel av den til murin anti-TAC [8].

PCT/US89/05857 beskriver også CDR-podete antistoffer som er spesifikke for p55 TAC-proteinet til IL-2-reseptoren. Det er beskrevet deri at CDR-podet antistoff kan kreve at 3 eller flere aminosyreresiduer fra donor lg i tillegg til CDR, der vanligvis minst én er rett ved siden av en CDR i donoren lg, blir forandret for å være i samsvar med den til donorantistoffet for å oppnå antigenbindende aktivitet.

Det er derfor innlysende at det ikke er enkelt å produsere et CDR-podet antistoff. Det er ofte ikke tilstrekkelig bare å pode CDR fra en donor-Ig på rammeverksregionene fra en akseptor-Ig. Det kan også være nødvendig å endre residuene i rammeverksregionene til akseptorantistoffet for å oppnå bindingsaktivitet. Det er derimot ikke mulig å forutsi, på grunnlag av tilgjengelig tidligere teknikk, hvilke, om noe, rammeverksresiduer vil være nødvendig å bli endret.

Ep-A-0 018 794 beskriver et murint MAb som gjenkjenner et antigen karakteristisk for humane hjelper-T-celler. Et spesielt eksempel på et slik MAb er beskrevet i søknaden og betegnet 0KT4. Antigenet som det gjenkjenner blir generelt referert til som CD4-antigenet. MAb er kommersielt tilgjengelig fra Ortho Diagnostic Systems Inc., Raritan, New Jersey, USA. Også tilgjengelig fra samme leverandør er et murint Mab kjent som 0KT4A. Dette gjenkjenner en annen epitope på CD4-antigenet i forhold til den som blir gjenkjent av 0KT4.

Transplantasjonseksperimenter i primater har vist at både 0KT4 og 0KT4A kan øke overlevelsen av podningen og kan være nyttig som en immunmodulator i mennesker. Erfaringer fra behandlingen av nyretransplanterte pasienter med murin MAb 0KT3 har vist at en populasjon av pasienter noen ganger utvikler nøytraliserende antistoffer mot 0KT3. Denne immunresponsen utelukker gjentatt administrasjon. For å redusere den betraktede immunresponsen mot murine anti-CD4-Mab, vil det være ønskelig å produsere en CDR-podet versjon av 0KT4A som har murine CDR og humant rammeverk og andre Ig-avledede regioner.

Som derimot beskrevet ovenfor, resulterer den enkle til-nærmelsen mot konstruering av et CDR-podet antistoff ikke alltid i et antistoff som binder antigenet effektivt. De nøyaktige residuene som omfatter CDR er vanskelig å definere og korresponderer ikke nødvendigvis med alle residuene i de hypervariable regionene. Det kan også være kritiske rammeverksresiduer som er viktige for å plassere CDR for inter-aksjon med antigen eller som er involvert i interaksjoner mellom de tunge og lette kjedene. Det kan være nødvendig å endre visse rammeverksresiduer slik at de korresponderer med de murine residuene ved disse posisjonene og som gjør det CDR-podete antistoffet mindre "humant" i karakter.

Til tross for problemene som er iboende i forsøk på å produsere et spesifikt CDR-podet antistoff, har oppfinnerne heri i en foretrukket utførelsesform lykkes i å produsere et CDR-podet antistoff basert på humane rammeverksregioner og med et antigenbindingssete som gjenkjenner CD4-antigenet. I visse spesielt foretrukne utførelsesformer har det CDR-podete antistoffet en affinitet for CD4-antigenet som er lik det til det murine Mab 0KT4A.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig en fremgangsmåte for fremstilling av et antistoffmolekyl som har evne til å bli bundet til CD4 antigenet, kjennetegnet ved at det omfatter en kompositt tungkjede og en komplementær lett kjede hvori, i den variable domenen av nevnte kompositt tungkjede, rammeverksregionene er hovedsakelig avledet fra et humant antistoff (akseptor) og minst residiene 23, 24, 26 til 35, 49 til 65 og 95 til 102 (ifølge Kabat nummerer ingssystem) tilsvarer de ekvivalente residiene i muse monoklonalt antistoff 0KT4A (donor) som vist i figur 3 i vedlagte tegninger.

Den CDR-podete kjeden har fortrinnsvis to og, mest foretrukket, alle tre CDR avledet fra donorantistoffet.

I den CDR-podete kjeden har den eller hver CDR en fullstendig CDR som omfatter alle residuene fra CDR og alle residuene i den tilsvarende hypervariable regionen til donorantistoffet.

Minst ett residu i rammeverksregionene til den CDR-podete kjeden er blitt endret slik at det tilsvarer det ekvivalente residuet i antistoffet.

Rammeverksregionene til den CDR-podete kjeden er fortrinnsvis avledet fra et human antistoff.

Rammeverksregionene til den CDR-podete kjeden er fortrinnsvis avledet fra en human Ig-tung kjede. For slike tunge kjeder er det foretrukket at residuet 35 i de regionene med tungkjede-rammeverket blir endret slik at den tilsvarer det ekvivalente residuet i donorantistoffet.

For slike tunge kjeder blir minst én kompositt CDR omfattende residuene 26 til 35, 50 til 65 eller 95 til 102 podet på det humane rammeverket (FR). Residuet 35 vil korrespondere med det ekvivalente residuet i donorantistoffet.

Residuene 23, 24 og 49 i slike tunge kjeder korresponderer med de ekvivalente residuene i antistoffet. Det er mere foretrukket at residuene 6, 23, 24, 48 og 49 i slike tunge kjeder korresponderer med donorantistoffet i ekvivalente residuposisjoner. Om ønskelig kan residuene 71, 73 og 79 også korrespondere slik.

For videre å optimalisere affiniteten kan en hvilken som helst eller en hvilken som helst kombinasjon av residuene 57, 58, 60, 88 og 91 korrespondere med det ekvivalente residuet i donorantistoffet.

Den tunge kjeden er fortrinnsvis avledet fra den humane KOL-tunge kjeden. Den kan derimot også være avledet fra den humane NEWM- eller EU-tunge kjeden.

Alternativt kan rammeverksregionene til den CDR-podete kjeden være avledet fra en human kappa- eller lambda-lettkjede. For en slik lett kjede er fordelaktig minst én kompositt-CDR omfattende residuene 24 til 34, 50 til 56 eller 89 til 97 podet på det humane rammeverket. Residuet 49 korresponderer også fortrinnsvis med det ekvivalente residuet i donor-antistof f et .

For ytterligere å optimalisere affiniteten er det foretrukket å forsikre at residuene 49 og 89 tilsvarer de ekvivalente residuene i donorantistoffet. Det kan også være ønskelig å selektere ekvivalente donorresiduer som danner saltbroer.

Den lette kjeden er fortrinnsvis avledet fra den humane REI-lette kjeden. Den kan derimot også være avledet fra den humane EU-lette kjeden.

Det CDR-podete antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter fortrinnsvis en lett kjede og en tung kjede, der én eller fortrinnsvis begge, er blitt CDR-podet i henhold til prinsippene angitt ovenfor for de individuelle lette og tunge kj edene.

I det foretrukne tilfellet er det fordelaktig at alle tre CDR på den tunge kjeden er endret og at minimale endringer blir utført på den lette kjeden. Det kan være mulig å ikke endre noen, én eller to av lettkjede-CDR og enda opprettholde bindingsaffiniteten i et betraktelig nivå.

Det vil i noen tilfeller være ønskelig, for både tunge og lette kjeder, at donor- og akseptorresiduene kan være identiske ved en bestemt posisjon og at det ikke er nødvendig med noen forandring av akseptorrammeverksresiduet.

For å beholde så langt som mulig den humane naturen til det CDR-podete antistoffet bør så få residuforandringer som mulig bli utført. I mange tilfeller vil det ikke være nødvendig å forandre mer enn CDR og et lite antall rammeverksresiduer. Bare i eksepsjonelle tilfeller vil det være nødvendig å forandre et stort antall rammeverksresiduer.

Det CDR-podete antistoffet er et fullstendig lg, f.eks. med isotype IgG^ eller IgG4.

Om ønskelig kan én eller flere residuer i de konstante regionene til lg bli endret for å endre effektorfunksjonene til de konstante domenene.

Det CDR-podete antistoffet har fortrinnsvis en affinitet for CD4-antigenet på mellom omtrent 10<5>.M_<1> til omtrent 10<12>.M-<1>, mere foretrukket er minst lo<S>.M<1>. og mest foretrukket er affiniteten lik den til Mab 0KT4 eller 0KT4A.

Det er fordelaktig at den eller hver CDR er avledet fra et pattedyrs antistoff og er fortrinnsvis avledet fra et murint MAb.

Det CDR-podete antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse blir fordelaktig produsert ved anvendelse av rekombinant DNA-teknologi .

Alternativt kan de første og andre DNA-sekvensene være til stede på forskjellige vektorer.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre en nukleotidsekvens, kjennetegnet ved at den koder for en antistof fkjede der rammeverksregionene er hovedsakelig avledet fra et første antistoff (akseptor) og minst én CDR er avledet fra et andre antistoff (donor), der antistoffkjeden kan danne et humanisert OKT 4a antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 16.

Det er betraktet at CDR-podete antistoffer fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse vil være av spesiell anvendelse i terapi, spesielt for behandling av podningsforkastelser eller for behandling av hjelper-T-celleforstyrrelser.

CDR-podete antistoffer fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli fremstilt ved hjelp av forskjellige teknikker, med ekspresjon i transfekterte celler, så som gjær-, insekt-, CHO- eller myelomceller. Det er foretrukket at vertscellen er en CHO-vertscelle.

