JP2000502324A - 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物 - Google Patents

異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、異種抗体を作ることが出来るトランスジェニック非ヒト動物、及び実質的な親和性をもってヒト抗原に結合するヒト配列抗体を作る方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物 関連出願の相互参照 本願は、米国特許出願 No.08/544,404（1995 年 10 月 10 日出願）の部分継 続出願であり、これは、No.08/352,322（1994 年 12 月７日出願）の部分継続出 願であり、これは、No.08/209,741（1994 年３月９日出願）の部分継続出願であ り、これは、No.08/165,699(1993年 12 月 10 日出願)の部分継続出願であり、 これは、No.08/161,739(1993 年 12 月３日出願)の部分継続出願であり、これは 、 No.08/155,301（1993 年 11 月 18 日出願）の部分継続出願であり、これは、No .08/096,762（1993 年７月 22 日出願）の部分継続出願であり、これは、No.08/ 053,131（1993 年４月 26 日出願）の部分継続出願であり、これは、No.07/990, 860（1992 年 12 月 16 日出願）の部分継続出願であり、これは、No.07/904,06 8（1992 年６月 23日出願）の部分継続出願であり、これは、No.07/853,408(199 2 年３月 18 日出願)の部分継続出願であり、これは、No.07/810,279(1991年 12 月 17 日出願)の部分継続出願であり、これは、No.07/575,962（1990 年８月 3 1 日出願）（現在は放棄された）の部分継続出願であり、これは、No.07/574,74 8（1990 年８月 29 日出願）（現在は放棄された）の部分継続出願である。本出 願は、ＰＣＴ出願 No.PCT/US91／06185（1992 年２月５日に出願した米国特許出 願 No.07/834,539 に対応する）およびＰＣＴ出願 No.PCT/US92／10983 に対し て、米国法、セクション 119 の、タイトル 35 の下に、外国の優先権を主張し ている。 産業上の利用分野 本発明は、異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物、 そのようなトランスジェニック動物を産生するのに使うトランスジーン(transge ne)、Ｖ−Ｄ−Ｊ組換えにおいて異種Ｄ遺伝子を機能的に再配列させることので きるトランスジーン、異種抗体を産生することのできる不死化Ｂ細抱、多数のイ ソタイプの異種抗体を産生せしめる方法およびそのためのトランスジーン、内因 性免疫グロブリン遺伝子座の発現を不活性化または抑制する方法およびそのため のトランスジーン、生殖細胞系列の再配列された可変領域配列に比較すると可変 領域配列が体細胞変異を含んで成る異種抗体を産生せしめる方法およびそのため のトランスジーン、ヒト一次配列を有する抗体を産生し且つヒト抗原に結合する トランスジェニック非ヒト動物、その様なトランスジュニック動物のＢ細胞から 作られたハイブリドーマ、並びに該ハイブリドーマにより発現され６モノクロー ナル抗体に関する。 従来の技術 ヒトにおけるモノクローナル抗体の生体内治療および診断用途の開発に直面す る主な障害の１つは、非ヒト免疫グロブリンの本質的免疫原性である。例えば、 免疫寛容性のヒト患者に治療量の齧歯類モノクローナル抗体を役与すると、患者 は齧歯類免疫グロブリン配列に対して抗体を産生し、それらのヒト抗マウス抗体 （HAMA）は治療抗体を中和し、急性毒性を引き起こし得る。よって、有望な治療 および／または診断上の標的である特異的ヒト抗体と反応性であるヒト免疫グロ ブリンを作製することが望ましい。 モノクローナル抗体を作製するための現在の技術は、動物（通常はラットまた はマウス）を抗原に予備暴露するか、または抗原で感作せしめ、該動物からＢ細 胞を収得し、そしてハイブリドーマクローンのライブラリーを作製することを伴 う。ハイブリドーマ集団を抗原結合特異性（イディオタイプ）についてスクリー ニングし、更に免疫グロブリンクラス（イソタイプ）についてもスクリーニング することにより、所望の抗体を分泌するハイブリドーマクローンを選択すること が可能である。 しかしながら、モノクローナル抗体を作製する現行法を、ヒト抗原に対して結 合特異性を有するヒト抗体を産生せしめる目的に適用すると、ヒトは典型的には 自己抗原に対しては免疫応答を生じないであろうから、ヒト免役グロブリンを産 生するＢリンパ球を得ることは深刻な妨げになる。 よって、ヒト抗原と特異的に反応するヒトモノクローナル抗体を作製する現行 法は明らかに不十分である。ハイブリドーマを作製するためのＢ細胞源として非 ヒト種を使用する場合にも、真の自己抗原に対するモノクローナル抗体を作製す ることに同じ制限が当てはまる。 機能的異種免疫グロブリントランスジーンを含有するトランスジェニック動物 の作製は、自己抗原と反応する抗体を産生させることができる方法である。しか しながら、療法上有用な抗体の発現、またはそのような抗体を産生するハイブリ ド−マクローンを得るためには、トランスジェニック動物がＢリンパ球発生過程 を経て成熟することのできるトランスジェニックＢ細胞を産生しなければならな い。そのような成熟はトランスジェニックＢ細胞上の表面IgＭの存在を必要とす るが、療法利用にはIgＭ以外のイソタイプが所望される。よって、機能的Ｖ−Ｄ −Ｊ再配列を受けて組換え多様性と接合多様性を生じることのできるトランスジ ーンおよびそのようなトランスジーンを有する動物が要求される。更に、そのよ うなトランスジーンとトランスジェニック動物は、好ましくは、Ｂ細胞成熟に必 要とされる第一のイソタイプから優れた療法的効用を有する次なるイソタイプへ のイソタイプ転換を促進するシス作用性配列を含有する。 多数の実験は、Ｉｇ遺伝子再配列に必要な特異的ＤＮＡ配列を決定するための トランスフェクトされた細胞系の使用を報告している〔Lewis およびGellert(l9 89)，Cell，59. 585-588〕。そのような報告は推定上の配列を同定し、そして再 配列に使う組換え酵素へのそれらの配列の近づきやすさ(accesibility)が転写に より変更されると結論づけている〔Yancopoulos およびAlt(1985)，Cell，40，2 71-281 〕。Ｖ（Ｄ）Ｊ結合のための配列は、報告によれば、高度に保存された ほぼ回文式のヘプタマーと、12または23 bp のいずれかのスペーサーにより隔て られたあまり保存されていない高ＡＴナノマーである〔Tonegawa(1983)，Nature ，302，575-581 ,Hesseら(1989)，Genes in Oev.，3，1053-1061〕。効率的組換 えは、伝えられるところによれば、異なる長さのスペーサー領域を有する組換え シグナル配列を含む部位の間でのみ起こる。 Ｉｇ遺伝子再配列は、組織培養細胞において研究されているが、トランスジェ ニックマウスでは詳しく研究されていない。マウス中に導入された再配列試験構 成物を記載している少数の報告が発表されているに過ぎない〔Buchini ら、Natu re ，326: 409-411 (1987)（再配列されていないニワトリλトランスジーン）；G oodhart ら、Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 84:4229-4233(1987)（再配列されて いないウサギκ遺伝子）；および Bruggemann ら、Proc ．Natl．Acad．Sci．U SA 86:6709-6713 (1989)（ハイブリッドマウス−ヒト重鎖）〕。しかしながら 、そのような実験の結果は変動的であり、場合によって、トランスジーンの不完 全なまたは最小の再配列を生じることがある。 更に、分子のＦｃ部分により抗体分子の多様な生物学的機能、例えばＦｃεを 介したマスト細胞または好塩基球との相互作用、およびＦｃμまたはＦｃγによ る補体の結合、が発揮され、イソタイプの変化により特定の特異性を有する機能 的に多様な抗体を生成せしめることが更に望ましい。 異種抗体の１または複数の鎖をコードするトランスジーンを含むトランスジェ ニック動物は作製されているけれども、好結果のイソタイプスイッチを受ける異 種トランスジーンについての報告は全くない。イソタイプをスイッチすることの できないトランスジェニック動物は単一のイソタイプの異種抗体を産生するもの に限定され、より詳しくは、Ｂ細胞成熟に不可欠であるイソタイプ、例えばIgＭ とおそらくIgＤを産生するものに限定され、それらの抗体は療怯的効用が限定さ れ得る。 上記に基づくと、第二の種において産生される第一の種の遺伝子配列によって コードされる異種抗体を効率的に産生せしめる方法に対する要求が存在すること は明らかである。より詳しくは、組換え多様性に貢献するＤセグメントの全部ま たは一部を含む機能的Ｖ−Ｄ−Ｊ遺伝子再配列を受けることができる異種免役グ ロブリントランスジーンおよびトランスジェニック動物に対する要求が当業界に 存在する。更に、（１）機能的なＢ細胞発達が起こり、そして（２）療法上有用 な異種抗体が産生されるようにＶ−Ｄ−Ｊ組換えとイソタイプスイッチングを支 えることができるトランスジーンおよびトランスジェニック動物に対する要求が 当業界に存在する。抗体が設計される特定の種において療法または診断用のモノ クローナル抗体を産生するハイブリドーマを製造することができるＢ細胞源に対 する要求も存在する。機能的Ｖ−Ｄ−Ｊ組換えおよび／またはイソタイプスイッ チングを受けることができる異種免疫グロブリントランスジーンはそれらの要求 を満たすことができる。 上記目的に従って、異種抗体、例えばヒト抗体、を産生することができるトラ ンスジェニック非ヒト動物が提洪される。 更に、異種抗体を発現することができるそのようなトランスジェニック動物か らのＢ細胞であって、特定抗原に特異的なモノクローナル抗体の源を提供するた めに不死化されている前記Ｂ細胞を提供することが本発明の目的である。 この上記目的に従って、そのような異種モノクローナル抗体を産生することが できるハイブリドーマ細胞を提供することが本発明の更なる目的である。 更にまた、上述の非ヒトトランスジェニック動物の製造に有用な再配列されて いないおよび再配列された異種免疫グロブリン重鎖および軽鎖トランスジーンを 提供することが本発明の目的である。 更にまた、トランスジェニック動物中の内因性免疫グロブリン遺伝子座を破壊 する方法を提供することが本発明の目的である。 更にまた、上述のトランスジェニック非ヒト動物において異種抗体産生を誘導 する方法を提供することが本発明の目的である。 本発明の更なる目的は、本発明の１または複数のトランスジーンを作製するた めに使われる免疫グロブリン可変領域遣伝子セグメントレパートリーを作製する 方法を提供することである。 上記の参考文献は、単に本出願の出願日より前のそれらの開示のために提供さ れる。本発明者らが先行発明によってそのような開示より以前は権利がないと認 めることと解釈してはならない。 発明の要約 異種抗体、例えばヒト抗体を産生することのできるトランスジェニック非ヒト 動物が提供される。そのような異種抗体は、IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgM，IgA 1，IgA2，IgAscc，IgD またはIgE を含む様々なイソタイプのものであることが できる。そのようなトランスジェニッグ非ヒト動物が免疫応答を行うには、Ｂ細 胞の発達と抗原刺激成熟を果たすためにトランスジェニックＢ細胞および前Ｂ細 胞が表面結合型免疫グロブリン、特にIgＭ（ことによるとIgＤ）イソタイプのも のを産生することが必要である。そのようなIgＭ（またはIgＤ）表面結合型免疫 グロブリンの発現はＢ細胞発達の抗原刺激成熟期の間にのみ要求され、一時期に は一回スイッチしたイソタイプだけが産生されるが、成熟Ｂ細胞は他のイソタイ プを産生し得る。 典型的には、Ｂ細胞系統の細胞は一時期に単一のイソタイプだけを産生するだ ろうが、μS（分泌型μ）およびμM（膜結合型μ）型、並びにμおよびδ免疫グ ロブリン鎖で天然に起こるような、シスまたはトランス二者択一ＲＮＡスプライ シングは、単一細胞による複数のイソタイプの同時代発現をもたらし得る。従っ て、複数のイソタイプの異種抗体、特に療法上有用なIgＧ，IgＡおよびIgＭイソ タイプの異種抗体を産生せしめるためには、イソタイプスイッチングが起こるこ とが必要である。そのようなイソタイプスイッチングは古典的クラススイッチで あってもよく、または１もしくは複数の非古典的イソタイプスイッチ機構から生 じてもよい。 本発明は、異種免疫グロブリントランスジーンおよびそのようなトランスジー ンを有するトランスジェニック動物を提供し、ここで該トランスジェニック動物 はイソタイプスイッチを受けることにより複数のイソタイプの異種抗体を産生す ることができる。古典的イソタイプスイッチは、トランスジーン中の少なくとも １つのスイッチ配列領域を巻き込む組換え現象によって起こる。非古典的イソタ イプスイッチは、例えば、ヒトσμ配列とヒトΣμ配列の間の相同組換え（δ− 関連欠失）により起こり得る。別の非古典的スイッチ機構、例えば特にトランス ジーン間および／または染色体間組換えは、イソタイプスイッチを果たすことが できる。 そのようなトランスジーンおよびトランスジェニック動物は、抗原刺激型Ｂ細 胞成熟に必要である第一の免疫グロブリンイソタイプを産生し、そして療怯的お よび／または診断的効用を有する１または複数の第二の異種イソタイプをコード し産生するようにスイッチすることができる。よって本発明のトランスジェニッ ク非ヒト動物は、一態様では、ヒト免疫グロブリン遣伝子配列によりコードされ 且つ高親和力で特異的ヒト抗原に結合するIgＧ，IgＡおよび／またはIgＥ抗体を 産生することができる。 本発明は、様々なイソタイプの異種抗体を発現することのできるトランスジェ ニック動物からのＢ細胞にも関し、そのようなＢ細胞は、特定抗原に対して特異 的なモノクローナル抗体の源を提供するために不死化される。そのようなＢ細胞 から誘導されたハイブリドーマ細胞は、そのような異種モノクローナル抗体の１ つの源として働くことができる。 本発明は、上述の非ヒトトランスジェニック動物中でまたはそのようなトラン スジェニック動物から外植されたＢ細胞系統のリンパ球中で生体内イソタイプス イッチを受けることができる、再配列されていないおよび再配列された異種免役 グロブリン重鎖および軽鎖トランスジーンを提供する。そのようなイソタイプス イッチは自然に起こるか、またはトランスジェニック動物もしくは外植されたＢ 細胞系統リンパ球をイソタイプスイッチ促進剤、例えばＴ細胞由来のリンホカイ ン（例えばIL-4および IFNγ）で処理することによって誘導することができる。 更に、本発明は、上述のトランスジェニック非ヒト動物中での異種抗体産生を 誘導する方法を包含し、ここでそのような抗体は様々なイソタイプのものである ことができる。それらの方法は、異種抗体、特にスイッチされたイソタイプ（Ig Ｇ．IgＡおよびIgＭ）の異種抗体の産生のためにトランスジェニック非ヒト動物 において抗原刺激型免疫応答を生じさせることを含む。 本発明は、トランスジェニック動物中で産生される異種免疫グロブリンおよび 前記動物のＢ細胞から誘導されるモノクローナル抗I本クローンが多様なイソタ イ プのものであり得るように、トランスジーンがイソタイプスイッチを果たす配列 を含む方法を提供する。 本発明は更に、特定のイソタイプ間のスイッチが、生殖細胞免疫グロブリン遣 伝子座中で典型的に起こるよりもずっと高頻度もしくは低頻度でおこるかまたは 異なる時間順序で起こるように、トランスジーンのイソタイプスイッチを促進す る方法を提供する。スイッチ領域は、様々なＣH遺伝子から移植しそしてトラン スジーン構成物中の別のＣH遺伝子に連結せしめることができる。そのような移 植スイッチ配列は典型的には結合されたＣH遺伝子とは独立的に機能し、そのた め、トランスジーン構成物中でのスイッチは結合されたスイッチ領域の元の機能 であろう。あるいはまた、スイッチ配列と共に、δ一結合欠失配列が様々なＣH 遺伝子に連結され、２つのδ−結合欠失配列の間の配列の欠失により非古典的ス イッチを果たすことができる。よって、特定のＣH遺伝子が異なるスイッチ配列 に連結され、それによって天然に結合されたスイッチ領域を使用した時に起こる よりも頻繁にスイッチされるトランスジーンを作製することができる。 本発明はまた、免疫グロブリントランスジーンを含有するトランスジェニック 動物においてトランスジーン配列のイソタイプスイッチが起こったかどうかを決 定する方法を提供する。 本発明は、その内の幾つかは生殖細胞の免疫グロブリン遺伝子座配列（欠失を 含んでもよい）のサブセットを含有する免疫グロブリントランスジーン構成物、 および免疫グロブリントランスジーン構成物の作製方法を提供する。本発明は、 免疫グロブリントランスジーンの容易なクローニングと作製のための特別な方法 であって、２つのユニークNotl部位により隣接されたユニーク XholおよびSalI 制限部位を使用するベクターを必要とする方法を包含する。 本発明のトランスジーンは、少なくとも１つの可変遺伝子セグメント、１つの 連結遺伝子セグメントおよび１つの定常領域遺伝子セグメントをコードするＤＮ Ａを含んで成る重鎖トランスジーンを包含する。免疫グロブリン軽鎖トランスジ ーンは、少なくとも１つの可変遺伝子セグメント、１つの連結遺伝子セグメント および１つの定常領域遺伝子セグメントをコードするＤＮＡを含んで成る。軽鎖 および重鎖遺伝子セグメントをコードする遺伝子セグメントは、それらが誘導さ れるトランスジェニック非ヒト動物にとって異種であるか、またはトランスジェ ニック非ヒト動物から成らない種からの免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子セ グメントをコードするＤＮＡに相当する。 本発明の一観点によれば、個々の遺伝子セグメントが再配列されておらず、即 ち機能的な免疫グロブリン軽鎖または重鎖をコードするようには再配列されてい ないようなトランスジーンが作製される。そのような再配列されていないトラン スジーンは、トランスジェニック非ヒト動物が抗原に暴露されると、前記動物中 での該遺伝子セグメントの組換え（機能的再配列）並びに生成した再配列された 免役グロブリン重鎖および／または軽鎖の発現を可能にする。 本発明の一観点によれば、異種重鎖および軽鎖免疫グロブリントランスジーン は、再配列された異種ＤＮＡの比較的大きい断片を含んで成る。そのような断片 は、典型的には異種免疫グロブリン遺伝子座からのＣ，Ｊ（および重鎖の場合に はＤ）セグメントの実質的部分を含む。加えて、そのような断片は可変遺伝子セ ダメントの実質的部分も含んで成る。 一態様では、そのようなトランスジーン構成物は、調節配列、例えばプロモー ター、エンハンサー、クラススイッチ領域、組換えシグナル、異種ＤＮＡから誘 導された対応配列等を含んで成る。あるいは、そのような調節配列を、本発明に 使われる非ヒト動物と同一のまたは関連の種からのトランスジーン中に組み込む ことができる。例えば、トランスジェニックマウスに使うために、齧歯類免疫グ ロブリンエンハンサー配列を有するトランスジーン中にヒト免疫グロブリン遺伝 子セグメントを組み合わせることができる。 本発明の方法では、生殖細胞再配列されていない軽鎖および重鎖免疫グロブリ シトランスジーン−即ちＤ細胞分化中にＶＤＪ結合を受けるもの−を抗原と接触 せしめ、二次レパートリーＢ細胞における異種抗体の産生を誘導する。 本発明に使われる非ヒト動物中の内因性免疫グロブリン遺伝子座を破壊するベ クターおよび方法も本発明に包含される。そのようなベクターおよび方法は、ト ランスジーン、好ましくはポジティブ−ネガティブ(positive-negative)選別ベ クターを使用し、該ベクターは、それが本発明において使用する非ヒト動物にと って内因性である重鎖および／または軽鎖免疫グロブリンをコードする遺伝子セ グメントのクラスの機能的破壊を標的するように構成される。そのような内因性 遺伝子セグメントとしては、多様性領域、連結領域および定常領域遺伝子セグメ ントが挙げられる。 本発明のこの観点によれば、ポジティブ−ネガティブ選別ベクターを少なくと も１つの非ヒト動物の胎児性幹細胞と接触させた後、ポジティブ−ネガティブ選 別ベクターが相同組換えによって非ヒト動物のゲノム中に組み込まれている細胞 を選択する。移植後、得られたトランスジェニック非ヒト動物は、該ベクターの 相同組み込みの結果として、免疫グロブリン媒介の免疫応答を開始することが実 質的に不可能である。そのような免疫不全非ヒト動物は、その後、免疫不全症の 研究に使うことができ、または異種免役グロブリン重鎖および軽鎖トランスジー ンの受容体として使うことができる。 本発明はまた、内因性免疫グロブリン遺伝子座を破壊することなく、１または 複数の種の免疫グロブリン鎖の発現を抑制するのに有用なベクター、方法および 組成物を提供する。そのような方法は、トランスジーンによってコードされる１ または複数の免疫グロブリン鎖の発現を許容しながら、トランスジーンによって コードされる１または複数の免疫グロブリン鎖の発現を抑制するのに有用である 。内因性免疫グロブリン鎖遺伝子座の遺伝的破壊とは異なり、免疫グロブリン鎖 発現の抑制は、破壊された内因性Ｉｇ遺伝子座についてホモ接合性であるトラン スジェニック動物の確立に必要である時間のかかる飼育を必要としない。 内因性Ｉｇ遺伝子破壊法に比較した時の抑制法の追加の利点は、ある態様では 、個体動物内で鎖抑制が可逆的であることである。例えば、Ｉｇ鎖抑制は、（１ ）内因性Ｉｇ鎖遺伝子配列に特異的にハイブリダイズするアンチセンスＲＮＡを コードし発現するトランスジーン、（２）内因性Ｉｇ鎖遺伝子配列に特異的にハ イブリダイズするアンチセンスズリゴヌクレオチド、および（３）内因性Ｉｇ鎖 ポリペプチドに特異的に結合する免疫グロブリン、を使って達成することができ る。 本発明は、機能的に分断された内因性重鎖対立遺伝子の同型接合対、機能的に 分断された内因性軽鎖対立遺伝子の同型接合対、非相同免疫グロブリン重鎖トラ ンスジーンの少なくとも１つのコピー、及び非相同免疫グロブリン重鎖トランス ジーンの少なくとも１つのコピーを含み、ヒト抗原（例えばCO4）といった抗原 での免疫化に続いて抗体応答を行なう、ヒト以外のトランスジェニック動物を提 供する。本発明は同様に、前記機能的に分断された内因性重鎖対立遺伝子がＪH 領域相同組換えノックアウトであり、前記機能的に分断された内因性軽鎖対立遺 伝子がＪk領域相同組換えノックアウトであり、前記非相同免疫グロブリン重鎖 トランスジーンがHC1又はHC2ヒトミニ遺伝子トランスジーンであり、前記非相同 軽鎖トランスジーンがKC2又はKCleヒトκトランスジーンであり、前記抗原がヒ ト抗原であるような、ヒト以外のトランスジェニック動物をも提供する。 本発明は同様に、内因性ヒト免疫グロブリン遺伝子座を抑制、切除及び／又は 機能的に分断するためのさまざまな実施態様をも提供している。 本発明は同様に、ヒト配列重鎖可変領域及びマウス配列重鎖恒常領域を含むキ メラ重鎖及びヒト配列重鎖の両方を発現するトランスジェニックマウスをも提供 する。このようなキメラ重鎖は一般に、機能的に再配置されたヒトトランスジー ンと内因性マウス重鎖恒常領域（γ１，γ２ａ，γ２ｂ，γ３）の間でのトラン ススイッチにより産生される。標準的にはトランスジーンコードされたヒト配列 軽鎖又は内因性マウス軽鎖と引合わされたこのようなキメラ重鎖を含む抗体は、 予め定められた抗原での免疫化に応答して形成される。これらの実施態様のトラ ンスジェニックマウスは、第１の時点でヒト配列重鎖を産生（発現）し、第２（ 次に続く）時点でヒト可変領域及びマウス恒常領域（例えば、γ１，γ２ａ，γ ２ｂ，γ３）から成るキメラ重鎖を産生（発現）するべくトランススイッチする Ｂ細胞を含むことができる；このようなヒト配列及びキメラ重鎖は軽鎖をもつ機 能的抗体内に組込まれる：このような抗体は、かかるトランスジェニックマウス の血清中に存在する。 かくして換言すると、これらの実施態様のトランスジェニックマウスは、ヒト 配列重鎖を発現しその後、ヒト可変領域及び交互の恒常領域（例えばマウスγ１ ，γ２ａ，γ２ｂ，γ３：ヒトγ，α，ε）から成るキメラ又はアイソタイプス イッチを受けた重鎖を発現するべくスイッチ（トランススイッチ又はシススイッ チによる）するＢ細胞を含むことができ；かかるヒト配列及びキメラ又はアイソ タイプスイッチされた重鎖は軽鎖を伴う機能的抗体（ヒト又はマウス）の中に組 込まれ；かかる抗体はかかるトランスジェニックマウスの血清内に存在する。 本発明はまた、大きなトランスジーンを生じる方法を提供し、該方法は、次の ことを含む：哺乳動物の細胞に、少なくとも３つのポリヌクレオチド種を導入す ることであって；第１のポリヌクレオチド種は、第２のポリヌクレオチド種と共 有された配列一致（sequence identity）の組換え遺伝子領域（recombinogenic region）を有し、第２のポリヌクレオチド種は、第１のポリヌクレオチド種と共 有された配列一致の組換え遺伝子領域および第３のポリヌクレオチド種と共有さ れた配列一致の組換え遺伝子領域を有し、かつ第３のポリヌクレオチド種は、第 ２のポリヌクレオチド種と共有された配列一致の組換え遺伝子領域を有する。組 換え遺伝子領域は、哺乳動物細胞（例えばＥＳ細胞）における、好ましくはまた 非哺乳動物の真核細胞（例えばサッカロマイセスおよび他の酵母または菌の細胞 ）における、イン ビボでの相同組換えを生じるのに十分な実質的な配列一致の 領域である。典型的には、組換え遺伝子領域は少なくとも 50〜100,000 ヌクレ オチド長、好ましくは 500 ヌクレオチド〜10,000 ヌクレオチド長で、たいてい 80〜100％同一、しばしば 95〜100％同一の、たいてい同質遺伝子である。 本明細書中に引用された参考文献は本出願の出願日より前にそれらの開示があ ったことを示すためだけに提供される。先行発明によって本発明者らがそのよう な開示よりも先であるという権利を与えられることを認めるものと解釈してはな らない。 （化２）及び（化３）はベクターpGPeの配列を示す。 （化４）及び（化５）は遺伝子ＶH49.8の配列を示す。 表１は本発明のトランスジェニックマウスの血清中のヒトIgＭおよびIgＧの検 出を示す。 （化６）及び（化７）はＶＤＪ接合の配列を示す。 表２は、成人の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）において見つかるＪセグメントに対 する、pHC1トランスジーンによってコードされる転写物中に組み込まれたＪセグ メントの分布を示す。 表３は、成人の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）において見つかるＤセグメントに対 する、pHC1トランスジーンによってコードされる転写物中に組み込まれたＤセグ メントの分布を示す。 （化８）及び（化９）は、pHC1トランスジェニックマウス中またはヒトＰＢＬ 中のフレーム内ＶＤＪ接合を有する転写物からのCDR3ペプチドの長さを示す。 表４は、pHC1トランスジェニックマウスから分析された30クローンのＶＤＪ領 域の推定アミノ酸配列を示す。 表５は、指摘の実験において使用したライン112 のトランスジェニックマウス を示す；（＋）は各トランスジーンの存在を示し、（＋＋）は該動物がＪHＤ突 出トランスジーンについてホモ接合性であることを示す。 表６は、複数の0011マウスの遺伝子型を示す。 表７は、トランスジェニックマウスにおけるHC2重鎖トランスジーン内の体細 胞突然変異の発生を示す。 表８は、トランスジーンＶおよびＪセグメント使用を示す。 表 11 は、トランスジェニックマウスからのハイブリドーマにおけるヒト可変 領域使用を示す。 表 14 は、YAC 4x17E1 でのヒト Vk セグメントの同定を示す。 表 15、マウス系統 KCo5−9272 において発現したヒト Vk 遺伝子の同定。 表 16、ヒト IgGk 抗-nCD4 モノクローナル抗体についての分泌レベル。 表 17、ヒト CD4 に結合するモノクローナル抗体についての速度および親和性 （affinity）定数。 表 18、ヒト抗ヒト CD4 モノクローナル抗体の親和性（affinity）および速度 定数。 表 19、ヒト抗ヒト CD4 モノクローナル抗体の結合力（avidity）および速度 定数。 表 20、抗 CD4 モノクローナル抗体について報告された結合力（avidity）お よび速度定数。 表 21、フローサイトメトリーにより測定された、ヒト抗ヒト CD4 モノクロー ナル抗体の親和性（avidity）定数。 表 22、機能的転写のための部分ヌクレオチド配列。 表 23、.ハイブリドーマ転写における生殖細胞系Ｖ(D)Ｊセグメント使用。 表 24、ミニジーン構成において使用されるプライマー、ベクターおよび産物 。 表 25、末梢のチンパンジーのリンパ球でのヒト mAbs の効果。 詳細な説明 上述したように、有望な治療および／または診断上の標的である特異的ヒト抗 原と反応するヒト免疫グロブリンを製造することが望ましい。しかしながら、ヒ ト抗原と特異的に結合するヒト免疫グロブリンは問題がある。 第一に、Ｂ細胞源として働く免疫処置動物が、与えられた抗原に対して免疫応 答を生じなければならない。動物が免疫応答を生じるには、与えられた抗原が外 来でなければならず、且つ動物が該抗原に寛容性でなければならない。よって、 例えばヒトタンパク質に結合するイディオタイプを有するヒトモノクローナル抗 体を製造しようと所望するならば、自己寛容性がヒトタンパク質に対する実質的 な免疫応答を生じるのを妨げるだろう。何故なら、免疫原性となり得る該抗原の 唯一のエピトープが、ヒト集団の中のタンパク質の多形性に由来するもの（同種 異系間エピトープ）であろうからである。 第二に、ハイブリドーマを形成させるためのＢ細胞の源として働く動物（一例 ではヒト）が真正自己抗原に対して免疫応答を生じるならば、該動物において深 刻な自己免疫病が発生し得る。ハイブリドーマ用のＢ細胞源としてヒトを使う場 合には、そのような自己免疫化は現代の道徳的規範により非論理的であると見な される。 かくして予め定められたヒト抗原に対する抗体応答を誘発できるヒト抗体分泌 Ｂ細胞が必要とされることから、予め定められたヒト抗原と特異的反応性をもつ ヒト免疫グロブリン鎖を分泌するハイブリドーマを開発することには問題が多い 。 ヒト抗原と特異的に反応するヒト抗体を得るのに利用することができる１つの 方法論は、本発明のヒト免疫グロブリントランスジーン構成物を含有するトラン スジェニックマウスの製造である。簡単に言えば、ヒト免疫グロブリン重鎖およ び軽鎖遺伝子座の全部もしくは部分を含有するトランスジーン、またはヒト重鎖 および軽鎖遺伝子座の必須機能要素を含んで成る合成「小遺伝子座」（下記、並 びに同時継続米国特許出願第 08/352,322 号(1994 年 12 月７日出願)、第 07/9 90,860 号(1992 年 12 月 16 日に出願)、第 07/810,279号(1991年 12 月 17 日 出願)、第 07/904,068 号(1992 年６月 23 日に出願)；第 07/853,408 号(1992 年３月 18 日に出願)、第 07/574,748 号(1990年８月 29 日に出願)、第 07/575 ,962 号（1990 年８月 31 日に出願）および PCT/US91/06185 号（1991 年８月 28 日に出願）に記載されている）を含有するトランスジーンを使ってトランス ジェニック非ヒト動 物を作製する。 そのようなトランスジェニック非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子によ りコードされる免疫グロブリン鎖を産生する能力を有し、その上、ヒト抗原に対 して免疫応答を生じることができるだろう。よって、そのようなトランスジェニ ック非ヒト動物は特定のヒト抗原と反応する免疫血清の源として働くことができ 、そのようなトランスジェニック動物からのＢ細胞をミエローマ細胞と融合せし めることにより、ヒト抗原と特異的に反応するモノクローナル抗体を分泌するハ イブリドーマを製造することができる。 様々な形の免疫グロブリン遺伝子を含有するトランスジェニックマウスの製造 は以前に報告されている。トランスジェニックマウスの製造には、再配列された マウス免疫グロブリン重鎖または軽鎖遺伝子が使われている。加えて、μまたは γ１定常領域を含む機能的に再配列されたヒトＩｇ遺伝子がトランスジェニック マウス中で発現されている。しかしながら、トランスジーンが再配列されていな い（再配列されないＶ−Ｄ−ＪまたはＶ−Ｊ）免疫グロブリン遺伝子を含んで成 る実験は変動的であり、場合によって、トランスジーンの不完全なまたは最少の 再配列を生じることがあった。しかし、トランスジーン中のＣH遺伝子間での好 結果のイソタイプスイッチを受ける再配列されたまたは再配列されていない免疫 グロブリントランスジーンの例は１つも報告されていない。 本発明は同様に、基本的にヒト恒常領域配列に対するポリペプチド結合におけ るヒトＶＤＪ配列から成るヒト免疫グロブリン鎖を含むモノクローナル抗体を分 泌するハイブリドーマ候補を同定するための方法をも提供する。かかるハイブリ ドーマ候補は、（１）基本的にヒトＶＤＪ領域とヒト恒常領域から成る免疫グロ ブリン鎖を発現するハイブリドーマクローン、及び（２）基本的にヒトＶＤＪ領 域及びマウス恒常領域から成るヘテロハイブリッド免疫グロブリン鎖を発現する トランススイッチされたハイブリドーマを含むハイブリドーマクローンのプール から同定される。個々の又はプールされたハイブリドーマクローンの上清は、予 め定められた抗原結合特異性をもつ抗体を選択するための結合条件下で、標準的 には固定基質（例えばマイクロタイターウェル）上に吸着により不動化される抗 原である予め定められた抗原と接触させられる。 ヒト恒常領域に特異的に結合する抗原も同様に、抗体が少なくとも１つのヒト 恒常領域エピトープに選択的に結合するもののマウス恒常領域エピトープには結 合しないような結合条件下で、ハイブリドーマ上清及び予め定められた抗原と接 触させられ、かくして予め定められた抗原及び特異的にヒト恒常領域と結合する 抗体に結合されたハイブリドーマ上清（トランスジェニックモノクローナル抗体 ）で基本的に構成されている複合体を形成する（そして、これは検出可能な標識 又はリポーターで標識付け可能である）。このような複合体の形成の検出は、ヒ ト免疫グロブリン鎖を発現するハイブリドーマクローン又はプールを表わす）。 本発明の好ましい実施態様において、スクリーニングにおいて使用される抗ヒ ト定常領域免疫グロブリンは、非−μ、非−δイソタイプ、好ましくはαまたは ε、より好ましくはγイソタイプ定常領域を特異的に認識する。γイソタイプの モノクローナル抗体が好ましい。というのは、(i)IgG免疫グロブリンの特性が、 いくつかの治療的な適用について、IgM免疫グロブリンに対して好ましい（例え ばIgMペンタマーに比べてIgGダイマーのより小さい大きさの故に）こと、および (ii)体細胞突然変異のプロセスが、μ定常領域から非μ（例えばγ）定常領域へ のクラススウィッチに相関されることのためである。クラススウィッチを受けた 免疫グロブリンの集団から選ばれた免疫グロブリン（例えばIgG）は、クラスス ウィッチを受けていない集団から選ばれた免疫グロブリン（例えばIgM）より高 い親和性で抗体を結合する傾向にある。例えばロンベルグ(Lonberg)およびハス ザー(Huszer)、 Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995年)を見よ。 １つの実施態様において、候補者のハイブリドーマがまず、γイソタイプ定常 領域についてスクリーニングされ、次に、IgG発現ハイブリドーマのプールが、 予め決められた抗原への特異的結合についてスクリーニングされる。 かくして、この方法によれば、本発明のトランスジェニックマウスは、予め決 められた抗原で免疫されて、免疫応答を引起す。Ｂ細胞がマウスから集められ、 不死細胞に融合されてハイブリドーマを生じる。ハイブリドーマはまずスクリー ニングされて、非μ、非δイソタイプのIg（例えばIgG）を分泌する個々のハイ ブリドーマを同定する。このハイブリドーマの組は次に、関心のある、予め決め られた抗原への特異的結合についてスクリーニングされる。スクリーニングは、 例えば、ハーロー(Harlow)およびレイン(Lane)、Antibodies:ア ラボラトリー マニュアル、コールドスプリングハーバー(A Laboratory Manua1，ColdSprinq H arbor)、ニューヨーク（1988年）に記載されたような標準的技術を用いて行われ る。この方法を用いると、高親和性（例えば約 107Ｍ-1より大きい Ka）の免疫 グロブリンを実用的に効率的に同定することが可能である。定義 本明細書中で使用する時、用語「抗体」は、少なくとも２本の同一の軽ポリペ プチド鎖と２本の同一の重ポリペプチド鎖を含んで成る糖タンパク質を言う。重 および軽ポリペプチド鎖は各々、抗原と相互作用する結合ドメインを含む可変領 域（通常はポリペプチド鎖のアミノ末端部分）を含有する。重および軽ポリペプ チド鎖は各々、ポリペプチド鎖の定常領域（通常はカルボキン末端部分）も含ん で成り、その配列の一部は、免疫系の種々の細胞、或る種の食細胞および典型的 補体系の第一成分（Clq）を含む宿主組織への免疫グロブリンの結合を媒介する 。 本明細書中で使用する時、「異種抗体」は、そのような抗体を産生するトラン スジェニック非ヒト生物に関連して定義される。それは、トランスジェニック非 ヒト動物から成らない生物において見つかるものに対応するアミノ酸配列を有す るかまたはＤＮＡ配列をコードする抗体である。 本明細書中で使用する時、「ヘテロハイブリッド抗体」は、異なる生物体起源 の軽鎖と重鎖を有する抗体を言う。例えば、マウス軽鎖と会合されたヒト重鎖を 有する抗体はヘテロハイブリッド抗体である。 本明細書中で使用する時、「イソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によりコ− ドされる抗体クラス（例えばIgＭまたはIgG1）を言う。 本明細書中で使用する時、「イソタイプスイッチ」は、抗体のクラスまたはイ ソタイプが或るＩｇクラスから別のＩｇクラスのうちの１つへ変化する現象を言 う。 本明細書中で使用する時、「非スイッチイソタイプ」は、イソタイプスイッチ が起こらなかった時に産生される重鎖のクラスを言う。非スイッチイソタイブを コードするＣH遺伝子は、典型的には磯能的に再配列されたＶＤＪ遺伝子のすぐ 下流の最初のＣH遺伝子である。 本明細書中で使用する時、用語「スイッチ配列」は、スイッチ組換えを招くそ れらのＤＮＡ配列を言う。「スイッチ供与体」配列、典型的にはμスイッチ領域 は、スイッチ組換え中に欠失されるであろう定常領域の５′（即ち上流）にある だろう。「スイッチ受容体」領域は、欠失されるであろう定常領域と代替定常領 域（例えばγ，ε等）との間であろう。組換えが常に起こる特異部位は１つもな いので、典型的には最終遺伝子配列は構成物から予想不可能であろう。 本明細書中で使用する時、「グリコシル化パターン」は、タンパク質、より詳 しくは免疫グロブリンタンパク質に共有結合している炭化水素単位のパターンと して定義される。当業者が異種抗体のグリコゾル化パターンをトランスジーンの ＣH遺伝子が由来する種よりも非ヒトトランスジェニック動物の種の中のグリコ シル化パターンに一層類似していると認識するような時には、異種抗体のグリコ シル化パターンは、非ヒトトランスジェニック動物の種によって産生される抗体 上に天然に存在するグリコシル化パターンと実質上類似していると特徴付けるこ とができる。 本明細書中で使用する時、「特異的結合」は、抗体が（１）予め決定された抗 原に少なくとも１×107 Ｍ-1の親和力で結合し、そして（２）予め決定された抗 原以外の非特異的抗原（例えばＢＳＡ、カゼイン）への結合親和力よりも少なく とも２倍大きい親和力で、予め決定された抗原に優先的に結合する性質を言う。 本明細書中で使用する時「天然に存在する」という用語は、対象物に用いた時 に対象物が天然に見つけることができることを言う。例えば、天然源から単離す ることができ且つ人間によって実験室で故意に変更されていない、生物体（ウイ ルスを含む）中に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、「天然 に存在する」ものである。 本明細書中で使用する時「再配列された」という用語は、Ｖセグメントがそれ ぞれ本質的に完全なＶHまたはＶLドメインをコードする構造においてＤ−Ｊまた はＪセグメントのすぐ近くに位置する重鎖または軽鎖免疫グロブリン遺伝子座 の配置を言う。再配列された免疫グロブリン遺伝子座は生殖細胞ＤＮＡとの比較 によって同定することができ；再配列された遺伝子座は少なくとも１つのヘプタ マー／ナノマー相同性要素を有するだろう。 Ｖセグメントに関して本明細書中で使用する時、「再配列されていない」また は「生殖細胞配置」なる用語は、ＤまたはＪセグメントのすぐ近くになるように Ｖセグメントが組換えられない配置を言う。 核酸については、「実質的相同性」ともいうのは、最適な形で整列され比較さ れた場合、２つの核酸又はその指定配列が、少なくとも約80％のヌクレオチド、 通常は少なくとも約90％〜95％、より好ましくは少なくとも約98〜99.5％のヌク レオチドにおいて適当なヌクレオチド挿入又は欠失を伴って同一であることを表 わす。代替的には、選択的ハイブリダイゼーション条件下でストランドの補体に 対しセグメントがハイブリッド形成するときに実質的な相同性が存在する。核酸 は、全細胞中に、細胞リゼイト中に、又は部分的に精製された形又は実質的に純 粋な形で存在しうる。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣSClバンディング、カ ラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動及び当該技術分野において周 知のその他の技術を含む標準的技術により、例えばその他の細胞核酸又はタンパ ク質といったその他の細胞成分はその他の汚染物質から精製された時点で、「分 離され」又は「実質的に純粋な状態にされ」ている。F．Ausubel，et．al.，ed ．「分子生物学における現在のプロトコル」、Greene,Publishing and Wiley-In terscience、ニューヨーク（1987）参照。 本発明の核酸組成物は、往々にして、ｃＤＮＡゲノミック又は混合物のいずれ かからの未変性配列（修正された制限部位などを除く）にあるものの、標準的技 術に従って遣伝子配列を提供するべくそこからの突然変異を受けることができる 。コーディング配列については、これらの突然変異は望まれるとおりにアミノ酸 配列に影響を及ぼしうる。特に、未変性にＤ．Ｊ．結合スイッチと実質的に相同 な又はこれらから誘導されたＤＮＡ配列及び本書に記されているその他のこのよ うな配列が考慮される（ここで「誘導された」というのは、１つの配列がもう１ つの配列と同一であるか又はそれから修正されたものであることを表わす）。 核酸は、他の核酸と機能的関係におかれたとき、それは「使用可能に連結され る。」例えば、プロモーター又はエンハンサーは、それが配列の転写に影響を与 えるとき、「作用可能に連結される。転写抑制配列に関し、作用可能に連結され るとは、連結されたＤＮＡ配列が隣接することを意味し、２つの蛋白質コード領 域を連結するのに必要な場合、隣接しており、そしてリーディングフレーム内に ある。スイッチ配列については、作用可能に連結されるとは、配列がスイッチ組 換えを行うことができることを意味する。異種抗体を産生することのできるトランスジェニック非ヒト動物 異種抗体レパートリーによる外来抗原刺激に応答するトランスジェニック非ヒ ト動物のデザインは、トランスジェニック動物の内部に含まれた異種免疫グロブ リントランスジーンがＢ細胞発達経路を通して正しく機能することを必要とする 。好ましい態様では、異種重鎖トランスジーンの正しい機能がイソタイプスイッ チを含む。従って、イソタイプスイッチを生じ且つ下記のうちの１つまたは複数 をもたらすように本発明のトランスジーンが作製される：（１）高レベルで且つ 細胞型特異的な発現、（２）機能的な遺伝子再配列、（３）対立遺伝子排除の活 性化およびそれに対する応答、（４）十分な一次レパートリーの発現、（５）シ グナル形質導入、（６）体細胞高度突然変異（hyper-mutation、および（７）免 疫応答の間のトランスジーン抗体遺伝子座の優性化。 下記開示から明らかなように、上記の基準の全てを満たす必要はない。例えば 、トランスジェニック動物の内因性免疫グロブリン遺伝子座が機能的に破壊され るそれらの態様では、トランスジーンは対立遺伝子排除を活性化する必要がない 。更に、トランスジーンが機能的に再配列された重鎖および／または軽鎖免疫グ ロブリン遺伝子を含んで成る態様では、２番目の基準である機能的な遺伝子再配 列は、少なくとも既に再配列されているトランスジーンには不要である。分子免 疫学に関する背景につては、Fundamental Immunolo- gy，第２版(1989)，Pau l William E.編，Raven Press，N.Y．を参照のこと。これは参考として本明細書 中に組み込まれる。 本発明の一観点では、トランジェニック動物の生殖細胞（ジャームライン）中 に再配列された、再配列されていない、または再配列されたものと再配列されて いないものとの組み合わせの、異種免疫グロブリン重鎖および軽鎖トランスジー ンを含有する、トランスジェニック非ヒト動物が提供される。重鎖トランスジー ンの各々は少なくとも１つのＣH遺伝子を含んで成る。加えて、重鎖トランスジ ーンは、トランスジェニック動物のＢ細胞中で多数のＣH遺伝子をコードする異 種トランスジーンのイソタイプスイッチを支持することができる機能的イソタイ プスイッチ配列を含んでもよい。そのようなスイッチ配列は、トランスジーンＣH 遺伝子の源として働く種からの生殖細胞免疫グロブリン遺伝子座に天然に存在 するものであることができ、またはトランスジーン構成物を受け入れることにな っている種（トランスジェニック動物）に存在するものから誘導することもでき る。 例えば、トランスジェニックマウスを製造するのに使われるヒトトランスジー ン構成物は、それがマウス重鎖遺伝子座中に天然に存在するものに類似したスイ ッチ配列を含むならば、より高頻度のイソタイプスイッチ現象をもたらすことが できる。というのは、恐らくマウススイッチ配列はマウススイッチレコンビナー ゼ酵素系が機能するように最適化されるが、一方ヒトスイッチ配列は最適化され ないだろうからである。スイッチ配列は、常用のクローニング法により単離しク ローニングすることができ、または免疫グロブリンスイッチ領域配列に関する発 表された配列情報に基づいてデザインした重複合成オリゴヌクレオチドから初め から合成することができる（Mills ら、Nucl ．Acids Res． 18.7305-7316（1991 ）; Siderrasら、Intl. Immunol. 1:631-642(1989)、これらは参考として本明 細書中に組み込まれる）。 上記トランスジェニック動物の各々について、機能的に再配列された異種重鎖 および軽鎖免疫グロブリントランスジーンは、トランスジェニック動物の有意な 率（少なくとも10パーセント）のＢ細胞中に検出される。 本発明のトランスジーンは、少なくとも１つの可変遺伝子セグメント、１つの 連結遺伝子セグメントおよび１つの定常領域遺伝子セグメントをコードするＤＮ Ａを含んで成る重鎖トランスジーンを包含する。免疫グロブリン軽鎖トランスジ ーンは、少なくとも１つの可変遺伝子セグメント、１つの連結遺伝子セグメント および１つの定常領域遺伝子セグメントをコードするＤＮＡを含んで成る。軽鎖 および重鎖遺伝子セグメントをコードする遺伝子セグメントは、それらが誘導さ れるトランスジェニック非ヒト動物にとって異種であるか、またはトランスジェ ニック非ヒト動物から成らない種からの免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子セ グメントをコードするＤＮＡに相当する。 本発明の一観点によれば、個々の遺伝子セグメントが再配列されておらず、即 ち機能的な免疫グロブリン軽鎖または重鎖をコードするようには再配列されてい ないようなトランスジーンが作製される。そのような再配列されていないトラン スジーンは、抗原に暴露されると、トランスジェニック非ヒト動物内でＶ，Ｄお よびＪ遺伝子セグメントの組換え（機能的再配列）を支持し、そして好ましくは 結果として得られる再配列された免疫グロブリン重鎖中へのＤ領域遺伝子セグメ ントの全部または部分の組み込みを支持する。 本発明の別の観点によれば、該トランスジーンは、再配列された「小遺伝子座 」を含んで成る。そのようなトランスジーンは、典型的にはＣ，ＤおよびＪセグ メントの実質的部分並びにＶセグメントのサブセットを含んで成る。そのような トランスジーン構成物では、様々な調節配列、例えばプロモーター、エンハンサ ー、クラススイッチ領域、ＲＮＡプロセシング用のスプライス供与体およびスプ ライス受容体、組換えシグナル等は、異種ＤＮＡから誘導された対応配列を含ん で成る。 あるいは、そのような調節配列を本発明に使われる非ヒト動物と同一のまたは 関連の種からのトランスジーン中に組み込むことができる。例えば、トランスジ ェニックマウスに使うために、トランスジーン中にヒト免疫グロブリン遺伝子セ グメントを齧歯類免疫グロブリンエンハンサー配列と組み合わせることができる 。あるいは、トランスジーン中に合成調節配列を組み込むこともでき、この場合 、そのような合成調節配列は哺乳類のゲノム中に天然に存在することが知られて いる機能的ＤＮＡ配列とは相同でない。合成調節配列は共通規則に従ってデザイ ンされ、例えば、スプライス受容体部位またはプロモーター／エンハンサーモチ ーフの許容配列を特定するものである。 例えば、ミニ遺伝子座は、天然に発生する生殖細胞系Ｉｇ遺伝子座と異なり、 可欠ＤＮＡ部分（例えば介在配列；イントロン又はその一部分）の少なくとも１ つの内部（すなわちこの部分の末端にはない）の欠失を有するゲノミック免疫グ ロブリン遺伝子座の一部分を含む。 本発明はまた、重鎖および軽鎖トランスジーンを有する生殖細胞を含有するト ランスジェニック動物にも関し、ここで前記トランスジーンの一方は再配列され た遺伝子セグメントを含み、他方は再配列されていない遺伝子セグメントを含む 。好ましい態様では、再配列されたトランスジーンが軽鎖免役グロブリントラン スジーンであり、再配列されていないトランスジーンが重鎖免役グロブリントラ ンスジーンである。抗体の構造および産生 全ての免役グロブリンの基本構造は、２つの軽鎖ポリペプチドと２つの重鎖ポ リペプチドとから成る単位に基づく。各軽鎖は、可変軽鎖領域および定常軽鎖領 域として知られる２つの領域を含んで成る。同様に、免疫グロブリン重鎖は、可 変重鎖領域および定常重鎖領域と呼ばれる２つの領域を含んで成る。 重鎖または軽鎖の定常領域は、重鎖または軽鎖定常領域遺伝子（ＣH）セグメ ントと呼ばれるゲノム配列によりコードされる。特定の重鎖遺伝子セグメントの 使用が免疫グロブリンのクラスを限定する。例えば、ヒトでは、μ定常領域遺伝 子セグメントが抗体のIgＭクラスを限定し、一方でγ，γ２，γ３またはγ４定 常領域遺伝子セグメントが抗体のIgＧクラス並びにIgＧのサブクラスIgＧ1〜Ig Ｇ4を限定する。同様に、α1またはα2定常領域遺伝子セグメントの使用が抗体 のIgＡクラス並びにIgＡ1およびIgＡ2サブクラスを限定する。δおよびε定常領 域遺伝子セグメントがそれぞれIgＤおよびIgＥ抗体クラスを限定する。 重鎖および軽鎖免疫グロブリンの可変領域は、一緒になって抗体の抗原結合領 域を含む。広範囲の抗原を結合できるようにするために抗体のこの領域に多様性 が必要なため、初期または一次レパートリー可変領域をコードするＤＮＡは、特 定の可変領域遺伝子セグメントのファミリーに由来する多数の異なるＤＮＡセグ メントを含んで成る。軽鎖可変領域の場合、そのようなファミリーは可変（Ｖ） 遺伝子セグメントと連結（Ｊ）遺伝子セグメントを含んで成る。よって、軽鎖の 初期可変領域は１つのＶ遺伝子セグメントと１つのＪ遺伝子セグメントによって コードされ、各セグメントはその生物のゲノムＤＮＡ中に含まれるＶおよびＪ遺 伝子セグメントのファミリーから選ばれる。重鎖可変領域の場合、重鎖の初期ま たは一次レパートリー可変領域をコードするＤＮＡは、１つの重鎖Ｖ遺伝子セグ メント、１つの重鎖多様性（Ｄ）遺伝子セグメントおよび１つのＪ遺伝子てグメ ントを含んで成り、各セグメントはゲノムＤＮＡ中の適当な免疫グロブリン遺伝 子セグメントのＶ，ＤおよびＪファミリーから選ばれる。 抗体結合部位の形成に貢献する配列の多様性を増加させるために、重鎖トラン スジーンが再配列されたＶ−Ｄ−Ｊ遺伝子配列中にＤ領域の全部または部分を組 み込むことができる機能的Ｖ−Ｄ−Ｊ再配列を支持するシス作用性配列を含むこ とが好ましい。典型的には、発現されたトランスジーンによってコードされる重 鎖（またはmRNA）の少なくとも約１％がＶ領域中に認識可能なＤ領域配列を含有 する。好ましくは、トランスジーンによってコードされるＶ領域の少なくとも約 10％、より好ましくは少なくとも約30％、最も好ましくは50％が認識可能なＤ領 域配列を含有する。 認識可能なＤ領域配列は一般に、重鎖トランスジーンのＤ領域遺伝子セグメン ト中に存在する配列に相当する少なくとも約８個の連続するヌクレオチドおよび ／またはそのようなＤ領域ヌクレオテド配列によりコードされるアミノ酸配列で ある。例えば、トランスジーンがＤ領域遺伝子DHQ52 を含むならば、Ｖ遺伝子セ グメント配列とＪ遺伝子セグメント配列の間のＶ領域中に配列5-TAACTGGG-3’を 含有するトランスジーンによってコードされるmRNAは、Ｄ領域配列、特にDHQ52 配列を含むものとして認識可能である。同様に、例えば、トランスジーンがＤ領 域遺伝子DHQ52を含むならば、Ｖ遺伝子セグメントアミノ酸配列とＪ遺伝子セグ メントアミノ酸配列の間のＶ領域中に置かれたアミノ酸配列-DAF-を含有するト ランスジーンによってコードされる重鎖ポリペプチドは、Ｄ領域配列、特にDHQ5 2配列を含むものとして認識可能である。 しかしながら、Ｄ領域セグメントをさまざまな程度までのさまざまな読み取り 枠内でのＶＤＪジョイニング内に取り込むことができることから、特定のＤセグ メントの取込みを見極めるには、トランスジーン内に存在するＤ領域セグメント に対する重鎖可変領域のＤ領域部域の比較が必要である。その上、組換え中の潜 在的エキソヌクレアーゼ消化は、Ｖ−Ｄ−Ｊ組換え中の不精確なＶ−Ｄ及びＤ− Ｊ連結を漂く可能性がある。 しかしながら、体細胞突然変異またはＮ領域付加のために、幾つかのＤ領域は 、認識可能であるが連続するＤ領域配列と全く同一には一致しないことがある。 例えば、ヌクレズテド配列 5′-CTAAXTGGGG-3′（ここでＸはＡ，ＴまたはＧで あり、該配列は重鎖Ｖ領域中にあり、Ｖ領域遺伝子配列とＪ領域遺伝子配列によ って隣接されている）は、DH52配列５′-CTAACTGGG-３′に相当すると認識され 得る。同様に、例えば、Ｖ領域中にありそしてアミノ末端側でトランスジーンＶ 遺伝子配列によってコードされるアミノ酸配列により隣接されそしてカルボキン 末端側でトランスジーンＪ遺伝子配列によってコードされるアミノ酸配列により 隣接されているポリペプチド配列 -DAFDI-，-DYFDY- または -GAFDI-は、Ｄ領域 配列として認識され得る。 従って、体細胞突然変異やＮ領域付加はトランスジーンＤ領域に由来する配列 中に変異をもたらし得るので、認識可能なＤ領域配列の存在を決定するための指 標として次の定義が与えられる。アミノ酸配列またはヌクレオチド配列は次のよ うな場合にＤ領域として認識可能である：（１）該配列がＶ領域中に存在し、一 方の側がＶ遺伝子配列（ヌクレオチド配列または推定アミノ酸配列）により隣接 されており、そして他方の側がＪ遺伝子配列（ヌクレオチド配列または推定アミ ノ酸配列）により隣接されており、且つ（２）該配列が既知のＤ遺伝子配列（ヌ クレオチド配列または推定アミノ酸配列）と実質的に同じであるかまたは実質的 に相同である場合。 ここで使用する用語「実質的な同一」は、ポリペプチド配列が参照配列に比較 して少なくとも50％の配列一致、しばしば少なくとも約80％の配列一致および、 時には約90％より多い配列一致を有し、核酸配列が参照配列に比較して少なくと も70％の配列一致を有する、 ポリペプチド配列またはヌクレオチド配列の特徴を 表す。配列一致の％は、参照配列の合計35％未満である小さな欠失または付加を 除いて計算される。参照配列は、より大きな配列のサブセット、例えば完全なＤ 遺伝子であってもよい；しかしながら、参照配列はポリヌクレオチドの場合長さ が少なくとも８ヌクレオチドであり、ポリペプチドの場合長さが少なくとも３ア ミノ酸残基である。典型的には、参照配列は少なくとも８〜12ヌクレオチドまた は少なくとも３〜４アミノ酸であり、好ましくは12〜15ヌクレオチドもしくはそ れ以上または少なくとも５アミノ酸である。 ここで使用する用語「実質的な相同」は、ポリペプチド配列が参照配列に対し て少なくとも80％の相同性を有する、ポリペプチド配列の性質を表す。配列相同 性の％は、同一アミノ酸または位置保存性アミノ酸置換を相同であるとして数え ることにより算出される。位置保存性アミノ酸置換は、単一ヌクレオチド置換か ら生じ得るものである。単一ヌクレオチド置換により最初のアミノ酸のコドンと 二番目のアミノ酸のコドンが異なり得る場合、最初のアミノ酸が二番目のアミノ 酸と置き換えられる。例えば、配列-Lys-Glu-Arg-Val-は配列-Asn-Asp-Ser-Val- と実質的に相同である。何故なら、コドン配列-AAA-GAA-AGA-GUU-は、わずか３ つの置換変異（２つの元のコドンのうちの３つに単一ヌクレオチド置換）を導入 することによって-AAC-GAC-AGC-GUU-に変異せしめることができるからである。 参照配列はより大きな配列のサブセット、例えば完全なＤ遺伝子であってもよい ；しかしながら、参照配列は長さが少なくとも４アミノ酸残基である。典型的に は参照配列は少なくとも５アミノ酸であり、好ましくは６アミノ酸またはそれ以 上である。一次レパートリー 重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子をコードするＤＮＡを作製する方法は、 主としてＢ細胞を発達させることに存する。種々の免疫グロブリン遺伝子セグメ ントの結合前、Ｖ，Ｄ，Ｊおよび定常（Ｃ）遺伝子セグメントは、大部分、一次 レパートリーＢ細胞の前駆体中にＶ，Ｄ，ＪおよびＣ遺伝子セグメントのクラス ターとして見つかる。通常、重鎖または軽鎖の遺伝子セグメントの全てが単一の 染色体上に比較的近くに密接して置かれている。様々な免疫グロブリン遺伝子セ グメントの組換え前のそのようなゲノムＤＮＡは、本明細書中「再配列されてい ない」ゲノムＤＮＡと呼称される。Ｂ細胞分化の間に、Ｖ，Ｄ，Ｊ（または軽鎖 遺伝子の場合はＶとＪのみ）の適当なファミリーメンバーのいずれか１つの遺伝 子セグメントが組み換えられて機能的に再配列された重鎖および軽鎖免疫グロブ リン遺伝子を形成する。 そのような機能的再配列は、機能的な可変領域をコードするＤＮＡを形成する 可変領域セグメントの再配列である。この遺伝子セグメント再配列過程は連続的 であると思われる。最初に、重鎖Ｄ−Ｊ接合が作られ、次いで重鎖Ｖ−ＤＪ接合 と軽鎖Ｖ−Ｊ接合が作られる。軽鎖および／または重鎖中の機能的可変領域のこ の初期形態をコードするＤＮ,へは、「機能的に再配列されたＤＮＡ」または「 再配列されたＤＮＡ」と呼ばれる。重鎖の場合、そのようなＤＮＡは「再配列さ れた重鎖ＤＮΛ」と呼はれ、そして軽鎖の場合、そのようなＤＮＡは「再配列さ れた軽鎖ＤＮＡ」と呼ばれる。本発明のトランスジーンの機能的再配列を記述す る ためにも同様な用語が使われる。 機能的な重鎖および軽鎖可変領域を形成するための可変領域遺伝子セグメント の組換えは、組換え応答能のあるＶ，ＤおよびＪセグメントに隣接する組換えシ グナル配列（ＲＳＳ）により媒介される。組換えを指令するのに必要且つ十分な ＲＳＳは、二分子対称ヘプタマー、高ＡＴノナマー、および12塩基対または23塩 基対のいずれかの中断スペーサー領域を含んで成る。それらのシグナルは、Ｄ− Ｊ（またはＶ−Ｊ）組換えを行いそして機能的に相互交換可能である異なる遺伝 子座および種の間で保存されている。Oettinge ら(1990)，Science, 248, 1517- 1523およびその中に引用された参考文献を参照のこと。 配列 CACAGTGまたはその類似体を含んで成るヘプタマーの後に非保存性配列の スペーサー、次いで配列 ACAAAAACCまたはその類似体を有するノナマーが存在す る。それらの配列は、各ＶおよびＤ遺伝子セグメントのＪ側、即ち下流側上に見 つかる。生殖細胞型たおよび遺伝子セグメントの直前に、再び２つの組換えシグ ナル配列があり、最初にノナマーそして非保存性配列により隔てられて次にヘプ タマーがある。ＶL，ＶHまたはＤセグメントの後ろのヘプタマーおよびノナマー 配列は、それらが組み換わるＪL，ＤまたはＪHセグメントの前方のものと相補的 である。ヘプタマーとノナマー配列との間のスペーサーは12塩基対の長さかまた は22〜24塩基対の長さかのいずれかである。 Ｖ，ＤおよびＪセグメントの再配列に加えて、軽鎖のＶセグメントとＪセグメ ントとの間および重鎖のＤセグメントとＪセグメントとの間の可変的祖換えによ って、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の一次レパートリーにおいて更なる多様性 が生まれる。そのような様々な組換えは、そのようなセグメントが結合する正確 な場所の変位（ずれ）によって生成される。軽鎖におけるそのようなずれは、典 型的にはＶ遺伝子セグメントの最後のコドンの内部およびＪセグメントの最初の コドンの内部に起こる。同様な結合のずれは、重鎖染色体上ではＤセグメントと ＪHセグメントとの間に起こり、10ヌクレオチドほどの多数に及ぶことがある。 更に、ＤセグメントとＪHセグメントとの間およびＶHセグメントとＤセグメント との間に、ゲノムＤＮＡによりコードされない幾つかのヌクレオチドが挿入され ることがある。それらのヌクレオチドの付加はＮ領域多様性として知られている 。 ＶＪおよび／またはＶＤＪ再配列の後、再配列された可変領域遺伝子セグメン トおよび再配列された可変領域の下流に置かれた１または複数の定常領域遺伝子 セグメントの転写は、一次ＲＮＡ転写物を生成し、これが適当なＲＮＡスプライ シングを受けると、全長の重鎖または軽鎖免疫グロブリンをコードするmRNAを生 じる。そのような重鎖および軽鎖は、Ｂ細胞の経膜領域中への免役グロブリンの 挿入および／またはＢ細胞からの分泌を行うリーダー配列を含む。このシグナル 配列をコードするＤＮＡは、免役グロブリン重鎖または軽鎖の可変領域を形成す るのに使うＶセグメントの第一エクソンの内部に含まれる。コードされる免疫グ ロブリン重鎖および軽鎖ポリペプチド（これは互いとの適切な会合によって抗体 分子を形成する）を生成するmRNAの翻訳を調節するためにmRNA中に適当な調節配 列も存在する。 可変領域遺伝子セグメント中のそのような再配列およびそのような連結中に起 こり得る可変的組換えの最終結果は、一次抗体レパートリーの生成である。一般 に、この段階まで分化された各Ｂ細胞は、単一の一次レパートリー抗体を産生す る。この分化過程の間に、機能的に再配列されたIg遺伝子内に含まれるもの以外 の遺伝子セグメントの機能的再配列を抑制する細胞現象が起こる。二倍体Ｂ細胞 がそのような単一特異性を維持する過程は、対立遺伝子排除と呼ばれる。二次レパートリー 一次レパートリーを含んで成る配列の組の中からの免疫グロブリンを発現する Ｂ細胞クローンは、外来抗原に応答させるのにすぐに利用できる。単純なＶＪお よびＶＤＪ結合により生じる限定された多様性のため、いわゆる一次応答によっ て産生される抗体は比較的低い親和性のものである。２つの異なる型のＢ細胞が この初期応答を作成する:一次抗体形成細胞の前駆体および二次レパトリ−Ｂ細 胞の前駆体〔Lintonら、Cell，59:1049-1059（1989）〕。最初の型のＢ細胞は或 る種の抗原に応答してIgM 分泌性形質細胞に成熟する。他方のＢ細胞は、Ｔ細胞 依存性成熟過程に入ることにより、抗原への初期暴露に応答する。 抗原により感作されたＢ細胞クローンのＴ細胞依存性成熟の間に、細胞表面上 の抗体分子の構造が２つの経路で変化する。第一は、定常領域が非IgＭサブタイ プにスイッチし、そして可変領域の配列が多数の単一アミノ酸置換により変更さ れて一層高い親和性の抗体分子を生成することができる。 前に指摘したように、Ig重鎖または軽鎖の各可変領域は、抗原結合領域を含む 。二次応答の間の体細胞突然変異は、アミノ酸および核酸配列決定により、３つ の相補性決定領域（CDR1，CDR2およびCDR3；これは超可変領域１，２または３と も呼ばれる）を含むＶ領域の至るところで起こることが決定されている〔Kabat ら、Sequences of Proteins of Immunological Interest（1991）U.S．Departme nt of Health and Human Services，Washington，DC；これは参考として本明細 書中に組み込まれる〕。CDR1とCDR2は可変遺伝子セグメント内部に位置し、一方 CDR3は大部分がＶ遺伝子セグメントとＪ遺伝子セグメントの間またはＶ，Ｄおよ びＪ遺伝子セグメントの間の組換えの結果である。 CDR1，2 または3 を構成しない可変領域の部分は、一般に、FR1，FR2，FR3 お よびFR4 と名付けられたフレームワーク領域と呼ばれる。図１を参照のこと。高 度突然変異の間に、再配列されたＤＮＡが変異されて異なるIg分子を有する新し いクローンを生じる。外来抗原に対して一層高い親和性を有するそれらのクロー ンがヘルパーＴ細胞によって選択的に増大されて、発現抗体の親和力成熟を引き 起こす。クローン選択は、典型的にはCDR1，CDR2および／またはCDR3領域中に新 規変異を含むクローンの発現をもたらす。