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PROCEDE DE FABRICATION D'INSULINE SOUS FORME CRISTALLINE.
Dans la fabrication d'insuline sous forme cristalline, le mode opératoire consistait jusqu'ici à faire cristalliser l'insuline à partir d'une solution aqueuse d'insuline contenant une substance tampon et un métal, dont la présence préalable est nécessaire pour la cristallisation de l'insuline, en changeant la valeur du PH de la solution d'insuline.
On emploie d'habitude les tampons de phosphate comme substance tampon. Toutefois, les tampons de citrate ont été également utilisés, leur emploi se traduisant par l'obtention de cristaux plus pure et aussi par une cristallisation plus rapide. Parmi d'autres substances tampons pouvant s'en- ployer on peut mentionner les tampons d'acétate.
Comme métaux dont la présence préalable est indispensable pour la cristallisation de l'insuline, on peut mentionner le zinc, le cobalt, le cadmium et le nickelé Seul le zinc a trouvé un emploi dans la pratique, et si la solution d'insuline ne contient pas par nature suffisamment de. zinc, on ajoute à la solution d'insuline un sel de zinc, par exemple du chlorure de zinc. De plus, on utilise généralement aussi une addition d'un solvant organique promoteur de la cristallisation, et à cet effet on a particulière- ment employé l'acétone.
Dans la plupart des cas on part d'une solution acide d'insu- line,dont on augmenté la valeur de P par l'addition d'alcalis jusqu'à la valeur de pH la plus favorable pour la cristallisation (environ 5,8 - 6,2).
Toutefois dans certains cas on élève la valeur du pH jusqu'à 7 environ, et on l'abaisse ensuite jusqu' environ 6.
Les cristaux d'insuline ainsi obtenus sont le plus fréquem- ment rhomboédriques ou prismatiques, mais peuvent avoir également la forme à pointements doubles.
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Suivant l'invention on a trouvé qu'il est possible d'arriver à de nouvelles formes cristallines d'insuline cristallisée, lorsque la cris- tallisation a lieu en présence de composés aromatiques hydroxylés. L'insu- line cristallise alors dans de nouvelles formes, de préférence en lamelles, aiguilles ou barres, tout ceci en fonction des conditions de cristallisation de la substance tampon utilisée, de la quantité de composé aromatique hydroxy- lé utilisée et des autres substances additionnelles, lorsqu'il y en a. Dans certaines conditions, ces nouvelles formes cristallines ont montré qu'elles possèdent une activité biologique autre que les cristaux d'insuline connus jusqu'ici.
Parmi les composés aromatiques hydroxyles, les bydroxy-benzè- nes conviennent particulièrement pour l'objet de l'invention, et parmi ceux- -ci spécialement le monohydroxybenzène (phénol). Parmi d'autres composés aromatiques utilisables on peut mentionner les naphtols. En outre, il est à noter que les composés aromatiques hydroxylés ne doivent pas être nécessai- rement non substitués pourvu que les substituants pouvant être présents ne contrarient pas la cristallisation de 1-'insuline. Comme exemple de composés hydroxyles substitués, utilisables pour l'objet de l'invention, on peut men- tionner les crésols. Il est évident que l'on peut utiliser également des mélanges de composés aromatiques hydroxyles.
La quantité de composé aromatique hydroxylé à utiliser dans chaque cas dépend entre attres de la substance tampon employée et de ce qu'il fait usage ou non d'acétone ou autres agents promoteurs de cristallisation.
De même, la quantité d'insuline présente dans le mélange de cristallisation joue un rôle, une augmentation de la concentration d'insuline entraînant une teneur plus élevée du composé aromatique hydroxylé.
Suivant l'invention,le composé aromatique hydroxylé s'emploie de préférence en quantité s'élevant au noihs à 2% du poids sec de l'insuline.
En vue d'expliquer ce qui a été dit plus haut et de rendre l'invention plus claire, il y a lieu de se référer aux exemples ci-après.
EXEMPLE 1.