For å konstruere et CDR-podet antistoff, er det først nødvendig å konstatere den variable domenesekvensen til et antistoff som har de ønskede bindingsegenskapene. Egnede kildeceller for slike DNA-sekvenser innbefatter avian-, pattedyr- eller andre vertebratkilder, så som kyllinger, mus, rotter og kaniner og fortrinnsvis mus. De variable domene-sekvensene (Vg og VL) kan bli bestemt fra tung og lett kjede-cDNA, fremstilt fra respektive mRNA ved teknikker som generelt er kjente innenfor fagområdet. De hypervariable regionene kan deretter bli bestemt ved anvendelse av Kabat-metoden [2] . CDR kan bli bestemt ved strukturell analyse ved anvendelse av røntgenkrystallografi eller molekylære modelleringsteknikker. En kompositt CDR kan deretter bli definert å inneholde alle residuene i én CDR og alle residuene i den korresponderende hypervariable regionen. Disse kompositt-CDR sammen med visse selekterte residuer fra rammeverksregionen (FR-regionen), blir fortrinnsvis overført som "antigenbindende seter", mens gjenværende antistoff, så som tung- og lettkjedekonstantdomenene og gjenværende rammeverksregioner, kan bli basert på humane antistoffer fra forskjellige klasser. Konstante domener kan bli selektert for å ha ønskede effektorfunksjoner hensiktsmessig for antatt anvendelse av antistoffet konstruert slik. F.eks. er de humane IgG-isotypene, IgG± og IgG3 effektive for komplement-fiksering og cellemediert lysering. For andre hensikter kan andre isotyper, så som IgGg og IgG4, eller andre klasser så som IgM og IgE, være mere egnet.

For human terapi er det spesielt ønskelig å anvende humane isotyper for å minimalisere antiglobulinresponser i løpet av terapi. Humane, konstante, domene-DNA-sekvenser fortrinnsvis sammen med deres variable domenerammeverksbaser, kan bli fremstilt i henhold til velkjente prosedyrer. Et eksempel er CAMPATH 1H tilgjengelig fra Burroughs Wellcome Ltd.

Visse CDR-podete antistoffer er tilveiebrakt som inneholder valgte endringer i den humanlignende rammeverksregionen (dvs. utenfor CDR til de variable domenene), resulterende i et CDR-podet antistoff med tilfredsstillende bindingsaffinitet. En slik bindingsaffinitet er fortrinnsvis fra omtrent 10<5>.M_<1 >til omtrent 10<i2>.M-<1> og er fortrinnsvis minst omtrent 10<8.>M-- 1-. Det er mest foretrukket at bindingsaffiniteten er omtrent lik den til murin Mab 0KT4A.

Ved konstruering av CDR-podete antistoffer fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse, kan Vg- og/eller VL-gensegmentene bli endret ved mutagenese. Fagfolk er også innforstått med at forskjellige andre nukleotider kodende for aminosyreresiduene eller -sekvensene innbefattet i Fc-delen eller andre områder av antistoffet, kan bli endret på samme måte (se f. eks. PCT/US89/00297 ).

Eksempel på teknikker innbefatter addisjon, delesjon eller ukonservativ substitusjon av et begrenset antall forskjellige nukleotider eller konservativ substitusjon av mange nukleotider, forutsatt at den riktige leserammen blir opprettholdt.

Substitusjoner, delesjoner, innskudd eller en hvilke som helst subkombinasjon kan bli anvendt for å oppnå en endelig konstruksjon. Pga. at det bare er 64 mulige kodonsekvenser, men bare 20 kjente aminosyrer, er den genetiske koden degenerert pga. at forskjellige kodoner kan tilveiebringe den samme aminosyren. Koden er derimot nøyaktig for hver aminosyre. Det er dermed minst ett kodon for hver aminosyre, dvs. hvert kodon tilveiebringer en enkelt aminosyre og ingen annen. Det er innlysende at i løpet av translasjonen, må riktig leseramme bli opprettholdt for å oppnå riktig aminosyresekvens i polypeptidet som blir produsert.

Teknikker for addisjoner, delesjoner eller substitusjoner på forutbestemte aminosyreseter som har en kjent sekvens, er velkjente. Eksempler på teknikker innbefatter oligonukleotid-formidlet seterettet mutagenese og polymerasekjedereaksjonen. Oligonukleotidsete-rettet mutagenese innbefatter hybridisering av et oligonukleotid kodende for en ønsket mutasjon med en enkel DNA-tråd inneholdende regionene som skal bli mutert og anvendelse av den enkelte tråd som et templat for ekstensjon av oligonukleotidet for å produsere en tråd som inneholder mutasjonen. Denne teknikken er i forskjellige former beskrevet i referansene [9] til [12].

Polymerasekjedereaksjonen (PCR) innbefatter eksponensiell amplifisering av DNA in vitro ved anvendelse av sekvens-spesifikke oligonukleotider. Oligonukleotidene kan inkorporere om ønskelig sekvensendringer. Polymerasekjede-reaksjonsteknikken er beskrevet i referanse [13]. Eksempler på mutagenese ved anvendelse av PCR, er beskrevet i referansene [14] til [17].

Nukleotidsekvensene ifølge foreliggende oppfinnelse, som kan uttrykke ønskede CDR-podete antistoffer, kan bli dannet fra forskjellige polynukleotider (genomisk DNA, cDNA, RNA eller syntetiske oligonukleotider). Det er for tiden foretrukket at polynukleotidsekvensen omfatter en fusjon av cDNA og genomisk DNA. Polynukleotidsekvensen kan kode for forskjellige Ig-komponenter (f. eks. V-, J-, D- og C-domener). De kan bli konstruert ved hjelp av forskjellige teknikker. Kobling av hensiktsmessige genomiske og cDNA-sekvenser er for tiden den mest vanlige produksjonsmetoden, men cDNA-sekvenser kan også bli anvendt (se EP-A-0 239 400 og [7]).

Visse egnede ekspresjonsvektorer og vertsceller er beskrevet i US-A-4 816 567.

Vektorene og fremgangsmåtene beskrevet heri er egnede for anvendelse i vertsceller i mange forskjellige prokaryotiske og eukaryotiske organismer.

Generelt er selvfølgelig prokaryoter foretrukket for kloning av DNA-sekvenser for konstruering av vektorer nyttige i oppfinnelsen. F.eks. er E. coli DH5a spesielt nyttig. Dette eksemplet er selvfølgelig illustrerende og ikke begrensende.

Prokaryoter kan også bli anvendt for ekspresjon. Ovennevnte E. coli-stammer, bacilli så som Bacillus subtilus og andre enterobakteriacea, så som Salmonella typhimurium eller Serratia marcesans og forskjellige Pseudomonas-arter kan bli anvendt.

Generelt blir plasmidvektorer inneholdende replikon og kontrollsekvenser som er avledet fra arter som er kompatible med vertscellen, anvendt i sammenheng med disse vertene. Vektoren bærer opprinnelig et replikeringssete samt markeringssekvenser som kan tilveiebringe fenotypisk seleksjon i transformerte celler. F.eks. blir E. Coli vanligvis transformert ved anvendelse av en av mange derivater av pBR322, et plasmid avledet fra en E. Coli-art

[18]. pBR322 inneholder gener for ampicillin og tetracyklin-resistens og fører dermed til enkel identifisering av transformerte celler. pBR322-plasmid, avkom eller andre mikrobielle plasmider kan også inneholde, eller bli modifisert til å inneholde, promotere som kan bli anvendt av den mikrobielle organisme for ekspresjon av rekombinante proteiner. Promoterene som vanligvis blir anvendt ved rekombinant DNA-konstruksjon, innbefatter laktosepromoter-systemer [19] til [21] og tryptofan(trp)-promotersystemene

[22] og EP-A-0 036 776. Disse er mest vanlig anvendte, men andre mikrobielle promotere er blitt oppdaget og anvendt, og detaljer vedrørende deres nukleotidsekvenser er blitt publisert og har muliggjort fagfolk å ligere dem funksjonelt til plasmidvektorer [23].

I tillegg til prokaryoter kan eukaryote mikrober, så som gjærkulturer, også bli anvendt. Saccharomyces cerevisiae, eller vanlig bakergjær, er mest anvendt blant eukaryote mikroorganismer, til tross for at et antall andre stammer også er tilgjengelige. For ekspresjon i Saccharomyces blir f.eks. plasmidet YRp7 vanligvis anvendt [24] til [26]. Dette plasmidet inneholder allerede trpl-genet som tilveiebringer en seleksjonsmarkør for en mutant gjærstamme som mangler evnen til å vokse i tryptofan, f.eks. ATCC nr. 44076 eller PEP4-1 [27]. Tilstedeværelse av trpl-lesjonen som en karakteristikk for gjærvertscellegenomet, tilveiebringer et effektivt miljø for detektering av transformasjon ved vekst i fravær av tryptofan.

Egnede fremmede sekvenser i gjærvektorer innbefatter promoterne for 3-fosfoglyceratkinase [28] eller andre glykolytiske enzymer, så som enolase, glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenase, heksokinase, pyruvat dekarboksylase, fosfofruktokinase, glukose-6-fosfatisomerase, 3-fosfo-glyceratmutase, pyruvatkinase, triosefosfatisomerase, fosfoglukoseisomerase og glukokinase [29] og [30]. Ved konstruering av egnede ekspresjonsplasmider er terminerings-sekvensene assosiert med disse genene også ligert inn i ekspresjonsvektor 3' av sekvensen som er ønsket å bli uttrykt for å tilveiebringe polyadenylering av mRNA og terminering. Andre promotere som har den ytterligere fordelen av tran-skripsjon kontrollert av vekstbetingelser, er promoter-regionene for alkoholdehydrogenase 2, isocytokrom C, sur fosfatase, degraderende enzymer assosiert med nitrogen-metabolisme og ovennevnte glyceraldehyd-3-fosfatdehydro-genase , et enzym ansvarlig for maltose- og galaktose-anvendelse [30]. En hvilken som helst plasmidvektor inneholdende en gjærkompatibel promoter, replikasjonsorigo og termineringssekvenser er egnet.

I tillegg til mikroorganismer kan cellekulturer avledet fra flercellede organismer også bli anvendt som verter. I prinsippet kan en hvilken som helst slik cellekultur anvendes, enten fra en vertebrat eller en invertebrat organisme. Interessen har derimot frem til nå vært størst i vertebrate celler og formering av vertebratceller i kultur (vevskultur) har blitt en rutinemessig prosedyre de senere årene [31]. Eksempler på slike nyttige vertscellelinjer er VERO, HeLa, kinesisk hamsterovarie (CHO), W138, BHK, COS-7, MDCK og myelomcellelinjer. Ekspresjonsvektorer for slike celler kan innbefatter (om nødvendig) et hensiktsmessig replikasjonsorigo, samt en promoter beliggende foran genet som skal bli uttrykt, sammen med eventuelt nødvendige ribosombindingsseter, RNA-spleiseseter, polyadenyleringsseter og transkripsjonene terminatorsekvenser.