しかしながら、抗原結合領域の特異性 および親和性に影響を及ぼすようなそれらの領域の外側の変異も起こる。異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物 本発明の１観点では、トランスジェニック非ヒト動物は、少なくとも１つの本 発明の免疫グロブリントランスジーン（後述）を非ヒト動物の接合子または初期 胚中に導入することにより製造される。本発明に有用である非ヒト動物は、一般 に、免疫グロブリン遺伝子セグメントを再配列して一次抗体応答を生ぜしめるこ とができる任意の哺乳類を包含する。そのような非ヒトトランスジェニック動物 としては、例えば、トランスジェニックブタ、トランスジェニックラット、トラ ンスジェニックウサギ、トランスジェニックウシ、および当業界で既知である他 のトランスジェニック動物種、特に哺乳動物種が挙げられる。特に好ましい非ヒ ト動物はマウスまたは齧歯類の他のメンバーである。 しかしなから、本発明はマウスの使用に限定されない。むしろ、一次および二 次抗体応答を開始することができる任意の非ヒト哺乳動物を使うことができる。 そのような動物としては、非ヒト霊長類、例えばチンパンジー、ウシ、ヒツジお よびブタの種、齧歯科の他のメンバー、例えはラット、並びにウサギおよびモル モットが挙げられる。特に好ましい動物はマウス、ラット、ウサギおよびモルモ ットであり、最も好ましくはマウスである。 本発明の一態様では、ヒトゲノム由来の様々な遺伝子セグメントが再配列され ていない形で重鎖および軽鎖トランスジーンに使われる。この態様では、そのよ うなトランスジーンがマウスに導入される。軽鎖および／または重鎖トランスジ ーンの再配列されていない遺伝子セグメントは、マウスゲノム中の円因性免疫グ ロブリン遺伝子セグメントと識別可能である、ヒト種に固有のＤＮＡ配列を有す る。それらは生殖細胞やＢ細胞から成らない体細胞では再配列されていない形態 でそしてＢ細胞では再配列された形態で容易に検出することができる。 本発明の別の態様では、トランスジーンは、再配列された重鎖および／または 軽鎖免疫グロブリントランスジーンを含んで成る。そのようなトランスジーンの 機能的に再配列されたＶＤＪまたはＶＪセグメントに相当する特定セグメントは 、マウス中の内因性免疫グロブリン遺伝子セグメントから明らかに識別可能であ る免疫グロブリンＤＮＡ配列を含む。 そういったＤＮＡ配列の相違は、マウスＢ細胞によりコードされるアミノ酸配 列に比較するとそのようなヒト免疫グロブリントランスジーンによりコードされ るアミノ酸配列にも反映される。よって、ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメント によりコードされる免疫グロブリンエピトープに特異的な抗体を使って、本発明 のトランスジェニック非ヒト動物において、ヒト免疫グロブリンアミノ酸配列を 検出することができる。 ヒトまたは他の種由来の再配列されていないトランスジーンを含有するトラン スジェニックＢ細胞は、適当な遺伝子セグメントを機能的に組換えると、機能的 に再配列された軽鎖および重鎖可変領域を形成する。そのような再配列されたト ランスジーンによりコードされる抗体は、本発明を実施するのに用いる非ヒト動 物中で通常遭遇するものとは異種であるＤＮＡおよび／またはアミノ酸配列を有 することは容易に明らかであろう。再配列されていないトランスジーン 本明細書中で使用する時、「再配列されていない免疫グロブリン重鎖トランス ジーン」は、少なくとも１つの可変遺伝子セグメント、１つの多様性遺伝子セグ メント、１つの連結遺伝子セグメントおよび１つの定常領域遺伝子セグメントを コードするＤＮＡを含んで成る。前記重鎖トランスジーンの各遺伝子セグメント は、前記トランスジーンが導入される非ヒト動物から成らない種の免疫グロブリ ン重鎖遺伝子セグメントをコードするＤＮＡから誘導されるか、またはそれに相 当する配列を有する。 同様に、本明細書中で使用する時、「再配列されていない免疫グロブリン軽鎖 トランスジーン」は、少なくとも１つの可変遺伝子セグメント、１つの連結遺伝 子セグメントおよび少なくとも１つの定常領域遺伝子セグメントをコードするＤ ＮＡを含んで成る。ここで、前記軽鎖トランスジーンの各遺伝子セグメントは、 前記軽鎖トランスジーンが導入される非ヒト動物から成らない種の免疫グロブリ ン軽鎖遺伝子セグメントをコードするＤＮＡから誘導されるか、またはそれに相 当する配列を有する。 本発明のこの観点でのそのような重鎖および軽鎖トランスジーンは、再配列さ れていない形態で上述の遺伝子セグメントを含有する。即ち、重鎖トランスジー ン中のＶ，ＤおよびＪセグメントの間および軽鎖トランスジーン中のＶとＪセグ メントの間には、適当な組換えシグナル配列（ＲＳＳ）が置かれる。加えて、そ のようなトランスジーンは、定常領域遺伝子セグメントをＶＪまたはＶＤＪ再配 列された可変領域と結合するための適当なＲＮＡスプライシングシグナルも含む 。 複数のＣ領域遺伝子セグメント、例えばヒトゲノムからのＣμおよびＣγ１を 含む重鎖トランスジーン内でのイソタイプスイッチを促進するために、各定常領 域遺伝子セグメントの上流で且つ可変領域遺伝子セグメントの下流に、免疫グロ ブリンクラススイッチ、例えばIgＭからIgＧへのクラススイッチを考慮した前記 定常領域間の組換えを可能にするため、下記に説明するような「スイッチ」領域 が組み込まれる。そのような重鎖および軽鎖免疫グロブリントランスジーンは、 可変領域遺伝子セグメントの上流に置かれたプロモーター領域を含む転写調節配 列（典型的にはTATAモチーフを含む）も含有する。 プロモーター領域は、下流配列に作用可能に連結されると該下流配列の転写を 指令することができるＤＮＡ配列として大体定義することができる。プロモータ ーは、効率的転写を指令するために連結された追加のシス作用性配列の存在を必 要とすることがある。更に好ましくは、繁殖不能性転写物の転写に関係する他の 配列が含まれる。繁殖不能性転写物の発現に関係する配列の例は、Rothman ら、Intl ．Immunol. 2: 621-627（1990）；Reidら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA86: 840-844（1989）；Stavnezer ら、Proc．Natl ．Acad．Sci．USA 85:7704-7708（ 1988）および Millsら、Nucl ．Acids Res. 18:7305-7316（1991）（この各々は参考として本明細書中に 組み込まれる）を包含する、発表文献中に見つけることができる。 それらの配列は、典型的にはスイッチ領域のすぐ上流の少なくとも約50 bp 、 好ましくはスイッチ領域の上流の少なくとも約200 bp、より好ましくはスイッチ 領域の少なくとも約200〜1000 bp またはそれ以上を含む。適当な配列はヒトＳ γ1,Ｓγ2,Ｓγ3,Ｓγ4,Ｓα1,Ｓα2 およびＳεスイッチ領域のすぐ上流に存在 するが、ヒトＳγ1 およびＳγ3 スイッチ領域のすぐ上流の配列が好ましい。そ れに代えて、又はそれと組合わせて、ネズミＩｇスイッチ配列を用いることがで きる。トランスジェニック非−ヒト動物と同じ種のＩｇスイッチ配列を用いるの が、しばしば有利である。特に、インターフェロン（ＩＦＮ）誘導性転写調節要 素、例えばＩＦＮ誘導性エンハンサーがトランスジーンスイッチ配列のすぐ上流 に含まれるのが好ましい。 プロモーターに加えて、主にＢ系列細胞中で機能する他の調節配列が使われる 。例えば、軽鎖トランスジーン上の好ましくはＪセグメントと定常領域遺伝子セ グメントとの間に置かれた軽鎖エンハンサー配列は、トランスジーンの発現を増 強し、それによって対立遺伝子排除を促進するために使われる。重鎖トランスジ ーンの場合、調節エンハンサーも使われる。そのような調節配列は、トランスジ ーンの転写および翻訳を最大にし、その結果対立遺伝子排除を誘導しそして比較 的高いレベルのトランスジーン発現を提供するために用いられる。 上述のプロモーターおよびエンハンサー調節配列は包括的に記載されているけ れども、そのような調節配列は非ヒト動物に対して異種であることができ、異種 トランスジーン免疫グロブリン遺伝子セグメントが得られるゲノムＤＮＡから誘 導することができる。あるいは、そのような調節遺伝子セグメントは、重鎖およ び軽鎖トランスジーンを含む、非ヒト動物または密接に関連した種のゲノム中の 対応する調節配列から誘導される。 好ましい態様では、遺伝子セグメントはヒトから誘導される。そのような重鎖 および軽鎖トランスジーンを含有するトランスジェニック非ヒト動物は、そのよ うな動物に投与される特異抗原に対してIg介在型免疫応答を開始することができ る。そのような動物中では異種ヒト抗体を産生することのできるＢ細胞が産生さ れる。不死化後、および適当なモノクローナル抗体（Mab ）、例えばハイブリド ーマの選択後、治療用ヒトモノクローナル抗体の源が提供される。そういったヒ トMab は、ヒトに療法的に投与した時に実質的に減少された免疫原性を有する。 好ましい態様はヒト遺伝子セグメントを含む重鎖および軽鎖トランスジーンの 作製を開示するけれども、本発明はそれに限定されない。この点に関しては、本 明細書中に記載される教示は、ヒト以外の種からの免疫グロブリン遺伝子セグメ ントの使用に合わせて容易に改変できると理解すべきである。例えば、本発明の 抗体によるヒトの療法的処置に加えて、適切な遺伝子セグメントによりコードさ れた療法的抗体を用いて獣医科学において使用するためのモノクローナル抗体を 生成せしめることができる。再配列されたトランスジーン 別の態様では、トランスジェニック非ヒト動物は、トランスジェニック動物の 生殖細胞中に機能的に少なくとも１つの再配列された異種重鎖免疫グロブリント ランスジーンを含有する。そのような動物は上述のような再配列された重鎖トラ ンスジーンを発現する一次レパートリーＢ細胞を含有する。そのようなＢ細胞は 、好ましくは、抗原と接触すると体細胞突然変異を受け、該抗原に対して高い親 和性を特異性を有する異種抗体を形成することができる。前記再配列されたトラ ンスジーンは、少なくとも２つのＣH遺伝子とイソタイプスイッチに必要な関連 配列を含むだろう。 本発明はまた、重鎖および軽鎖トランスジーンを有する生殖細胞を含み、前記 トランスジーンのうちの一方が再配列された遺伝子セグメントを含み、他方が再 配列されていない遺伝子セグメントを含む、トランスジェニック動物にも関する 。そのような動物では、重鎖トランスジーンが少なくとも２つのＣH遺伝子とイ ソタイプスイッチに必要な関連配列を有するだろう。 本発明は更に、本発明のトランスジーンにおいて使うことができる合成可変領 域遺伝子セグメントレパートリーを作製する方法にも関する。該方法は、免疫グ ロブリンＶセグメントＤＮＡの集団を作製することを含んで成る。ここで前記Ｖ セグメントＤＮＡの各々は免疫グロブリンＶセグメントをコードし、そして各末 端に制限エンドヌクレアーゼの開裂認識部位を含む。免疫グロブリンＶセグメン トＤＮＡの前記集団は、その後、鎖状に連結されて合成免疫グロブリンＶセグメ ントレパートリーを形成する。そのような合成可変領域重鎖トランスジーンは、 少なくとも２つのＣH遺伝子とイソタイプスイッチに必要な関連配列を有するだ ろう。イソタイプスイッチ Ｂリンパ球の発達過程において、該細胞は、生産的に再配列されたＶHおよび ＶL領域によって決定される結合特異性を有するIgＭを最初に産生する。続いて 、各Ｂ細胞とその子孫の細胞が同じＬおよびＨ鎖Ｖ領域を有する抗体を合成する が、それらはＨ鎖のイソタイプをスイッチすることができる。 μまたはδ定常領域の使用は、大部分は、IgＭおよびIgＤを単一細胞中で同時 発現できるようにする、交互スプライシングによって決定される。その他の重鎖 イソタイプ（γ，αおよびε）は、遺伝子再配列現象がＣμおよびＣδエクソン を欠失させた後で本質的にのみ発現される。この遺伝子再配列過程はイソタイプ スイッチと呼ばれ、典型的には各重鎖遺伝子（δを除く）のすぐ上流に置かれた いわゆるスイッチセグメントの間での組換えによって起こる。 個々のスイッチセグメントは長さが 2〜10 kb であり、主として短い反復配列 から成る。組換えの正確な位置は個々のクラススイッチ現象ごとに異なる。cDNA 由来のＣHプローブを用いるサザンブロット法または溶液ハイブリダイゼーショ ン速度論を使った実験は、スイッチが細胞からのＣH配列の消失に関係し得るこ とを確証した。 μ遺伝子のスイッチ（Ｓ）領域、Ｓμは、コード配列の約１〜２kb５′側に位 置し、そして（GAGCT）n（GGGGT）の形の配列の多数の縦列反復から成る。ここ でｎは通常２〜５であるが、17ほどの大きさに及ぶことができる。〔T．Nikaido ら、Nature，292: 845-848(1981)を参照のこと。〕 他のＣH遺伝子の５′にも 、数キロ塩基対に及ぶ同様な内部反復性スイッチ配列が見つかっている。Ｓα領 域は配列決定されており、縦列に反復した80 bp の相同性単位から成ることが判 明した。一方、Ｓ2a，Ｓ2bおよびＳ3は全て、互いに非常に類似している反復し た49 bp の相同性単位を含む〔P．Szurek ら、J.Immunol，135: 620-626（1985 ）およびT．Nikaidoら、J ．Biol．Chem. 257:7322- 7329（1982）を参照のこと ；これらは参考として本明細書中に組み込まれる〕。全ての配列決定されたＳ領 域は、Ｓμ遺伝子の基本的反復配列であるペンタマーGAGCT およびGGGGT の多数 の存在を含む〔T．Nikaidoら、J ．Biol．Chem. 257: 7322-7329（1982）；これ は参考として本明細書中に組み込まれる〕；他のＳ領域では、それらのペンタマ ーはＳμのようには正確に縦列に反復されていないが代わりに大きな反復単位中 に埋もれている。Ｓγ1領域は追加の高次構造を有し、即ち、２つの直接反復配 列が49 bp の縦列反復の２つのクラスターの各々に隣接する〔M.R.Mowattら、J ．Immunol. 136: 2674-2683（1986）を参照のこと；これは引用して不明細書中 に組み込まれる〕。 ヒトＨ鎖遺伝子のスイッチ領域はそれらのマウス同族体に非常に類似している ことがわかっている。実際、ＣH遺伝子の５′側のヒトクローンとマウスクロー ンの間の類似性はＳ領域に限られることがわかっており、これは、それらの領域 の生物学的重要性を確証する事実である。 μ遺伝子とα遺伝子の間のスイッチ組換えは複合Ｓμ−Ｓα配列をもたらす。 典型的には、組換えが常に起こるような特異部位はＳμ領域中にも他のＳ領域中 にも存在しない。 一般に、Ｖ−Ｊ組換えの酵素的機構とは異なり、スイッチ機構は、明らかに生 殖細胞Ｓ前駆体の反復相同領域の種々の整列を適応させることができ、次いで該 配列を異なる位置で一直線上に連結することができる。〔T.H. Rabbitts ら、Nu cleic Acids Res. 9: 4509-4524（1981）およびJ．Ravetchら、Proc ．Natl．Aca d. Sci. USA, 77:6734-6738（1980）を参照のこと；これらは参考として本明細 書中に組み込まれる。〕 特定のイソタイプへのスイッチを選択的に活性化する機構の詳細は未知である 。リンホカインやサイトカインのような外因性影響物質はイソタイプ特異的レコ ンビナーゼを増加調節するかもしれないが、この酵素機構はあらゆるイソタイプ へのスイッチを触媒し、そして特異性がこの酵素機構の標的を特定のスイッチ領 域に向けることにある可能性もある。 Ｔ細胞由来のリンホカインIL-4および IFNγは、幾つかのイソタイプの発現を 特異的に促進することが証明されている IL-4はIgＭ，IgＧ2a，IgＧ2bおよびIg Ｇ3 発現を減少させ、IgＥおよびIgＧ1 発現を増加させる；IFNγはIgＧ2a発現 を選択的に刺激し拮抗する一方、IgＥとIgＧ1 発現の増加を誘導する〔Coffman ら、J ．Immunol. 136: 949-954（1986）およびSnapper ら、Science 236: 944- 947(1987)；これらは参考として本明細書中に組み込まれる〕。 スイッチに関するＴ細胞作用に関係する実験のほとんどは、特定のスイッチ組 換えを有する細胞において観察される増加が事前スイッチされた細胞または事前 傾倒された細胞の選択を反映し得る可能性を無視することができなかった。しか し、最もありそうな説明はリンホカインが実際にスイッチ組換えを促進するとい うものである。 クラススイッチの誘導は、スイッチセグメントの上流で始まる繁殖不能転写物 (stelile transcript)に関係があるらしい〔Lutzekerら、Mol. Cell Biol. 8:18 49（1988）；Stavnezer ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:7704（1988）：E sserおよびRadbruch，EMBO J. 8: 483（1989）；Bertonら、Proc ．Natl．Acad.S ci．USA 86:2829（1989）；Rothmanら、Int ．Immunol．2:621（1990）；これら の各々は参考として本明細書中に組み込まれる〕。例えば、観察されるIL-4によ るγ１繁殖不能転写物の誘導および IFNγによる阻害は、IL-4がＢ細胞中でのγ １へのクラススイッチを促進し、IFNγがγ1発現を阻害するという観察結果と一 致する。従って、繁殖不能転写物の転写に影響を及ぼす調節配列の包含は、イソ タイプスイッチの速度にも影響を及ぼし得る。例えば、特定の繁殖不能転写物の 転写を増加せしめることが、典型的には近隣のスイッチ配列を伴うイソタイプス イッチ組換えの頻度を増加させると期待できる。 それらの理由により、トランスジーンがイソタイプに使用する予定の各スイッ チ領域の約1〜2 kb 上流以内に転写調節配列を含むことが望ましい。それらの転 写調節配列は、好ましくはプロモーターとエンハンサー要素を含み、より好まし くはスイッチ領域と生来関連している（即ち生殖細胞配置で存在する）５′隣接 （即ち上流）領域を含む。この５′隣接領域は、典型的には長さが少なくとも50 ヌクレオチド、好ましくは長さが少なくとも約200 ヌクレオチド、より好ましく は少なくとも500〜1000ヌクレオチドである。 １つのスイッチ領域からの５′隣接配列をトランスジーン構成物用の別のスイ ッチ領域に作用可能に連結させることができる（例えば、ヒトＳγ１スイッチか らの５′隣接配列をＳα1スイッチのすぐ上流に融合させることができ；ネズミ Ｓγ１フランキング領域をヒトγ１スイッチ配列の隣りに移殖することができ； あるいはネズミＳγ１スイッチをヒトγ１コード領域に移植することができる） けれども、或る態様では、トランスジーン構成物中に含まれる各スイッチ領域が 、天然に存在する生殖細胞配置においてすぐ上流に存在する５′隣接配列を有す ることが好ましい。 モノクローナル抗体 モノクローナル抗体は、当業者にとっては周知のさまざまな技術によって得る ことができる。簡単に言うと、望ましい抗原で免疫化された動物からの脾細胞を 、一般には骨髄腫細鉋との融合によって不死化させる。（Kchle及びMilstein，E ur ．J．Immunol. ，6 ; 511-519（1976）を参照のこと）。不死化の代替的方法と しては、エプスタインーバーウイルス、オンコ遺伝子又はレトロウイルスでの形 質転換、又はその他の当該技術分野において周知の方法が含まれる。 単一の不死化された細胞から発生したコロニーは、抗原に対する望ましい特異 性及び親和力を有する抗体の産生についてスクリーニングされ、かかる細胞によ り産生されるモノクローナル抗体の収量は、脊椎動物宿主の腹腔内への注入を含 むさまざまな技術によって増強できる。免疫グロブリンを産生するための動物の 免疫化、モノクローナル抗体の産生；プローブとしての使用を目的とした免疫グ ロブリンの標識付け,イムノアフィニティ精製及び免疫学的検定法を含め、これ らの技術分野で有効なさまざまな技法が、例えば、Harlow及びLane、抗体：その 研究室マニュアル 、Cold Spring Habor, New York（1988）の中で論述されてい る。トランスジェニック一次レパートリー Ａ．ヒト免疫グロブリン遺伝子座 トランスジーン機能のための重要な必要条件は、広範囲の抗原に対して二次免 疫応答を開始させるのに十分な程度に多様である一次抗体レパートリーの作製で ある。再配列された重鎖遺伝子は、シグナルペプチドエクソン、可変領域エクソ ン、および各々が数個のエクソンによりコードされる多ドメイン定常領域の縦列 整列領域から成る。定常領域遺伝子の各々は異なる免役グロブリンクラスの定常 部分をコードする。Ｂ細胞発達の間に、定常領域に近いＶ領域が欠失されて新規 重鎖クラスの発現をもたらす。各重鎖クラスについては、ＲＮＡスプライシング の別パターンが経膜型と分泌型の両方の免疫グロブリンをもたらす。 ヒト重鎖遺伝子座は、2 Mbにわたる約200 個のＶ遺伝子セグメント（今回のデ ーターは約50−100 Ｖ遺伝子セグメントの存在を支持している。）、約40 kb に わたる約30個のＤ遺伝子セグメント、3 kbの範囲内に密集した６個のＪセグメン ト、および約300 kbにわたる９個の定常領域遺伝子セグメントから成ると予想さ れる。全遺伝子座は、染色体14の長い方の腕の遠位部分約2.5 Mbに及ぶ（図４） 。 Ｂ．遺伝子断片トランスジーン 1．重鎖トランスジーン 好ましい態様では、免疫グロブリン重鎖および軽鎖トランスジーンは、ヒト由 来の再配列されていないゲノムＤＮＡを含んで成る。重鎖の場合、好ましいトラ ンスジーンは670 〜830 kbの長さを有するNotI断片を含んで成る。この断片の長 さは、３′制限部位が実際にマッピングされていないため、不明瞭である。しか しながら、α１とψα遺伝子セグメントとの間にあることが知られている。この 断片は、６つの既知ＶHファミリーの全部のメンバー、ＤおよびＪ遺伝子セグメ ント、並びにμ，δ，γ３．γ１およびα１定常領域を含む。Bermanら、EMBOJ. 7:727-738(1988)。このトランスジーンを含有するトランスジェニックマウス 系は、Ｂ細胞の発達に必要とされる重鎖クラス（IgＭ）を正しく発現し、そして ほとんどの抗原に対して二次応答を開始せしめのに十分な程多数のレパートリー と共に、少なくとも１つのスイッチされた重鎖クラス（IgＧ1）を発現する。 2．軽鎖トランスジーン ヒト軽鎖遺伝子座からの必要な遺伝子セグメントおよび調節配列を全て含有す るゲノム断片を同様に作製することができる。そのような構成物は本実施例中に 記載のようにして作製される。 Ｃ．生体内組換えにより細胞内的に作製されるトランスジーン 単一ＤＮＡ断片上の重鎖遺伝子座の全部または一部分を単離する必要はない。 例えば、ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座からの670-830 ko Not I 断片は、ト ランスジーン形成(transgenesis)の間に非ヒト動物の生体内で形成させることが で きる。そのような生体内トランスジーン作製は、２以上の重複するＤＮＡ断片を 非ヒト動物の胎児性核に導入することにより行われる。ＤＮＡ断片の重複部分は 、実質的に相同であるＤＮＡ配列を有する。胎児性核内に含まれるレコンビナー ゼに暴露されると、重複しているＤＮＡ断片が適切な方向において相同的に組み 換わって670-830 kbの Notl重鎖断片を形成する。 生体内トランスジーン作製は、そのサイズのために現存の技術による作製また ば操作が因難であるかまたは不可能である多数の免疫グロブリントランスジーン を形成せしめるのに使うことができると理解すべきである。例えば、生体内トラ ンスジーン作製は、ＹＡＣベクター〔MurrayおよびSzostak, Nature 305:189-19 2 (1983)〕により繰作することができるＤＮＡ断片よりも大きい免疫グロブリン トランスジーンを作製するのに有用である。そのような生体内トランスジーン作 製は、トランスジェニック非ヒト動物から成らない種の実質的に完全な免疫グロ ブリン遺伝子座を非ヒト動物中に導入する場合にも使うことができる。 ゲノム免疫グロブリントランスジーンを形成させることに加えて、実施例に記 載の如く「小遣伝子座」トランスジーンを形成させるのにも生体内相同組換えを 使うことかできる。 生体内トランスジーン作製・を利用する好ましい態様では、各々の重複するＤ ＮＡ断片は、好ましくは第一のＤＮＡ断片の末端部分と第二のＤＮＡ断片の末端 部分の間で重復する実質的に相同なＤＮＡ配列を有する。ＤＮＡ断片のそのよう な重復部分は、好ましくは約500 bp-約2000 bp、最も好ましくは1.0 kb〜2.0 kb を含む。生体円でトランスジーンを形成させるための重複ＤＮＡ断片の相同組換 えは、1992年3月19日に公開された「哺乳類細胞における相同性組換え (llomolo gous Recombination in Mammalian Cells)と称するPCT 公開WO 92/03917 に更に 詳しく記載されている。Ｄ．小遺伝子座トランスジーン 本明細１書中で使用する時、「免疫グロブリン小遺伝子座」なる用語は、通常 は 約150 kb未満、典型的には約25〜100 kbのＤＮＡ配列であって、前記ＤＮＡ配列 が少なくとも１つの実質的不連続性（例えば、相同ゲノムＤＮＡ配列に関して、 通常は少なくとも約 2〜5 kb、好ましくは10〜25 kbミたはそれ以上の欠失）を 有するような、次のものを各々少なくとも１つ含むＤＮＡ配列を言う：機能的可 変（Ｖ）這伝子セグメント、機能的運結（Ｊ）領域セグメント、少すくとも１つ の機能的定常（Ｃ）領域遣伝子セグメント、および重鎖小遺伝子座の場合には、 機能的多様性（Ｄ）領域セグメント。軽鎖小遺伝子座トランスジーンは、長さが 少なくとも25 kb、典型的には50〜80 kb であるだろう。重鎖トランスジーンは 、スイッチ領域に作用可能に連結された２つの定常領域を有する、典型的には約 70〜80 kb、好ましくは少なくとも約60 kb の長さであろう。更に、小遺伝子座 の個々の要素は好ましくは生殖細胞（ジァームライン）配置にあり、そして小遺 伝子座の該要素により完全にコードされる多様な抗原特異性を有する機能的抗体 分子を発現するように、トランスジェニック動物の前駆体Ｂ細胞において遺伝子 再配列を受けることができる。更に、少なくとも２つのＣH 遺伝子と必要なスイ ッチ配列とを含んで成る重鎖小遺伝子座は、典型的には、異なる免役グロブリン クラスの機能的抗体分子が生成されるように、イソタイプスイッチを受けること ができる。そのようなイソタイプスイッチは、トランスジェニック非ヒト動物内 に存在するＢ細胞中で生休内で起こるか、またはトランスジェニック非ヒト動物 から外植されたＢ細胞系列の培養細胞中で起こり得る。 他の好ましい態様では、免疫グロブリン重鎖および軽鎖トランスジーンはＶ-H , ＤおよびＪH 遺伝子セグメントを各々１つまたは復数並びにＣH 遺伝子を２つ 以上含んで成る。適当なタイプの遺伝子セグメントの少なくとも１つが小遺伝子 座トランスジーンに組み込まれる。重鎖トランスジーンのＣH セグメントに関し ては、トランスジーンが少なくとも１つのμ遣伝子セグメントと、少なくとも１ つの他の定常領域遺伝子セグメント、より好ましくはγ遣伝子セグメント、最も 好ましくはγ３またはγ１遺伝子セグメントとを含むことが好ましい。この優先 性は、コードされる免疫グロブリンのIgＭ形とIgＧ形の間のクラススイッチおよ び分泌形の高親和性非IgＭ免疫グロブリンの産生を考慮したものである。他の定 常領域遺伝子セグメント、例えばIgＤ，IgＡおよびIgＥの産生をコードするもの も使うことができる。 当業者は、重鎖ＣH 遺伝子の発生の順序が該ＣH 遺伝子の供与体として働く種 の生殖細胞において見つかる天然に存在する空間的順序とは異なるであろうトラ ンスジーンも作製するだろう。 更に、当業者は、１つの種の複数の個体からＣH 遺伝子を選択することができ （例えば、同種異系ＣH 遺伝子）、そしてイソタイプスイッチを受けることがで きる過剰のＣH 遣伝子として前記遣伝子をトランスジーン中に組み込むことがで きる。次いで、結果として生じたトランスジーン非ヒト勤動物は、或る態様では 、トランスジーンＣH 遺伝子を得た前記種に象徴されるアロタイプの全てを包含 する様々なクラスの抗体を生産することができる。 更にまた、当業者は、異なる種からＣH 遺伝子を選択してトランスジーン中に 組み込むことかできる。各ＣH 遺伝子と共に機能的スイッチ配列が含まれるが、 使用するスイッチ配列は必ずしもＣH 遺伝子の隣に天然に存在するものである必 要はない。種間のＣH 遺伝子組み合わせは、様々な種からのＣH 這伝子に相当す る多様はクラスの抗体を産生することのできるトランスジェニック非ヒト動物を もたらすだろう。腫間ＣH トランスジーンを含有するトランスジェニック非ヒト 動物は、獣医学用のモノクローナルを産生するハイブリドーマを作製するための Ｂ細胞の源として働くことができる。 ヒトの重鎖ｊ領域セグメントは、３kbのＤＮＡ長さにおいて密集した６個の機 能的Ｊセグメントこ３個の偽遺伝子を含んで成る。それが比較的小さいサイズで あることとそれらのセグメントがμ遺伝子およびδ遺伝子の５′部分と一緒に単 一の23 kb SFil／Soel断片として単離できること〔Sadoら、Biochem Biophys.R es.Commun. 154: 246-271 (1988)；これは参考として本明細書甲に組み込まれる ｊを仮定すれば、小遺伝子座構成物において全部のＪ領域遺伝子セグメントを使 うことが好ましい。更に、この断片はμ遺伝子とδ遺伝子の間の領域に広がるた め、μ発現に必要とされるシス結合した３′調節要素の全部を含むことが適当で ある。 更に、この断片は完全なＪ領域を含むため、重鎖エンハンサーとμスイッチ領 域を含む〔Mills ら、Nature 306:809(1983)；YancopoulosおよびAlt，AnnRev Immunol. 4:339-368(1986)；これらは参考として本明細書中に組み込まれる〕 。それは、ＶＤＪ結合を開始させて一次レパートリーＢ細胞を形成させる転写開 始部位も含む〔Yancopoulos およびAlt，Cell 40:271-281 (1985) ;これは参考 として本明細書中に組み込まれる〕。あるいは、23 kb SfiI/SpeI 断片の代わり に、Ｄ領域の一部を含む36 kb BssHII/SpeI 断片を使うことができる。そのよう な断片の使用は、効率的Ｄ−ｊ結合を促進させる５′隣接配列の量を増加させる 。 ヒトＤ領域は、縦列に結合した４または５個の相同な9 kbの亜領域から成る〔 Siebenlistら、Nature 294:631-635(1981)〕。各亜領域は10個までの個々のＤ セグメントを含む。それらのセグメントの一部はマッピングされており、それを 図４に示す。２つの異なる方策を使って小遺伝子座Ｄ領域を作製する。第一の方 策は、１つまたは２つの反復Ｄ亜領賊を含む短いＤＮＡの連続鎖の中に置かれた それらのＤセグメントのみを使うものである。候補となるのは、12個の個々のＤ セダメントを含む単一の15 kb断片である。 ＤＮＡのこの断片は２つの連続するEcoRI 断片から成り、そして完全に配列決 定されている〔Ichiharaら、EMBO J. 7:4141-4150(1988)〕。 12のＤセグメント が一次レバートリーに十分であろう。しかしなから、Ｄ領域の分散性質があると すれば、別の方策は、幾つかの不連続Ｄ断片含有断片を一緒に連結して、より多 数のセグメントを有する一層小型のＤＮＡ断片を作製することである。例えば、 特徴的な隣接ノナマーまたはヘブタマー配列（前傾）の存在により、および文献 への参照により、追加のＤセグメント遺伝子を同定することができる。 重鎖小遺伝子座トランスジーンを作製するのには、少なくとも１つ、好ましく は複数のＶ遺伝子セグメントが使われる。隣接配列を伴うまたは伴わない、再配 列されたまたは再配列されていないＶセグメントは、「異種性抗体を生産するこ とができるトランスジェニック非−ヒト動物」（Transgenic Non-Human AnimalC apable of Producing Heterologous Artibodies）と称する。1992年3月19日に公 開されたPCT 公開WO 1092/03918 に記載の通りに単離することができる。 隣接配列を伴うまたは伴わない、再配列されたまたは再配列されていないＶセ グメント、Ｄセグメント、ＪセグメントおよびＣ遺伝子は、1992年3月19日に公 開されたPCT 公開WO 1092/03918 に記載の通りに単することができる。 小遺伝子座軽鎖トランスジーンは、ヒトλまたはκ免疫グロブリン遺伝子座か ら同様にして作製することができる。すなわち、例えば、複数のＤＮＡ断片、少 なくとも２つ、３つまたは４つのＤＮＡ断片から、Ｖ，Ｄ，Ｊおよび定常領域配 列（各配列はヒト遺伝子配列に実質的に相同である）をコードする、例えば約75 kbの、免疫グロブリン重鎖小遺伝子座トランスジーン構成物を形成せしめること ができる。好ましくは、前記配列は転写調節配列に作用可能に連結され、そして 再配列を受けることができる。２以上の適当に置かれた定常領域配列（例えばμ およびγ）およびスイッチ領域では、スイッチ組換えも起こる。典型的な軽鎖ト ランスジーン構成物は、1990年8月29日出願の同時係属出願 USS 07/574,748に記 載の通りに、ヒトＤＮＡに実質的に相同であり且つ再配列を受けることのできる 複数のＤＮＡ断片から同様に形成せしめることができる。 Ｅ．イソタイプスイッチを受けることができるトランスジーン構成物 理想的には、クラススイッチを受けることになっているとランスジーン構成物 は、繁殖不能転写物を調節するのに必要なシス作用性配列の全てを含むべきであ る。天然に存在するスイッチ領域並びに上流のプロモーターおよび調節配列（例 えばＩＦＮ誘導性要素）は、イソタイプスイッチを受けることかできるトランス ジーン構成物中に含まれる好ましいシス作用性配列である。スイッチ領域、好ま しくはヒトγ１スイッチ領域のすぐ上流の少なくとも約50塩基対、好ましくは少 なくとも約200 塩基対、より好ましくは少なくとも500 〜1000塩基対またはそれ 以上の配列が、スイッチ配列、好ましくはヒトγ１スイッチ配列に作用可能に連 結されるだろう。更に、スイッチ領域は、特定のスイッチ領域の隣に天然には存 在しないＣH 遺伝子の上流に（且つ近隣に）連結せしめることができる。例えば 、限定のつもりでないが、ヒトγ１スイッチ領域をヒトα２ＣH 遺伝子の上流に 連結してもよく、またはマウスγ１スイッチ領域をヒトＣH 遺伝子に連結しても よい。 トランスジェニックマウスにおいて非古典的イソタイプスイッチ（例えばδ− 関連欠失）を得るための別法は、ヒトμ遺伝子に隣接する400 bpの直接反復配列 (σμおよびεμ)〔Yasui ら、Eur J. Immunol. 19:1399(1989)〕の包含を伴う 。それらの二配列の間の相同組換えはIgＤ型のみのＢ細胞においてμ遺伝子を欠 失せしめる。重鎖トランスジーンは、次の式によって表すことができる： (VH ) x-(D) y-(JH ) z-(SO ) m-(CI) n-[(T)-(SA ) P-(C2)]q 上式中、 ＶH は重鎖可変領域遺伝子でセグメントであり、 Ｄは重鎖Ｄ（多様性）領域遺伝子セグメントであり、 ＪH は重鎖Ｊ（連結）領域遺伝子セグメントであり、 ＳO はイソタイブスイッチが起こるようなＳd 受容体領域セグメントとの組換 え現象に参加することのできる供与体領域セグメントであり、 ＣI はＢ細胞発達ににおいて使われるイソタイプ（例えばμまたはδ）をコー ト゛する重鎖定常領域遺伝子セグメントであり、 Ｔは少なくともプロモーターを含有するシス作用性転写調節領域セグメントで あり、 Ｓ4 はイソタイプスイッチが起こるような選択されたＳO 供与体領域セグメン トとの組換え現象に参加することのできる受容体領肢セグメントであり、 Ｃ2 はμ以外のイソタイプ（例えばγ1 ,γ2 ,γ3 ,γ4 ,α1 ,α2 ,ε ）をコードする封鎖定常領域遺伝子セグメントであり、ｘ, ｙ, ｚ, ｍ, ｎ, ｐ およびｑは整数であり、ｘは１〜100 、ｎは０〜10、ｙは１〜50、ｐは１〜10、 ｚは１〜50、ｑは０〜50、ｍは０〜10である。典型的には、トランスジーンがイ ソタイプスイッチを受けることができる時、ｑは少なくとも１であり、ｍは少な くとも１であり、ｎは少なくとも１であり、そしてｍはｎと等しいかまたはそれ より大きくなければならない。 ＶH , Ｄ, ＪH , ＳO , Ｃ1 , Ｔ, ＳA およびＣ2 セグメントは様々な種、好 ましくは哺乳動物種、より好ましくはヒトおよびマウス生殖細胞ＤＮＡから選択 することができる。 ＶH セグメントは、ヒト生殖細胞中に天然に存在するＶH セグメント、例えば ＶＨ251から選択することができる。典型的には、約２個のＶH セグメント、好 ましくは約４個、より好ましくは少なくとも約10個のＶH セグメントが含まれる 。 典型的には少なくとも１個のＤセグメントか含まれるが、奸ましくは少なくと も10個のＤセグメントか含まれ、態様によっては、10個以上のＤセグメントが含 まれる。幾つかの好ましい態様はヒトＤセグメントを含む。 典型的には少なくとも１個のＪH セグメントがトランスジーンに含まれるが、 約６個のＪH セグメントを含むことが好ましく、幾つかの好ましい態様は約６個 以上のＪH セグメントを含み、非ヒトＪH セグメントを１つも含まない。 ＳO セグメントは該トランスジーンのＳA セグメントとの組換え現象に参加す ることかできる供与体領域である。古典的なイソタイプスイッチでは、ＳO およ びＳA 領域はＳμ, Ｓγ1 , Ｓγ2 , Ｓγ3 , Ｓγ4 , Ｓα, Ｓα2 および ＳE といったスイッチ領域である。好ましくは、スイッチ領或はマウスまたはヒトで あり、より好ましくはＳO がヒトまたはマウスＳμであり、ＳA がヒトまたはマ ウスＳγ1 である。非古典的イソタイプスイッチ（δ関連欠失）でが、ＳO およ びＳA 領域は、好ましくはヒトμ遺伝子に隣接する400 塩基対の直接復配列で ある。 Ｃ1 セグメントは、典型的にはμまたはδ遺伝子であり、好ましくはμ遺伝子 であり、より好ましくはヒトまたはマウスμ遺伝子である。 Ｔセグメントは、典型的には天然に存在する（即ち生殖細胞）スイッチ領域に 隣接する５′隣接配列を含む。Ｔセグメントは典型的には長さが少なくとも約50 ヌクレオチド、好ましくは長さが少なくとも約200 ヌクレオチド、より好ましく は長さが少なくとも500 〜1000ヌクレオチドである。好ましくはＴセグメントは 、生殖細胞配置においてヒトまたはマウススイッチ領域のすぐ上流に存在する５ ′隣接配列である。前記Ｔセグメントが動物の生殖細胞に天然に存在しないシス 作用性転写調節配列（例えばウイルスのエンハンサーおよひプロモーター、例え ばSV40、アデノウイルス、および真核細胞に感染する他のウイルス中に見つかる もの）を含んでもよいことは当業者にとって明白である。 Ｃ2 セグメントは、典型的にはγ1 , γ2 , γ 3 , γ4 , α1 , α2 または εＣ11 遺伝子であり、好ましくはそれらのイソタイプのヒトＣ11 遺伝子であり 、より好ましくはヒトγ1 またはγ3 遺云子である。様々な種からの下流（スイ ッチされる）イソタイプ遺伝子としてマウスγ24およびγ2bを使ってもよい。重 鎖トランスジーンが免疫グロブリン重鎖小遺伝子座を含む場合、該トランスジー ンの全長は典型的には150 キロ塩基対未満であろう。 一般に、該トランスジーンは、生来の重鎖Ｉｇ遺伝子座以外のものであるだろ う。例えば、不必要な領域の欠失または他の種からの対応領域との置換か存在す るだろう。 Ｆ.Ｉｇトランスジーン中の機能的.イソタイプスイッチを決定する方法 トランスジェニック非ヒト動物におけるイソタイプスイッチの発生は、当業界 で公知である任意の方法によって同定することができる。好ましい態様としては 次のものが挙げられ、それらば単独でまたは組み合わせて使用される。 1. δ以外の少なくとも１つのトランスジーン下流ＣH 遺伝子に相同である配 列とトランスジーンＶH −ＤH −ＪH 再配列された遺伝子に相同である隣接配列 とを含有するmRNA転写物の検出；そのような検出はノーザンハイブリダイゼーシ ョン、Ｓ1 ヌクレアーゼ保護アッセイ、ＰＣＲ増幅、cDNAクローニングまたはそ の他の方法によることができる。 2. トランスジェニック動物の血清中の、または該トランスジェニック動物の Ｂ細胞から作製したハイブリドーマ細胞の培養上清中の、下流ＣH 遺伝子により コードされる免疫グロブリンタンパク質の検出。ここで免疫化学的方法により、 そのようなタンパク質が機能的可変領域を含んで成ることを証明することもでき る。 3. トランスジェニック動物のＢ細胞からのＤＮＡ中の、またはハイブリドー マ細胞からのゲノムＤＮＡ中の、該トランスジーン中のイソタイプスイッチの発 生と一致するＤＮＡ再配列の検出。そのような検出はサザンブロットハイブリダ イゼーション、ＰＣＲ増幅、ゲノムクローニングまたは他の方法によって達成す ることができる。 4. イソタイプスイッチの他の徴候、例えば繁殖不能転写物の産生、スイッチ に関与する特徴的な酵素の産生（例えば「スイッチレコンビナーゼ」）、あるい は現行技術によって検出、測定または観察され得る他の徴候の同定。 各々のトランスジェニック系列はトランスジーンの異なる組み込み部位とトラ ンスジーン挿入断片の潜在的に異なる縦列整列を表し、そしてトランスジーンと 隣接ＤＮＡ配列の各々の異なる配置は遺伝子発現に影響を与え得るため、高レべ ルのヒト免疫グロブリン、特にＩgＧイノタイプのものを発現し、且つ最少コピ ー数の該トランスジーンを含有するマウスの系統を同定しそれを使用することが 好ましい。単一コピーのトランスジェニック動物は、起こり得る不完全な対立遺 伝子発現の問題を最少にする。 トランスジーンは典型的には宿主染色体ＤＮＡ中、最も普通には生殖細胞ＤＮ Ａ中に組み込まれ、そしてその後の生殖細胞系列トランスジェニック飼育用動物 の飼育によって繁殖される。しかしながら、実施者は、適宜および所望により、 当業界において既知であるかまたは後に開発される他のベクターおよびトランス ジェニック法に置換することができる。 内因性非ヒト重鎖恒常領域遺伝子に対するトランススイッチが起こって、キメ ラ重鎖及びかかるキメラヒト／マウス重鎖を含む抗体を産生する可能性がある。 かかるキメラ抗体は、本書で記述するいくつかの用途には望まれるかもしれない が、望ましくない場合もある。 Ｇ．内因性免疫グロブリン遺伝子鎖の機能的破壊 好結果に再配列された免疫グロブリン重鎖および軽鎖トランスジーンの発現は 、トランスジェニック非ヒト動物中の内因性免疫グロブリン遺伝子の再配列を抑 制することにより優性作用を有すると予想される。しかしながら、内因性抗体を 欠く非ヒト動物を生成せしめる別の方注は、内因性免疫グロブリン遺伝子座を突 然変異せしめることによるものである。胎児性幹細胞技術および相同組換えを使 って、内因性免疫グロブリンレパ−トリ−を容易に排除することができる。下記 はマウス免疫グロブリン遺伝子座の機能的破壊を説明する。しかしながら、開示 されるベクターおよび方法は、他の非ヒト動物における使用に合わぜて容易に改 変することができる。 簡単に言えば、この技術は、生殖細胞組織に分化することができる多分化能性 細胞系における、相同組換えによる遺伝子の不活性化を包含する。マウス免疫グ ロブリンの変更コピーを含むＤＮＡ構成物を胎児性幹細胞の核に導入する。その 細胞の一部において、導入されたＤＮＡマウス遺伝子の内因性コピーと組み換わ り、それを変更コピーで置き換える。新たに操作された遺伝的損傷を含む細胞を 宿主マウス胚に注入し、それを受容体の雌に再移植する。それらの胚の一部が変 異細胞系に完全に由来する生殖細胞を有するキメラマウスに発達する。従って、 キメラマウスを交配することにより、導入された遺伝的損傷を含むマウスの新規 系列を獲得することが可能である〔Capecchi (1989) Science, 244, 1288-1292 により概説されている〕。 マウスλ遺伝子座は免疫グロブリンのわずか５％に寄与するため、重鎖および ／またはκ軽鎖遺伝子座の不活性化で十分である。それらの遺伝子座の各々を破 壊するのには３つの方法があり、Ｊ領域の欠失、Ｊ−Ｃイント０ンエンハンサー の欠失、および終結コドンの導入による定常領域コード配列の破壊である。ＤＮ Ａ構成物デザインの見地から、最後の方法の選択が最も簡単である。μ遺伝子の 排除はＢ細胞の成熟を破壊し、それによっていずれかの機能的重鎖セグメントに クラススイッチすることを防ぐ。それらの遺伝子座を破壊（ノックアウト）する 方策を下記に概説する。 マウスμ-およびκ遺伝子を破壊するためには、Jaenischおよび共同研究者〔Z ijlstraら(1989), Nature, 342, 435-433〕によりマウスβ２ミクログロブリン 遺伝子の好結果の破壊に使われたデザインを基にした標的ベクターを用いる。プ ラスミドpnMClneo からネオマインン耐性遺伝子 (neo) を標的遺伝子のコード領 域中に挿入する。pMClneo 挿入断片は neo発現を指令するのにハイブリッドワイ ルスプロモーター／エンハンサー配列を使う。このプロモーターは胎児性幹細胞 中で活性である。従って、破壊（ノックアウト）構成物の組込みのための選択マ ーカーとしてneo を使うことができる。ランダム挿入現象に対する陰性選択マー カーしてHSV チミジンキナーゼ(tk)遺伝子を該構成物の末端に付加する（Zijlst raら、前掲）。 重鎖遺伝子座を破壊するための好ましい方策はＪ領域の削除である。この領或 はマウスではかなり小さく、わずか1.３ kbに及ぶ。遺伝子標的ベクタ−を作製 するために、分泌されるＡ定常領域エクソンの全部含む15 kb の KpnＩ断片を マウスゲノムライブラリ−から単離する。1.3 kbのＪ領賊をpMCleo からの1.1 k b挿入断片により置き換える。次いで該 KpnＩ断片の５′末端にHSV tk遺伝子を 付加する。相同組換えによるこの構成物の正しい組込みは、 neo遺伝子によるマ ウ スＪH 領域の置換をもたらすだろう。neo 遺伝子を基にしたプライマーとＤ頑域 中の KpnＩ部位の５′のマウス配列に相同のプライマーとを使って、ＰＣＲによ り組換え体をスクリーニングする。 あるいは、μ遺伝子のコード領域を破壊することにより重鎖遺伝子座を破壊（ ノックアウト）する。このアプローチは、上記のアプローチで使ったものと同じ 15 kb のKpnＩ断片を必要とする。pMIClneo からの1.1 kb挿入断片をエクソンII 中のユニークBamHI 部位のところに挿入し、そしてHSK tk遺伝子を３′KpnＩ末 端に付加する。neo 挿入断片の片側における二重交差（これはtk遺伝子を削除す る）を選択する。それらは、選択されたクローンのプールからＰＣＲ増幅により 検出される。ＰＣＲプライマーの一方はneo 配列に由来し、そして他方は標的ベ クターの外側のマウス配列に由来する。マウス免疫グロブリン遺伝子座の機能的 破壊は実施例に記載される。 Ｇ．内因性免疫グロブリン遺伝子座の発現の抑制 内因性Iｇ遺伝子座の機能的破壊に加えて、内因性Ｉｇ遺伝子座の発現を防ぐ 別の方法は抑制である。内因性Ｉｇ遺伝子の抑制は、１または複数の組み込まれ たトランスジーンから産生されるアンチセンスＲＮＡにより、アンチセンスオリ ゴヌクレオチドにより、および／または１または複数の内因性Ｉｇ鎖に特異的な 抗血清の投与により達成することができる。アンチセンスポリヌクレオチド 特定の遺伝子の発現を部分的または全体的に破壊するためにアンチセンスＲＮ Ａトランスジーンを使うことができる〔Pepin ら(1991)Nature 355: 725 ; Hel ene．C．およびToulme. J. (1990) Bioch- mica Biophys. Acta 1049: 99 ; Sto ut, J. およびCaskey, T.(1990)Somat. Cell Mol. Genet. 1G: 369 ; Munirら (1990) Somat. Cell Mol. Genet. 16: 383 ; これらの各々は参考として本明細 書中に組み込まれる］。 「アンチセンスポリヌクレオチド」は、（１）参照配列、例えば内因性IgのＣH またはＣL 領域配列の全部または一部に相捕的であり、且つ（２）相捕的な標 的配列、例えば染色体遺伝子座またはIg mRNA に特異的にハイブリダイズするポ リヌクレオチドである。そのような相補的アンチセンスポリヌクレオチドは、関 連する標的配列への特異的ハイブリダイゼーションが該ポリヌクレオチドの機能 的性質として保持される限り、ヌクレオチド置換、付那加、欠失または転位を含 んでもよい。 相補的アンチセンスポリヌクレオチドとしては、個々のmRNA種に特異的にハイ ブリダイズしそして該mRNA種の転写および／またはＲＮＡプロセシングおよび／ またはコードされるポリペプチドの翻訳を防ぐことができる、可溶性アンチセン スＲＮＡまたはＤＮＡオリゴヌクレオチドが挙げられる〔Ching ら、Proc. Nati . Acad ．Sci. USA 86.10006-10010 (1989)； Broderら、Ann. Int. Ned. 113:6 04-613 (1990)；Loreau ら、FEBS Letters 274: 53-56 (1990)；Holcenbergら 、WO091/11535；U.S.S.N 07/530,165（「新規ヒトCRIPRO遺伝子」）; WO091/098 65；WO91/04753；WO90/ 13641 およびEP 386563；これらの各々は参考として本 明細書中に組み込まれる〕。 アンテセンス配列は、長さが少なくとも約15の連続ヌクレオチド、より好まし くは長さが約30以上の連続ヌクレオチドの少なくとも１つの免疫グロブリン遺伝 子配列に相補的であるポリヌクレオチド配列である。しかしながら、或る態様で は、アンチセンスポリヌクレオチドの特性として特異的ハイブリダイセーション が保持される限り、アンチセンス配列は,相補的免疫グロブリン遺伝子配列に比 較して置換、付加または欠失を有することができる。一般的に、アンチセンス配 列は、免疫グロブリン鎖をコードするか、またはＤＮＡ再配列後に免疫グロブリ ン鎖をコードする潜在能力を有する内因性免疫グロブリン遺伝子配列に相補的で ある。ある場合には、免疫グロブリン遺伝子列に一致するセンス配列が特に転写 を妨害することによっで発現を抑制する働きをすることがある。 従ってアンチセンスポリヌクレオチドは、コードされるポリペプチドの産生を 阻害する。この点に関して、１または複数の内因性Ｉｇ遺伝子座の転写および／ または翻訳を阻害するアンチセンスポリヌクレオチドは、内因性Ｉｇ遺伝子座に よりコードされる免疫グロブリン鎖を産生する非ヒト動物の能力および／または 特異性を変更することができる。 アンチセンスポリヌクレオチドは、トランスフェクタント細胞またはトランス ジェニック細胞中、例えば個体の造血幹細胞集団の全部または一部を再構成する のに使われるトランスジェニック多分化能性造血幹細胞中、あるいはトランスジ ェニック非ヒト動物中で異種発現カセットから生産され得る。あるいは、アンチ センスポリヌクレオチドは、試験管内では培地中または生体内では循環系もしく は間質液中のいずれかの外部環境に投与される可溶性オリゴヌクレオチドを含ん で成ることができる。外部環境中に存在する可溶性アンチセンスオリゴヌクレオ チドは、細胞質に接近しそして特定のmRNA種の翻訳を阻害することが証明されて いる。 ある態様では、アンチセンスポリヌクレオチドがメチルホスホネート成分を含 んで成るか、あるいはホスホロチオネートまたはＯ−メチルリボヌクレオチドを 使用してもよく、そしてキメラオリゴヌクレオチドを使用してもよい〔Oagｌeら (1990) Nucleic Acids Res. 18: 4751〕。ある用途には、アンチセンスオリゴ ヌクレオチドはポリアミド核酸を含んてもよい〔Nielsen ら (1991) Science 25 4: 1497〕。アンチセンスポリヌクレオチドに関する一般法については、Antisen se RNA and DNA (1988)，D.A. Helton編, Cold Spring Harbor Labo-ratory, Co ld Spring Harbor, NYを参照のこと。 １または復数の配列に相補的なアンチセンスポリヌクレオチドを使って、転写 、ＲＮＡプロセシング、および／または同起源のmRNA種の翻訳を阻害し、それに よってコードされる各ポリペプチドの量を滅少させる。そのようなアンチセンス ポリヌクレオチドは、生体内で１または復数の内因性Ｉｇ遺伝子座の形成を阻害 することにより治療機能を提供することができる。 可溶性アンチセンスポリヌクレオチドとしてまたはアンチセンストランスジー ンから転写されたアンチセンスＲＮＡとしてのいずれにせよ、本発明のアンチセ ンスポリヌクレオチドは、生体内の生理的状態において内因性Ｉｇ配列に優先的 にハイブリダイズするように選択される。最も典型的には、選択されたアンチセ ンスポリヌクレオチドは、本発明の重鎖または軽鎖トランスジーンによりコード される異種Ｉｇ配列にそれほど多くはハイブリダイズしないだろう（即ち、アン チセンスオリゴヌクレオチドは約25〜35％以上トランスジーンＩｇｆ発現を阻害 しないであろう）。坑血清抑制 内因性Iｇ鎖発現の部分的または完全な抑制は、マウスに１または復数の内因 性Ｉｇ鎖に対する抗血清を注入することにより達成することができる〔(Weiss ら(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:211；これは参考として本明細書中 に組み込まれる〕。抗血清は、１または復数の内因性Ｉｇ鎖とは特異的に反応す るが本発明のＩｇトランスジーンによりコードされる異種Ｉｇ鎖とは最少の反応 性を有するかまたは全く反応性を持たないように選択される。よって、Weiss ら （前掲）のものにより代表されるようなスケジュールに従った選択抗血清の投与 は、内因性Ｉｇ鎖発現を抑制するが本発明のトランスジーンによりコードされる １または複数の異積Ｉｇ鎖の発現を許容する。 抗体適切な抗体共給源としては、以下のものが含まれる： （１）特異的にマウスμ, γ, κ又は入鎖に結合するものの本発明のヒトＩｇト ランスジ−ンによりコ−ドされるヒト免疫グロブリン鎖と反応しない、モノクロ −ナル抗体といったようなモノクロ−ナル抗体、 （２）混合物が、内因性Ｉｇ鎖の単一種上の多重エピトープと、多重内因住Ｉｇ 鎖（例えばマウスμ及ひマウスγ）と、又は多重エピトープ及び多重の鎖又は内 因性免疫グロブリンと結合するような、かかるモノクローナル抗体の混合物； （３）ポリクローナル抗血清又はその混合物。標準的には、かかる抗血清（単鎖 ）は、内因性Ｉｇ鎖の単一種（例えばマウスμ, マウスγ, マウスκ, マウスλ ）又は内因性Ｉｇ鎖の多重種）に結合するため単一特異性のものであり、最も好 ましくは、かかる抗結清は、本発明のトランスジーンによりコードされたヒト免 疫グロブリン鎖に対して無視できる結合力しか有していない：及び／又は （４）内因性Ｉｇ鎖の単一又は多重種に対し結合し、最も好ましくは不発明のト ランスジーンによりコードされるヒト免疫グロブリン領に対して無視できるほど の結合力しかもたないポリクローナル抗血清とモノクロ−ナル抗体の混合物。一 般にポリクローナル抗体が好まれ、かかる実質的に単一特異性のポリクローナル 抗体は、有利には、ヒト以外の動物種（例えばマウス）から誘導される抗体での 予備吸着及び／又ば例えば不動化されたヒトＩｇを含む親和性樹脂上での抗血清 又はその精製分画のアフィニティクロマトグラフィ（ここで結合された分画は抗 血清中の望ましい抗ヒトＩｇについて冨化されており、この結合分画は標準的に は低pH又はカオトロピック塩溶液という条件で溶離される）によりヒト免疫グロ ブリンに対して生成された抗血清から産生できる。 内因性の（例えばマウスの）免疫グロブリン鎖を発現するリンパ球の抗体によ り誘導された細胞の枯渇を増強させるため、細胞分裂及び／又は補体固定を利用 することができる。例えば、一実施態様においては、マウスＩｇを発現する外植 された造血細胞及び／又はヒトＩｇトランスジーンを宿すトランスジェニックマ ウスから得たＢ−系列のリンパ球の半ビボ枯渇のために抗体が利用される。かく して、造結細胞及び/又はＢ系列リンパ球が、ヒトＩｇトランスジーンを宿す（ 好ましくはヒト重鎖トランスジーン及びヒト軽鎖トランスジーンの両方を宿す） ヒト以外のトランスジェニック動物から外植され、外植された細胞は、（１）内 因性免疫グロブリン（例えばマウスμ及び／又はκ）に結合し、（２）トランス ジーンによりコードされるヒト免疫グロブリン鎖に対する実質的な結合力に欠け る抗体（単数又は複数）と共にインキュベートされる。 このような抗体は、明確化を期して「抑制抗体」と呼ばれる。外植された細胞 集団は、抑制抗体（単複）に結合する細胞を選択的に枯渇させられる，このよう な枯渇は、（１）末結合細胞から抑制抗体結合細胞を除去するための物理的分離 （例えば、抑制抗体に結合している細胞を不動化し除去するため固体支持体又は 磁気ビードに抑制抗体を結合させることができる）、（２）抑制抗体により結合 された細胞の抗体依存型細胞死滅（例えば、ADCC、補体固定、又は抑制抗体に連 関された毒素による）、及び（３）抑制抗体により誘発されたクローンアネルギ ー、などのさまざまな方法により達成できる。 往々にして、内因住Ｉｇ鎖産生の抗体抑制のために用いられる抗体は、補体を 固定することができる。ウサギ又はモルモットといったように半ビボ／インビト ロ 枯渇のための便利な補体源と充分反応するようにかかる抗体を選択できること が往々にして好ましい。インビボ枯渇については、一般に抑制抗体がヒト以外の トランスジェニック動物種においてエフェクター機能を有することが好ましい。 かくして、トランスジェニックマウスでの使用のためには、一般に、マウスエフ ェクター機能（例えば、ADCC及び補体固定）を含む抑制抗体が好ましい。 １変形実施態様においては、内因性免疫グロブリンを発現するリンパ球の半ビ ボ /インビトロ枯渇のために、予め定められた内因性免疫グロブリン鎖に特異的 に結合する抑制抗体が用いられる。ヒト免疫グロブリントランスジーンを宿すヒ ト以外のトランスジェニック動物からの細胞外植体（例えばリンパ球試料）は抑 制抗体と接触させられ、抑制抗体に特異的に結合する細胞は枯渇させられ（例え ば、不動化、補体固定などにより）、かくして内因性（非ヒト）免疫グロブリン を発現する細胞（例えばマウスＩｇを発現するリンパ球）内で枯渇された細胞副 次集団を生成する。 結果として得られた枯渇したリンパ球集団（Ｔ細胞、ヒトＩｇ−陽性Ｂ細胞な ど）は、内因性抗体を産生する能力が実質的に無い同じ種の免疫適合性ある（す なわちNHC 適合性ある）ヒト以外の動物（例えばSCIOマウス、RAG-１又はRAG-２ ノックアウトマウス）の体内へとトランスファさせることができる。再構成され た動物（マウス）を次に抗原で免疫化させ（又は外稙体を提供したドナー動物を 免疫化するのに使用した抗原を用いて再免疫化させる）、高親和性（親和性成熟 した）抗体及びかかる抗体を産生するＢ細胞を得ることができる。かかるＢ細胞 は、従来の細胞融合によりハイブリドーマを生成するのに使用でき、スクリーニ ングできる。抗体抑制はその他の内因性Ｉｇの失活／抑制方法（例えばＪH ノッ クアウト、ＣH ノックアウト、Ｄ−領域切除、アンチセンス抑制、補償されたフ レームシフト失活）と組合わせて使用することもできる。 完全な内因性Ｉｇ遺伝子座失活 或る種の実施態様では、ヒト可変領域及び非ヒト（例えばマウス）恒常領域を 含むハイブリッド免疫グロブリン鎖が形成され得ないような形で（例えばトラン スジーン及び内因性Ｉｇ配列の間のトランス切換えにより）、内因性Ｉｇ遺伝子 座の完全な失活を行なうことが望ましい。ＪH 領域においてのみ機能的に分断さ れている（原文with→which の誤り）内因性重鎖対立遺伝子を支持するノックア ウトマウスは、標準的にはトランスジーンによりコードされた再配置されたヒト 可変領域（ＶＤＪ)が内因性マウス恒常領域に連鎖された融合タンパク質として 発現されるトランススイッチを頻繁に示すが、その他のトランススイッチされた 連結も可能である。 この潜在的問題を克服するためには、一般に、制眼的な意味なく以下のものを 含むさまざまな方法のうちのいずれかにより内因性重鎖遺伝子座を完全に失活す ることが望ましい：（１）少なくとも１つ、好ましくは全ての内因性重鎖恒常領 域遺伝子を、相同組換えによって機能的に分断及び／又は欠失させること、（２ ）少なくとも１つ好ましくは全ての内因性重鎖恒常領域遺伝子を突然変異させて 、終止コドン（又はフレームシフト）をコードし、切形又はフレームシフトされ た産物（トランスススイッチされた場合）を産生すること、及び当業者にとって は明白なその他の方注及び戦略。重鎖恒常領域遺伝子及び／又はＤ−領域遺伝子 の実質的部分又は全ての欠失は、特に「ヒット・エンド・ラン」タイプなどの相 同組換えターゲティングベクターによる遂次欠失を含むさまざまな方法によって 達成できる。同様にして、内因性軽鎖恒常領域遺伝子を切除するための少なくと も １つの内因性軽鎖遺伝子（例えばκ）の機能的分断及び／又は欠失が往々にして 好ましい。 頻繁に、非相同トランスジーンがＪセグメント（単複）内のフレームシフト及 びトランスジーン恒常領域遺伝子のうちの単数又は複数のもの（好ましくは全て ）の初期領域（すなわちアミノ末端コーディング部分）内の補償フレームシフト （例えば原読取り枠を再生させるため）を含んでいるようなフレームシフトされ たトランスジーンを利用することが好ましい。内因性IgH遺伝子座恒常遺伝子（ 補償フレームシフトを含まないもの）に対するトランススイッチは、切形又はミ スセンス産物を結果としてもたらすことになり、その結果、トランススイッチさ れたＢ細胞は欠失されるか又は選択されなくなり、かくしてトランススイッチさ れた表現型は抑制されることになる。 内因性Ｉｇ遺伝子産物発現（例えば、マウス重鎖及び軽鎖配列）及び／又はト ランススイッチされた抗体（例えばヒト可変／マウス恒常キメラ抗体）の実質的 に完全な機能的失活を実施するためにはアンチセンス抑制及び抗体抑制も同様に 使用することができる。 内因性（例えばマウスの）Ｉｇ鎖発現の基本的に完全な抑制を行なうためには 、失活及び抑制戦略のさまざまな組台せを使用することが可能である。 （トランス−スイッチ） いくつかの変形態様においては、トランススイッチされた免疫グロブリンを産 生することが望ましい場合がある。例えば、このようなトランススイッチされた 重鎖は、キメラのものでありうる（すなわち非マウス（ヒト）可変領域及びマウ ス恒常領域）。このようなトランススイッチされたキメラ免疫グロブリンを含む 抗体は、非ヒト（例えばマウス）恒常領域を有することか望まれるさまざまな利 用分野（例えば、ヒト恒常領域を結合しない二次抗体の結合のためといったよう なマウス免疫学的決定因子の存在について宿主内のエフェクター機能の保持のた め）のために使用することができる。１例を挙げると、或る種の抗体に関して、 マウス可変領域能力範囲（レパートリー）に比べて、ヒト可変領域能力範囲が有 利である可能性がある。 おそらくは、ヒトＶH , Ｄ, ＪH , ＶL 及びＪL 遺伝子は、進化の間に、或る 種の進化上重要な抗原を結合する免疫グロブリンをコードするその能力のために 選択されてきたのであろう：マウスの能力範囲のための進化上選択的な圧力を提 供した抗原は、ヒトの能力範囲を形作るのに進化的圧力を提供した抗原と全く異 なるものである可能性がある。マウス恒常領域（例えばトランススイッチされた マウスの）アイソタイプと組合わされたときヒト可変領域能力範囲を有利なもの にするその他の能力範囲の利点も存在しうる。マウス恒常領或の存在は、ヒト恒 常領域に比べ利点を提供する可能性がある。 例えば、トランススイッチによりヒト可変領域に連鎖されたマウスγ恒常領域 は、予め定められた抗原（例えばヒトIL−２レセプター）と反応性あるキメラ抗 体（好ましくはモノクローナル）を、マウス内のＴリンパ球が機能的ヒトIL−２ レセプターを発現する移植細胞対宿主病のマウスモデルといったマウス疾病モデ ルの中でテストできるように、マウスエフェクター機能（例えばAOCC、マウス補 体固定）を有する抗体を提供しうる。これに続いて、ヒト可変領域コーディング 配列を（例えば供給源（ハイブリドーマクローン）からのｃＤＮＡクローニング 又はPCR 増復により）分離させ、望ましいヒト恒常領域をコードする配列にスプ ライシングして、免疫原性が好ましくは最小限にされているヒトの治療用途によ り適したものであるヒト配列抗体をコードすることが可能である。 結果として得られる完全にヒトのコーディング配列（単復）を有するポリヌク レオチド（単複）を宿主内で発現させ（例えば哺乳動物細胞中の発現ベクターか ら）、医薬品のため精製することが可能である。いくつかの利用分野では、マウ ス恒常領域をヒト恒常領域と置換することなく直接キメラ抗体を使用することが できる。トランススイッチされたキメラ抗体のその他の変形態様及び用途は、当 事者にとって明白であろう。 本発明は、一般にヒト重鎖トランスジーンと内因性マウス重鎖恒常領域遺伝子 の間のトランススイッチの結果として得られるキメラ抗体を発現するＢリンパ球 を含む、ヒト以外のトランスジェニック動物を提供する。このようなキメラ抗体 は、一般にマウスのスイッチされた（すなわち非μ、非δ）アイソタイプである マウス恒常領域とヒト配列可変領域を含む。予め定められた抗原に対するキメラ 抗体を作ることのできるヒト以外のトランスジェニック動物は、通常、ヒト可変 及びヒト恒常領域遺伝子をコードするヒト重鎖及びヒト軽鎖トランスジーンの両 方が組込まれた場合、完全にヒトの配列の抗体を作る能力もある。 最も標準的には、機能的に分断された重鎖遺伝子座及び／又は軽鎖遺伝子座に ついて同型接合であるが、トランススイッチできる単数又は複数の内因性重鎖恒 常領域遺伝子（例えばγ, α, ε）を保持し、頻繁にシス連鎖したエンハンサー を保持する。このようなマウスは、通常アシュバントと組合わせた形で予め定め られた抗原を用いて免疫化され、マウス恒常領域配列に連鎖されたヒト配列可変 領域から成る重鎖を含む検出可能な量のキメラ抗体を含む免疫応答が生み出され る。標準的には、かかる免疫化された動物の血清ば少なくとも約１μｇ／ml往々 にして約10μg/ ml以上、頻繁には30μg／ml以上、そして最高50〜100 μｇ／ｍ l以上の濃度でこのようなキメラ抗体を含みうる。 キメラヒト可変／マウス恒常領域重鎖を含む抗体を含む抗血清は標準的に、ヒ ト可変／ヒト恒常領域（完全ヒト配列）重鎖を含む抗体をも含んでいる。