JPH0815436B2 - Ｌ−トリプトフアン類の製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は酵素機能を用いて光学活性体のＬ−トリプト
ファン又はＬ−５−オキシトリプトファンを製造する方
法に関する。

（従来の技術と課題） Ｌ−トリプトファンは、必須アミノ酸の１種で、特に
栄養上生理上重要なアミノ酸である。現在Ｌ−トリプト
ファンは大量製造が困難なことから、用途は主に医薬用
に限定されている。しかしながら、安価な製造技術が確
立しうれば食品、飼料添加剤、高分子素材等の新規な、
規模の大きい市場が創成されることが期待されている。

Ｌ−５−オキシトリプトファンは、主に生理的作用が
注目されているアミノ酸であるが、現在有効な製法が充
分に確立されてなく、安価に製造可能な工業的製法の開
発が望まれている。

従来これら両アミノ酸の製法は、インドール若しく
は、５−オキシインドールに、アンモニムイオン及びピ
ルビン酸又はオキザロ酢酸、又はＬ−リンゴ酸を用いる
方法が知られている（特公昭49−46917号等）。

しかしながら、これらの原料の中で特にピルビン酸、
オキザロ酢酸又はＬ−リンゴ酸は、大変高価であり、本
発明の目的である工業的製造法には適さない。ここにお
いて、本発明者等は鋭意研究の結果、フマル酸とアンモ
ニウムイオン及びインドールからＬ−トリプトファン
を、又フマル酸とアンモニウムイオンと５−オキシイン
ドールからＬ−５−オキシトリプトファンを製造するこ
とが可能であることを見出し、本発明を完成した。

（発明の構成と効果） 本発明の要旨は、下記の（１）の方法である。

（１）A:フマル酸からＬ−リンゴ酸を生成し得る酵素を
含有するブレビバクテリウム属に属する微生物の菌体。

B:L−リンゴ酸からオキザロ酢酸を生成し得る酵素を含
有するエシエリヒア属、プロテウス属、もしくはエルビ
ニア属に属する微生物の菌体。

C:トリプトファナーゼを含有するエシエリヒア属、プロ
テウス属若しくはエルビニア属に属する微生物の菌体。

上記のＡ、Ｂ、及びＣからなる菌体の存在の下にフマ
ル酸、アンモニウムイオン及び一般式 （但し、Ｒは水素原子又は水酸基を示す。） で表わされるインドール類から対応するＬ−トリプトフ
ァン類を生成すること特徴とするＬ−トリプトファン類
の製造法。

本発明の基本は、フマル酸を原料の１つとし用いるこ
とにあり、該反応系に用いる酵素系の供給源としては、
同一の微生物菌体内に存在する酵素を利用する方法に限
定されず、複数の種類の微生物菌体又はその処理物を利
用する方法も当然対象となる。

同一種の微生物菌体を利用してインドールとフマル酸
又はその塩及びアンモニウムイオンからＬ−トリプトフ
ァンを又インドールの代わりに５−オキシインドールを
用いて同様にＬ−５−オキシトリプトファンを製造する
場合には、複数種類の微生物供役反応に比較して菌体調
製が、単一培養で済む為に培養コストは低い反面、反応
に関与する各酵素活性には制約がある。

一方、複数種類の微生物菌体を利用する場合には、各
微生物毎に菌体を調製する必要がある反面、各反応ステ
ップに於いて最大速度をもって反応せしめることが出
来、結果的にＬ−トリプトファン又はＬ−５−オキシト
リプトファンの高い生産速度がえられる。

上記いずれの場合にも、本方法はインドール又は５−
オキシインドールとフマル酸又はその塩及びアンモニウ
ムイオンからＬ−トリプトファン又はＬ−５−オキシト
リプトファンを製造する新規なプロセスを提供するもの
である。

本プロセスは、フマル酸からＬ−リンゴ酸を生成しう
る反応イとＬ−リンゴ酸からオキザロ酢酸を生成しうる
反応ロとオキザロ酢酸からピルビン酸を生成しうる反応
ハとトリプトファナーゼ反応ニとからなり、そのうち反
応ハは非酵素的な脱炭酸反応であり、水溶液中で容易に
ピルビン酸に変換される。