For anvendelse i pattedyrceller er kontrollfunksjonene på ekspresjonsvektorene ofte tilveiebrakt fra viralt materiale. F.eks. er vanlig anvendt promotere avledet fra humant Cytomegalovirus (HCMV), Polyomavirus, Adenovirus 2 og som oftest Simianvirus 40 (SV40). Tidlig og sen promotere til SV40-virus er spesielt nyttig pga. at begge blir lett oppnådd fra viruset som et fragment som også inneholder SV40 viralt replikasjonsorigo [32]. Det er videre også mulig, og ofte ønskelig, å anvende promoter eller kontrollsekvenser som normalt er assosiert med den ønskede gensekvensen, forutsatt at slike kontrollsekvenser er kompatible med vertscelle-systemet.

Et replikasjonsorigo kan bli tilveiebrakt enten ved konstruksjon av vektoren for å innbefatte et eksogent origo, som kan bli avledet fra SV40 eller annen viral (f.eks. Polyoma virus, Adeno virus, VSV eller BPV) kilde, eller kan bli tilveiebrakt fra vertscellens kromosomale replikasjons-mekanisme. Dersom vektoren er integrert i vertscelle-kromosomet er det siste ofte tilstrekkelig.

Vektorene inneholdende DNA-segmentene av interesse (f.eks. tung- og lettkjedekodende sekvenser og ekspresjonskontroll-sekvenser) kan bli overført til vertsceller ved velkjente fremgangsmåter som varierer avhengig av cellulær vertstype. F.eks. blir kalsiumkloridtransfeksjon vanligvis anvendt for prokaryote celler, mens kalsiumfosfatbehandling, lipofeksjon eller elektroporasjon kan bli anvendt for andre cellulære verter [33].

Når uttrykt, kan CDR-podete antistoffer fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse bli renset ifølge standard prosedyrer, inkludert ammoniumsulfatpresipitasjon, affinitets-kolonner, kolonnekromatografi og gelelektroforese [34]. Bindingsaffinitetene til konstruksjonene uttrykt på denne måten, kan bli bekreftet ved kjente teknikker som er eksemplifisert i eksempeldelen.

Vesentlig rene CDR-podete antistoffer med en homogenitet på minst 90 til 95 # er foretrukket, og 98 til 99 % eller mere homogenitet er mest foretrukket for farmasøytiske anvendelser. Når renset, delvis eller til homogenitet etter behov, kan CDR-podete antistoffer bli anvendt diagnostisk eller terapeutisk (inkludert ekstrakorporalt) eller for utvikling og utføring av analyseprosedyrer, immunofluorescensfarginger og lignende [35].

CDR-podete antistoffer fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse vil vanligvis bli anvendt for behandling av T-cellemedierte forstyrrrelser. Typiske sykdomstilstander egnede for behandling innbefatter graft versus vertssykdommen og transplantatavstøtning i pasienter som gjennomgår en organtransplantering, så som hjerte, lunge, nyre eller lever. Andre sykdommer innbefatter autoimmune sykdommer, så som type I-diabetes, multippel sklerose, leddgikt, systemisk lupus erythematosus og myasthenia gravis.

T-celler er klonale ekspansjoner fra enkeltceller som bare uttrykker én T-celleantigenreseptor som kan gjenkjenne et peptid bundet til et spesifikt HLA-molekyl på spesialiserte antigenpresenterende celler, så som en makrofag og på andre vev. Aktivering av disse T-cellene kan bli blokkert av antistoffer som gjenkjenner T-cellereseptorkomplekset eller peptid-HLA-komplekset. 0KT3 gjenkjenner CD3-molekylet som består av flere subenheter fysisk kompieksbundet med T-cellereseptoren. Flere andre molekyler på T-cellen, inkludert CD4- og CD8-molekyler er også involvert i T-celleaktivering ved binding til HLA-molekyler på seter som er forskjellige fra T-cellereseptorbindingssetet.

CD4 finnes på subpopulasjonen av T-celler med T-celle-reseptorer som gjenkjenner HLA-klasse-II-molekyler. Én tilnærming til immunosuppresjon innbefatter derfor anvendelse av monoklonale antistoffer, så som 0KT4 eller 0KT4A som er immunosuppresive pga. at de inhiberer interaksjonen av CD4-molekylet med HLA-klasse-II-molekylet. Antistoffbinding til CD4 kan resultere i immunosuppresjon ved et antall mekanismer inkludert inhibisjon av et normalt aktiveringssignal, utløsning av en nedreguleringssignalvei eller modulering av denne reseptoren fra celleoverflaten. Det kan også indusere en subpopulasjon av T-celler som kan undertrykke andre alloreaktive eller autoreaktive subpopulasjoner. Anti-CD4-antistoffer kan også virke ved indusering av komplement eller antistoff-avhengig T-celle-lysering eller ved fjerning av T-celler fra blodstrømmen eller betennelsesstedet. Derfor kan Fc-reseptorbindende karaktertrekk til hvert antistoff være viktig for deres funksjon. Alternative strategier innbefatter anvendelse av anti-CD4-antistoffer som er blitt radiomerket eller koblet til toksiner.

Disse immunsuppressive egenskapene til disse anti-CD4-antistoffene tilveiebringer en terapeutisk anvendelse ved suppresjon av aktiverte T-lymfocytter som formidler sykdommene knyttet til transplantasjon og autoimmunitet. CD4-molekylet er også reseptoren for gpl20-subenheten til HIV-viruset. Pga. at 0KT4A inhiberer bindingen av gpl20 til CD4, kan dette antistoffet eller fragmentene derav blokkere viral infeksjon.

CD4-molekylet er normalt involvert i tilveiebringing av et kostimulerende signal for T-cellen som et resultat av dets binding til HLA-klasse-II-molekylet. Det er derfor også mulig at anti-CD4-antistoffer kan tilveiebringe en kostimulerende funksjon i kombinasjon med andre signal induserende reagenser. Denne terapeutiske strategien kan være nyttig for behandling av immunokompromitterte pasienter.

CDR-podete antistoffer fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse kan også bli anvendt i kombinasjon med andre antistoffer, spesielt MAb reaktive med andre markører på humane celler ansvarlig for sykdommene. F.eks. kan egnede T-cellemarkører innbefatte de som er gruppert i såkalte "Clusters of Differentiation", som benevnt av First International Leukocyte Differentiation Workshop [36].

Generelt vil foreliggende CDR-podete antistoffer bli anvendt i renset form sammen med farmakologisk hensiktsmessige bærere. Disse bærerne innbefatter vanligvis vandige eller alkoholiske/vandige oppløsninger, emulsjoner eller suspen-sjoner, inkludert saltholdig og buffret medium. Parenterale bærere innbefatter natriumkloridoppløsning, Ringer's dekstrose, dekstrose og natriumklorid og laktert Ringers. Egnede fysiologisk akseptable adjuvanser, om nødvendig for å holde komplekset i suspensjon, kan bli valgt fra fortyknings-midler så som karboksymetylcellulose, polyvinylpyrrolidon, gelatin og alginater.

Intravenøse bærere innbefatter fluid og næringssupplerings-midler og elektrolyttsuppleringsmidler, som de basert på Ringers dekstrose. Konserveringsmidler og andre tilsetnings-stoffer, så som antimikrobielle midler, antioksiderings-midler, gelateringsmidler og inerte gasser, kan også være til stede [37].

CDR-podete antistoffer fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse kan også bli anvendt som separat administrerte sammensetninger eller sammen med andre midler. Disse kan innbefatter forskjellige immunterapeutiske medikamenter, så som cyklosporin, metotreksat, adriamycin eller cisplatinum og immunotoksiner. Farmasøytiske sammensetninger kan innbefatte "cocktailer" av forskjellige cytotoksiske eller andre midler sammen med CDR-podete antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse, eller selv kombinasjoner av CDR-podete antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse og CDR-podete antistoffer med forskjellige spesifisiteter.

Administrasjonsveien til de farmasøytiske sammensetningene ifølge oppfinnelsen kan være hvilke som helst av de allerede innen fagområdet kjente. For terapi, inkludert uten begrensning immunterapi, kan CDR-podete antistoffer ifølge oppfinnelsen bli administrert til en hvilken som helst pasient i henhold til standardteknikker. Administrasjonen kan være ved hjelp av en hvilken som helst hensiktsmessig metode, inkludert parenteralt, intravenøst, intramuskulært, intra-peritonealt eller også hensiktsmessig ved direkte infusjon med et kateter. Doserings- og administrasjonsfrekvens vil avhenge av alder, kjønn og pasientens tilstand, samtidig administrasjon av andre medikamenter, motindikasjoner og andre parametere som blir vurdert av klinikeren.

CDR-podete antistoffer fremstilt ifølge denne oppfinnelsen kan bli lyofilisert for lagring og rekonstituert i en egnet bærer før bruk. Denne teknikken har vist seg å være effektiv med konvensjonelle immunoglobuliner og kjente lyofiliserings-og rekonstitusjonsteknikker kan bli anvendt. Som det fremkommer for fagfolk kan lyofilisering og rekonstitusjon føre til varierende grad av tap av antistoffaktivitet (f.eks. med konvensjonelle immunoglobuliner, IgM-antistoffer har en tendens til å ha høyere aktivitetstap enn IgG-antistoffer) og at anvendelsesnivåene kanskje må bli justert for å kompensere for dette.

Sammensetningene inneholdende foreliggende CDR-podete antistoffer eller en cocktail derav, kan bli administrert for profylaktiske og/eller terapeutiske behandlinger. Ved visse terapeutiske anvendelser er en tilstrekkelig mengde for å oppnå minst delvis inhibisjon eller dreping av en populasjon av selekterte celler, definert som en "terapeutisk-effektiv dose". Mengder nødvendig for å oppnå denne doseringen, vil avhenge av hvor alvorlig sykdommen er og den generelle tilstanden til pasientens eget immunsystem, men varierer vanligvis fra 0,005 til 5,0 mg CDR-podet antistoff pr. kg kroppsvekt, idet doser på 0,05 til 2,0 mg/kg/dose vanligvis blir anvendt. For profylaktiske anvendelser kan sammensetninger inneholdende foreliggende CDR-podete antistoff eller cocktailer derav, også bli administrert i lignende eller noe lavere doser.

En sammensetning inneholdende et CDR-podet antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli anvendt i profylaktiske og terapeutiske oppsett for å være behjelpelig med alternering, inaktivering, dreping eller fjerning av en valgt T-cellemål-populasjon i et pattedyr.