トラン ススイッチされたキメラ抗体は通常、（１）ヒト可変領域とマウス恒常領域（標 準的にはマウスガンマ）から成るキメラ重鎖及び（２）ヒトのトランスジーンコ ーディングを受けた軽鎖（標漂準的にはけカッパ）又はマウス軽鎖（標準的には カッパノックアウトパックグラウンド内のラムダ）を含んでいる。 かかるトランススイッチされたキメラ抗体は、一般に、約１×107 Ｍ-1以上、 好ましくは５×１07 Ｍ-1以上、より好ましくは１×10n Ｍ-1〜１×102 Ｍ-1以 上 の親和力で予め定められた抗原（例えば免疫原）に結合する。頻繁には、予め定 められた抗原は、ヒトタンパク質、例えばヒト細胞表面抗原（例えばCD４, CD８ ,IL−２レセプター、EGF レセプター、POGFレセプター）、その他のヒト生物学 的巨大分子（例えばトロンボモジュリン、プロテインＣ、炭水化物抗原、シアリ ルールイス抗原、Ｌ−セレクチン）又は非ヒト疾病関連巨大分子（例えば細菌性 LPS 、ビリオン・カプシドタンパク質又は外被糖タンパク質）などである。 本発明は、次のものを含むゲノムを含むヒト以外のトランスジェニック動物を 提供する：すなわち、（１）（例えば、機能的スイッチ組換え配列、標準的には 機能的エンハンサーに対するシス連鎖における）トランススイッチすることので きる少なくとも１つのマウス恒常領域遺伝子を含む同型接合で機能的に分断され た内因性重鎖遺伝子、（２）機能的ヒト重鎖可変領域をコードし発現するよう再 配置することができかつトランススイッチすることのできる（例えばシス連鎖さ れたＲＳＳを有する）ヒト重鎖トランスジーン；さらに任意には（３）機能的ヒ ト軽鎖可変領域をコードするべく再配置しかつヒト配列軽鎖を発現することので きるヒト軽鎖（例えばカッパ）トランスジーン；さらに任意には、（４）同型接 合で機能的に分断された内因性軽鎖遺伝子座（κ、好ましくはκ及びλ）；そし てさらに任意に（５）ヒトトランスジーンによりコードされたヒト配列可変領域 及ひ内因性マウス重鎖恒常領域遺伝子（例えばγ１, γ２ａ, γ２ｂ, γ３）に よりコードされたマウス恒常領域配列から成るキメラ重鎖を含む抗体を含む血清 。 かかるトランスジェニックマウスはさらに、約１×104 Ｍ-1以上、好ましくは 約５×104 Ｍ-1以上、より好ましくは１×107 Ｍ-1〜１×102 Ｍ-1以上の親和力 で、予め定められたヒト抗原（例えば、CD４, CD８, CBA ）に結合するキメラ抗 体を含む血清を含みうる。頻繁には、こうして産生されたモノクローナル抗体か 少なくとも８×107 Ｍ-1の親和力をもつハイプリドーマを作ることかできる。往 々にして非ヒト抗体に結合することができる、マウス恒常領域とヒト可変領域か ら成る重鎖を含むキメラ抗体が同様に血清中に、又はハイプリドーマから分泌さ れた抗体として、存在しうる。 いくつかの変形態様においては、無傷の重鎖恒常領域遺伝子を保持する失活し た内因性マウス重鎖遺伝子座を有し、トランススイッチできるヒト重鎖トランス ジーンを有し、任意には単数又は複数の失活した内因性マウス軽鎖遺伝子座を伴 い、ヒト軽鎖トランスジーンをも有するトランスジェニックマウスを生成するこ とが望ましい。かかるマウスは有利にも、トランススイッチにより、完全にヒト の重鎖を含む抗体及びキメラ（ヒト可変／マウス恒常）重鎖を含む抗体を交互に 発現することのできるＢ細胞を産生することができる。このマウスの血清には、 完全にヒトの重鎖を含む抗体及び、好ましくは完全にヒトの軽鎖と組合わせた状 態でキメラ（ヒト可変／マウス恒常）重鎖を含む抗体を含む抗体が含まれる。ハ イブリドーマは、このマウスのＢ細胞から生成されうる。 一般にこのようなキメラ抗体はトランススイッチにより生成でき、ここで、イ ンピボ で産生能あるＶ−Ｄ−Ｊ再配置によりコードされるヒト可変領域及びヒト 恒常領域、標準的にはヒトμをコードするヒトトランスジーンは、非トランスジ ーン免疫グロブリン恒常遺伝子スイッチ配列（ＲＳＳ）でのスイッチ組換えを受 け、かくしで、標準的に内因性マウス免疫グロブリン重鎖恒常領域又は第２のト ランスジーン上でコードされた非相同（例えばヒト）重鎖恒常領域である、前記 トランスジーンによりコードされていないヒト重鎖恒常領域とトランスジーンコ ーデイングを受けたヒト可変領域を作動的に連結させる。シスースイッチという のは、トランスジーン内のＲＳＳ要索の組換えによるアイソタイプスイッチのこ とであるが、トランススイッチには、往々にしてトランスジーンを宿す染色体と は異なる染色体上で、トランスジーンＲＳＳとこのトランスジーンの外側のＲＳ Ｓ要その間での組換えが関与する。 トランススイッチは、一般に、発現されたトランスジーン重鎖恒常領域遺伝子 と、（非μアイソタイプ、標準的にはγの）内因性マウス恒常領域遺伝子のＲＳ Ｓ又は往々にして別々の染色体上に組込まれている第２のトランスジーン上に含 まれたヒト恒常領域遺伝子のＲＳＳのいずれか一方の間で起こる。 トランススイッチが第１の、発現されたトランスジーン重鎖恒常領域遺伝子（ 例えばμ）のＲＳＳと、第２のトランスジーン上に含まれたヒト重鎖恒常領域遺 伝子のＲＳＳの間で起こる場合、実質的に完全にヒトの配列をもつ非キメラ抗体 が産生される。制眼的な意味のない例として、ヒト重鎖恒常領域（例えば、γ１ ）及び作動的に連鎖されたＲＳＳ（例えばγＩＲＳＳ）をコードするポリヌクレ オチドを、トランスジーンコーディングと受けたヒトμ鎖を含む抗体を発現する トランスジェニックマウスのＢ細胞（又はＢ細胞集団）から生成されたハイブリ ドーマ細胞の集団内に導入（例えばトランスフェクション）することができる。 結果として得られたハイブリドーマ細胞を、導入されたポリヌクレオチドの存 在について、及び／又は、ヒトμ鎖の可変領域（イディオタイプ／抗原反応性） を有しかつ導入されたポリヌクレオチド配列（例えば、ヒトγ１）によりコード される恒常領域をもつ重鎖を含むトランススイッチされた抗体の発現について、 選択することができる。トランスジーンにコードされたヒトμ鎖のＲＳＳと下流 のアイソタイプ（例えばγ１）をコードする導入されたポリヌクレオチドのＲＳ Ｓの間のトランススイッチ組換えは、かくしてトランススイッチされた抗体を生 成することかできる。 本発明はと同様に、（１）トランススイッチすることのできる少なくとも１つ のマウス恒常領域遺伝子（例えばγ２ａ, γ２ｂ, γ１, γ３）を含む、同型接 合で機能的に分離された内因性重鎖遺伝子座、（２）機能的ヒト重鎖可変領域を コードするべく再配置しヒト配列重鎖を発現することができ、かつアイソタイプ スイッチ（及ビ／又はトランススイッチ）を受けることのできるヒト重鎖トラン スジーン；さらに任意には（３）機能的ヒト軽（例えはカッパ）鎖可変領域をコ ードするべく再配置しヒト配列軽鎖を発現することができるヒト軽鎖（例えばカ ッパ）トランスジーン、そしてさらに任意には（４）同型接合で機能的に分断さ れた内因性軽鎖遺伝子座（標準的にはκ、好ましくはκとλの両方）、そしてさ らに任意には（５）ヒトトランスジーンによりコードされたヒト配列可変領域及 び内因性マウス重鎖恒常領域遺伝子（例えば、γ１, γ２ａ, γ２ｂ, γ３）に よりコードされるマウス恒常領域配列から成るキメラ重鎖を含む抗体を含む血清 、を含むゲノムを含むトランスジェニックマウスを予め定められた抗原で免疫化 する段階を含む、このようなトランススイッチされたキメラ抗体を産生するため の方法も提供している。 親和性標識：スイッチされたアイソタイプについての巽択 有利なことに、体細胞突然変異のプロセスは、トランススイッチ（及びシスス イッチ）と結びつけられる。体細胞突然変異は、Ｂ細胞のクローン後代によりコ ードされる抗体親和力の範囲を拡張する。例えば、スイッチ（トランス−又はシ ス−）を受けたハイブリドーマ細胞により産生された抗体は、スイッチを受けな かったハイブリドーマ細胞内に存在するよりも広い抗原結合親和力範囲を示す。 従って、第１のヒト重鎖恒常領域（例えばμ）に対するポリペプチド結合におい て第１のヒト重鎖可変領域を含む重鎖を含む第１の抗体を発現するハイブリドー マ細胞集団（標準的にはクローンの）を、第２の重鎖恒常領域（例えはヒトγ、 α又はε恒常領域）に対するポリペプチド結合において前記第１のヒト重鎖可変 領域を含む重鎖を含む抗体を発現するハイブリドーマ細抱クローン変異株につい てスクリーニングすることができる。 かかるクローン変異株は、インビトロでシススイッチを生成する天然クローン 変異によって、又はＴ細胞誘導されたリンホカイン（例えばIL−４及びＩＦＮ- γ）といったアイソタイプスイッチを促進する作用物質の投与を通してといった ようなクラススイッチ（トランス−又はシス−）の誘発によって、又はトランス スイッチのための基質として役立つべき非相同（例えばヒト）重鎖恒常領域遺伝 子及ひ機能的ＲＳＳを含むポリヌクレオチドの導入によって、又は上述のものの 組合せなどによって、産生させることかできる。往々にして、作動的に連鎖され たＲＳＳを伴うヒト下流アイソタイプ恒常領域（例えばγ１, γ３など）を含む ポリヌクレオチドが同様に、ハイブリドーマ細胞内に導入され、トランス・スイ ッチメカニズムを介してアイソタイプスイッヂを促進する。 クラススイッチ及び親和性成熟は、本発明のトランスジェニック動物から誘導 されたＢ細胞の同じ集団内で発生する。従って、クラススイッチされたＢ細胞（ 又はそれから誘導されたハイブリドーマ）の同定を、高親和力のモノクローナル 抗体を得るための１つのスクリーニング段階として使用することができる。シス −スイッチ（トランスジーン内スイッチ）、トランススイッチ又はその両方とい ったクラススイッチ事象を容易にするため、さまざまなアプローチを利用するこ とができる。例えば、付随するＲＳＳ要素及びスイッチ調節要素（例えば不稔写 しプロモーター）を伴うμ及ひγの両方の恒常領域遺伝子を含む単一の連続ヒト ゲノミックフラグメントを、トランスジーンとして使用することができる。 しかしながら、望まれる単一の隣接するヒトゲノミックフラグメントの一部分 は、例えばクローニング宿主などの中で複製されるときの不安定さの問題などに より、効果的にクローニングすることが困難でありうる：特にδとγ３の間の領 域は、特にμ遺伝子、γ３遺伝子、Ｖ遺伝子、Ｄ遺伝子セグメント及びＪ遺伝子 セグメントを含む隣接するフラグメントのように効率良くクローニングしにくい ことが判明する可能性がある。 同様に例として、ヒトμ遺伝子、ヒトγ３遺伝子、ヒトＶ遺伝子（単復）、ヒ トＤ遺伝子セグメント及びヒトＪ遺伝子セグメントから成り、介入する（イント ロンの）又はその他の形で可欠な配列（例えば単数又は復数のＶ、Ｄ、及び／又 はＪセグメント及び／又は単数又は複数の非μ恒常領域遺伝子）の単数又は復数 の欠失を伴う、不連続のヒトトランスジーン（ミニ遺伝子）、がある。このよう なミニ遺伝子は、効率良い免疫グロブリンの発現及びスイッチのための必須要素 の全てにまたがるゲノミックＤＮＡの単一の隣接セグメントを分離することに比 べて、いくつかの利点を有する。 例えば、このようなミニ遺伝子は、クローニングし難い配列（例えば、不安定 配列、毒物配列など）を内含しうるＤＮＡの大きい断片を分離する必要性を無く する。さらに、シス−又はトランス−スイッチのためのアイソタイプスイッチの ために必要な要素（例えば、ヒトγ不稔写しプロモータ）を含むミニ遺伝子座は 、有利にもインビボで体細胞突然変異及びクラススイッチを受けることができる 。多くの真核性ＤＮＡ配列がクローニングし難いものであることが立証されてい るため、可欠配列を削除することが有利であることが判明する。 一変形態様においては、高い結合親和力（例えば１×107 Ｍ-1以上、好ましく は１×108 Ｍ-1以上、より好ましくは１×109 Ｍ-1以上）をもつ抗体を産生する ハイブリドーマクローンは、産生力ある（枠内）Ｖ−Ｄ−Ｊ再配置を受けること ができる内因性マウス重鎖遺伝子座が実質的に欠如しアイソタイプスイッチを行 なうことのできる（以上参照）ヒト重鎖トランスジーンを宿すトランスジェニッ クマウスのＢ細胞から誘導されたハイブリドーマ細胞のプールから、ヒト（又は マウス）非μ重鎖恒常領域に対するポリペプチド結合においてヒト配列重鎖可変 領域を含む重鎖を含む抗体を発現するハイブリドーマを選択することによって得 られる。これらの抗体は、インビボ又は細胞培養中でのシス−スィッチ及び／又 はトランス−スイッチの結果として産生される「スイッチされた重鎖」を含むこ とから、「スイッチされた抗体」と呼ばれる。 スイッチされた抗体を産生するハイブリドーマは、一般に、体細胞突然変異プ ロセスを受けており、このハイブリドーマのブールは一般により広い抗原結合親 和力範囲を有することになり、この中から高親和力の抗体を分泌するハイブリド ーマクローンを選択することができる。標準的には、予め決定された抗原につい て実質的な結合親和力（１×107 Ｍ-1〜１×108 Ｍ-1以上）をもつヒト配列抗体 を分泌し、このヒト配列抗体がヒト免疫グロブリン可変領域（単復）を含んでい るようなハイブリドーマを、２段階プロセスを含む方方により選択することかで きる。１つの段階は、（例えば、スイッチされた重鎖に特異的に結合しスイッチ されていないアイソタイプ、例えばμ、に対して実質的に結合しない不動化され た免疫グロブリンに対しハイブリドーマ細胞を結合することにより）、スイッチ された重領を含む免疫グロブリンを分泌するハイブリドーマ細胞を同定し分離す ることにある。 もう１つの段階は、（例えばハイブリドーマクローン上清のELISA 、標識づけ された抗原を用いたFACS分析などにより）実質的な結合親和力で予め定められた 抗原に結合するハイブリドーマ細胞を同定することにある。標準的には、スイッ チされた抗体を分泌するハイブリドーマの選択は，予め定められた抗原を結合す るハイブリドーマ細胞を同定する前に行なわれる。予め定められた抗原に対する 実質的な結合親和力をもつスイッチされた抗体を発現するハイブリドーマ細胞が 分離され、標準的には個々の選択されたクローンとして当該技術分野において既 知の適切な成長条件下で培養される。任意には、この方法には、モノクローナル 抗体の発現に適した条件下で前記選択されたクローンを培養する段階が含まれる 。このモノクローナル抗体を収集し、これを治療、予防及び／又は診断の目的で 投与することができる。 往々にして、選択されたハイブリドーマクローンは、予め定められた抗原に結 合する（又はこれに対する結合力を付与する）免疫グロブリン（例えば可変領域 ）をコードする免疫グロブリン配列を分離するめたのＤＮＡ又はＲＮＡ原として 役立ちうる。これに続いて、ヒト可変領域コーディング配列を分離し（例えばPC R 増幅又は供給源（ハイブリドーマクローン）からのｃＤＮＡクローニングによ る）、好ましくは免疫原性が最小限にされるヒトの治療用途により適したヒト配 列抗体をコードするべく望ましいヒト恒常領域をコードする配列に対しスプライ シングする。結果として得られた完全にヒトのコーディング配列（単復）をもつ ポリヌクレオチド（単複）を宿主細胞（例えば哺乳細胞内の発現ベクターから） の中で発現させ、医薬品のために精製することが可能である。 キセノ（異種）エンハンサー ヒト免疫グロブリン（例えば重鎖）をコードすることのできる非相同トランス ジーンは、有利にも、マウスゲノムから誘導されていない、及び／又は非相同ト ランスジーンのエキソンとシスで自然に結びつけられていないシス−連鎖された エンハンサーを含んでいる。例えば、ヒトκトランスジーン（例えばκミニ遺伝 子座）は有利にも、ヒトＶK 遺伝子、ヒトｊK 遺伝子、ヒトＣK 遺伝こ及びキセ ノエンハンサーを含んでいる可能性があり、標準的には、このキセノエンハンサ ーは、標準的にＪK 遺伝子とＣK 遺伝子の間にあるか又はＣK 遺伝子の下流に位 置づけされた、ヒト重鎖イントロンエンハンサー及び／又はマウス重鎖イントロ ンエンハンサーを含む。例えば、マウス重鎖Ｊ−μイントロンエンハンサー(Ban erji etal．(1983) Cell 33: 729) は、プラスミドpkVe2 の 0,9kbのkba １フラ グメント上で分離されうる（下記参照）。 ヒト重鎖Ｊ−μイントロンエンハンサー（Hayday etal. (1984) Nature 307 3 34）は、1.4kbのMlu I/Hind IIIフラグメントとして分離されうる（下記参照） 。基本的にマウスＪ−μイントロンエンハンサーに対しシスで連鎖されたヒトＪ −μイントロンエンハンサーで構成されている組合されたきせノエンハンサーと いった、トランスジーンに対する転写的に活性なキセノエンハンサーの付加は、 特にこのトランスジーンかヒトκといった軽鎖をコードする場合、トランスジー ンの高い発現レベルを付与することかできる。同様に、ラット３′エンハンサー を、ヒト重鎖とコードできるミニ遺伝子座構成体内に有利にも含み入れることか できる。核酸 「実質的相同性」なる用語は、２つの核酸またはデザインしたその配列を最適 に整列しそして比較した時に、少なくとも約80％のヌクレオチド、通常は少なく とも約90％〜95％、より好ましくは少なくとも約98％〜99.5％のヌクレオチドが 同一であることを指摘する。あるいは、セグメントが選択的ハイブリダイゼーシ ョン条件下でその鎖の相補体にハイブリダイズする時、実質的相同性が存在する 。核酸は完全細胞中に、細胞溶解物中に、または部分的に精製されたもしくは実 質的に純枠な形で、存在することかできる。 核酸は、標準技術により、例えばアルカリ／SOS 処理、CsClバンド沈降、カラ ムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動および当業界で公知の他の方法 により、他の細胞成分または他の汚染物、例えば他の細胞性核酸もしくはタンパ ク質から分離精製された時、「単離され」または「実質的に純粋にされ」る。F. Ausubelら編、Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishingan d Wiley-Interscience, New York (1987)を参照のこと。 本発明の核酸組成物は、遺伝子配列を提供するための標準技術に従って、しば しばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは混合物のいずれかからの生来の配列（修飾さ れた制限部位等を除く）を変異せしめることができる。コード配列については、 それらの変異は、所望であればアミノ酸配列に影響してもよい。特に生来のＶ， Ｄ, Ｊ, 定常, スイッチおよび他の本明細書中に記載のそのような配列に実質的 に相同であるかまたはそれから誘導されるＤＮＡ配列が考えられる（ここで、「 誘導される」とは、ある配列が別の配列と同一であるかまたは変更されているこ とを指摘する）。 核酸はそれが別の核酸配列と機能的関係に置かれる時、「作用可能に連結され る」という。例えば、プロモーターまたはエンハンサーがコード配列の転写に作 用するならば、それらはコード配列に作用可能に連結されている。転写調節配列 については、作用可能に連桔されるとは、連結されるＤＮＡ配列が連続であって 、そして２種のタンパク質コード領域を連結することが必要な場合には、連続で あって且つ読み枠内であることを意味する。スイッチ配列については、作用可能 に連結されるとは、該配列がスイッチ組換えを行うことができることを意味する 。特定の好ましい態様 本発明の好ましい態様は、実施例５, ６, ８または14に記載の軽鎖トランスジ ーンの単一のコピーを含有する動物と交配させた実施例12に記載のトランスジー ン（例えばpHC1またはpHC2）の少なくとも１回のコピー、典型的には２〜10回の コピー、時には25〜50回以上のコピーを含有する動物、並びに実施例10に記載の ＪH 欠失動物から繁殖させた子孫である。動物はそれらの３つの特性について同型 接合に交配される。 そのような動物は次の遺伝子型を有する：再配列されていないヒト重鎖小遺伝 子座（実施例12に記載）の単一コピー（染色体の一倍体１組あたり）、再配列さ れたヒトκ軽鎖構成物（実施例14に記載）の単一コピー（染色体の一倍体１組あ たり）、および機能的ＪH セグメントの全部を除去する各内因性マウス重鎖遺伝 子座のところの欠失（実施例10に記載）。そのような動物は、ｊH セグメントの 欠失について同型接合であるマウスと交配させる（実施例10）と、ＪH 欠失につ いて同型接合でありそしてヒト重鎖および軽鎖構成物については半接合である子 孫を生産する。生じた動物に抗原を注入し、それらの抗原に対するヒトモノクロ ーナル抗体の産生に使う。 そのような動物がら単離されたＢ細胞は、それらが各遺伝子の単一コピーのみ を含むため、ヒト重鎖および軽鎖に関して単一特異性である。更に、それらはヒ トまたはマウス重鎖に関して単一特異性であろう。というのは、実施例９および 12に記載のようにして導入されたｊH 領域に広がる欠失によって、両万の内因性 マウス重鎖遺伝子コピーが非機能的であるためである。更に、Ｂ細胞の実質的部 分はヒトまたはマウス軽鎖に関して単一特異性であろう。何故なら、再配列され たヒトκ軽鎖遺伝子の単一コピーの発現が、Ｂ細胞の実質的部分における内因性 マウスκおよびλ鎖遺伝子の再配列を対立的におよび同位的に排除するだろうか らである。 好ましい態様のトランスジェニックマウスは、理想的には生来のマウスのもの と実質的に同じである、有意なレパートリーを有する免疫グロブリン産生を示す だろう。例えば、内因性Ig遺伝子が不活性化されている態様では、総免疫グロブ リンレベルは約0.1〜10mg／ml血清、好ましくは0.５〜5mg／ml、理想的には少な くとも約1.O mg／mlの範囲であろう。IgM からIgG にスイッチすることができる トランスジーンをトランスジェニックマウスに導入した時、血清尾IgG対IgMの 成熟マウス比は好ましくは約10：１である。もちろん、IgＧ対IgＭ比は、未成熟 マウスではずっと低いだろう。一般に、脾臓およびリンパ節Ｂ細胞の約10％より 多く、好ましくは40〜80％が、もっぱらヒトIgＧタンパク質のみを発現する。 レパートリーは理想的にば非トランスジェニックマウス中にしめされるものと ほぼ等しく、通常は少なくとも約10％ほど高く、好ましくは25〜50％またはそれ 以上高いだろう。マウスゲノム中に導入される異なるＶ, ＪおよびＤ領域の数に 主として依存して、通常少なくとも約1000種の異なる免疫グロブリン（理想的に はIgＧ）、好ましくは104 〜106 またはそれ以上の免疫グロブリンが産生される だろう。それらの免疫グロブリンば、典型的には、高抗原性タンパク質の約半分 またはそれ以上を認識するだろう。 抗原性タンパク質としては、ハトチトクロームＣ、ニワトリリゾチーム、アメ リカヤマゴボウのマイトジェン(PWM) 、ウシ血清アルブミン、アオガイヘモシア ニン、インフルエンザ赤血球凝集素、スタフィロコッカスブロテインＡ、マッコ ウクジラミオグロビン、インフルエンザノイラミニダーゼおよびλリプレッサー タンパク質が挙げられるがそれに限定されない。上記免疫グロブリンの幾つかは 、予め選択された抗原に対して、少なくとも約107 Ｍ -1、好ましくは108 Ｍ -1〜 109 Ｍ -1またはそれ以上の親和性を示すだろう。 いくつかの実施態様においては、予め定められた抗原タイプに対する抗対応答 において表わされるＶ遺伝子の選択を制限する目的で、予め定められた能力範囲 をもつマウスを生成することが好まれる可能性がある。予め定められた能力範囲 をもつ重鎖トランスジーンは例ば、人間ににおける予め定められた抗原タイプに 対する抗体応答で好んで用いられるヒトＶH 遺伝子を含みうる。代替的には、さ まざまな範囲により（例えば、予め定められた抗原に対する高い親和力のＶ領域 をコードする確率が低い；対細胞突然変異及び親和力激化を受ける傾向が弱い； 又は一定の人間に対する免疫原性をもつ）、規定された能力範囲からいくつかの ＶH 遺伝を除外することができる。 様々な重鎖または軽鎖遺伝子セグメントを含むトランスジーンの再配列の前に 、それらの遺伝子セグメントは、例えばハイブリダイゼーションまたはＤＮＡ配 列決定により、トランスジェニック動物以外の生物種に由来するものであると容 易に同定することができる。 本発明のトランスジェニックマウスは、ヒトの抗体が望ましいところの、予め 決められた抗原、例えば膜通過蛋白質、細胞表面巨大分子または他の適当な抗原 （例えば TNF、LPS 等）で免疫され得る。マウスは、トランスジーン内スウィッ チ組換え（シスースウィッチ）を経てクラススウィッチを受け、予め決められた 抗原と反応する免疫グロブリンを発現するＢ細胞を生成する。免疫グロブリンは 、ヒト配列抗体であり得、ここで、重鎖および軽鎖ポリペプチドがヒトトランス ジーン配列によってエンコードされ、これは体細胞突然変異によって誘導される 配列およびＶ領域組換えジョイント、ならびに生殖細胞系エンコード配列を含み ；これらのヒト配列免疫グロブリンは、ヒトVL またはVH遺伝子セグメントおよ びヒトJL または JL セグメントによってエンコードされたポリペプチド配列に 実質的に同一であるとされ得る。たとえ他の非生殖細胞系配列が、体細胞突然変 異および分化 V-JおよびV-D-J組換えジョイントの結果として存在し得るとして も。そのようなヒト配列抗体に関して、各鎖の可変領域は、ヒト生殖細胞系V、J および重鎖の場合にはＤ遺伝子セグメントによって、典型的には少なくとも80％ エンコードされており；しばしば少なくとも85％の可変領域が、トランスジーン に存在するヒト生殖細胞系配列によってエンコードされており；時には90または 95％またはそれ以上の可変領域配列がトランスジーンに存在するヒト生殖細胞系 配列によってエンコードされている。しかしながら、非生殖細胞系配列は体細胞 突然変異および VJおよび VDJ結合によって導入されるので、ヒト配列抗体はし ばしば、マウスの生殖細胞系におけるヒトトランスジーンに見出されるように、 ヒトV、D、またはＪ遺伝子セグメントによってエンコードされるいくつかの可変 領域配列 (および、あまりしばしばではないが、定常領域配列),を有するであろ う。典型的には、その ような非生殖細胞系配列（または個々のヌクレオチド配置）は、CRD の中もしく は近くに、または体細胞突然変異が集中する(cluster)ことが知られている領域 に、集中するであろう。 予め決められた抗原に結合するヒト配列抗体は、ヒト配列γ鎖（例えばγ1、 γ2a、γ2Bまたはγ3）およびヒト配列軽鎖（例えばκ）を含むヒト抗体が生成 されるようなイソタイプスウィッチから、結果として生じ得る。そのようなイソ タイプスウィッチされたヒト配列抗体はしばしば、典型的には可変領域に、特に 二次的な（引き続く）抗原チャレンジに続く、抗原によるＢ細胞の親和性突然変 異および選択の結果として、しばしば CDR の約10残基内で、１またはそれ以上 の体細胞突然変異を含む。これらの高親和性ヒト配列抗体は、少なくとも１ｘ109 Ｍ-1、典型的には少なくとも５ｘ109Ｍ-1、しばしば1ｘ１010 Ｍ-1より上、時 には５ｘ1010 Ｍ-1〜1ｘ1011 Ｍ-1またはそれ以上の結合親和性を有することが できる。そのような高い親和性ヒト配列抗体は、ヒト抗原、例えばヒト CD4等の ヒト巨大分子（例えばヒト膜通過または細胞表面蛋白質または他の細胞表面抗原 ）に対して高い結合親和性を有して、作られ得る。 そのようなマウスからのＢ細胞は、ヒト蛋白質たとえば CD4 等を含む種々の 抗原に対してモノクローナル高親和性（2ｘ109 Ｍ-1 より上）のヒト配列抗体を 発現するハイブリドーマを生じるのに使用され得る。これらのハイブリドーマは 、予め決められたヒト抗原への結合について、少なくとも２ｘ109Ｍ-1の親和性 定数（Ka）を有する免疫グロブリンを含む組成物を生じるために使用され得る。 ここで、前記免疫グロブリンは、つぎのものから成る： ヒト配列軽鎖であって、(１)ヒトVL遺伝予セグメントおよびヒトJLセグメ ントによりエンコードされたボリペプチド配列と実質的に同一のポリペプチド配 列を含む軽鎖可変領域および(２)ヒトCL遺伝子セグメントによりエンコードされ たポリペプチド配列と実質的に同一のポリぺプチド配列を含む軽鎖定常領域を含 むヒト配列軽鎖：および ヒト配列重鎖であって、(１)ヒトVH遺伝子セグメント、任意的に はＤ領域、およびヒト JH セグメントによりエンコードされたポリペプチド配列 と実質的に同一のポリペプチド配列を含む重鎖可変領域および(２)ヒト CH 遺伝 子セグメントによりエンコードされたボリペプチド配列と実質的に同一のポリペ プチド配列を含む定常領域を含むヒト配列重鎖。 しばしば、ヒト配列重鎖およびヒト配列軽鎖は、ヒト重鎖トランスジーンおよ びヒト軽鎖トランスジーンによって、それぞれ別々にエンコードされ、マウス細 胞のゲノムに組込まれる。しかしながら、両方の鎖が単一のトランスジーン上に エンコードされ得るか、または一方もしくは両方の鎖が多重トランスジーン上に エンコードされ得る。多重トランスジーンは、例えば、マウス生殖細胞における ヒト重鎖トランスジーンと同じ遺伝子座で、組込まれていないＶH配置を含む YA C からＶ遺伝子セグメントを誘導したヒト重鎖トランスジーン（例えばHC2）で ある。 １つの実施態様において、組成物は、Ｋ定常領域を有するヒト配列軽鎖および γ定常領域を有するヒト配列重鎖を含む免疫グロブリンを含む。 マウス（およびそれから誘導されたハイブリドーマ）は、予め決められたヒト 抗原への結合について少なくとも１ｘ1010 Ｍ-1の親和性定数（Ka）を有する免 疫グロブリンのための供給源である。ここで、該免疫グロブリンは、次のものか ら成る： ヒト配列軽鎖であって、(１)ヒト VL遺伝子セグメントおよびヒトJL セグ メントによりエンコードされたポリペプチド配列と実質的に同一のポリペプチド 配列を含む軽鎖可変領域および(２)ヒトＣL遺伝子セグメントによりエンコード されたポリペプチド配列と実質的に同一のポリペプチド配列を含む軽鎖定常領域 を含むヒト配列軽鎖；および ヒト配列重鎖であって、(１)ヒトＶH遺伝子セグメント、任意的にはＤ領 域、およびヒトJH七グメントによりエンコードされたポリペプチド配列と実質的 に同一のポリペプチド配列を含む重鎖可変領域および(２)ヒトＣH遺伝子セグメ ントによりエンコードされたポリペプチド配列と実質的に同一のポリペプチド配 列を含む定常領域を含むヒト配列重鎖。 本発明は、次のものを含むトランスジーンマウスを提供する：機能的 に分断された内因性の重鎖対立遺伝子のホモ接合の組、機能的に分断された内因 性の軽鎖対立遺伝子のホモ接合の組、ヘテロガス免疫グロブリン軽鎖トランスジ ーンの少なくとも１のコピー、およびヘテロガス免疫グロブリン重鎖トランスジ ーンの少なくとも１のコピー。ここで、該動物は、ヒト抗原との免疫に続いて抗 体応答をし、抗体応答は、予め決められたヒト抗原への結合について少なくとも ２ｘ109 Ｍ-1の親和性定数 (Ka)を有する免疫グロブリンを含み、該免疫グロブ リンは、次のものから成る： ヒト配列軽鎖であって、(１)ヒトＶL遺伝子セグメントおよびヒトＪLセグ メントによりエンコードされたポリペプチド配列と実質的に同一のポリペプチド 配列を含む軽鎖可変領域および(２)ヒトＣL遺伝子セグメントによりエンコード されたポリペプチド配列と実質的に同一のポリペプチド配列を含む軽鎖定常領域 を含むヒト配列軽鎖；および ヒト配列重鎖であって、(１)ヒトＶH遺伝子セグメント、任意的にはＤ領 域、およびヒトＪHセグメントによりエンコードされたボリペプチド配列と実質 的に同一のポリペプチド配列を含む重鎖可変領域および(２)ヒトＣH遺伝子セグ メントによりエンコードされたポリペプチド配列と実質的に同一のポリペプチド 配列を含む定常領域を含むヒト配列重鎖。 そのようなトランスジェニックマウスは、ヒトの少なくとも１の体細胞系上に 存在するヒトの表面もしくは膜通過蛋白質に結合するところのヒト配列免疫グロ ブリンを生成することができ、ここで、免疫グロブリンは、1.5ｘ10 Ｍ-1〜1.8 ｘ1010 Ｍ-1の親和性定数（Ka）で、該ヒトの表面もしくは膜通過蛋白質に結合 する。そのようなヒトの表面もしくは膜通過蛋白質の１例はCD4であるが、他の ものが所望の免疫原として使用され得る。 予め決められた抗原に対する高親和性のヒト配列抗体の発生は、組込まれたヒ ト免疫グロブリントランスジーンを含むゲノムを有するトランスジエニックマウ スにおいてヒト可変領域遺伝子セグメントのレパートリーを広げるための方法に よって促進され、該方法は、該組込まれたヒ ト免疫グロブリントランスジーンに存在しないＶ領域遺伝子セグメントを含むｖ 遺伝子トランスジーンをゲノムに導入することを含む。しばしば、このＶ領域ト ランスジーンは、ヒトゲノムに自然に生じ得るような、または組換え法によって 別々にスプライスされ得るような、ヒトのＶHまたはＶL（ＶK）遺伝子セグメン ト配置の部分を含む、酵母の人工的な染色体であり、これは、適切でない（out- of-order）または省略されたＶ遺伝子セグメントを包含し得る。しばしば、少な くとも５またはそれ以上の機能的ｖ遺伝子セグメントがYACに含まれる。この変 形において、Ｖレパートリー拡張法（V-repertoire expansion method)によって 生成されたトランスジェニックマウスを作ることが可能であり、ここで、マウス は、Ｖ領域トランスジーンに存在するＶ領域遺伝子セグメントによってエンコー ドされた可変領域配列およびヒトIgトランスジーンにエンコードされたＣ領域を 含む免疫グロブリン鎖を発現する。ｖレパートリー拡張法によって、少なくとも ５の明瞭なＶ遺伝子を有するトランスジェニックマウスが生成されることができ 、また、少なくとも約24のｖ遺伝子またはそれ以上を有するマウスが生成され得 る。もちろん、いくつかのＶ遺伝子セグメントは非機能的であることができ（例 えば偽遺伝子等)、これらのセグメントは保持されることができ、または所望な ら当業者に入手可能な組換え法により削除されることができる。 マウス生殖細胞系が、ＪおよびＣ遺伝子セグメントを含むヒトＩgトランスジ ーンにおいて実質的に存在しない、拡張されたＶセグメントレパートリーを有す る機能的YACを含むように処理されたなら、形質は増殖され、他の遺伝子バック グラウンドへと繁殖され得る。他の遺伝子バックグラウンドは、拡張されたＶセ グメントレパートリーを有する機能的YACが、異なるヒトＩｇトランスジーンを 有するマウス生殖細胞系へと繁殖されるところのバックグラウンドを包含する。 拡張されたＶセグメントレパートリーを有する多重の機能的YACは、生殖細胞系 へと繁殖されて、ヒトＩｇトランスジーン（または多重ヒトＩｇトランスジーン ）と共に働き得る。ここで、YACトランスジーンと称するけれども、ゲノムに 組込まれたときそのようなトランスジーンは、酵母の配列を実質的に欠き得る。 それは、例えば酵母での自律性の複製に必要とされる配列であり、そのような配 列は、もはや必要ではない、酵母での複製後に（すなわち、マウスES細胞または マウスプロザイゴート(prozygote)に導入されるに先立って)、遺伝子工学（例え ば制限消化およびパルス場ゲル電気泳動（pulsed-field qel electrophoresis） または他の適当な方法）によって任意的に除去され得る。 本発明はまた、ヒト配列免疫グロブリン発現の形質を増殖させる方法を提供し 、この方法は、ヒトIgトランスジーンを有し、かつ拡張されたＶセグメントレパ ートリーを有する機能的YACを任意的にまた有するトランスジェニックマウスを 繁殖させることを含む。ＶHおよびＶL遺伝子セグメントの両方が、YACの上に存 在し得る。トランスジェニックマウスは、実行する人が所望する任意のバックグ ラウンドへと繁殖され得、このバックグラウンドは、ヒトIgトランスジーンおよ び／または他のヒトリンパ球蛋白質をエンコードするトランスジーンを含む、他 のヒトトランスジーンを収容するバックグラウンドを包含する。 本発明はまた、拡張されたＶ領域レパートリーYACトランスジーンを有するト ランスジェニックマウスにより生成された高親和性ヒト配列免疫グロブリンを提 供する。 上記に本発明のトランスジェニック動物の好ましい態様を記戴したけれども、 他の態様は本明細書の開示により、そしてより特定的には実施例に記載のトラン スジーンにより定義される。トランスジェニック動物の４つのカテゴリーが定義 され得る I ．再配列されていない重鎖免疫グロブリントランスジーンと再配列された軽 鎖免疫グロブリントランスジーンとを含有するトランスジェニック動物。 II．再記列されていない重鎖免疫グロブリントランスジーンと再配列されてい ない軽鎖免疫グロブリントランスジーンとを含有するトランスジェニック動物。 III. 再配列された重鎖免疫グロブリントランスジーンと再配列されていない 軽鎖免役グロブリントランスジーンとを含有するトランスジェニック動物。 IV．再配列された重鎖免疫グロブリントランスジーンと再配列された軽鎖免疫 ダロブリントランスジーンとを含有するトランスジェニック動物。 トランスジェニック動物の上記カテゴリーの好ましい優先順序は、内因性軽鎖 遺伝子（または少なくともκ遺伝子）が相同組換え（または他の方法）により破 壊されている場合にはII＞II＞III＞IVであり、そして内因性軽鎖遺伝子が破壊 されておらず且つ対立遺伝子排除により優性になるに違いない場合には I＞II＞ III＞IVである。 先に議論したように、本発明は、ヒトの疾病の処置において有用なヒト配列モ ノクローナル抗体を提供する。モノクローナル抗体の治療上の使用は、例えばラ リックおよびボーラ、Journal of BiologicalResponse Modifiers,５：379−393 において議論されている。ヒトモノクローナル抗体の使用は、自己免疫疾患、癌 、感染症、移植組織の拒絶、血液障害例えば凝固障害、および他の疾病の処置を 包含する。 本発明の抗体は、蛋白質の送り出しについて医療分野で公知の任意の方法によ り、患者に投与され得る。抗体は、非経口投与（すなわち皮下、筋肉内、または 静脈内投与）に特に適している。本発明の薬剤組成物は、代替的薬剤送り出しア プローチを用いた投与にまた適している（例えばランガー、サイエンス、249：1 527−1533(1990)）。 非経口投与のための薬剤組成物は通常、受け入れ可能な担体、好ましくは水性 担体中に溶解されたモノクローナル抗体の溶液を含む。種々の水性担体が使用で き、例えば水、緩衝された水、0.4％塩水、0.3％グリシンなどである。これらの 溶液は、無菌であり、一般に微粒子物質を含まない。これらの組成物は、慣用の 公知の滅菌技術によって滅菌され得る。組成物は、適当な生理的条件に必要とさ れるような、薬剤的に受け入れ可能な補助的物質、例えばpH調整剤および緩衝剤 、緊張調整剤等、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化 カルシウム、乳酸ナトリウム等を含むことができる。これらの処方における抗体 の濃度は、広く変わり得る。すなわち、約 0.5 重量％より下から、通常0.1 重 量％以上、1.5 または 2.0 重量％までであり、選択された投与の 特定の様式にしたがって、第１に流体体積、粘度などに基づいて選択されるであ ろう。非経口投与可能な組成物を実際に調製する方法は、当業者に公知であるか または明らかであり、より詳細には、例えばレミントンの薬学科学（Remington' s Pharmaceutical Scinences）、第１７版、マックパブリッシングカンパニー、 イーストン、ペンシルバニア(1985)に記載されている。 本発明の抗体またはその混合物を含む組成物は、予防的および／または治療的 処置のために投与されることができる。治療的施与において、組成物は、治療す るのに十分な量、または感染およびその合併症を少なくとも部分的に阻止するの に十分な量で患者に投与される。これを成し遂げるのに適切な量は、「治療的に 有効な投与量」として定義される。この使用のために有効な量は一般に、約0.05 mg/kg体重〜約５mg／kg体重、好ましくは約0.2 mq/kq体重〜約1.5mg／kg体重の 範囲である。 いくつかの例においては、本発明の免疫グロブリン分子を変性してその生物学 的活性を変化させることが望ましいであろう。例えば、免疫グロブリンは、直接 または間接に、他の化学療法薬と一緒にすることができる。種々の化学療法薬が 標的にするために一緒にされ得る。例えば、一緒にされ得る抗炎症剤は、免疫調 節薬、血小板活性化因子（PAF）拮抗剤、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、リポキ シゲナーゼ阻害剤およびロイコトリエン拮抗剤を包含する。いくつかの好ましい 部分は、シクロスポリンＡ、インドメタシン、ナプロキセン、FK−506、マイコ フェノール酸等を含む。同様に、抗酸化剤例えばスーパーオキシドジスムターゼ が、リパーヒュージョン障害（reperfudion injury）の処置において有用である 。同様に、抗がん剤たとえばダウノマイシン、ドキソルビシン、ビンブラスチン 、ブレオマイシン等が標的にされ得る。 本発明のモノクローナル抗体はまた、患者の部位に対して両親媒性のもの（例 えばリポソーム）を標的にするのに使用され得る。これらの調製において、受け 渡しされるべき薬剤が、ヒトモノクローナル抗体が埋 め込まれるところのリポソームの部分として組込まれる。 本発明のヒト配列モノクローナル抗体は、それらが向けられた、予め決められ た抗原に特異的に結合するので、有用である。予め決められた抗原がヒト抗原（ すなわち、ヒト蛋白質またはそのフラグメント）であるとき、本発明のヒト免疫 グロブリンがまた非ヒト動物、特に薬剤試験（例えば生物学的活性、薬物動態学 および安全の臨床前試験）のためによく使用される動物で見出されたコグネイト 抗原に結合するなら、それは時には有利である。これらの動物は、マウス、ウサ ギ、ラット、イヌ、ブタ、および特に非ヒト霊長類例えばチンパンジー、無尾猿 (ape)および猿(monkey)（例えばレサスモンキー(Rhesus monkeyおよびシノモル ガスモンキー(cynomolgus monkey)）を含む。実験動物において抗原を認識する 能力は、免疫グロブリンの生物分布での特異的結合の効果を測定するのに特に有 用である。コグネイト抗原は、（i）ヒト抗原と実質的に同様の構造（例えばア ミノ酸配列）を有する（すなわち、動物のコグネイト蛋白質のアミノ酸配列は、 典型的にはヒト蛋白質に少なくとも約50％同一、通常少なくとも約70％同一、お よびしばしば少なくとも約80％またはそれ以上同一である）；（ii）ヒト抗原と 実質的に同じ機能を有する；および(iii)ヒト抗原と同じ細胞区画にしばしば見 出されるところの抗原である。ヒトおよび動物のコグネイト抗原は、典型的には （いつもではないが）同じ名前を有する。コグネイト抗原の例は、ヒトチューブ リンおよびマウスチューブリン、ヒト CD4 およびレサス(Rhesus)CD4およびヒト IgG およびラット IgG を含む。 別の観点では、本発明は、人工遺伝子によってエンコードされた少なくとも１ のポリペプチドを有する抗原結合ヒトmABを提供する。人工遺伝子は、細胞誘導 された鋳型核酸ストランド（例えば細菌性の細胞または免疫もしくはハイブリド ーマ細胞から得られた核酸鋳型）および人工遺伝子の（複製を経た）子孫を必要 としない化学的または酵素的方法によってイン ビボで合成された、ポリペプチ ドをエンコードする核酸セグメント、すなわち完全に合成された核酸を含む。 短い核酸をプライマー、リンカー等として使用することは遺伝子工学において ルーチンであるが、化学的および／または酵素的手段によって、30、50またはそ れ以上の塩基を長さに有する、完全に合成の蛋白質をエンコードする核酸を生成 することがまた可能である。本発明の人工遺伝子は、合成核酸領域と細胞誘導核 酸領域との両方を含み得る。人工遺伝子の合成核酸領域は一般に、少なくとも約 50塩基、しばしば少なくとも約100塩基、典型的には少なくとも約200塩基、より たびたびには少なくとも約250塩基、通常300塩基または400塩基より多い塩基の 長さがある。典型的には、合成核酸領域は、可変遺伝子セグメントまたはその部 分例えば CDR領域をエンコードし、定常領域は、細胞誘導された核酸によってエ ンコードされる。免疫グロブリンポリペプチド（すなわち、免疫グロブリン重鎖 および免疫グロブリン軽鎖）は、ポリペプチドをエンコードする人工遺伝子を用 いて簡便に発現され得る。通常、人工遺伝子は、転写プロモーター配列、例えば 免疫グロブリン遺伝子からまたはウィルス（例えばSV40、CMV、HIV、RSV）また はハイブリッドプロモーターから誘導されたプロモーター配列に動作可能に結合 される。人工遺伝子は、他の配列例えばポリアデニル化配列およびイントロンに もまた結合され得る。免疫グロブリンポリペプチドを発現するための１つの方法 は、免疫グロブリンポリペプチドの１つの領域（例えば可変領域またはその部分 ）をエンコードする合成核酸を、残留するセグメントまたは免疫グロブリン鎖の 部分（例えばμ、γ、γ2、γ3、γ4、δ、ε、α1、α2定常領域)、および任意 的にプロモーター（例えば CMV（サイトメガロウィルス）プロモーター)、ポリ アデニル化もしくは他の配列をエンコードするベクターへ挿入することを含む。 そのようなベクターは、細胞に導入されると、ベクター配列の細胞性転写および 翻訳が免疫グロブリンボリペプチドをもたらすように構成される。 機能的ヒト配列免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子およびポリペプチドは 、人工遺伝子を用いて構成され、予め決められた抗原に特異的に結合するような 所望の特異性を有する免疫グロブリンを生成するため に使用され得る。これは、予め決められた抗原で免疫されたトランスジェニック 動物からの細胞またはその動物から誘導されたハイブリドーマによって発現され たボリペプチドと実質的に同様の免疫グロブリンポリペプチドをエンコードする 人工遺伝子を構成することによって達成される。かくして、本発明は、免疫グロ ブリンポリペプチドをエンコードする人工遺伝子および、人工遺伝子を用いてヒ ト配列免疫グロブリンを生成する方法を提供する。 この方法に従って、トランスジェニック動物（例えば、機能的に分断された 内因性の重鎖対立遺伝子のホモ接合の組、機能的に分断された内因性の軽鎖対立 遺伝予のホモ接合の組、ヒト免疫グロブリン軽鎖トランスジーンの少なくとも１ つのコピー、およびヒト免疫グロブリン重鎖トランスジーンの少なくとも１つの コピーを有するトランスジェニックマウス）が、予め決められた抗原、例えばヒ ト蛋白質で免疫される。核酸、好ましくは mRNA は次に、集められまたは、免疫 グロブリン遺伝子転位が起こるところの細胞または細胞集団から分離され、免疫 グロブリンの重鎖および／または軽鎖（特にＶセグメント）をエンコードする核 酸又はその部分の配列が決定される。この配列情報は、人工遺伝子の配列のため の基礎として使用される。 配列の決定は一般に、興味ある遺伝子または cDNA の少なくとも部分、例え ば転位されたヒトトランスジーンまたは免疫グロブリンポリペプチドをエンコー ドする対応する cDNAの部分の分離を必要とする。通常、これは、ヒト免疫グロ ブリンポリペプチドをエンコードする DNA、または好ましくはmDNA(すなわち cD NA）のクローニングを必要とする。クローニングは、標準の技術（例えばサムブ ルックら、（1989年)、モレキュラークローニング:ア ラボラトリーガイド、第1 −3巻、コールド スプリングハーバープレスを見よ）を用いて行う。例えば、cD NA ライブラリーは、ポリA+ mRNA、好ましくは膜結合mRNA、および免疫グロブ リンボリペプチド遺伝子配列に特異的なプローブを用いてスクリーニングされた ライブラリーの逆転写によって構成される。しかしながら、好ま しい実施態様において、ポリメラーゼ鎖反応（pcR）が、興味のある免疫グロブ リン遺伝子セグメント（例えば軽鎖可変セグメント）をエンコードする cDNA（ または全長さの cDNA の部分）の増幅に使用される。ヒト免疫グロブリンポリペ プチド遺伝子の配列は当業者に容易に入手可能なので、ヒト免疫グロブリン遺伝 子またはそのセグメントを特異的にハイブリッド化するまたは増幅するプローブ またはPCRプライマーは容易に設計され得る。テイラーら、Nuc. Acids. Res., 2 0：6287（1992年）を見よ。さらに、トランスジェニックマウスのヒトトランス ジーンの配列はしばしば、実施する人には公知であり、プライマー配列は、トラ ンスジーンの適当な領域にハイブリッド化するように選択され得る。増幅された 配列は、任意の適当なベクターたとえば発現ベクター、ミニジーンベクター、ま たはファージ表示ベクターへと、容易にクローン化され得る。興味のある免疫グ ロブリンポリペプチドのある部分の配列を決定することが可能である限りは、使 用される特定のクローン化の方法は重要ではないことが正しく認識される。ここ で使用されるように、クローン化され、増幅され、標識を付けられた、またはさ もなければ、興味のある核酸の配列が決定され得るようにバックグラウンド核酸 から区別された核酸は、分離されたと考えられる。 クローニングおよび配列に使用されるRNAの１つの供給源は、トランスジェニ ックマウスからＢ細胞を得、かつＢ細胞を不死細胞に融合することによって製造 されるハイブリドーマである。ハイブリドーマを使用する利点は、それらが容易 にスクリーニングされ、興味のあるヒトモノクローナル抗体を生成するハイブリ ドーマが選択されることである。あるいは、RNAが、免疫した動物のＢ細胞（ま たは脾臓全部）から分離され得る。ハイブリドーマ以外の供給源が使用されると き、特異的結合特性を有する免疫グロブリンまたは免疫グロブリンポリペプチド をエンコードする配列についてスクリーンニングするのが好ましい。そのような スクリーニングの方法の１つは、ファージ表示技術の使用である。ファージ表示 は、例えばダウアーら、国際特許出願WO 91/17271、マックカ ファーティら、国際特許出願WO 92/01047、およびカトンおよびコプロウスキー 、Proc．Natl．Acad．Sci．USA、 87:6450-6454（199０年）に記載されている。 ファージ表示技術を用いた１つの実施態様において、免疫されたトランスジェニ ックマウスからのcDNA（例えば全脾臓cDNA）が分離され、ポリメラーゼ鎖反応が 、免疫グロブリンポリペプチドの部分、例えば CDR 領域をエンコードするcDNA 配列を増幅するのに使用され、かつ、増幅された配列は、ファージベクターに挿 入される。興味のあるペプチド、例えば所望の結合特性を有する可変領域ペプチ ドをエンコードするcDNAは、パニング(panning)のような標準の技術によって同 定される。 次に、増幅されたまたはクローン化された核酸の配列が決定される。典型的に は、免疫グロブリンポリペプチドの可変領域全部をエンコードする配列が決定さ れるが、しかし、時には可変領域の部分、例えばCDRをエンコードする部分のみ を配列することが適当であろう。典型的には、配列された部分は、少なくとも30 塩基の長さであり、よりしばしば、可変領域の長さの少なくとも約３分の１また は少なくとも約２分の１の長さについて基づいたコーディング（based coding） が配列されるであろう。 配列は、cDNAライブラリーから分離されたクローン上で、またはPCRが使用さ れるときは、増幅された配列のサブクローニングの後で、または増幅されたセグ メントの直接PCR配列によって、行われることができる。配列は標準技術（例え ばサムブルックら、(1989年)、モレキュラークローニング：ア ラボラトリーガ イド、第１−３巻、コールド スプリング ハーバー プレスおよびサンガー、Ｆ ら、(1977年)、proc．Natl.Acad. Sci. USA 74:5463-5467を見よ）を用いて行わ れる。クローン化された核酸の配列を、ヒト免疫グロブリン遺伝子およびcDNAの 公開された配列と比べることにより、配列された領域に依存して、(i)ハイブリ ドーマ免疫グロブリンポリペプチド（重鎖のイソタイプを含む）の生殖細胞系セ グメント使用(usage)および(ii)重鎖および軽鎖可変領域 の配列（N-領域添加および体細胞突然変異のプロセスから生じた配列を含む）を 、当業者は容易に決定することができる。免疫グロブリン遺伝予配列情報の１つ の供給源は、ナショナルセンターフォーバイオテクノロジーインフォメーション 、ナショナルライブラリーオブメディシン、ナショナル インスティテューツ オ ブ ヘルス、ベセスダ、エムディーである。 代替的な実施態様においては、興味のある免疫グロブリンのアミノ酸配列は、 直接蛋白質配列によって決定することができる。 免疫グロブリン発現遺伝子（すなわち、転位トランスジーン）の少なくとも一 部分に一致するかまたは実質的に同様の配列を有する人工遺伝子を構成すること ができる。同様に、人工遺伝子は、転位トランスジーンの配列された部分により エンコードされたポリペプチドに一致するかまたは実質的に同様であるところの ポリペプチドをエンコードすることができる。遺伝子コードの縮重は同じポリペ プチドが多重核酸配列によってエンコードされるのを許す。時には核酸配列を変 えて、例えば制限部位を誘導する、コドンの使用(usage)を変えて特定の発現系 を反映する、またはグリコシル化部位を除去することが望ましい。さらに、ハイ ブリドーマ配列における変化は、免疫グロブリンの特性（例えば結合特性）を変 えるために導入され得る。例えば、重鎖および軽鎖可変領域のCDR 領域において 特に、予め決められた抗原にたいしての免疫グロブリンの親和性を増加するため に、変化が導入される。 合成核酸を構成するための方法はよく知られている。完全に化学的合成が可能 であるが、一般に混合した化学的−酵素的合成が行われ、この方法では、化学的 に合成されたオリゴヌクレオチドがライゲーション反応および／またはポリメラ ーゼ鎖反応に使用されて、より長いポリヌクレオチドを作り上げる。もっとも好 ましい実施態様において、ボリメラーゼ鎖反応は、増幅の結果が人工遺伝子のた めに望ましい配列を有するDNA であるように選ばれたオーバーラッププライマー を用いて行われる。本発明のオリゴヌクレオチドは、固相または溶液中で合成さ れ得る。一 般に、固相合成が好ましい。ホスファイトトリエステル、ホスホトリエステルお よびＨ-ホスホネート化学によるオリゴヌクレオチドの固相合成についての工程 の詳細な記載は、広く入手可能である。例えば、イタクラ、米国特許第4,401,79 6号明細書：カルサーズら、米国特許第4,458,066号明細書および第4,500,707号 明細書；ビユーケイジら、Tetrahedron Lett.，22:1859−1862；マッチューチら 、Ｊ．Amer.Chem．Soc.，103：3185−3191（1981年）；カルサーズら、GeneticE ngineering，4：1−17（1982年）；ジョーンズ、第２章、アトキンソンら、第３ 章、およびスプロートら、第４章、ガイト編、オリゴヌクレオチド合成：ア プ ラクティカル アプローチ、IRLプレス、ワシントンＤ．Ｃ.(1984年）；フレーラ ーら、Tetrahedron Lett.，27：469−472（1986年）；フレーラーら、Nucleic A cids Res.，14：5399−5407（1986年）；シンハら、Tetrahedron Lett.,24：584 3−5846（1983年）；シンハら、Nucleic Acids Res.，12：4539−4557（1984年 ）を見よ。 人工遺伝子は細胞に導入され、発現されて、免疫グロブリンポリペプチドを生 成することができる。発現のための細胞タイプの選択は、多くの要因（例えば所 望される蛋白質グリコシル化のレベル）に依存するが、ヒト免疫グロブリンを分 泌することができる細胞が好ましい。特に好ましい細胞は、CHO細胞およびミエ ローマ誘導細胞例えばSP20およびNSO細胞系を含む。標準の細胞培養はよく知ら れており、また、ニューマンら、Biotechnology，10：1455−1460（1992年）； ベビントンら、Biotechnology，10：169−175（1992年）；コケットら、Biotech nology,8:662−667(1990年);カーターら、Biotechnology,10：163−167（1992年 ）に記載されている。核酸例えば人工遺伝子の導入方法はよく知られており、ト ランスフェクション（例えばエレクトロポレーションによってまたはリポソーム が媒介する）および形質転換を含む。導入された遺伝子の発現のためのシステム は、一般に、サムブルックらの上記の文献に記載されている。 免疫グロブリン（例えば IgG分子）がイン ビボで生成されるように、同じ細 胞中で２つの免疫グロブリンポリペプチド（すなわち、重鎖および軽鎖）を発現 することがしばしば望ましい。したがって、２つの人工遺伝子（すなわち、１つ は重鎖をエンコードし、１つは軽鎖をエンコードする）を細胞に導入するのが時 には望ましい。（この２つの人工遺伝子は単一のベクター上に導入され得る。） あるいは、１つの免疫グロブリンポリペプチドをエンコードする１つの人工遺伝 子が、遺伝子的に操作されて他の免疫グロブリンポリペプチドを発現する細胞に 導入され得る。 人工遺伝子がトランスフェクトされた細胞が増殖すると、人工遺伝子の合成核 酸部分全部が、複製および転写のための鋳型としてふるまうことが明らかである 。それにもかかわらず、子孫の遺伝子は、合成核酸由来であったであろう (すな わち、細胞誘導鋳型核酸ストランドを必要としない、化学的または酵素的方法に よってインビトロで合成された、ポリペプチドをエンコードする核酸分子)。そ して、ここで使用されているように、これはまた、人工遺伝子と考えられる。か くして、ハイブリドーマの、発現されたトランスジーンに対する人工遺伝子の合 成部分の関係は、情報的結合（すなわち、配列情報）はあるが、直接物理的結合 はないところのものである。 本発明はまた、治療的および診断的な適用において、特にヒトの疾病の処置に おいて有用な、抗 CD4 モノクローナル抗体を提供する。CD4は、胸腺細胞および Ｔ細胞にまず発現される細胞表面蛋白質であり、これは、Ｔ細胞機能および抗原 の MHC クラスII認識に含まれる。CD4 に向けられた抗体は、CD4 細胞の活性を 減らすようにふるまい、かくして、望まない自己免疫反応、炎症性の応答および 移植した器官の拒絶を減らす。 実際に、抗 CD4 mAb の投与は、動物モデルにおいて、自己免疫疾患を防ぐ（ ウォオフジーら、J．Exp．Med.，161：378−391 (1985年)）または逆転させる（ ウォフジーら、J．Immunol.，138：3247−3253(1987年)、ワルダーら、サイエン ス、227：415−417 (1985年)）ことが示された。ネズミまたはキメラの抗 CD4 m Ab の、リュウマチ様の関 節炎患者への投与は、臨床的恩恵を示した（ノックスら、Blood, 77:20−30（19 91年）；ゴールドベリーら、Ｊ．Autoimmunity，4：617−630；ヘルツォグら、 ランセット、ii：1461−1462；ホーネフら、Arthritis Rheum.,34:129−140;ラ イターら、Arthritis Rheum.,34：525−536；ウェンディングら、Ｊ．Rheum.，3 8：325−327；ファンデル ルツベら、ArthritisRheum.,38：1097−1106；ファ ン デル ルッベら、Arthritis Rheum.，36：1375−1379；モァランドら、Arthri tis Rheum.，36：307−318およびチョイら、Arthritis andRheumatism，39(1)： 52−56 (1996年))。さらに、上記したように、キメラ抗 CD4 mAbは、菌状息肉症 の患者においていくらかの臨床的効力を示した（ノックスら、（1991年）Blood ，77：20)。抗 CD4 抗体はまた、ニューマンら、バイオテクノロジー、10：1455 −1460（1992年）において議論されている。 実施例方法および材料 トランスジェニックマススは、llogan ら、“Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory （これは参考として 本明細書中に組み込まれる）に従って誘導される。 胎児性幹細胞は、発表された方法に従って操作される〔Terato- carcinomas a nd embryonic stem cells ： a practical approach, E.J. Robertson編, IRL, Press，Washington, D.C., 1987 ; Zjilstraら、Nature 342: 435-438 (1889)お よびSchwartzberg, P.ら、Science 246:799-803 (1939) ; この各々は参考とし て本明細書中に組み込まれる〕。 ＤＮＡクローニング方法は、J．Sambrookら、Molecular Cloning:A Laborator y Manual, 第２版, 1989, Cold Spring Harbor Labo-ratory Press, Cold Spri ng Harbor, N,Y,（これは参考として本明細書中に組み込まれる）に従って実施 される。 オリゴヌクレオチドは、製造業者により与えられた規格書に従ってAppolied B iosystemsのオリゴヌクレオチド合成装置上で合成される。 ハイブリドーマ細胞および抗体は、“Antibodies: A Laboratory Manual”, H aralow およびDavid Lane編，Cold Spring Harbor Labo-ratory 1988)（これは 参考として本明細書中に組み込まれる）に従って操作される。実施例１ ゲノム重鎖ヒトIgトランスジーン この実砲例は、マウスの接合子中にマイクロインジェクトされるヒトゲノム重 鎖免疫グロブリントランスジーンのクローニングとマイクロインジェクションを 記載する。 Marzluff, W.Fら、“Transcription and Translation : A Pra-ctical Appro ach”, B.D. Hammes およびS.J. Higins編, 89-129頁, IRL Press，Oxford(1985 )により記載されたようにして、新鮮なヒト胎盤組織から核を単離する。単離さ れた核（またはＰＢＳで洗浄したヒト精母細胞）を低融点アガロース母材中に埋 め込み、EDTAとプロティナーゼＫで溶解せしめで高分子量ＤＮＡを暴露させ、こ のＤＮＡを次いでM. FinneyによりCurrent Protocols in Moleculer Biology(F. Ausubeら編, John Wiley & Sons,増補４版，1938, 第2.5.1 章）中に記載され た通りにアガロース中で制限酵素Not Iで消化する。 次いでNot Ｉ消化さｎたＤＮＡを、Anand，R, ら、Nucl ．Acids Res., 17:342 5-3433 (1989) により記載されたようにパルスフィールドゲル電気泳動により分 画する。Not ｉ断片に冨む画分をサザンブロットハイブリダイゼーションにより アッセイし、この断片によりコードされる１または復数の配列を検出する。その ような配列ば、重鎖Ｄセグメント、Ｊセグメント、μおよびγ１定常領域と一緒 に８種のＶH ファミリーの全部の代表物を含む〔この断片は、Bermanら (1988) 前掲によりHeLa細胞から87O kb断片として同定されているが、本発明者らはヒト 胎盤および精子ＤＮＡからは830 kb断片としてであることを発見した〕。 このNot I断片を含む画分（図４参照）をプールし、そして酵母細胞中のベク ターpYACNNの Ｎot I部位にクロ−ニングする。プラスミドpYACNNは、pYAC-4 Ne o〔Cook，H.ら、Nucl ．Acids Res． 16:11817（1988）］をEcoRIで消化しそして オリゴヌクレオチド５′−AAT TGC GGC CGC−３′の存荘下で連結せしめること により調製する。 Brownsteinら(1989),Science, 244, 1348-1351およびGreen．E．ら、ProcNatl ．Acad．Sci．USA 87:1213-1217（1990）（これらは参考として本明細書中に組 み込まれる）により記載されたようにして、重鎮 Not Ｉ断片を含む YACクロー ンを単離する。M．Finncy．（前掲）により記載されたパルスフィールドゲル電 気泳動により、高分子量酵母ＤＮＡからクローン化 Not Ｉ挿入断片を単離する 。1Mmのスベルミンの添加によりこのＤＮＡを凝縮さぜ、上述の単細胞胚の核に 直接マイクロインジュクトする。実施例２ 生体内相同組換えにより形成されるゲノムκ軽鎖ヒトIgトランスジーン ヒトκ軽鎖の地図はLorenz．Wら、Nucl ．Acids Res． 15;9667-9677（1987） に記載されており、これは参考として本明細書中に組み込まれる。 全てのＣκ、３′エンハンサー、全てのＪセグメントおよび少なくとも５つの 異なるＶセクメントを含む450 kbの XhoI−Not I断片を実施例１に記載の如く単 離し、そして単一の細胞胚の核の中にマイクロインジェクトする。実施例３ 生体内相同組換えにより形成されるゲノムκ軽鎖ヒトIgトランスジーン 前記成分の全部と少なくとも20個多いＶセグメントとを含む750 kp ＭluＩ−N ot I断片を実施例１に記載の如く単離し、そしてBssHIIで消化して約400 kbの断 片を生戊せしめる。 450 kb Xho I−Not I断片と約400 kb MIuI−BssHII断片は、Bss H II制限部位 とXho I制限部位とにより眼定される配列重複を有する。マウス接合子のマイク ロインジェクションによるそれらの２断片の相同組換えは、450 kb Xho I／Not I断片（実施例２）中に見つかるものよりも少なくとも15〜20個追加のＶセグメ ントを含むトランスジーンをもたらす。実施例４ 重鎖小遺伝子座の作製 Ａ．pGP1 およびpGP2の作製 pBR322をEcoRI とSFtyIで消化し、下記のオリゴヌクレオチドと連結せしめる ことにより、図８に記載の制限部位を有する147塩基対の挿入断片を含むpGP1を 作製する。それらのオリゴの概括的重複は図９にも示される。 