上記の各反応に使用される菌株は特に制限されるもの
ではないが、例えば、反応イロニに用いられる菌株とし
ては、エシエリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ−1
2系菌株ATCC 27325,エシエリヒア・コリ（Escherichia
coli）Ｋ−12系菌株（FERM BP−1733およびFERM BP
−1734），プロテウス・モルガニー（Proteus morgani
i）IFO−3848,エルビニア・ヘルビコラ（Erwinia herbi
cola）ATCC−21433などがある。

前記反応イ及び反応ロに用いられる菌株としては、ブ
レビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavu
m）MJ−233（FERM BP−1497），ブレビバクテリウム・
フラバム（Brevibacterium flavum）MJ−233−AB−41
（FERM BP−1498）などが挙げられる。

本発明においては、前記反応イ及び反応ロに用いられ
る菌株は、上記ブレビバクテリウム属に属する微生物の
菌体又はその処理物が好ましく用いられ、特にブレビバ
クテリウム・フラバムMJ−233（FERM BP−1497）、ブ
レビバクテリウム・フラバムMJ−233−AB−41（FERM B
P−1498）等の菌体を用いるのが好ましい。

上記ブレビバクテリウム属に属する微生物を用いる
と、特に酵素活性の低下もなく、反応に使用した微生物
菌体の再使用が可能である。

上記いずれの反応も通常の酵素反応と同様に例えば0.
1Mリン酸緩衝液あるいは水等でpHを６〜９に調整した水
溶液中で、約20〜約50℃、好ましくは約30〜約40℃の温
度で通常約１〜約72時間行われる。インドール又は５−
オキシインドールの反応時の使用量には特に制限はない
が、一般には0.1〜20％（wt/vol）の濃度範囲で使用す
るのが適当である。また、フマル酸又はその塩とアンモ
ニウムイオン濃度は特に制限されるものではないが、一
般には0.1〜20％（wt/vol）が適当に用いられる。該反
応に使用される菌体又はその処理物の使用量は、一般に
0.1〜10％（wt/vol）の濃度で使用することが出来る。

なお、上記菌株の培養は、通常用いられる合成培地或
いは天然培地を用いて行うことが出来る。しかして炭素
源としては、エシエリヒア属、プロテウス属及びエルビ
ニア属の場合には、グルコース、グリセロール、フラク
トース、シュクロース、糖蜜等の炭水化物が使用でき
る。一方ブレビバクテリウム属の場合には、上記の炭水
化物の他にエタノールを炭素源として用いることが出来
る。また、窒素源としての、トリプトン、酵母エキス、
コーン・スチープリカー、カゼインの加水分解物等の天
然有機窒素源の多くは窒素源と共に炭素源にもなり得
る。培養は、振盪培養或いは通気撹拌槽培養などの好気
的条件下に行うことが出来る。培養温度は一般に20〜50
℃であり、培地中の培地のpHは中性または微アルカリ性
付近に維持することが望ましい。培養期間は、通常約５
時間〜約３日である。

上記のような培養方法によって得られた菌体を用い
て、インドール又は５−オキシインドールとフマル酸又
はその塩とアンモニウムイオンから、インドールを用い
た場合はＬ−トリプトファン、５−オキシインドールを
用いた場合はＬ−５−オキシトリプトファンを生成せし
めることが出来る。

反応液中に生成したＬ−トリプトファン等の分離・精
製は、イオン交換樹脂、活性炭等による吸着、脱着処理
等の公知の方法により行うことが出来る。

以下、実施例にて本発明を具体的に説明する。

参考例−1:ブレビバクテリウム・フラバム菌体の調製 第１表に示した組成の培地100ml2組を500ml容の三角
フラスコ２本に別々に分注し、120℃で15分間加熱滅菌
したもの各々にエタノールを２容量％無菌的に添加し、
これらにブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacteri
um flavum）MJ−233（FERM BP−1497）又はブレビバ
クテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）MJ−
233−AB−41（FERM BP−1498）を一白金耳ずつ植菌
し、30℃にて24時間培養した。