I en annen utførelsesform kan konstruksjonene beskrevet heri bli anvendt ekstrakorporalt eller in vitro selektivt for å drepe, tappe eller på annen måte effektivt fjerne målcelle-populasjonen fra en heterogen kolleksjon av celler. Blod fra pattedyret kan bli kombinert ekstrakorporalt med CDR-podete antistoffer hvorved de uønskede cellene blir drept eller på annen måte fjernet fra blodet før tilbakeføring til pattedyret i henhold til standardteknikker.

I tillegg til de terapeutiske anvendelsene, vil CDR-podete antistoffer anvendes i diagnostiske analyser. CDR-podete antistoffer kan bli merket i henhold til kjente teknikker. CDR-podete antistoffer er også nyttige for andre in vivo-hensikter. F.eks. kan CDR-podete antistoffer bli anvendt for selektiv cellebehandling av perifere blodceller der det er ønskelig å eliminere bare mål-T-lymfocytter eller likeledes i cellekultur for å eliminere uønskede T-lymfocytter.

Foreliggende oppfinnelse blir nå beskrevet som eksempel med referanse til vedlagte tegninger, der: Fig 1 angir nukleotidsekvensen til den 0KT4A tungkjedevariable domenen; Fig 2 angir nukleotidsekvensen til den 0KT4A lettkjedevariable domenen; Fig 3 angir den 0KT4A tungkjedevariabledomene aminosyresekvensen der CDR er understreket; Fig 4 angir den 0KT4A lettkjedevariabledomene aminosyresekvensen der CDR er understreket; Fig 5 angir oppstilling av KOL med 0KT4A CDR-podet tungkjede-aminosyresekvens der CDR er understreket, humane sekvenser er angitt øverst og murine sekvenser nederst; Fig 6 angir oppstilling av REI med 0KT4A CDR-podet lettkjede-aminosyresekvens der CDR er understreket, humane sekvenser er angitt øverst og murine sekvenser nederst; Fig 7 angir DNA-sekvensen og aminosyretranslasjon av en CDR-podet tung kjede; Fig 8 angir DNA-sekvensen og aminosyretranslasjon av en CDR-podet lett kjede; Fig 9 angir konstruksjonen av en CDR-podet 0KT4A tungkjedeekspresjonsvektor; Fig 10 angir bindings- og blokkeringsanalyser av CDR-podete 0KT4A lettkjedekonstruksjoner i kombinasjon med en kimærisk OKT4A tung kjede; Fig 11 angir bindings- og blokkeringsanalyser av 0KT4A tungkjedekonstruksjoner, HCDR1, HCDR2 og HCDR3, i kombinasjon med 0KT4A lett kjede; Fig 12 angir oppstilling av REI med CDR-podete 0KT4A-lettkjedene, LCDR1 og LCDR2, og murine 0KT4A-lettkjedeamino-syresekvenser der CDR er understreket, humane sekvenser er øverst og murine sekvenser er nederst; Fig 13 angir oppstilling av KOL med CDR-podete 0KT4A-tungkjeder, HCDR1 til og med HCDR10, og murine 0KT4A-tungkjedeaminosyresekvenser der CDR er understreket, humane sekvenser er øverst og murine sekvenser er nederst; Fig. 14 angir bindings- og blokkeringsanalyser av CDR-podete tungkjedekonstruksjoner, HCDR1, HCDR2 og HCDR3 i kombinasjon med CDR-podet lettkjede-LCDR2; Fig. 15 angir bindings- og blokkeringsanalyser av CDR-podete tungkjedekonstruksjoner, HCDR4 til og med HCDR10 i kombinasjon med lettkjede-LCDR2; Fig. 16 (A & B) angir blokkeringsanalyser av 0KT4A-tungkjede-konstruksj onene HCDR5, HCDR6 og HCDR10 i kombinasjon med lettkjedekonstruksjonene LCDR2, LCDR3, LCDR2Q, LCDR3Q og LCDR4Q, og kimæriske former av 0KT4A; Fig. 17 angir relative affinitetsanalyser av 0KT4A-tungkjede-konstruksj onene HCDR5 og HCDR10 i kombinasjon med lettkjede-konstruksjonen LCDR2 og kimæriske og murine former av 0KT4A ved anvendelse av de murine og kimæriske formene av 0KT3 som negative kontroller; Fig. 18 angir resultatene av studiene på inhibisjon av MLR ved forskjellige antistoffer ved anvendelse av T6 som negativ kontroll; og Fig. 19 angir resultatene av studiene på inhibisjon av proliferasjonen av forskjellige antistoffer.

Humanisering av 0KT4A

0KT4A er et murint monoklonalt antistoff som gjenkjenner CD4-antigenet beliggende hovedsakelig på hjelper-T-lymfocytter. CDR-podete antistoffer er blitt konstruert der CDR til de variable domenene av både tunge og lette kjeder var avledet fra den murine 0KT4A-sekvensen. De variable domene-rammeverker og konstante domener ble avledet fra humane antistoffsekvenser.

Tre CDR som ligger på både tunge og lette kjeder består av de residuene som strukturelle studier har vist å være involvert i antigenbinding. Teoretisk, dersom CDR til murint 0KT4A-antistoff ble podet på humane rammeverk for å danne en CDR-podet variabel domene, og denne variable domenen var koblet til humane konstante domener, ville det resulterende CDR-podete antistoffet vesentlig være et humant antistoff med spesifisiteten til murin 0KT4A til å binde det humane CD4-antigenet. Med den sterkt "humane" naturen til dette antistoffet vil det være ventet å være mye mindre immunogent enn murin 0KT4 når administrert til pasienter.

Etter testing for antigenbinding av et CDR-podet 0KT4A-antistoff der bare CDR ble podet på det humane rammeverket, ble det vist at dette ikke produserte et CDR-podet antistoff med tilstrekkelig affinitet for CD4-antigenet. Det ble derfor bestemt at ytterligere residuer ved siden av noen av CDR og kritiske rammeverksresiduer, var nødvendig å bli endret fra humane til tilsvarende murine 0KT4A-residuer for å danne et funksjonelt antistoff.

Isolering av OKT4A tung og lettkjede cDNA og DNA- sekvensanalyse av den variable domenen

For å konstruere CDR-podet 0KT4A-antistoff, var det først nødvendig å bestemme sekvensen til den variable domenen til murine 0KT4A tunge og lette kjeder. Sekvensen ble bestemt fra tung- og lettkjede-cDNA som var blitt syntetisert fra respektive mRNA.

mRNA ble preparert fra 0KT4A-produserende hybridomceller ved guanidiniumtiocyanatekstraksjon etterfulgt av cesiumkloridgradientrensing [38]. cDNA ble syntetisert og bibliotek ble preparert og screenet i Dr. J. Rosen's laboratorium ved R. W. Johnson Pharmaceutical Research Institute in La Jolla, California. cDNA ble syntetisert fra mRNA, EcoRI-1inkere ble tilsatt og det ble deretter ligert inn i EcoRI-setet til lgtlO-kloningsvektoren. Rekombinante fag ble pakket til infeksiøse partikler som ble anvendt for å infisere E. Coli C600.

Dette biblioteket ble screenet for 0KT4A-tungkjedesekvenser ved anvendelse av oligonukleotidprobene Cg og FR3. Cg (mRNA-sekvenseringsprimer fra Pharmacia LKB Biotechnologies, Inc.) har sekvensen

og bindes til den murine IgG-konstante domenen. Probe FR3 har sekvensen og blir bundet til den tredje rammeverksregionen fra den variable domenen av murine tunge kjeder. Fem positive kloner ble vurdert ved southern-overføring og hybridisering til probene Cg, FR3 og et cDNA til mus IgG2a CH3. En enkelt klon med et 1 600 bp EcoRI-innskudd som hybridiserte til alle tre probene ble selektert. Biblioteket ble screenet for 0KT4A-lettkjedesekvensen ved anvendelse av en oligonukleotidprobe Ck (mRNA-sekvenserings-primer fra Pharmacia) med en sekvens og som bindes til den konstante domenen til musekappa. Seks positive kloner ble videre vurdert ved southern-overføring og hybridisering til oligonukleotidprobene T4AK, der sekvensen er og som bindes til rammeverksregion 3 til musekappakjeden og Ck. En enkelt klon som inneholdt et 900 bp EcoRI-innskudd og hybridiserte til begge probene, ble valgt. 1 600 bp tungkjede-cDNA ble klonet inn i EcoRI-setene til pBluescript-plasmidvektor (Stratagene Cloning Systems) og M13mp8-sekvenseringsvektoren (Pharmacia LKB Biotechnologies, Inc.). 900 bp lettkjede-cDNA ble klonet inn i EcoRI-setene til plasmidvektor pUC8 (Pharmacia LKB Biotechnologies, Inc.) og Ml3mpl9-sekvenseringsvektoren.

Dideoksy-nukleotidkjedetermineringsmetoden for DNA-sekvensanalyse [39] ble anvendt for å bestemme sekvensen til både enkelttrådet [M13] og dobbelttrådet (plasmid) templater. Sekvensen til de 5'-utranslaterte regionene, signal-sekvensene, variable domener og en del av de konstante domenene, ble bestemt for både tung- og lettkjede-cDNA. DNA-sekvensen for tunge og lette kjeder er illustrert i fig. 1 og 2. Aminosyretranslasjon av den tungkjedevariable domenesekvensen er presentert i fig. 3. En translasjon av den lettkjedevariable domenen er presentert i fig. 4. Nukleotidsekvensen angitt for den lette kjeden har et A-residu i posisjon 163, mot begynnelsen av den CDRl-kodende sekvensen (se fig. 2).

Translasjon av denne sekvensen tilveiebringer et glutaminresidu i posisjon 27 i den lette kjeden (se fig. 4).

Når sekvenseringen av 0KT4-lettkjeden opprinnelig ble utført, var nukleotidresiduet 163 antatt å være et C-residu, som tilveiebringer et prolinresidu i posisjon 27 i den lette kjeden. De første CDR-podete antistoffene produsert ifølge foreliggende oppfinnere, ble konstruert med den antakelsen av at lettkjederesidu 27 var et prolinresidu. Dette fremkommer fra fig. 6, 8 og 12.