オリゴヌクレオチドは下記のものである： オリゴ−１ ５′−CTT GAG CCC GCC TAA TAG GCG GGC TTT TTT TTG CAT ACT GCG GCC−３′ オリゴ−２ ５′−GCA ATG GCC TGG ATC CAT GGC GCG CTA GCA TCG ATA TCT AGA GCT CGA GCA−３′ オリゴ−３ ５′−TGC AGA TCT GAA TTC CCG GGT ACC AAG CTT ACG CGT ACT AGT GCG GCC GCT−３′ オリゴ−４ ５′−AAT TAG CGG CCG CAC TAG TAC GCG TAA GCT TGG TAC CCG GGA ATT−３′ オリゴ−５ ５′−CAG ATC TGC ATG CTC GAG CTC TAG ATA TCG ATG CTA GCG CGC CAT GGA TCC−３′ オリゴ−６ ５′−AGG CCA TTG CGC CCG CAG TAT GCA AAA AAA AGC CCG CTC ATT AGG CGG GCT−３′ このプラスミドは、マイクロインジェクション用のベクター配列から単離する ことができる大挿入断片を構築するための、稀少な切断性Not I部位により隣接 された大きなポリリンカーを含む。このプラスミドは、pUC 系プラスミドに比べ て比較的低コピー数であるpBR322に由来する（pGP1は複製開始点の近くにpBR322 コピー数調節領域を保持している）。低コピー数は挿入配列の潜在的毒性を減少 させる。加えて、pGP1は、アンピシリン耐性遺伝子と前記ポリリンカーとの間に 挿入された、trp由来の強力な転写ターミネーター配列〔Christie．G．E．ら、P roc ．Natl．Acad．Sci．USA 78:4180（1981）〕も含む。これは、アンピシリン プロモーターから起こる読み通し転写を防ぐことにより、或る腫の挿入断片に関 係する毒性を減少させる。 ブラスミドpPG2は、ポリリンカー中に追加の制限部位（Sfi I）を導入するよ うにpGP1から誘導される。pGP1をMIuIと SpeIで消化し、該プラスミドのポリリ ンカー邪分の中の認識配列を切除する。 このように消化されたpGP1に次のアダプターオリゴヌクレオチドを連結せしめ てpGP2を作製する。 ５′CGC GTG GCC GCA ATG GCC A ３′ ５′CTA GTG GCC ATT GCG GCC A ３′ pGP2は MIuI部位と Spe I部位の間に置かれた追加のSfiI部位を含むこと以外 はpGP1と同じである。これは挿入断片をSfiIで並びにNot Iで完全に切除するこ とを可能にする。 Ｂ．pRE3 （ラットエンハンサー３′）の作製 ラット定常領域の下流に置かれたエンハンサー配列を重鎮構成物中に導入する 。 Petterssonら、Nature 344:165-168（1990）により記載された重鎖領域３′ エンハンザーを単離し、クロ−ニングする。次のオリゴヌクレオチド ５′CAG GAT CCA CAT ATC AGT ACC TGA AAC AGG GCT TGC ３′ ５′GAG CAT GCA CAG GAC CTG GAG CAC ACA CAG CCT TCC ３′ を使って、ラットIGH ３′エンハンサー配列をＰＣＲ増幅せしめる。 こうして形成された３′エンハンサーをコードする二本鎖ＤＮＡをBamHIとSph Iで切断し、BamHI/SphIで切断されたpGP2中にクロ−ニングしてpRE3（ラットエ ンハンサ−３′）を得る。 Ｃ．ヒトＪ−μ領域のクローニング この領域の実質的部分を、λファージ挿入断片から単離された２以上の断片を 組み合わせることによりクロ−ニングする。図９を参照のこと。 オリゴヌクレオチド GCA CTG TGT CCC TGT GTG ATG CTT TTG ATGTCT GGG GCCA AG を使って、全部のヒトｊセグメントを含む6.３kbBamHI／HindIII 断片〔Mats uda ら、BMBO J ． 7:1O47-1051（1988）：Ravetechら、Cell 27:583-591（198 1）、これらは参考として本明細書中に組み込まれる〕をヒトゲノムＤＮＡライ ブラリーから単離する。 オリゴヌクレオチド CAC CAA GTT GAC CAG CCT GGT CAC AGA CCTGAC CAC CTA TGAを使って、エンハンザー、スイッチおよび定常領域コードエクソンを含む隣 接の10 kb HindIII／BamHI 断片〔Yasui ら、Eur ．J．Immunol． 19:1399-1403 （1989）〕を同様にして単離する。 プローブとしてクローンpMUM挿入断片（pMUMは、μ膜エクソン１オリゴヌクレ オチド：CCT GTG GAC CAC CGC CTC CAC CTT CAT CGT CCT CTT CCT CCTを使って ヒトゲノムＤＮＡライブラリーから単離された4 kb EcoRI／HindIII断片である ）を使って隣接の３′1.5 kbBamHI 断片を同様に単雌し、そしてpUCl9中にクロ −ニングする。 pGP1をBamHIとBgl IIで消化した後、子ウシ腸アルカリホスファターゼで処理 する。 図９からの断片（ａ）および（ｂ）を前記消化pGP1中にクロ−ニングする。次 いで５′BamHI部位が BamHI／Bgl II融合により破壊されるように置かれたクロ ーンを単離する。それをpMU と命名する（図10参照）。 pMU をBamHI で消化し 、図９からの断片（ｃ）を挿入する。HindIII 消化により方向性を確認する。生 じたプラスミドpHIG1（図10）は、およびＣμセグメントをコードする18 kb 挿 入断片を含有する。 Ｄ．Ｃμ領域のクロ−ニング pGP1をBamHI とHindIIIで消化し、次いで子ウシ腸アルカリホスファターゼで 処理する（図14）。このように処理された図14の断片（ｂ）および図14の（ｃ） を、BamHI／HindIIIで切断したpGP1中にクローニングする。HindIII消化により 断片（ｃ）の正しい方向を確認し、Ｃμ領域をコードする12 kb 挿入断片を含む pCONIを得る。 PHIGIは、Not I部位により隣接されたポリリンカ−ー中にSfiI３′部位と S peI５′部位を有する18 kb挿入断片内にＪセグメント、スイッチおよびμ配列を 含む故に、再配列されたＶＤＪセグメントに使われるだろう。pCONIはＪ領域を 欠き12 kb 挿入断片のみを含むこと以外はpHIGIと同じである。再配列されたＶ ＤＪセグメントを含む断片の作製におけるpCONIの使用については後で記載す る。 Ｅ．γ−１定常領域のクローニング（oREG2） ヒトγ−１領域のクローニングは図16に描写される。 Yamamuraら、Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 86:2152-2156（1986）は、組込み 時に部分的に削除されたトランスジーン構成物からの膜結合ヒトγ−１の発現を 報告している。彼らの結果は、３′BamHI 部位が、５kb未満のＶ−Ｃイントロン を有する経膜再配列されそしてスイッチされたγ遺伝子コピーを含む配列の輪郭 となることを指摘している。従って、再配列されていないスイッチされていない 遺伝子では、最初のγ−１定常エクソンの５′末端から5 kb未満のところで始ま る配列中にスイッチ領域全体が含まれる。 従ってそれは５′5.3 kb Hind III 断片中に含まれる〔EIIison，J.W．ら、Nu cleic.Acids Res ． 10:4071-4079（1982）；これは参考として本明細書中に組み 込まれる〕。Takahash1ら、Cell 29:671-679（1982）（これは参考として本明 細書中に組み込まれる）もまた、この断片がスイッチ配列を含むことを報告して おり、この断片と7.7 kb Hind III−BamHI断片とを合わせると我々がトランスジ ーン構成物に必要とする配列の全部を含むに違いない。イントロン配列は、特定 遺伝子のイントロン中に存在する少なくとも15の連続ヌクレオチドのヌクレオチ ド配列である。 γ−１の第三エクソン（ＣH３）に特異的である次のオリゴヌクレオチドを使 って、γ−１領域を含むファージクローンを同定し単離する。 ５′TGA GCC ACG AAG ACC CTG AGG TCA AGT TCA ACT GGT ACG TGG ３′ 7.7kb Hind III -Bgl II断片（図11中の断片（ａ））をHindIII／Bgl IIで切 断されたpRE3中にクロ−ニングしてpREG1を作製する。上流の5.3 kb Hind III 断片（図11中の断片（ｂ））をHindIII 消化されたpREG1中にクロ−ニングしてp REG2を作製する。BamHI／Spe I消化により正しい方向を確かめる。 Ｆ．ＣγとＣμの結合 上述したプラスミドpHIG1はヒトｊセグメントとＣμ定常領域エクソンを含む 。Ｃμ定常領域遺伝子セグメントを含むトランスジーンを提供するために、pHIG エをSfi Iで消化した（図10）。プラスミドpREG2 もSfiIで消化し、ヒトＣγエ クソンとラット３′エンハンザー配列を含む13.5 kb挿入断片を得た。それらの 配列を連結し、31.5 kb挿入断片上にヒトＪセグメント、ヒトＣμ定常領域、ヒ トＣγ１定常領域およびラット３′エンハンサー配列を含むプラスミドpH1G3′ を作製した（図12）。 pCONI をSfiIで消化し、そしてpREG2 をSfi Iで消化して得られたヒトＣγ領 域とラット３′エンハンサーとを含むSfiＩ断片と連結せしめることにより、ヒ トＣμおよびヒトＣγ１をコードするがＪセグメントを含まない第二のプラスミ ドを作製する。得られたプラスミドpCON（図12）は、ヒトＣμ、ヒトγ１および ラット３′エンハンサー配列を有する20 kbの Not I／Spe I挿入断片を含有する 。 Ｇ．Ｄセグメントのクローニング ヒトＤセグメントをクローニングするための方策は図13に描写される。Ｄセグ メントを含むヒトゲノムライブラリーからのファージクローンを、多様性領域配 列〔Y．Ichihara ら、EMBO J. 7:4141-4150（1988）〕に特異的なプローブを使 って同定しそして単離する。次のオリゴヌクレオチドを使用する。 OXP1： ５′−TGG TAT TAC TAT GGT TCG GGG AGT TAT TAT AAC CAC AGT GTC −３′ DXP4： ５′−GCC TGA AAT GGA GCC TCA GGG CAC AGT GGG CAC GGA CAC TGT −３′ DN4： ５′−GCA GGG AGG ACA TGT TTA GGA TCT GAG GCC GCA CCT GAC ACC −３′ オリゴ DXP1 を使って同定されたファージクローンから、DLR1，DXP1，DXP'1 およびUA1を含む5.2 kb XhoI断片（図13中の断片（ｂ））を単離する。 オリゴ DXP4 を使って同定されたファージクローンから、DXR4,OA4およびOK4 を含む3.2 kb Xbe I断片（図13中の断片（ｃ））を単離する。 図13中の断片（ｂ），（ｃ）および（ｄ）を結合し、pGP1のXba I／Xho I部位 中にクローニングして、10.6 kb挿入断片を含むpHIG2 を形成せしめる。 このクロ−ニングは連続的に行われる。まず、図13の5.2 kb断片（ｂ）と図13 の2.2 kb断片（ｄ）を子ウシ腸アルカリホスファターゼで処理し、そしてXho I とXba Iで消化されたpGP1中にクロ−ニングする。生じたクローンを該5.2 kbお よび2.2 kb挿入断片を用いてスクリ−ニングする。5.2 kbおよひ2.2 kb挿入断片 での試験に陽性であるそれらのクローンの半分が、BamHI 消化により確かめると 正しい方向で5.2 kb挿入断片を有する。次いで図13の3.2 kb Xba I断片を、断片 （ｂ）と（ｄ）を含むこの中間プラスミド中にクロ−ニングし、pHIG2 を形成せ しめる。このプラスミドは、ユニーク５′Sfi I部位とユニーク３′Spe I部位を 有するポリリンカー中にクローニングされた多様性セグメントを含む。完全なポ リリンカーはNot I部位により隣接される。 Ｈ．重鎖小遺伝子座の作製 下記は、１または複数のＶセグメンントを含むヒト重鎖小遺伝子座の作製を説 明する。 Newkirkら、J ．Clin．Invest. 81:1511-1518（1988）（これは参考として本 明細書中に組み込まれる）のハイブリドーマ中に含まれるＶセグメントとして同 定されたものに相当する再配列されていないＶセグメントを、次のオリゴヌクレ オチド ５′−GAT CCT GGT TTA GTT AAA GAG GAT TTT ATT CAC CCC TGT GTC−３′ を使って単離する。 再配列されていないＶセグメントの制限地図を調べて、消化すると３′および ５′隣接配列と一緒に再配列されていないＶセグメントを含む約2 kbの長さを有 するＤＮＡ断片を提供するユニーク制限部位を同定する。５′開始配列はプロモ ーターおよび他の調整配列を含み、一方３′隣接配列はＶ−ＤＪ結合に必要な組 換え配列を提供するだろう。この約3.0 kbＶセグメント挿入断片をpGB2のポリリ ンカー中にクロ−ニングし、pVHIを形成せしめる。 pVHIをSCiIで消化し、得られた断片をpHIG2のSfiI部位にクロ−ニングしてpHI G5′を作製する。pHIG2はＤセグメントのみを含むので、生成したpHIG5′プラス ミドはＤセグメントと一緒に単一のＶセグメントを含む。pHIG5に含まれる挿入 断片のサイズは、10.６ kb÷Ｖセグメント挿入断片のサイズである。 Not IとSpeIでの消化によりpHIG5から挿入断片を切り出す。Ｊ．ＣμおよびＣ γ１セグメントを含むpHIG3′をSpeＩとNot Iで消化し、そして上記配列とラッ ト３′エンハンサーとを含む3kb断片を単離する。それらの２断片を一緒にして 、Not Iで消化されたpGP1中に連結せしめ、Ｖセグメント、９つのＤセグメント 、６つの機能的なＪセグメント、Ｃμ、Ｃγおよびラット３′エンハンザーを含 むPHIGを作製する。この挿入断片のサイズは約43 kb÷Ｖセグメント挿入断片の サイズである。 Ｉ．相同組換えによる重鎖小遺伝子座の作製 前の章で指摘したように、pHIG挿入断片は単一のＶセグメントを使用すると約 43〜45 kbである。この挿入断片サイズは、プラスミドベクター中に容易にクロ ーニングすることかできる限界かまたはそれに近い。より多数のＶセグメントの 使用に備えるために、接合子またはＥＳ細胞内での相同組換えによってラット３ ′エンハンサー配列、ヒトＣμ、ヒトＣγ１、ヒトＪセグメント、ヒトＤセグメ ントおよび多数のヒトＶセグメントを含むトランスジーンを形成する、重複ＤＮ Ａ断片の生体内相同組換えを下記に記載する。 ヒトＪセグメントを含む6.3 kb BamHI／HindIII断片（図９中の断片（ａ）を 参照のこと）を、次のアダブター： ５′GAT CCA AGC AGT ３′ ５′CTA GAC TGC TTG ３′ ５′CGC GTC GAA CTA ３′ ５′AGC TTA GTT CGA ３′ を使って、MIu I／SpeＩで消化されたpHIG5′中にクローニングする。 生成したプラスミドをpHIG5’0（重複）と命名する。このプラスミド中に含ま れる挿入断片はヒトＶ，ＤおよびＪセグメントを含む。pVH1からの単一Ｖセグメ ントが使われる時、この挿入断片のサイズは約17 kb÷2 kbである。この挿入断 片を単離し、そしてヒトＪ，Ｃμ，γ１およびラット３′エンハンサー配列を含 むpHIG3′からの挿入断片と組み合わせる。両挿入断片は、２つのＤＮＡ断片の 間の約6.3 kbの重復部分に備えるヒトＪ配列を含む。これらをマウス接合子中に 同時注入すると、生体内相同組換えが起こり、pHIG中に含まれる挿入断片と同等 のトランスジーンを生成する。 このアプローチは生体内で形成されるトランスジーン中への多数のＶセグメン トの付加に備える。例えば、単一のＶセグメントをpBIG5′中に組み込む代わり に、（１）単離されたゲノムＤＮＡ、（２）ゲノムＤＮＡから誘導された連結Ｄ ＮＡ、または（３）合成ＶセグメントレパートリーをコードするＤＮＡ、上に含 まれる多数のＶセグメントをpHIG2のSfiI部位にクローニングしてpHIG5′VNを作 製する。次いで図９のＪでグメント断片（ａ）をpHIG5′VN中にクローニングし 、そして挿入断片を単離する。この挿入断片は、pHIG3′から単離した挿入断片 上に含まれるＪセグメントと重複するＪセグメントと多数のＶセグメントを含む ようになる。これをマウス接合子の核中に同時注入すると、相同組換えか起こり 、多数のＶセグメントおよび多数のＪセグメント、多数のＤセグメント、Ｃμ領 域、Ｃγ１領域（全てヒト由来）並びにラット３′エンハンサー配列をコードす るトランスジーンを生成する。実施例５ 軽鎖小遺伝子座の作製 Ａ．pE μlの作製 pEμlの作製は図16に描写される。オリゴ ５′GAA TGG GAG TGA GGC TCT CTC ATA CCC TAT TCA CAA CTG ACT ３′ を使ってファージクローンから678 bpのXba I−EcoRI 断片〔J.Banerji ら、Ce li 33:729-740（1983）〕においてマウス重鎖エンハンサーを単離する。 このＥμ断片を、EcoRI 部位の平滑末端フィルインにより、EcoRV／Xba I消化 されたpGP1中にクローニングする。生じたプラスミドをpEμlと命名する。 Ｂ．κ軽鎖小遺伝子座の作製 κ構成物は、少なくとも１つのヒトＶκセグメント、５つのヒトＪκセグメン ト全部、ヒトＪ−Ｃκエンハンサー、ヒトκ定常領域エクソン、および理想的に はヒト３′κエンハンサーを含む〔K．Meyerら、EMBO J. 8:1959-1964(1989)〕 。マウスのκエンハンサーはＣκから9 kb下流である。しかしながら、ヒトでは まだ同定されていない。加えて、該構成物はマウス重Ｊ−ＣμエンハンサーのＩ コピーも含む。 この小遺伝子座は次の４つの成分断片から作製される （ａ）マウス遺伝子座との類推によりヒトＣκエクソンと３′ヒトエンハンサ ーとを含む16 kb Sma I断片： （ｂ）５つのＪセグメント全部を含む５′隣接5 kb SmaＩ断片： （ｃ）ρεμ１から単離されたマウス重鎖イントロンエンハンサー（この配列 は、Ｂ細胞発達のできるだけ初期に軽鎖構成物の発現を誘導するために含まれる 。重鎖遣伝子は軽鎖遺伝子よりも初期に転写されるため、この重鎮エンハンサー はおそらくイントロンκエンハンサーよりも早い段階で活性であろう。）；およ び （ｄ）１または複数のＶセグメントを含む断片。 この構成物の調整は次の通りである。ヒト胎盤ＤＮＡをSmaIで消化し、電気泳 動によりアガロース上で分画する。同様に、ヒト胎盤ＤＮＡを BamHIで消化し、 電気泳動により分画する。SmaIで消化したゲルから16 kb画分を単離し、同様にB amHIで消化したＤＮＡを含むゲルから11 kb領域を単離する。 16 kb Sma I画分を、Xho Iで消化されXho I制限消化生成物をフィルインする ためにクレノウ断片ＤＮＡポリメラーゼで処理されているラムダFIX II（Stra tagene．La Jo11a，Ca1ifornia）中にクローニングする。 16 kb Sma I画分の連 結はSma I部位を破壊するがXho I部位はそのまま残す。 11 kb BamHI 画分を、クローニング前にBamHIで消化したラムダFIX II（Strat agene．La Jolla．Callfornia）中にクローニングする。 各ライブラリーからのクローンを、Ｃκ特異的オリゴ ５′GAA CTG TGG CTG CAC CAT CTG TCT TCA TCT TCC CGC CAT CTG ３′ を用いて探査する。 ＣκかSma Iに隣接するように、16 kb Xho Ｉ挿入断片をXho Iで切断されたpE μl中にサブクローニングする。生じたブラスミドをpKap1と命名する。 上記Ｃκ特異的オリゴヌクレオチドを用いてλ EML3/BamIIIライブラリーを探 査し、11 kbクローンを同定する。５ kb Sma I断片（図25の断片（ｂ））をザブ クローニングし、次いでSma Iで消化されたpKap1中に挿入する。正しい方向のＪ セグメント、ＣκおよびＥμエンハンサーを含むそれらのプラスミドをpKap2と 命名する。 その後、１または複数のＶκセグメントをpKap2のMIuI中にサブクローニング し、ヒトＶκセグメント、ヒトＪκセグメント、ヒトＣκセグメントおよびヒト ＥμエンハンサーをコードするプラスミドpKapHを生ぜしめる。pKapHを NotI 消 化することによりこの挿入断片を切り出し、そしてアガロースゲル電気泳動によ り情製する。こうして精製された挿入断片を上述の如くマウス接合子の前核中に マイクロインジェクトする。 Ｃ．生体内相同組換えによるκ軽鎖小遺伝子座の作製 11 kb BamHI断片を、その３′末端が Sfi I部位の方に向くように、BamHIで消 化されたpGP1中にクローニングする。生じたプラスミドをpKAPintと命名する。p KAPint 中のBamHI 部位とSpe I部位との間のポリリンカー中に１または複数のＶ κセグメントを挿入してpKapHVを作製する。pkapHVの挿入断片をNot Iでの消化 により切り出し、そして精製する。pKap2からの挿入断片をNot Iでの消化 により切り出し、精製する。それらの２断片の各々は、pKapHVからの断片が、pK ap2がら得られる挿入断片中に含まれる5 kb SMa I断片と実質的に相同であるＪ κセグメントを含む 5 kbのＤＮＡ配列を含むという点で、相同性領域を含有す る。それ故に、それらの挿入断片は、マウス接合子中にマイクロインジェクトさ れると相同組換えして、Ｖκ，Ｊκ,およびＣκをコードするトランスジーンを 形成することができる。実施例６ 免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子の再配列され発現されるコピーに相当するゲノムク ローンの単離 この実施例は、着目の免疫グロブリンを発現する培養細胞からの免役グロブリ ンκ軽鎖遺伝子のクローニングを記載する。そのような細胞は、与えられた免疫 グロブリン遺伝子の多数の対立遺伝子を含み得る。例えば、ハイブリドーマは４ コピーのκ軽鎖遺伝子を含み、その２コピーは融合相手の細胞系からのものであ り、２コピーは着目の免疫グロブリンを発現するもとのＢ細胞からのものである 。それらの４コピーのうち、数個が再配列することかできるという事実にもかか わらず、ただ１つだけが着目の免疫グロブリンをコードする。この実施例に記載 の手順は、κ軽鎖の発現コピーの選択的クローニングを考慮したものである。 Ａ．二本鎖cDNA ヒトハイブリドーマもしくはリンパ腫からの細胞、または細胞表面形態もしく は分泌形態またはその両形態のκ軽鎖含有IgMを合成する他の細胞系を、ポリ_A- RNAの単離に使用する。次いで該RNAを、逆転写酵素を使ったオリゴdT開姑cDNAの 合成に使用する。次で一本鎖cDNAを単離し、ポリヌクレオチドターミナルトラン スフェラーゼ酵素を使って３′末端にＧ残基を付加する。次いでＧ末端が付けら れた一本鎖cDNAを精製し、そしてプライマーとして次のオリゴヌクレオチド ５'−GAG GTA CAC TGA CAT ACT GGC ATG CCC CCC CCC CCC−３′ を使った第二鎖合成（ＤＮＡポリメラーゼ酵素により触媒される）のための鋳型 として用いる。 二本鎮cDNAを単離し、発現される免疫グロブリン分子の重鎖および軽鎖をコー ドするmRNAの５′末端のヌクレオチド配列を決定するために使用する。次いで、 それらの発現される遺伝子のゲノムクローンを単離する。発現される軽鎖遺伝子 のクロ−ニング方法は、下記のＢ部に要約される。 Ｂ．軽鎖 Ａ部に記載された二本鎖cDNAを変性せしめ、次のオリゴヌクレオチドプライマ ５′−GAT CGC CAT ATC AGC TGG ATG AAG TCA TCA GAT GGC GGG AAG ATG AA G ACA GAT GGT GCA−３' を使った第３巡目のＤＮＡ合成のための鋳型として使用する。 このプライマーは、κ軽鎖情報の定常部分に特異的な配列（TCA TCA GAT GGCG GG AAG ATG AAG ACA GAT GGT GCA）並びに新たに合成されるＤＮＡ鎖のＰＣＲ増 幅のためのプライマーとして使うことができるユニーク配列（GTA CGC CAT ATC AGC TGG ATG AAG）を含む。この配列を、次の２つのオリゴヌクレオチドプライ マー ５′−GAG CTA CAC TGA CAT ACT GGC ATG−３′ ５′−GTA CGC CAT ATC AGC TGG ATG AAG−３′ を使ってＰＣＲにより増幅せしめる。 ＰＣＲ増幅された配列をゲル電気泳動により精製し、そしてプライマーとして 次のオリゴヌクレオチド ５′−GAG GTA CAC TGA CAT ACT GGC ATG−３′ を使うジデオキシ配列決定反応のための鋳型として使用する。 次いで、該配列の最初の42ヌクレオチドを使って、免疫グロブリン情報が転写 された遺伝子を単離するためのユニークプローブを合成する。このＤＮＡの合成 42ヌクレオチドセグメントを、以後ｏ−カッパと称することにする。 Ig発現細胞系から単離しそして個別におよびSmaIを含む幾つか異なるの制限エ ンドヌクレアーゼと対に組み合わぜて消化したＤＮＡのサザンブロットを、32Ｐ 標識したユニークオリゴヌクレオチドｏ−カッパを用いて探査する。ユニーク制 限エンドヌクレアーゼ部位は、再配列されたＶセダメントの上流に同定される。 次いでIg発現細胞系からのＤＮＡをSma Iおよび第二の酵素（Ｖセグメントの 内側にSma I部位がある場合にはBamHI またはKpnI）で切断する。いずれかの生 成した非平滑末端をT4 DNAポリメラーゼ酵素で処理し、平滑末端化ＤＮＡ分子を 与える。次いで制限部位をコードするリンカー（断片中にどの部位が存在しない かに応じてBamHI，EcoRI（または Xho I）を付加し、そして対応するリンカー酵 素で切断してBamHI，EcoRIまたはXho I末端を有するＤＮＡ断片を与える。次い で該ＤＮＡをアガロースゲル電気泳動によりサイズ分画し、発現されるＶセグメ ントを包含するＤＮＡ断片を含む画分をラムダEMBL3またはラムダFIX (Stratage ne，La Jolla，Califortia中にクローニングする。ユニークプローブｏ−カッパ を使って、Ｖセグメント含有クローンを単離する。陽性クローンからＤＮＡを単 離し、そしてpKap1のポリリンカー中にサブクローニングする。生じたクローン をpRKLと命名する。実施例７ 免疫グロブリン重鎖μ遺伝子の再配列され発現されるコピーに相当するゲノムロ ーンの単離 この実施例は、着目の免疫グロブリンを発現する培養細胞からの免疫グロブリ ンン重鎖μ遺伝子のクローニングを記載する。この実施例に記載の手順は、μ重 鎖遺伝子の発現コピーの選択的クローニングを考慮したものである。 上述した如く、二本鎖cDNAを調製し単離する。この二本鎖cDNAを変性せしめ、 次のオリゴヌクレオチドプライマー ５′−GTA CGC CAT ATC AGC TGG ATG AAG ACA GGA CAC GAG GGG CAA AAG GG T TGG GGC GGA TGC−３′ を使った３巡目のＤＮＡ合成のための鋳型として使用する。 このプライマーは、μ重鎖情報の定常部分に特異的な配列（ACA GGA GAC GAGG GG GAA AAG GGT TGG GGC GGA TGC）並びに新たに合成されるＤＮＡ鎖のＰＣＲ増 幅のためのプライマーとして使うことができるユニーク配列（GTA CGC CAT ATC AGC TGG ATG AAG）を含む。この配列を、次の２つのオリゴヌクレオチドプライ マー： ５′−GAG GTA CAC TGA CAT ACT GGC ATG−３ ′ ５′−GTA CTC CAT ATC AGC TGG ATG AAG−３ ′ を使ってＰＣＲにより増幅せしめる。 ＰＣＲ増幅された配列をゲル電気泳動により精製し、そしてプライマーとして 次のオリゴヌクレオチド ５′−GAG GTA CAC TGA CAT ACT GGC ATG−３′ を使ったジデオキシ配列決定反応のための鋳型として使用する。 次いで、該配列の最初の42ヌクレオチドを使って、免疫グロブリン情報が転写 された遺伝子を単離するためのユニークプローブを合成する。このＤＮＡの合成 42ヌクレオチドセグメントを、以後ｏ−ミューと称することにする。 Ig発現細胞系から単離しそして個別におよびMIuI（MIuIは、Ｊセグメントとμ CHI との間を開裂する稀少切断性酵素である）を含む幾つかの異なる制限エンド ヌクレアーゼと対に組み合わせて消化したＤＮＡのサザンプロットを、32Ｐ標識 したユニークオリゴヌクレオチドｏ−ミューを用いて探査する。ユニーク制限エ ンドヌクレアーゼ部位は、再配列されたＶセグメントの上流に同定される。 次いでIg発現細胞系からのＤＮＡをMIuIと第二の酵素で切断する。次でMIuIま たはSpeIアダプターリンカーを末端に連結せしめ、切断して上流部位をMIuIまた は SpeI変換する。次いで該ＤＮΛをアガロースゲル電気泳動によりサイズ分画 し、発現されるＶセグメントを包含するＤＮＡ断片を含む画分をプラスミドpGP1 中に直接クローニングする。ユニークプローブｏ−ミューを使って Ｖセグメント含有クローンを単離し、その挿入断片をMIuIでまたはMIu I／Spe I で切断されたプラスミドpCON2中にサブクローニングする。生じたクローンをpRM GHと命名する。実施例８ ヒトκ小遺伝子座トランスジーンの作製 軽鎖小遺伝子座 κ軽鎖特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いてヒトゲノムＤＮＡファージ ライブラリーをスクリーニングし、Ｊκ−Ｃ領域に及ぶクローンを単離した。Ｊ κ1 を含む5.７ kb Cla I／Xho I断片をＪκ2-5とＣκを含む 13 kb XhoI断片と 一緒にpGPlb中にクローニングし、そしてプラスミドpKcorを作製するのに使った 。このプラスミドは、4.５ kbの５′隣接配列と９ kbの３′隣接配列と共に、Ｊ κ1-5、κインロトンエンハンサーおよびＣκを含有する。それはＶセグメント のクローニング用のユニークな５′Xho I部位と追加のシス作用性調節配列の挿 入用のユニークな３′Sal I部位も有する。Ｖκ遺伝子 Ｖκ軽鎖特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いてヒトゲノムＤＮＡファー ジライブラリーをスクリーニングし、ヒトＶκセグメントを含むクローンを単離 した。ＤＮＡ配列分析により機能的Ｖセグメントを同定した。それらのクローン は、TATAボックス、リーダーと可変性ペプチド（２つのシステイン残基を含む） をコードする転写解読枠、スプライス配列、および組換えヘプタマー−12 bスペ ーサー−ノナマー配列を含有する。該クローンのうちの３つをマッピングし、配 列決定した。該クローンのうちの２つ、65.5と65.8が機能的であり、それらがTA TAボックス、リーダーと可変性ペプチド（２つのシステイン残基を含む）をコー ドする転写解読枠、スプライス配列、および組換えヘプタマー−12 bスペーサー −ノナマー配列を含有すると思われる。３つめのクローン65.4は、非規準的組換 えヘプタマーを含むことからＶκＩ偽遺伝子をコードすると思われる。 VkIIIファミリー遺伝子をコードする機能的クローンのうちの１つＶκ 65-8 を使って軽鎖小遺伝子座構成物を作製した。pkCI Ｖκ 65-8を含む7.5kb XhoI／Sa1 I断片を pKcorの５′Xho I部位に挿入する ことにより、κ軽鎖小遺伝子座pKC1（図38）を作製した。注入前にNotIでの消化 により該トランスジーン挿入断片を単離した。 精製した挿入断片を、受精した(C57BL/6×CBA)F2マウス胚の前核中にマイクロ インジェクトし、次いでHogan ら(Methods of Manipulating the Mouse Embryo ，1986．Cold Spring Harbor Laboratory，New York)に記載の通りに、生存して いる胚を偽妊娠に移した。注入された胚から発育したマウスを、尾部ＤＮＡのサ ザンプロット分折によりトランスジーン配列の存在について分析した。既知量の クローン化ＤＮＡを含有する対照標準に比較したバンド強度により、トランスジ ーンコピー数を評価した。それらの動物から血清を単離し、そしてHarlowおよび Lane（Antibodies:A Laboratory Manual，1988．Cold Spring Harbor Laborator y，New York）により記載された通りに、トランスジーンによりコードされるヒ トIgκタンパク質の存在についてELISAにより分析した。 マイクロタイタープレートウエルをヒトIgκ（クローン 6E1，＃0173．AMAC I nc.，Westbrook，MEヒト.IgM（クローン AF6．＃0285．AMAC Inc., Westbrook ，ME）およびヒトIgGl（クローンJL512，＃0280,AMAC Inc.,WesLbrook，ME）に 特異的なマウスモノクローナル抗体でコーティングした。血清試料を該ウエル中 に系列希釈し、そしてマウス免疫グロブリンとの交差反応性を最少にするために 予備吸着されているアフィニディー精製済アルカリホスファターゼ接合ヤギ抗ヒ トIg（多価）を使って特定の免疫グロブリンの存在を検出した。 図41は、８匹のマウス（I.D．=676．674，673，670．666，665．664 および49 ６）からの血清のELISAアッセイの結果を示す。それらのマウスの最初の７匹は ρKClトランスジーン挿入断片が注入された胚から発育し、そして８番目のマウ スはphClトランスジーン（前記）のマイクロインジェクションにより生まれたマ ウ スに由来する。pKC1注入胚からの７匹のマウスのうちの２匹（I.D．＃666と664 ）は、ＤＮＡサザンプロット分析により分析するとトランスジーン挿入断片を含 んでおらず、５匹（I.D．＃676，674，673，670および665）は該トランスジーン を含んでいた。 pKC1トランスジーン陽性動物の一匹を除く全てが検出可能なレベルのヒトIgκ タンパク質を発現し、残りの一匹の非発現性動物はＤＮＡサザンプロット分析に 基づくと遺伝的モザイクであるらしい。pHCl陽性トランスジェニックマウスはヒ トIgMとIgGlを発現するがIgκを発現せず、これは該アッセイに使用する試薬の 特異性を証明する。pkC2 Ｖκ65.5を含む８ kb XhoI／Sa1 Ｉ断片をpKC1の５′Xho I部位に挿入するこ とにより、κ軽鎖小遺伝子座pKC2を作製した。２つのＶκセグメントを含む生成 トランスジーン挿入断片をマイクロインジェクション前にNotIでの消化により単 離した。pKVe2 この構成物は、Ｊκの５′に1.2 kbの追加配列を含みそしてＶκ65.8の３′の 4.5 kbの配列を欠いていること以外は、pKC1と同じである。該構成物は更に、マ ウス重鎖J−ｍイントロンエノハンサー〔Banrji ら、Cell 33:729-740（1982） 〕を含む0.91 kb Xba I断片と、下流に挿入されたヒト重鎖Ｊ−ｍイントロンエ ンハンサー〔Haydayら、Nature 307:334-340(1984)〕を含む゛1.4 kb MIuI−Hin dIII断片を含有する。この構成物を、対立遺伝子排除とイソタイプ排除を果たす 軽鎖小遺伝子座の初期再配列を開始する可能性について試験する。異なるエンハ ンサー、即ちマウスまたはラットの３′κまたは重鎖エンハンサー〔Meyer およ びNeuberger．EMBO J. 8:1959-1964（1989），Pettersonら、Nature 344:165-16 9（1990）：これらは参考として本明細書中に組み込まれる〕を有する類似構成 物を作製することができる。再配列された軽鎖トランスジーン ヒトＢ細胞ＤＮＡからＰＣＲにより増幅され機能的に再配列された軽鎖遺伝子 を再構成するためにκ軽鎖発現カセットをデザインした。方策を図39に示す。Ｐ ＣＲ増幅させた軽鎖遺伝子を、κ軽鎖遺伝子65.5から単離した3.7 kbの５′隣接 配列を含むベクターpK5nx中にクローニングする。次いで、Ｊκ2-4、Ｊκイント ロンエンハンサー、Ｃκおよび9 kbの下流配列を含むベクターpK31sのユニークX hoI部位中に、５′転写調節配列に融合させたＶＪセグメントをクローニングす る。生じたプラスミドは、再構成された機能的に再配列されたκ軽鎖トランスジ ーンを含有し、このトランスジーンは胚へのマイクロインジェクションのために Not Iで切り出すことができる。該プラスミドは追加のシス作用性調節配列の挿 入のために３′末端にユニークSal I部位も含有する。 ヒト脾臓ゲノムＤＮＡ由来の再配列されたκ軽鎖遺伝子を増幅せしめるのに２ つの合成オリゴヌクレオチド（o-130，o-131）を使った。オリゴヌクレオチドo- 130（gga ccc aga(g,c)ggg aac cat gga a(g,a)(g,a,T,c)）は、ＶκIII ファ ミリー軽鎖遺伝子の５′領域に相補的でありそしてリーダー配列の最初のＡＴＣ と重複している。オリゴヌクレオチド o-131（gtg caa tca att ctc gag ttt ga c tac aga c）は、Ｊκ１の約150 bp ３′よりの配列に相補的であり、Xho I部 位を含む。それらの２つのオリゴヌクレオチドは、Ｊκ１セグメントに連結され た再配列されたＶκIII遺伝子に相当するヒト脾臓ＤＮＡからの0.７ kbのＤＮＡ 断片を増幅する。 ＰＣＲ増幅されたＤＮＡをNcoIとXhoＩで消化し、個々のＰＣＲ生成物をプラ スミドpNNO3中にクローニングした。５つのクローンのＤＮＡ配列を決定すると 、機能的ＶＪ連結（転写解読枠）を有する２つのクローンが同定された。追加の 機能的に再配列された軽鎖クローンも収集される。機能的に再配列されたクロー ンは上記軽鎖発現カセット（図39）中に個別にクローニングすることができる。 再配列された軽鎖構成物を用いて生産されたトランスジェニックマウスを重鎖小 遺伝子座トランスジェニックマウスと交配せしめることにより、一次レパートリ ーの多様性の全てが重鎖により与えられる完全にヒトの抗体のスペクトルを発現 するマウス株を生産することができる。 軽鎖多様性の１つの起源は体細胞突然変異からであることができる。全ての軽 鎖が様々な異なる重鎖と結合する能力に関して同等であるわけではないので、各 々が異なる軽鎖構成物を含有する異なるマウス抹を生成せしめ試験することがで きる。この方策の利点は、再配列されていない軽鎖小遺伝子座の使用とは反対に 、容易に重鎖と対を作りすぐに重鎖ＶＤＪ連結が起こるような軽鎖を有すること から生まれる軽鎖対立遺伝子およびイソタイプ排除の増加である。この組み合わ せは、完全にヒトの抗体を発現するＢ細胞の頻度の増加をもたらし、かくしてヒ トIg発現性ハイプリドーマの単離を容易にすることができる。 プラスミドpIGM1，pHCl，pIGH1，pKC1およびpKC2のNot I挿入断片をアガロー スゲル電気泳動によりベクター配列から単離した。精製されたそれらの挿入断片 を、受精した(C57BL/6×CBA)F2マウスの前核中にマイクロインジェクトし、そし てHogan らにより記載された通りに〔Hogan ら、Methods of Manipulating the Mouse Embryo ，Cold Spring Harbor Laboratory．New York(1986)〕、生存して いる胚を偽妊娠雌中に移した。実施例９ 相同組換えによるマウスκ軽鎖遺伝子の不活性化 この実施例は、胎児性幹(ES)細胞中での相同組換えによるマウス内因性κ遺伝 子座の不活性化に次いで、不活性化されたκ対立遺伝子を有する標的ES細胞を初 期マウス胚（胚盤胞）中に注入することによるマウス生殖細抱系中への変異遺伝 子の導入を記載する。 方策は、Ｊκ遺伝子とＣκセグメントに及ぶ遺伝子座の4.5 kbセグメントが削 除されそして選択マーカーneoにより置き換えられているマウスκ遺伝子座に相 同なＤＮＡ配列を含むベクターを用いた相同組換えによりＪκ遺伝子とＣκ遺伝 子を欠失せしめることである。κ標的ベクターの作製 プラスミドpGEM7(KJ1)（M.A．Rudnicki,Whitehead Institute）は、クローニ ンダベクタ−7Zf(÷)中のマウスホスホグリセレートキナーゼ(pgk)プロモータ− 〔Xba I／TaqI断片；Adra，C.N.ら、Gene 60:65-74（1987）］の転写調節下に、 トランスフェクトされたES細胞の薬剤選択に使うネオマイシン耐性遺伝子（neo ）を含む。このプラスミドは、マウスpgk 遺伝子の３′領域に由来する、neｏ遺 伝子にとって異種のポリアデニル化部位〔Pvu II／HindIII 断片.Boer，PH.ら、Biochem1cal Genetics 28:299-308（1990）〕も含む。このプラスミドをκ福的 ベクターの作製のための出発点として使った。第一段階はneo発現カセットの３ ′のκ遺伝子座に相同な配列を挿入することであった。 Ｃκ遺伝子座に特異的なオリゴヌクレオチドプローブ ５′−GGC TGA TGC TGC ACC AAC TGT ATC CAT CTT CCC ACC ATC CAG −３′ とＪκ遺伝子でグメントに特異的なオリゴヌクレオチドプローブ ５′-CTC ACG TTC GGT GCT GGG ACC AAG CTG GAG CTG AAA CGT AAG −３′ を使って、肝臓ＤＮＡから誘導されたゲノムファージライブラリーから、マウス κ鎖配列（図25a）を単離した。 陽性ファーンクローンから２断片において、即ち1.2 kb BgIII／Sac I断片と6 .3 kb SacI断片として、マウスＣκセグメントの３′に及ぶ8 kb BgIII／SacI断 片を単離し、それをBgIII／Sac Iで消化されたpGEM(KJ1)中にサブクローニング し、プラスミド pNEO-K3′を作製した（図25b）。 Ｊκ領域の５′に及ぶ1.2 kb EcoRI／Sph I断片も陽性ファージクローンから 単離した。この断片のSphI部位にSphI／Xba I／Bgl II／EcoRI アダプターを連 結せしめ、生じたEcoRI 断片をneo遺伝子および下流の３′κ配列と同じ５′− ３′方向で、EcoRIで消化された pNEO-K3′に連結せしめ、pNEO-K5′3′（図25 ｃ）を作製した。 次いで、Mansourら、Nature 336:348-352（1988）（これは参考として本明細 書中に組み込まれる）により記載されたようにして、相同組換え体を有するES クローンの富化に備えるために、該構成物中に単純ヘルペスウイルス(HSV)チ ミジンキナーゼ(TK)遺伝子を含めた。プラスミドpGEM7(TK)からHSV TKカセット を得た。このカセットは、pGEM(KJ1)について上述したのと同様に、マウスpgk プロモーターとポリアデニル化配列とにより隣接されたHSV TK遺伝子の構造配列 を含む。pGEM7(TK)のEcoRI部位をBamHI部位に変更し、そしてTKカセットをBamHI ／HindIII 断片として切り出し、pGP1b中にサブクローニングしてpGP1b-TKを作 製した。このプラスミドをXho I部位のところで線状化し、Ｊκの５′からのゲ ノム配列とＣκの３′からのゲノム配列とにより隣接されたneo遺伝子を含む、p NEO-K5’3’由来の XhoI断片をpGP1b-TK中に挿入し、標的ベクターJ/C K1（図25 ｄ）を作製した。J/C K1を用いた相同組換え後のゲノムκ遺伝子座の推定構造を 図25eに示す。κ対立遺伝子の標的不活性化によるES細胞の作製および分析 使用したES細胞は、本質的には記載された通りに〔Robertson，E．J.，Terato carcinomas and Embryonic Stem Cells:A Practical Approach， E.J.Robertson 編（Oxford:IRL Press）71-112頁(1987)〕、分裂上不活性なSNL76/7 支持細胞層 〔McMahonおよびBradley，A Cell 62:1073-1085（1990）〕上で増殖させたAB-1 系であった。他の適当なES系としては、E14系〔Hooperら、Nature 326:292-295 (1987)〕、D3系〔Ｄoeｔschmanら、J.Embryol ．Exp．Morph． 87:28-45(1985) 〕.、およびCCE 系〔Robertson ら、Neture 323:445:448(1986)〕が挙あげられ るが、それらに限定されないい。特異的な標的変異を有するES細胞からマウス系 統をうまく作製できるのは、ES細抱の多分化能性（即ち、宿主胚盤胞中に注入さ れれば、胚形成に参加することができ且つ生じた動物の生殖細胞に貢献すること ができるそれらの能力）に依存している。 任意の与えられたES細胞系の多分化能性は、培養時間およびそれに取り払った 注意によって異なり得る。多分化能性についての唯一の決定的アッセイは、使用 することになっているES細胞の特定集団がESゲノムの生殖細胞伝達を行うことが できるキメラ体を生成することができるかどうかを決定することである。この理 由により、遺伝子標的の前に、AB-I細胞の親集団の一部をC57O1/6J胚盤胞中に注 入し、該細胞がキメラマウスを生成できるかどうか、およびそれらのキメラ体の 大部分がESゲノムを子孫に伝達できるがどうかを確かめる。 κ鎖不活性化ベクタ−J/C K1を NotIで消化し、そして記載された方法〔Hasty ，P.R．ら、Nature 350:243-246(1991)〕によりAB-1細胞中にエレクトロポレー トぜしめた。エレクトロポレートされた細胞を100 mm皿上に２〜5×105細胞／皿 の密度で塗抹した。24時間後、G418（200μg/mlの活性成分）およびFIAU（0.5μ Ｍ）を培地に添加し、10〜11日に渡り薬剤耐性クローンを発達させた。クローン を採取し、トリプシン処理し、２部分に分け、更に増殖させた。次いで、各クロ ーンからの細胞の半分を凍結させ、もう半分をベクターと標的配列との間の相同 組換えについて分析した。 サザンブロットハイブリダイゼーションによりＤＮＡ分析を行った。記載の如 く〔Laird，P.W.ら、Nucl ．Acids Res． 19:4293 (1991)〕クローンからＤＮＡ を単離し、XbaＩで消化し、そして標特的プローブとして図25ｅに指摘の800 bpE coRI／Xba Ｉ断片を用いて探査した。このプローブは野生型遺伝子座中の3.7kb XbaＩ断片、および標的ベクターと相同組換えされた遺伝子座中の標徴的な1.8 k bバンドを検出した（図25ａおよびｅを参照のこと）。サザンブロット分析によ りスクリーニングした 901個のG４18およびFIAU体制クローンのうち、７つのク ローンがκ遺伝子のうちの１つへの相同組換えを示す1.8 kb XbaＩバンドを表し た。それらの４つのクローンを更に BgIII．Sac IおよびPstＩ酵素で消化し、 κ遺伝子のうちの１つに該ベクターが相同的に組み込まれたことを確認した。標 徴的800 bp EcoRI／Xba Ｉ断片（プローブＡ）を用いて探査すると、野生型ＤＮ ＡのBgIII．Sac ＩおよびPst Ｉ消化物がそれぞれ4.1，5.4，および7 kbの断片 を生成し、一方標的されたκ対立遺伝子の存在はそれぞれ2.4，7.5および5.７ k bの断片により指摘された（図25ａおよびｅを参照のこと）。XbaＩ消化物により 検出された７つの陽性クローンの全てが、κ軽鎖のところでの相同組換えに標徴 的である期待の BgIII，Sac Ｉおよび Pst Ｉ制限断片を示した。不活性化されたκ鎖を有するマウスの作製 前の章で記載した標的されたESクローンのうちの５つを、記載の如く〔8radle y．A．，Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells:A Practical Approach,E .J．Robertson 編 (Oxford: IRL Press)，113-151 頁(1987)〕C57B1/6J胚盤胞中 に注入し、そして偽妊娠雌の子官に移し、注入ES細胞から誘導された細胞と宿主 の胚盤胞との混合物に由来するキメラマウスを作製丁る。黒いC57B1/6J背景上に おいて、ES細抱系由来のアグーチ皮膜着色の量により、キメラ体へのES細胞の貢 献の程度を外観的に同定する。標的クローンの胚盤胞注入から得られた子孫のほ ぼ半分がキメラであり（即ち、アグーチ並びに黒い着色を示した）、それらの大 部分が皮膜着色への過剰のES細胞の貢献（70％以上）を示した。A81 ES細胞はXY 細胞系であり、それらの高率キメラ体の大部分が、コロニー形成された雄ES細胞 による雌胚の性転換のために雄であった。 雄のキメラをC57BL/6Jと交配さぜ、ESゲノムの生殖細胞伝達の指標である優性 のアグーチ皮膜色の存在について子孫を観察する。それらのクローンのうちの２ つからのキメラ体が一貫してアグーチ子孫を生産した。κ遺伝子座の唯一のコピ ーが注入ESクローンに標的されたので、各アグーチ子孫は変異遺伝子座を受け継 ぐ見込みを50％有した。尾部生検試料からのBgIII消化ＤＮＡのサザンブロット 分析により、標的ESクローンの同定に用いたプローブ（プローブＡ、図25ｅ）を 使って、標的遣伝子のスクリーニングを行った。予想通り、アグーチ子孫の約50 ％が4.1 kbの野生型バンドに加えて2.4 kbのハイブリダイズするBgIIIバンドを 示した。この結果は、標的されたκ遺伝子座の生殖細胞伝達を証明する。 該変異に対して同型接合性のマウスを生成せしめるために、異型接合体同士を 交配し、そして上述のようにして子孫のκ遣伝子型を決定した。予想通り、異型 接合体交配から３つの遺伝子型か誘導された：２コピーの正常κ遺伝子座を有す る野生型マウス、１コピーの標的κ遺伝子と１つのＮＴκ遺伝子を有する異型接 合体、およびκ変異に対して同型接合性であるマウス。それらの後者のマウスか らのκ配列の欠失は、Ｊκに特異的なプローブ（ブローブＣ、図25ａ）を使った サザンブロットハイブリダイゼーションにより確認した。該Ｊκプローブのハイ ブリダイゼーションは異型接合性子孫と野生型子孫からのＤＮＡ試料に観察され たが、一方で同型接合体には全くハイブリダイゼーションシグナルが検出されな かった。これは、標的変異の結果としての欠失によりκ遺伝子座の両方のコピー が不活性化されている新規マウス株の発生を証明する。実施例10 相同組換えによるマウス重鎖遺伝子の不活性化 この実施例は、胎児性幹(ES)細胞中での相同組換えによる内因性マウス免疫グ ロブリン重鎖遣伝子の活性化を記載する。方策は、ＪH領域が削除されそして選 択マーカー遺伝子neoにより置き換えられている重鎖配列を含むベクターとの相 同組換えにより内因性重鎖Ｊセグメントを欠失せしめることである。重鎖標的ベクターの作製 ＪH４特異的オリゴヌクレオチドプローブ ５′−ACT ATG CTA TGG ACT GGG GTC AAG GAA CCT CAG TCA CCG −３´ を使って、03 ES 細胞系〔Gossler ら、Proc ．Natl．Acad．Sci．U.S.A．83:906 5-9069（1986）〕から誘導されたゲノムファージライブラリーから、ＪH領域を 含むマウス重鎖配列（図26ａ）を単離した。 ＪH領域に及ぶ3.5 kbのゲノムSac I／Stu I断片を陽性ファージクローンから 単離し、それをSac.I／Sma Iで消化されたpUC18 中にサブクローニングした。 生じたプラスミドをpuc18ＪHと命名した。トランスフェクトされたES細胞の薬剤 選別に用いるネオマイシン耐性遺伝子(neo)は、プラスミド pGEM7 (KJI)の修復 変形から誘導された。文献中の報告〔Yenofskiら、Proc ．Natl．Acad．Sci.U.S. A．87 : 3435-3439(1990)〕は、pGEM7（KJI）中に使用されるneo遺伝子の源とし て働いた pMClneo〔ThomasおよびCappechi．Cell 51: 503-512(1987)〕を含む 幾つかの常用の発現ベクターの neoコード配列の点変異を証明している。 この変異は neo遺伝子産物の活性を減少させるが、該変異を含む制限断片を野 生型 neoクローンからの対応配列と置き換えることにより修復された。pGEM7（K Jl）中のHindlll部位を合成アダプターの付加によってSalＩ部位に変更し、そし てXba I／Sal Iでの消化によりneo 発現カセットを切り出した。次いで neo断 片の両端をＤＮＡ polＩのクレノウ形での処理により平滑末端化し、pUC13 JHの Nae I部位中にサブクローニングし、プラスミドpUC18 ＪH -neo（図26ｂ）を作 製した。 標的ベクターの更なる作製は、プラスミドpGPlbの誘導体において行った。pGP lbを制限酵素 Not Iで消化し、アダプターとして次のオリゴヌクレオチド 5′ −GGC CGC TCG ACG ATA GCC TCG AGG CTA TAA ATC TAG AAG AAT TCC AGC AAA GC T TTG GC- 3´ と連結せしめた。 生じたプラスミド（pGETと命名）を使ってマウス免疫グロブリン重鎖標的構成 物を構築した。 Mansour ら、Nature 336: 348-352(1988)により記載されたようにして、相同 組換え体を有するESクローンの冨化に備えるために、該構成物中に単純ヘルペス ウイルス(HSV)チミジンキナーゼ(TK)遺伝子を含めた。プラスミドpGEM(TK)からE coRIとHindIIIでの消化によりHSV TK遺伝子を得た。このTK DNA断片をpGMTのEco RI 部位とHindIII部位との間にサブクローニングし、プラスミドpGMT-TK（図26 ｃ）を作製した。 標的配列に対する広範な相同性領域を提供するために、陽性ゲノムファージク ローンから Xho IでのＤＮＡの限定消化および Xba Iでの部分消化により、ＪH 領域の５′に位置する5.9 kbのゲノムXba I／Xho I断片を誘導した。図26ａに示 されるように、このXba I部位はゲノムＤＮＡ中には存在せず、むしろ陽性ファ ージクローン中のクローン化ゲノム重鎖挿入断片にすぐに隣接するファージ配列 から誘導される。この断片をXba I／Xho Iで消化されたpGMT-TK中にサブクロー ニングし、プラスミド pGMT-TK-JH 5′（図27ｄ）を作製した。 作製の最終段階は、neo遺伝子および隣接するゲノム配列を含むpUC18 ＪH-neo からの2.8 kb EcoRI断片の切除を含んだ。この断片をクレノポリメラーゼにより 平滑末端にし、同様に平滑末端化されたpGMT-TK-JH ５′のXhoＩ部位中にサブク ローニングした。生じた構成物ＪH KOl（図27ｅ）は、ＪH遺伝子座を隣接する6. 9 kbのゲノム配列を含み、neo 遣伝子が中に挿入されているＪH 領域に及ぶ2.3 kbの欠失を有する。図27fは、標的用構成物との相同組換え後の内因性重鎖遺伝 子の構造を示す。実施例11 標的されたES細胞の生産および分析 本質的には記載された通りに〔Robertson．E.J.(1987) Terato-carcinomas an d Embryonic Stem Cells:A Practical Approach ， E.J.Robertson編 (Oxford: IRL Press)，71-112頁〕、分裂上不活性なSNL76/7 支持細胞層〔McMahon および Bradley，Cell 62: 1073-1085(1990)〕上でAB-1 ES細胞を増殖させた。前の実 施例に記載した通り、標的指向性構成物ＪH KOl によるES細胞のエレクトロポレ ーションの前に、ESゲノムの生殖細胞伝達能力を有することが証明されたAB-1由 来のキメラの作製により、ES細胞の多分化能力を決定した。 重鎖不活性化ベクタ−ＪH.KOl をNot Iで消化し、そして記載された方法〔Has ty ら、Nature 350: 243-246 (1991)〕にこよりAB-1細胞中にエレクトロポレー トせしめた。エレクトロポレートされた細胞を100 mm皿上に1〜2×105細胞／皿 の密度で塗抹した。24時間後、G418（200 mg／mlの活性成分）およびFIAU（0.5m M）を培地に添加し、８〜10日間に渡り薬剤耐性クローンを発達させた。クロー ンを採取し、トリプシン処理し、２部分に分け、更に増殖させた。次いで、各ク ローンからの細胞の半分を凍結させ、もう半分をベクターと標的配列との間の相 同組換えについて分析した。 サザンプロットハイブリダイゼーションによりＤＮＡ分析を行った。記載の如 く〔Laird ら、Nucl ．Acids Res． 19:4293 (1991)〕クローンからＤＮＡを単 離 し、Stu Iで消化し、そしてプローブＡとして図27ｆに示される500 bp EcoRI／S tu I断片を用いて探査した。このプローブは野生型遣伝子座中の 4.7 kb StuI断 片を検出し、一方で3 kbバンドは標的指向ベクターと内因性配列の相同組換えに 標徴的である（図26ａおよび27ｆを参照のこと）。サザンブロットハイブリダイ ゼーションによりスクリーニングした525 個のG418およびFITU二重耐性クローン のうち、12個が標的指向ベクターとの組換えに標徴的な3 kb断片を含むことがわ かった。それらのクローンがＪH 遣伝子座のところに期待の標的現象（図27ｆに 示されるような）示すことは、HindIII、Spe IおよびHpa Iでの更なる消化によ り確認された。 Hindlll、Spe IおよびHpa Iで消化されたＤＮＡのサザンプロットへのプロー ブＡ、（図27ｆ参照）のハイブリダイゼーションは、野生型遣伝子座については それぞれ2.3 kb、＞10 kbおよび＞10 kbのバンドをもたらし、一方標的された鎖 遺伝子座についてはそれぞれ5.3 kb、3.8 kbおよび1.9 kbのバンドが予想される （図27ｆ参照）。Stu I消化物により検出された12個の陽性クローンの全てが、 標的ＪH遺伝子に標徴的な推定HindIII、Spe IおよびHpa Iバンドを示した。加え て、neo-持異的プローブ（プローブＢ、図27ｆ）を使った12個のクローン全ての Stu I消化物のサザンプロット分析は3 kbの推定断片のみを生じ、それらのクロ ーンが各々標的指向ベクターの単一コピーを含有することを証明した。ＪH 欠失を有するマウスの作製 前の章で記載した標的されたESクローンのうちの３つを解凍し、記載の如く- 〔Bradley，A．(1987)Teratocarcinomas and EmbryonicStem Cells: A Practica lApprocach ，E．J．Robertson編 (Oxford: IRL Press)．113-151 頁(1987)〕C5 7B1/6J胚盤胞子中に注入し、そして偽妊娠雌の子官に移した。黒色C5781/6J背景 上において、ES細胞系由来のアグーチ皮膜着色の量から、キメラ体へのES細胞の 貢献の程度を外観的に同定する。２つの標的クローンの胚盤胞注入から得られた 子孫のほぼ半分がキメラであり（即ち、アグーチ並びに黒い着色を示した）、３ つ目の標的クローンはキメラ動物を生じなかった。それらのキメラ体の大部分が 皮膜着色へのES細胞のかなりの貢献度（70％以上）を示した。ABl ES細胞はXY細 胞系で あり、キメラ体の大部分は、コロニー形成された雌胚が雄ES細胞により性転換さ れたために雄であった。雄キメラをC57BL/6J雌と交配させ、ESゲノムの生殖細胞 伝達の標徴である優性のアグーテ皮膜色の存圧について子孫を観察する。 それらのクローンのうちの両方からのキメラ体が一貫してアグーチ子孫を生産 した。重鎖遺伝子座の唯一のコピーが注入ESクローン中に標的されたので、各ア グーチ子孫は変異遺伝子座を受け継ぐ見込みを50％有した。尾部生検試料からの Stu I消化ＤＮＡのサザンブロット分析により、標的ESクローンの同定に用いた プローブ（プローブＡ、図27ｆ）を使って、標的遺伝子のスクリーニングを行っ た。予想通り、アグーチ子孫の約50％が4.7 kbの野生型バンドに加えて約3 kbの ハイブリダイズする。Stu Iバンドを示した。この結果は、標的されたＪH 遺伝 子座の生殖細胞伝達を証明する。 該変異に対して同型接合のマウスを作製するために、異型接合体同士を交配し 、そして上述のようにして子孫の重鎖遺伝子型を決定した。予想通り、異型接合 体交配から３つの遣伝子型が誘導された：２コピーの正常ＪH 遺伝子座を有する 野生型マウス、該遺伝子の１つの標的コピーと１つの正常コピーを有する異型接 合体、およびＪH 変異に対して同型接合であるマウス。それらの後者のマウスか らのＪH 配列の欠失は、ＪH に特異的なプローブ（プローブＣ、図26）を使った サザンブロットハイブリダイゼーションにより確認した。異型接合性子孫と野生 型子孫からのＤＮＡ試料において4.7 kb断片へのＪH プローブのハイブリダイゼ ーションが観察されたが、一方でＪH 変異体同型接合体からの試料には全くシグ ナルが検出されなかった。これは、ＪH 配列の欠失により重鎖遺伝子の両方のコ ピーが変異されている新規マウス株の生成を証明する。実施例12 重鎖小遺伝子座トランジーン Ａ．大型ＤＮＡ配列をクローニングするためのプラスミドベクターの作製 1. pGPla プラスミドpBR322を EcoRIと StyＩで消化し、そして次のオリゴヌクレオチド オリゴ−42 ５′-caa gag ccc gcc taa tga gcg ggc ttt ttt ttg cat act gcg gcc gct −３′ オリゴ−43 ５′−aat tag cgg ccg cag tat gca aaa aaa agc ccg ctc att ag g cgg gct −３′ と連結せしめた。 生じたプラスミド pGPlaを、稀少切断性制限酵素 NotＩにより切除することが できる非常に大型ＤＮＡ構成物をクローニングするために改変する。それは、tr pA遺伝子に由来する強力な転写終結シグナル〔Christieら、Proc ．Natl．Acad.S ci．USA 78:4180 (1981)〕の下流に（アンピシリン耐性遺伝子AmpRに関して）N otＩ制限部位を含む。この終結シグナルは、AmpR遺伝子からの読み通し転写を排 除することにより、NotＩ部位中に挿入されるコード配列の潜在的毒性を低下さ せる。加えて、このプラスミドは、pBR322コピー数調節領域を保持しているため に pUCプラスミドに比較して低コピー数である。この低コピー数も挿入配列の潜 在的毒性を更に低下させ、そしてＤＮＡ複製による大型挿入断片に対する選択を 減少させる。ベクター pGPlb，pGPlc，pGPldおよびpGPlf はpGPla から誘導され 、そして異なるポリリンカークローニング部位を含む。そのポリリンカー配列を 下記に与える。 化1それらの各プラスミドは大型トランスジーン挿入断片の作製に利用することがで き、該挿入断片は NotIで切り出すことができ、その結果トランスジーンＤＮＡ をマイクロインジェクション前に、ベクター配列から精製することができる。 2． pGPlb pGPlaを NotIで消化し、そして次のオリゴヌクレオチド： オリゴ−47 ５′−ggc cgc aag ctt act gct gga tcc tta att aat cga tag tg a tct cga ggc−３′ オリゴ−43 ５′−ggc cgc ctc gag atc act gat taa tta agg atc cag cag ta a gct tgc −３′ と連結せしめた。 生じたプラスミド pGPlbは、NotIにより隣接された短いポリリンカー領域を含 む。これは、NotIにより切除することができる大型挿入断片の作製を容易にする 。 3．pGPe 次のオリゴヌクレオチド オリゴ−44 ５′−ctc cag gat cca gat atc agt acc tga aac agg gct tgc − ３′ オリゴ−45 ５′−ctc gag cat gca cag gac ctg gag cac aca cag cct tcc − ３′ を使って、ポリメラーゼ連鎖反応技術によりラット肝臓ＤＮＡ由来の免疫グロブ リン重鎖３′エンハンサー〔S．Pettersonら、Nature344:165-168 (1990)〕を増 幅せしめた。 増幅生成物を BamHIとSph．Iで消化し、そして BamHI／Sph Iで消化されたpNN O3（pNNO3 は、記載順に次の制限部位：Not I，BamHI，Nco I，Cla I，EcoRV，X ba I，Sac I，Xho I，Sph I，Pst I，Bgl II，EcoRI，Sma I，Kpn I,HindIII お よび Not Iを有するポリリンカーを含む pUC由来のプラスミドである）中にクロ ーニングした。生じたプラスミドpRE3を BamHIとHindIII で消化し、そしてラッ トＩg重鎖３′エンハンサーを含む挿入断片を、BamHI／HindIIIで消化されたpGP lb中にクローニングした。生じたプラスミドpGPe（図28および（化２）及び（化 ３））は、配列をクローニングすることができそして次いで Not I消化によって ３′エンハンサーと一緒に切り出すことがかできる幾つかのユニーク制限部位を 含有する。 化2 及び 化3 ベクターｐＧＰｅの配列 Ｂ．IgM を発現する小遺伝子座トランスジーン pIGMlの作製 1. Ｊ−μ定常領域クローンの単離およびpJMlの作製 ファージベクターλEMBL3/SP6/T7（Clonetech Laboratories，Inc.，Palo Alt o，CA)中にクローニングしたヒト胎盤ゲノムＤＮＡライブラリーを、ヒト重鎖Ｊ 領域特異的オリゴヌクレオチド： オリゴ−１ ５′−gga ctg tgt ccc tgt gtg atg ctt ttg atg tct ggg gcc aa g−３′ を用いてスクリーニングし、そしてファージクローンλ1.3を単離した。６つの Ｊセグメント全部並びにＤセグメントOHG52 および重鎖Ｊ−μイントロンエンハ ンサーを含む、6 kbのHindIII／Kpn I断片をこのクローンから単離した。同じラ イブラリーをヒトμ特異的オリゴヌクレオチド： オリゴ−２ ５′−cac caa gtt gac ctg cct ggt cac aga cct gac cac cta t ga −３′ を用いてスクリーニングし、ファージクローンλ2.1を単離した。μスイッチ領 域およびμ定常領域エクソンの全部を含む、10.5 kbのHindIII ／Xho I断片をこ のクローンから単離した。それらの２断片を、Kpn I／Xho Iで消化されたpNNO3 と一緒に連結せしめ、プラスミドpJMIを得た。 2． pJM2 ファージクローンλ2.1から4 kbのXho I断片を単離した。該断片は、ある種の IgO発現Ｂ細胞中でのμ遺伝子のδ関連欠失に関与するいわゆるΣμ要素〔HYasu iら、Eur ．J．Immunol 19:1399 (1989)；これは参考として本明細書中に組み込 まれる〕を含む、pJMlの配列のすぐ下流の配列を含有する。この断片をＤＮＡポ リメラーゼＩのクレノウ断片で処理し、そして Xho Iで切断されクレノウで処理 されたpJMlと連結せしめる。