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Procédé pour la récupération des enzymes protéolytiques des pancréas de mammifères.
La présente invention se rapporte à un procédé de récupération des enzymes protéolytiques de pancréas, appelés simplement enzymes dans la description ci-desscus, provenant de mammifères, particulièrement des bêtes à cornes et des porcs, en connexion avec la préparation de l'insuline à partir de ces glandes. la récupé'ation de l'insuline.:des pancréas des mammifères, particulièrement des bêtes à cornes et des porcs, est effectuée par le traitement des glandes hachées par des agents extractifs appropriés propres à dissoudre l'insuline et dans des circons- tances telles que les enzymes sont empêchées de rendre l'insu- line inactive.
L'eau, l'alcool éthylique et l'alcool méthylique, appelés plus simplement alcools ci-dessous, l'acétone ou les @
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mélanges de ces substances avec ou sans addition d'acides, d'alcalis ou de sels, sont signalas dans la littérature comme étant des agents extractifs appropriés.
Toutefois, dans la plu- part des procédés on ajoute d'habitude de l'alcool ou de l'acétone à un certain moment soit immédiatement, c'est-à-dire aux glandes hachées elles-mêmes ou ultérieurement, par exem- ple à un extrait aoueux de celles-ci et ensuite on peut préparer l'insuline à l'état pur sans égard particulier pour les enzymes et sans donner lieu à une inactivption sensible de l' insuline.
On ne trouve pas d'enzymes actives dans les glandes retirées des animaux immédiatement après leur abatage. Les enzymes s'y trouvent à un état complètement inactif, mais elles sont rapidement transformées en un état actif moins que les glandes ne soient immédiatement frigorifiées à une températu- re inférieure à 0 C. Comme les enzymes actives exercent une action inactivante sur l'insuline, même à une basse températu- re, les glandes toujours fraîches ou bien-conservées, c'est- à-dire les glandes immédiatement frigorifiées, dans lesquelles les enzymes sont par conséquent complètement ou presoue com- plètement inactives sont employées dans la préparation de l'insuline pour en obtenir les meilleurs rendements possibles.
Que l'insuline pure puisse être produite par les procédés d'extraction mentionnés ci-dessus sans donner lieu à aucune inactivation perceptible de l'insuline, on l'attribue à l'emploi d'alcool ou d'acétone qui, d'après certains expé- rimentateurs, retarde l'action des enzymes tandis que d'au- tres expérimentateurs estiment pu'ils détruisent les enzymes.
En conséquence, les substances séparées pendant la préparation de l'insuline ont été considérées comme impropres à la récu- pération des enzymes des glandes de pancréas et, d'une façon générale, ces substances ont été considérées cornue une matière résiduaire qui ne peut être employée que comme nourriture pour le bétail.
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Il en résulte que pour la production de préparations d'enzymes du pancréas, qui ont trouvé récemment différentes applications techniques et pharmaceutiques il était nécessaire jusqu'ici d'employer les glandes directement soit en extrayant les enzymes par un traitement au moyen d'agents extractifs appropriés, de préférence des liquides aqueux, soit en procé- dant à une simple dessiccation des glandes, en enlevant leur graisse, si on le désire, et en les pulvérisant, étant entendu qu'on emploie les glandes où toutes les enzymes sont activées par un emmagasinage de plus ou moins longue durée suivant la température et à un degré quelconque jusqu'à ce aue toutes les enzymes inactives aient été transformées en enzymes actives.
La présente invention est basée sur la nouvelle ob- servation que les enzymes ne sont pas détruites pendant le traitement par l'alcool ou l'acétone visant à récupérer l'insu- line, mais qu'il se forme alors une précipitation des enzymes, en fonction de la concentration de l'alcool ou de l'acétone employé. Toutefois, la précipitation dépend aussi de la pro- portion de liquide et de substance pendant l'extraction (le rapport d'extraction) mais si l'on n'adopte pas des proportions tout à fait extraies, la précipitation se produit pour une quantité de 20 à 60% d'alcool ou d'acétone, 20% correspondant à un faible degré d'extraction et 60% à un degré élevé d'ex- traction.
Ainsi, on trouve en réalité les enzymes dans le résidu de la récupération de l'insuline lorsqu'on emploie 20 à 60% d'alcool ou d'acétone pour la récupération. Parmi les nombreu- ses substances séparées pendant la purification de l'insuline on n'a pas trouvé d'enzymes. Ainsi, les bons résultats de la récupération de l'insuline sont évidemment dus au fait qu'on emploie à un moment donné un dissolvant qui dans les condi- tions considérées agit en même temps comme un agent pour la précipitation desenzymes. Ces dernières se trouvent par conséquent à un état non dissous ou inactif dans le résidu @
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provenant de la préparation de l'insuline au oyen de glandes fraîches ou bien conservées et ne peuvent donc' pas être ac- tivées avant d'être dissoutes.
Pour obtenir une préparation d'enzyme active au mayen du résidu provenant de la récupération de l'insuline, il suffi- ra par conséquent, suivant l'invention, de dissoudre les enzy- mes précipitées et de les soumettre ensuite à l'activation.