Konstruksjon av CDR- podet 0KT4A- antistoff

For å konstruere CDR-podet 0KT4A-antistoff var det nødvendig å bestemme hvilke residuer av murin 0KT4A som omfatter CDR fra lette og tunge kjeder. Undersøkelse av antistoffrøntgen-krystallstrukturer viser at den antigenbindende overflaten er beliggende på en serie av tre løkker som går ut i fra "b-barrel"-rammeverket til den variable domenen. Disse løkkene kan dermed bli anvendt for å definere CDR. Pga. at krystallstrukturen til murin-0KT4A ikke er tilgjengelig, ble strukturen til et lignende murint antistoff med kjent krystallstruktur anvendt for å definere residuene til løkkene.

Tre regioner med hypervariabilitet blant de mindre variable rammeverksekvensene finnes både i lette og tunge kjeder [2]. I de fleste tilfeller korresponderer disse hypervariable regionene med, men kan gå ut over, CDR. Det ble bestemt at en kombinasjon av de murine 0KT4A-residuene i CDR og de i hypervariable regioner, vil omfatte kompositt-CDR som skal bli podet på det humane antistofframmeverket. Aminosyresekvensene til murine 0KT4A tunge og lette kjeder er presentert i fig. 3 og 4, idet selekterte kompositt-CDR er understreket.

Den humane antistofframmeverkssekvensen for den tunge kjeden er den til det humane antistoffet KOL. KOL ble valgt pga. at dets røntgenkrystallografiske struktur var blitt bestemt med høy resolusjonsgrad. Dette vil muliggjøre nøyaktig molekylær modulering av antistoffet. Av samme grunn ble rammeverks-sekvensen til den humane lette kjededimeren, REI, anvendt for lettkjedede rammeverk. Aminosyresekvensene til KOL og REI er vist i fig. 5 og 6 sammenlignet med de i de CDR-podete 0KT4A-tunge (HCDR1) og lette (LCDR1) kjedevariable domenene.

CDR-podet tungkjede ble konstruert og inneholde en human IgG4-konstant del. IgG4-subklassen ble valgt basert på erfaringen med det murine anti-CD3-monoklonale antistoffet, 0KT3, som blir anvendt for å behandle nyrepodningsavstøtning. 0KT3 har en murin IgG2a-isotype og fikserer ikke komplement i mennesker. Human IgG4-isotype fikserer helle ikke komplement. CDR-podet 0KT4A-lettkjede ble konstruert med den humane kappakonstante domenen.

Konstruksjon av CDR- podete 0KT4A- gener

Tung- og lettkjede-CDR-podete variable domener ble konstruert ved ligering av syntetiske dobbelttrådete DNA-oligomerer, på samme måte som fremgangsmåten anvendt i [40]. 5'-enden av de variable domenene inneholder signalsekvenser av de lette og tunge kjedene til murinmonoklonalt antistoff B72.3 [41]. Signalsekvensen leder sekresjon av antistoffet fra pattedyr-cellene. En Kozak-sekvens [42] kommer rett etter AUG-startkodonet for å forsterke translasjon. Variable domener blir deretter ligert til DNA, kodende for de humane konstant-domenene for å danne gener for CDR-podete tunge og lette kj eder.

CDR- podet 0KT4A- tungk. 1 edekonstruksj on

Åtte komplementære par av oligomerer, med omtrent 30 bp i lengde ble konstruert for å danne overlappende ender og å dekke den variable domenen fra et Xhol-sete beliggende 1 rammeverk 2 til et Hindlll-sete ved begynnelsen av den første konstante domenen. Disse åtte oligomerparene ble syntetisert, ligert sammen på en trinnvis måte og deretter ligert til Hindlll 5'-enden av det humane IgG4-konstantdomene DNA. IgG4-DNA ble tilveiebrakt av Celltech, Ltd. (Slough, U.K.) som genomisk DNA. Det er et 2153bp-innskudd i en M13-fag DNA-vektor med et 5' EcoRI- og et 3' BamHI-restriksjonssete. CH1-, hengsel-, CH2- og CH3-domenene er omgitt av fire introner. Genet ble modifisert av Celltech for å inneholde en C til A forandring ved den nestsiste basen av CHl-eksonet for å danne et nytt Hindlll-sete for CDR-podete genkonstruk-sjoner .

5'-enden av den variable domenen ble konstruert ved ligering av to komplementære par av syntetiske oligomerer, hver med omtrent 90 bp i lengde. Dette fragmentet, som hadde en 5' EcoRI-ende og en 3' Xhol-ende ble ligert til Xhol-enden av fragmentet beskrevet ovenfor for å tilveiebringe det fullstendige CDR-podete tungkjedegenet. Dette genet har en lengde på 2364bp og har en 5' EcoRI-ende og en 3' BamHI-ende. DNA-sekvensen med aminosyretranslasjon av genet er vist i fig. 7. Regioner av interesse, definert ved nukleotidtall, er:

CDR- podet lettk. 1 edegenkonstruksj on

Tolv komplementære par av syntetiske oligomerer med overlappende ender ble ligert samtidig for å oppstille den CDR-podete lettkjedevariable domenen. Dette fragmentet hadde en 5' EcoRI-ende og en 3' Narl-ende. Dette ble ligert til 5' Narl-enden av humant kappakonstant domene-DNA. Humant kappakonstant cDNA ble modifisert ved Celltech for å innbefatte et Narl-restriksjonssete i tredje og fjerde kodoner. Det resulterende CDR-podete lettkjedegenet var 754bp i lengde og hadde EcoRI-ender. DNA-sekvensen med aminosyretranslasjon er vist i fig. 8. Regioner av interesse definert ved nukleotidtall, er:

Ekspresjon av CDR- podet 0KT4A- antistoff

Konstruksjon av tungkjedeekspresjonsvektoren

En CDR-podet tungkjedeekspresjonsvektor ble konstruert ved innskudd av tungkjedegenet inn i ekspresjonsplasmidet pEe6HCMVBgl2 og tilsetning av GS-fragmentet, som består av SV40-origo og glutaminsyntetaseminigenet. Disse trinnene er angitt i fig. 9. pEe6HCMVBgl2 og GS-fragmentet ble tilveiebrakt av Celltech, Ltd.

pEe6HCMV ble spaltet ved EcoRI- og Bcll-setene. pEe6HCMVBgl2 DNA var blitt demetylert ved gjennomgang gjennom DAM E. Coli-stamme GM242, som mangler deoksyadenosinmetylasen. Bell vil bare hemme DNA som ikke inneholder N^-metylert deoksyadenosin ved enzymets gjenkjenningssete. Overhenget som er et resultat av Bcll-restriksjonen, er kompatibelt med BamHI-overhenget. EcoRI/BamHI CDR-podet tungkjedegenet (HCDR1) ble deretter ligert til EcoRI/BclI-endene av pEe6HCMVBgl2 for å produsere pEeåHCDRl.

Et 5500 bp BamHI-fragment inneholdende glutaminsyntetaseminigenet og SV40-replikasjonsorigo og tidlige og sene promotere, ble skutt inn i BamHI-setet til pEeåHCDRl for å produsere pEe6HCDRlgs. Den riktige orienteringen til GS-fragmentet blir verifisert ved restriksjonsanalyse. pEe6HCDRlgs ble preparert fra pattedyrcelletransfeksjon ved den alkaliske lyseringsmetoden og cesiumkloridgradientrensing

[43].

pEe6HCDRlgs kan uttrykke CDR-podet 0KT4A-tungkjede i COS- og CHO-celler. HCMV-promoteren ligger 5' for genet for tung kjede og leder transkripsjonen. SV40-polyadenyleringssignal-sekvensen, som ligger 3' for genet, virker som en transkripsjonen terminator. For transient ekspresjon i COS-celler, er SV40-replikasjonsorigo tilstede i GS 5500 bp-fragmentet. GS-minigenet er tilstede som en selekterbar markør for anvendelse etter CHO-celletransfeksjoner. Ekspresjon av

glutaminsyntetaseminigenet blir drevet av SV40-senpromoteren. GS-fragmentet er orientert slik at SV40-senpromoteren driver transkripsjonen i samme retning som HCMV-promoteren.

Flere post-transkripsjonelle hendelser oppstår for å produsere CDR-podet tungkjede. Innenfor kjernen er de tre mellomliggende sekvensene av den IgG4-konstante delen fjernet og eksonene blir spleiset samen for å danne et modent mRNA. Etter translasjon blir 19 aminosyresignalsekvensen fjernet i røft endoplasmatisk retikulum (ER). Et enkelt karbohydrat blir tilsatt til CH2-domenen av hver kjede i ER og Golgi-apparatet. Hver kjede inneholder også fire intrakjede-disulfidbindinger. Når et lettkjedepeptid blir tilveiebrakt av en ko-transfektert lettkjedeekspresjonsvektor, blir et modent antistoff oppstilt ved sammenbinding, via disulfid-bindinger, av to tunge og to lette kjeder.

Konstruksjon av CDR- podet 0KT4A- lettkjedeekspresjonsvektor

CDR-podet 0KT4A-lettkjedeekspresjonsvektor ble konstruert ved innskudd av det CDR-podete lettkjedegenet inn i ekspresjonsvektor pEe6HCMVBgl2 og deretter tilsetning av SV40-origo og glutaminsyntetaseminigen-inneholdende GS-fragment. Lettkjede-ekspresjonsvektoren ble konstruert ved vesentlig samme fremgangsmåte som ble anvendt for vektoren for ekspresjon av tungkjede som illustrert i fig. 9. Genet for den lette kjeden ble ligert inn i EcoRI-setet til pEe6HCMVBgl2 for å fremstille pEe6LCDRl. Den riktige orienteringen av genet for den lette kjeden ble verifisert ved restriksjonsanalyse. 5500 bp GS-fragmentet ble skutt inn i BamHI-setet for å fremstille pEe6LCDRlgs. Den riktige orienteringen av GS-fragmentet ble verifisert ved restriksjonsanalyse. pEe6LCDRlgs fremstilt for pattedyrcelletransfeksjon ved den alkaliske lyseringsmetoden

[43] og ved cesiumkloridgradientrensing.

Som med CDR-podet tungkjedegenet er transkripsjonen av CDR-podet lettkjedegenet i pEe6LCDRgs drevet av HCMV-promoteren og transkripsjonen terminering blir signalisert av SV40-polyadenyleringssignalsekvensen. SV40-replikasjonsorigo innbefattet i GS-fragmentet, muliggjør autonom replikasjon av denne konstruksjonen i COS-celler. Glutaminsyntetaseminigenet i GS-fragmentet tilveiebringer en mekanisme for seleksjon og amplifikasjon i CHO-celler.