生じたプラスミドpJM2（図29）は、内部の Xho I部 位を失っているが、クレノウ酵素による不完全な反応の結果として３′Xh o Iを保持している。pJM2は完全なヒトＪ領域、重鎖Ｊ−μイントロンエンハン サー、μスイッチ領域およびμ定常領域エクソン全部、並びにμ遺伝子のδ関連 欠失に関与する２つの0.4 kbの直接反復σμおよびΣμを含有する。 3． Ｄ領域クローンの単離およびpOH1の作製 次のヒトＤ領域特異的オリゴヌクレオテド オリゴ−４ ５′−tgg tat tac tat ggt tcg ggg agt tat tat aac cac agt gt c −３′ を用いて、ヒト胎盤ゲノムライブラリーをＤ領域クローンについてスクリーニン グした。ファージクローンλ4.1とλ4.3を単離した。Ｄ要素ＤK1．ＤN1およびＤM2 〔Y．Ichihara ら、EMBO J．7: 4141 (1988)〕を含む5.5 kbの Xho I断片をフ ァージクローンλ4.1から単離した。Ｄ要素ＤLR1，ＤXP1，ＤXP'1およびＤA1を 含む上流の隣接5.2 kb Xho I断片をファージクローンλ4.3から単離した。それ らのＤ領域 Xho I断片の各々をプラスミドベクターρSP72（Promega，Madison、 WI)のSal I部位中にクローニングし、２配列を結合する Xho I部位を破壊した。 次いで上流断片を Xho IとSma Iで切り出し、下流断片を EcoRVと Xho Iで切り 出した。得られた単離断片を Sal Iで消化されたpSP2と一緒に連結せしめ、プラ スミドpOH1を与えた。pOH1は、少なくとも７つのＤセグメントを含みXho I（５ ′）およびEcoRV（３′）で切り出すことができる10.6kbの挿入断片を含有する 。 4. pCOR1 プラスミドpJM2をAsp718（Kpn Iのアイソシゾマー）で消化し、そしてDNA-ポ リメラーゼＩのクレノウ断片を用いて突出末端をフィルインした。次いで生じた DNA をCla Iで消化し、挿入断片を単離した。この挿入断片をpOH1の XhoI／EcoR V 挿入断片および XhoI／Cla I消化pGPeと連結せしめ、pCOR1 を作製した（図30 ）。 5． pVH251 ２つのヒト重鎖可変領域セグメントＶH 251 とＶH 105〔Humphrise ら、Hatur e 331:446（1988)〕を含む10.3 kbのゲノムHindIII断片をpSP72中にサブクロー ニングし、プラスミドpVH251を与えた。 6. pIGM1 プラスミドpCOR1 を XhoIで部分消化し、そしてpVH251の単離Xho I／Sal I挿 入断片を上流の XhoI部位にクローニングし、プラスミド pIGM1（図31）を作製 した。pIGM1 は、下記の配列要素の全邪が NotIでの消化によりベクター配列を 含まない単一断片において単離することができそしてマウス胚の前核中にマイク ロインジェクトすることができるように、２つの機能的ヒト可変領域セグメント 、少なくとも８つのヒトＤセグメント、６つのヒトＪH セグメント全部、ヒトμ エンハンサー、ヒトσμ要素、ヒトμスイッチ領域、ヒトμコードエクソン全部 およびヒトΣμ要素を、ラット重鎖３′エンハンサーと共に含有する。 Ｃ．IgM とIgGを発現する小遺伝子座トランスジーンpHClの作製 1. γ定常領域クローンの単離 次のヒトIgG 定常領域遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチド オリゴ−29 ５′−cag cag gtg cac acc caa tgc cca tga gcc cag aca ctg ga c −３′ を用いてヒトゲノムライブラリーをスクリーニングした。ファージクローンλ29 4とλ29.5を単離した。γスイッチ領域を含むファージクローンλ29.4の 4 kbHi ndIII断片を使って、ファージベクターラムダ FIXTMIII (Stratagene，La JoIIa ，CA)中にクローニングされたヒト胎盤ゲノムＤＮＡライブラリーを探査した。 ファージクローンλSgl.13を里離した。異なるγクローンのサブクラスを決定す るために、鋳型として上記３つのファージクローンの各々のサブクローンを使っ てそしてプライマーとして次のオリゴヌクレオチド オリゴ−67 ５′−tga gcc cag aca ctg gac −３′ を使って、ジデオキシ配列決定反応を実施した。 ファージクローンλ29.５とλS γ1.13は両方ともγ1サブクラスであると決定 された。 2. o γel γ１コード領域を含むファージクローンλ29.5の7.8 kb Hind III 断片をpUC1 8中にクローニングした。生じたプラスミドpLT1を Xho Iで消化し、クレノウ断 片で処理し、そして再連結せしめて内邪Xho I部位を破壊した。生じたクローンp LTlxkをHindIIIで消化し、挿入断片を単離し、pSP72 中にクローニングしてプラ スミドクローンpLTlxks を作製した。ポリリンカーXho I部位とヒト配列由来のB amHI 部位のところでのpLTlxksの消化は、γ１定常領域コードエクソンを含む7. 6 kb断片を与えた。この7.6 kb Xho I／BamHI 断片を、ファージクローンλ29.5 からの隣接の下流4.5 kb BamHI断片と一緒に、Xho I／BamHI で消化されたpGPe 中にクローニングし、プラスミド pγe1を作製した。pγe1は、ラット重鎖３′ エンハンサーに連結された、5 kbの下流配列と共にγ１定常領域コードエクソン の全部を含有する。 3. p γe2 γ１スイッチ領域とスイッチ前繁殖不能転写物(sterile trans-cript)〔P．Si derasら、International Immunol. 1:631(1989)〕の第一エクソンとを含む5.3 k bのHindIII 断片をファージクローンλSγ1.13から単離し、そして挿入断片の５ ′末端の近隣にポリリンカー Xho I部位を有するpSP71 中にクローニングし、プ ラスミドクローンpSγlsを作製した。pSγlsの Xho I／Sal I挿入断片をXho Iで 消化されたpγe1中にクローニングし、プラスミドクローンpγe2を作製した（図 32）。pγe2は、ラット重鎖３′エンハンサーに連結された、下流の5kb配列と共 に、γ１定常領域コードエクソン全部並びに上流のスイッチ領域および緊殖不能 転写物エクソンを含有する。 4. pHC1 プラスミドpIGM1 を Xho Iで消化し、43 kb 挿入断片を単離し、そして Xho I で消化されたpγe2中にクローニングし、プラスミドpHC1を作製した（図31）。 pHC1は、下記の配列要素の全部が Not Iでの消化によりベクター配列を含まない 単一断片において単離しそしてマウス胚の前核中にマイクロインジェクトしてト ランスジェニック動物を作製することができるように、ラット重鎖３′エンハン サーと共に、２つの機能的ヒト可変領域セグメント、少なくとも８つのヒトＤセ グメント、６つのヒトＪHセグメント全部、ヒトＪ−μエンハンサー、ヒトσμ 要素、ヒトμスイッチ領域、ヒトμコードエクソン全部、ヒトΣμ要素、および ヒトγ１定常領域（関連のスイッチ領域および繁殖不能転写物関連エクソンを含 む）を含有する。 Ｄ．IgM とIgG を発現する小遺伝子鎖トランスジーンpHC2の作製 １．ヒト重鎖Ｖ領域遺伝子 VH49.8 の単離 ヒト胎盤ゲノムＤＮＡライブラリーラムダ FIXTM II(Stratagene，La Jolla,C A)を、次のヒトVH1 ファミリー特異的オリゴヌクレオチド： オリゴ−49 5'-gtt aaa gag gat ttt att cac ccc tgt gtc ctc tcc aca ggt g tc−3' を用いてスクリーニングした。 ファージクローンλ49.8を単離し、そして可変セグメントVH49.8を含む6.1 kb Xba I断片をpNNO3 中にサブクローニングし（ポリリンカー Cla I部位がVH49.8 の下流にそしてポリリンカー Xho I部位が上流にくるように）、プラスミドpVH4 9.8を作製した。この挿入断片の800 bp領域を配列決定すると、VH49.8は転写解 読枠並びに完全なスプライシングシグナルおよび組換えシグナルを有することが わかり、よって該遺伝子が機能的であることを指摘する（表２）（化４）（化５ ）。 化４ 及び 化５ ヒトＶHＩファミリー遺伝子ＶH49.8の配列 2．pV2 プラスミドｐUCl2中にサブクローニングされたヒトＶH IVファミリー遺伝子ＶH 4-21〔I．Sanz ら、EMBO J．8: 3741 (1989)〕を含む4 kb Xba Iゲノム断片をS ma IとHindIII で切り出し、ポリメラーゼIのクレノウ断片で処理した。平滑末 端化された断片を、Cla Iで消化されクレノウで処理されたpVH49.8 中にクロー ニングした。生じたプラスミド pV2は、挿入断片の３′末端のユニーク Sal I部 位および５′末端のユニーク Xho I部位を使って、同じ方同でVH4-21[の上流に 連結された、ヒト重鎖遺伝子VH49.8を含む。 3．pS γ1-5' 近隣の上流3.1 kb Xba I断片と一緒に0.7 kb Xba I／HindIII 断片（プラスミ ド pγe2中の 5.3 kb γ１スイッチ領域含有断片のすぐ上流で且つそれに隣接し た配列を表す）をファージクローンλSg1.13から単離し、そしてHindIII／XbaI で消化された pUCl8ベクター中にクローニングした。生じたプラスミドpSγ1-5' は、γ１イソタイプにスイッチする前のＢ細胞中に見つかる繁殖不能転写物(ste rile transcript)〔P. Siderasら、International Immunol.，1: 631 (1989)〕 の開始部位の上流の配列を表す3.8 kb挿入断片を含む。該転写物はイソタイブス イッチの開始に関係があり、そして上流のシス作用性配列はしばしば転写調節に 重要であるので、繁殖不能転写物の正しい発現および関連するスイッチ組換えを 促進するためにそれらの配列がトランスジーン構成物中に含まれる。 4．pVGEl pSγ1-5'挿入断片を Sma IとHindIII で切り出し、クレノウ酵素で処理し、そ して次のオリゴヌクレオチドリンカー 5′−ccg gtc gac cgg − 3′ と連結せしめた。この連結生成物を Sal Iで消化し、Sal Iで消化されたpV2 に 連結せしめた。 生じたブラスミドpVP は、２つの機能的ヒト可変遺伝子セグメントVH49.8とVH 4-21（表２（化４）及び（化５）参照）の下流に連結された3.8 kbのγ１スイッ チ５′隣接配列を含む。Sal Iでの部分消化および Xho Iでの完全消化の後、ア ガロースゲル上での15kb断片の精製により、pVP 挿入断片を単離する。次いで該 挿入断片を pγe2の Xho I部位中にクローニングし、プラスミドクローンpVGE1 （図33）を作製する。pVGE1 は、ヒトγ１定常遺伝子および関連のスイッチ領域 の上流に２つのヒト重鎖可変遺伝子セグメントを含有する。可変領域と定常領域 との間のユニークSal I部位を用いて、Ｄ，Ｊおよびμ遺伝子セグメントをクロ ーニングすることができる。γ１遺伝子の３′末端にラット重鎖３′エンハンザ ーが連結され、そして挿入断片全体は Not I部位により隣接される。 5．pHC2 プラスミドクローンpVGE1をSal Iで消化し、pIGM1 のXho I挿入断片をその中 にクローニングした。生じたクローンpHC2（図31）は、４つの機能的ヒト可変領 域セグメント、少なくとも８つのＤセグメント、６つのヒトＪHセグメント全部 、ヒトＪ−μエンハンサー、ヒトσμ要素、ヒトμスイッチ領域、ヒトμコード エクソン全部、ヒトΣμ要素、およびヒトγ１定常領域（繁殖不能転写物開始部 位の上流の4 kb隣接配列と共に、関連のスイッチ領域と繁殖不能転写物関連エク ソンを含む）を含有する。 それらのヒト配列は、前記配列要素全部を Not Iでの消化によりベクター配列 を含まない単一鎖上に単離しそしてマウス胚の前核中にマイクロインジェクトし てトランスジェニック動物を生せしめることができるように、ラット重鎖３′エ ンハンサーに連結される。該挿入断片の５′末端のユニーク Xho I部位を使って 、追加のヒト可変遺伝子セグメントをその中にクローニングし、この重鎖小遺伝 子座の組換え多様性を更に増大させることができる。 Ｅ．トランスジェニックマウス プラスミドpIGM1 およびpHC1の Not I挿入断片をアガロースゲル電気泳動によ りベクター配列から単離した。精製された挿入断片を、受精した（C57BL/6×CBA ）F2マウスの胚の前核中にマイクロインジェクトし、そして生存している胚を 、Hogan らにより記載された通りに（B．Hogan，F．Costantini およびE．Lacy ，Methods of Manipulating the Mouse Embryo，1986，Cold Spring Harbor Lab oratory．New York）偽妊娠した雌に移した。注入された胚から発育したマウス を、尾部ＤＮＡのサザンプロット分析によりトランスジーン配列の存在について 分折した。既知量のクローン化ＤＮΛを含有する対照標準物に比較したバンド強 度により、トランスジーンコピー数を評価した。 ３〜８週齢において、それらの動物から血清を単離し、そしてHarlowおよびLa ne（E．Harlow およびD．Lane,Antibodies: A Laboratory Manual，1988，ColdS pring Harbor Laboratory, New York）により記載されたように、トランスジー ンによりコードされるヒトIgＭおよびIgＧ１の存在について ELISAによりアッセ イした。マイクロタイタープレートのウエルを、ヒトIgＭに特異的なマウスモノ クローナル抗体（クローンAF6，＃0285，AMAC，Inc．Westbrook, ME）およびヒ トIgＧに特異的なマウスモノクローナル抗体（クローンJL512，＃0280，AMAC，I nc.Westbrook, ME）によりコーティングした。該ウエル中に血清試料を連続的に 希釈し、予備吸着させることによってマスウ免疫グロブリンとの交差反応性を最 小限にしたアフィニティー単離されたアルカリホスファターゼ接合ヤギ抗ヒトIg （多価）を用いて、特異的免疫グロブリンの存在を検出した。 表１と図34は、プラスミドpHC1のトランスジーン挿入断片を注入した胚から発 育した２匹の動物の血清中のヒトIgＭおよびIgＧ１の存在についてのELISAアッ セイの結果を示す。このアッセイにより試験した対照の非トランスジェニックマ ウスは全て、ヒトIgＭおよびIgＧの発現について陰性であった。pIGN1 Not I挿 入断片を含有する２系統のマウス（系統＃6と15）はヒトIgＭを発現するがヒトI gＧ１を発現しない。我々はpHC1挿入断片を含む６つの系のマウスを試験した。 その結果、４系統（系＃26，38，57および122）がヒトIgＭとヒトIgＧ１の両方 を発現し、２系統のマウス（系統＃19および21）は検出可能なレベルのヒト免疫 グロブリンを発現しなかった。 ヒト免疫グロブリンを発現しなかったpHC1トランスジェニックマウスは、マイ クロインジェクトした胚から直接発育したものであり、該トランスジーンの存在 についてモザイクであり得る、いわゆるＧ0マウスであった。サザンブロット分 析は、それらのマウスの多くが細胞あたり該トランスジーンの１つまたは少数の コピーを含むことを示した。pIGM1トランスジェニック動物の血清中のヒトIgＭ 、並びにpHC1トランスジェニック動物の血清中のヒトIgＭとIgＧ１の検出は、ト ランスジーン配列がＶＤＪ連結、転写およびイソタイプスイッチを指令すること において正しく機能しているという証拠を提供する。１匹の動物(＃18)は、サザ ンブロット分折によりトランスジーンについて陰性であり、検出可能レベルのヒ トIgＭまたはIgＧ１を全く示さなかった。２番目の動物(＃38)は、サザンブロッ ティングによりアッセイすると該トランスジーンの約５コピーを含んでおり、そ して検出可能レベルのヒトIgＭとIgＧ１の両方を示した。トランスジーンを注入 した胚から発育した11匹の動物についてのELISAアッセイの結果を下表（表１） に要約する。 表１ 表１ ELISA アッセイによるトランスジェニック動物の 血清中のヒトIgＭおよびIgＧ1の検出 注入した 細胞あたりのおよその 動物＃ トランスジェン トランスジェンコピー数 ヒトIgＭ ヒトIgＧ１ 6 pIGM1 1 ＋＋ − 7 pIGM1 0 − − 9 pIGM1 0 − − 10 pIGM1 0 − − 12 pIGM1 0 − − 15 pIGM1 10 ＋＋ − 18 pHC1 0 − − 19 pHC1 1 − − 21 pHC1 ＜1 − − 26 pHC1 2 ＋＋ ＋ 38 pHC1 5 ＋＋ ＋ 表１は、組み込まれたトランスジーンＤＮＡの存在と血清中のトランスジーン によりコードされる免疫グロブリンとの間の相関関係を示す。pHC1トランスジー ンを含むことがわかった動物のうちの２匹は、検出可能なレベルのヒト免疫グロ ブリノを発現しなかった。それらは共に低コピー動物であり、該トランスジーン の完全なコピーが含まれていないか、または該動物が遺伝的モザイクを有してい る（動物＃21について評価された細胞あたり＜１コピーにより指摘される）こと があり、そしてトランスジーン含有細胞が造血系統に移っていない場合がある。 あるいは、トランスジーンがそれらの発現に至らないゲノム領域中に組み込まれ ている場合がある。pIGM1 トランスジェニック動物の血清中のヒトIgＭの検出、 並びにpHC1トランスジェニック動物の血清中のヒトIgＭとIgＧ１の検出は、トラ ンスジーン配列がＶＤＪ結合、転写およびイソタイプスイッチを指令する上で正 しく機能することを指摘する。 Ｆ．cDNA クローン ＶＤＪ連結およびクラススイッチ、並びにＢ細胞発達および対立遺伝子排除に おけるトランスジーンがコードするヒトＢ細胞レセプターの関与に関するpHC1ト ランスジーンの機能性を評価するために、トランスジェニックマウス脾臓mRNAか ら誘導した免疫グロブリンcDNAクローンの構造を調べた。ＤおよびＪセグメント 用法、Ｎ領域の付加、CDR3の長さ分布、並びに機能的mRNA分子をもたらす接合部 の頻度に焦点を合わせて、該トランスジーンによりコードされる重鎖の総合的多 様性を調べた。VH105 とVH251 を組み込んだIgM およびIgＧをコードする転写物 を調べた。 第11週の雄第二世代57系列pHC1トランスジェニックマウスからポリアデニル化 ＲＮＡを単離した。このＲＮＡを使ってオリゴｄＴ開始−本鎖cDNAを合成した。 次いで得られたcDNAを、次の４つの合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして 使った４つの各ＰＣＲ増幅反応のための鋳型として使用した：VH251特異的オリ ゴ−149 ctagct cga gtc caa gga gtc tgt gcc gag gtg cag ctg（g,a,t,c） ；VH105 特異的オリゴ−150 gtt gct cga gtg aaa ggt gtc cag tgt gag gtg ca g ctg（g,a,t,c）；ヒトγ１特異的オリゴ−151 ggc gct cga gtt cca cga cac cg t cac cgg ttc；およびヒトμ特異的オリゴ−152 cct gct cga ggc agc caa cgg cca cgc tgc tcg。反応１はプライマー o-149とo-151 を使って VH251−γ１転 写物を増幅せしめ、反応２はプライマー o-149とo-152 を使って VH251−μ転写 物を増幅せしめ、反応３はプライマー o-150とo-151 を使ってVH105−γ１転写 物を増幅せしめ、そして反応３はプライマーo-150 とo-152 を使って、VH105− μ転写物を増幅せしめた。 得られた0.５ kbのＰＣＲ産物をアガロースゲルから単離した。対応するELISA データ（図40）と一致しで、μ転写物産物はγ転写物産物よりも豊富であった。 ＰＣＲ産物を Xho Iで消化し、プラスミドpNN03 中にクローニングした。４つの ＰＣＲ増幅の各々からの９個のクローンのミニプレプから二本鎖プラスミドＤＮ Ａを単離し、そしてジデオキシ配列決定反応を実施した。該クローンのうちの２ つがＤまたはＪセグメントを含まない欠失体であることがわかった。それらは正 常のＲＮＡスプライシング生成物からは誘導することができなかったので、おそ らくＰＣＲ増幅中に導入された欠失から生じたのであろう。該ＤＮＡ試料のうち の１つは、２つの個々のクローンの混合物であることがわかり、そして他の３つ のクローンは読み取り可能なＤＮＡ配列を生成しなかった（おそらくＤＮＡ試料 か十分に純粋でなかったためであろう）。 残りの30個のクローンからのＶＤＪ接合部のＤＮＡ配列を（化６）（及び化７ ）にまとめた。各配列はユニークであり、遺伝子再配列の単一経路が優性でない こと、またはトランスジーン発現性Ｂ細胞の単一クローンが優性でないことを示 す。どの２配列も類似していないという事実は、免疫グロブリンの莫大な多様性 が２個のＶセグメント、10個のＤセグメントおよび６個のＪセグメントのみを含 む小型の小遺伝子座から発現され得るという暗示でもある。該トランスジーン中 に含まれるＶセグメントの両方、６個のＪセグメントの全部および10個のＤセグ メントの７個がＶＤＪ接合部に使われる。 加えて、両定常領域遺伝子（μとγ１）が転写物中に含まれる。VH105プライ マーは実施した反応においてVH105に特異的であることがわかった。従って、反 応３および４からのクローンの多くがVH251転写物を含んでいた。更に、連結反 応３のＰＣＲ産物から単離されたクローンはIgＧよりもむしろIgＭをコードする ことがわかった；しかしながら、これは、ＤＮＡを同一ゲル上で単離したため、 反応４からのＰＣＲ産物による汚染を表すかもしれない。成人末梢血リンパ球（ ＰＢＬ）から免疫グロブリン重鎖配列を増幅せしめそしてＶＤＪ接合部のＤＮＡ 配列を決定した同様な実験が、細菌Yamadaらにより報告された〔J ．Exp．Med.17 3: 395-407（1991）；これは参考として本明細書中に組み込まれる〕。このヒト ＰＢＬからのデータをpHC1トランスジェニックマウスからの我々のデータと比較 した。 化６ 及び 化７Ｇ．Ｊセグメント選択 表２は、成人ＰＢＬ免疫グロブリン転写物中に見つかるＪセグメントに対して 、pHC1トランスジーンによりコードされる転写物中に取り込まれるＪセグメント の分布を比較した。それらの分布プロフィールは非常に類似しており、両系とも Ｊ４セグメントが優性セグメントであり、次いでＪ６セグメントが優性である。 Ｊ２はヒトＰＢＬ中およびトランスジェニック動物中で最も稀なセグメントであ る。 表2 表2 Ｊセグメント選択 使用％（±3％） Ｊセグメント HCI トランスジェニック動物 ヒトＰＢＬ Ｊ1 7 1 Ｊ2 3 ＜1 Ｊ3 17 9 Ｊ4 44 53 Ｊ5 3 15 Ｊ6 26 22 100％ 100％ Ｈ．Ｄセグメント選択 Yamadaらにより分析されたクローンの49％（82のうち40）が、pHClトランスジ ーン中に含まれるＤセグメントを含んでいた。他の11クローンは、該著者らによ り既知Ｄセグメントのいずれにも指定されなかった配列を含んだ。それらの指定 されなかった11個のクローンのうちの２つは、pHCl構成物中に含まれるDlR2セグ メントの逆位から誘導されるようだ。lchiharaら〔EMBO J ． 7: 4141 (1988)〕 により予想されそしてSanz 〔J.lmmunol．147:1720-1729(1991)〕により観察さ れたこの機構を、Yamadaら〔J ．Exp．Med. 171:395-407(1991)〕は考慮に入れな かった。表２は、pHClトランスジェニックマウスについてのＤセグメント分布と YamadaらによりヒトＰＢＬ転写物について観察されたものとの比較である。Yama daらのデータを、DlR2使用を包含しそしてpHClトランスジーン中にないＤセグメ ントを除外するように再編集した。 表３は、Ｄセグメント組み込みの分布がトランスジェニックマウスとヒトＰＢ Ｌとにおいて非常に類似していることを証明する。２つの優性なヒトＤてグメン トOXP’１とDNlは、トランスジェニックマウス中にも高頻度で見つかる。２つの 分布間の最も大きな相違点は、ヒトに比べてトランスジェニックマウス中でのDH Q52の高頻度である。DHQ52の高頻度はヒト胎児肝臓中のＤセグメント分布を思い 出させる。Sanzは重鎖転写物の14％がDHQ52配列を含んだことを報告している。p HCl中に見つからないＤセグメントを分析から除外すれば、Sanzにより分析され た胎児転写物の31％がDHQ52を含んでいる。これは、不発明者らがpHClトランス ジェニックマウス中に観察した27％と同等である。 表3 表3 Ｄセグメント選択 使用％（±３％) Ｄセグメント HCI トランスジェニック動物 ヒトＰＢＬ DLRI ＜1 ＜1 DXPI 3 6 DXP’1 25 19 DAl ＜1 12 DKI 7 12 DNl 12 22 DIR2 7 4 DM2 ＜1 2 DLR2 3 4 DHQ52 26 2 ? 17 17 100％ 100％ Ｉ．ＶＤＪ接合部の機能性 表４は、pHClトランスジェニック動物から分析された30個のクローンからのＶ ＤＪ領域の推定アミノ酸配列を示す。翻訳配列は、30個の、ＶＤＪ接合部のうち の23個（77％）が可変セグメントとＪセグメントに関して枠内（in-frame）であ ることを示す。 化８ 及び 化９ ＶＤＪ接合部の機能性 Ｊ．C0R3 の長さ分布 表４は、pHClトランスジェニックマウス中の枠内ＶＤＪ接合部を有する転写物 からのCDR3ペプチドの長さをヒトＰＢＬ中のそれと比較したものである。ヒトＰ ＢＬデータは同じくYamadaらから得られたものである。両分布は類似しているが 、トランスジェニックマウスの分布はヒトＰＢＬから観察されたものよりもわず かに小さいCOR3ペプチドの方に偏っていた。トランスジェニックマウスにおける COR3の平均長さは10.3アミノ酸である。これはSanz 〔J ．Immunol．147;1720-17 29(1991)〕によりヒトCDR3ペプチドについて報告された平均サイズと実質的に同 じである。 表4 表4 CDR3 の長さ分布 存在率（±3％) CDR3 中のアミノ酸数 HCI トランスジェニック動物 ヒトＰＢＬ 3〜8 26 14 9〜12 48 41 13〜18 26 37 19〜23 ＜1 7 ＞23 ＜1 1 100％ 100％実施例13 再配列された重鎖トランスジーン Ａ．再配列されたヒト重鎖ＶＤＪセグメントの単離 ファージベクターλEMBL3/SP6/T7（C1onetech Laboralories，Inc.，Palo Alt o，CA)中にクローニングされた２種のヒト白血球ゲノムＤＮＡライブラリーを、 ヒト重鎖Ｊ−μイントロンエンハンサーを含むλl.３のl kb PacＩ／HindIII断 片を用いてスクリーニングする。陽性クローンを、次のＶH特異的オリゴヌクレ オチド： オリゴ−７ ５′−tca gtg aag gtt tcc tgc aag gca tct gga tac acc ttc ac ｃ−３′ オリゴ−８ ５′−tcc ctg aga ctc tcc tgt gca tct gga ttc acc ttc agt− ３' の混合物とのハイブリダイゼーションについて試験する。 ＶプローブとＪ−μプロ−ブの両方とハイブリダイズするクローンを単離し 、そして再配列されたＶＤＪセグメントのＤＮＡ配列を決定する。 Ｂ．再配列されたヒト重鎖トランスジーンの作製 機能的ＶＪセグメントを含む断片（転写解読枠およびスプライスシグナル）を 、プラスミト゛由来の XhoＩ部位が挿入断片配列の５′末端に隣接するように、 プラスミドベクタ−pSP72中にサブクローニングする。機能的ＶＤＪセグメント を含むサブクローンをXholとPacI （PacIはＪ−μイントロンエンハンサ−近く の部位を認識する稀少な切断酵素である）で消化し、そして挿入断片をXhoI／Pa cIで消化されたpHC2中にクローニングし、機能的、ＶＤＪセグメント、Ｊ−μイ ントロンエンハンサー、μスイッテ要索、μ定常領域コードエクソンおよひγ１ 定常領域（これは緊殖不能転写物関連配列、γ1スイッチおよびコードエクソン を含む）を有するトランスジーン構成物を作製する。上述したように、このトラ ンスジーン構成物をNot Iで切り出し、そしてマウス胚の前核中にマイクロイン ジェクトしてトランスジェニック動物を作製する。実施例14 軽鎖トランスジーン Ａ．プラスミドベクターの作製 １． プラスミドベクターpGPlc プラスミドベクターpGPlaをNo l消化し、そして次のオリゴヌクレオチドオリ ゴ−81 ５′−ggc ctc atc ccg gag ctc gag gac gac aag ctt tcg agg atｃcg c−３' オリコ゛−８２ ５′ ggc cgc tcc tg aaa gt tgt cga cc cga gac ccg g gａtgc−３' をその中に連結せしめる。生じたプラスミドpGP1cは、No l部位により隣接され たXmaI,Xhol,SalI,HindIIIおよびBamHI 制眼部位を有するポリリンンカ−を含む 。 2． プラスミドベクタ−pGP1d プラスミドベクタ−pGP1a Not I 消化し、そして次のオリゴヌクレオチドオリ コ゛−８７ ５′ −ggc cgc tgt cga caａ gt tat cga tgg atc ctc g ag tgc−３′ オリコ゛−88 ５′ −gg cgc act cga gga tcc atc gat aag ctt gtc gac a gc−３′ をその中に連結せしめる。生じたプラスミドpGP1d は、Not Ｉ部位により隣接さ れたSa1I，Hindlll,Cla Ｉ,BamIIIよびXho I制限部位を有するポリリンンカー を含む。 Ｂ．ＪκおよびＣκクローンの単離 ファージベクターλEMBL3/SP6/T7（C1onetech Laboratories，Inc.，Palo A lto，CA）中にクロ−ニングされたヒト胎盤ゲノムＤＮＡライブラリーを、ヒト κ軽鎖Ｊ領域特異的オリゴヌクレオチド： オリコ゛-36 ５'-cac ctt cgg cca agg gac acg act gga gat taa acg taa gcａ−３′ を用いてスクリ−ニングし、そしてファージクローン136.2と136.5を単離する。 136.2からＪκ１セグメントを含む7.4kb Xhol断片を単離し、プラスミドpNNO3 中にサブクロ−ニングしてプラスミドクローンp36.2を作製する。Ｃκ遺伝子セ グメントと共にＪκセグメント２〜５を含む近隣の13 kb Xho I断片をファージ クローン136.5から単離し、そしてプラスミドpNNO3中にサブクロ−ニングしてプ ラスミドクロ−ンp36.5を作製する。それら２つのクローンを一緒にすると、Ｊ κ1の7.2 kb上流で始まりＣκの9 kb下流で終わる領域に及ぶ。 Ｃ．再配列された軽鎖トランスジーンの作製 1． 再配列された可変セグメントを発現さぜるためのＣκベクタ−pCK1 Ｃκ遺伝子を含むプラスミドクロ−ンp36.5の13 kb Xho I断片を、９ kbの下 流配列と一緒に、該挿入断片の５′末端がプラスミドXho I部位に隣接した状態 で、プラスミドベクタ−pGP1cのSal Ｉ部位中にクロ−ニングする。生じたクロ ーンpCK1は、再配列された、ＶＪκセグメントを含むクロ−ン化断片をユニーク ５′Xho Ｉ部位に収容することができる。次いで該トランスジーンをNot Iで切 り出し、ゲル電気泳勤によってべクター配列から精製する。得られたトランスジ −ン構成物は、ヒトＪ−Ｃκイントロンエンハンサーを含むであろうし、ヒト３ ′κエンハンサーを含むことができる。 2． 再配列された可変セグメントを発現させるための重鎖エンハンサー含有Ｃ κベクターpCK2 マウス重鎖Ｊ−μイントロンエンハンサー〔J．Banerjiら、Cell33: 729-740( 1983)〕を含むマウスゲノムＤＮＡの0.9kb Xbal断片をpUCl8中にサブクローニン グし、プラスミドpJH22.lを作製した。このプラスミドをSphtにより線状化し、 クレノウ酵素を用いて末端をフィルインした。クレノウ処理されたＤＮＡを次い でトHindlll で消化し、そしてヒト重鎖μイントロンエンハンサー〔Haydayら、Nature 307:334-340(1984)〕を含むファージクローンλ1.３ （前の実施例） の uI （クレノウ）／Hind1ll 断片をそれと連結した。 生じたプラスミドpMHEl、両者が単一のBamHI／Hindlll 断片上に切除されるよ うに、pUC18中に一緒に連結されたマウスとヒトの重鎖μイントロンエンハンサ ーから成る。この2.3 kb断片を単離し、pGPlc中にクロ−ニングしてpMHE2を作製 する。pMHE2 を Sallで消化し、p36.5の13 kb XhoＩ挿入断片をその中にクロ− ニングする。生じたプラスミドpCK2は、マウスとヒトの重鎖Ｊ−μイントロンエ ンハンサーがトランスジーン挿入断片の３′末端に融合していること以外は、pC Klと同一である。最終トランスジーンの発現を調節するために 異なるエンハン サー、即ちマウスまたはラットの３′κまたは重鎖エンハンサー〔Meyer および Neubrrger,EMBD Ｊ．8:1959-1964 (1989)；Pettersonら、Nature 344:165-168(1 990)〕を使って類似構成物を作製することができる。 3．再配列されたκ軽鎖可変セグメントの単離 ファージベクターλEMBL3/SP6/T7（Clonetech Laboratories．Inc.．Palo Alt o，CA)中にクロ−ニングされた２つのヒト白血球ゲノムＤＮＡライブラリーを、 p36.5の3.5 kb Xho I／Sma I 断片を含むヒトκ軽鎮Ｊ領域を用いてスクリーニ ングした。陽性クローンを、次のＶκ特異的オリゴヌクレオチド オリゴ−65 ５′ −agg ttc agt ggc agt ggc agt ggg tct ggg aca gac ttc ctc acｃatc agc−３′ とのハイブリダイゼーションについて試験した。ＶプロープとＪブローブの両方 とハィブリダイズしたクローンを単離し、そして再配列されたＶＪκセグメント のＤＮＡ配列を決定する。 4．再配列されたヒト軽鎖構成物を含有するトランスジェニックマウスの作製 機能的ＶＪセグメントを含む断片（転写解読枠およびスプライススグナル）を ベクタ−pCK1およびpCK2の XhoＩ部位中にサブクロ−ニングし、再配列されたκ 軽鎖トランスジーンを作製する。Not lでの消化により該トランスジーン構成物 をベクター配列から単離する。アガロースゲル上で精製した挿入断片をマウス胚 の前核中にマイクロインジェクトし、トランスジェニックマウスを作製する。ヒ トκ鎖を発現している動物を、重鎖小遺伝子を含有するトランスジェニック動物 （実施例14）と交配し、ヒト抗体を完全に発現するマウスを作る。 ＶＪκ組合せの全部か、広域スペクトルの種々の重鎖ＶＤＪ組合せと安定な重 鎖ー軽鎖複合体を形成できるわけではないので、それぞれ異なる再配列されたＶ Ｊκクローンを使って幾つかの異なる軽鎖トランスジーン構成物を作製し、そし て重鎖小遺伝子座トランスジーンを発現するマウスと交配させる。ニ重トランス ジェニック（重鎖構成物と軽鎖構成物の両方）動物から、末梢血、脾臓およびリ ンパ節リンパ球を単離し、ヒトおよびマウスの重鎖および軽鎖免疫グロブリンに 特異的な蛍光抗体(Pharmingen，San Diego，CA）で染色し、そしてFACScan 分析 装置(Becton Dickinson，San Jose．CA）を使ってフローザイトメトリーにより 分折する。最大数のＢ細胞の表面上に最高レベルのヒト重鎖／軽鎖複合体を生じ 且つ免疫細胞区分に悪影響を与えない（ＢおよびＴ細胞サブセット特異的抗体を 用いたフローサイトメトリー分折によりアッセイした時）再配列された軽鎖ト ランスジーン構成物を、ヒトモノクローナル抗体の産生のために選択する。 Ｄ．再配列されていない軽鎖小遺伝子座トランスジーンの作製 1． 小遺伝子座トランスジーンを作製するためのＪκ，Ｃκ含有べクタ−pJCKl p36.5の13 kbのＣκ含有 Xhol挿入断片をクレノウ酵素で処理し、Hindlllで消 化されクレノウ処理されたプラスミドpGP1d中にクロ−ニングする。挿入断片の ５′末端がべクター由来のClaI部位に隣接するようなプラスミドクローンを選択 する。生じたプラスミドp36.5-IdをClaIで消化し、クレノウで処理する。 p36.2 のＪκl含有7.4 kb Xho I挿 入断片をクレノウで処理し、そしてClaIで消化され クレノウ処理されたp36.5-ld中にクロ−ニングする。p36.2挿入断片がp36.5挿入 断片と同じ方向にあるクローンを選択する。このクローンpJCK1 （図35）は、7 .2kbの上流配列および9 kbの下流配列と一緒に、完全なヒトＪκ領域およびＣκ 領域を含む。 該挿入断片はヒトＪ−Ｃκイントロンエンハンサーも含み、ヒト3′κエンハ ンサーを含むこともある。該挿入断片は、追加の３′隣接配列、例えば重鎖また は軽鎖エンハンザーをクロ−ニングする目的でユニーク３′ Sal I 部位により 隣接される。ユニーク:Xho I 部位は、再配列されていないＶκ遺伝子セグメン ト中でクローニングする目的で該挿入断片の５′末端に置かれる。ユニークSal I およびXho I 部位は、最終のトランスジーン構成物をべクター配列から 単離するために使われる Not I 部位により隣接される。 2．再配列されていなＶκ遺伝子セグメントの単離およびヒトIｇ軽鎖タンパク質 を発現するトランスジェニック動物の作製 Ｖκ特異的オリゴヌクレメチテドであるオリゴ−65（上述）を使って、ファー ジベタターλEMBL3/SPG/T7 (Clonetech Laboratories,Inc.PaloAlto.CA)中にク ロ−ニングされたヒト胎盤ゲノムＤＮＡを探査する。生じたタローンからの可変 遺伝子セグメントを配列決定し、機能的と思われるクローンを選択する。機能性 を判断するための基準は、転写解読格、完全なスプライス受容体および供与体配 列、並びに完全な組換え配列を含むことである。 選択された可変遺伝子セグメントを含むＤＮＡ断片をプラスミドpJCKlのユニ ークXhol部位にクロ−ニングし、小遺伝子座構成物を作製する得られたクローン をNotＩで消化し、挿入断片を単離し、そしてマウス胚の前.核中にマイクロイン ジェクトしてトランスジェニック動物を作製する。それらの動物のトランスジー ンは、Ｂ細胞発達の際にＶ−Ｊ結合を受けるであろう。ヒトκ鎮を発現丁る動物 を、重鎮小遣伝子座を含有丁るトランスジェニック動物と交配し、ヒト抗体を完 全に発現するマウスを得る。実施例15 ゲノム重鎖ヒトIｇトランスジーン この実施例は、接合子中へのマイクロインジェクンョンまたはES細胞中への組 み込みによりマウス生殖細胞中に導入される、ヒトゲノム重鎖免疫グロブリント ランスジーンのクロ−ニングを記裁する。 Marzluff,W.F ら、(1985)Transcription and Translation:A Practrical Approa ch, B.D.Hammes およびS.J.Higgins偏,98-129頁，IRL Press,Oxord により記載 されたようにして、新鮮なヒト胎盤組織から核を単離する。単離された核（また はPDSで洗浄したヒト精母細胞）を0.5％低融点アガロースブロック中に埋め込み 、そして核については5OOmM EDTA．1％ SOS 中の1mg/mlのプロテイナーゼＫに より、精母細泡については5OOmM EDTA，1％ SOS．10mM DTT中の 1mg／mlのプロ テイナーゼＫにより、50℃にて18時間溶解せしめる。該ブロックを40μg/mlのPM SF／TE中で50℃にて30分間インキュベートすることにより、プロテイナ−ゼＫを 不活性化する。次いでM．FinneyによりCurrent Protocols in MolecularBiology (F.Ausubelら偏,John Miley & Sons,増補4, 1988,例えば第2.5.1章）中に記載 されたように、アガロース中で該ＤＮＡを制限酵素 Not Iで消化する。 Not I 消化したＤＮＡを、次いでAnandら、Nuc.Acids Rcs．17:3425-3433(1 989)により記載されたようにバルスフィールドゲル電気泳勤により分画する 。NotＩ断片に冨む画分をサザンハイブリダイゼーションによりアッセイしの断 片によってコードされる１または複数の配列を検出する。そのような配列は、重 鎮Ｄセグメント、Ｊセグメントおよびγ1定常領域と共に６つのＶHファミリー全 部の代表物を含む〔この断片は、Bermanら(1988)，前掲によればHeLa細鉋から67 0 kb断片として同定されているけれども、本発明者らはそれかヒト胎盤および精 子ＤＮＡからのは330 kb断片であることを発見した〕。この Not I 断片を含む 画分（図４参照）を記載の如く〔McCormickら、Tehnique 2:65-71（199O)〕べク タ−pYACNNの NotＩ部位中に連結せしめる。プラスミドpYACNNは、pYACneo(Clon tech)をEcoRIで消化しそしてオリコ゛ヌクレオチド5 ′-AAT TGC GGCCGC−３′ の存在下で連結せしめることにより、調製される。 Traverら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5898-5902 (1989) により言己 載された通りに、重鎖Not I 断片を含むYAC ベクターを単離する。クローン化さ れたNotＩ挿入断片を、M.Finney（前掲）により記截されたようなパルスフィー ルドゲル電気泳動により高分子量酵母ＤＮＡから単離する。ｌmMスペルミンの添 加によりＤＮＡを濃縮し、上述した通り単細胞胚の核に直接マイクロインジェク トする。あるいは、ＤＮＡをパルスフィールドゲル電気泳動により単離し、そし てリポフェクション〔Gnirkeら、EMBD J 10:1629-1634(1991)〕によりES細胞 中に導入するか、またはYAC をスフェロプラスト融合によりES細胞甲に導入する 。実施例16 不連続ゲノム重鎖lgトランスジーン ＶH６、Ｄセグメント、Ｊセグメント、μ定常領域および一部のγ定常領域を 含むヒトゲノムＤＮＡの85 kb Spel断片は、不質的には実施例１に記裁した通り のYAC クロ−ニングによって単離された。生殖細胞型可変領域由来の断片、例え は多コピーのＶ1〜Ｖ5を含む上記の670-830kb Not I 断片の上流の570 kb N ot Ｉ断片、を含有するYACを上述の如く単離る。〔Bermanら(1988)，前掲は、各々 が多数のＶセグメントを含有する２つの570 kb Not Ｉ断片を検出した。j この2 断片を実施例Iに記載の如くマウス単細胞胚の核中に同時注入する。 典型的には、２つの異なるＤＮＡ断片の同時注入は、染色の体内の同一部位の ところへの両断片の組込みをもたらす。従って、該２断片各々の少なくとも１コ ピーを含む生じたトランスジェニック動物の約50％が、定常領域含有断片の上流 に挿入されたＶセグメント断片を有する。それらの動物のうち、85 kb SpeＩ断 片の位置に関する570 kb NotＩ断片の方向性に依存して、約50％がＤＮＡ逆位に よりＶ−ＤＪ結合を行い、そして約50％が欠失によりＶ−ＤＪ結合を行うだろう 。生じたトランスジェニック勤物からＤＮＡを車離し、そしてサザンブロットハ イブリダイゼーソョンにより両方のトランスジーンを含んでいることが示された 動物（詳しくは、多数のヒトＶセグメントとヒト定常領域遺伝子の両方を含む動 物標準技術に従って、ヒト免疫グロブリンを発現する能力について試験する。実施例17 トランスジェニックＢ細胞中の機能的に再配列された可変領域配列の同定 着目の抗原を使って、次の遺伝的特性：ＪHの欠失（実施例10）については内 因性所有鎮遺伝子座中の同型接合性；再配列されていないヒト重鎖小遺伝子座ト ランスジーン（実施例5および14）の単コピーについては半接合性；および再配 列されたヒトκ軽鎖トランスジーン（実施例６および14）の単一コピーにつては 半接合性、を有するマウスを免疫化する〔HarlowおよびLane,Antibodies:A Labo ratory Manual, Cold Spring Harbor, New York (1988)を参照のこと〕。 免役化スケジュールの後、脾臓を取り出し、脾細胞を使ってハイブリドーマを 調整する。着目の抗原と反応性である抗体を分泌する個々のハイブリド−マクロ −ンからの細胞を使ってゲノムＤＮＡを調整する。ゲノムＤＮＡの試料を、ユニ ークな６塩基対配列を認識する幾つかの異なる制限酵素で消化し、そしてアガロ −スゲル上で分固する。サザンブロットハイブリグイゼーションを凹って２〜10 kb範囲内の２つのＤＮＡ断片を同定する。該断片の一方は、再配列されたヒト重 鎖ＶＤＪ配列の単一コピーを含み、もう一方は再配列されたヒト軽鎖ＶＪ配列の 単一コピーを含む。それらの２断片をアガロースゲル上でサイズ分画し、pUCl8 中に直接クロ−ニングする。クローン化された挿入断片を、定常碩域配列を含む 重鎮および軽鎮発現カセット中にそれぞれサブクロ−ニングする。 プラスミドクローンpγe1（実施例12）を重鎖発現カセットとして使用し、再 配列されたＶＤＪ配列を Xhol部位中にクロ−ニングする。プラスミドクローンp CK1を軽鎖発現カセットとして使用し、再配列されたＶＪ配列を XhoＩ部位中に クローニングする。生じたクローンを一緒に使ってSP。細胞をトランスフェクト せしめ、着目の抗原と反応する抗体を産生せしめる〔M.S．Coら、Proc ．Natl.Ac ad.Scl USA 88:2869(1991)〕。 あるいは、上述のクローン化ハイブリドーマ細胞からmRNAを単離し、cDNAを合 成するのに使う。発現されるヒト重鎖および軽鎖ＶＤＪおよび、Ｖｊ配列を、次 いでＰＣＲにより増幅し、クロ−ニングする〔J.W.Larrichら(1989)Bio1 ．Techn ologv.7: 934-938〕。それらのクローンのヌクレオチド配列を決定した後、同じ ポリペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを合成し、そしてC.Queenら、Pro c. Natl. Acad. Sci. USA 84:5454-5458 (1989)により記載されたようにして合 成発現ベクターを作製する。複合抗原によるトランスジェニック動物の免疫化 次の実験は、トランスジェニック動物がヒト赤皿球上の抗原のような複合抗原 により好結果に免役化することができ、そして正常マウスにおいて観察される応 答速度論に類似した速度論で応答することができることを証明する。 血液細胞は一般に適当な免役原であり、赤皿球と白皿球の表面上には多数の異 なる型の抗原を含んで成る。ヒト血液による免疫化 一人の提供者からのヒト血液のチューブを収集し、機能的に破壊された内因性 重鎖遺伝子座（ＪHＤ）を有し且つヒト重鎖小遺伝子構成物(HCI)を含有するトラ ンスジェニックマウスを免疫化するのに使った。それらのマウスを系112と命 名する。血液を洗浄し、50mlのハンクス溶液中に再懸濁し、1×106細胞／mlに希 釈した。次いで23ゲージの針と！ccの注射器を使って0.2ml（2×107細胞）を腹 腔内注射した。この免疫化プロトコールを６週間に渡りほぼ毎週繰り返した。眼 窩後方出血から採血し、血清を収集し、それを特異抗体について試験することに より、血清抗体価をモニタリングした。免疫前出血を対照として取った。まさし く最後の免疫化の時、血清またはハイブリドーマを得るためにそれらの動物を犠 牲にする３日前に、ハイブリドーマの生産を増大させるために尾部静脈内への1 ×103細胞による免疫化を１回行った。 表5 表5 動物 マウス# 2343と2348は所望の表現型を有する：重鎖破壊背景上のヒト重鎖小遣伝 子トランスジェニック。ハイブリドーマの作製 上述の通り免疫化された約16週齢のトランスジェニックマウス（表５）のマウ ス脾細胞を非分泌性ＨＡＴ感受性ミエローマ細胞系X63 Ag8.653 から成る融合相 手と融合せしめることにより、ハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマクロ ーンを培養し、血液細胞抗原に対して特異的な結合親和性を有する免疫グロブリ ンを含有するハイブリドーマ上清を、例えばフロ−ザイトメトリーにより、同定 した。フローサイトメトリー フロ−サイトメトリーを使って血清とハイブリドーマ上清を試験した。提供者 からの赤血球をハンクス溶液中で４回洗浄し、50,000個の細胞を1.1 mlのポリプ ロピレン微小菅中に入れた。細胞をハイブリドーマからの上清または抗血清と共 に染色媒質〔フェノールレッドまたはビオチン(Irvlne Scientific)、３％新生 ウシ血清、0.１％ナトリウムアジドを含まない1×RPMI培地〕中で氷上で30分間 ィンキュベートした。対照は他の遺伝子型を有する同腰マウスから成った。次い で細胞をSorvall RT600B中で1000 rpmで５〜10分間4℃にて遠心することにより 洗浄した。細胞を２回洗浄した後、蛍光生成試薬を使って細胞表面上の抗体を検 出した。２種類のモノクローナル試薬を使って試験した。１つはFITCで標識され たマウス抗ヒトμ重鎖抗体（Pharmagen，San Diego，CA）であり、もう１つはPE で標識されたラット抗マワスκ軽鎖抗体（Becton-Dickenson，San Jose，CA)で あった。それらの試薬は両方とも同様な結果を与えた。全血（赤血球と白血球） および白血球のみを標的細胞として使用した。両方の組が陽性結果を与えた。 トランスジェニックマウスおよび同腹対照の血清を提供者からの赤血球または 他の個体がらの白血球のいずれかと共にインキュベートし、洗浄し、次いで抗ヒ トIgM FITC 標識抗体により発色させ、フローサイトメーター中で分析した。結 果は、ヒト小遺伝子座についてトランスジェニックであるマウス（マウス 2343 および2348）からの血清がヒトIgＭ反応性を示し、一方全ての同腹動物（2344,2 345．2346，2347）からの血清は該反応性を示さなかった。正常マウス血清（Ｎ Ｓ）とリン酸塩緩衝化塩溶液（ＰＢＳ）を負の対照として使用した。赤血球は未 濾過であり、白血球はリンパ球のみを含むように濾過された。比較を与えるため にｘ軸とｙ軸上に線が引かれている。融合体2348からの 100の上清に関してフロ ーサイトメトリーを実施した。４つの上清が血球細胞抗原に対する陽性反応性を 示した。実施例18 アンチセンスＲＮＡによる内因性マウス免疫グロブリン発現の減少 Ａ．アンチセンスＩｇ配列の発現用のベクター 1． クローニングベクターpGPlh の作製 ベクターpGP1b（前の実施例に記載）をXho ＩとBamHIで消化し、そして次のオ リゴヌクレオチド ５′- gat cct cga gac cag gta cca gat ctt gtg aat tcg −３′ ５ - tcg acg aat tca caa gat ctg gta cct ggt ctc gag - ３′ と連結せしめてプラスミドpGPlhを作製した。このプラスミドは、次の制限部位 ：Not Ｉ，EcoRl，Bglll，Asp718，BamHI，Hind lll，Not Ｉを含むポリリンカ ーを含有する。 2．pBCElの作製 プロモーター−リーダー配列エクソン、第一イントロンおよびヒトＶH−Ｖフ ァミリー免疫グロブリン可変遺伝子セグメントの第二エクソンの一部を含む、pV H251（前の実施例に記載）の0.8 kb Xba Ｉ／Bgl 11断片を、Xba Ｉ／Bgl llで 消化したベクターpXN03 中に挿入してプラスミドpVH251N を作製した。 ヒト成長ホルモン遺伝子〔hGH ； Seeburg(1982)DNA l:239-249〕のコードエ クソンを含む2.2 kb BamHI／EcoRI ＤＮＡ断片を、BamHI／EcoRI で消化したpGH 1h中にクローニングした。生じたプラスミドをBamHIで消化し、そしてpVH251N のBammHI／EcoRI 断片をhGH 遣伝子と同じ方向において挿入し、プラスミドpVhg h を作製した。 マウス重鎖Ｊ−μイントロンエンハンサー〔Banerji ら（1983）Cell 33:729- 740〕を含むマウスゲノムＤＮＡのO.9 kb Xba Ｉ断片をpUC18 中にサブクローニ ングしてプラスミドpJH22.1 を作製した。このプラスミドをSph Ｉで直鎖状にし 、末端をクレノウ酵素でフィルインした。次いでクレノウ処理したＤＮＡをHind lll で消化し、そしてヒト重鎖Ｊ−μイントロンエンハンサー〔Hayday ら（198 4）Nature 307:334-340〕を含むファージクローンλ1.3（上記実施例）の1.4kb Mlu Ｉ（クレノウ）／HIindlll断片をそれと運結せしめた。得られたプラスミド pMHE1は、単一の BamHI／Hindlll 断片において切り出すことができるようにpU Cl8中に一緒に連結されたマウスおよひヒトの重鎖」−μイントロンエンハンザ ーから成る。 pMHE1 の BamHI／Hindlll断片を BamHI／Hindlll で切断されたpVhgh 中にク ローニングし、Ｂ細胞発現ベクタ−pBCE1を作製した。このベクター（図42に描 写）はユニーク Xho IおよびAsp718クローニング部位を含有し、その中にアンテ センスＤＮＡ断片をクロ−ニングすることができる。それらのアンチセンス配列 の発現は、上流の重鎖プロモーター−エンハンサー組み合わせにより指令され、 下流のhGH遺伝子配列はイントロン配列に加えてトランスジーン構成物の発現を 促進するポリアデニル化配列を提洪する。pBCE1 から作製されたアンチセンスト ランスジーン構成物は Not Ｉでの消化によりベクター配列から分離することが できる。 Ｂ．IgM アンチセンストランスジーン構成物 下記オリゴヌクレオチド： ５′- cgc ggt acc gag agt cag tcc ttc cca aat gtc -３′ ５′- cgc ctc gag aca gct gga atg ggc aca tgc aga -３′ を、基質としてマウス胛朦cDNAを使ったポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による マウス IgM定常領域配列の増幅のためのプライマーとして使用した。得られたO. 3 kbのＰＣＲ産物をAsp718と Xho Ｉで消化し、そしてAsp718／Xho Ｉで消化し たpBCE1 中にクローニングしてアンチセンストランスジーン構成物pMAS1 を作製 した。pMAS1 の精製済 Not Ｉ挿入断片を、単独でまたは１もしくは復数の別の トランスジーン構成物と組み合わせて、半日マウス胚の前核中にマイクロインジ ェクトし、トランスジェニックマウスを作製した。この構成物はマウスIgＭのmR NAとハイブリダイズするＢ細胞中のＲＮＡ転写物を発現し、よってマウスIgＭタ ンパク質の発現をダウンレギュレーションする。 pMAS1 とpHCC1のようなヒト重鎖トランスジーン小遺伝子座とを含有する二重 トランスジェニックマウス（両構成物の同時注入によるかまたは一重トランスジ ェニックマウスの交配により作製される）は、ヒト重鎖小遺伝子座のみについて トランスジェニックであるマウスよりも高い比率のＢ細胞上に、ヒトトランスジ ーンによってコードされるIgレセプターを発現するだろう。ヒト対マウスIgレセ プター発現細胞の比は、一部はＢ細胞の分化と発展を促進する因子および細胞に 対する２集団間の競争のためである。IgレセプターはＢ細胞発達において重要な 役割を果たすので、表面上に減少したレベルのIgＭを発現する（マウスIg特異的 アンチセンスダウンレギュレーションのため）マウスIgレセプター発現Ｂ細胞も 、ヒトレセプターを発現する細胞も競争しないだろう。 Ｃ．Igκアンチセンストランスジーン構成物 次の２つのオリゴヌクレオテド： ５′- cgc ggt acc gct gat gct gca cca act gta tcc -３′ ５′- cgc ctc gag cta aca ctc att cct gtt gaa gct -３′ を、基質としてマウス脾臓cDNAを使ったポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による マウスIgκ定常領域配列の増幅のためのプライマーとして使用した。得られた0. 3 kbのＰＣＲ産物をAsp718とXho Ｉで消化し、そしてAsp718／Xho Ｉで消化した pBCE1 中にクローニングしてアンチセンストランスジーン構成物 pKAS1を作製し た。pMAS1 の精製済Not I挿入断片を、単独でまたは１もしくは複数の別のトラ ンスジーン構成物と組み合わせて、半日マウス胚の前核中にマイクロインジェク トし、トランスジェニックマウスを作製した。この構成物はマウスIgκ mRNA と ハイブリダイズするＢ細胞中のＲＮＡ転写物を発現し、よってpMAS1 について上 述したのと同様にマウスIgκタンパク質の発現をダウンレギュレーションする。実施例19 この実施例は、本発明のトランスジェニックマウスにおける好結果の免疫化と 免疫応答を証明する。マウスの免疫化 １分子あたり 400以上のジニトロフェニル基と結合させたアオガイヘモシアニ actical Immunology，L．HudsonおよびF．C．Hay，B1ackwell Scientific出版， 第９頁，1980年）に従ってミョウハン沈澱させた。ミョウバン沈殿させたKLH-DN P 400 μgを100μｌのリン酸塩緩術化塩溶液（ＰＢＳ）中の臭化ジメチルジオク タデシルアンモニウム 100μgと一緒に各マウスに腹腔内注射した。６日後に眼 窩後洞出血により血清試料を収集した。血清中のヒト抗体反応性の分析 間接エンザイムリンクドイムノソルベントアッセイ(ELISA)を使って抗体の反 応性および特異性を評価した。免疫原による抗体誘導を分析するために幾つかの 標的抗原を試験した。タンパク質成分に対する反応性の同定にはアオガイヘモシ アニン（Calbiochem）、ハブデンおよび／または修飾アミノ基に対する反応性の 同定にはウシ血清アルブミン、そして全免疫原に対する反応性の同定にはKLH-DN P を・使用した。抗原へのヒト抗体結合は、マウス免疫グロブリンとの交差反応 性を全く持たないIgＭおよびIgＧサブクラスに特異的な酵素接合（本により険出 した。 簡単に言えば、ＰＢＳ中５μg/mlのタンパク質を37℃にて一晩乾燥することに よりマイクロタイタープレートを抗原コーティングした。ＰＢＳ、５％ニワトリ 血清、O.５％ Tween-20中に希釈した血清試料をウエル中で室温にて１時間イン キュベートし、次いで同希釈剤中の抗ヒトIgG FcおよびIgG F(ab')−西洋ワサヒ ペルオキシダーゼまたは抗ヒトIgM Fc−西洋ワサビペルオキシダーゼと共にイン キュベートした。室温で１時間後、ABTS基質（Sigma，St．Louis，Missouri）の 添加により酵素活性を評価し、30分後に415-490 nmで読み取った。トランスジェニックマウス中の免疫応答におけるヒト重鎖の関与 図43は、KLH-DNP による免疫化に対する３匹の同腹子マウスの応答を表す。第 1296号のマウスは再配列されていないヒトIgＭおよびIgＧトランスジーンを有し 、マウスIg重鎖破壊について同型接合性であった。第1299号のマウスは無破壊の 背景上にトランスジーンを有し、1301号のマウスはそれらの遺伝子組のいずれも 遺伝しなかった。別の同腹子である第1297号のマウスはヒトトランスジーンを有 し、マウス重鎖破壊に関して半接合性であった。それを非免疫化対照として実験 に組み入れた。 結果は、ヒトIgＧとIgＭ応答は両方ともタンパク質への接合という状況におい てハプテンに対して発生したことを証明する。ヒトIgＭはKLH に対しても発生し たが、この時点では有意なレベルのヒトIgＧは存在しなかった。同じマウスから の免疫前血清試料では、同じ標的抗原に対するヒト抗体の力価は有意でなかった 。実施例20 この実施例は、本発明のトランスジェニックマウスにおけるヒト抗原による好 結果の免疫化および免疫応答を証明し、そしてヒトトランスジーンの可変領域配 列中に無作為でない体細胞変異が起こることを証明する。ヒト糖タンパク質抗原に対するヒト免疫グロブリン重鎖を含んで成る抗体応答の 証明 この実験に使用するトランスジェニックマウスは、機能的内因性（マウス）重 鎖生産の欠失をもたらすＪ領域のところへのトランスジーンの導入（前掲）によ り作製された機能的に破壊されたマウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座について同 型接合性であった。該トランスジェニックマウスは、少なくとも１つの完全な再 配列されていないヒト重鎖小遺伝子座トランスジーン（HC1、前掲）も含み、該 トランスジーンは単一の機能的ＶH遺伝子（ＶH 251）、ヒトμ定常領域遺伝子、 およびヒトｒ１定常領域遣伝子を含んで成る。ヒト免疫グロブリントランスジー ン産物を発現することが示されたトランスジェニックマウス（前掲）をヒト抗原 による免疫化のため選択し、トランスジェニックマウスがヒト抗原免疫化に対し て免疫応答を生じる能力を有することを証明した。HC1-26系統のマウス３匹とHC 1-57系統のマウス３匹（前掲）にヒト抗原を注射した。 ミョウバン上に不溶化された精製済ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）100 μg を不 児全フロイントアジュバント中で０日目に注射し、次いで更に7．14．21および2 8日目に不完全フロイントアジュバント中のミョンバン沈澱ＣＥＡを毎週注射し た。ＣＥＡの注射前の各日に眼窩後方出血により血清試料を収集した。各グルー プ中の３匹のマウスの各々から同容量の血清を分析用にプールした。 マイクロタイタープレート上に固定化したヒトＣＥＡに結合したヒトμ鎖含有 免疫グロブリンおよびヒトγ鎖含有免疫グロブリンをELISA アッセイにより測定 した。ヒトμ鎖含有免段グロブリンおよびヒトγ鎖含有免疫グロブリンについて の ELISAアッセイの結果をそれぞれ図44および45に示す。７日目までは両系統に ついて有意なヒトμ鎖Ig抗体価が検出され、約21日目まで上昇が観察された。ヒ トγ鎖Igについては、有意な抗体価は遅れ、前者がHC1-57系統で14日目そして後 者はHC1-26系統で21日目に明らかになった。ヒトγ鎖Igの抗体価は、実験の間じ ゅう時間と共に増加を示し続けた。観察されたヒトμ鎖Ig応答は、平坦域に達し た後、遅れて発生する上昇し続げるγ鎖応答と組み合わせると、親和性の成熟に 伴って観察されるパターンに特徴的である。21日目の試料の分析は、無関係の抗 原であるアオガイヘモシアニン(KLH)に対する反応性の欠失を示した。これは、 抗体応答が特異的な形でＣＥＡに対して向けられたことを指摘する。 それらのデータは、再配列されていないヒト免疫グロブリン遺伝子座に関して トランスジェニックである動物が、（１）ヒト抗原（例えばヒト糖タンパク質、 ＣＥＡ）に対して応答でき、（２）観察されたμからγへのクラススイッチによ り例示されるようなイソタイプスイッチ（クラススイッチ）を受けることができ 、そして（３）それらの体液性免疫応答における親和性の成熟の特徴を表すこと を示す。一般に、それらのデータは、（１）ヒトIgトランスジェニックマウスが 異種抗体を誘導する能力を有すること、（２）単一のトランスジーン重鎖可変領 域が限定抗原に対して応答する能力を有すること、（３）一次方よび二次応答形 成に典型的は時期に渡る応答速度論、（４）IgM からIgG への、トランスジーン によってコードされる体液性免疫応答のクラススイッチ、および（５）トランス ジェニック動物がヒト抗原に対してヒト配列抗体を産生する能力を有することを 指摘する。ヒト重鎖トランスジーン小遺伝子座における体細胞変異の証明 HC1 トランスジーンの多重コピーを含有するHC1-57系統のトランスジェニック マウスを免役グロブリン重鎖欠失マウスと交配させ、HC1 トランスジーンを含み 且つ内因性マウス重鎖の両対立遺伝子に破壊を含むマウスを得た（前掲）。それ らのマウスは、マウスκおよびλ軽鎖と共にヒトμおよびγ１重鎖を発現する（ 前掲）。それらのマウスのうちの１匹を、1.５カ月の期間に渡る反復腹腔内注射 により、ヒト癌胎児性抗原に対して高度免疫化した。このマウスを犠牲にし、脾 臓、鼠径部および腸間膜のリンパ節、並びにパイヤー斑からリンパ系細胞を単離 した。該細胞を合わせ、全ＲＮＡを単離した。該ＲＮＡから第一鎖cDNAを合成し 、次の２つのオリゴヌクレオチドプライマー 149 ５′- cta gtc cga gtc caa gga gtc tgt gcc gag gtg cag ctg(g/a/t/c) -３ 151 ５′- ggc gct cga gtt cca cga cac cgt cac cgg ttc -3’ を用いたＰＣＲ増幅のための鋳型として使用した。 それらのプライマーはVH25l/γ１ cDNA配列を特異的に増幅する。増幅された 配列を Xho Ｉで消化し、ベクターpNN03 中にクローニングした。23個のランダ ムクローンの挿入断片のＤＮＡ配列を図46〜51に示す；生殖細胞配列からの配列 変異が指摘され、ドットは配列が生殖細胞と同じであることを示す。VH251 ト ランスジーンの生殖細胞配列と該cDNA配列との比較は、クローンのうちの３個が 完全に未変異であり、他の23個は体細胞変異を含むことを明らかにした。 ３個の未変異配列のうちの１つは枠外（ouｔ-of-frame）ＶＤＪ連結に由来す る。特定の位置において観察された体細胞変異は、ヒトリンパ球において観察さ れたものと同様な頻度で且つ同様な分布パターンで起こる〔Cai ら（1992）J ．E xpMed．176 :1073；これは参考として不明細書中に組み込まれる〕。体細胞変異 の総体的頻度は約１％である；しかしアよがら、CORI同の頻度は約５％にまで及 び、抗原結合に影響を及ぼすアミノ酸変化への選択を指摘する。これは、ヒト重 細配列の抗原指令型親和性成熟を証明する。実施例21 この実施例は、組み換わると完全なヒト軽鎖小遺伝子座トランスジーンを形成 する２つの別々のボリヌクレオテドを同時導入することによる、好結果のトラン スジーンの形成を証明する。