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On dissout 1,0 g d'insuline amorphe dans 35 centimètres cubes d'une solution aqueuse de phénol à 4% par addition d'environ 15 centimètres cubes d'acide chlorhydrique 0,1 N. On ajoute alors 10 centimètres cubes d'une solution contenant par litre 100 grammes d'acide citrique, 56 grammes de sou- de caustique et 4 grammes de zinc (à l'état de chlorure), après quoi on di- lue le mélange avec de l'eau, jusqu'à un volume total de 100 centimètres cu- bes On ajuste la valeur du pH du mélange ainsi obtenu à environ 6,0 au moyen de soude caustique 1 N. Après repos de 1 à 2 jours à la température ordinai- re, l'insuline cristallise en cristaux ayant la forme d'aiguilles ou de bar- res.
EXEMPLE II.
On dissout 200 milligrammes d'insuline amorphe dans 10 centi- mètres cubes d'une solution aqueuse de phénol à 2% en y ajoutant 2,5 centi- mètres cubes d'acide chlorhydrique 0,1 N. On ajoute ensuite 10 centimètres cubes d'une solution de chlorure de zinc contenant 0,01 % de zinc, et-10 centimètres cubes d'une solution contenant 13,6 grammes d'acétate de sodium et 100 grammes de chlorure de sodium par litre, après quoi on dilue le mélan- ge avec de l'eau jusqu'à un volume total de 100 centimètres cubes On ajus-. te la valeur du pH du mélange obtenu à environ 6,0 avec de la soude caustique 1 No Après repos de trois jours à la température ordinaire l'insuline cris- tallise sous forme de barres ou de lamelles.
EXEMPLE III.
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On dissout 200 milligrammes d'insuline amorphe' dams 10 centi- '
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mètres cubes d'une solution de chlorure de zinc contenant 0,01 % de zinc en y ajoutant 2,5 centimètres cubes d'acide chlorhydrique 0,1 No On ajoute a- lors 50 centimètres cubes d'une solution aqueuse de tricrésol à 0,6 % et 10 centimètres cubes d'une solution 0,1 molaire d'acétate de sodium contenant 10% de chlorure de sodium, après quoi on dilue le mélange avec de l'eau jus- qu'à un volume total de 100 centimètres cubes.
La valeur du pH du mélange est réglée aux environs de 6,0 au moyen de soude caustique 1 No Après repos de trois jours environ à la température ordinaire on obtient l'insuline sous forme cristalline à l'état de petites barres à arêtes aiguës.
EXEMPLE IV.
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On dissout 200 milligrammes d'insuline amorphe dans 10 centi- mètres cubes d'une solution contenant par litre 100 milligrammes de zinc (à l'état de chlorure), 600 milligrammes de bêta-naphtol et 300 centimètres cu- bes d'acide chlorhydrique 0,1 No On ajoute ensuite 80 centimètres cubes d'une solution aqueuse de bêta-naphtol contenant 600 milligrammes de bêta- naphtol par litre, et 10 centimètres cubes d'une solution contenant par li- tre 100 grammes de chlorure de sodium et 13,6 grammes d'acétate de sodium.
On ajuste la valeur du pH du mélange obtenu à environ 6,0 au moyen de soude caustique 1 No Après repos de 4 jours à la température ordinaire, l'insuli- ne cristallise sous forme d'aiguilles.
EXEMPLE V.
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On dissout 200 milligrammes d'insuline cristallisée dans 10 centimètres cubes d'une solution de chlorure de zinc contenant 0,08 % de zinc, par addition de 2,5 centimètres cubes d'acide chlorhydrique 0,1 N. On ajoute ensuite 10 centimètres cubes d'une solution aqueuse de phénol à 2% de même que 10 centimètres cubes d'une solution 0,1 molaire de phosphate disodique, après quoi on dilue avec de l'eau le mélange jusqu'à un volume total de 100 centimètres cubes. On ajuste la valeur du pH du mélange vers 6,0 avec de l'acide chlorhydrique 1 No Après repos pendant environ 1 à 2 semaines à la température ordinaire l'insuline cristallise sous forme d'aiguilles.
REVENDICATIONS.
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1. Procédé de fabrication d'insuline sous forme cristalline, dans lequel on fait cristalliser l'insuline à partir d'une solution aqueuse d'insuline contenant un métal, dont la présence préalable est requise pour la cristallisation de l'insuline, et éventuellement une substance tampon, en changeant la valeur du Pu de la solution d'insuline, caractérisé en ce que la cristallisation se fait en présence de un ou plusieurs composés aro- matiques Hydroxylés.