Post-transkripsjonell prosessering av CDR-podet lettkjede-mRNA er ikke nødvendig før translasjon, pga. at ingen introner er tilstede i genet. Etter translasjon blir ledersekvensen fjernet i røff ER. To intrakjededisulfid-bindinger blir dannet. Oppstilling av et modent antistoff ble diskutert i den tidligere seksjonen.

Transient ekspresjon av CDR- podet 0KT4A 1 COS- l- celler Transient ekspresjon av CDR-podete gener i COS-l-celler tilveiebringer et hurtig og hensiktsmessig system for å teste CDR-podet 0KT4A-antistoffekspresjon og funksjon. COS-l-celler uttrykker SV40 stort T-antigen konstituitivt og dette understøtter den transiente replikasjonen av episomer inneholdende SV40-replikasjonsorigo [44] . De CDR-podete genekspresjonsvektorene pEe6HCDRlgs og pEe6LCDRlgs inneholder SV40-replikasjonsorigo som en del av GS-fragmentet. Ved transfeksjon inn i COS-l-celler blir ekspresjonsvektorene replikert i kjernen til et høyt kopiantall og resulterer i relativt høye ekspresjonsnivåer.

COS-l-celler ble oppnådd fra American Type Culture Collection (CRL 1650) og dyrket i Dulbecco's modifiserte Eagle-medium (DMEM fra GIBCO) med 10 % føtalt kalveserum. De CDR-podete genekspresjonsvektorer ble transfektert inn i COS-celler ved anvendelse av DEAE-dekstranmetoden etterfulgt av DMSO-sjokk

[45]. 0,2 ml 1 mg/ml DEAE-dekstran i buffer ble tilsatt til 15 mg vektor-DNA i 0,8 ml DMEM/tris. Dette ble tilsatt til

1 - 1,5 x 10^ celler i en 60 mm vevskulturskål og inkubert i omtrent 6 timer. DEAE-dekstran/DNA-komplekset blir fjernet og 10 % DMSO i buffer tilsatt til skålen i 2 minutter. Dette blir fjernet, cellene vasket én gang med DMEM og deretter inkubert med DMEM inneholdende 10 # føtalt kalveserum i 3 - 4 dager. Da blir supernatanten fra brønnene høstet og undersøkt for antistoffnivåer og evne til å binde CD4-positive lymfocytter.

Antistoffnivåene ble bestemt ved ELISA. Brønnene ble belagt med et geiteanti-humant Fc-spesifikt antistoff. Forskjellige fortynninger av COS-cellesupernatanten inneholdende utskilt antistoff, ble tilsatt, inkubert i én time ved romtemperatur i et fuktekammer og vasket. Et pepperrotperoksidase-bundet geiteanti-humant kappakjedeantistoff ble tilsatt, inkubert i én time ved romtemperatur og vasket. Substrat for pepperrotperoksidase ble tilsatt for deteksjon. CDR-podete 0KT4A-nivåer etter ko-transfeksjon av pEe6HCDRlgs og pEe6LCDRlgs varierer fra 200 til 1 200 ng/ml COS-cellesupernatant.

Antigenbindende studier

CDR-podet 0KT4A produsert av COS-celler ble testet for dets evne til å bli bundet til humane perifere blodlymfocytter (PBL) eller CD4-positiv HPBALL(human perifer blodakutt-lymfocytisk leukemi)-cellelinjen. Det ble også testet for dets evne til å blokkere bindingen av murine 0KT4A til disse cellene. Bindingen ble målt ved følgende fremgangsmåte. PBL ble isolert fra serum eller HPBALL-celler ble høstet fra vevskulturen. Cellene ble inkubert ved 4°C i 1 time med forskjellige fortynninger av testantistoffet, positiv kontrollantistoff eller negativ kontrollantistoff. Cellene ble vasket én gang og inkubert ved 4°C i 1 time med et FITC-merket geiteanti-humant IgG (Fc-spesifikt, museabsorbert). Cellene ble vasket to ganger og analysert ved cytofluorografi. Kimærisk 0KT4A (beskrevet nedenfor) ble anvendt som en positiv kontroll. FITC-merket murin 0KT4A ble anvendt som en positiv kontroll for direkte binding. Celler inkubert med narre-transfektert COS-cellesupernatant, etterfulgt av FITC-merket geiteanti-humant IgG, tilveiebrakte den negative kontrollen.

For å teste evnen som CDR-podet 0KT4A har til å blokkere murin 0KT4A-binding, ble PBL- eller HPBALL-cellene inkubert ved 4°C i 1 time med forskjellige fortynninger av test-antlstoff eller kontrollantistoff. En fastsatt mettende mengde FITC-0KT4A ble tilsatt. Prøvene ble inkubert i 1 time ved 4°C, vasket to ganger og analysert ved cytofluorografi. Positive kontroller ble FITC-merket 0KT4A for å bestemme maksimal binding og umerket murin 0KT4A som referansestandard for blokkering. Negative kontroller var umerkede celler med eller uten narre-transfektert cellesupernatant.

Evnen som CDR-podet 0KT4A-lettkjeden har til å binde CD4-positive celler og blokkere bindingen av murin 0KT4A, ble opprinnelig testet i kombinasjon med en kimærisk 0KT4A-tungkjede. Den kimæriske 0KT4A tunge kjeden består av murin 0KT4AA-variabel domene og den humane IgG4-konstante delen. Det kimæriske tunge kjedegenet blir uttrykt i samme ekspresjonsvektor anvendt for CDR-podete gener. CDR-podet lettkjedeekspresjonsvektor og kimærisk tungkjedeekspresjonsvektor ble ko-transfektert inn i COS-cellene. Det fullstendige kimærisk 0KT4-antistoffet (kimærisk lettkjede og kimærisk tungkjede) ble funnet å kunne bli bundet til CD4-positive celler og blokkere bindingen av murine 0KT4 til disse cellene.

Som fig. 10 viser, kunne CDR-podet 0KT4A-lettkjede, LCDR1, i kombinasjon med den kimæriske 0KT4A tunge kjeden, ikke binde CD4-positive celler eller blokkere bindingen av murine 0KT4A til disse cellene.

Fig. 11 viser bindings- og blokkeringsstudier utført med CDR-podet 0KT4A-tungkjede, HCDR1, kombinert med kimærisk 0KT4A-lettkjede. Kimærisk 0KT4A-lettkjeden består av en murin 0KT4A-variabel domene og en human kappakonstant domene. Den blir også uttrykt i samme ekspresjonsvektor som anvendt for CDR-podete antistoffer. COS-celler ble ko-transfektert med

CDR-podet tungkjedeekspresjonsvektor og kimærisk lettkjedeekspresjonsvektor.

CDR-podet 0KT4Å-tungkjede, HCDR1, i kombinasjon med kimærisk 0KT4A-lettkjede, hadde heller ikke evnen til å binde CD4-positive celler eller blokkere bindingen av murin 0KT4A til disse cellene.

Modifikasjon av CDR- podet antistoff

Bindings- og blokkeringsdataene demonstrerer klart at det opprinnelige konstruerte CDR-podete 0KT4A-antistoffet ikke kunne gjenkjenne CD4-antigenet. Ytterligere modifikasjon av antistoffet var nødvendig. Enten var det nødvendig at murine 0KT4A CDR ble ytterligere utvidet eller at kritiske rammeverksresiduer involvert i plassering av CDR, domenepakking eller lett- og tungkjedeintraksjoner, ble forandret fra humane til fra mus.

Molekylær modellering ble anvendt for å identifisere residuene som fremkom som mest kritiske for vellykket antigeninteraksjon. Modelldannelse ble utført ved Celltech, Ltd. med HYDRA software på et silikongrafisk instrument.

Modifikasjon av CDR- podet lett kjede

Krystallstrukturen til 0KT4A er ikke blitt bestemt slik at en molekylær modell på selve 0KT4A ikke kunne bli anvendt i analysen. For å analysere residuer til CDR-podet lettkjede, var en molekylær modell av den humane REI-lette kjeden lagt opp og sammenlignet med et muse-MOPC 603 Fab-fragment. MOPC 603-lettkjeden har lik aminosyresekvens som 0KT4A. Også studier ble utført for den humane REI-lette kjeden og humane KOL-tunge kjeden ble registrert. Det ble avgjort å utvide CDR1 ved å omdanne residuene 33 og 34 fra human leu og asp til murin 0KT4A ile og ala. Det humane REI-residuet glu38 ble funnet å være involvert i pakking av tung og lett kjede. Forandring av dette til murin 0KT4A his38 kan være fordelaktig. Residuet 49 ved den aminoterminale enden av CDR2 virker direkte inn på CDR2 og er også i kontakt med CDR3 fra den tunge kjeden. Residuet 89 nær den aminoterminale enden av CDR3, reagerer med phe98 i CDR3 av den lette kjeden og kontakter også CDR3 fra den tunge kjeden. REI tyr49 og gln89 ble forandret til murin 0KT4A his49 og leu89.

Det nye CDR-podete 0KT4A-lettkjedegenet som ble dannet ved ovennevnte forandringer ble betegnet LCDR2. En sammenligning av aminosyresekvensen til de variable domenene av human REI, LCDR1, LCDR2 og antatt murin 0KT4A-lettkjeden, er vist i fig. 12. Forandringene ble oppnådd ved endring av kodonene ved sete-rettet mutagenese [46]. "Bluescripf-fagmidvektor fra Stratagene Cloning Systems ble anvendt for å danne enkelttrådet templat for mutagenese. Ekspresjonsvektoren pEe6LCDR2gs ble konstruert på samme måte som for LCDR1. COS-cellene ble ko-transfektert med pEe6LCDR2gs og den kimæriske tungkjedeekspresjonsvektoren.

Resultatene av bindings- og blokkeringsstudiene er vist i fig. 10. LCDR2-versjonen av den CDR-podete 0KT4A-lette kjeden, i kombinasjon med den kimæriske 0KT4A-tunge kjeden, har evne til å bli bundet til CD4-positive celler og blokkering av bindingen av murin 0KT4A. disse data viser at LCDR2 er en funksjonell CDR-podet 0KT4A-lettkjede.