これら二組の培養液20mlを２容ジャーファーメンタ
ー中の第２表に示した組成の培地１にそれぞれ別に接
種し、33℃、pH7.6、通気量1vvmの条件にて撹拌し、エ
タノール濃度が1.0〜1.5容量％に保たれるようにエタノ
ールを断続的に添加した。30時間の培養後、培養液を遠
心分離（6,000rpm,15分）して得た菌体それぞれを供試
菌体とした。

第 １ 表 尿素 4.0g 硫酸アンモニウム 14.0g KH₂PO₄ 0.5g K₂HPO₄ 0.5g MgSO₄・7H₂O 0.5g FeSO₄・7H₂O 6.0mg MnSO₄・４〜6H₂O 6.0mg 酵母エキス 1.0g カザミノ酸 1.0g ビオチン 200μｇ チアミン塩酸塩 100μｇ 蒸留水 1000ml 第 ２ 表 硫酸アンモニウム 23.0g KH₂PO₄ 0.5g K₂HPO₄ 0.5g MgSO₄・7H₂O 0.5g FeSO₄・7H₂O 20 mg MnSO₄・４〜6H₂O 20 mg 酵母エキス ３ ｇ カザミノ酸 ３ ｇ ビオチン 200μｇ チアミン塩酸塩 100μｇ 蒸留水 1000ml 参考例−2:エシエリヒア・コリ菌体の調製 第３表に示した組成の培地50mlを500ml容三角フラス
コに分注し、120℃で15分間滅菌処理したものにエシエ
リヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ−12系菌株（ATC
C 27325及びFERM BP−1733及びFERM BP−1734）を植
菌し、37℃にて１日振盪培養したものを、同様に滅菌調
製したＬ−トリプトファンを200μg/mlの濃度で含有す
るＬ培地1000mlに20ml接種し、同じく37℃にて８時間振
盪培養した。培養終了液を遠心分離（6000rpm,15分間,4
℃）して得た菌体を供試菌体とした。

第 ３ 表 Ｌ培地 トリプトン 10g 酵母エキス 5g NaCl 5g グルコース 1g 蒸留水 １ （pH 7.2） 参考例−3:プロテウス・モルガニー菌体の調製 第４表に示した組成の培地50mlを500ml容三角フラス
コに分注し、120℃で15分間滅菌処理したものにプロテ
ウス・モルガニー（Proteus morganii）IFO−3848を植
菌し、37℃にて24時間振盪培養したものを、同様に滅菌
したＬ−トリプトファンを200μg/mlの濃度で含有する
第４表の培地1000mlに20ml接種し、同じく37℃にて８時
間振盪培養した。培養終了液を遠心分離（6000rpm,15分
間,4℃）して得た菌体を供試菌体とした。

第 ４ 表 KH₂PO₄ 0.5g/ K₂HPO₄ 0.5g/ MgSO₄・7H₂O 0.5g/ FeSO₄・7H₂O 6ppm MnSO₄・nH₂O 6ppm 酵母エキス 10g/ カザミノ酸 5g/ （pH 7.5） 参考例−4:エルビニア・ヘルビコラ菌体の調製 菌株としてエルビニア・ヘルビコラ（Erwinia herbic
ola）ATCC−21433を用いた以外は参考例−３と同様の培
地及び操作にて37℃で８時間振盪培養を行った。培養終
了液を遠心分離（6000rpm,15分間,4℃）して得た菌体を
供試菌体とした。

実施例−１ 第５表に示した組成の反応液50mlを500ml容三角フラ
スコに分注したのち、該反応液に参考例−１で調製した
ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flav
um）MJ−233（FERM BP−1497）の培養液40mlから遠心
分離（6000rpm,15分間,4℃）により得た菌体と、参考例
−２で調製したエシエリヒア・コリ（Escherichia col
i）Ｋ−12系菌株ATCC 27325の培養液40mlから遠心分離
（6000rpm,15分間,4℃）により得た菌体とを添加し、37
℃にて24時間振盪反応を行った。反応終了後、遠心分離
（4000rpm,15分間，室温）にて菌体を除去し、その上清
液中のＬ−トリプトファンを定量したところ800mg/の
生成が認められた。

なお、上記反応液にエシエリヒア・コリ（Escherichi
a coli）Ｋ−12系菌株ATCC 27325の培養液40mlから回
収した菌体のみを添加して、37℃にて24時間振盪反応を
行った場合には、Ｌ−トリプトファンの生成量は450mg/
であった。

