PL228763B1 - Sposób wytwarzania7α-hydroksyandrost-4-en-3,17-dionu - Google Patents

Description

(12)OPIS PATENTOWY ₍i₉₎PL ₍n)228763 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 417204 (22) Data zgłoszenia: 13.05.2016 (51) Int.CI.

C12P 33/06 (2006.01) C07J 1/00 (2006.01) C12R 1/645 (2006.01)

Sposób wytwarzania 7a-hydroksyandrost-4-en-3,17-dionu (73) Uprawniony z patentu:

UNIWERSYTET PRZYRODNICZY WE WROCŁAWIU, Wrocław, PL (43) Zgłoszenie ogłoszono:

10.04.2017 BUP 08/17 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono:

30.05.2018 WUP 05/18 (72) Twórca(y) wynalazku:

EWA KOZŁOWSKA, Wrocław, PL MONIKA DYMARSKA, Wrocław, PL EDYTA KOSTRZEWA-SUSŁOW, Wrocław, PL JAKUB GRZESZCZUK, Opole, PL ELŻBIETA PLĄSKOWSKA, Wrocław, PL TOMASZ JANECZKO, Wrocław, PL (74) Pełnomocnik:

rzecz, pat. Anna Olszewska co co rco

CM

CM

Q_

PL 228 763 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania 7a-hydroksyandrost-4-en-3,17-dionu.

Metoda, według wynalazku może znaleźć zastosowanie w przemyśle farmaceutycznym do wytwarzania leków o właściwościach diuretycznych (Lehman L.R., Stewart J.D., Filamentous fungi: Potentially useful catalysts for the biohydroxylations of non-activated carbon centers Curr. Org. Chem. 2001,5, 439; Wong L.L., Cytochrome P450 monooxygenases. Curr. Opin. Chem. Biol. 1998, 2, 263).

Mikroorganizmy mają szerokie zastosowanie w biotransformacji sterydów ze względu na ich zdolność do regio- i stereoselektywnej hydroksylacji tych związków (Bhatti H.N., Khera R.A., Biological transformation of steroidal compounds. Steroids 77 (2012) 1267-1290; Donova M.V., Egorova O.V., Microbial steroid transformation: current stateand prospect. Appl. Biochem. Microbiol. 94 (2012) 1423-1447).

Mikrobiologiczne konwersje steroidów są przyjaznymi dla środowiska procesami i mogą być alternatywą dla syntezy chemicznej w uzyskaniu nowych połączeń o pożądanej aktywności biologicznej (Mahato S.B., Garai S., Advance in microbial steroid biotransformation. Steroids 62 (1997) 332-345; Donova M.V., Transformation of steroids by actinobacteria: a review, Appl. Biochem. Microbiol. 43 (2007) 5-18).

Z opisu zgłoszenia wynalazku P.416996 znany jest szczep Isaria fumosorosea KCh J2.

Znana jest mikrobiologiczna metoda otrzymywania 7a-hydroksyandrost-4-en-3,17-dionu z androst-4-en-3,17-dionu (AD): - z wydajnością 9,2% w wyniku zastosowania szczepu Penicillium griseopurpureum (Huang L-H, Li J, Xu G, Zhang X-H, Wang Y-G, Yin Y-L, Liu H-M, Biotransformation of dehydroepiandrosterone (DHEA) with Penicillium griseopurpureum Smith and Penicillium glabrum (Wehmer) Westling. Steroids 75 (2010) 1039-1046); - z wydajnością 15,3% w wyniku zastosowania szczepu Neurospora crassa (Faramarzi MA, Aghelnejad M, Tabatabaei Yazdi M, Amini M, Hajarolasvadi N. Metabolism of androst-4-en-3,17-dione by the filamentous fungus Neurospora crassa. Steroids 73 (2008) 13-18); - z wydajnością 21% w wyniku zastosowania szczepu Mucor racemosus (Faramarzi M.A. Badiee M. Tabatabaei Yazdi M. Amini M. Torshabi M. Formation of hydroxysteroid derivatives from androst-4-en-3,17-dione by the filamentous fungus Mucor racemosus. J Mol Cat BEnzym. 50 (2008) 7-12); - z wydajnością poniżej 50% w wyniku zastosowania szczepu Chaetomium sp. KCH 6651 (Janeczko T. Dmochowska-Gładysz J. Kostrzewa-Susłow E. Białońska A. Ciunik Z. (2009) Biotransformations of steroid compounds by Chaetomium sp. KCH 6651. Steroids, 74, 657-661); - z wydajnością poniżej 39% w wyniku zastosowania szczepu Didymosphearia igniaria KCH 6670 (Janeczko T., Świzdor A., Dmochowska-Gładysz J., Białońska A., Ciunik Z. KostrzewaSusłow E.: (2012) Novel metabolites of dehydroepiandrosterone and progesterone obtained in Didymosphearia igniaria KCH 6670 culture. J. Mol. Cat. B-Enzym. 82, 24-31); - w wyniku zastosowania szczepu Paecilomyces victoriae (Shen, G.J., Zhou, B., Lai, T.C., Su, H.L., Yang, H.Y. Study on biotransformation products of androstenedione by PaecHomyces victoriae. Adv. Mater. Res 807-809, 414-417); - z wydajnością poniżej 38% w wyniku zastosowania szczepu Absidia glauca (Huszcza E. Dmochowska-Gładysz J. (2003) Transformations of testosterone and related steroids in Absidia glauca culture. J. Basic Microbiol. 43, 113-120).