Modifikasjon av CDR- podet tung kjede

For modellstudier av den tunge kjeden ble den molekylære modellen av det humane antistoffet KOL anvendt. Alle residuforandringene ble utført ved sete-rettet mutagenese for å forandre kodoner. Det ble avgjort å forandre glu57 og his58 i KOL til thr57 og tyr58 til murin 0KT4A. Denne reviderte CDR-podete tunge kjeden ble betegnet HCDR2. I tillegg til forandringene i residuene 57 og 58, ligger residuet 24 nær CDR1 og kan være involvert i plassering av CDR1. Residuene 88 og 91 er også involvert i pakking av den tungkjedevariable domenen og grenseflaten mellom tunge og lette kjeder. Disse tre ytterligere residuforandringene fra KOL til murin 0KT4A, ble inkorporert inn i tungkjedeversjonen HCDR3. En aminosyre-sekvenssammenligning av de variable domenene til KOL, HCDR1, HCDR2, HCDR3, murin 0KT4A-tungkjede og versjoner som blir beskrevet nedenfor, er illustrert i fig. 13.

Ekspresjonsvektorene pEe6HCDR2gs og pEe6HCDR3gs ble ko-transfektert inn i COS-celler med enten kimærisk 0KT4A-lettkjedeekspresjonsvektor eller pEe6LCDR2gs. Bindings- og blokkeringsdata er presentert i fig. 11 og 14. Hverken HCDR2 eller HCDR3 kunne effektivt reagere med antigen når kombinert med en kimærisk eller CDR-podet 0KT4A-lettkjede.

Ytterligere modifikasjoner i CDR-podet tung kjede ble undersøkt. Det ble avgjort å forandre KOL tyr35 til murin 0KT4A ser35. Molekylær modelldannelse demonstrerte at residuet 42 var involvert i plassering av CDR2. Residuet 44 er involvert i lettkjedekontakter. Det kan være fordelaktig å forandre KOL gly42 og gly44 til murin 0KT4A glu42 og arg44. KOL ala60 ble forandret til murin OKT4A pro60. Disse forandringene ble introdusert i forskjellige kombinasjoner, mens forandringene utført ved residuene 24, 57, 58, 88 og 91 ble beholdt i tidligere versjoner. Disse tidligere versjonene ble betegnet HCDR4, HCDR5, HCDR6, HCDR7, HCDR8. Residuforandringene i hver er beskrevet i fig. 13. Samme ekspresjonsvektor ble anvendt som ved andre konstruksjoner. COS-cellene ble ko-transfektert med de nye tungkjedeeks-presjonsvektorene og pEe6LCDR2gs.

Resultatene av bindings- og blokkeringsstudier, i kombinasjon med LCDR2 (fig. 15), viser positive interaksjoner med CD4-antigenet i alle disse versjonene unntatt HCDR8. Omdanningen av tyr35 til murin ser35 er en kritisk forandring. Forandringen til det 1,2 murine residuet i posisjon 60, ser ut til å forsterke antigeninteraksjonen (sammenlign HCDR6 vs HCDR4), mens forandringen i posisjon 44 er noe inhibitorisk (HCDR5 vs HCDR4 og HCDR7 vs HCDR6).

For å bestemme om forandringene i residuene 35 og 60 ville være tilstrekkelig for antigenbinding, ble HCDR9 (murine residuer ved posisjonene 24, 35, 57, 58, 88, 91) og HCDR10

(murine residuer ved posisjonene 24, 35, 57, 58, 60, 88, 91)

dannet ved sete-rettet mutagenese. Samme ekspresjonsvektor-system blir anvendt for disse versjonene av CDR-podet tung kjede. De ble ko-transf ektert inn i COS-cellene med pEe6LCDR2gs.

Resultatene av bindings- og blokkeringseksperimentene er illustrert i fig. 15 sammen med tidligere versjoner av CDR-podet tung kjede. Det fremgår at forandringene utført i residuene 42 og 44 i tidligere versjoner, ikke var nødvendige i motsetning til kriteriene angitt i PCT/US89/05857. Forandringen i residuet 60, tilstede i HCDR10, men ikke i HCDR9, er fordelaktig.

En oppsummering av CDR-podete 0KT4A-tunge kjeder og deres aktiviteter i bindings- og blokkeringsanalyser, er vist i tabell 1. Det mest aktive CDR-podete 0KT4A-antistoffet som inneholder de færreste murinresiduene, er kombinasjonen av HCDR10 og LCDR2.

Alternative lettkj edekonstruksj oner

Som angitt ovenfor ble foreliggende lettkjedekonstruksjoner produsert på den antakelsen av at det i posisjon 27 i 0KT4A-lettkjeden var et prolinresidu. Når det fremkom at posisjon 27 bør være et glutaminresidu, ble tre nye lettkjedekonstruksjoner dannet og uttrykt. Disse ble merket LCDR2Q, LCDR3Q og LCDR4Q og er identiske med LCDR2, LCDR3 og LCDR4 med unntakelse av at det i posisjon 27 er et glutamin(Q)-Istedenfor et prolin(P)-residu. Det er blitt vist at disse lette kjedene beholdt full aktivitet. Data som viser dette er presentert i fig. 16.

Det er å bemerke at prolin er betraktelig forskjellig i forhold til alle andre aminosyrer pga. at det har en plan struktur. Det finnes derfor vanligvis ved seter i peptid-sekvenser hvor en forandring i orientering av kjeden oppstår. Det er derfor sannsynlig at strukturen til den lette kjeden CDR1 som har prolin i residuet 27, vil være betraktelig forskjellig i forhold til lettkjede-CDRl som har glutamin i residuet 27. Til tross for dette er det blitt demonstrert at de to lett kjedene er ekvivalente fra et funksjonelt standpunkt. Dette understøtter at det ikke er nødvendig å forandre alle 6 CDR i antistoffet for å produsere et funksjonelt CDR-podet antistoff.

Alternative modifikasjoner av CDR- podete lette og tunge kjeder

Residuforandringer utført i senere versjoner av CDR-podete lette og tunge kjeder ble utført basert på molekylær modellering av REI, KOL og et beslektet museantistoff, MOPC 603, istedenfor selve CDR-podete antistoffer. Noen av endringene kan være unødvendig for binding, spesielt ved lavere bindingsaffiniteter. Vi har konstruert flere CDR-podete lette og tunge kjedegener der noen av rammeverks-residuene tidligere omdannet til museresiduer, er blitt forandret tilbake til det humane. De residuene som ikke er direkte involvert i forlenging av CDR eller plassering av CDR, blir forandret tilbake til de humane residuene i forskjellige kombinasjoner. Tabell 2 har oppført disse lette og tunge kjedegenene med residutall som reverterer fra murin til human. Sete-mutagenese ble anvendt for å konstruere disse genene. De vil bli uttrykt i COS-celler og deres evne til å gjenkjenne CD4 vil bli testet i bindings- og blokkeringsanalyser. Det mest ønskelige CDR-podete antistoffet er det med færrest murine residuer som kan gjenkjenne CD4 med en affinitet som er lik den til murin 0KT4A.

Bestemmelse av relativ bindingsaffinitet

Relative bindingsaffiniteter til CDR-podete anti-CD4-monoklonale antistoffer ble bestemt ved konkurreringsbinding

[8] ved anvendelse av HPB-ALL-human T-cellelinje som en kilde for CD4-antigen og fluorescens-konjugert murin K0T4A (Fl-0KT4A) med kjent bindingsaffinitet som et markørantistoff. Bindingsaffiniteten til Fl-0KT4A-markørantistoffet ble bestemt ved direkte bindingsanalyse der økende mengde Fl-0KT4A ble inkubert med HPB-ALL (5 x IO<5>) i PBS med 5 % føtalt kalveserum i 60 minutter ved 40°C. Cellene ble vasket og fluorescensintensiteten ble bestemt på et FACScan-flow-cytometer kalibrert med kvantitative mikrokuleoppsett (Flow Cytometry Standards, Research Triangle Park, NC). Fluorescensintensitet pr. antistoffmolekyl (F/P-forhold) ble bestemt ved anvendelse av mikrokuler som har et forutbestemt antall muse-IgG-antistoffbindingsseter (Simply Cellular Beads, Flow Cytometry Standards). F/P er lik fluorescensintensiteten til kuler mettet med F1-0KT4A delt på antall bindingsseter pr. kule. Mengden av bundet og fri F1-0KT4A ble beregnet ut i fra gjennomsnittlig fluorescensintensitet pr. celle, og forholdet bundet/fri ble plottet mot antall mol antistoff bundet. En lineær tilpasning ble anvendt for å bestemme bindingsaffiniteten (absolutt verdi til stigningen).

For konkurrerende binding ble økende mengder kompetitor-antistoff tilsatt til en sub-mettende dose F1-0KT4A og inkubert med 5 x IO<5> HPB-ALL i 200 >j1 PBS med 5 % føtalt kalveserum i 60 minutter ved 4°C. Fluorescensintensitetene til cellene ble målt på et FACScan-flow-cytometer kalibrert med kvantitative mikrokulestandarder. Konsentrasjonene av bundet og fritt F1-0KT4A ble beregnet. Affinitetene til konkurrerende antistoffer ble beregnet fra ligningen [X]-[0KT4A] = (1/Kx) - (l/Ka), der Ka er affiniteten til murin 0KT4A, Kx er affiniteten til kompetitor X, [ ] er konsentra-sjonen av kompetitorantistoffet der bundet/fri binding er R/2, og R er maksimal bundet/fri binding.

Affinitetsresultater

Relative affinitetskonstanter til humaniserte antistoffer (fig. 17, tabell 3) ble bestemt, og LCDR2 kombinert med HCDR10 beholdt 68 % av aktiviteten til forelderen. LCDR2/HCDR5 (tabell 1) beholdt bare 13 % av den murine antistoffaffiniteten. Disse resultatene er i samsvar med de som ble oppnådd i blokkeringsanalysene (fig. 16a & b). Sammenligning av HCDR5 med HCDR7 (fig. 15) foreslår at residuet 60, som ikke er kritisk for aktivitet, er fordelaktig når omdannet til den i donorsekvensen. I samme figuren kan den skadelige virkningen av donorresiduet i posisjon 44 også sees (HCDR4 vs. HCDR5).

Funksjonelle studier

Det antas at CD4-antigenet som blir gjenkjent av 0KT4A og dets kimæriske og CDR-podete ekvivalenter, er involvert i interaksjoner som gir opphav til de biologiske funksjonene til T-lymfocytter som bærer CD4-antigenet. Det er spesielt antatt at CD4-antigenet er involvert i den blandede lymfo-cyttreaksjonen (MLR) og i proliferasjon av perifere mono-nukleære celler fra blod (PBMC). For å vise at CDR-podete antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse sannsynligvis har samme biologiske aktivitet som murin 0KT4A, ble følgende funksjonelle studier utført.