第 ５ 表 インドール 20mM フマル酸ナトリウム 50mM 塩化アンモニウム 300mM ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD） 20mM リン酸緩衝液（pH8.0） 100mM 実施例−２ 実施例−１と同様の反応液50mlに参考例−１で調製し
たブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium fl
avum）MJ−233 AB−41（FERM BP−1498）の培養液40m
lから得た菌体と、参考例−２で調製したエシエリヒア
・コリ（Escherichia coli）Ｋ−12系菌株（FERM BP
−1733）の培養液40mlからの菌体とを添加し、37℃にて
15時間振盪反応を行い、反応終了後の上清液中のＬ−ト
リプトファンを定量したところ3200mg/であった。

反応上清液40mlをアンモニア型強酸性イオン交換樹脂
（ダイヤイオンSK−IB、三菱化成製）のカラムを通して
Ｌ−トリプトファンを吸着させたのち、アルカリ溶液で
溶出後、濃縮しＬ−トリプトファンの粗結晶を析出させ
た。これをアセトンで洗浄し乾燥してＬ−トリプトファ
ンの結晶を95mgをえた。

なお、実施例−１と同様にエシエリヒア・コリ（Esch
erichia coli）Ｋ−12系菌株（FERM BP−1733）の培
養液40mlから得た菌体のみを反応に供した場合には、Ｌ
−トリプトファンの生成量は460mg/であった。

実施例−３ 実施例−１と同様の反応液50mlに参考例−１で調製し
たブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium fl
avum）MJ−233−AB−41（FERM BP−1498）の培養液40m
lから得た菌体と、参考例−２で調製したエシエリヒア
・コリ（Escherichia coli）Ｋ−12系菌株（FERM BP
−1734）の培養液40mlから得た菌体とを添加し、37℃に
て15時間振盪反応を行い、反応終了後の上清液中のＬ−
トリプトファンを定量したところ3100mg/であった。

反応上清液40mlをアンモニア型強酸性イオン交換樹脂
（ダイヤイオンSK−IB、三菱化成製）のカラムを通して
Ｌ−トリプトファンを吸着させたのち、アルカリ溶液で
溶出後、濃縮しＬ−トリプトファンの粗結晶を析出させ
た。これをアセトンで洗浄し乾燥してＬ−トリプトファ
ンの結晶を87mgを得た。

なお、実施例−１と同様にエシエリヒア・コリ（Esch
erichia coli）Ｋ−12系菌株（FERM BP−1734の培養
液40mlから得た菌体のみを反応に供した場合にはＬ−ト
リプトファンの生成量は430mg/であった。

実施例−４ 実施例−１と同様の反応液50mlに参考例−１で調製し
たブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium fl
avum）MJ−233−AB−41（FERM BP−1498）の培養液40m
lから得た菌体と、参考例−３で調製したプロテウス・
モルガニー（Proteus morganii）IFO−3848の培養液80m
lから得た菌体とを添加し、37℃にて24時間振盪反応を
行い、反応終了後の上清液中のＬ−トリプトファンを定
量したところ1050mg/であった。

実施例−２と同様の操作で反応上清液40mlからＬ−ト
リプトファンを回収したところ32mgの結晶を得た。

なお、実施例−１と同様にプロテウス・モルガニー
（Proteus morganii）IFO−3848の培養液80mlから得た
菌体のみを反応に供した場合にはＬ−トリプトファンの
生成は430mg/であった。

実施例−５ トリプトファナーゼ保有菌株として、プロテウス・モ
ルガニーの代わりに参考例−４で調製したエルビニア・
ヘルビコラ（Erwinia herbicola）ATCC−21433を用いた
以外は実施例−４と同様の操作にて37℃で24時間反応を
行った。反応終了後の上清液中のＬ−トリプトファンを
定量したところ710mg/の生成が認められた。

なお、実施例−１と同様にエルビニア・ヘルビコラ
（Erwinia herbicola）ATCC−21433の培養液80mlから得
た菌体のみを反応に供した場合にはＬ−トリプトファン
の生成量は320mg/であった。