２つの重複ＤＮＡ断片の同時注入による再配列されていない軽鎖小遺伝子座トラ ンスジーンの作製 1．再配列されていない機能的Ｖκ遺伝子セグメントvκ65.3．vκ65.8およびvk6 5.15の単離 Ｖκ特異的オリゴヌクレオチドであるオリゴ-65（5’- agg ttc agt ggc agtg gg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc -3')を使って、ファージベクタ ーニングされたヒト胎盤ゲノムＤＮＡライブラリーを探査した。陽性ファージク ローンからのVκセグメントを含有するＤＮＡ断片をプラスミドベクター中にサ ブクローニングした。 得られたクローンからの可変遺伝子断片を配列決定し、機能的であると思われ るクローンを選択した。機能性を判断する基準は次のものを含む：転写解読枠、 完全なスプライス受容体および供与体配列、並びに完全な組換え配列。この方法 により単離された４つの異なるるプラスミドクローンからの４つの機能的 Ｖκ遺伝子セグメント(vk65.3．vk65.5，vk65.8およびvk65.15)のＤＮＡ配列を 図52〜55に示す。４つのプラスミドクローン p65.3f，p65.5gl，p65.8およびp65 .15f) を下記に説明する。 (1 a)p65.3f ファージクローンλ65.3の3 kb Xba I断片を、べクター由来のSal I部位が該 挿入断片の３′末端に近位になり且つベクター由来の8amlll 部位が該挿入断片 の5 ′末端に近位になるように pUC19中にサブクローニングした。このクローン の3 kb BamHl／Sal I挿入断片を pGPlf中にサブクローニングしてp65.3fを得た 。(1 b)p65.5gl ファージクローンλ65.5の6.8 kb EcoRI断片を、ベクター由来のXho i部位が 該挿入断片の5 ′末端に近位になり且つベクター由来の Sall部位が該挿入断片 の３'末端に近位になるようにpGPlf中にサブクローニングした。得られたプラス ミドをp65.5glと命名した。 (1 c)p65.8 ファージクローンλ65.3の6.5 kb Hindlll 断片をpSP72 中にクローニングし てp65.8 を得た。 (1 d)p65.15f ファージクローンλ65.16 の10 kb EcoRI 断片をpUCl8 中にサブクローニング してプラスミドp65.15.3を作製した。該プラスミド挿入断片中のＶκ遺伝子セグ メントを4.6 kb EcoRI／Hindlll 小断片にマッピングし、これをpGPlf 中にサブ クローニングした。得られたクローン p65.15fは、挿入断片の５′および３′末 端にそれぞれユニークXho I部位およびSal I部位が置かれている。 2．pkV4 p65.8 のXho I／Sal I挿入断片を p65.15fのXho I部位中にクローニングして プラスミドpKV2を作製した。p65.5gl のXho I／Sal Ｉ挿入断片をpKV2の XhoI部 位中にクローニングしてpKV3を作製した。pKV3のXho I／Sal I挿入断片をp65.3f の Xho I部位中にクローニングしてプラスミドpKV4を作製した。このプラスミド は、４つの機能的Ｖκ遺伝子セグメントを含む単一の21 kb Xho I／Sal1挿入断 片を含有する。Not Iを使って挿入断片全体を切り出すことができる。 3．pKCIB (3 a)pKcor ヒトゲノムＤＮＡファージλクローンに由来する２つの Xho I 断片をプラス ミドベクター中にサブクローニングした。第一の断片である13 kb のJκ２−ｊ κ５／Ｃκ含有断片をクレノウ酵素で処理し、そしてHndlll で消化されクレノ ウ処理されたプラスミドpGPld 中にクローニングした。挿入断片の５′末端がベ クター由来のCla I部位に近いプラスミドクローン（pK-31）を選択した。第二の Xho I断片である、jκｌを含有する7.4 kbのＤＮＡ断片を、３′挿入断片XhoI部 位がベクターSal I部位への連結により破壊されるように、Xho I／Sal Iで消化 された pSP72中にクロ.ーニングした。 得られたクローンp36.2sは、Jκlの4.5 kb上流に挿入断片由来のCla I部位、 およびJκ1とJκ２の間に天然に存在するXho I部位の少し下流にポリリンカー由 来の Cla I部位を含有する。このクローンをCla Iで消化して4.7 kb断片を遊離 せしめ、該断片を正しい５′−３′方向においで、Cla Iで消化されたpK-31 中 にクローニングし、全部で５個のヒトJκセグメント、ヒトイントロンエンハン サー、Ｃκ、4.５ kbの５′隣接配列を含有するプラスミドを作製した。このプ ラスミドpKcor は、挿入断片のそれぞれ５′および３′側にユニークな隣接Xho I部位およびSal I部位を含有する。 (3 b) pKcorB ヒト３′κエンハンサーを含有する4 kb BamHI断片〔Judde，J.G．およびMax, E.E.，Mol.Cell Biol．12:5206(1992)；これは参考として本明細書中に組み込ま れる〕を、５′末端がベクターのXho I部位に近位になるようにpGPlf 中にクロ ーニングした。得られたブラスミド p24BfをXho Iで切断し、pKcor の17.7kb Xh o I／Sal I断片を該エンハンサー断片と同じ方向でその中にクローニングした。 得られたブラスミドpKcorBは、該挿入断片の５′および３′末端にそれぞれユニ ークKho IおよびSa1 Ｉ部位を含有する。 (3 c)pKC1B pKcorBの Xho I／Sal Ｉ挿入断片をp65.3fのSal Ｉ部位の中にクローニングし て軽鎖小遺伝子座トランスジーンプラスミド pKCIBを作製した。このプラスミド は、５個のJκセグメント、ヒトイントロンエンハンサー、ヒトＣκ、およびヒ ト３′κエンハンサーを含有する。この25 kb 挿入断片全体をNot I消化により 単離することができる。 4．Co4 プラスミドpKV4とpKClBからの２つの Not I挿入断片を各々2.5 μg/mlの濃度 でマイクロインジェクション緩衝液中に混合し、そして上記実施例に記載のよう にして半日マウス胚の前核中に同時注入した。生成したトランスジーン動物は、 ２断片が一緒に組み込まれたトランスジーン挿入断片（Co4 と命名、図56に示し た組換えの生成物）を含有する。pKV4挿入断片の３′の3 kbとpKCIB挿入断片の ５′の3 kbは全く同じである。幾つかの組み込み現象は3 kbの共通配列に渡って ２断片の間で相同組換えが起こったことを表す。Co4 は遺伝子座はトランスジ- ェニックマウス中のヒト配列軽鎖のレパートリーの発現を指令するだろう。 本発明の好ましい態様の今までの記載は、例示および説明のために与えられる 。それらは排他的であるつもりはなく、また本発明を正確な開示形態に制限する つもりはない。上記教示に照らして多数の改良および変更が可能である。 本明細書中の全ての刊行物および特許出願は、あたかも各々の刊行物または特 許出願が明確に且つ個別に参考として本明細書中に組み込まれると指摘されたか のように、参考として本明細書中に組み込まれる。実施例２２ この例は、ヒトＩｇトランスジーンによりコードされるヒト免疫グロブリン鎖 を含みかつ特異的免疫原と反応性をもつモノクローナル抗体を分泌するマウスの ハイブリド−マクローンの産生の成功を実証している。ヒト重鎖トランスジーン産物を取込むモノクローナル抗体の生成 １．ヒト重鎖トランスジーンを宿すマウスの免疫化 内因性重鎖遺伝子（上記実施例２０を参照）のノックアウト（すなわち機能的 分断）について同型接合でトランスジーンをコードするヒト重鎖を含むマウスを 、精製されたヒトＣＥＡで免疫化し、その後適切な免疫応答期間の後に脾細胞を 収穫した。従来の技術を用いて（Kohler及びMilstein，Eur.J.Immunol.，6：511 -519（1976），Harlow 及びLane、「抗体：その研究所マニュアル、Cold SpringH arbor,New York（1988）参照）ハイブリドーマを生成するべく、マウスの脾細胞 をマウス骨髄腫細胞と融合させた。免疫化のために用いられたマウスは、単一の 機能的ＶH遺伝子（ＶH251）、ヒトＤ及びＪセグメント、ヒトμ恒常領域、及び ヒトγｌ恒常領域遺伝子を含むヒトの再配置されていない重鎖ミニ遺伝子座トラ ンスジーンを内含していた。それが由来したトランスジェニック系統はＨＣｌ− ５７（上記）と呼称された。 ミョウバン上で不溶化させた精製ヒトガン胎児性抗原（ＣＥＡ）（Cyrstal Ch em、シカゴ，IL又はScripps Labs，サンディエゴ，CA）を１００μｇ、完全フロ イントアジュバントの中で、０日目に注入し、その後さらに７日目、１４日目、 ２１日目及び２８日目に不完全フロイントアジュバント中のミョウバン沈降した ＣＥＡを週に一度注入した。さらに２０μｇの可溶性ＣＥＡを８３日目に静脈内 で投与し、その後９２日目に、不完全フロイントアジュバント中の５０μｇのミ ョウバン沈降させたＣＥＡを注入した。骨髄腫細胞と脾細胞の融合に先立って血 清試料中に、ＣＥＡに対するヒト重鎖応答を確認した。 ９５日目に動物を安楽死させ、脾臓を除去し、ポリエチレングリコールを用い てＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３マウス骨髄腫細胞（ATCC CRC 1580，Americn Typ e Culture Collection，Rockville，MO）と融合させた。２週間後、ＥＬＩＳＡ によりヒト重鎖μ又はγ恒常領域エピトープを含む、ＣＥＡと特異的に反応する 抗体の存在について、融合ウエルからの上清をスクリーニングした。簡単に言う と、２．５μｇ／mlでＰＶＣマイクロタイタープレート上に精製されたヒトＣＥ Ａをコーティングさせ、これを、ＰＢＳ、０．５％のＴｗｅｅｎ、５％のニワト リ血清内で１：４又は１：５に希釈された培養上清と共にインキュベートした。 プレートを洗浄し、その後ひきつづき、ヒトＩｇＧ Ｆｃに対し特異的なホー スラディッシュベルオキシダーゼで接合されたヤギ抗血清又はヒトＩｇＭ Ｆｃ ５Ｍｕに特異的なウサギ抗血清（Jackson Immuno Research．West Grove，PA） を付加した。さらに洗浄した後、ＡＢＴＳ基質の付加により、捕獲された抗体に 結合された接合体の存在を確認した。独立した２つの融合ウエルがＣＥＡに対す る実質的な結合力をもつ抗体を含んでいることがわかった。クローニングの後、 ＥＬＩＳＡにより、ヒトμ鎖及びマウスκ鎖の存在について、両方のハイブリド ーマが陽性であることがわかった。類似の検定を用いて、いかなるマウスＩｇＧ もＩｇＭも検出されなかった。 ２つの独立した親ハイブリドーマのサブクローニングの結果、９２−０９Ａ− ４Ｆ７−Ａ５−２及び９２−０９Ａａ、−ＩＤ７−１−７−１と呼称される２つ のクローンが得られた。両方の系統共、ブタぺスト条約に基づきＡＴＣＣ特許培 養寄託所に寄託され、それぞれＡＴＣＣ呼称ＨＢ１１３０７及びＨＢ１１３０８ を受けた。これらの細胞系統からの培養上清に関し、ＥＬＩＳＡを用いていくつ かの精製された標的タンパク質に対する反応性についてテストすることによって 、特異性を評価した。図５７に示されているように、さまざまな抗原に対するモ ノクローナル抗体の反応性を決定するためのＥＬＩＳＡ検定は、ＣＥＡ及びＣＥ Ａ関連抗原ＮＣＡ−２のみが有意の反応性を示すことを立証したが、これは、ヘ テロハイブリッド免疫グロブリン分子の可変領域について制限された反応性の発 達を 表わしている。実施例２３ この例は、ヒトＩｇミニ遺伝子座トランスジーンによりコードされる再配置さ れたヒトＶＤＪ遺伝子を、キメラヒト／マウスＩｇ鎖をコードするべく例えばト ランススイッチメカニズムによって、内因性Ｉｇ恒常領域遺伝子を含む写しとし て転写させることができるということを立証している。キメラヒト−マウス重鎖をコードするトランス−スイッチ写しの同定 内因性重鎖Ｊセグメント欠失について同型接合の高度免疫されたＨＣｌ系統５ ７のトランスジェニックマウスからＲＮＡを分離させた（上記）。本書に参考と して内含されているTaylor et al.(1993)Nucleic Acids Res ．20 ：6287に従っ てｃＤＮＡを合成し、以下の２つのプライマを用いてＰＣＲにより増幅した ｏ −１４９（ヒトＶH251) ： ５′−CTA GCT CGA GTC CAA GGA GTC TGT GCC GAG GTG CAG CTG(G,A,T,C)−３′ ｏ−２４９（マウスガンマ）： ５′−GGC GCT CGA GCT GGA CAG GG(A／C) TCC A(G／T)A GTT CCA −３′ オリゴヌクレオチドｏ−１４９は、ＨＣｌでコードされた可変遺伝子セグメン トＶH251に特異的であり、一方ｏ−２４９は、次のような特異性順序でマウス及 びヒトの両方のガンマ配列に対しハイブリッド形成する マウスγ１＝マウスγ２ｂ＝マウスγ３＞マウスγ２ａ≫ヒトγ１ ＰＣＲ産物から生成された無作為に選択した１０個のクローンからのＤＮＡ配 列を決定し、これらを図５８に示す。２つのクローンが、ヒトＶＤＪ及びマウス γ１を含んでいた：４つのクローンがヒトＶＤＪ及びマウスγ２ｂを含んでいた 。又４つのクローンがヒトＶＤＪとマウスγ３を含んでいた。これらの結果は、 トランスジェニックＢ細胞の一分画の中で、トランスジーンでコードされたヒト ＶＤＪが、クラススイッチ又は類似の組換えにより内因性マウス重鎖遺伝子座内 に組換わったということを表している。実施例２４ この例は、ヒトＩｇ鎖をコードし発現するクローンから、キメラヒト／マウス Ｉｇ鎮をコードするクローンを弁別するためのハイブリドーマプールのスクリー ニング方法について記述する。例えば、Ｊ領域で分断された内因性重鎖遺伝子座 について同型接合でありヒトＩｇ重鎖トランスジーンを含むトランスジェニック マウスから作られたハイブリドーマクローンのプールの中で、トランススイッチ されたヒトＶＤｊ−マウス恒常領域重鎖をコードするハイブリドーマクローンを 、ヒトＶＤＪ−ヒト恒常領域重鎖を発現するハイブリドーマクローンから同定し 分離することが可能である。キッメラＩｇ鎖を除去するためのハイブリドーマのスクリーニング スクリーニングプロセスには、単独で又は任意には組合わせた形で実施できる 次の２つの段階が関与している：（１）予備的なＥＬＩＳＡに基づくスクリーン 及び（２）ハイブリドーマ候補の二次的分子特徴づけ。好ましくは、ヒトＶＤＪ 領域及びヒト恒常領域を発現するハイブリドーマ候補の初期同定のためには、予 備的なＥＬＩＳＡに基づくスクリーンが用いられる。 （例えば、トランスジェニックマウス内での抗体応答を惹起するのに用いられ る免疫原などの）抗原との陽性の反応性を示すハイブリドーマを、マウスμ．γ ，κ及びλ及びヒトμ．γ及びκと特異的に反応するモノクローナル抗体のパネ ルを用いてテストした。ヒト重鎖及び軽鎖に対して陽性でありかつマウス鎖につ いて陰性であるハイブリドーマだけが、ヒト免疫グロブリン鎖を発現するハイブ リドーマ候補として同定される。かくして、ハイブリドーマ候補は、特定の抗原 との反応性を有し、ヒト恒常領域の特徴であるエピトープを有することがわかる 。 ＲＮＡをハイブリドーマ候補から分離し、最初のストランドのｃＤＮＡを合成 するのに使用する。この最初のストランドのｃＤＮＡを次に、（１本鎖ＤＮＡを 連結する）ＲＮＡリガーゼを用いて、予め定められた配列の唯一の１本鎖オリゴ ヌクレオチドに連結する。連結されたｃＤＮＡを次に、２組のオリゴヌクレオチ ドプラマーを用いてＰＣＲにより２つの反応において増幅させる。セットＨ（ 重鎖）は、（ＥＬＩＳＡの結果に応じて）ヒトμ又はヒトγ１のいずれかへと特 異的にアニールするオリゴ、及び、オリゴ−Ｘ配列へとアニールするオリゴを含 む。こうして、ヒトミニ遺伝子座内へトランス再配置している可能性のあるマウ スＶセグメントを含め、特別なＶセグメントの検出に対抗する偏が防止される。 第２の組のプライマ、つまりセットＬ（軽鎖）は、ヒトκへと特異的にアニール するオリゴと、オリゴ−Ｘへと特異的にアニールするオリゴを含む。ＰＣＲ産物 を分子クローニングし、ヒト及びマウスＩｇ配列に対する配列比較に基づいてハ イブリドーマが唯一のヒト抗体を産生しているか否かを確かめるため、そのいく つかのＤＮＡ配列を決定する。実施例２５ この例は、ヒト軽鎖（κ）ミニ遺伝子座を宿すトランスジェニックマウスの産 生を実証する。ヒトκミニ遺伝子座トランスジェニックスマウス ＫＣＩ （上記のようなκ特異的オリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーション によるヒトゲノミックＤＮＡファージライブラリから分離された）ファージクロ ーンからの１３kbのＸｈｏＩ Ｊκ２−Ｋκを含むフラグメントをクレノウ酵素 で処理し、ｐＫ−３１を産生するべくｐＧＰｌｄのクレノウ処理されたＨｉｎｄ lll 部位にクローニングさせた。これにより、インサートＸｈｏＩ部位が破壊さ れ、唯一のポリリカー誘導されたＸｈｏＩ部位はＪκ２の隣り５′末端に位置つ げされた。唯一のポリリカー誘導されたＣｌａＩ部位をこのＸｈｏＩ部位とイン セット配列の間に位置設定し、一方唯一のポリリカー誘導されたＳａｌI部位を インサートの３′末端に位置設定する。 ｊκｌ及び上流配列を含む７．５kbのＸｈｏＩフラグメントも同様に、（上述 のようにκ特異的オリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションによりヒ トゲノミックＤＮＡファージライブラリーから分離された）ヒトゲノミックＤＮ Ａファージクローンから分離した。この７．５kbのＸｈｏＩフラグメントをｐＳ Ｐ７２（Promega，Madison，Misconsin）のＳａｌｌ部位内にクローニングさせ 、かくして両方のＸｈｏＩ部位を破壊し、Ｊκ１の３′にポリリンカーＣｌａＩ 部位を位置づけた。結果として得られたクローンをＣｌａＩで消化させると、上 流配列を４．５kbとＪκ１を含む４．７kbのフラグメントが放出された。 この４．７kbのフラグメントをｐＫ−３１のＣｌａＩ部位内にクローニングさ せ、ｐＫｃｏｒ「を作り出した。残りの唯一の５′ＸｈｏＩ部位をポリリンカー 配列から誘導する。再配置されていないヒトＶκlll 遺伝子セグメント６５．８ （プラスミドｐ６５．８、実施例２１）を含む６．５kbのＸｈｏＩ／Ｓａｌｌ ＤＮＡフラグメントをｐＫｃｏｒのＸｈｏＩ部位内にクローニングしてプラスミ ドｐＫＣ１を生成させた。ｐＫＣ１のＮｏｔＩインサートを１／２日目のマウス 胎児内に微量注射してトランスジェニックマウスを生成した。２つの独立したｐ ＫＣ１誘導されたトランスジェニック系統を樹立し、重鎖及び軽鎖ミニ遺伝子座 を両方共含むマウスを繁殖させるのに用いた。これらの系統ＫＣｌ−６７３及び ＫＣ１−６７４は、サザンブロットハイブリダイゼーションにより、それぞれト ランスジーンのおよそ１及び１０〜２０のコピーの組込みを含むものとして見積 られた。ＫＣｌｅ マウス及びヒト重鎖Ｊ−μイントロンエンハンサーを両方共含む２．３kbのイ ンサートを切除するため、ＢａｍＨ［及びＨｉｎｄlllを用いてプラスミドｐＭ ＨＥｌ（実施１３及び１８）を消化した。このフラグメントをクレノウ処理し、 Ｓａｌｌリンカー（New England Biolabs，Beverly.Massachusetts）に連結させ 、ｐＫＣＩの唯一の３′Ｓａｌｌ部位の中にクローニングさせてプラスミドｐＫ Ｃ１ｅを生成した。ｐＫＣｌｅのＮｏｔｌインサートを１／２日目のマウス胎児 に微量注射してトランスジェニックマウスを生成した。４つの独立したｐＫＣｌ ｅ誘導されたトランスジェニック系統を樹立し、重鎖及び軽鎖ミニ遺伝子座を両 方共含むマウスを繁殖させるのに使用した。これらの系統ＫＣｌｅ−１３９９． ＫＣｌｅ−１４０３．ＫＣｌｅ−１５２７及びＫＣｌｅ−１５３６は、サザンブ ロットハイブリダイゼーションにより、それぞれトランスジーンの約２０〜 ５０，５〜１０，１〜５及び３〜５のコピーの組込みを含むものであると見積ら れた。ｏＫＣ２ 再配置されていないヒトＶκlll遺伝子セグメント６５．５（プラスミドｐ６ ５．５ｇｌ、実施例２１）を含む６．８kbのＸｈｏｌ／ＳａｌＩ ＤＮＡフラグ メントをｐＫＣｌの唯一の５′ＸｈｏＩ部位内にクローニングしてブラスミドｐ ＫＣ２を生成した。このミニ遺伝子座トランスジーンは、２つの異なる.機能的 Ｖκlll遺伝子セグメントを含む。１／２日目のマウス胎児の中にｐＫＣ２のＮ ＯｔＩインサートを微量注射してトランスジェニックマウスを生成した。５つの 独立したｐＫＣ２誘導されたトランスジェニック系統を樹立し、重鎖及び軽鎖ミ ニ遺伝子座の両方を含むマウスを繁殖させるのに用いた。これらの系統ＫＣ２− １５７３，ＫＣ２−１５７９，ＫＣ２−１５８８，ＫＣ２−１６０８及ひＫＣ２ −１６１０は、サザンブロットハイブリダイゼーションにより、それぞれトラン スジーンの約１〜５，１０〜５０，１〜５，５０〜１００及び５〜２０のコピー の組込みを含むものと見積られた。実施例２６ この例は、ヒトκトランスジーンを支持するトランスジェニックマウスが、機 能的ヒトκ鎖を含む抗体を形成する抗原誘発された抗体応答を発生させることが できるということを示している。ヒトＩｇκ軽鎖と結びつけられた抗体応答 ＨＣｌ−５７ヒト重鎖及びＫＣｌｅヒトκトランスジーンを含むトランスジェ ニックマウスを精製されたヒト可溶性ＣＤ４（ヒト糖タンパク質抗原で免疫化し た。ポリスチレンラテックス粒子（Polysciences．Marrington，PA）に対する接 合（コンジュゲーション）により不溶化された精製ヒトＣＤ４（NEN Researchの 製品、Westwood，MA）を２０μｇ、０日目にジメチルジオクタデシル臭化アンモ ニウム（Cal bio chem，San Diego，CA）を伴う食塩水中で腹腔内注射し、その 後２０日目及び３４日目にさらに注射を行なった。 ２５日目と４０日目に眼窩後方出血をとり、ＥＬＩＳＡにより、ヒトＩｇＭ又 はヒトＩｇＧ重鎖を含むＣＤ４に対する抗体の存在についてスクリーニングした 。簡単に言うと、ＰＶＣのマイクロタイタープレート上に２．５μｇ／mlで精製 されたヒトＣＤ４をコーティングし、ＰＢＳ、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０、５％ のニワトリ血清中で１：４／１：５に希釈された培養上清と共にインキュベート させた。プレートを洗浄し、その後、ヒトＩｇＧ Ｆｃに特異的なホースラディ ッシュペルオキシダーゼ接合されたヤギ抗血清又はヒトＩｇＭ Ｆｃ５Ｍｕに特 異的なウサギ抗血清（Jackson Immuno Research，Westr Grove，PA）を付与した ＡＢＴＳ基質の付加によるさらなる洗浄後に、捕獲された抗体に結合された接 合体の存在を見極めた。両方の出血において、抗原との反応性をもつヒトμを検 出したが、γ反応性は基本的に検出不能であった。４０日目に、ヤギ抗ヒトκペ ルオキシダーゼ接合体（Sigma，St.Louis，MO）での同じ検定を用いて抗原反応 性ヒトκ鎖についても試料をテストした。この時点でＣＤ４を結合するκ反応性 が検出された。検定の結果は、図５９に示されている。実施例２７ この例は、機能的に分断されたマウス重鎖及び軽鎖遺伝子座（重鎖及びκ鎖遺 伝子座）について同型接合であり、しかも、機能的ヒト重鎖及び機能的ヒト軽鎖 をコードするべく産生的に再配置することのできるヒト軽鎖トランスジーンとヒ ト重鎖トランスジーンを並行して宿すマウスの生成の成功を示している。このよ うなマウスは「００１１」マウスと呼ばれ、ここで最初の２ケタの２つのゼロは このマウスに機能的な重鎖及び軽鎖遺伝子座が欠如していることを表わし、次の ２ケタの１は、このマウスがヒト重鎖トランスジーン及びヒト軽鎖トランスジー ンについて半接合であることを表わしている。この例は、かかる００１１マウス に予め定められた抗原に対する特異的抗体応答を発生させる能力があること、又 かかる抗体応答にアイソタイプスイッチが関与しうることを示している。００１１／００１２マウス：内因性Ｉｇノックアウト＋ヒトＩｇトランスジーン 上述のＨＣｌ−２６トランスジェニックマウス系統といったヒトＨＣｌトラン スジーンも宿し、機能的ＪH領域が欠如した機能的に分断された内因性重鎖遺伝 子座（ＪＨＤ÷÷又はＪＨΔ÷÷と呼ばれる）について同型接合であったマウス を、機能的ＪH領域の欠如した機能的に分断された内因性カッパ鎖遺伝子座（こ こではＪＫＤ÷÷又はＪＫ△÷÷と呼ばれる、図９参照）について同型接合のマ ウスと同系交配させて、ＪＨＤ÷÷／ＪＫＤ÷÷と呼ばれるＨＣｌトランスジー ンを含む機能的に分断された重鎖及びカッパ鎖遺伝子座（重鎖／カッパ鎖ノック アウト）について同型接合のマウスを産生した。 かかるマウスを、同系交配により産生させ、ゲノミックＤＮＡのサザンブロッ トにより評価されるとおりの遺伝子型に基づいて選択した。ＨＣｌ−２６÷／Ｊ ＫＤ＋÷／ＪＨＤ＋＋マウスと呼ばれるこれらのマウスを、ヒトカッパ鎖トラン スジーンを宿すマウス(系統ＫＣ２−１６１０，ＫＣｌｅ−１３９９及びＫＣｌ ｅ−１５２７；実施例２５参照).と同系交配させ、機能的に分断された重鎖及び 軽鎖遺伝子座について同型接合でしかもＨＣｌトランスジーン及びＫＣ２又ＫＣ ｌｅトランスジーンについで半接合である子孫マウスを同定するのに、ゲノミッ クＤＮＡのサザンブロット分析を用いた。 このようなマウスは番号で呼称され、以下の略号を用いてその遺伝子型に関し て同定された：すなわち、ＨＣｌ−２６÷はＨＣｌ−２６系統のヒト重鎖ミニ遺 伝子座トランスジーン組込みに対する半接合を表わし；ＪＨＤ＋÷はＪHノック アウトに対する同型接合を表わし；ＪＫＤ÷÷はＪκノックアウトに対する同型 接合を表わし；ＫＣ２−１６１０÷は、系統ＫＣ２−１６１０の場合と同じよう に組込まれたＫＣ２ヒトκトランスジーンについての半接合を麦わし：ＫＣｌｅ −１５２７÷は、系統ＫＣｌｅ−１５２７の場合と同じように組込まれたＫＣｌ ｅヒトκトランスジーンについての半接合を表わし；ＫＣｌｅ−１３９９÷は、 系統ＫＣｌｅ−１３９９の場合と同じように組込まれたＫＣｌｅヒトκトランス ジーンについての半接合を表わす。 結果して得られた個々の子孫には各々数字で表わした呼称（例えば６２９５． ６９０７など。）が与えられ、各々ＪHノックアウト対立遺伝子、Ｊκノックア ウト対立遺伝子、ＨＣｌ−２６トランスジーン及びκトランスジーン（ＫＣ２又 はＫＣｌｅ）の存在について評価され、各遺伝子座において半接合（÷）又は同 型接合（÷÷）のいずれかであることが決定された。表１０は、子孫マウスのい くつかの番号呼称、性別及び遺伝子型を示している。 表 ６ ID 番号 性別 Ig コード 遺伝子型 6295 Ｍ 0011 HCl−26＋；JHO＋＋ ；JKO＋＋ ；KC2−1610＋ 6907 Ｍ 0011 HCl−26＋；JHO＋＋ ；JKO＋＋ ；KCle−1527＋ 7086 Ｆ 0011 HCl−26＋；JHO＋＋ ；JKO＋＋ ；KCle−1399＋ 7088 Ｆ 0011 HCl−26＋；JHO＋＋ ；JKO＋＋ ；KCle−1399＋ 7397 Ｆ 0011 HCl−26＋；JHO＋＋ ；JKO＋＋ ；KCle−1527＋ 7494 Ｆ 0012 HCl−26＋；JHO＋＋ ；JKO＋＋ ；KC2−1610++ 7497 Ｍ 0011 HCl−26＋；JHO＋＋ ；JKO＋＋ ；KCle−1399＋ 7648 Ｆ 0011 HCl−26＋；JHO＋＋ ；JKO＋＋ ；KC2−1610＋ 7649 Ｆ 0012 HCl−26＋；JHO＋＋ ；JKO＋＋ ；KC2−1610＋＋ 7654 Ｆ 0011 HCl−26＋；JHO＋＋ ；JKO＋＋ ；KC2−1610＋ 7655 Ｆ 0011 HCl−26＋；JHO＋＋ ；JKO＋＋ ；KC2-1610＋ 7839 Ｆ 0011 HCl−26＋；JHO＋＋ ；JKO＋＋ ；KCle−1399＋ 7656 Ｆ 0001 HCl−26−；JHO＋＋ ；JKO＋＋ ；KC2−1610＋ 7777 Ｆ 1100 Col-2141−；JHO＋ ；JKO＋ 我々は、生後６週間の雌マウスから脾臓をとり出した。サザンプロットハイブ リダイゼーションにより、マウス＃７６５５は、ＨＣｌ（系統２６）及びＫＣ２ （系統１６１０）トランスジーン取込みについて半接合であり、マウスμ及びκ Ｊ領域のＪＨΔ及びＪκΔターゲティングされ欠失について同型接合であること が見極められた。マウス＃７６５６は、サザンプロットハイブリダイゼーション により、ＫＣ２（系統１６１０）トランスジーン組込みについて半接合でありマ ウスμ及びκＪ領域のＪＨΔ及びＪκΔターゲッティングされた欠失について同 型接合であることが見極められた。マウス＃７７７７は、サザンプロットハイブ リダイゼーションにより、マウスμ及びκＪ領域のＪＨΔ及びＪκΔターゲティ ングされた欠失について半接合であると見極められた。これらの欠失が劣性であ ることから、このマウスは表現型上野生型であるはずである。００１１マウスにおける内因性Ｉｇ鎖の発現 （１）野生型マウス（７７７７）、（２）重鎖及びカッパノックアウト対立遺 伝子について同型接合でヒト軽鎖トランスジーン（７６５６）を宿す０００１マ ウス及び（３）重鎖及びカッパノックアウト対立遺伝子について同型接合でヒト 軽鎖トランスジーン及びヒト重鎖トランスジーン（７６５５）を宿す００１１マ ウスから外植されたリンパ球を選別するため、ヒトμ、マウスμ、ヒトκ、マウ スκ、又はマウスλのいずれかと反応性ある抗体のパネルを用いたＦＡＣＳ分析 を使用した。 我々は、Mishell 及びShiigi（Mishell，B.B．& Shiigi.S.M．（eds)細胞免疫 学における選択された方法 。W.H.Freeman & Co.，New York，1980）により記述 されているように、脾臓から単細胞懸濁液を調製し、ＮＨ4、Ｃlで赤血球を溶解 させた。リンパ球を以下の試薬で染色するヨウ化プロピジウム（分子プローブ、 Eugene，OR）、ＦＩＴＣ接合された抗ヒトＩｇＭ（クローンＧ２０−１２７１Ph armingen.サンディエゴ，CA）、ＦＩＴＣ接合された抗マウスＩｇＭ（クローン Ｒ６−６０． ２；Pharmingen，サンディエゴ，CA）、フィコエリトリン接合さ れた抗ヒトＩｇκ（クローンＨＰ６０６２；Cal Tag，サウスサンフランシスコ ，CA）、ＦＩＴＣ接合された抗マウスＩｇλ（クローンＲ２６−４６；Pharming en，サンディエゴ，CA)、ＦＩＴＣ接合された抗マウスＢ２２０（クローンＲＡ ３−６Ｂ２；Pharmingen，サンディエゴ，CA）、及びＣｙ−クロム接合された抗 マウスＢ２２０（クローンＲＡ３−６Ｂ２；Pharmingen，サンディエゴ，CA）。 我々は、ＦＡＣＳｃａｎフロー血球計算器及びＬＹＳＩＳＩＩソフトウェア（Be ct on Dickinson，サンホゼ，CA）を用いて染色された細胞を分析した。 マクロファ−ジ及び残留赤血球を、前方及び側方散乱をゲ−ト・オンすること により排除する。死濁細胞は、ヨウ化プロピジウム陽性細胞をゲート・アウトす ることにより排除する。図６０及び図６１のフローサイトメトリーデータは、サ ザンブロットハイブリダイゼーションデータを確認し、マウス＃７６５５がヒト μ及びヒトκの両方を発現し、あったとしても比較的わずかなマウスμ又はマウ スκを発現することを実証している。それでも、Ｂ細胞の有意な分画（約７０〜 ８０％）がヒト重鎖及びマウスλ軽鎖から成るハイブリッドＩｇレセプターを発 現すると思われる。 図６０は、細胞表面上でヒトμ又はマウスμを発現するＢ細胞の相対的分布を 示す；００１１マウス（７６５５）リンパ球はヒトμに対し陽性であるが、相対 的にマウスμが欠如している；０００１マウス（７６５６）リンパ球は、多くの ヒトμ又はマウスμを発現しない；野生型マウス（７７７７）リンパ球はマウス μを発現するが、ヒトμが欠如している。 図６１は、細胞表面上でヒトκ又はマウスκを発現するＢ細胞の相対的分布を 示す；００１１マウス（７６５５）リンパ球はヒトκについて陽性であるが、相 対的マウスκが欠如している；０００１マウス（７６５６）リンパ球は多くのヒ トκ又はマウスκを発現しない；野生型マウス（７７７７）リンパ球はマウスκ を発現するが、ヒトκか欠如している。 図６２は、細胞表面上でマウスλを発現するＢ細胞の相対的分布を示す；００ １１マウス（７６５５）リンパ球はマウスλについて陽性である；０００１マウ ス（７６５６）リンパ球は、有意なマウスλを発現しない；野生型マウス（７７ ７７）リンパ球はマウスλを発現するが、００１１マウス（７６５５）に比べ相 対的に低いレベルにある。 図６３は、ヒトκ（トランスジーンでコードされたもの）に比べての内因性マ ウスλについて陽性のＢ細胞の相対的分布を示す。左上の図版は、機能的内因性 重鎖及び軽鎖対立遺伝子を有しヒトトランスジーン（単複）が欠如している野生 型マウスからの細胞の結果を示す；細胞はマウスラムダについて陽性である。右 上の図版は、κノックアウトバックグラウンド（ＪＫＤ÷÷）を有しＫＣｌｅ− １３９９系統のヒトκトランスジーンの組込みを宿すマウス（＃５８２２）から の細胞を示す;細胞は、おおまかに比例する量でヒトκ又はマウスλについて陽 性である。 左下図版は、κノックアウトバックグラウンド（ＪＫＤ÷÷）を有しＫＣ２− １６１０系統のヒトκトランスジーン組込みを宿すマウス（＃７１３２）からの 細胞を示すヒトκに対してよりマウスλに対してより多くの細胞が陽性であり、 ＫＣ２−１６１０トランスジーン組込みがＫＣｌｅ−１３９９トランスジーン組 込みほど効率が良くないということを表わしている可能性がある。右下図版は、 ヒトκミニ遺伝子座トランスジーン（ＫＣｏ４）を宿し機能的内因性マウスκ対 立遺伝子か欠如しているマウスからの細胞を示す。 図６３に示されているデータは同様に、トランスジーン間の表現型の可変性を も実証している。かかる可変性は、組込まれたトランスジーンの結果もたらされ る単数又は複数の表現型上の特徴（例えばアイソタイプスイッチ、高レベル発現 、低マウスＩｇバックグラウンド）を発現する個々のトランスジーン及び／又は トランスジェニック系統について選択するのが望ましいことであるということを 表わしている。−般に、（１）トランスジーン、（２）トランスジーン組込みの 部位、及び／又は（３）遣伝的背景により異なっている多数の個別のトランスジ ェニック系統を形成するため、別々に単一又は多数のトランスジーン種（例えば ｐＫＣｌｅ．ｐＫＣ２，ＫＣｏ４）が利用される。 次のような望ましいパラメータについて個々のトランスジェニック系統を検査 する：（１）予め定められた抗原に対する免疫応答を高める能力、（２）トラン スジーンでコードされた恒常領域内のアイソタイプスイッチの頻度及び／又は内 因性（例えばマウス）Ｉｇ恒常領域遣伝子に対するトランススイッチの頻度、（ ３）トランスジーンでコードされた免疫グロブリン鎖及び抗体の発現レベル、（ ４）内因性（例えばマウス）免疫グロブリン、免疫グロブリン配列の発現レベル 、及び（５）産生的ＶＤＪ及びＶＪ再配置の頻度。標準的には、トランスジーン でコードされる（例えばヒト）免疫グロブリン鎖を最大濃度で産生するトランス ジェニック系統が選択される；好ましくは、選択された系統は、トランスジェニ ック動物の血清中で少なくとも約４０μｇ／mlのトランスジーンコードされた重 鎖（例えばヒトμ又はヒトγ）及び／又は少なくとも約１００μｇ／mlのトラン スジーンコードされた軽鎖（例えばヒトκ）を産生する。 マウスの免疫化を受けていない血清及び特異的抗原つまりヒトＣＤ４での免疫 化の後の血清の中のヒト及びマウス免疫グロブリン鎖の発現について、マウスを 検査した。図６４はさまざまな遺伝子型の別々の４匹の免疫化を受けていない０ ０１１マウスの血清の中に存在するヒトμ、ヒトγ、マウスμ、マウスγ、ヒト κ、マウスκ及びマウスλ鎖の相対的発現を示している（ｎｔ＝テストせず）； ヒトκが最も豊富な軽鎖として優勢であり、ヒトμ及びマウスγ（推定上はトラ ンススイッチの産物）が最も豊富な重鎖であるが、系統間で可変性が存在してお り、このことは、ヒト鎖の発現を可能にしながらマウス鎖の発現を最小限にする 有利な遺伝子型組合せを同定するための選択段階の有用性を表わしている。マウ ス＃６９０７及び７０８８は、ヒトμからヒトγへのアイソタイプスイッチ（ト ランスジーン内のシス・スイッチ）を示している。 図６５は、さまざまな００１１遺伝子型のマウス内のヒトμ（ｈｕμ）、ヒト γ（ｈｕγ）、ヒトκ（ｈｕκ）、マウスμ（ｍｓμ）、マウスγ（ｍｓγ）、 マウスκ（ｍｓκ）、及びマウスλ（ｍｓλ）についての血清免疫グロブリン鎖 レベルを示している。００１１マウス内の特異的抗体応答 ００１１マウス（＃６２９５）を、次の免疫化計画に従って免疫原性用量のヒ トＣＤ４を用いて免疫化した：０日目、ＣＤ４マウス免疫血清１００μｌの腹腔 内注入；１日目、１００μｌ中ＤＤＡを伴いラテックス溶球上で２０μｇのヒト ＣＤ４（American Bio-Tech）を注入する；１５日目、１０μｌ中ＤＤＡを伴い ラテックス溶球上で２０μｇのヒトＣＤ４（American Bio-Tech）を注入する； ２９日目、１００μｌ中ＤＤＡを伴いラテックス溶球上で２０μｇのヒトＣＤＡ （American Bio-Tech）を注入する；４３日目、１００μｌ中ＤＤＡを伴いラテ ックス溶球上で２０μｇのヒトＣＤ４（American Bio-Tech ）を注入する。 図６７は、抗ＣＤ４応答におけるヒトμ、ヒトκ及びヒトγ鎖の存在を立証す る３週間目及び７週間目のＣＤ４免疫化に対する相対的抗体応答を示す。ヒトγ 鎖は、７週間目の血清中で著しく増大した発生量で存在し、野生型動物における ァィソタイプスイッチのものと似た時間的関係で重鎖トランスジーン内でのシス −スイッチ（アイソタイプスイッチ）が発生していることを表わしている。 図６８は、さまざまなヒト重鎖及び軽鎖トランスジーンの概略的寄せ集めを示 す。実施例２８ この例は、マウスλ軽鎖遺伝子座のターゲティングされたノックアウトを提供 する。マウスラムダ軽鎖遺伝子座のターゲティングされた失活 Ｉｇ重鎖及びカッパ軽鎖遺伝子座とは異なり、マウスＶλＪλ及びＣλ遺伝 子セグメントは、５′−３′アレイの形に配置された３つのグループにまとめら れておらず、その代りに散在させられている。最も５′の部分は２つのＶセグメ ント（Ｖλ２及びＶλＸ）で構成されており、これら２つのセグメントの後には 、３′方向に続行して各々独自のＪセグメント（Ｊλ２Ｃλ２及び遺伝子Ｊλ４ Ｃλ４）と結びつけられた２つの恒常領域エキソンが続いている。次にくるのは 最も広く用いられるＶセグメント （Ｖλ１）であり、このセグメントの後には 恒常領域エキソンの第２のクラスター（Ｊλ３Ｃλ３及びＪλ１Ｃλ１）が続い て いる。全体として、遣伝子座は約２００kbにまたがり、２つのクラスター間の間 隔は〜２０〜９０kbである。 ラムダ遺伝子座の発現には、優越してＪλ２までのＶλ２又はＶλＸの再配置 そして稀にのみＪλ３又はＪλ１に対してさらに３′の再配置が関与する。Ｖλ １はJλ３及びＪλ１の両方と組換え可能である。かくして、遺伝子座の組換え 及び発現を充分に削除するため、ラムダ遺伝子座を突然変異させることが可能で ある。 ２つのラムダ遣伝子クラスターの間の距離は、マウスＩｇ重鎖及びカッパ軽鎖 遺伝子座を失活させる上で用いられたとおりに、単一のち密なターゲッティング された欠失の生成を介して遺伝子座の発現を失活することを困難にする。その代 り、発現ラムダ軽鎖を削除することになる小さい単一の欠失は、Ｊλ２Ｃλ２か らＪλ１Ｃλ１までに広がる約１２０kbにまたがっている（図６９）。こうして ラムダ恒常領或エキソンの全てならびにＶλ１遺伝子セグメントが除去され、遺 伝子座の失活が確保される。 欠失された１２０1kbがＰＧＫ発現カセット内で選択可能な標識遣伝子ｎｅｏ と置換されている、置換型ターゲティングベクター（Thomas及びCapecehi（1987 ）前掲書中）が構築される。このマーカーは、ラムダ遺伝子座に対する相同性を 提供するため欠失にフランキングするゲノミックラムタダ配列内に埋め込まれて おり、同様に、ベクターを相同的に組込んだ細胞についての富化を可能にするた め、相同性領域の１つの端部にＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を含むこともできる。ターゲ ティングされている染色体ＤＮＡに対し同質遺伝子型のターゲティングベクター の使用が相同組換えの効率を増強することが報告されていることから、ラムダ遺 伝子座ゲノミッククローン配列は、ターゲティングされているＥＳ系統と同質遺 伝子型の系１２９／Ｓｖゲノミックファージライブラリのスクリーニングによっ て得られる。 ラムダ遣伝子座に対する相同性の長さで相異のあるターゲティングベクター が構築される。第１のベクター（図７０中のベクター１）は、合計約８〜１２kb のラムダ遺伝子座配列によりフランキングされた標識遣伝子を含む。置換ベクタ ーが数kbのＤＮＡの付加又は検出を媒介するターゲティング事象については、こ れは、充分以上の相同性範囲であることが実証されてきた（Hasty et al．（199 1）、前掲書Ｍ中；Thomas et al.（1992）前掲書中）。フランキングラムダ配列 をさらに約４０〜６０kb伴うベクターも又構築される（図７０中のベクタ−２） 。少なくとも８０kbのヒト１ｇミニ遣伝子座が日常的にクロ−ニングされ、プラ スミドベクタ−ｐＧＰ１の中で増殖される（Taylor et al.（1993）前掲書中） ラムダ遣伝子座の失活のための代替的なアプローチでは、同じＥＳ細胞内にお いて、例えば２つの恒常領域クラスタ一又は２つのＶ領域遺伝子座の突然変異と いった２つの独立した突然変異が利用される。 恒常領域が両方共各々ＤＮＡの〜６kb内に内含されているのに対しＶ遺伝子座 の１つは〜１９kbにまたがっていることから、ターゲディングベクターは」λ２ Ｃλ２／Ｊλ４Ｃλ４及びＪλ３Ｃλ３／Ｊλ１Ｃλ１遺伝子座を独立して欠失 するように構築される。図１７０に示されているように、各々のベクターは、各 欠失にフランキングする合計〜８〜１２kbのラムダ遺伝子座ゲノミックＤＮＡに よりとり囲まれた、ＰＧＫ発現カセット内の選択可能なマーカー（例えばｎｅｏ 又はｐａｃ）から成る。陽性−陰性選択による相同組換え事象のため富化するべ く、ターゲディングベクターに対し、ＨＳＶ−ｔｋ遣伝子を付加することが可能 である。 恒常領域遺伝子のうちの１つの欠失を支持するクローンが生成されるように、 ＥＳ細胞を２つのベクターで逐次的にターゲッティングさせる。次にこれらのク ローンを２つのベクターで逐次的にターゲティングさせて、恒常領域遺伝子座の １つの欠失を支持するクローンが生成されるようにし、その後これらのクローン を残りの機能的恒常領域クラスターの欠失を生成するべくターゲティングさせる 。両方のターゲティング事象がかくして同じ細胞に対し向けられていることから 、２つのターゲティングのために異なる選択可能なマーカーを使用することが好 ましい。図７０に示されている概略的な例においては、ベクターのうち一方はｎ ｅｏ遺伝子を含み、もう一方はｐａｃ（ピュロマイシンＮ−アセチルトランスフ ェラーゼ）遺伝子を含んでいる。 第３の潜在的に優性な選択可能マーカーは、ｈｙｇ（ハイグロマインンホスフ ォトランスフェラーゼ）遺伝子である。ｐａｃ及びｈｙｇ遣伝子は両方共、Ｉｇ 重鎖及びカッパ軽鎖遣伝子座の中にｎｅｏ遺伝子座をターゲティングするために うまく使用されるＰＧＫ発現構成体の中に挿入され得る。２つのラムダ恒常領域 クラスターは密に連鎖されるされていることから、２つの突然変異が同じ染色体 上にあることが重要である。好ましくは独立した２つのターゲティング事象によ り同じ対立遺伝子を突然変異させる確率は５０％あり、突然変異の連鎖は、２重 にターゲティングされたＥＳ細胞から誘導されたキメラの繁殖（交配）中のその 同時分離により確立される。実施例２９ この例は、マウス重鎖遺伝子座のターゲティングされたノックアウトを提供す る。マウス重鎖遺伝子座のターゲティングされた失活 ＥＳ細胞内での遺伝子ターゲティングによりマウス重鎖遣伝子座恒常領域遺伝 子のうちの少なくとも１つ好ましくは実質的に全てを欠失するために、図９１に 示された構造をもつ相同組換え遺伝子ターゲティングトランスジーンを使用する 。図９１は、ターゲティングトランスジーンの全体的概要図を示す。セグメント （ａ）は、欠失されるべき恒常領域遺伝子（単複）の上流にある（すなわち遺伝 子に近接する）クローニングされたゲノミックＤＮＡ配列である：セグメント（ ｂ）は、ｐｇｋ−ｎｅｏといった正の選択マーカーを含みセグメント（ｃ）は欠 失すべき恒常領域遺伝子（単複）の下流にある（すなわち恒常領域遺伝子（単複 ）及びＪH遺伝子に対し遠位にある）クローニングされたゲノミックＤＮＡ配列 である；又任意のものであるセグメント（ｄ）は、負の選択マーカー遺伝 子（例えばＨＳＶ−ｔｋ）を含む。図７１は、「免疫グロブリン遺伝子」、Honj ｏT．Alt，FW及びRabbits TH(eds)Academic Press，MY(1939)p129からとったマ ウス重鎖遣伝子座の地図を示す。 ターゲティングトランスジーンは、図９１に従った構造を有し、ここで（１） （ａ）セグメントは、クローンＪＨ８．１の１１．５kbのインサート（Chen eta l.(1993)Int.Immunol. ５.647）又は、マウスＣμ遺伝子の上流にある少なくと も約１〜４kbの配列を含む同等の部分であり、（２）（ｂ）セグメントは上述の とおりのｐｇｋ−ｎｅｏであり、（３）（ｃ）セグメントは、５′−gtg ttg cg t gta tca gct gaa acc tag aaa cag ggt gac cag −３′という配列をもつ末端 標識づけされたオリゴヌクレオチドでマウスゲノミッククローンライブラリをス クリーニングすることにより分離されたマウスＣα遺伝子のファージクローンか ら分離された４〜６kbのインサート又は図７２に示された１６７４bpの配列を含 んでおり、（４）（ｄ）セグメントは上述のＨＳＶ−ｔｋ発現カセットを含んで いる。 代替的には、第１のターゲティングが相同性領域すなわち恒常領域遺伝子（単 複）、第１種の正の選択マーカー遺伝子（ｐｇｋ−ｎｅｏ）及びＨＳＶ−ｔｋ負 の選択マーカーにフランキングする配列に相同なセグメント（ａ）及び（ｃ）を 含んでいる、単数又は複数の重鎖恒常領域遺伝子の段階的欠失を実施する。かく して、（ａ）セグメントは、Ｃγ３の上流にある領域に相同な少なくとも約１〜 ４kbの配列を含むことができ、（ｃ）セグメントはＣγ２ａの上流にある領域に 対して相同な少くなくとも約１〜４kbの配列を含むことができる。 このターゲティングトランスジーンはＣγ３，Ｃγ１．Ｃγ２ｂ及びＣγ２ａ 遺伝子を欠失させる。この第１のターゲティングトランスジーンはＥＳ細胞内に 導入され、適正にターゲティングされた組換え体が選択され（例えばＧ４１８で ）、適正にターゲティングされたＣ碩域欠失を生み出す。次にＨＳＶ−ｔｋカセ ットの喪失についての負の選択が行なわれる（例えばｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ又 はＦＩＡＵで）。結果として得られる適正にターゲティングされた第１図のＣ欠 失組換え体は、Ｃγ３．Ｃγ１．Ｃγ２ｂ及びＣγ２ａ遣伝子が欠如した重鎮遣 伝子座を有する。 第２のターゲティングトランスジーンは、相同性領域すなわち、恒常領域遣伝 子（単複）、第１の種とは異なる第２種の正の選択マーカー遣伝子（例ｇｐｔ又 はｐａｅ）及びＨＳＶ−ｔｋ負の選択マーカーにフランキングする配列と相同な セグメント（ａ）及び（ｃ）を含んでいる。かくして、（ａ）セグメントは、Ｃ εの上流にある領域に対し相同な少なくとも約１〜４kbの配列を含むことができ 、（ｃ）セグメントは、Ｃαの上流にある領域に相同で少なくとも約１〜４kbの 配列を含むことかできる。このターゲティングトランスジーンはＣε及びＣα遣 伝子を欠失させる。 この第２のターゲティングトランスジーンは、第１のターゲティング事象から 得られた適正にターゲティングされたＣ−領域組換え型ＥＳ細胞の中へ導入され る。第２のノックアウト事象のために適正にターゲティングされている（すなわ ち第２のターゲティングトランスジーンでの相同組換えによる）細胞は、第２種 の正の選択マー力ー遺伝子に特異的な選択薬剤（例えば、ｇｐｔについて選択す るためのミコフェノール酸ｐａｃについて選択するためのピュロマイシン）を用 いて選択される。その後、ＨＳＶ−ｔｋカセットの喪失についての負の選択が行 なわれる（例えばｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ又はＦＩＡＵを用いて）。結果として 得られるこれらの適正にターゲティングされた第２回目のＣ領取組換え体は、Ｃ γ３．Ｃγ１．Ｃγ２ｂ．Ｃγ２ａ，Ｃε及びＣα遺伝子が欠如した重鎖遺伝子 座を有する。 単数又は複数のＣ領域遺伝子が欠如した適正にターゲティングされた第１回又 は第２回目の組換え型ＥＳ細胞を、上述のとおり、胚盤胞注入のために使用し、 キメラマウスを産生する。ターゲティングされた重鎖対立遺伝子の生殖細胞系伝 播が樹立され、結果として得られた創立者マウスの繁殖（交配）を行なってＣ領 域ノックアウトに対して同型接合のマウスを生成する。このようなＣ領域ノック アウトマウスは、ＪHノックアウトマウスに比べていくつかの利点を有する：− 例を挙げると、Ｃ領域ノックアウトマウスは、ヒト重鎖トランスジーンと内因性 重鎖遺伝子座恒常領域の間のトランススイッチを受ける能力が低下しており（又 はこの能力が完全に欠如している）、かくしてトランスジェニックマウス内のキ メラヒト／マウス重鎖の頻度を減少している。μ及びデルタも同様に頻繁に相同 ターゲティングによって欠失させられているものの、マウスガンマ遣伝子のノッ クアウトが好まれる。 内因性マウス重鎖遣伝子座内のその他のターゲティングされた病巣と合わせて 、Ｃ領域ノックアウトを行なうことが可能である：中でも、マウス重鎮遺伝子座 の産生的ＶＤＪ再配置を排除するため及びヒト重鎖トランスジーンとマウス重鎖 遣伝子座の間のトランススイッチを排除又は削減するために、ＪHノックアウト とＣ領域欠失を組合わせることが可能である。いくつかの実施態様については、 内因性重鎖遣伝子座の単数又は複数のＣ領域遺伝子が特定的に欠如しているもの のその他のいくつかのＣ領域遺伝子を保持しているマウスを産生することが望ま しい可能性がある。例えば、キメラヒト／マウスＩｇＡ、が有利な表現型を付与 し実質的にマウスの望ましい有用性と干渉しない場合、このＩｇＡのトランスス イッチによる産生を可能にするべくマウスＣα遺伝子を保持することが好ましい 可能性がある。実施例３０ この例は、ヒトトランスジーンを宿トランスジェニックマウスから得られるリ ンパ球試料からの内因性（マウス）免疫グロブリンを発現するリンパ球の半ピボ 枯渇を実証する。マウスＩｇを発現するリンパ球は、トランスジーン（単複）に よりコードされるヒト免疫グロブリンに対する実質的結合力が欠如している抗マ ウス免疫グロブリン抗体に対する特異的結合により選択的に枯渇される。マウスＩｇ−発現Ｂ細胞の半ビボ枯渇 ヒト重鎖ミニ遺伝子座トランスジーン（ＨIＣ２）及びヒト軽鎖ミニ遺伝子座 ト ランスジーン（ＫＣｏ４）に対して同型接合のマウスをＣ５７ＢＬ／６（Ｂ６） 同系繁殖マウスと繁殖（交配）させ、２２１１マウス（すなわち、機能的内因性 マウス重鎖遺伝子座に対し同型接合で、機能的内因性マウス軽鎖遺伝子座に対し 同型接合で、かつヒト重鎖トランスジーンの１つのコピーとヒト軽鎖トランスジ ーンの１つのコピーを有するマウス）を得る。かかる２２１１マウスば同様にＢ ６主要及び非主要組織適合抗原をも発現する。これらのマウスを、免疫原性用量 の抗原でプライミングさせ、約１週間後に脾細胞を分離させる。 標準的方法（Wyso ckiet al.(1978). Proc.Natl.Acad.Sci ．(U.S.A.)75；2844 ；MACS磁気細胞選別、Miltenyi Biotec Inc．Sunnyvale，CA）に従った固相連結 されに抗体依存型細胞分離及び、それに続く、マウスＩｇに関し陽性の残留細胞 を実質的に除去するための抗体依存型補体媒介の細胞溶解（「細胞免疫学におけ る選択された方法」、Mishell 88及びshiigi SM (eds)，W.M.Freeman and Compa ny，New York，1980，p211〜212）によって、マウスＩｇに関して陽性のＢ細胞 を除去する。枯渇された試料中の残りの細胞（例えば、ヒトＩｇについて陽住な Ｂ細胞、Ｔ細胞）を、好ましくは発生するＢ細胞に対する付加的な抗マウスＩｇ 抗体と合わせて、ＳＣＩＤ／Ｂ６又はＲＡＧ／Ｂ６マウスに静脈内注射する。再 構成されたマウスを次に、さらに抗原に対し免疫化させ、ハイブリド−マクロー ンを産生するための抗体及び親和力の成熟した細胞を得る。実施例３１ 体細胞キメラ内の完全にヒトの抗体の産生 体細胞キメラマウス内で完全にヒトの抗体を産生するための方法が記述される 。これらのマウスは、ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖及び軽鎖トランスジーン を有し、機能的マウスＩｇ重鎖及びカッパ軽鎖遺伝子が欠如した胚幹（ＥＳ）細 胞を、ＲＡＧ−１又はＲＡＧ−２欠損マウスからの胚盤胞の中に導入することに よって生成される。 ＲＡＧ−１及びＲＡＧ−２欠損マウス（Mombaerts et al．(1992)Cell 68: 869；Shinkai et al．(1992)Cell 68：855）には、ＶＤＪ再配置を開始しＩｇ ｓをコードする遺伝子セグメント及びＴ細胞レセプタ（ＴＣＲ）を組立てること ができないため、マウスＢ及びＴ細胞が欠如している。Ｂ及びＴ細胞の産生にお けるこの欠陥は、ＲＡＧ−２欠損動物から誘導された胚盤胞内への野生型ＥＳ細 胞の注入によって補完できる。結果として得られたキメラマウスは、注入された ＥＳ細胞から完全に誘導された成熟したＢ及びＴ細胞を産生する（Chen et al(1 993)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90：4528）。 キメラのＢ及び／又はＴ細胞全ての中に、規定の突然変異及び／又は外因性Ｄ ＮＡ構成体を導入するために、注入されたＥＳ細胞の遺伝子操作を使用する。Ch en et al. (1993), Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90：4528−4532) ＲＡＧ胚盤胞内に注入された時点で、Ｂ細胞が無い状態でＴ細胞を作るキメラ を産生した、Ｉｇ重鎖遺伝子座の同型接合失活を有する生成されたＥＳ細胞（原 文不明瞭）。突然変異体ＥＳ細胞内への再配置されたマウス重鎖のトランスフェ クションの結果、Ｂ細胞の発達が救われ、キメラ内でＢ細胞及びＴ細胞の両方が 再生されることになる。 マウスＩｇ重鎖又はカッパ軽鎖の合成が無い状態で完全にヒトの抗体を発現す るキメラマウスを生成することが可能である。マウスＩｇ重鎖及びカッパ軽鎖遺 伝子の両方の失活について同型接合であるＥＳ細胞の中に、ヒトＩｇ重鎖及び軽 鎖構成体を導入する。このときＥＳ細胞を、ＲＡＧ２欠損マウスから誘導された 胚盤胞の中に注入する。結果として得られるキメラは、マウスＩｇ重鎖及びカッ パ軽鎖遺伝子を発現することはできないもののヒトＩｇ遺伝子は発現する注入さ れたＥＳ細胞から排他的に誘導されたＢ細胞を含んでいる。免疫グロブリン重鎖及びカッパ軽鎖遺伝子の失活について同型接合のＥＳ細胞の 生成 それぞれ既知の手順に従った（Chen et al.(1993)EMBO J. 12：821；及びChen et al.(1993)Int.Immunol. 前掲書中）、ＥＳ細胞内でのＩｇＪH及びＪκ／Ｃ κ配列のターゲティングされた欠失により、失活されたＩｇ重鎖及びカッパ 軽鎖遺伝子座を支持するマウスを生成した。２つの突然変異体系のマウスを合わ せて繁殖させて、両方のＩｇ遺伝子座の失活について同型接合の系を生成した。 この２重突然変異体の系を、ＥＳ細胞の誘導のために使用した。使用されたプロ トコルは、基本的に、Robertson により記述されたものであった（１９８７、「 奇形ガン腫及び胚幹細胞；１つの実践的アプローチ」中。 p71〜112。E.J.Robertson 編、ＩＲＬプレス）。簡単に言うと、同系接合の２ 重突然変異体マウスの自然交配により、胚盤胞が生成された。受胎した雌を妊娠 ２．５日目に卵巣摘出し、妊娠７日目に子官から「遅延した」胚盤胞を洗い流し 、支持細胞上で培養して、それらの未分化状態の維持を助けた。その形態で同定 できる胚盤胞の内部細胞質量からの幹細胞をとり出し、解離させ、支持細胞上で 継代させた。正常な核型をもつ細胞を同定し、雄細胞系統は、キメラを生成しマ ウスの生殖細胞に寄与するその能力についてテストされることになる。雄キメラ ははるかに多くの子孫を産生できることから、雌系統よりも雄ＥＳ細胞の方が好 ましい。マウスＩｇ重鎖及びカッパ軽鎖欠損ＥＳ細胞内へのヒトＩｇ遺伝子の導入 ＨＣＳ及びＫＣ−ＣＯ４といったミニ遺伝子座構成体又はＪ１．３Ｐといった ＹＡＣクローンのいずれかとして、ヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子を突 然変異体ＥＳ細胞内に導入する。ヒトＩｇ ＤＮＡでのＥＳ細胞のトランスフェ クションを、電気穿孔又は陽イオン脂質でのリポフェクションといった技術によ って行なう。ヒトＤＮＡを取込んだＥＳ細胞の選択を可能にするため、選択可能 マーカーを構成体に連結させるか又はＥＳ細胞へと構成体と同時トランスフェク ションさせる。突然変異体ＥＳ細胞は、Ｉｇ遺伝子失活を生成した遺伝子ターゲ ティング事象の結果としてネオマイシンホスフォトランスフェラーゼ（ｎｅｏ） 遺伝子を含んでいることから、ヒトＩｇ遺伝子をＥＳ細胞内に導入するため、ハ イグロマイシンホスフォトランスフェラーゼ（ｈｙｇ）又はピュロマイシンＮ− アセチルトランスフェラーゼ（ｐａｃ）といったさまざまな選択可能なマーカー が使用される。 ヒトＩｇ重鎖及び軽鎖遺伝子は、異なる選択可能マーカーを用いて、突然変異 体ＥＳ細胞内に同時に又は逐次的に導入することができる。トランスフェクショ ンの後、適切な選択可能マーカーで細胞を選択し、ヒト遺伝子配列の組込みを確 認し分析するべく凍結しＤＮＡ分析する目的で薬剤耐性コロニーを拡張させる。キメラの生成 記述されているとおり（Bradley，A．(1987)，「奇形ガン腫及び胚幹細胞：１ つの実践的アプローチ」中、p113〜151，E.J.Robertson編、ＩＲＬプレス）ＲＡ Ｇ−２胚盤胞内にヒトＩｇ重鎖及び軽鎖遺伝子を含むＥＳクローンを注入し、偽 妊娠の雌の子官内にトランスファさせる、血清試料のＥＬＩＳＡ険定により、ヒ ト抗体の存在について子孫をスクリーニングする。ヒトモノクローナル抗体の免 疫化及び産生のために陽性動物を使用する。実施例３２ この例は、スイッチ組換えを受けるＢ細胞の欠失へと導くマウス重鎖遺伝子座 内へのターゲティングされたフレームシフト突然変異の、ＥＳ細胞内の相同組換 えを介しての導入について記述する。フレームシフトされたマウスは、ヒト配列 免疫グロブリンをコードするマウス以外の（例えばヒトの）トランスジーンを宿 すための適切な宿主である。 新しいフレームシフトされたマウスは、なかでも、重鎖トランスジーン（単複 ）及び／又は軽鎖トランスジーンによりコードされる非マウス（例えばヒト）配 列免疫グロブリンを発現させるため、及び導入されたトランスジーンからのクラ ススイッチされた親和力が成熟したヒト配列抗体を発現するハイブリドーマの分 離のために使用可能である。４つのマウスＪＨ遺伝子セグメントのうちの１つの 中、そしてマウスμ遺伝子の第１のエキソンの中に、フレームシフトを導入する 。導入された２つのフレームシフト突然変異は、互いに補償し合い、かくして、 機能的ＶＤＪ連結のためにＢ細胞がフレームシフトされたＪＨを使用するときの 完全に機能的なマウスμ重鎖の発現を可能にする。残りのＪＨ遺伝子内で補償さ れないμ内のフレームシフトのため、その他の３つのＪＨセグメントのいずれも 機能的ＶＤＪジョイニングに使用することができない。代替的には、多数のマウ スＪＨ遺伝子の中に、補償するフレームシフトを工作することもできる。 補償されフレームシフトされた免疫グロブリン重鎖対立遺伝子に対し同型接合 のマウスは、ほぼ生理学的レベルの末梢Ｂ細胞及び、マウスとヒトのμを両方共 含むほぼ生理学的レベルの血清ＩｇＭを有する。しかしながら胚中心内に動員さ れたＢ細胞は、頻繁に、非μアイソタイプへのクラススイッチを受ける。内因性 マウスμ鎖を発現するＢ細胞内のこのようなクラススイッチは、残りの非μＣH 遺伝子が補償するフレームシフトを有していないことから、補償されていないフ レームシフトｍＲＮＡの発現を導く。結果として得られるＢ細胞は、Ｂ細胞レセ プタを発現せず、欠失される。従って、マウス重鎖を発現するＢ細胞はそれらが アイソタイプスイッチの起こる分化段階にひとたび達した時点で欠失される。し かしながら、アイソタイプスイッチの能力をもちかかるアイソタイプ制限フレー ムシフトを含まない、非マウス（例えばヒト）トランスジーンによりコードされ る重鎖を発現するＢ細胞は、アイソタイプスイッチ及び／又は親和力成熟などを 含むさらなる発達の能力をもつ。 従って、フレームシフトを受けたマウスはマウス重鎖(μ)に関して二次応答が 損なわれているが、トランスジーンコードされた重鎖に関しては有意な二次応答 を有する。クラススイッチを受けることのできる重鎖トランスジーンがこの突然 変異体バックグラウンド内に導入された場合、非−ＩｇＭ二次応答は、Ｂ細胞を 発現するトランスジーンにより支配される。かくしてこれらのフレームシフトさ れたマウスからハイブリドーマを発現する親和力成熟したヒト配列免疫グロブリ ンを分離することが可能である。さらに、フレームシフトされたマウスは一般に 、ヒト重鎖トランスジーンが可変領域の制限された能力能囲しかコードできない 場合に有利でありうるマウスＩｇＭの免疫防御レベルを有する。 ヒト配列モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作るために、トラン スジェニック突然変異体マウスを免疫化し、その脾臓を骨髄細胞系統と融合さ せ、結果として得られたハイブリドーマを、トランスジーンでコードされたヒト 非μアイソタイプの発現についてスクリーニングする。さらに、フレームシフト したマウスは、シススイッチのための活性基質として役立つ転写されたＶＤＪに 隣接した搬能的μスイッチ配列を含むことになり（Gu et al,(1993)Cell 73;11 55）、かくしてキメラヒト／マウス抗体を発現するトランススイッチされたＢ細 胞レベルを低下させるため、ＪＨ欠失したマウスに比べ有利でありうる。フレームシフトベクターの構築 ２つの別々のフレームシフトベクターを構築する。これらのベクターのうちの １つは、マウスＪ４遺伝子セグメントの３′末端で２つのヌクレオチドを導入す るのに用いられ、もう１つのベクターは、マウスμ遺伝子のエキソン１の５′末 端からこれらの同じ２つのヌクレオチドを欠失させるために用いられる。 １．ＪＨベクター ホスホグリセリン酸キナーゼプロモータの制御下でヘルペスチミジンキナーゼ 遺伝子及びネオマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドベクター内に、マウス重鎖 Ｊ領域及びμイントロンエンハンサーを網羅する３．４kbのＸｈｏＩ／ＥｃｏＲ Ｉフラグメントをサブクローニングする（ｔｋ／ｎｅｏカセット、Hasty et al. ,（1991）Nature 350：243）。次に以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用 いて２つの異なるＰＣＲフラグメントを生成するための基質として、このクロー ンを使用する： o−A1 5′-cca cac tct gca tgc agc aga agc ttt tct gat-3′ o−A2 5′-ggt gac tga ggt acc ttg acc cca gta gtc cag-3′ o−A3 5′-ggt tac ctc agt cac cgt ctc ctc aga ggt aat aat ggc ctc -3′ o-A4 5′-agg ctc cac cag acc tct cta gac agc aac tac-3′ ＳｐｈＩ及びＫｐｏｎＩ消化される１．２kbのフラグメントを増幅するため、 オリゴヌクレオチドｏ−Ａ１及びｏ−Ａ２を使用する。ＫｐｎＩ及びＸｂａＩで 消化される０．６kbのフラグメントを増幅するため、オリゴヌクレオチドｏ−Ａ ３及びｏ−Ａ４を使用する。次にこれら２つの消化されたフラグメントを、Ｓｐ ｈＩ／ＸｂａＩで消化されたプラスミドＡの中にクローニングし、プラスミドＢ を生成する。 プラスミドＢは、Ｊ４の末端に２ヌクレオチド挿入を含み、さらに挿入の上流 に新しいＫｐｎＩ部位を含む。挿入のための診断マーカーとして、ＫｐｎＩ部位 を使用する。 相同組換え効率を増大させるため、プラスミドの５′ＸｈｏＩ部位及び３′Ｅ ｃｏＲＩ部位の中に、付加的フランキング配列をクローニングすることができる 。その後、ＳｐｈＩ又はインサート内に単一の部位をもつもう１つの制限酵素で 、結果として得られたプラスミドを消化し、胚幹細胞へと電気穿孔させ、これら の細胞を次に、Hasty et al (1991)、前掲書中、により記述されているとおりに 、Ｇ４１８で選択させる。サザンプロットハイブリダイゼーションにより相同組 換え体を同定し、次にHasty et al により記述されているとおりにＦＩＡＵによ り選択させて、２塩基対挿入とＪＨ４内の新たなＫｐｎＩ部位のみを含む欠失さ れたサブクローンを得る。これらを、ＫｐｎＩ消化されたＤＮＡのサザンブロッ トハイブリダイゼーションにより同定し、ＰＣＲ増幅されたＪＨ４ ＤＮＡのＤ ＮＡ配列分析により確認する。 結果として得られたマウスは、突然変異されていない配列：すなわち ...TGGGGTCAAGGA ACCTCAGTCACCGTCTCCTCAG gtaagaatggcctctcc. TrpGlyGlnGlyThrSerValThrVAlSerSerGlu から突然変異体配列すなわち、 ...TGGGGTCAAGGTACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGAGgtaagaatggcctctcc... TrPGlyGlnGlyThrSerValThrVAlSerSerGlu へと変換されたＪＨ４セグメントを含む。μエキソンｌベクター ＪＨｄ遺伝子セグメント内への２塩基対挿入を工作するべく上述したものと類 似のインビトロ突然変異誘発を用いて、第１のμエキソンの５′末端で２塩基対 欠失を含むベクターを作り出すため、ＰＣＲ産物及びゲノミックサブクローンを 組立てる。さらに突然変異をマーキングするため、ＡをＧに変更することにより 新しいＸｍｎＩ部位も下流に導入する。 