Tenant compte de ces considérations, le procédé suivent l'invention est caractérisa en ce aue le résidu oui se forme pendant la production de l'insuline au moyen de glpndes fraî- ches ou bien conservées hachées, en traitant celles-ci ou leurs extraits, à , un pH approprié, par une Quantité d'alcool ou d'a- cétone suffisante pour produire une concentration d'alcool ou d'acétone de plus de 20 à 60% et en séparant le liouide, est soumis à une extraction de l'enzyme en présence de moins de 20 à 60% d'alcool ou d'acétone.
Suivant la présente invention, on peut conséquement produire l'insuline et les enzymes au moyen des mêmes glandes en extrayant d'abord l'insuline à un pH approprié en présence d'une quantité d'alcool ou d'acétone suffisante pour en ob- tenir une concentration de plus de 20. à 60% ou en ajoutant de l'alcool ou de l'acétone à un extrrit des glandes jusqu'à une concentration de 20 à 60%, en traitant l'insuline provenant de ce liouide et en soumettant ensuite le résidu à une extrac- tion d'enzyme, des soins étant pris pour ('D'il existe moins (le 20 à 60% d'alcool cu d'acétone pendant cette extroction ou, en d'autres ternes, en remplaçant l'agent de précipitation par un agent dissolvant et -en activant ensuite l'enzyme dissoute.
On peut s'exprimer d'une autre manière, en disant oue pendant la préparation de l'insuline, le concentration en alcool ou acétone doit être supérieure à 70 10% tandis au'une concentration en rlcool ou acétone-inférieure à 30¯10% doit être employée pendent l'extraction des enzymes, la valeur
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30 + 10% (c'est-à-dire 40%) étant appliquée pour un degr d'extraction élevé et la valeur 30-10% (c'est-à-dire 20%) pour un faible degré d'extraction.
Pour montrer davantage 1'importance de la concentrption en alcool ou en acétone on signaler? oue, l'lcool éthylique étant employé à titre d'exemple, pour un degr d'extraction de 7 :1 la précipitation des enzymes commence à environ 30% d'al- cool et est pratiquement quantitative à environ 40%. Par con- séquent, dans ce ces, une concentration en alcool éthylique dépassant 40% doit être employée pendant l'extraction de l'insuline, tandis que la concentration en alcool doit être inférieure à 30% pendant l'extraction de l'enzyme.
La production des enzymes qu'on peut obtenir par le procédésuivant l'invention dépend des conditions existant pendant la récupération de l'insuline et pendent la. récupéra- tion des enzymes.
En ce qui concerne les conditions existant pendant la récupération de l'insuline, le rendement en enzymes est indépendant de la concentration en alcool ou en acétone em- ployée lorsque cette concentration est plus de 20 à 60% et in- dépendant de la période'd'extraction employée si seulement cette dernière a été suffisamment longue pour que l'alcool ou l'acétone utilisé soit venu en contact avec les enzymes et les ait précipitées.
Quant aux conditions de la récupération des enzymes, le rendement dépend en premier lieu de la, concentration de l'alcool ou de l'acétone employée. A une concentration de 20 à 60% en alcool on acétone et davantage - suivant le degré d'extraction - les enzymes restent non dissoutes, et en-dessous de cette concentration les enzymes commencent à se dissoudre et le rendement augmente alors fortement lorsque la concentra- tion en alcool ou-: en.acétone diminue. La période d'extraction joue aussi un rôle, en ce sens que des périodes d'extraction @
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réduites donnent lieu à des rendements décroissants.
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Prptiquèrent, il est prr-:ffr[1ble d'employer de l'e?u pour dissoudre les enzywes et on a trouva 0u'lme extraction u -,,ioyen d'eru pendent une période de ,4 heures donne de bons rendements lorsqu'on emploie 7 parties du liquide d'extraction.
Ainsi qu'il ressort de ce qui précède, il est d'impor-
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tance décisive Pu point de vue du rendement en enz1I1 ;es rue les teneurs en alcool ou en acétone du résidu de la fabricption de l'insuline soient 2T11enres à. moins de e '0 à 60'i. Pour obtenir ce résultaton peut traiter un résidu à forte teneur en alcool
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ou acétone par des qU[1ntitbs suffisantes de l'agent dissolvant des enz.-ries, par exemple de l'eau. Il vut mieux enlever d'abord la partie principale des teneurs en alcool ou peptone du rési- du, par exemple, par compression, et effectuer ensuite l'ex- traction des enzynes. On obtient insi des solutions d'enzymes
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plus concentrées et de 'ueilleures conditions pour récupérer l'alcool ou l'::1cétone employé.
Le procédé suivant l'invention vise particulièrement une utilisation du résidu, des glndes provenant de l'extrpc-
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tion de l'insuline ?'lcooli:',ue par voie acide. Lorsqu'on emploie ppr exemple de 1' cide ch1orJdriave, de 'L'acide phosphorieue, de l'acide lseticue ou de l'acide 2etinue pendant cette extrncticnl les enzymes peuvent être extraites du résidu pu ?oyen d'eru lorscu'on a soin qu'il y Pit mains de 20 a 60,' d'r'icool pend,-,nt l'extraction.