実施例−６ 第６表に示した組成の反応液50mlを500ml容三角フラ
スコに分注したのち、実施例−２と同様の操作にて反応
を行い、反応終了後の上清液中のＬ−５−オキシトリプ
トファンを定量したところ2500mg/であった。

反応上清液40mlをアンモニア型強酸性イオン交換樹脂
（ダイヤイオンSK−IB、三菱化成製）のカラムを通して
Ｌ−５−オキシトリプトファンを吸着させたのち、アル
カリ溶液で溶出後、濃縮しＬ−５−オキシトリプトファ
ンの粗結晶を析出させた。これをアセトンで洗浄し乾燥
してＬ−５−オキシトリプトファンの結晶を72mgを得
た。

なお、実施例−１と同様にエシエリヒア・コリ（Esch
erichia coli）Ｋ−12系菌株（FERM BP−1733）の培
養液40mlから得た菌体のみを反応に供した場合には、Ｌ
−５−オキシトリプトファンの生成量は420mg/であっ
た。

第 ６ 表 ５−オキシインドール 20mM フマル酸ナトリウム 50mM 塩化アンモニウム 300mM ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD） 20mM リン酸緩衝液（pH8.0） 100mM 実施例−７ エシエリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ−12系
菌株（FERM BP−1733）の代わりにエシエリヒア・コリ
（Escherichia coli）Ｋ−12系菌株（FERM BP−173
4）を用いた他は実施例−６と同様の操作にて反応を行
い、反応終了後の上清液中のＬ−５−オキシトリプトフ
ァンを定量したところ2560mg/であった。

反応上清液40mlをアンモニア型強酸性イオン交換樹脂
（ダイヤイオンSK−IB、三菱化成製）のカラムを通して
Ｌ−５−オキシトリプトファンを吸着させたのち、アル
カリ溶液で溶出後、濃縮しＬ−５−オキシトリプトファ
ンの粗結晶を析出させた。これをアセトンで洗浄し乾燥
してＬ−５−オキシトリプトファンの結晶を70mgを得
た。

なお、実施例−１と同様にエシエリヒア・コリ（Esch
erichia coli）Ｋ−12系菌株（FERM BP−1734）の培
養液40mlから得た菌体のみを反応に供した場合には、Ｌ
−５−オキシトリプトファンの生成量は420mg/であっ
た。

実施例−８ 第６表に示した組成の反応液50mlを500ml容三角フラ
スコに分注したのち、実施例−４と同様の操作にて反応
を行い、反応終了後の上清液中のＬ−５−オキシトリプ
トファンを定量したところ850mg/であった。

反応上清液40mlをアンモニア型強酸性イオン交換樹脂
（ダイヤイオンSK−IB、三菱化成製）のカラムを通して
Ｌ−５−オキシトリプトファンを吸着させたのち、アル
カリ溶液で溶出後、濃縮しＬ−５−オキシトリプトファ
ンの粗結晶を析出させた。これをアセトンで洗浄し乾燥
してＬ−５−オキシトリプトファンの結晶を27mgを得
た。

なお、実施例−１と同様にプロテウス・モルガニー
（Proteus morganii）IFO−3848の培養液80mlから得た
菌体のみを反応に供した場合には、Ｌ−５−オキシトリ
プトファンの生成量は400mg/であった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｐ 13/22 Ｃ１２Ｒ 1:18） (Ｃ１２Ｐ 13/22 Ｃ１２Ｒ 1:185）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】A:フマル酸からＬ−リンゴ酸を生成し得る
   酵素を含有するブレビバクテリウム属に属する微生物の
   菌体。 B:L−リンゴ酸からオキザロ酢酸を生成し得る酵素を含
   有するエシエリヒア属、プロテウス属、もしくはエルビ
   ニア属に属する微生物の菌体。 C:トリプトファナーゼを含有するエシエリヒア属、プロ
   テウス属若しくはエルビニア属に属する微生物の菌体。 上記のＡ、Ｂ、及びＣからなる菌体の存在の下にフマル
   酸、アンモニウムイオン及び一般式 （但し、Ｒは水素原子又は水酸基を示す。） で表わされるインドール類から対応するＬ−トリプトフ
   ァン類を生成すること特徴とするＬ−トリプトファン類
   の製造法。