Istota wynalazku polega na tym, że do podłoża odpowiedniego dla grzybów strzępkowych wprowadza się szczep Isaria fumosorosea KCh J2. Po upływie co najmniej 48 godzin do hodowli wprowadza się substrat, którym jest androst-4-en-3,17-dion o wzorze 1, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą. Transformację prowadzi się w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciągłym wstrząsaniu, co najmniej 24 godziny. Kolejno produkt ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą i oczyszcza chromatograficznie.

W wyniku regioselektywnego wprowadzenia grupy hydroksylowej w cząsteczce substratu, którym jest androst-4-en-3,17-dion (androstendion), otrzymuje się 7a-hydroksyandrost-4-en-3,17-dion, a reakcję prowadzi się w wodnej kulturze szczepu Isaria fumosorosea KCh J2.

Korzystnie jest, gdy stosunek masy dodawanego substratu do objętości hodowli wynosi 0,1 mg : 1 mL.

Korzystnie także jest, gdy proces prowadzi się w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Dodatkowo, korzystnie jest, gdy transformację prowadzi się przez 24 godziny.

Postępując zgodnie z wynalazkiem, w wyniku działania układu enzymatycznego zawartego w komórkach szczepu Isaria fumosorosea KCh J2, następuje steroselektywna hydroksylacja przy nieaktywowanym atomie węgla C-7. Uzyskany w ten sposób produkt wydziela się z wodnej kultury mikroorganizmu, znanym sposobem, przez ekstrakcję rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą (chloroform).

PL 228 763 B1

Zasadniczą zaletą wynalazku jest otrzymanie 7a-hydroksyandrost-4-en-3,17-dionu z wydajnością izolowaną na poziomie 42% (konwersja substratu według GC >99%), w temperaturze pokojowej i przy pH naturalnym dla szczepu.

Wynalazek jest bliżej objaśniony na przykładzie wykonania.

P r z y k ł a d. Do kolby Erlenmajera o pojemności 2000 cm³, w której znajduje się 500 cm³ sterylnej pożywki zawierającej 10 g aminobaku i 30 g glukozy, wprowadza się szczep Isaria fumosorosea KCh J2. Po 72 godzinach jego wzrostu dodaje się 100 mg androst-4-en-3,17-dionu o wzorze 1, rozpuszczonego w 1 cm³ acetonu. Transformację prowadzi się w 25 stopniach Celsjusza przy ciągłym wstrząsaniu przez 24 godziny. Następnie mieszaninę poreakcyjną ekstrahuje się trzykrotnie chloroformem, osusza bezwodnym siarczanem magnezu i odparowuje rozpuszczalnik. Otrzymany ekstrakt oczyszcza się chromatograficznie, używając jako eluentu mieszaniny heksanu i acetonu w stosunku objętościowym 2 : 1.

Na tej drodze otrzymuje się 42 mg 7a-hydroksyandrost-4-en-3,17-dionu (wydajność 42%, stopień konwersji substratu >99%).

Uzyskany produkt charakteryzuje się następującymi danymi spektralnymi:

¹H NMR (600 MHz) (ppm) (CDCIs) δ: 0.89 (s, 3H, 18-H); 1.20 (s, 3H, 19-H); 1.26 (td, 1H, J = 13.1, 3.6 Hz, 12-Ha); 1.45 (td, 1H, J = 13.0, 3.5 Hz, 11-Hp); 1.50-1.60 (m, 2H, 9-H, 15-Hp); 1.68-1.79 (m, 4H, 1-Ha, 8-H, 11-Ha, 14-H); 1.82 (dm, 1H, J = 13.0 Hz, 12-Hp); 2.01-2.13 (m, 3H, 1-Hb, 15-Ha, 16-Ha); 2.35 (dm, 1H, J = 16.6 Hz, 2-Ha); 2.37-2.49 (m, 3H, 2-Hp, 6-Ha, 16-Hp); 2.65 (d, 1H, J = 14.9 Hz, 6-H3); 4.09 (s, 1H, 7-Hp); 5.78 (s, 1H, 4-H).

¹³C NMR (151 MHz) (ppm) (CDCI3) δ: 13.49 (C-18), 17.01 (C-19), 20.15 (C-11), 21.25 (C-15), 30.98 (C-12), 33.89 (C-2), 35.40 (C-1), 35.71 (C-16), 38.55 (C-10), 39.37 (C-8), 41.01 (C-6), 45.31 (C-9), 45.64 (C-14), 47.31 (C-13), 67.01 (C-7), 127.03 (C-4), 167.25 (C-5), 198.83 (C-3), 220.41 (C-17).

Claims (4)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania 7a-hydroksyandrost-4-en-3,17-dionu, znamienny tym, że do podłoża odpowiedniego dla grzybów strzępkowych wprowadza się szczep Isaria fumosorosea KCh J2, następnie po upływie co najmniej 48 godzin do hodowli wprowadza się substrat, którym jest androst-4-en-3,17-dion o wzorze 1, rozpuszczony w rozpuszczalniku organicznym mieszającym się z wodą, transformację prowadzi się w temperaturze od 20 do 30 stopni Celsjusza, przy ciągłym wstrząsaniu, co najmniej 12 godzin, po czym produkt ekstrahuje się rozpuszczalnikiem organicznym niemieszającym się z wodą i oczyszcza chromatograficznie.
2. 2. Sposób według zastrz. 1., znamienny tym, że stosunek masy dodawanego substratu do objętości hodowli wynosi 0,1 mg : 1 mL.
3. 3. Sposób według zastrz. 1., znamienny tym, że proces prowadzi się w temperaturze 25 stopni Celsjusza.
4. 4. Sposób według zastrzeżenia 1., znamienny tym, że transformację prowadzi się przez 24 godziny.