突然変異を受けていないμ遺伝子の配列は以下のとおりである： ...ctggtcctcagAGAGTCAGTCCTTCCCA AATGTCTTCCCCCTCGTC. GluSerGlnSerPheProAsnValPheProLeuVal 突然変異を受げけたμ遺伝子の配列は以下のとおりである。 XmnI ...ctggtcctcag＿AGTCAGTCCTTCCCGAATGTCTTCCCCCTCGTC... SerGlnSerPheProAsnValPheProLeuVal 突然変異体配列を含む相同組換えベクターを、ＪＨ４挿入を含むＥＳ細胞系統 へと線形化させ電気穿孔させる。ネオマイシン耐性クローンから相同組換え体を 同定する。ＪＨ挿入と同じ染色体上のフレームシフト挿入を含むこれらの相同組 換え体を、ＫｏｎＩ／ＢａｍＨＩで消化されたＤＮＡのサザンブロットハイブリ ダイゼーションにより同定する。野生型１１．３kbから突然変異体９kbまでのＫ ｐｎＩ／ＢａｍＨＩを含むＪ−μイントロンのサイズを減少させる新しいＫｐｎ Ｉ部位とＪＨ４挿入を結びつける。次に、ＦＩＡＵを用いて、挿入されたｔｋ／ ｎｅｏカセットの欠失のために、結果として得られたクローンを選択する。突然 変異体μエキソンを含むクローンを、ＸｍｎＩで消化されたＤＮＡのサザンブロ ットハイブリダイゼーションにより同定する。突然変異は、ＰＣＲ増幅されたμ エキソンｌＤＮＡのＤＮＡ配列分析により確認される。フレームシフトされたマウスの生成 次に、ＪＨ４内の２塩基対挿入及びμエソキン１内の２塩基対欠失の両方を含 むＥＳ細胞系統を、キメラを生成するべく偽妊娠の雌の体内に挿入される胚盤胞 段階の胚の中に導入する。キメラ動物を繁殖させて生殖細胞系列の伝播を得、結 果として得られた動物を同型接合まで繁殖させて、補償されたフレームシフトさ れた重鎖遺伝子座に対し同型接合でかつマウス重鎖を発現するＢ細胞内の二次体 液性免疫応答が損なわれている突然変異体動物を得る。 例えばｐＨＣＩ又はｐ ＨＣ２といったヒト重鎖トランスジーンを、フレームシ フトされたマウスＩｇＨ遺伝子座をもつマウスの中にかかるヒトトランスジーン を宿すマワスを交雑育種することによってマウス重鎖フレームシフトバックグラ ウンドへと繁殖させることができる。同系交配及び戻し交配を介して、μ補償さ れフレームシフトされたマウスＩｇＨ対立遺伝子に対してマウスＩｇＨ遺伝子座 で同型接合で（すなわちマウスの非μ鎖ではなくμ鎖のみの補償された枠内発現 をすることのできる）しかも機能的ヒト重鎖トランスジーン（例えばｐＨＣｌ又 はｐＨＣ２）の少なくとも１つの組込みコピーを宿すマウスを産生させる。かか るマウスは任意には、上述のとおりの内因性マウスκ及び／又はλ遺伝子のノッ クアウトを内含していてよく、又任意には、ヒト又はその他の非マウス軽鎖トラ ンスジーン（例、ｐＫＣ１ｅ，ｐＫＣ２ｔよど）を含む可能性がある。 代替的には、トランスジーン恒常領域遺伝子（単複）内のフレームシフトによ り補償されるフレームシフトがトランスジーンＪ遺伝子（単複）に含まれるよう に、ヒトトランスジーン（単複）（重鎖及び／又は軽鎖）にば補償フレームシャ フトが含まれていてもよい、内因性恒常領域遺伝子に対するトランススイッチは 、補償されす、切形の又はナンセンス産生を産生する；かかる補償されていない トランススイッチされた免疫グロブリンを発現するＢ細胞に対し選択を行ない、 これを枯渇させる。実施例３３ Ｄ領域切除による内因性重鎖の失活 この例は、マウス生殖細胞系統免疫グロブリン重鎖Ｄ領域を非機能的な再配置 されたＶＤ」セグメントで置換するための正−負選択相同組換えベクターについ て記述する。結果として得られる対立遺伝子は、対立遺伝子内重鎖クラススイッ チを受けかくしてトランススイッチレベルを活性トランスジーン遺伝子座まで減 少させている状態で、正常な非産生的対立遺伝子としてＢ細胞内で機能する。Ｄ領域ターゲティング構成体 マウスＤ領域の上流にある８〜１５kbのＤＮＡフラグメントを、Gen Bankにリ ストアップされたＤＦＬ１６．１セグメントに対する公表済み配列の約５０の連 続したヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプローブを用いて、マウス系１２ ９ファージライブラリから分離し、サブクローニングする。ＤＦＬ１６．１は、 上流Ｄセダメント（すなわち、Ｖ領域遺伝子クラスターに近位で、恒常領域遺伝 子クラスタに遠位のもの）である。 同様に、ＪＨ３，ＪＨ４，Ｅμ，Ｓμ及びμ恒常領域の最初の２つのコーティ ングエキソンを含む９．５kbのＢａｍＨＩフラグメントを、マウス系１２９ゲノ ミックファージライブラリーから分離しサブクローニングする。 次にマウスハイブリドーマ（あらゆる系）から５〜１０kbの再配置されたＶＤ Ｊを分離し、停止コドンを含む合成リンカーをＪセグメント内に挿入する。Ｖ置 換再配副が可能であるため、枠外ＶＤＪ連結よりもＪの内部の停止リンカーが好 まれる。 これら３つのフラグメントをＰＧＫｎｅｏ正の選択カセット及びＰＧＫＨＳＶ ｔｋ負の選択カセットと合わせて組立てて、相同組換えにより１２９−誘導ＥＳ 細胞（例えばＡＢｌ）内のマウスＤ領域を削除するための正−負選択ベクターを 形成する。ターゲティングベクターは、それ自体９．５kbのＢａｍＨＩフラグメ ントに連結される再配置された５〜１０kbの再配置済みＶＤＪにそれ自体連結さ れている正の選択カセット（例えばＰＧＫｎｅｏ）に８〜１５kbのＤＮＡフラグ メントを連結させることによって形成される。次に、ターゲティング構成体のい ずれかの端部で負の選択カセット（例えばＰＧＫＨＳＶｔｋ）を連結させる。か かるＤ領域ターゲティングベクターの構成は、図７３に概略的に示されている。 Ｄ領域ターゲディング構成体を、ＡＢ１ ＥＳ細胞内にトランスファし、正及 び負の選択を上述のとおりに行ない、適正にターゲディングされたＥＳ細胞をク ローニングする。胚盤胞注入のために、適正にターゲティングされたＥＳ細胞ク ローンを使用し、キメラマウスを産生する。Ｄ領域失活された重鎖対立遺伝子を 宿す創立者マウスを産生するため、キメラマウスを繁殖させる。機能的内因性重 鎖遺伝子座が欠如した同型接合体を産生するため、子孫の同系交配を行なう。 このような同型接合体を用いて、ヒトＩｇトランスジーン（例えばｐＨＣ１， ｐＨＣ２．ｐＫＣ２．ｐＫＣ１ｅ，ＫＣｏ４）を宿マウスまで交雑育種し、（さ らに、機能的Ｄ領域が欠如した同型接合体までもどし交配することにより）、機 能的内因性重鎖遺伝子座が欠如しかつヒト重（鎖）トランスジーン（そして好ま しくはヒト軽鎖トランスジーンも）を宿すマウスを生み出す。 いくつかの機能的内因性軽鎖遺伝子座（例えばλ遺伝子座）が残る実施態様に おいては、一般に、トランスジーンがヒト軽鎖（例えばκ）ポリペプチドの高レ ベル発現を誘導する転写制御配列を含み、かくしてトランスジーンの遺伝子座が 残りの同因性軽鎖（例えばλ）遺伝子座と有効に競合できるようにすることが好 ましい。例えば、Ｃｏ４カッパ軽鎖トランスジーンは、トランスジェニック動物 内の内因性λ遺伝子座と有効に競合する能力に関してｐＫＣ１に比べ一般に好ま れている。実施例３４ この例は、ヒトＶκ遺伝子座の一部分を含む酵母人工染色体とヒトκ軽鎖ミニ 遺伝子座の同時注入によるヒト軽鎖トランスジーンＶ遺伝子の能力範囲の拡張に ついて記述する。Ｖκ含有ＹＡＣ ＤＮＡとκミニ遺伝子座の同時注入による機能的ヒト軽鎖Ｖセ グメントの導入 一般に入手可能なＩＣＲＦ ＹＡＣライブラリーのクローン４×１７Ｅ１から 、増幅されていないＹＡＣ ＤＮＡとして、ヒトＶκ遺伝子座の一部を含む約４ ５０kbのＹＡＣクローンを得た（Larin et a1．(1991)Proc.Natl.Acad.Sci(U.SA ）88 ：4123；Imperial Cancer Research Fund、 ゲノム分析研究所、ロンドン． UK）。メーカーの仕様に従って標準的なパルフフィールドゲル電気泳動法により 、予め増幅することなく、４５０kb]のＹＡＣクローンを分離した（ＣＨＥＦ ＤＲ−(I、電気泳動セル、Bio-Rad Laboratories，Richmond，CA)。臭化エチジ ウムを用いて６つの個別のバルスフィールドゲルを染色し、ＹＡＣクローンＤ ＮＡを含むゲル材料をゲルがら切除し、次に三角形のゲルトレイ内に流し込まれ た新しい（標準ゲル緩衡液中の低融点アガロース）ゲル内にこれを埋込む。標準 電気泳動緩衝液に加えて２ＭのＮａＯＡｃを伴う狭いアガロースゲルを用いて頂 点において、結果として得られた三角形のゲル（６つの切除されたＹＡＣ含有ゲ ルブロックを内含する）を伸展させた。次にゲルを、標準ゲル緩衝液中に浸潰さ れた電気泳動チャンバ内に入れた。 Ｙ形状のゲルフォーマは、電流（流動？）が狭く高いソルトゲル部分までだけ 流れるように、緩衝液の表面より上に立上っている。緩衝液内へのＮａＯＡｃの 拡散を防ぐため、高ソルトゲル切片全体にわたり、アクリルのブロックを置いた 。次に、ＹＡＣ ＤＮＡを切片化された（埋込まれた）もとの切除ゲルから狭い 高ソルトゲル部分内へと電気泳動させた。低ソルトゲルから高ソルトゲルへの遷 移の時点で、三角形のゲルの頂点でＤＮＡの移動を有効に停止させる抵抗の低下 が存在する。 電気泳動及び臭化エチジウムでの染色の後、濃縮したＹＡＣ ＤＮＡを残りの ゲルから切り離し、アガロースをＧＥＬａｓｅ（Epi Centre Technologies，Ｍa dison，Wisconsin)で消化した。次に、結果として得られたＹＡＣ含有液体に塩 化セシウムを付加し、１．68ｇ／mlの密度を得た。この溶液を３６時間３７００ ０rpmで遠心分離し、あらゆる汚染物質からＹＡＣ ＤＮＡを分離した。結果と して得られた密度勾配の０．５ml分画を分離し、５mMのＴｒｉｓ（pH７．４）、 ５mMのＮａＣｌ、０．１ＭのＥＤＴＡに対してピークＤＮＡ分画を透析した。 透析の後、結果として得られたＹＡＣ ＤＮＡの０．６５ml溶液の濃縮は、２ μｇ／mlのＤＮＡを含んでいることがわかった。このＹＡＣ ＤＮＡを、２０： １：１（マイクログラムＹＡＣ４×１７Ｅｌ：ＫＣｌＢ：ＫＶ４）の比率で、プ ラスミドｐＫＣｌＢ及ひｐＫＶ４からの精製されたＤＮＡインサートと混合した 。半日のＢ６ＣＢＦ２の胚の前後の中に、結果として得られた２μｇ／mlの溶液 を注入し、９５の存続する微量注入された胚を偽妊娠の雌の卵菅内に移送した。 微量注入された胚から発達した１２匹のマウスが生まれた。実施例３５ この例は、失活した内因性免疫グロブリン遺伝子座に対して同型接合でありか つＨＣｌ又はＨＣ２重鎖トランスジーンを含む免疫化したトランスジェニックマ ウスの中でのクラススイッチ、体細胞突然変異及びＢ細胞発達について記述する ヒト配列生殖細胞系統配置ミニ遺伝子座が真正遺伝子座と置換できることを実 証するために、我々は、ヒト生殖細胞系統−配置ＩｇＨトランスジーンを含む系 を用いて、内因性ＩｇＨが欠如したマウス系を繁殖させた。２つのトランスジー ンミニ遺伝子座ＨＣ１及びＨＣ２は、それぞれ１つ及び４つの機能可変（Ｖ）セ グメント、１０及び１６の多様性（Ｄ）セグメント、６つのジョイニング（ＪＨ ）セグメント全て、及び両方のμ及びγ１垣常領域でグメントを含む。ミニ遺伝 子座は、コーディングでグメントに密に連鎖されている--ＪＨ−μイントロンエ ンハンサー及びμ及びγ１スイッチ配列といった--ヒトシス作用性調節配列を含 む。 これらは同様に、ラットＩｇＨ遺伝子座の３′末端から誘導された付加的なエ ンハンサー要累も含んでいる。我々は、ＨＣ１及びＨＣ２トランスジェニックマ ウスを、記述のとおり（前出）ＪＨセグメント（ＪＨＤマウス）が欠如し従って 機能的重鎖再配置を受けることのできない幹細胞由来の突然変異マウスと交配さ せた。結果として得られたトランスジェニック−ＪＨＤマウスは、導入された重 鎖配列に依存するＢ細胞を含んでいる。免疫化及びハイブリドーマ 我々は、５０〜１００μｇの抗原の腹腔内注入によりマウスを免疫化した。抗 原には、ヒトのガン胎児性抗原（ＣＥＡ；Crystal Chem，Chicago，IL）、ニワ トリ卵白リゾチーム（ＨＥＬ；Picrce．Rockford，IL）及びキーホールリンペッ トヘモシアニン（ＫＬＨ；Pierce．Rockford，IL)が含まれていた。一次注入の ために、我々は抗原を完全フロイントアジュバントと混合し、その後の注入につ いては不完全フロイントアジュバント(Gibco BRL．Galthersburg，MD)を用いた 。脾細胞を、非分泌性マウス骨髄腫Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（ATCC，CRL158 0）と融合させた。 我々は、ＥＬＩＳＡにより、ヒト重鎖配列を含む特異的及び非特異的抗体の存 在について血清試料及びハイブリドーマ上清を検定した。非特異的抗体の検出の ために、我々は、ヒト重鎖アイソタイプ特異的抗体（マウスＭＡｂαヒトＩｇＧ ｌ、クローンＨＰ６０６９、Cal bio chem，La Jolla，CA；マウスＭＡｂαヒト ＩｇＭ、クローンＣＨ６、The Binding Site．Birmingham，UK）でマイクロタイ ターウエルをコーティングし、ペルオキシダーゼ接合抗血清（ポリクローナルヤ ギαヒトＩｇＧ（ｆｃ）からのホースラディッシュベルオキシダーゼ接合の親和 性精製されたｆａｂフラグメント、ｃａｔ ＃１０９−０３６−０９８；親和性 精製されたホースラディッシュペルオキシダーゼ接合されたボリクローナルウサ ギαヒトＩｇＭ（ｆｃ）．ｃａｔ ＃３０９−０３５−０９５。 jackson Immuno Research，West Grove，PA）を用いて発達させた。抗原特異 的抗体の検出のため、我々はマイクロタイターウエルを抗原でコーティングし、 ペルオキシダーゼ接合されたヒト重鎖アイソタイプ特異血清を用いて発達させた 。我々は、過酸化水素及び２，２′−アジノ−ピス−（３−エチルベンズテアソ リン−ｂ−スルフォン酸、Sigma Chem．Co.，St.Louls，Mo）でのインキュベー ションにより、結合ベルオキシダーゼを検出した。反応産物を４１５nmで吸収に より測定し、４９０nmでの吸収について補正する。フロ−サイトメトリ− 我々は、脾臓、骨髄及び腹腔から単細胞懸濁液を調製し、Mishell及びShiigi により記述されているとおりにＮＨ4Ｃｌで赤血球を溶解した。次の試薬でリン パ球を染色した：すなわち、フィコエリトリン接合された抗マウスＩｇκ（クロ −ンＸ３６；Becton Oickinson．San Joss．CA），ＦＩＴＣ接合された抗マウス ＩｇＤ（クローンＳＢＡＩ．Southern Biotech．AL）．ＦＩＴＣ接合された抗マ ウスＣＤ５（クローン５３−７．３；Becton Dickinson，San Jose．CA），ＦＩ ＴＣ接合された抗マウスＩｇλ（クローンＲ２６−４６）；Pharmingen，San Di ego，CA）及びＣｙ−クロム接合された抗マウスＢ２２０（クローンＲＡ３−６ Ｂ２；Pharmingen，San Diego，CA）、我々はＦＡＣＳｃａｎクローン血球計算 器及びＬＹＳＩＳIIソフトウェア(Becton Dickinson，San Jose．CA)を用いて染 色した細胞を分析した。前方及び側方散乱器上でのゲーティングにより、大部分 のマクロファージ、好中球及び残留赤血球を排除する。Ｂ細胞区画の救助 ＨＣ１トランスジェニック−ＪＨＤ動物の腹腔内では、ＣＤ5+Ｂ細胞の正常レ ベル及び従来のＣＤ5-Ｂ細胞の正常レベルの約４分の１が見られる。トランスジ ェニック腹腔ＣＤ5+Ｂ細胞は、正常な動物内での記述されたいわゆるＢ−１細胞 に類似している：すなわち、これらは従来のＢ及びＴリンパ球よりも大きく、脾 臓内で見られる従来のＢ細胞よりも低いレベルのＢ２２０を発現し、より高い割 合のλ軽鎖発現細胞を含んでいる。脾臓Ｂ細胞の９０％以上がκを発現し、一方 最高５０％の腹腔Ｂ細胞がλを発現する。かくして、従来のＢ細胞のレベルは全 ての組織内で均等に減少している一方で、自己更新の能力がはるかに大きいもの として報告されているＢ−１のレベルは、ＨＣ１トランスジュニック−ＪＨＤ動 物において正常であると思われる。クラススイッチ トランスジェニッタ−ＪＨＤマウスにおいては、抗原に対して反復的に露呈す ることにより、ヒトｒ１抗体ならびにμ抗体が結果として産生される。我々は、 一週間の間隔でトランスジェニック−ＪＨＤマウス内にヒトＣＥＡを注入し、４ 週間にわたり抗原特異的ＩｇＭ及びＩｇＧ１の血清レベルを監視した（図７４） 。１週間目に、検出可能なＩｇＭ応答があるがＩｇＧ１応答は全く無い。しかし ながらＩｇＧ１応答は２週間後ＩｇＭ応答よりも大きく、ＩｇＭ応答が比較的恒 常な状態にとどまっているのに対して増大し続けている。このパターン、すなわ ち初期のＩｇＭ応答とそれに続くＩｇＧ反応は、二次免免応答に典型的なもので あり、これは、トランスジーン内に内含されているシス作用性配列が、クラスス イッチを導くサイトカインに対し応答しているかもしれないということを示唆し ている。我々は、各々文献中で論述されてきた非μアイソタイプの発現について 考えられる３つのメカニズムを考慮した。これらのメカニズムとはすなわち、μ 遺伝子の欠失が関与しない交互のスプライシング；フランキング反復配列間の相 同組換えを介してのμ遺伝子の欠失が関与した「δ−型」スイッチ；そしてスイ ッチ領域間の非相同組換えである。以下で記述する我々の実験の結果はスイッチ 領域組換えモデルを表わしている。 アイソタイプシフトを説明するのに２つのタイプの非欠失性交互スプライシン グメカニズムを喚起することができる。第１に、μ及びγ１の両方をカバーする 単一の写しをトランスジーンから発現させることが可能である；この写しは抗原 に対する露出により誘発されたサイトカインに応答して交互にスプライグさせる ことができた。代替的には、サイトカイン誘発されたγ１の上流で開始する不稔 写しを、μ写しにトランススプライシングさセることができた。これらのメカニ ズムのうちのいずれかがヒトγ１配列の発現の原因であったならば、μ及びγ１ の両方を発現するハイブリドーマを分離できるということを期侍したであろう。 しかしながら、ヒトμ又はヒトγ１のいずれかを発現する数百のハイブリドーマ をスクリーニングしてきたものの、かかる二重産生者（μ+，γ１+）ハイブリド ーマは全く発見されなかった。このことは、γ１の発現にμ遺伝子の欠失が供っ ていることを表わしている。 μ遺伝子の欠失は、μとγ１スイッチ領域の間の非相同組換えによって、又は ＨＣ１及びＨＣ２トランスジーン内に含まれている２つのフランキングする４０ ０bpの直接反復（σμ及びΣμ）の間の.相同組換えによって媒介されうる。σ μ及ひΣμの間の欠失組換えは、いくつかのヒトＢ細胞のＩｇＤ+，ＩｇＭ-表現 型の原因であることが報告されてきた。第１のメカニズムすなわち非相同スイッ チ組換えは可変的な長さのスイッチ産物を産生するはずであるが、一方第２のメ カニズムすなわちσμ／Σμ組換えはつねに同じ産物を生成するはずである。我 々は、μを発現するもの１つとγ１を発現するもの２つの計３つのハイブリドー マ（図７５）から分離したゲノミックＤＮＡのサザンプロット分析を行なった。 γ１スイッチ領域のうち２つの中にのみトランスジーンγ１の上流にゲノミッ ク再配置が発見される（図７６）。さらに、観察した構造のうちいずれもσμと Σμの間の相同組換えと両立性がない。従って、我々の結果は、トランスジーン でコードされたμ及びγ１のスイッチ領域の間での欠失性非同組換えによって媒 介されるγ１アイソタイプ発現のためのモデルと一貫性を有する。トランススイッチ ヒトγ１に加えて、ＨＣ１及びＨＣ２トランスジェニック−ＪＨＤマウスの 血清中にマウスγが見い出される。これらの動物から、マウスγ発現ハイブリド ーマも得られた。非トランスジェニック同型接合ＪＨＤ動物は、検出可能なレベ ルのマウス免疫グロブリンを発現しないことから、ＨＣ１及びＨＣ２トランスジ ェニック−ＪＨＤ動物内のマウスγの発現は、トランススイッチ現象のせいであ ると思われる。我々が分析したトランスジェニック・ハィブリドーマの全ては、 マウス又はヒトのいずれかの恒常領域配列を発現するものの両方を発現すること はない。従ってトランススプライシングメカニズムが関与する可能性は低い。ト ランススイッチ産物のｃＤＮＡクローンを分離するためのＰＣＲ増幅を用い、結 果として得られるクローンのうちの１０個のヌクレオチド配列を決定した（図７ ７）。ＰＣＲ増幅中の５′オリゴヌクレオチドはトランスジーンコードされたＶ Ｈ２５１に特異的であり、３′オリゴヌクレオテドはマウスγ１，γ２ｂ及びγ ３配列に特異的である。これら３つのマウス恒常領域の全てを取込んだトランス スイッチ産物の例が見られる。体細胞突然変異 図７に示されているトランススイッチ産物の可変領域内のヌクレオチドの約１ ％が、生殖細胞系統コーディングを受けていない。これはおそらく、休細胞突然 変異のせいであると思われる。突然変異を受けた配列は内因性遺伝子座にトラン スロケートされていたため、これらの突然変異を導くシス作用性配列は、マウス γスイッチから３′のどこにでも位置設定することができた。しかしながら以下 で論述するとおり、かかるトランスロケーションを受けなかったＶＤＪでセグメ ント内の体細胞突然変異も観察される。そしてこの結果は、重鎖体細胞突然変異 が必要とする配列がトランスジーン内に内含されているということを表わしてい る 。 ＨＣ１及びＨＣ２構成体が、トランスジェニック−ＪＨＤマウス円で体細胞突 然変異が起こるのに充分なシス作用性配列を含んでいるか否かを決定するため、 我々は、２つの独立したＨＣ１トランスジェニック系統そして１つのＨＣ２系統 から誘導されたｃＤＮＡクローンを分離し部分的に配列決定した。トランスジェ ニック−ＪＨＤマウスからのγ１写しのいくつかが、広範な体細胞突然変異を伴 うＶ領域を含んでいることがわかる。これらの突然変異を受けた写しの頻度は、 免疫化の反復に伴って増大するように思われる。図７８及び７９は、２組のｃＤ ＮＡ配列を示す：すなわち１組は、ＲＮＡを分離する５日前に抗原の一回の注入 で免疫化したＨＣ１（系統２６）トランスジェニック−ＪＨＤマウスから誘導体 されている； 第２の組は、ＲＮＡを分離する５カ月前から始めて異なる日に３回抗原を注入 することによって高度免疫させたＨＣ１（系統２６）トランスジェニック−ＪＨ Ｄマウスから誘導されている；第２の組は、ＲＮＡを分離する５カ月前から始め て異なる日に３回抗原を注入することによって高度免疫させたＨＣ１（系統２６ ）ソランスジェニック−ＪＨＤマウスから誘導されている（原文重複）。露呈後 ５日目から１３のＶ領域のうちわずか２つだけがいずれかの生殖細胞系統コーデ ィングを受けていないヌクレオチドを含んでいる。これらのＶの各々は単一のヌ クレオチド変更しか含まず、この試料について０．１％未満の全体的体細胞突然 変異頻度を与えている。これとは対照的に、高度免疫された動物からの１３のＶ 配列のいすれも完全に生殖細胞系統ではなく、全体的体細胞突然変異頻度は１６ ％である。 単一の組織試料から分離されたμ及びγ１写しの比較は、体細胞突然変異の頻 度がクラススイッチを受けたトランスジーンコピーの場合よりも高いということ を示している。我々は高度免疫したＣＨ１系統５７トランスジェニック−ＪＨＤ マウスからの４７の独立したμ及ひγ１ｃＤＮＡクローンを分離し、部分的に配 列決定した（図８０及び８１）。μｃＤＮＡクローンのほとんどは、生殖細胞系 統配列との関係において修正されておらず、一方γ１クローンの半数以上は、多 数の生殖細胞系統コーディングを受けていないヌクレオチドを含んでいる。γ１ 発現細胞は、μ発現細胞とは全く異なり、２つのプロセスは必ずしも連関されて いないものの、クラススイッチと体細胞突然変異は、Ｂ細胞の同じ副次集団内で 起こっている。 高度免疫を受けていないＣＨ１トランスジェニックマウス同にＶＨ２５１遺伝 子の広範な体細胞突然変異は見られないが、特定の実験を受けていないＨＣ２ト ランスジェニックマウスにおいてはＶＨ５６ｐ１及びＶＨ５１ｐ１遺伝子の中で 著しい体細胞突然変異が発見された。生後９週間の免疫化を受けていない雌のＨ Ｃ２トランスジェニック動物から脾臓及びリンパ節ＲＮＡを分離した。我々は、 Ｖ及びγ１特異的プライマを用いてＨＣ２トランスジーン内の４つのＶ領域の各 々を取込むγ１写しを個別に増幅した。特異的ＰＣＲ産物の各々の相対的収量は ＶＨ５６ｐ１≫ＶＨ５１ｐ１＞ＶＨ４．２１＞ＶＨ２５１であった。この技術は 厳密に定量的ではないものの、ＨＣ２マウス同でのＶセグメントの使用における 偏りを表わす可能性がある。 図８２は、４つのＶ特異的プライマ全ての等モル混合物を用いたＰＣＲ増幅か ら誘導された、無作為にとり上げた２３個のγ１ｃＤＮＡ配列を示している。こ こでも又、ＶＨ５６ｐ１（１９／２３クローン）向かっての偏りが見られる。さ らに、ＶＨ５６ｐ１配列は、Ｖ遺伝子セグメント内で２．１％の全体的頻度で、 著しい体細胞突然変異を示している。ＣＤＲ３配列を検査すると、１９のうち１ ７の個別のＶＨ５６ｐ１クローンが固有のものであるけれども、それらがわずか ７つの異なるＶＤＪ組換え事象のみから誘導されている、ということかわかる。 従って、特定の実験を受けていない動物において、恐らくは内因性病原体又は自 己抗原によりＶＨ５６ｐ１発現Ｂ細胞が選択されるように思われる。この同じ遺 伝子がヒトの胎児能力範囲内で過剰表示されることが適切である可能性がある。要約 上流シス作用性配列は、個々のスイッチ領域の機能性を規定し、クラススイッ チには必要なものである。ＨＣ１トランスジーン内のクラススイッチが二次応答 に関与する細胞に大幅に制限されており、全Ｂ細胞集団を横切って無作為に発生 しないという我々の観察は、トランスジーンと共に内含される最低限の配列が充 分なものであるということを示唆している。この構成体の中に内含されるγ配列 は、γ１不稔写しの開始部位の上流わずか１１６個のヌクレオチドのところで始 まっていることから、スイッチ調節領域はち密なものである。 我々の結果から、これらの重要なシス作用性調節要素が個々のγ遺伝子に密に 連鎖されているか又はＨＣ１及びＨＣ２トランスジーン内に含まれている３′重 鎖エンハンサーと結びつけられているかであるということが立証される。ＨＣ１ 及びＨＣ２インサートは、体細胞突然変異を受けている可能性の高い配列に対す るマーカーとして役立ちうるトランスジーン自律性クラススイッチを受けている ことから、我々は内因性遺伝子座へのトランスロケーションに由来したものでな い高度に突然変異を受けた写しを容易に見い出すことができた。我々は、３つの 独立したトランスジェニック系統（２つのＨＣ１系統及び１つのＨＣ２系統）の 中に体細胞突然変異を受けたγ写しを見い出した。従って、トランスジーンの組 込み部位にフランキングする配列がこのプロセスに影響を及ぼすという可能性は 低い：その代り、トランスジーン配列は、体細胞突然変異を導くのに充分なもの である。実施例３６ この実施例は、失活した内因性免疫グロブリン遺伝子座について同型接合であ り、ヒト配列重鎖及びヒト配列軽鎖をコードするトランスジーン配列を含むマウ スからのハイブリドーマの生成について記述する。ここで記述されるハイブリド ーマは、ヒト配列重鎖及びヒト配列軽鎖を含むモノクローナル抗体を分泌し、Ｔ 細胞上で発現される予め定められた抗原に結合する。この実施例は同様に、ヒト 由来の免役原ヒトＣＤ４に応えてヒト配列抗体を作るマウスの能力、及びヒト抗 原と反応性あるヒト配列モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作るた めの供給源としてのかかるマウスの適性をも立証する。 Ａ．ヒトＣＤ４抗原で免疫化されたＨＣ１トランスジェニックマウスから誘導さ れたヒトＩｇモノクローナル抗体の生成 機能的に分断されたＪH遺伝子座について同型接合でしかも、ヒト配列重鎖を コードするべく再配置可能なトランスジーン及びヒト配列軽鎖をコードするべく 再配列可能なトランスジーンを宿すトランスジェニックマウスを免疫化した。マ ウスの遺伝子型はＨＣ１−２６+ＫＣｌｅ−１５３６+ＪHＤ+/+ＪKＤ-であり、こ れはマウス重鎖失活に対する同型接合、及びＨＣ１ヒト配列重鎖トランスジーン 及びＫＣｌｅヒト配列軽鎖トランスジーン生殖細胞系統コピーの存在を表わして いた。 マウスを、安定した形でトランスフェクションされたポリヌクレオチドにより コードされたマウスーヒトハイブリッドＣＤ４分子を発現するＥＬ４細胞系統（ ＡＴＣＣ）の変異体で免疫化した。発現されたＣＤ４分子は、実質的にヒト様の ＣＤ４配列を含む。１００μｌの完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）を伴う １００μｌのＰＢＳの中の約５×１０5の細胞を、０日目に１腹腔内注入を介し てマウス体内に導入した。７日目、１４日目、２１日目、２８日目、６０日目及 び７７日目に接種をくり返し行ない、１８日目、３５日目及び６７日目にテスト 出血を行なった。８１日目に脾臓を除去し、標準的な方法（ＰＥＧ融合）により 約１２×１０7の融合パートナ−細胞（Ｐ３×６３Ａｇ８．６５３細胞系統：Ａ ＴＣＣ）に対して約７．２×１０7の脾細胞を融合させ、ＲＰＭＩ１６４０．１ ５％ＦＣＳ，４mMグルタミン、１mMのピルビン酸ナトリウムにＨＡＴ及びＰＳＮ 培地を加えたものの中で培養させた。多数の融合を実施した。 ハイブリドーマを成長させ、ＣＨＯ細胞内で発現された精製組換え型可溶性ヒ ト配列ＣＤ４（Amcrican Bio-Technologics．Inc.(ABT)．Cambridge，MA）及び ／又はNEW-DuPontから得られるＣＤ４といった市販の供給源に対する結合力につ いて、ＥＬＩＳＡを用いて上清をテストした。ＡＢＴ試料は、ヒトＣＤ４のＶ1 〜Ｖ3ドメインから成る精製された５５kOのヒトＣＤ４分子を含んでいた。検定 プレートに対して、組換え型ヒト配列ＣＤ４（ＣＨＯ−Ｋ１細胞内で産生された もの）を吸着させ、ハイブリドーマ上清からの抗体を捕獲するのに用い、次に捕 獲した抗体を、ヒトμ、ヒトκ、ヒトγ、マウスμ又はマウスκのいずれかを結 合する抗体のパネルに対する結合力について評価した。 １つのハイブリドーマを、１Ｆ２と呼ばれるその培養プレートウエルからサブ クローニングした。ＡＢＴ ＣＤ４調製物に対して結合された１Ｆ２抗体は、ヒ トμ及ひヒトκについて陽性であり、ヒトγ、マウスγ及びマウスκについて陰 性であった。 Ｂ．ヒトＣＤｄ及びヒトＩＥで免疫化されたＨＣ２トランスジェニックマウスか ら誘導されたヒトＩｇモノクローナル抗体の生成 重鎖トランスジーンＨＣ２は図 ６８ に示され、上で記述したきた（実施 例３４参照）。 図６８に記されているヒト軽鎖トランスジーンＫＣｏ４は、マウスゲノム内の 単一部位での２つの個別にクローニングされたＤＮＡフラグメントの同時組込み により生成される。フラグメントは４つの機能的ＶKセグメント、５Ｊセグメン ト、ＣKエキソンそしてイントロン及び下流の両方のエンハンサー要素を含んで いる（実施例２１参照）（Meyer及びNeuberge (1989)，EM80 J．8 : 1959-1964: judde及びMax(1992)．Mol.Cell Biol. 12：5206-5216）。２つのフラグメント は共通の３Kb配列を共有していることから（図６７参照）、これらは、重複する 配列の間の相同組換えの後、隣接する４３kbのトランスジーンとしてゲノミック ＤＮＡの中に潜在的に組込まれうる。 かかる組換え事象は、重複するＤＮＡフラグメントの微量注入の時点で頻繁に 発生することが立証されてきた（Pieper et al．(1992)．Nucleic Aacids Res.2 0：1259-1264）。同時注入されたＤＮＡは同様に接合体内に同時組込みされる 傾向をもち、個々にクローニングされたフラグメント内に含まれた配列は、その 後Ｂ細胞の発達中ＤＮＡ再配置により連結されることになる。表８は、トランス ジェニック系統のうち少なくとも２つからのトランスジーンインサートが機能的 であることを示す。４つのトランスジーンコーディングを受けたＶセグメントの 各々及び５Ｊセグメントの各々を取込んだＶＪ連結の例が、この３６クローンの 組の中に表わされている。 上記の表はＫＣｏ４トランスジェニックマウスにおけるヒト軽鎖Ｖ及びＪセグ メントの使用を示す。この表は、示されたヒトカッパー配列を含有する、２つの トランスジェニック系に由来するｃＤＮＡから増幅されたＰＣＲクローンの数を 示す。ｗ個々のＫＣｏ４トランスジェニックマウス（マウス＃８４９０、３ｍｏ 、雄性ＫＣｏ４系４４３７；マウス＃８８６７、２．５ｍｏ．、雌性、ＫＣｏｄ 系４４３６）から単離された脾臓ＲＮＡを用いてｃＤＮＡを合成した。Ｃｋ特異 的オリゴヌクレオチド５・TAG AAG GAA TTC AGC AGG CAC ACA ACA GAG GCA GTT CCA ３′、並びに２つのＶｋ特異的オリゴヌクレオチド５′AGC TTC TCG AGCTCC TGC TGC TCT GTT TCC CAG GTG CC3′及び５′CAG CTT CTC GAG CTC CTG CTA CT C TGG CTC (C,A)CA GAT ACC ３′の１：３混合物を用いてＰＣＲによりｃＤＮＡ を増幅した。このＰＣＲ生成物をＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩにより消化し、そして プラスミドベクター中にクローニングした。各動物からの無作為にとり上げた１ ８個のクローンにつき、ジデオキシチェンターミネージョン法により部分ヌクレ オチド配列を決定した。各クローンの配列を未組換え（unrearranged）トランス ジーンのジァームライン配列と比較した。 ２３の軽鎖ミニ遺伝子座陽性及び１８の重鎖陽性マウスが、注射した胚から 発達した。機能的マウス重鎖及びκ軽鎖遺伝子座が無い状態でヒト重鎖及びκ軽 鎖を含むマウスを得るため、内因性マウス重鎖（系ｊＨＤ）及びκ軽鎖遺伝子座 （系ＪＣＫＤ）の中にターゲティングされた突然変異を含むマウスを用いて、こ れらのマウス及びその後代を繁殖させた。これらのマウスにおいて、あったとし ても、マウスの軽鎖の寄与のみがマウスλ遺伝子座からのものである。 表７は、体細胞突然変異がトランスジェニックマウスのトランスジーンコーデ ィングを受けたヒト重鎖写しの可変領域の中で発生することを示している。ＨＣ ２トランスジニニックマウスがらの２３のｃＤＮＡクローンを部分的に配列決定 して可変領域内の生殖細胞系統コーディングされていないヌクレオチドの頻度を 決定した。データには各クローンからのＶセグメントコドン１７〜９４の配列の みが含まれており、Ｎ領域は含まれていない。ＲＮＡは、マウス５２５０の脾臓 及びリンパ節から分離した（ＨＣ２系統２５５０半接合、ＪＨＤ同型接合）、記 述されているとわり（参考）一本鎖ｃＤＮＡを合成し、γ写しをＰＣＲで増幅し た。増幅したｃＤＮＡをプラスミドベクターにクローニングし、ジデオキシ読み 終り方法により２３の無作為にとり上げたクローンを部分的に配列法定した。Ｐ ＣＲ導入されたヌクレオチド変更の頻度は、恒常領域成配列から＜０．２％とし て見積られる。 表７ 表７：ＨＣ２トランスジェニックマウス内のヒトγ写しの可変領域は、 生殖細胞系統コーディングされていないヌクレオチドを含む ＶＨセグメント クローン数 生殖細胞系統 生殖細胞系統 コーディング コーディング されていない されていない ヌクレオチド ヌクレオチド の数 の頻度（％） Ｖ２５１ ０ Ｖ５６Ｐｌ １０ １００ ２．１ Ｖ５ｌＰｌ １ ５ ２．０ ＶＨ４．２ｌ ３ ０ ０．０フローサイトメトリー 我々は、ＦＡＣＳｃａｎフロー血球計算器及びＬＹＳＩＳIIソフトウェア（Be cton Dickinson，San Jose．CA）を用いて染色した細胞を分析した。以下の試薬 を用いて脾細胞を染色した；ヨウ化プロビシウム（分子プローブ、Eugene，OR） 、フィコエリトリン接含されたα−ヒトＩｇκ（クローンＨＰ６０６２；Caltag ，S.San Francisco，CA ）、フィコエリトリン接合されたα−マウスＩｇκ（ク ローンＸ３６；Becton Dickinson，San Jose．CA）、ＦＩＴＣ接合されたα−マ ウスＩｇλ（クローンＲ２６−４６；Pharmingen，San diego，CA ）、ＦｉＴＣ 接合されたα−マウスＩｇμ（クローンＲ６−６０ ２；Pharmingen，San dieg o，CA ）、ＦＩＴＣ接合されたα−ヒトＩｇμ（クローンＧ２０−１２７.Pharm ingen．San Dicgo，CA ）、及びＣｙ−クロム接合された抗−マウスＢ２２０（ クローンＲＡ３−６Ｂ２；Pharmingen．San Diego，CA ）。ヒトＩｇトランスジーンの発現 図８３は、ＪＨＤ及びＪＣＫＤの両方の突然変異について同型接合であるＫＣ ｏ４及びＨＣ２マウスからの脾細胞のフロー血球計算法による分析を示す。ヒト 配列ＨＣ２トランスジーンはＪＨＤ突然変異バックグラウンド内でのＢ細胞の発 達を救助し、脾臓内のＢ２２０+細胞の相対的数を野生型動物の約半分まで回復 させた。これらのＢ細胞はトランスジーンコーディングを受けた重鎖を用いた細 胞表面免疫グロブリンレセプタを発現した。ヒトＫＣｏ４トランスジーンは同様 に機能的であり、無傷の内因性λ軽鎖遣伝子座をうまく競合した。重鎖及び軽鎖 ヒトトランスジーンを両方共含む（２重トランスジェニック）ＪＨＤ／ＪＣＫＤ 同型接合突然変異体マウスの中のＢ脾細胞のほぼ９５％が、完全にヒト細胞表面 ＩｇＭκを発現した。 血清Ｉｇレベルを以下のとおりＥＬＩＳＡによって決定した：ヒトμ：マウス ＭａｂαヒトＩｇＭ（クローンＣＨ６、結合部位、Birmingham，UK）でコーティ ングされベルオキシダーゼ接合されたウサキαヒトＩｇＭ（ｆｃ）（ｃａｔ＃３ ０９−０３５−０９５，Jackson Immuno Research．West Grove,PA ）で発達さ せられたマイクロタイターウエル。ヒトγ４：マウスＭＡｂαヒトＩｇＧｌ（ク ローンＨＰ６０６９，Calblochem，La Jolla，CA）でコーティングされ、ベルオ キシダーゼ接合されたヤギαヒトＩｇＧ（ｆｃ）（ｃａｔ＃１０９−０３６−０ ９８．Jackson Immuno Research，West Gvove，PA )で発達させられたマイクロ タイターウエル。 ヒトκ：マウスＭａｂαヒトＩｇκ（ｃａｔ＃０１７３．AMAC．Inc，Ｉｇκ （ｃａｔ＃Ａ７１６４，Sigma Chem．Co.，St Louis．NO ）でコーティングされ マイクロタイターウエル。マウスγ：ヤギαマウスＩｇＧ（ｃａｔ＃１１５−０ ０６−０７１．Jackson Immuno Research，West Grove，PA ）でコーティングさ れたマイクロタイターウエル。マウスλ：ラットＭＡｂαマウスＩｇλ（ｃａｔ ＃０２１７１Ｄ．Pharmingen，San Diego，CA ）でコーティングされ、ペルオ キシダーゼ接合されたウサギαマウスＩｇＭ（ｆｃ）（ｃａｔ＃３０９−０３５ −０９５，Jackson Immuno Research，West Grove,PA )で発達させられたマイク ロタイターウエル。結合したペルオキシダーゼを、過酸化水素及び２，２′−ア ジノ−ビス−１３−エチルベンズチアゾリン−６−スルフォン酸、Sigma ChemCo ., St.Louis，MO ）を用いたインキュベーションにより検出する。反応産物を、 ４１５nmでの吸収により測定する。 ２重トランスジェニックマウスは、血清中で完全にヒトの抗体をも発現する。 図８４は、いくつかの異なるトランスジェニック創立者動物から誘導された重及 びカッパ軽鎖失活について同型接合である１８の個々の２重トランスジェニック マウスに関する免疫グロブリンタンパク質の測定された血清レベルを示す。我々 は、検出可能なレベルのヒトμγ１及びκを発見した。我々は以上で、発現され たヒトγ１がトランスジーンμ及びγ１スイッチ領域の間のゲノミック組換えに よる真正なクラススイッチの結果として得られるということを示した。その上、 我々は、トランスジーン内邪のクラススイッチが重鎖可変領戚の体細胞突然変異 により達成されることを発見した。 ヒト免疫グロブリンに加えて、我々は血清内のマウスγ及びλをも発見した。 内因性遺伝子座が完全に無傷であることからマウスλタンパク質の存在が予想さ れる。我々は他の箇所で、マウスγ発現が、内因性重鎖遺伝子座内へのトランス ジーンＶＤＪセグメントのトランススイッチ組換えの結果であるということを示 した。当初野生型重鎖対立遺伝子及び再配置されたＶＤＪトランスジーンについ て立証されていたこのトランススイッチ現象（Durdik et al.(1989)，Proc.Natl .Acad.Sci.USA 86：2346-2350；Gerstein et al.(1990)，細胞63：537-548）は 、下流重鎖恒常領域及びそのそれぞれのスイッチ要累がなおも無傷であることか ら、突然変異体ＪＨＤバックグラウンド内で起こる。 ２重トランスジェニックマウス内のヒトＩｇＭκの血清濃度は約０．１mg／ml であり、動物間又ば系統間での偏差はほとんど無い。しかしながら、ヒトγ１、 マウスγ及びマウスλレベルは０．１〜１０マイクログラム／mlの範囲に及んで いる。個々の動物間で見られたγレベルの変動は、γが誘発可能な恒常領域であ るという事実の結果である可能性がある。発現はおそらく、動物の健康、抗原に 対する露呈そして場合によってはＭＨＣタイプといった要因により左右されると 思われる。マウスλ血清レベルは、個々のトランスジェニック系統と相関すると 思われる唯一のパラメータである。 １回の組込みあたりのトランスジーンのコピー数が最も少ない（約１〜２コピ ー）ＫＣｏ４系統４４３６マウスは、最高の内因性λレベルを有し、一方ＫＣｏ ４系統の４４３７マウス（組込み一回あたり〜１０コピー）は最低のλレベルを 有する。これは、κトランスジーンに続いて内因性λが再配置し、血清λレベル が選択されずその代りに前駆体Ｂ細胞プールの相対的サイズを反映しているよう な１つのモデルと一貫性をもつ。多数の軽鎖インサートを含むトランスジーン遺 伝子座は、１つ以上のＶ〜Ｊへの組換え事象を受げる磯会を有する可能性があり 、そのうちの１つが機能的なものとなる確率は増大する。かくして、高いコピー 系統は、より小さい潜在的λ細胞プールを有することになる。ヒトＣＤ４及びＩｇＥでの免疫化 免疫応答に参加するトランスジェニックＢ細胞の能力をテストするために、我 々はヒトタンパク質抗原で２重トランスジェニックマウスを免疫化し、ＥＬＩＳ Ａにより抗原特異的免疫グロブリンの血清レベルを測定した。腹腔内注入により 完全フロイントアジュバント内のポリスチレン溶球（ｃａｔ＃０８２２６，Poly sciences Inc.，Warrington，PA ）に共役結合された５０μｇ(7)組換え型ｓＣ Ｄ４（ｃａｔ，＃０１３１０１，American Bio-Technologies lnc.，Cambridge ，MA ）でマウスを免反化した。マウスの各々は、内因性μ及びκ遺云子座の分 断について同型接合であり、ヒト重鎖トランスジーンＨＣ２系統２５００及びヒ トκ軽鎖トランスジーンＫＣｏ４系統４４３７について半接合である。方法 血清試料を、組換え型ｓＣＤ４でコーティングされたマイクロタイターウエル へと希釈させた。ベルオキシダーゼ接合されたウサギαヒトＩｇＭ（ｆｃ）（Ja ckson Immuno Research，West Grove，PA ）又はベルオキシダーゼ接合されたヤ ギの抗ヒトＩｇκ（Sigma，St.Louis，MO)を用いて、ヒト抗体を検出した。 図８５は、組換えヒト可溶性ＣＤ４で免疫化されたトランスジェニックマウス の一次応答を示す。 免疫化された４匹の動物は全て、抗原特異的ヒトＩｇＭ応答を１週間目に示す 。ＣＤ４特異的血清抗体は、ヒトμ重鎖及びヒトκ軽鎖の両方を含んでいる。 ＨＣ２トランスジーンの二次応答に参加する能力を評価するため、我々は、抗 原を反復的に注入することによりトランスジェニックマウスを高度免疫し、誘発 された抗体の重鎖アイソタイプを監視した。ヒト重鎖トランスジーンＨＣ２及び ヒトκ軽鎖トランスジーンＫＣｏ４について同型接合であるマウスを、０日目に 完全フロイントアジュバント内の２５μｇのヒトＩｇＥκ（The Binding Site,i rmingham，UK）で免疫化した。その後、約一週間おきで不完全フロイントアジュ バント中でＩｇＥκをマウスに注入した。血清試料を１対１０の割合で希釈させ 、ヒトＩｇＥ，λでコーティングされたプレート上で抗原特異的ＥＬＩＳＡを行 なった。 図８６は、これらの動物からの免疫応答の標準的時間的経過を示している。我 々は、完全フロイントアジュバント中のヒトＩｇＥを２重トランスジェニックマ ウスに注入し、その後週一回、不完全フロイントアジュバント内のＩｇＥで追加 免疫した。初期ヒト抗体応答はＩｇＭκであり、その後抗原特異的ヒトＩｇＧκ が現われた。これらのマウス内の誘発された血清抗体は、ヒトＩｇＭ又はＢＳＡ に対していかなる反応反応性も示さなかった。ヒトＩｇＧの経時的発達、（原文 抜け）。 我々は、重鎖トランスジーンのインビトロでのクラススイッチを受ける能力も テストした：同じ重鎖構成体（ＨＣ２、系統２５５０）について半接合である脾 臓Ｂ細胞が精製された形の動物は、ＬＰＳ及び組換え型マウスＩＬ−４の存在下 で、ヒトＩｇＭからヒトＩｇＧ１へとスイッチする。しかしながら、インビトロ スイッチは、ＬＰＳ及び組換え型マウスＩＬ−２又はＬＰＳ独自の存在下で起こ らなかった。 ２重トランスジェニック／２重ノックアウト（００１１）マウスの脾臓、リン パ節、腹膜及び骨髄内にヒトＩｇＭ発現細胞が見られる。腹腔には正常な数のＢ 細胞が含まれているものの、骨髄及び脾臓中のトランスジェニックＢ細胞の絶対 数は、正常値の約１０〜５０％である。トランスジーン依存性のＢ細胞の発達に おける遅延の結果として、減少がもたらされる可能性がある。２重トランスジェ ニック／２重ノックアウト（００１１）マウスは同様に、これらのマウスにおけ るヒトμ、γ１及びκのレベルが有意なものである状態で、血清中で完全にヒト の抗体を発現する。発現されたヒトγ１は、トランスジーンμとγ１のスイッチ 領域の間でのゲノミック組換えによる真正のクラススイッチの結果として得られ る。 さらに、トランスジーン内のクラススイッチには、トランスジーンによりコー ドされた重鎖可変領域の体細胞突然変異が伴う。ヒト免疫グロブリンに加えて、 これらのマウス内にはマウスμ及びマウスλが見られる。マウスμ発現は、トラ ンスジーンＶＤＪ遺伝子が内因性マウス重鎖遺伝子座内に組込まれるトランスス イッチ組換えの結果であると思われる。もともと野生型重鎖対立遺伝子及び再配 置されたＶＤＪトランスジーンについて文献内に見られたトランススイッチは、 マウス下流重鎖恒常領域及びそのそれぞれのスイッチ要素がなおも無傷であるこ とから、我々のＪH -/-バックグラウンド内で起こる。 トランスジェニックＢ細胞の免疫応答に参加する能力を実証するため、我々は 、ヒトタンパク質抗原で００１１マウスを免疫化し、抗原特異的免疫グロブリン の血清レベルを監視した。初期ヒト抗体応答はＩｇＭであり、その後抗原特異的 ヒトＩｇＧの発現が続く（図８６及び図８８）。ヒトＩｇＧ抗体が現われる前の 遅延は、抗原に対する二次応答とクラススイッチの間の結びつきと一貫性をもつ ヒトＣＤ４で免疫化されたトランスジェニックマウスにおいては、ＣＤ４抗 原に対するヒトＩｇＧの反応性は、２×１０-2〜１．６Ｘ１０-4の範囲の血清濃 度で検出可能であった。抗ヒト体ＣＤ４ハイブリドーマの同定 ヒト重鎖トランスジーンＨＣ２及びヒトκ軽鎖トランスジーンＫＣｏ４につ いて同型接合のトランスジェニックマウスを、０日目に完全フロイントアジュバ ント内の組換え休ヒトＣＤ４ ２０μｇで免疫化した。その後、約一週間の間隔 をおいて不完全フロイントアジュバント中のＣＤ４をマウスに注入した。図８８ は、トランスジェニックマウスの血清中のヒトＣＤ４に対するヒト抗体応答を示 す。血清試料を１：５０で希釈し、ヒトＣＤ４でコーティングされたプレート上 で抗原特異性ＥＬＩＳＡを行なった。各々のラインは、個々の試料の測定値を表 わす。黒丸はＩｇＭを、白丸はＩｇＧを表わす。 我々は同様に、ヒトＣＤ４免疫化に応答したマウスの一匹からハイブリドー マ細胞系統も分離した。クローニングされたハイブリドーマのうちの５つは、組 換え型ヒトＣＤ４に結合しその他の糖タンバク質抗原のパネルと交又反応しない （ＥＬＩＳＡにより測定される通り）ヒトＩｇＧκ（ヒトγ１／ヒトκ）抗体を 分泌する。ＩｇＧκハイブリドーマ、４Ｅ４．２及び２Ｃ５．１の２つにより分 泌されたモノクローナル抗体に対する免疫化用ヒトＣＤ４抗原の結びつき及び解 離の速度を測定した。実験的に誘導された結合定数（Ｋａ）はそれぞれ抗体４Ｅ ４２及び２Ｃ５．１について約９×１０7Ｍ-1及び８×１０-1であった。これら のＫａの値、その他の者による臨床的試験に万いて用いられてきた（Chenet al. (1993)Int.Immunol．６.647）マウスＩｇＧ抗ヒトＣＤ４抗休の範囲内に入る。 ライン＃７４９ｄ（００１２；ＨＣｌ−２６＋；；ＪＨＤ＋＋，ＪＫＤ＋＋； ＫＣ２−１６１０＋＋）のマウスを０日目、１３日目、２０日目、２８日目、３ ３日目及び４７日目にヒトＣＤ４で免疫化すると、ヒトκ及びヒトμ又はγから 成る抗ヒトＣＤ４抗体を産生した。 ２８日目に、血清中にヒトμ及びヒトκが見られた。４７日目までに、ヒトＣ Ｄ４に対する血清応答には、ヒトμ及びヒトγよらびにヒトκが含ミれていた。 ５０日目に、Ｐ３×６３−Ａｇ８．６５３マウス骨髄腫細胞で脾細胞を融合させ 、培養した。７００のウエルのうち４４（６．３％）がヒトγ及び／又はκ抗ヒ トＣＤ４モノクローナル抗体を含んでいた。これらのウエルのうち３つは、ヒト γ抗ＣＤ４モノクローナル抗体を含んでいることが確認されたが、ヒトκ鎖（お そらくはマウスλを発現する）が欠如していた。９つの１次ウエルは、完全にヒ トのＩｇＭκ抗−ＣＤ４モノクローナル抗体を含んでおり、さらなる特徴づけの ため選択された。完全にヒトのＩｇＭκ抗−ＣＤ４モノクローナル抗体を発現す る１つのこのようなハイブリドーマを２ＣＩＩ−８と呼称した。 限界希釈法により一次ハイブリドーマをクローニングし、ＣＤ４に対して反応 性あるヒトμ及びκモノクローナル抗体の分泌について評価した。９つのハイブ リドーマのうち５つがＣＤ４ＥＬＩＳＡにおいて陽性にとどまった。ヒトＣＤ４ についてのこれらのヒトＩｇＭκモノクローナル抗体の特異性は、オバルブミン 、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、キーホールリンペットヘマシアニ ン及びガン胎児性抗原を含むその他の抗原との反応性が欠如していることによっ て実証された。 これらのモノクローナル抗体が細胞表面上のＣＤ４（例えば未変性ＣＤ４）を 認識できるか否かを見極めるため、ＣＤ４＋Ｔ細胞系統、ＳｕｐＴ１との反応性 について、これら５つのクローンの上清もテストした。５つのヒトＩｇＭκモノ クローナル抗体のうち４つがこれらのＣＤ４＋細胞と反応した。これらのＩｇＭ κモノクローナル抗体の特異性をさらに確実にするため、これらの抗体で、分離 されたばかりのヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を染色した。５つの一次ハイブリ ッドのうちの４つから誘導されたクローンからの上清はＣＤ４＋リンパ球のみに 結合し、ＣＤ８÷リンパ球には結合しなかった（図８７）。 図８７は、ヒトＰＢＬとのＩｇＭκ抗ＣＤｄモノクローナル抗体の反応性を示 す。ヒトＰＢＬを各クローンからの上清又はアイソタイプ整合された負の対照モ ノクローナル抗体及びそれに続くＰＥに接合されたマウス抗ヒトＣＤ４モノクロ ーナル抗体（上段）又はＦＩＴＣに接合されたマウス抗ヒトＣＤ８Ａｂ（下段） のいずれかを用いてインキュベートした。それぞれＦＩＴＣ又はＰＥに接合され たマウス抗ヒトμで、あらゆる結合したヒトＩｇＭκを検出した。クローンの１ つ、２Ｃ１１−８(右側)及び対照ＩｇＭκ（左側）についての代表的結果が示さ れている。予想通り、負の対照ＩｇＭκはＴ細胞と反応せず、ヤギ抗ヒトμは、 おそらくはヒトＢ細胞である約１０％のＰＢＬと反応した。 ＩｇＭκ抗−ＣＤ４モノクローナル抗体の産生のレベルの高さ及び優れた成長 は、発達のためのクローナルハイブリドーマ細胞を選択する上で重要な要因であ る。ハイブリドーマのｌつ２Ｃ１１−８からのデータは、最高５pg／細胞／日が 産生されうることを示している（図８９）。第２のクローンの場合にも類似の結 果が見られた。−般に観察されるように、細胞が定常期成長に入るにつれて産生 は劇的に増大する。図８９は、細胞の成長及び小規模培養におけるヒトＩｇＭκ 抗−ＣＤ４モノクローナル抗体の分泌を示す。総量２mlの甲に１mlあたり２×１ ０5 細胞の割合で重複培養を播種した。その後４日間２４時間毎に、培養を収穫 した。生存可能な細胞を計数することにより細胞の成長を決定し、全ヒトμ（上 の図版）についてＥＬＩＳＡによりＩｇＭκ産生の量を計った。ＩｇＭκの量を 細胞の数で除することにより、一日細胞一個あたりの産生を計算した（下の図版 ）。 図９０は、ヒトＩｇＭκ抗−ＣＤ４モノクローナル抗体のエピトープ地図作製 を示す。ＩｇＭκ抗−ＣＤ４モノクローナル抗休２Ｃ１１−８（ＨＢ １１６６ ８）により認識されるエピトープを位置設定するため競合結合フロー皿球計算実 験を使用した。これらの研究のためには、ＣＤ４上の重復しないユニークエピト ープに結合するマウス抗ＣＤ４モノクローナル抗体Ｌｅｕ３ａ及びＲＰＡ−Ｔ４ を用いた。減少する濃度のＲＰＡ−ＴＡ又はＬｅｕ−３ａのいずれかで予備イン キュベートされその後ひきつづき２Ｃ１１−８で染色させたＣＤ４÷細抱のＰＥ 螢光を、ＰＥ接合されたヤギ抗ヒトＩｇＭで検出した。Ｌｅｕ３ａによるヒトＩ ｇＭκ抗−ＣＤ４モノクローナル抗体２Ｃ１１−８の結合については濃度依存性 競合が存在したが、ＲＰＡ−Ｔ４によるその結合については存在しなかった。か くして、２Ｃ１１−８により認識されたエピトープは、モノクローナル抗体Ｌｅ ｕ３ａにより認識されたエピトープと類似していたか又は同一であったが、ＲＰ Ａ−Ｔ４により認識されたものとは全く異なっていた。 要約すると、我々は、未変性ヒトＣＤ４と特異的に反応しヒトＰＢＬＳをＣＤ ４+ 及びＣＤ４- 副次集団へと弁別するのに用いることのできるヒトＩｇＭκモ ノクローナル抗体を分泌する複数のハイブリドーマクローンを産生した。これら の抗体のうち少なくとも１つはモノクローナル抗体Ｌｅｕ３ａにより構成された エピトープに又はその近くに結合する。このエピトープに対して誘導されたモノ クローナル抗体は、混合型の白血球応答を阻害するものであることが示されてき た（Engleman et al.,J.Eyp.Med (1981) 153：193）。モノクローナル抗体Ｌｅ ｕ３ａのキメラバージョンは、菌状患肉腫を患う患者においていくつかの臨床的 効力を示した（Knox et al.(1991) Blood 77：20）。 われわれは、３つの異なるハイブリドーマ細胞系（2C11.8、2C5.1および 4E4. 2）からcDNA クローンを分離し、これらの細胞系のそれぞれにおいて、発現され た免疫グロブリン遺伝子のいくつかの部分的ヌクレオチド配列を決定した。 配列の分析のために、全 RNAを約 5x106ハイブリドーマ細胞から分離した。オ リゴdT での逆転写をプライミング（Priming）することにより、sscDNA を合成 した。このsscDNA の部分を、二重 PCR 反応において使用した。この反応は、(i )HCl または HC2トランスジーン内に含まれる重鎖可変骨格領域および定常ヒト ガンマ配列に特異的な単一の下流オリゴ、または(ii)KC2 またはKCo4 トランス ジーン内に含まれる軽鎖可変骨格領域および定常ヒトカッパ配列に特異的な単一 の下流オリゴについて特異性を有するオリゴのプールによってプライムされた。 これらのPCR反応からの産物を適当な制限酵素によって消化し、ゲル精製し、そ してpNNO3 ベクターへと独立にクローン化した。DNAを分離し、手動のジデオキ シおよび／または自動の蛍光配列化反 応をdsDNAに行った。 ３つのハイブリドーマ2C11.8、2C5.1および4E4.2の特性を以下の表11に示す。表11 ハイブリドーマにおけるヒト可変領域使用 nd.= 測定せず ２つのIgGkハイブリドーマ 2C5.1および 4E4.2からの発現された重鎖および軽 鎖配列のヌクレオチド配列分析は、それらが、同じプロゲニターＢ細胞から誘導 された同胞クローンであることを示す。正確なヌクレオチド配列は予定運命体細 胞突然変異によって異なるが、２つのクローンからの重鎖および軽鎖Ｖ(D)J接合 は一致する。重鎖 VDJ結合配列は、 である。軽鎖 VJ接合は、 以下の非生殖細胞系エンコードコドンを同定した（予定運命体細胞突然変異） ： 2CS.1 重鎖 AGC-〉AGG S28R （置換） 軽鎖 CCG-＞ACG P119T （置換） 4E4.2 重鎖 AGC-＞AGG S28R （置換） CTG-＞CTA L80L （沈黙） 軽鎖 GAG-〉GAC E41D （置換） AGG-＞AAG R61K （置換） CCG-〉ACG P119T （置換） これらの２つのガンマハイブリドーマは、規定された量の体細胞突然変異を受 けたＢ細胞から誘導されたと推断する。このデータは、HC2トランスジェニック 動物がVH5-51（aka VH251）Ｖセグメントを使用することを示す。VH4-34、VHI-6 9 および VH3-30.３がこれらのマウスによって発現されることを、われわれは予 め示した。これらの結果の組合せは、HC2 トランスジェニックマウスは、ヒトVH 遺伝子をエンコードしたトランスジーンの４つすべてを発現することを証明す る。 ヒト免疫グロブリン発現Ｂ細胞は、発生を経験し、かつマウス免疫系の状況に おいて抗原に応答することを我々は推断した。抗原応答性は、免疫グロブリン重 鎖イソタイプスウィッチおよび可変領域体細胞突然変異に至る。われわれはまた 、慣用のハイブリドーマ技術を、これらのマウスからモノクローナルヒト配列抗 体を得るために使用することができることを証明した。したがって、これらのト ランスジェニックマウスは、ヒトターゲット抗原に対するヒト抗体の供給源を意 味する。 実施例37 この実施例は、不活化された内因性重鎖およびκ鎖遺伝子座についてホモ接合 であり、かつ多重下流ヒトCH遺伝子にイソタイプスウィッチ可能なトランスジー ンを収容する、トランスジェニックマウスの生 成を記載する。この実施例はまた、重複する相同の配列結合（図92をみよ）を含 む多重DNAフラグメント（断片）の共ミクロ注入によって、大きいトラスジーン （例えば160kb）を集めるためのクローニング方法を証明し、これは、イン ビボ で集められるべきフラグメントの組の、例えばミクロ注入されたES細胞またはそ のクローン子孫において、遠位端での複数の相同領域の相同の組換えによって、 ２より多い重複するフラグメント（断片）からの大きなトランスジーンの構成を 許す。この実施例はまた、とりわけ、トランッスジェニック動物から分離された リンパ球が、例えばIL-4 およびLPS を用いて、イン ビトロでのイソタイプスウ ィッチを受けるために導入され得ることを示す。 ５つの異なるプラスミドクローンの組を、プラスミド挿入部が分離され得、実 質的にべタター配列がないように；かつ挿入部は共におよそ150kbの長さに及ぶ 重複配列の単一の重なった組を形成するように構成した。この組は、ヒトV、D、 J、μ、γ3およびγ１コード配列ならびにマウス重鎖3′エンハンサー配列を含 む。５つのクローンは、5′から3′順で、pH3V4D、pCOR1xa、p11-14、pP1-570 および pHP-3aである(図92)。このクローンの組を生成するために、いくつかの 異なるクローニングベクターを使用した。ベクターのいくつかは、大きいトラン スジーンを構築する目的で特異的に設計された。これらのベクター(pGP1a、pGP1 b、pGP1c、pGP1d、pGP1f、pGP2a、およびpGP2b)は、pUCベクターより細胞当たり のコピ-数が低く保持された pBR322に基づくプラスミドである（ヤニッシュ−ペ ロンら、（1985年）Gene33：103-119)。これらのベクターはまた、ポリリンカー とプラスミドβラクターゼ遺伝子の3′末端との間にtrpA転写終止シグナルを含 む。ポリリンカーは、まれな切断（rare cutting）酵素 NotI についての制限部 位によって隣接され；かくして胎児ミクロ注入に先立つベクター配列から挿入部 を分離することを見込む。NotI 部位の内部で、ポリリンカーは、どちらの末端 でも、ユニークＸhoI およびSalI 部位を含む。pGPl ベクターは、テイラーら、 (1992年)、NucleicAcids Res. 23：6287に記載されている。pGP2 ベクターを生成するために、pGPlfをまずAlwN I で消化し、合成オリゴヌクレオチドo-236 および o-237（o-236、5'-ggc gcg cct tgg cct aag agg cca−3'：o-237、5′-cct ctt agg cca agg cgc gcc tgg- 3′）でライゲート(ligate)した。得られたプラスミドは pGP2a と呼ばれる。プ ラスミド pGP2a は次に、KpnI および EcoRI で消化され、オリゴヌクレオチド o-288 および o-289 (o-288、5'-aat tca gta tcg atg tgg tac-3';o-289、5'-c ac atc gat act g-3'）でライゲートされて、pGP2b を作った（図 93A および 9 3B)。 pGP プラスミドを用いてトランスジーンを構成するための一般的スキームは、 図 94（パスＡおよびＢ）に略述されている。要素DNAフラグメントのすべてがま ず、pGP ベクターにおいて同じ5'から3'定位方向で独立してクローン化される。 挿入部 NotI、XhoI および SalI部位は、オリゴヌクレオチド突然変異生成によ って、または可能なら、部分的消化、ポリメラーゼ充填および平滑末端連結反応 によって壊される。これは、各挿入部の5'および3'末端に、ポリリンカー誘導 X hoIおよび SalI 部位のみを残す。個々の挿入部は次に、１つのクローンからXho I／salI フラグメントを分離し、かつ分離されたフラグメントを別のクローンの 5'XhoI または 3'SalI 部位に挿入する方法によって、段階的に結合されること ができる(図 94、パス A)。形質転換体を次に、１以上の挿入部フラグメントを 用いてフィルターハイブリッド化によってスクリーニングして、集められたクロ ーンを得る。XhoI／SalI結合はいずれの酵素によっても裂くことができないので 、得られた産物は、ユニーク 5'XhoI および 3'SalI部位を維持し、構成の段階 で使用され得る。このスキームの変形は、ベクターpGP2a およびpGP2bを用いて 行われる(図 94、パス B)。これらのプラスミドは、アンピシリン抵抗性遺伝子 と複製のプラスミド源との間に SfiI部位を含む。SfiI およびXhoI またはSalI を用いての切断によって、薬剤抵抗性配列または複製の起源と共に、挿入部が分 離され得る。合成の各段階 において、１つのSfiI／XhoI フラグメントが、１つの SfiI／SalIフラグメント にライゲートされる。このスキームには、３つの利点がある：(i)アンピシリン の存在中で、両方のフラグメントからの配列がプラスミドの複製に必要とされる ので、バックグラウンド形質転換体が減らされる；（ii）ライゲーションは単一 の5'から3'定位方向でのみ起こり得る；および(iii) SfiI 末端が自己和合性で なく、SalIまたはXhoI と和合性でなく、かくして非生産的ライゲーションのレ ベルを下げる。このスキームの不都合は、挿入部SfiI 部位が NotI、XhoIおよび SalI と同様に除去されなければならないことである。これらの培地複写ベクタ ーは、よく使われる pUC 誘導クローニングベクターより改良されている。これ らのベクターの能力を比較して大きい DNA 挿入部を維持するために、ヒト JH/C μ領域を含む 43kb のXhoI フラグメントを、pSP72（プロメガ、マジソン、WI） 、pUC1９（BRL、グランド アイラインド、ニューヨーク）およびpGP1f の SalI 部位にライゲートした。形質転換体クローンをニトロセルロースに移し、挿入部 を含むクローンを放射能標識したプローブでのハイブリッド化により選択した。 正のクローンを 3mlの培地で一晩育て、DNA を分離した：得られたDNA のEcoRI 消化は、すべてのpSP72およびpUC19 誘導クローーンが挿入部を欠失した（図95 ）が；18のpGP1f誘導クローンのうちの12が完全な挿入部を含んでいたことを示 す。両方の定位方向が、これらの 12 のクローンにおいて示される。 HCo7 トランスジーンを生成するために使用された５つのクローン（pH3V4D、p COR1xa、p11-14、pP1-570 および pHP-3a）の構成および分離を以下に略述する 。pH3V4D 生殖細胞系配置重鎖可変遺伝子セグメントを、VH1 およびVH3 クラスについて の合成オリゴヌクレオチドプローブを用いて、ファージ１ゲノムDNA ライブラリ ーから分離した。VH1 クラスプローブは、o-49であった： 5'-gtt aaa gaggat ttt att cac ccc tgt gtc ctc tcc aca ggtgtc -3' VH3 クラスプローブは、o-184 であった： 5'-gtt tgc agg tgt cca gtg t(c,g)ａggt gca gct g(g,t)t ggagtc (t,c)(g,c) g -3' 正にハイブリッド化されたクローンを分離し、部分的に制限地図を作成し、サ ブクローン化し、そして部分的に配列した。ヌクレオチド配列から、o-49プロー ブで分離されたVH1 クローンの１つが、hv1263遺伝子の公開された配列に含まれ たものと一致するアミノ酸配列を含む、VH 遺伝子セグメント、49.8 をエンコー ドすることが決定された(チェンら、(1989年)、Arthritis Rheum. ３２：７２) 。0-184プローブで分離されたVH3遺伝子のうちの３つ、184.3、184.14、および1 84.17は、VH 遺伝予 DP-50、DP-54 および DP-45 について公開されたものに含 まれるものに一致するアミノ酸配列をエンコードする配列を含んでいた（トムリ ンソンら、(1992年)、J.Mol.Biol. 227：776)。これら４つのVH遺伝子は、pH3V4 Dプラスミドを構築するために使用された。 184.3 遺伝子は、3kbのBamHI エフラグメント内に含まれるべきことが見出さ れた。このフラグメントは、ポリリンカーの XhoI 部位が遺伝子の５'であり、 かつ SalI 部位が３'であるように、プラスミドベクターpGP1f へとサブクロー ン化された。得られたプラスミドはp184.3.36f と呼ばれる。184.14遺伝子は、4 .8kb の HindIIIフラグメント内に含まれるべきことが見出された。