Inhibisjon av MLR

Human PBMC ble isolert ved tetthetsgradientsentrifugering med Ficoll og resuspendert i fullstendig DMEM inneholdende 1 % føtalt kalveserum (FCS). 2 x 10<5->responder PBMC og 1 x 10<5->bestrålt (2 Mrad) allogenisk PBMC ble tilsatt til hver brønn av en 96 brønn vevskulturskål, etterfulgt av serie-fortynninger av et renset anti-CD4-antistoff. Cellene ble dyrket i 6 dager, pulset med <3>H-tymidin i 24 timer og høstet. <3>H-tymidininkorporering ble målt ved vaeskescintillasjon.

Som en negativ kontroll ble bestrålte responderceller anvendt istedenfor bestrålte allogeniske PBMC og antistoff ble ikke tilsatt. Som en positiv kontroll ble eksperimentet utført uten tilsetning av antistoff. I eksperimentet var antistoffene som ble anvendt murin 0KT4A, kimærisk 0KT4A og F(ab')2-fragmentet til murin 0KT4A.

Resultatene av eksperimentet er vist i fig. 18. Både kimærisk 0KT4A og murin 0KT4A viste lignende inhibisjon av MLR.

Proliferas. ionsinhibisjon

0KT3 (20 ng/ml), et murin MAb som gjenkjenner CD3-antigenet på T-lymfocytter, ble immobilisert på polystyren 96 brønn vevskulturskåler i 4 timer ved 20"C. Skålene ble vasket tre ganger med f osf atbuf f ret saltvann (PBS) og 1 x IO<5> PMBC ble tilsatt til hver brønn. Deretter ble fortynninger i serie av et anti-CD4-antistoff tilsatt. Cellene ble dyrket i 72 timer, pulset med <3>H-tymidin i 24 timer og høstet. <3>H-tymidin-inkorporeringen ble målt ved vaeskescintillasjon.

Som en negativ kontroll ble proliferingen målt i fravær av både 0KT3- og anti-CD4-antistoffene. Som en positiv kontroll ble proliferasjonen målt i nærvær av 0KT3 alene. I dette eksperimentet var antistoffene som ble anvendt murin 0KT4A, kimærisk 0KT4A og F(ab')g-fragmentet av murin 0KT4A. Resultatene er angitt i fig. 19 som viser at kimærisk 0KT4A har vesentlig samme evne til å inhibere proliferasjonen som murin 0KT4A.

De funksjonelle studiene vist ovenfor viser at kimærisk 0KT4A har ekvivalente biologiske egenskaper som murin 0KT4A. Pga. at CDR-podete anti-CD4-antistoffer har vesentlig samme affinitet for CD4-antigenet som kimærisk 0KT4A-antistoffet og pga. at det kimæriske 0KT4A-anti stoffet har samme konstante domener som CDR-podete 0KT4A-antistoffer, kan det ventes at CDR-podete 0KT4A-antistoffer vil ha samme biologiske funksjoner som murine 0KT4A og vil dermed kunne anvendes i terapi.

Oppsummering

Et antall forskjellige CDR-podete 0KT4A-antistoffer er blitt dannet. DNA, kodende for CDR fra murin 0KT4A tunge og lette kjeder, er blitt podet på rammeverket til den humane tunge kjeden KOL og lette kjeden REI-antistoffgenene. Disse variable domenene blir ligert til DNA, kodende for human kappalettkjede og IgG4-tungkjedekonstantdelen. Resulterende CDR-podete gener blir uttrykt i COS-l-cellene. Antistoff utskilt i vevskulturmediet blir oppsamlet, kvantifisert ved ELISA og testet for dets evne til å binde til CD4-positive celler og å blokkere bindingen av murin 0KT4A.

Det opprinnelig konstruerte CDR-podete antistoffet kunne ikke reagere med CD4. Et antall modifikasjoner ble utført på den lette kjeden hvor kritiske humane rammeverksresiduer i REI-sekvensen, identifisert ved molekylær modelldannelse, ble forandret til murine 0KT4A-residuer. Denne nye versjonen av den lette kjeden, LCDR2, gjenkjente CD4-antigenet. Likeledes ble et antall rammeverksresiduer fra human tung kjede forandret til murine i forskjellige kombinasjoner for å danne HCDR2 til og med HCDR10. Flere av disse tunge kjedene, i kombinasjon med LCDR2, konkurrerer med det murine 0KT4A-antistoffet for CD4. CDR-podet 0KT4A som fortrinnsvis velges, er kombinasjonen av LCDR2Q og HCDR10. Ytterligere versjoner av lette og tunge kjeder blir for tiden dannet der nettverks-residuer som tidligere var blitt forandret til murine residuer, blir forandret tilbake til humane. Disse mer humaniserte CDR-podete antistoffene vil bli testet for deres evne til å gjenkjenne CD4.

Claims (16)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et antistoffmolekyl som har evne til å bli bundet til CD4 antigenet, som omfatter en kompositt tungkjede og en komplementær lett kjede hvori, i den variable domenen av nevnte kompositt tungkjede, rammeverksregionene er hovedsakelig avledet fra et humant antistoff (akseptor) og minst residiene 23, 24, 26 til 35, 49 til 65 og 95 til 102 (ifølge Kabat nummereringssystem) tilsvarer de ekvivalente residiene i muse monoklonalt antistoff 0KT4A (donor) som vist i figur 3, karakterisert ved at en første DNA-sekvens tilveiebringes, som koder for en første antistoffkjede der rammeverksregionene er hovedsakelig avledet fra et første antistoff (akseptor) og minst én CDR er avledet fra et andre antistoff (donor), under kontroll av egnede oppstrøms- og nedstrøms-elementer; en vertscelle transformeres med den første DNA-sekvensen og den transformerte vertscellen dyrkes slik at et humanisert OKT 4a antistoff fremstilles.

2. Fremgangsmåte for fremstilling ifølge krav 1, der i den CDR-podete kjeden, den eller hver CDR omfatter en kompositt-CDR omfattende alle residier fra CDR og alle residiene i den tilsvarende hypervariable regionen av donorantistoffet, karakterisert ved at tilsvarende ekspresjonssystem anvendes.

3. Fremgangsmåte for fremstilling av humanisert OKT 4a antistoff ifølge kravene 1 eller 2, der minst ett residie i rammeverksregionene av den CDR-podete kjeden er blitt endret slik at det korresponderer med det ekvivalente residiet i donoranti-stof fet, karakterisert ved at tilsvarende ekspresjonssystem anvendes.

4 . Fremgangsmåte for fremstilling av humanisert OKT 4a antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3, der rammeverksregionene til den CDR-podete kjeden er avledet fra en human lg tung kjede, karakterisert ved at tilsvarende ekspresjonssystem anvendes.

5. Fremgangsmåte for fremstilling av humanisert OKT 4a antistoff ifølge krav 4, der residiet 35 i rammeverksregionene til den tunge kjeden er blitt endret slik at det tilsvarer det ekvivalente residiet i donorantistoffet, karakterisert ved at tilsvarende ekspresjonssystem anvendes.

6. Fremgangsmåte for fremstilling av humanisert OKT 4a antistoff ifølge kravene 4 eller 5, der residiene 23, 24 og 49 i den tunge kjeden er endret for å korrespondere med de ekvivalente residiene i donorantistoffet, karakterisert ved at tilsvarende ekspresjonssystem anvendes.

7 . Fremgangsmåte for fremstilling av humanisert OKT 4a antistoff ifølge krav 6, der residiene 6, 23, 24, 48 og 49 korresponderer med det ekvivalente residiet i donorantistoffet, karakterisert ved at tilsvarende ekspresjonssystem anvendes.

8. Fremgangsmåte for fremstilling av humanisert OKT 4a antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3, der rammeverksregionene i den CDR-podete kjeden er avledet fra en human Ig-lett kjede, karakterisert ved at tilsvarende ekspresjonssystem anvendes.

9 . Fremgangsmåte for fremstilling av humanisert OKT 4a antistoff ifølge krav 8, der residiet 49 i den lette kjeden korresponderer med ekvivalente residier i donorantistoffet, karakterisert ved at tilsvarende ekspresjonssystem anvendes.

10. Fremgangsmåte for fremstilling av humanisert OKT 4a antistoff ifølge krav 8 eller 9, deri de lette kjedene, korresponderer residiene 49 og 89 med ekvivalente residier i donorantistoffet, karakterisert ved at tilsvarende ekspresjonssystem anvendes.

11. Fremgangsmåte for fremstilling av humanisert OKT 4a antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 10, der det omfatter en lett kjede og en tung kjede, der den ene er blitt CDR-podet i henhold til prinsippene angitt i et hvilket som helst av kravene 1 til 10,karakterisert ved at tilsvarende ekspresjonssystem anvendes.

12. Fremgangsmåte for fremstilling av humanisert OKT 4a antistoff ifølge krav 11, der den CDR-podete kjeden er den tunge kjeden og alle tre CDR i den tunge kjeden er blitt endret, karakterisert ved at tilsvarende ekspresjonssystem anvendes.

13. Fremgangsmåte for fremstilling av humanisert OKT 4a antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 11, der det omfatter en lett kjede og en tung kjede, der begge er blitt CDR-podet i henhold til prinsippene angitt i et hvilket som helst av kravene 1 til 10, karakterisert ved at tilsvarende ekspresjonssystem anvendes.

14. Fremgangsmåte for fremstilling av humanisert OKT 4a antistoff ifølge krav 13, der alle tre CDR i den tunge kjeden er blitt endret og bare én eller to av CDR i den lette kjeden er blitt endret, karakterisert ved at tilsvarende ekspresjonssystem anvendes.

15 . Fremgangsmåte for fremstilling av humanisert OKT 4a antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 14, der det har en affinitet for CD4-antigenet som er lik det til 0KT4Å, karakterisert ved at tilsvarende ekspresjonssystem anvendes.

16. Fremgangsmåte for fremstilling av humanisert OKT 4a antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 15, der det blir fremstilt ved anvendelse av rekombinant DNA-teknologi, karakterisert ved. at tilsvarende ekspresjonssystem anvendes.