D'outre part, lorsqu'on emploie de 1'1lcièe sulfurai- que pour l'extrnct:1on de l'insuline on trouve nue les enzymes existent (l2ns le résidu, à. un ?tet tel ('11'e11e3 ne Deuvent pris être extrpites directement, "'ê"le si In concentration en alcool ou en acétone est nulle penè2nt l'extraction de l'enzyme; 12 période c" extraction est [,lors longue ''et le 1uPntit± de linui- de d'extraction élevée. Toutefois, suivant l'invention, l'extraction est favorable lorsqu'on emploie une solution
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concentrée d'urée, plus de 50% d'acide acétique, 85% d'acide formique, du phénol liquide comme agent d'extraction ou lors- qu'on effectue une extraction prudente au moyen d'un agent alcalin.
Toutefois, on a trouvé, suivant l'invention, qu'on peut aussi opérer une simple extraction aqueuse si on soumet le résidu à un chauffage de courte durée, par exemple à 100 C.
Quant à la valeur pH pendant l'extraction de l'enzyme elle doit être comprise entre 1 et 7 environ, de préférence entre 1 et 4.
Il a été proposé antérieurement, dans le brevet belge n .445.131 de la Demanderesse:, un procédé pour récupérer si- multanément les enzymes et l'insuline des pancréas, où l'insu- line et les enzymes peuvent aussi être récupérées des mêmes glandes. Toutefois, ce procédé est essentiellement différent du procédé suivant l'invention, car il consiste à extraire d'abord les enzymes des glandes fraîches ou bien conservées au moyen d'un agent d'extraction aqueux acide à basse température et/ou à employer de courtes périodes d'extraction et à récupérer en- suite l'insuline en partant du résidu d'extraction suivant les procédés connus.
Les exemples suivants feront comprendre le procédé conforme à l'invention.
EXEMPLE¯1.-¯
1 Kg. de glandes de pancréas fraîches ou bien-conser- vées est haché et soumis à l'extraction pendantIl heures dans 4 litres à 80% d'alcool éthylique auxquels on a ajouté 30 c.c. d'acide chlorhydrioue concentré. On filtre le liquide et on peut le traiter pour obtenir l'insuline de la manière usuelle tendis que le résidu est soumis à l'extraction des enzymes pendant 24 heures dans 7 litres d'eau et ensuite centrifugé, les enzymes étant récupérées du liquide. Une production d'en- viron 10 millions d'unités Fuld-Gross été obtenue ainsi.
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EXEMPLE 2.-
1 Kg. de glandes de pancréas fraîches ou bien conser- vées est haché et soumis à l'extraction pendant 4 heures dans
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6 litres à'ù0/? d'acétone auxquels on 8jOUtr- 3E c.c. décide chlorhydri0ue, concentrp. On filtre le lirviôe et on peut le traiter de la .Tanière usuelle pour obtenir l'insuline. On soumet le résidu à l'extraction des enzymes pendant 24 heures
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dans 7 litres d'eau, puis on en opère la cf-,ntrifugptiori et les enzymes sont récupérées du liquide. On obtient une production d'environ 10 nillions d'unités Fuld-Gross.
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1 Kg. de glandes de pancréas fraîches ou bien-conser-
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EXEMPLE 4. -
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1 Kg. de glnndes de pancréas fre1ches ou bien-ccnser- vries est 1:.;:Jch,ç et soun.is à l'extraction pendrnt 8 heures d2ns 6 litres à 80% d'alcool éthylique auxquels on ajoute 10 c.c. d'acide sulfurique concentré. On opère la centrifugation du li- quide qu'on peut alors traiter pour l'obtention d'insuline de
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1= manière usuelle tandis que le résidu RprÀs pressur'3ge est mélangé à 4 litres d'eau auxquels on a ajoute 20 c. c. d'acide chlorhydricue concentré et est chauffa rapidement à 100 C, puis refroidi de nouveau immédiatement après. On récupère les enzymes du liquide après centrifugation.
On obtient une produc- tion d'environ 9 millions d'unités Fuld-Gross.
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Ces chiffres expriment des productions moyennes. On peut obtenir des productions considérablement plus élevées lorsqu'on emploie des glandes de toute première Qualité.
REVENDICATIONS ---------------------------
1) Procédé pour la récupération des enzymes protéolyti-. eues du pancréas des mammifères, particulièrement des bêtes à cornes et des porcs, caractérisé en ce que le résidu ou'on ob- tient lors de la production de l'insuline au moyen de glandes fralches ou bien-conservées, hachées, en traitant celles-ci ou leurs extraits, à un pH approprié, par une quantité d'alcool éthylique, d'alcool méthyliaue ou d'acétone suffisante pour produire une concentration en alcool ou en acétone de plus de 20 à 60% et en séparant le liquide, est soumis à une extraction des enzymes en présence de moins de 20 à 60% d'alcool ou d'a- cétone.