このフラグ メントは、遺伝子がさらに、遺伝子のゲノムXhoI 部位 0.7kb上流でおよびポリ リンカーが誘導した遺伝子のsalI 部位３'でのXhoI/salI 消化によって3.5kbの フラグメントとして分離され得るような定位方向で、プラスミドベクターpUC19 へとサブクローン化された。得られたプラスミドはp184.14.1 と呼ばれる。184. 17遺伝予は、5.7kbの HindIII フラグメント内に含まれるべきことが見出された。このフラグメントは、ポリリ ンカー誘導XhoI およびSalI 部位がそれぞれ、遺伝子の5'および３'であるよう な定位方向で、プラスミドベクターpSP72（プロメガ、マジソン、WI）へとサブ クローン化された。このプラスミドの挿入部は、XhoI での部分消化、クレノー フラグメント充填、および再ライゲーションによって除去された遺伝子の3'末端 に XhoI 部位を含む。得られたプラスミドは p184.17SK と呼ばれる。49.8 遺伝 子は、6.3kb の XbaI フラグメント内に含まれるべきことが見出された。このフ ラグメントは、ポリリンカー誘導 XhoI および ClaI 部位がそれぞれ、遺伝子の 5'および３'であるような定位方向で、プラスミドベクターpNNO3 へとサブクロ ーン化されて、プラスミドpVH49.8 を作った（テイラーら、(1994年)、Internat ional Immunol, 6：579)。pVH49.8のXhoI／ClaI 挿入部を次に、pGP1f へとサブ クローン化して、プラスミドp49.8fを作り、これは、ユニークXhoI および SalI 部位をそれぞれ49.8遺伝子の5'および3'末端に含む。 p184.14.1 の 3.5kb の XhoI／SaII フラグメントを、p184.3.36fのXhoI 部位 にクローン化して、プラスミド pRMVH1 を生じ、これは184.14および 184.3 遺 伝子の両方を同じ定位方向に含む。このプラスミドを XhoI で消化し、そして p 184.17SKの 5.7kbの XhoI／SalIフラグメントを挿人してプラスミドpRMVH2 を作 り、これは 5'から 3'へ、３つのVH 遺伝子、184.17、184.14および 184.3 を、 すべて同じ定位方向で含む。プラスミドpRMVH2 を次にXhoI で切断し、そしてp4 9.8fの 6.3kbの XhoI／SalI 挿入部を挿入してプラスミドpH3VH4を作り、これは 5'から3'へ、４つのVH 遺伝子、49.8、184.17、184.14および184.3 を、すべて同 じ定位方向で含む。 ヒトＤ領域クローンpDH1 の10.6kb の XhoI／EcoRV 挿入部（前述した；例え ば実施例12において）を、XhoI／EcoRV 消化 pGPe プラスミドベクターへとタロ ーン化して新しいプラスミドpDH1eを作った。次にこのプラスミドをEcoRVで消化 し、そしてSaIl 部位を含む合成 リンカーフラグメント（5'- ccg gtc gac ccg -3'）でライゲートした。得られ たプラスミド、pDH1es は、XhoI 部位は5'末端にあり、Sa1l 部位は3'末端にあ るように、XhoI およびSalI で除去され得る挿入部内にヒトD1 クラスターのほ とんどを含む。この挿入部を分離し、pH3VH4 のSalI 部位にクローン化してプラ スミド pH3VH4D を作り、これは４つの生殖細胞系配置ヒトVH 遺伝子セグメント および８つの生殖細胞系配置ヒトＤセグメントを含み、すべてが同じ 5'から 3' への定位方向にある。このクローンの挿入部は、NotI での消化によって、ベク ター配列を実質的に含まず、分離されることができる。pCOR1xa ９つのヒトＤセグメント、６つのヒトＪセグメント、Ｊμイントロン重鎖エン ハンサー、μスウィッチ領域およびＣμコードエクソンを含む32kb の XhoI 挿 入部を含むプラスミドpCUR1（前記）を、XhoI で部分的に消化し、クレノ一処理 し、そして合成SalI リンカーライゲートして、新しいプラスミドpCOR1xa を生 じ、これはユニークXhoI 部位を 5'末端に有し、ユニークSalI 部位を 3'末端に 有する。pCOR1およびpCOR1xa の両方が 0.6kbのラット重鎖 3'エンハンサーフラ グメントを 3'末端に含み、これは、プラスミドがXhoI または XhoI／salIの代 わりにNotI で消化されるなら、挿入部に含まれる。pP1-570 ファージ P1 ライブラリー（Genome systems Inc.,セントルイス、ミズーリ 州）を、次のオリゴヌクレオチドプライマー対を用いて PCRによってスクリーニ ングした： 5'- tca caa gcc cag caa cac caa ｇ -3' 5'- aaa agc cag aag acc ctc tcc ctg -3' このプライマー対を、ヒトγ遺伝子鋳型を有する216 bp PCR 産物を生成する ようにデザインした。同定されたP1 クローンの１つはヒトγ3およびγ1遺伝子 の両方を 80kb の挿入部内に含むことが見出され た。このクローンの挿人部（図９６に示す）は、NotIおよび Sa1Iでの消化によ って、ベクター配列を実質的に含まず、分離することができる。p11-14 ヒトγ3／γ1 クローン P1−570 の制限酵素地図化は、挿入部の5'末端に近い 14kbのBamHエフラグメントを示した。この14kbのフラグメントを、ポリリンカー 誘導SalI 部位が挿入部の 5'末端に隣接するように、プラスミドベクターpGP1f へサブクローン化した。得られたプラスミドはpB14 と呼ばれる。別に、プラス ミドクローン pJ1NA（チョイら、（1993年）Nature Genetics 4：117）から誘導 された、ヒトμ遺伝子の3'末端およびヒトδ遺伝子の5'末端をカバーする11kbの NdeI／SpeI ゲノムDNA フラグメントを、合成オリゴヌクレオチドアダプターを 用いて、pBluescrlpt（Stratagene, LaJolla,CA）の SalI 部位へサブクローン 化した。次に、得られたSalI挿入部を分離し、pJ1NA からのμフラグメントの5' から3'への相対的定位方向がP1−570からのγフラグメントと同じであるように 、pB14のSalI 部位へクローン化した。得られたクローンはp11−14と呼ばれる。 このクローンの挿入部は、NotI での消化によって、ベクター配列を実質的に含 まず、分離することができる。pHP-3a マウス重鎖3'エンハンサー（ダリアバッハら、（1991年）Eur.J.Immunol.21 ：1499；リーべルソンら、（1991年）Nucleic acids Res. 19：933）をbalb/ｃマウスゲノムDNA ファージλライブラリーから クローン化した。プローブを得るために、全balb/cマウス胸腺DNAを、以下の２ つのオリゴヌクレオチドを用いたPCR増幅のための鋳型として使用した： cck76：5'−caa tag ggg tca tgg acc c -3’ cck77：5'- tca ttc tgt gca gag ttg gc -3’ 得られた220bpの増幅産物を、TAクローニング（商標）キット（Invitrogen、 サンジエゴ、CA）を用いてクローン化し、挿入部を、マウスファージλライブラ リーをスクリーニングするために使用した。得られたファージクローンの１つか らの正にハイブリッド化された5.8kbの HindエエエフラグメントをpGP1f へサブ クローン化した。このサブクローンの挿入部、pHC3'ENfa の定位方向は、ポリリ ンカーXhoI部位が挿入部の 5'末端に隣接し、SalI 部位が 3'末端に隣接するよ うな方向である。このHindII フラグメントの部分のヌクレオチド配列分析は、 それが 3'重鎖エンハンサーを含むことを確認した。pHC3'ENfaの挿入部はエンハ ンサー配列のコアで、ECoR1 部位の約 1.9kb 上流にXhoI 部位を含む。この Xho I 部位は、部分消化、クレノー充填および再ライゲーションによって除去されて 、クローン pH3'Efxを 作り、これはユニークXhoI および SalI 部位をそれぞれ 、挿入部の 5'および3'末端に含む。 ヒトγ3／γ1クローンP1−570の 3'末端を次のようにしてサブクローン化した ：P1−570 DNA をNotI で消化し、クレノー処理し、次いでXhoI で消化し；そし て13kb の末端フラグメントを分離し、プラスミドベクターpGP2b（BamHI で消化 し、クレノー処理し、次いでXhoIで消化されている）へライゲートした。得られ たプラスミド、pPX−3は挿人部の5'末端でポリリンカーXhoI 部位に隣接するポ リリンカーNotI 部位を失った；しかし、XhoI 部位はそのまま残り、挿入部はNo tIおよびXhoI または、SalI およびXhoI での消化により分離され得る。pH3'Efx のXhoI／SalI 挿入部を含む3'エンハンサーを分離し、そしてpPX−3 の3'SalI 部位へライゲートして、プラスミドpHP-3a を作った。pHP-3a挿人部内にフラグ メントを含むエンハンサーは、P1−570 クローンの3'末端として逆の定位方向で ライゲートされる。したがって、pHP-3a は内部SalI 部位を含み、挿入部はXhoI およびNotIの消化によって分離される。これはエンハンサー要素であるので、5 ' から 3'方向は一般に機能のために重要でない。HCo7. 前核ミクロ注入用のHCo7 DNA 混合物を調製するために、上記した５つのプラ スミドのそれぞれからのDNA を制限酵素で消化し、アガロースゲル上で分離した 。クローンpH3V4D を NotI で切断し；pCOR1xaをNotI で切断し；p11-14をNotI で切断し；pP1-570 をNotI およびSalI で切断し；そしてpHP-3a をNotI および XhoI で切断した。DNA 挿入部を電気溶出し(electroeluted)、さらにEtBr なし の平衡CsCl 勾配上で精製した。挿入部を注入緩衝液中へ透析し、次のように混 合した：50マイクロリットルのpH3V4D 挿入部＠20.4ng／マイクロリットル；50 マイクロリットルのpCOR1xa 挿入部＠20.8ng／マイクロリットル；50マイクロリ ットルのp11−14 挿入部＠15.6ng／マイクロリットル；300マイクロリットルのp P1-570 挿人部＠8.8ng／マイクロリットル；60マイクロリットルのpHP-3a 挿人 部＠10.8ng／マイクロリツトル；および1.49 ml の注入緩衝液。HCo7 トランスジェニック動物 HCo7 DNA 混合物を、１/２日令の胚の前核にミクロ注入し、ホーガンらによっ て記載されている（マウスの胚の操作、コールド スプリング ハーバー ラボラ トリーズ、コールド スプリング ハーバー NY）ように、この胚を偽妊娠したメ スの卵管に移した。 テールチップDNA（tail tip DNA）を、ミクロ注入した胚から発生した202 の 動物から分離した。ヒトμおよびDH 配列を含むプローブを用いた、このDNA の サザンブロット分析は、HCo7 トランスジーンの少なくとも一部を組込んだ22の 創立動物を示した。図 97は、HCo7 DNAをミクロ注入された胚から発生した6 匹 のGO 動物の血清におけるヒトμおよびヒトγ１の発現の分析を示す。ヒト免疫 グロブリン蛋白質の血清濃度を、ロンバーグら、（1994年）nature 368：865 に 記載さ れたELISA によって測定した。これら６匹のマウスのうちの４匹は、サザンブロ ット分析によるトランスジーンの組み込みの証拠を示し、これらのマウスのうち の３匹は、それらの血清中にヒトμおよびヒトγ１蛋白質の両方を発現した。ヒ ト免疫グロブリン蛋白質を発現しなかった１匹のトランスジェニックマウスが、 サザンブロット分析により、トランスジーンの少数のコピーのみを含むことが決 定され、全部のトランスジーンが組込まれなかったこと、またはこのマウスが遺 伝モザイクであったことの可能性がある。創立HCo7 マウスのうちの２匹、＃119 52および＃11959は、ヒトκミニ遺伝子座（または小遺伝子座）(KCo4 系4436)ト ランスジェニックマウス（このマウスはまた、内因性重鎖およびκ軽鎖遺伝子座 （ロンバーグら、前述）の分裂についてホモ接合であった）を用いて繁殖されて 、２つの内因性遺伝子座分裂についてホモ接合であり、かつ２つの誘導されたヒ トミニ遺伝子座、KCo4 およびHCo7 についてヘミ接合であるマウスを生じた。こ れらのいわゆる二重トランスジェニック／二重欠失マウスのうちの５匹を、ヒト IgM、ヒトIgG1 およびヒトIgG3 の発現について分析した。対照として、３匹の HC2/KCo4 二重トランスジェニック／二重欠失マウスを分析に含めた。この実験 を図 98に示す。この図におけるELISA データを、ロンバーグら（前述）におけ るように（ただしヒトIgG3 の欠失を除く）集め、コーティング抗体はヒト IgG3 （cat.＃08041、ファーミンゲン、ラ ジョラ、CA）に対して向けられた特異的ｍ Ab であり；IgG3 アッセイの他の詳細はIgG1 について公開されたものと同一で あつた。HC2/KCo4 マウスがヒトIgM およびヒトIgG1 のみを発現し、一方HC2/KC o4 マウスはまた、これら２つのイソタイプのほかにヒトIgG3 を発現する。HCo7 マウスにおけるヒトγ3およびχ1の発現はまた、トランスジェニックマウスの 脾臓から分離されたRNA から合成されたcDNA のPCR 増幅によって検出された。 図 99は、トランスジェニックマウスの３つの異なる系統からの脾臓cDNA を用い て合成されたPCR 増幅産物を示す：系2550 はHC2 トランスジェニック系であり 、 系11959 および11952 はHCo7 トランスジェニック系である。単一の残された(st randed)cDNA を、テイラーら、(1992年)、NucleicAcidRes.20:6287 に記載され たように、脾臓RNA から合成した。このcDNAを次に、以下の２つのオリゴヌクレ オチドを用いて、PCR増幅した： o-382：5'- gtc cag aat tcg gt(c,g,t) cag ctg gtg (c,g)agtct gg -3' o-383：5'-ggt ttc tcg agg aag agg aag act qac ggt cc-3’ このプライマーの対は、ヒトγ転写のヒンジ領域に及ぶPCR 産物の合成を支配 する。ヒトγ１およびγ３ヒンジ領域の構造の違いの故に、PCR 増幅は、これら ２つの転写の間を区別する。ヒトγ１鋳型は752 bpPCR 産物の合成を支配し、一 方、ヒトγ３は893 bp 産物の合成を支配する。ヒトγ１鋳型のみが、HC2 系255 0 およびHCo7 系11959 脾臓で検出可能であるが、γ１およびγ３転写の両方が 、HCo7 系11952脾臓で検出可能である。このアッセイの非定量性の故に、かつ個 々の動物の間のγ３発現における違い（図98においてELISAによって示した）の 故に、図99におけるHCo7系11959脾臓にγ３を観察することの不能は、γ３がこ の系に発現されないことを示さない。HCo7/KCo4マウスから分離された牌臓細胞 はまた、LPS およびIL4 での刺激によりイン ビトロで、IgG1 およびIgG3 の両 方を発現するように誘導され得る。この実験は、図 100に示される。７周令のオ スの HCo7/KCo4二重トランスジェニック／二重欠失マウス（＃12496；系11959／ 4436）から分離された脾臓細胞を、単独で、および種々のサイトカインと結合し て、胸腺非依存Ｂ細胞分裂促進因子、LPS に応答しての免疫グロブリン分泌につ いて試験した。脾臓細胞は、Ｔ細胞による細胞障害性除去によって、Ｂ細胞が豊 富にされた。B-豊富にされた細胞を、24のウェルプレート中で、RPMI-1640 中10 ％FCS ２ ml中、２ｘ106細胞／ウエルで、培養した。LPS を、10 マイクログラ ム／ml で、すべてのウェルに添加した。IL-2 を50 単位／ml で添加し、IL-4 を15 ng／mlで添加し、IL-6を15 ng／ml で添加し、γIFN を100 単位／ml で添加した。培養物を37℃、5％CO2 で10日間インキュベートした後、上清をELI SA によつてヒトIqG1 およびIgG3 について分析した。ELIZAのためのすべての試 薬は、ジャクソン イム ノロジカルズ（ウエスト グローブ、PA）からのポリク ローナル抗血清であったが、ただし、キャプチャー抗ヒト IqMは、ザバインディ ングサイト（バーミンガム、UK）からのモノクローナル抗体であった。 実施例38 この実施例は、ヒトκ軽鎖ミニ遺伝子座および、多重ヒトVK セグメントを含 む YAC クローンの共注入（co-injection）による、機能的ヒト軽鎖Ｖセグメン トのマウスゲノムへの好結果の導入を説明する。この実施例は、YAC に含まれ るVKセグメント遺伝子が、得られたマウスにおいてヒトκ鎖の発現されたレパー トリーに寄与することを示す。この実施例は、トランスジーンエンコードヒト免 疫グロブリン蛋白質のレパートリー拡張のための方法を証明し、詳細には、ヒト κ鎖可変領域レパートリーが、結合されていないポリヌクレオチド（ヒト免疫グ ロブリン可変領域セグメントを含む）の共導入(co-introduction）によってどの ようにして拡張され得るかを示す。vK 含有酵母人工染色体クローンDNAおよびκ軽鎖ミニ遺伝子座クローン DNA の共 注入による機能的ヒト軽鎖ｖセグメントの導入 I. クローン化されたヒトVK 遺伝子セグメントを含む酵母株の分析 全ゲノムDNAを、ヒトVK 遺伝子座（ICRF YAC ライブラリー デザイネーシヨン 4x17E1)の部分を含む、450kb の酵母人工染色体(YAC)を含む酵母株から分離し た。このYACクローンに含まれるVK 遺伝子セグメントのいくつかの同一性を決定 するために、一連のVK ファミリー特異的PCR 増幅反応のための基質として、ゲ ノムDNA を使用した。４組の増幅において、４つの異なる5'プライマーを、単一 のコンセンサス3'プライマーとそれぞれ対にした。この5'プライマーは：o-270 (5'-gac atc cag ctg acc cag tct cc-3')、o-271 (5'-gat attcag ctg act cag tct cc-3')、o-272（5'−gaa att cag ctg acgcag tct cc-3') および o-273 ( 5'-gaa acg cag ctg acg cag tctcc-3')であった。これらのプライマーは、マー クスら（Eur．J.Immunol. 1991.21，985）により、ＶR ファミリー特異的プライ マーとして使用される。３'プライマー、o-274（5'-gca agc ttc tgt cccaga cc c act gcc act gaa cc-3'）は、FR3 のためのコンセンサス配列に基づく。４組 のプライマーのそれぞれが、YACクローン4x17E1を含む酵母ゲノムDNAからの期待 された0.2kb のフラグメントの増幅を支配した。次に、異なる４組の増幅産物は ゲル精製され、プラスミドベクターpSP72（プロメガ）の PvuII／HindIII 部位 へクローン化された。11 の得られたクローンのヌクレオチド配列分析は、７つ のはっきりとしたＶ遺伝子を同定した。これらの結果を以下の表14に示す。表14. YAC 4x17E1 上でのヒト Ｖ K セグメントの同定 * 遺伝子セグメントは、遠位のＶKクラスター内で地図を描いた（コックスら、E ur.Ｊ.Immunol. 1994．24，827；パージェントら、Eur.Ｊ.Immunol.1991．21、1 829；スカブル及びザツチュー、Biol．Chem．Hoppe-Seyler1993．374，1001)。 YAC クローンから増幅された配列のすべてが、遠位のクラスターに地図を描か れるＶK遺伝子に明白に割り当てられるか、またはそれらは遠位の遺伝子配列と 適合し得る。配列はどれも近位のＶ遺伝子に明白に割り当てられないので、YAC 4x17E1 は遠位のＶK領域からの配列を含むことが明白である。さらに、同定され た配列のうちの１つ、クローン＃７（VkO2）は、遠位のクラスターのＪ近位末端 の近くに地図を描き、一方、別の配列、クローン＃１および４（VkL22）は、遠 位のクラスターのＪ遠位末端の近くに、300kb を超えて上流に地図を描く。かく して、450kb のYAC クローン4x17E1 が、対応するヒトゲノムフラグメントの非 欠失コピーを示すなら、それは、少なくとも32の異なるＶKセグメントを含む。 しかし、これらのうちのいくつかは、非機能偽遺伝子である。 ２．YAC 誘導ＶK遺伝子セグメントを含むトランスジェニックマウスの生成 胚の前核へのミクロ注入のための精製YAC DNA を得るために、全ゲノムDNA を アガロースゲル上で、サイズ分画（size fraction）をした。YAC 4x17E1を含む 酵母細胞を、溶解に先立ってアガロース中に埋め込み、そしてYAC DNAを、標準 パルスフィールドゲル電気泳動（製品明細：CHEF DR-II 電気泳動細胞、BIO-RAD ラボラトリーズ、リッチモンド CA）によって、酵母染色体DNA から分離した。 ６つの独立のパルスフィールドゲルを、エチジウムブロマイドで染色し、YAC ク ローン含有ゲル物質をゲルの残部から切り離した。次に、YAC 含有ゲル片を，三 角形のゲルトレー中の新たな（低い融点の）アガロースゲルキャスト(cast)中に 埋め込んだ。得られた三角形のゲルを、標準ゲル緩衝液の他に２モル／リットル の酢酸ナトリウムを含む細いゲルを用いて、頂点で広げた(図 101)。次に、ゲル を、標準ゲル緩衝液に浸した電気泳動チャンバー中に置いた。電流が細い高塩ゲ ル片にだけ流れることができるように、Ｙ字形のゲル型を緩衝液の表面より上に 上げ た。プレキシグラスブロックを細い高塩ゲル片の上に置いて、NaOAcがゲル緩衝 液へと拡散するのを防いだ。次に、YAC DNAを、元のゲル片から細い高塩ブロッ クへと電気泳動した。低塩ゲルから高塩ゲルへの移動の時点で、ゲルを通ったYA C DNAの移動を効果的に停止させる抵抗低下がある。これは、三角形のゲルの頂 点でYAC DNAの濃縮に至る。電気泳動および染色に続いて、濃縮したYAC DNAをDN Aの残部から切り離し、アガロースをGELase（EPICENTRE Technologies）で消化 した。次に、塩化セシウムをYAC DNA含有液体に添加して、1.68g／mlの密度を得 た。この溶液を37,000 rpmで36時間遠心分離して、汚染物質からDNAを分離した 。得られた密度勾配の0.5ml画分を分離し、ピークDNA含有画分を、５mMトリス（ pH7.4）／５mMNaCl／0.1M EDTAに対して透析した。透析後、YAC DNAの得られた0 .65ml溶液の濃度は、２マイクログラム／mlであることがわかった。このDNAを、 プラスミドpKC1BおよびpKV4からの精製DNA挿入部（ロンバーグら、1994年、ネイ チャー 368、856）と、20:１:１（マイクログラムYAC4x17E1：KC1B：KV4）で混 合した。得られた２マイクログラム／ml溶液を、半日マウス胚の前核に注入し、 95の生き残ったミクロ注入した胚を、偽妊娠したメスの卵管に移した。ミクロ注 入した胚から発生した、39のマウスが生まれた。これらマウスのうちの２匹、＃ 9269および＃9272を、トランスジェニック系を確立するために使用した。この系 は、KCo5−9269およびKCo5−9272と称する。 系KCo5−9269およびKCo5−9272マウスからのゲノムDNAのサザンブロット分析 を行って、YAC 4x17E1誘導VKセグメントがそれらのゲノム中に組込まれたかどう かを決定した。遠位のVKクラスターの中央からのVK遺伝子セグメント、VkA10（ アセッション＃：x12683；ストロービンガーら、1988、Biol．chem．Hoppe−Sey ler 369、601−607）を、サザンブロット分析のためのプローブとして選択した 。クローン化したプローブを得るために、VkA1O遺伝子をまずPCRによって増幅し た。２つのオリゴヌクレオチド、o-337(５'−cgg tta aca tag ccc tgg gac gag ac -３')およびo-338（５'−ggg tta act cattgc ctc caa agc ac -３')を、YAC 4x17E1から１kbフラグメントを増幅するためのプライマーと して使用した。増幅産物をゲル精製し、HincIIで消化し、そしてpUC18へクロー ン化して、プラスミドp17E1A10を得た。次に、このプラスミドの挿入部を、KCo5 −9269およびKCo5−9272 DNAのサザンブロットを調べるために使用した。ブロッ トは、KCo5−9272マウスDNAのみにおいて予想される制限フラグメントへのプロ ーブのハイブリッド化を示した。このことは、VkA1O遺伝子が、KCo5−9272マウ スのゲノムに組込まれ、KCo5−9269マウスには組込まれなかったことを示す。次 に、系KCo5−9272マウスをHC2-2550/JHD/JKDマウスと交配して、内因性重鎖およ びκ軽鎖遺伝子座の分断についてホモ接合であり、かつHC2およびKCo5トランス ジーンについてヘミまたはホモ接合であるマウスを得た。内因性重鎖およびκ軽 鎖遺伝子座の分断についてホモ接合で、ヒト重鎖およびκ軽鎖トランスジーンに ついてヘミまたはホモ接合である動物は、二重トランスジェニック／二重欠失マ ウスと称する。 cDNAクローニング実験を行って、YAC誘導Vk遺伝子のいずれかがKCo5−9272系 マウスに発現されるかどうかを決定した。二重トランスジェニック／二重欠失マ ウス＃12648（HC2-2550/KCo5−9272/JHD/JKD）を犠牲にし、全RNAを牌臓から分 離した。１つのよられたcDNAをRNAから合成し、オリゴヌクレオチドo-270、o-27 1、o-272およびo-273を５'プライマーとして用い、かつCk特異的オリゴヌクレオ チド、o-186（５'-tag aag gaa ttc agc agg cac acaaca gag gca gtt cca -３' ）を３'プライマーとして用いて、４つの別々のPCR反応における鋳型として使用 した。増幅産物をpCRIITAクローニングベクター（インビトロゲン）へクローン 化した。19の挿入部のヌクレオチド配列を決定した。配列分析の結果を以下の表 15にまとめる。表15.マウス系KCo5-9272に発現されたヒトVk遺伝子の同定 ★ トランスジーンプラスミド配列によってエンコードされたVk遺伝子★★ YAC誘導トランスジーン配列によっで唯一にエンコードされたVk遺伝子 これらの結果は、少なくとも３のYAC誘導Vk遺伝子セグメント、A10、L18およ びL24が、KCo5−9272系マウスの発現されたヒトレパートリーに寄与することを 示す。 骨髄および脾臓での種々のB220+細胞集団のサイズにおけるこの増加したレパ ートリーの効果を決定するために、KCo5−9272系マウスにおいて、フローサイト メトリー分折を行った。この分析の一部が、図102および図103に示されている。 ２匹の二重トランスジェニック／二重欠失マウス（一匹はKCo5トランスジーンを 含み、一匹はKCo4トランスジーンを含む）をこの実験において比較した。これら ２つのトランスジーンは、同じ結合および定常領域配列、ならびに同じイントロ ンおよび３'エンハンサー配列を共にする。それらはまた、４つの 異なるクローン化されたV遺伝子セグメントを共にするが；KCo5トランスジーン は、KCo4トランスジーンには含まれない、YAC 4x17E1から誘導された追加のVセ グメントを含む。細胞を、マウス＃13534（HC2-2550/KCo5−9272/JHD/JKD）およ びマウス＃13449（HC2-2550/KCo4−4436/JHD/JKD）から分離した。骨髄細胞を、 抗マウスB22O（カルタグ、サウス サンフランシスコ、CA）、抗マウスCD43（フ ァーミンゲン、ラ ジョラ、CA）および抗ヒトIgM（ジャクソン イムノロジック 、ウエストグローブ、PA）で染色した。脾臓細胞を抗マウスB220および抗ヒトIg Mで染色した。 図102は、KCo5およびKCo4マウスの骨髄におけるＢ細胞およびＢ細胞前駆体集 団の比較を示す。骨髄中のＢ細胞の画分（B220+、IgM+）は、KCo5マウスにおい て（6％）は、KCo4マウスにおける（２％）より、約３倍高い。プレＢ細胞集団 （B220+、CD43-、IgM-）がまた、KCo5マウスにおいて、より高い（９％、KCo4の ４％に比べて）。さらに、プロＢ区画(B220+、CD43+)がこれらのマウスにおいて 上昇している(Kco5では11％、KCo4では５％)。これら３つの区画のそれぞれは、 KCo5マウスでは、KCo4マウスにおけるより大きいが、そのレベルはなお、野生型 マウスにおいて見出された約半分である。骨髄Ｂ細胞の数の増加はたぶん、増加 したレパートリーサイズの直接の結果である。これらのマウスのより大きい第１ のレパートリーは、内因性の抗原についていくらかの最小の閾値親和性を膜Igに 提供し得る。次に、レセプターライゲーションが反応性Igを発現するそれらＢ細 胞の増殖を見込むことができた。しかしながら、プレＢおよびプロＢ細胞は軽鎖 遺伝子を発現しないので、KCo5マウスにおけるこれら２つの区画の増加したサイ ズについての説明は直ぐに明らかではない。増加したＢ細胞の数は、これらの集 団の拡張に、より助けとなる骨髄環境をつくるので、Ｂ細胞前駆体区画はKCo5マ ウスにおいてより大きくあり得る。この効果は、分泌された因子によって、また はＢ細胞と前駆細胞との間の細胞−細胞接触によって直接媒介されることができ たか、または、さもな ければ前駆細胞の生存または増殖を阻害するであろう因子または細胞の滴定によ って、間接的に媒介されることができた。 図103は、KCo5およびKCo4マウスにおける脾臓Ｂ細胞(B220+、IgM+)集団の比較 を示す。これらの２匹のマウスの間の主な違いは、B220曇っているＢ細胞集団の 相対的サイズである(Kco5マウスでは６％、かつKCo4マウスでは13％)。B220曇っ ている 細胞は、B220明るいＢ細胞より大きく、それらのより高い画分は、１つの 軽鎖を発現する。これらは、通常、野生型マウスでの末梢Ｂ細胞集団を支配する 、いわゆるB1細胞集団の特性である。KCo4マウスの脾臓は、B220曇っている細胞 の変則的に高い画分を含み、一方、KCo5マウスは、これらの細胞のより普通の分 布を有する。しかしながら、両方の系統が、脾臓のＢ細胞の通常の数の約１/２ 〜１/３を含む。 実施例39 この実施例は、高親和性の抗原特異的なヒトIgGモノクローナル抗体を分泌す るハイブリドーマクローンを分離するために、実施例38のKCo5トランスジェニッ クマウスの好結果の使用を説明する。免疫化 二重欠失／二重トランスジェニックマウス（KCo5−9272/HC2-2550/JHD/JKD、 ＃12657）を、８週間１週おきに、腹腔内に、４〜10ｘ106照射T4D3細胞、ヒトCD 4を発現するネズミＴ細胞系（ドクタージェインパーンズ、スタンフォード大学 ）で免疫し、次いで２週間後、不完全フロイントアジュバント（シグマ）中の20 mgの可溶な組換えヒトCD4（sCD4；イントラセル）を腹腔内に１回注入した。こ のマウスを、20 mgのsCD4と融合するに先立って３日間に１度、静脈内に追加し た。ハイブリドーマ融合 免疫したマウスからの脾臓リンパ球の単一細胞懸濁液を、１/６の数のP3X63-A g8.653非分泌マウスミエローマ細胞(ATCC CRL 1580) に、50％PEG（シグマ）を用いて融合した。平底ミクロ滴定プレートに、約2x106 で、細胞を移植し、次いで、20％胎児クローン血清(HyClone)、18％「653」なら し培地、５％オリジエン(Origen)(IGEN)、４mM L-グルタミン、1mM ピルビン酸 ナトリウム、５mM HEPES、0.055mM２-メルカプトエタノール、50単位／ml mMペ ニシリン、50mg／ml ストレプトマイシン、50mg／ml mMゲンタマイシンおよび１ xHAT（シグマ；融合の24時間後にHATを添加した）を含有する選択培地中で２週 間インキュベートした。２週間後、HATをHTで置き換えた培地中で細胞を培養し た。広範囲のハイブリドーマの成長または培地が使われたことが観察されたら、 ウェルをELISAおよびフローサイトメトリーでスクリーニングした。ELISA によるハイブリドーマのスクリーニング 抗CD4 mAbを検出するために、ミクロ滴定プレート （ファルコン）を、PBS中 2.5mg／mlのsCD4 50mlで、４℃にて１晩被覆し、PBS中５％のチキン血清100 mL で１時間室温にてブロックし、次いで室温にて１時間インキュベートした。イン キュベーションはそれぞれ、ハイブリドーマからの上清の希釈１:４、セイヨウ ワサビペルオキシダーゼ(HRPO)結合ヤギ抗ヒトIgG（ジャクソン）のF(ab')2フラ グメントの1,1000希釈または、HRPO結合ヤギ抗ヒトIgK抗体（シグマ）プラス１ ％通常のマウス血清の１：250希釈で行い、および最後に、0.0024％H2O2を有す る、0.1Mのクエン酸燐酸緩衝液(pH4)中0.22mg／ml ABTSを用いて行った。最初以 外はすべてのインキユベーション間で、プレートを洗浄緩衝液(PBS中0.5％Tween −20)で３〜６回洗浄した。希釈液（５％チキン血清を有する洗浄緩衝液）を使 用して、上清およびHRPOコンジュゲートを希釈した。二重波長を用いて吸光度を 測定した（490nmの参照波長でのODを415nmでのODから引いた）。 マウスλ含有mAbを検出するために、以下のこと以外は、上記のELISAプロトコ ールを使用した。ミクロ滴定プレートのウェルを、100mlの１）1.25mg／mlヤギ 抗マウスλ（ピアス）、２）1.25mg/ml ヤギ抗ヒトFcγ （ジャクソン）、または３）２.５mg／ml sCD4(ABT)で被覆し た。検出段階について、ビオチンに結合した１:5000ヤギ抗マウス１(SBA)100ml を使用し、次いでHRPO（ジャクソン）に結合した１:1000ストレプトアビジン100 mlを使用した。ネズミおよびヒトのmAb標準を、示された濃度で使用した。関連 のない抗原に対する交差反応性をさがすために、ウェルを、CEA（クリスタルケ ム）、KLH（カルバイオケム)、HSA（シグマ）、BSA（シグマ）またはOVA（シグ マ；すべて２mg／ml、ただしCEAは2.5mg／mlであった）で被覆した。 適当な抗体を滴定し、正の対照（ヒトIgM抗CEA（ジェンファーム）、ウサギ抗KL H（シグマ）、ヒツジ抗HSA（ザ バインディングサイト）、ヒツジ抗BSA（ザ バ インディングサイト）およびヒツジ抗OVA（ザ バインデイングサイト)）として 使用した。どの結合された抗体も、ヤギ抗ヒトIgM、ロバ抗ウサギIgGまたはロバ 抗ヒツジIgG(すべて、１:1000に希釈され、ジャクソンから得た）のHRPOコンジ ュゲートで検出された。さもなければ、標準ELISAプロトコールは、以下のよう であった。フローサイトメトリーアッセイによるハイブリドーマスクリーニング 自生種細胞の表面CD4と反応性のmAbをさらにスクリーニングするために、５ｘ 105のSupT1細胞（ATCC CRL 1942）を、融合プレートからの使われた上清の１:２ 希釈を用いて氷上で30分間インキュベートし、冷染色緩衝液（0.1％BSA、0.02％ NaN3、PBS中）で２回洗浄し、FITC結合ヤギ抗ヒトFcg(FITC−GaHuIgG;ジャクソ ン)のF(ab')2フラグメント1.5mg／mlで15分間インキュベートし、１回洗浄し、 そしてFACScan（ベクトン−ディッキンソン）で直ちに分析した。CD4 反応性ハイブリドーマ 上記したELISAおよびフローサイトメトリー技術を用いて、自生種ヒトCD4と特 異的に反応するヒトIgGを分泌する12のハイブリドーマクローンを同定した。こ れら12のクローンのうちの10をさらにサブクローン化した。これらサブクローン のうちの８つをヒトIgG1k分泌ハイブリドーマとして同定した。他の２つは、マ ウスλ軽鎖を発現 した。８つの完全なヒトクローンのためのペアレントウェルは、1E11、2E4、4D1 、6C1、6G5、7G2、10C5および1G1であった。完全なヒトIgGkサブクローンのうち の３つ（4D1.4、6G5.1および10C5.6）の結合のフローサイトメトリーアッセイを 図104に示す。 図104は、IgGk抗nCD4モノクローナル抗体のnCD4+SupT1細胞への結合を示す。 ログフェーズグロース培養（log phase growthculture）からの細胞を洗浄し、 モノクローナル抗体なし、4E4.2(負の対照として)、キメラLeu3a（正の対照とし て）または10のヒトIgG抗nCD4モノクローナル抗体のうちの１つで染色した。ど の結合したモノクローナル抗体も、FITC結合ヤギ抗ヒトFcγで検出された。10の モノクローナル抗体のすべてがSupT1細胞に結合した。ただし、そのうちの３つ しか、データがここに示されていない。クローン化されたハイブリドーマによるヒト抗体分泌の分析 mAbの成長および分泌レベルを比べるために、サブクローンを複製培養物（2x1 05細胞／mlの初期密度で、24のウェルプレート中、HT培地中）に入れた。７日間 毎日、各サブクローンについての複製培養物の１つを取り、細胞数、細胞生存度 （トリパンブルー排除による）および上清中のmAbの量（全ヒトγについて定量 的ELISAによる）を測定した。表16は、ハイブリドーマサブクローンのうちの７ つによる抗体分泌についてのデータを示す。表16．ヒトIGk抗nCD4モノクローナル抗体についての分泌レベル ★pg/細胞＝（mAbの最大量）／（生存細胞の最大数） pg／細胞／d=（pg/細胞）／７日ヒトmAbの精製 個々のハイブリドーマクローンをHTおよびオリジェンなしの培地中で成長させ 、FCSを徐々に減らして、最終１リットル培地中で約２〜３％までにした。ハイ ブリドーマの生存度が約30％より下に落ちたら、上清を取った。IgGk mAbを精製 するために、使用した上清を遠心分離して細胞を除去し、超音波にて約50〜100m lに濃縮し、PBS、pH7.4で１:５に希釈し、そして５mlのプロテインＡ（ファルマ シア）カラムに載せた。カラム体積の３〜５倍のPBSで洗浄した後、ヒトIgGk mA bを、0.1HCl、150 mM NaCl、pH2.8で溶出し、そして直ちに1Mトリス塩基で中和 した。OD280＞0.2の物質を含むカラム画分を集め、PBSに透析した。次に、OD280 を測定し、1.4の吸収係数(absorbtivitycoefficient)を使用して、ヒトIgGの蛋 白質濃度を計算した。流れの中にmAbは検出されず、％回収率は93〜100％の範囲 であった。３〜６mgの各精製mAbが得られ、純度＞90％であった。クローン化されたハイブリドーマからのモノクローナル抗体の分析 mAbの結合の特異性を調べるために、ヒトPBMCをフィコール上で分離し、以下 のように染色した。染色緩衝液中のヒトPBMC(106)を氷上で30分間インキュベー トし、別々の反応において、サブクローン化したハイブリドーマの３つ（4D1.4 、6G5.1および10C5.6）のそれぞ れからの同体積の上清を用いて、またはイソタイプが合った負の対照mAbを用い て行い、２回洗浄し、そして、フィコエリトリン(PE)に結合したマウス抗ヒトCD 4mAb(Leu3a;ベクトン−ディッキンソン)10ml、PEに結合したマウス抗ヒトCD8 mA b（Leu2a；ベクトン−ディッキンソン）10mlまたはPEに結合したマウス抗ヒトCD 19mAb(SJ25−C1；カルタグ）5mlと一緒に1mg/mlのFITC−GaHuIgGを用いて、20分 間氷上でインキュベートした。次に、ゲートリンパ球(gatedlymphocyte)をFACSc anフローサイトメーター（ベクトンディッキンソン、サン ジョゼ、CA)で分析し た。３つの抗体すべてが、ヒトPBMCのCD4画分に特異的に結合することが見出さ れた。 これら３つのmAbによって認識されるエピトープの位置を近づけるために、５ ｘ105 SupT1細胞を、緩衝液、2.5mg/ml RPA-T4、または染色緩衝液中の2.5mg／m l Leu3aを用いて氷上で20分間、次いで10のヒトIgG mAb（１:２に希釈した上清 中）のうちの１つを用いて30分間、そして最後に0.5mg／ml FITC結合ヤギ抗ヒト Fcγを用いてプレインキュベートして、結合したヒトIgGをいずれも検出した。 最後の段階の前に２回、その後に１回、細胞を染色緩衝液で洗浄した。このブロ ッキングアッセイの結果を図105に示す。３つの抗体のどれも、RPA−T4とエピト ープを共にしないが、6G5.1および10C5.6は、Leu3aによって認識されたのと同じ （または隣接する）エピトープを認識するようである。速度および平衡定数の測定 ヒトsCD4(2500〜4200RU)を、製品の指示に従って、センサーチップ表面に、ア ミン基を介して共有結合によって固定した。抗体希釈物を、平衡に到達するまで 、抗原結合センサーチップの上を流し、次いで緩衝液のみを流れるようにした。 反応、結合および解離の各相について、結合した抗体の画分を時間に対してプロ ットした。結合曲線の導関数（dR／dt）を計算し、各濃度についての応答に対し てプロットした。会合速度定数（k会合）を計算するために、それらの得られた 線の勾配を、モノクローナル抗体の濃度に対してプロットした。このグラフから の線の勾配がｋ会合に対応した。解離速度定数（k解離）を、時間間隔に対して の応答（緩衝液の流れ相中）における低下の対数から、計算した。ｋ会合をｋ解 離 で除して、Kaを誘導した。KCo5／HC2二重トランスジェニック／二重欠失マウ スから誘導された５つの異なる精製モノクローナル抗体および、市販の供給源（ ベクトンディッキンソン、サン ジョゼ、CA）から得られた１つの精製抗体につ いて測定した速度および親和性定数データを表17に示す。表17.ヒトCD4に結合したモノクローナル抗体についての速度および親和性定数 混合リンパ球反応(MLR) KCo5トランスジェニックマウスから誘導されたヒトモノクローナル抗体10C5.6 のインビトロでの効力を、マウス抗体Leu3aと比較するために、MLRアッセイを行 った。２人の関連のないドナーからのヒトPBMCをフィコール上で分離し、各ドナ ーからのCD4+PBLを、製品の指示に従って、CD4カラム（ヒトCD4セレクト、バイ オテックス ラボラトリーズ、インク.、カナダ）を用いて精製した。両方のドナ ーか らのPBMCを、培地（次のものを含むRPMI 1640：10％加熱−不活化ヒトAB血清(NA BIから)、ヘペス、ピルビン酸ナトリウム、グルタミン、pen／strep、およびb- メルカプトエタノール(すべて製品の推奨濃度で使用)）中の100mg／mlマイトマ イシンｃ（アルドリッチ）を用いて、37℃で30分間処理した後、培地で３回洗浄 することによって、不活化された刺激物細胞(stimulator cell)を得た。培地で 希釈した種々の濃度のmAbまたは培地のみを、滅菌ろ過し、96ウェルの丸底プレ ートに、トリプル（triplicate）でウェル当たり100mlで加えた。次に、１人の ドナーからの105CD4+PBL（培地中） 50mlおよび別のドナーからの105マイトマ イシンＣ処理したPBMC（50mlの培地中）を、各ウェルに加えた。mAbのいかなる 毒性または分裂促進因子効果についても対照するために、CD4＋PBL反応物(respo nder)のみプラスmAbを有する対照プレートをセットした。刺激物のみの対照およ び培地バックグラウンド対照をまた含めた。37℃、５％CO2加湿インキュベータ にて７日間の後、各ウェルから上清100mlを除去し、2Omlの比色分析試薬（セル タイター96AQキット、プロメガコーポレーション、マジソン、WI）を加えた。４ 〜６時間発色させ、490nmにてプレートを読んだ。図106に示されたこの実験の結 果は、ヒトIgG1k抗体10C5.6は、このアッセイにおいて、ヒトPBMC CD4細胞の機 能を妨げることにおいて、少なくともLeu3aと同様に有効であることを示す。 実施例40ヒトIgGカッパ抗CD4モノクローナル抗体の結合特性 この実施例は、ヒトCD4で免疫したHC2/KCo5/JHD/JCKDトランスジェニックマウ スから得たハイブリドーマクローンから誘導されたヒトIgGkモノクローナル抗体 の結合特性を提供する。このモノクローナル抗体は、組換えおよび天然ヒトCD4 に対して高い結合力および親和性(avidity and affinity)を有することが示され た。 ヒトCD4と反応性のヒトIgGカッパモノクローナル抗体(mAb)を分泌する、10の 個々のハイブリドーマ細胞系（1E11、1G2、6G5、10C5、1G1、6C1、2E4、7G2、1F 8および4D1）からの細胞を、 JHD/JCKD/HC2/KCo5トランスジェニックマウスから誘導した。細胞系を培地で成 長させ、抗体蛋白質を上清から分離した（フィッシュワイルドら、1996年、ネイ チャーバイオテクノロジー14、845-851)。プロテインＡアフィニティクロマトグ ラフィーにより精製した抗体を結合定数を測定するために使用した。結果を表18 および19に示す。 表18に示された速度および平衡定数は、センサーチップに結合されたヤギ抗ヒ トIgG（Fc特異的）を使用し、飽和濃度のmAbを流して、次いで種々の抗原（rCD4 ）濃度で、BIAcore（ファルマシア バイオセンサー）を用いて測定された。これ らの定数は、精製したmAbを用いた３つの実験から誘導された。表18．親和性および速度定数 表19に示した速度および平衡定数は、センサーチップに結合した抗原（rCD4） を用い、次いでmAbを流して、BIAcoreにて測定した。これらの定数は、精製mAb を用いて、少なくとも３つの独立した実験から誘導された。表19．結合力および速度定数 表20は、科学文献に示された抗CD4 mAbについての平衡定数を与える。表20．抗CD4モノクローナル抗体について報告された結合力および速度定数 NR=報告なし、 (１)J.Cell.Biol.15E:A179 (２)J.Immunol.145:2839 (３)Clin.Immunol.Immunopath.64:248 (４)Biotechnology.10:1455 (５)Mol.Immunol.30:1443 (６)欧州特許出願#0626389A1 上記した結合力および親和性の測定は、組換えCD4（rCD4）を用いて行った。 野生種CD4（nCD4）についてのヒトモノクローナル抗体の結合力を測定するため に、変性されるべき抗体を必要としない、追加の結合アッセイを使用した。特異 的に、抗体の連続希釈物を、SupT1細胞と共に、６時間氷上でインキュベートし 、洗浄し、FITCヤギ抗ヒトFcγと結合したどの抗体をも検出した。Kaを、最大蛍 光の１／２を与える抗体の濃度から測定した(４つのパラメータフィットを使用 した)。その結果は、10のヒトモノクローナル抗体すべてが、Ka値＞109M-1 で、nCD4に非常によく結合したことを証明する(表21)。ほとんどの抗体（キメラ Leu3aを含む）が、rCD4よりもnCD4に、あまりよく結合しなかった。このことは 、抗原の密度の差ならびに２つの抗原の間の差異に帰することができた。表21.フローサイトメトリーにより測定された結合力定数 ★ヒトモノクローナル抗体は、SupT1細胞と共に、連続希釈物中で６時間インキ ュベートし、２回洗浄し、FITC結合ヤギ抗ヒトFcγ抗血清と共にインキュベート し、洗浄し、固定した。４つのパラメータフィットから測定したように、最大蛍 光の１／２を与える抗体の濃度からKaを計算した。 実施例41 ヒトIgGκ抗CD4抗体をエンコードするヌクレオチド配列の同定 この実施例は、試験したハイブリドーマのそれぞれが１つの機能的重鎖または 軽鎖RNA転写物のみを生成することを証明し、これは、適当な機能する対立遺伝 子排除と一致する。さらに、重鎖および軽鎖CDRセグメントの配列分析は、免疫 グロブリントランスジーンの体細胞突然変異が起こったことを示す。 ヒトCD4と反応するヒトIgGκモノクローナル抗体を分泌し、 JHD/JCKD/HC2/KCo5トランスジェニックマウスから誘導された、５つの個々のハ イブリドーマ細胞系(1E11、1G2、6G5、10C5および4D1)からの細胞が、個々の抗 体のそれぞれをエンコードするRNAを分離するために使用された（フィッシュワ イルドら、1996年、NatureBiotechnology 14、845-851)。RNAが、cDNAを合成す るための基質として使用され、これは次に、ヒトVH、Vκ、Cγ、およびCκに特 異的なプライマーを用いて、PCRによってヒトIgγおよびκ転写配列を増幅する ために使用された（テイラーら、1992年、Nucleic AcidsRes.20、 6287-6295； ラリック、J.W.ら、(1989年)、 Bio/Technology 7．934-938；マークス、J.D.ら、(1991年)、Eur.J．Immunol.21 .985-991;テイラーら、1994年、Int.Immunol．6、579-591)。増幅されたIg重鎖 およびκ軽鎖の配列を、細菌のプラスミドへクローン化し、ヌクレオチド配列を 決定した。重鎖VDJおよび軽鎖VJ結合に広がる配列の分析は、５つのクローンの それぞれについてフレーム内（in frame）重鎖および軽鎖転写を示し、いくつか の場合には、非機能的対立遺伝子を表している追加のフレーム外（out offrame ）無菌転写物を示す。適当な機能する対立遺伝子排除と一致して、個々のクロー ンのそれぞれについて同定された１より多いユニーク機能的重鎖または軽鎖転写 物がある場合はない。10の機能的転写物のそれぞれについて、部分ヌクレオチド 配列が、以下の配列I.D．番号に割り当てられ：1E11 γ[配列I.D.No.１]；1E11 κ[配列I.D.No.2]；1G2γ[配列I.D.No.３]；1G2κ[配列I.D.No.４]；6G5 γ[配列I.D.No.５]；6G5 κ[配列I.D.No.6]；10C5γ[配列I.D.NO.７]；10C5κ[ 配列I.D.No.８];4D1γ[配列I.D.No.９];4D1κ[配列I.D.No.10]、表22に示される 。総ての配列が５'から３'への方向で示される。表22.機能的転写物についての音分ヌクレオチド配列 これらのDNA配列の分折は、５つのハイブリドーマクローンが４つの個々のプ ライマリーＢ細胞の子孫を示すことを証明する。表23は、10のCDR3領域のそれぞ れについて誘導されたアミノ酸配列およびこれらの転写物をエンコードする遺伝 子のそれぞれに挿入された生殖細胞系遺伝子セグメントについての割り当てを示 す。生殖細胞系の割り当ては、ナショナルセンターオブバイオテクノロジー イ ンフォメーション(National Center for Biotechnology Information)、ナショ ナル ライブラリー オブ メディシン（National Library ofMedlcine)、ナショ ナル インスティテューツ オブ ヘルス(NationalInstitutes of Health)、Bethe sda、Md.から入手可能な公開された遺伝子配列に基づく。また、次をみよ：クッ クら、1994年、NatureGenet．7、162-168；トムリンソンら、1992年、J．Mol．B iol．227、776-798；マツダら、1993年、Nature Genet．3、88-94；スカブル＆ ザッチュー、1993年、Biol．Chem．Hoppe-Seyler 374、1001-1022；コックスら 、1994年、Eur.J.Immunol.24、827-836；ラベッチら、1981年、Cell 27、583-59 1；イチハラら、1988年、EMBO J．7、4141-4150；ヤマダら、1991年、J．Exp．M ed．173、395-407；サンツ、1991年、J．Immunol．147、1720-1729。表23．ハイブリドーマ転写物における生殖細胞系V(D)Jセグメント使用 n.d.は、ヌクレオチド配列から決定することができなかった。 実施例42トランスフェクトされた細胞系におけるヒトIgGκ抗CD4抗体の発現のためのミニ ジーンの構成 この実施例は、免疫グロブリンポリペプチド（すなわち、免疫グロブリン重鎖 または軽鎖）をエンコードする、完全に人工の遺伝子を作る方法を説明する。PC R増幅したV重鎖およびV軽鎖cDNA配列が完 全な重鎖および軽鎖ミニジーンを再構成するために使用され得るように、プラス ミドを構成した。 κ軽鎖プラスミド、pCK7-96は、κ定常領域およびポリアデニル化部位[配列ID No.11]を含む。それは、イニシエーターメチオニンの上流のHindIII部位を含む ５'プライマーで増幅されたκ配列が、HindIIIおよびBbsIで消化されることがで き、かつHindIIIおよびBbsIで消化されたpCK7-96へクローン化されて、ポリアデ ニル化部位と共に配列をコードする完全な軽鎖を再構成するように行われる。こ のカセットは、HindIII／NotIフラグメントとして分離され、転写プロモータ配 列にライゲートされて、細胞へのトランスフェクションのための機能的ミニジー ンを作ることができる。 γ１重鎖プラスミド、pCG7−96は、ヒトガンマ１定常領域およびポリアデニル 化部位[配列ID No.12]を含む。それは、イニシエーターメチオニンの上流のHind III部位を含む５'プライマーで増幅されたγ配列が、HindIIIおよびAgeIで消化 されることができ、かつHindIIIおよびAgeIで消化されたpCG7-96へクローン化さ れて、ポリアデニル化部位と共に配列をコードする完全なγ１重鎖を再構成する ように行われる。このカセットは、HindIII／SalIフラグメントとして分離され 、転写プロモータ配列にライゲートされて、細胞へのトランスフェクションのた めの機能的ミニジーンを作ることができる。 以下の実施例は、ハイブリドーマからのヌクレオチド配列データがどのように して、機能的Ｉｇ重鎖および軽鎖ミニジーンを再構成するために使用され得るか を説明する。ハイブリドーマ6G5および10C5からの重鎖および軽鎖転写物のヌク レオチド配列が、合成オリゴヌクレオチドの重複する組をデザインして、自然配 列と一致するアミノ酸コードキャパシティーを有する合成V配列を作るために使 用された。合成重鎖およびκ軽鎖配列（示されたHC6G5[配列I.D．No.61]およびL C6G5[配列I.D．No.62]は、３つの方法において自然配列と異なっていた：反復し たヌクレオチド塩基の糸が中断されてオリゴヌクレオ チド合成およびPRC増幅を促進する；最適翻訳開始部位がコザクの規則（Kozak、 1991年、J.Biol.Chem.266、19867−19870）に従って挿入された；およびHindIII 部位が翻訳開始部位の上流で操作された)。 Ａ.合成κ軽鎖 軽鎖PCR反応１ 以下のオリゴヌクレオチドをプールし：o-548[配列ID No.13]、o-549[配列ID No.14]、o-550[配列ID No.15]、o-551[配列IDNo.16]、o-552[配列ID No.17]、o- 563[配列ID No.18]、o-564[配列ID No.19]、o-565[配列ID No.20]、o-566[配列I D No.21]、o-567[配列ID No.22]、以下の２つのプライマーで増幅した：o-527[ 配列ID No.23]およびo-562[配列ID No.24]。 軽鎖PCR反応２ 以下のオリゴヌクレオチドをプールし：o-553[配列ID No.25]、o-554[配列ID No.26]、o-555[配列ID No.27]、o-556[配列IDNo.28]、o-557[配列ID No.29]、o- 558[配列ID No.20]、o-559[配列ID No.31]、o-560[配列ID No.32]、o-561[配列I D No.33]、o-562[配列ID No.24]、そして以下の２つのプライマーで増幅した：o -552[配列ID No.17]およびo-493[配列ID No.34]。軽鎖PCR反応３ 次に軽鎖PCR反応１および２の産物をまとめ、かつ次の２つのプライマーで増 幅した：o-493[配列ID No.34］およびo-527[配列IDNo.23]。 次に軽鎖PCR反応３の産物をHindIIIおよびBbsIで消化し、HindIII／BbsI消化p CK7−96[配列ID No.11]にクローン化して、pLC6G5[配列ID No.35]を生成した。Ｂ.合成γ重鎖 重鎖PCR反応１ 以下のオリゴヌクレオチドをプールし：o-528[配列ID No.36]、 o-529[配列ID No.37]、o-530[配列ID No.38]、o-531[配例IDNo.39]、o-532[配列 ID No.40]、o-543[配列ID No.41]、o-544[配列ID No.42]、o-545[配列ID No.43] 、o-546[配列ID No.44]、o-547[配列ID No.45]、そして以下の２つのプライマー で増幅した：o-496[配列ID No.46]およびo-542[配列ID No.47]。 重鎖PCR反応２ 以下のオリゴヌクレオチドをプールし：o-533[配列ID NO.48]、o-534[配列ID No.49]、o-535[配列ID No.50]、o-536[配列IDNo.51]、o-537[配列ID No.52]、o- 538[配列ID No.56]、o-539[配列ID No.53]、o-540[配列ID No.54]、o-541[配列I D No.55]、o-542[配列ID No.47]、ならびに、pCG7−96[配列ID No.12]の分離し た439 bp BbsIフラグメント、そして以下の２つのプライマーで増幅した：o-490 [配列ID No.57]およびo-520[配列ID No.58]。 重鎖PCR反応３ 次に重鎖反応１および２の産物をまとめ、かつ次の２つのプライマーで増幅し た：o-520[配列ID No.58]およびo-521[配列ID No.59]。 次に重鎖反応３の産物をHindIIIおよびAgeIで消化し、HindIII／AgeI消化pCG7 −96[配列ID No.12]にクローン化して、pHC6G5[配列ID No.60]を生成した。表24.ミニジーン構成において使用されるプライマー、べクターおよび産物 実施例43ヒト抗CD4モノクローナル抗体の非ヒト霊長類リンパ球への結合 動物モデルにおいて、ヒト抗CD4モノクローナル抗体の前臨床的毒物学および 薬物動力学的研究を行うことができるのは望ましい。いくつかの目的で、動物が 、モノクローナル抗体でそれが認識されるように、ヒトCD4と交差反応性のエピ トープを含むCD4を発現する非ヒト霊長類であることが更に望ましい。３匹の異 なる非ヒト霊長類種、チンパンジー、アカゲザル（リーサスモンキー）(rhesus monkey)およびカニクイザル（シノモルガスモンキー）(cynomolgus monkey)を、 ハイブリドーマ1E11、1G2、6G5、10C5および4D1からの５つの異なるヒト抗CD4モ ノクローナル抗体と交差反応性CD4エピトープについて試験した。チンパンジー 、アカゲザルおよびカニクイザルの全血から末梢血リンパ球を分離した。分離し た細胞を、これら５つのハイブリドーマのそれぞれからのヒト抗体（FITC-抗ヒ トIgGで検出した）およびPE-抗CD8またはPE-抗CD4で二重染色した。染色した細 胞を次に、フローサイトメトリーで分析して、ヒトモノクローナル抗体のそれぞ れが、これら３種の非ヒト霊長類のそれぞれからのリンパ球の表面の内因性CD4 に結合したかどうか決定した。５つの抗体のうちの４つ、1E11、6G5、10C5およ び4D1が、チンパンジーのCD4細胞に結合することがわかった。さらに、５つの抗 体のうちの４つ、1G2、6G5、10C5および4D1が、アカゲザルおよびカニクイザル の両方のCD4細胞に結合することがわかった。かくして、５つの抗体のうちの３ つ、6G5、10C5および4D1が、試験した３種の非ヒト霊長類のそれぞれにおけるCD 4細胞に結合する。 実施例44 モノクローナル抗体(mAb)が患者において非欠乏または免疫抑制的であるかど うかを確実に予言することができる、インビボでのアッセイは知られていない。 しかしながら、ヒトおよび非ヒト霊長類例えばチンパンジーおよびカニクイザル において、３つの異なるmAbの、不足する（または不足しない）能力の間に相関 関係が観察された（例えばM．ジョンカーら、Clin.Exp.Immunol.,93：301-307(1 993年）；およびJ.A.パウエルソンら、Transplantation、57:788-793(1994年)) 。したがって、非ヒト霊長類においてヒトmAbを用いて研究を行った。 この研究にチンパンジーを使用した。というのは、抗CD4 mAbのうちの１つ、1 E11はチンパンジーにおいてのみCD4を認識し、アカゲザルまたはカニクイザルで は認識しないからである。第２のmAb、 6G5は、チンパンジー、アカゲザルおよ びカニクイザルにおいてCD4を認識する。第３のmAb、1G2は、チンパンジーにお いてCD4を認識しないが、アカゲザルおよびカニクイザルにおいてCD4を認識する 。そのmAbはすでに、カニクイザルにおいてインビボで非欠乏であることが示さ れた。 末梢血中でCD4+Ｔ細胞数におけるヒトmAbの効果を調べるだけでなく、イン ビ ボでのＴ細胞機能におけるmAb投与の効果をまた評価した。これを行うために最 も受け入れられるやり方は、抗原例えばツベルクリンまたは破傷風トキソイドに 前感作された、かつ皮膚に過敏性反応を固定する動物を使用することである。 ３匹のオスのチンパンジーをこの研究に登録した。-７、-３および１日に、ベ ースライン全血試料を得た。１日に血液を採取した後、１匹のチンパンジー毎に 、2mg／kgにて、２つのヒトmAbのうちの１つ（1E11または6G5）を静脈内注入し た。第３のチンパンジーは、等体積／kgの緩衝液のみを受け入れた。血液を、注 入後30分、２時間、８時間、24時間および48時間に採取した。２日に、皮膚反応 性試験を行った。 以下の表25に示された結果は、1E11が末梢血リンパ球の一時的欠乏を引起し、 ほとんどのCD4+Ｔ細胞が欠乏されていることを明らかに証明している。6G5はリ ンパ球またはCD4+Ｔ細胞の欠乏を引起さなかったが、mAbの両方が、対照チンパ ンジーに比べて、破傷風トキソイドへの過敏性応答を阻害することができた。か くして、ヒトmAbは両方、インビボで免疫抑制的であるのが明らかであり、この 免疫抑制は、必ずしもＴ細胞欠乏を必要としない。表25.末梢チンパンジーリンパ球におけるヒトmAbの効果 前述した本発明の好ましい実施態様は、説明し、記載する目的のために示され たものである。それらは、網羅されていること、または本発明を開示された通り の形に限定することを意図せず、上記の教示に照らして、多くの修正および変形 が可能である。いくらかの変化および変形が請求の範囲内で行われ得ることが明 らかである。 すべての公開物および特許出願は、各公開物または特許出願が詳細にかつ個々 に示されたのと同じ程度に、参照することにより本明細書に組込まれている。一 般に挙げられた出願USSN 08/544,404（1995 年10月10日出願)、USSN 08/352,322（1994年12月７日出願)、USSN 08/209,741(1 994年３月９日出願)、USSN 08/165,699(1993年12月10日出願）およびUSSN 08/16 1,739（1993年12月３日出願）（これは、08/155,301（1993年11月18日出願）の 部分継続出願である)、国際特許出願WO92/03918、USSN 07/810,279(1991年12月1 7日出願)、USSN 07/853,408(1992年３月18日出願)、USSN 07/904,068(1992年６ 月23日出願)、USSN 07/990,860(1992年12月16日出願)、国際特許出願WO93/12227 およびUSSN08/053131（1993年４月26日出願）は、参照することにより本明細書 に組込まれている。 ここで、ヒト免疫グロブリンを発現するＢ細胞が発達を受け、マウス免疫系の 情況の下で抗原に応答するという結論を下したい。抗原反応性は免疫グロブリン 重鎖アイソタイプスイッチ及び可変領域体細胞突然変異を導く。我々は又、これ らのマウスからモノクローナルヒト配列抗体を得るのに従来のハイブリドーマ技 術を用いることができるということも実葵証してきた。従ってこれらのトランス ジェニック抗体は、ヒト標的抗原に対するヒト抗体の供給源である。 本発明の.トランスジェニックマウスを、下記の表Ｂ及ひＣから選択されたひ ト抗原により免疫する。トランスジェニックマウスは前記ヒト抗原に結合するヒ ト抗体を生産する。免疫されたトランスジェニックマウスからのＢ細胞を用いて 、前記選択されたヒト抗原に対するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドー マ を作製する。 表Ｂ ヒトＣＤ抗原 標示 認識される膜成分 CO1a gp49 CO1b gp45 CO1c gp43 C02 CD58(LFA-3)レセプタ、gp50 CO2R CO2活性Ｔに限定されるエピトープ C03 CO3−複合体（５鎖）、gp/p26，20．16 CO4 ClassII／HIVレセプタ、gp59 CO5 gp67 CO6 gp100 CO7 gp40 CO8 クラス１レセプタ、gp32．αα又はαβダイマー CO9 p24 CO10 gp100,CALLA CO11a. LFA-1，gp180/95 CO11b C3biレセプタ、gp155／95 CO11c gp150／95 COw12 p90-120 CO13 gp150 CO14 gp55 CD15 3-FAL，X−ハプテン CO16 FcRIII，gp50-65 COw17 ラクトシルセラマイド CO18 CD11a，b，ｃに対するβ鎖 CO19 gp95 CO20 p37／32 CO21 C3d／EBV-Rec．(CR2)， p140 CO22 gp135， ミエリン関運gpに対する相同性(MAG) CO23 FcERll, gp45-50 CO24 gp41／38 CD25 IL-2R β鎖、 gp55 CO26 gp120 CO27 p55(ダイマー) CO28 gp44 CO29 VLAβ−抗原 β１−鎖、Plt GPIIa CO30 gp120，Ki-1 CO3L gp140,Plt，GPIIa COw32 FcRII，GP40 C033 gp67 CO34 gp105-120 CO35 CR1 CO36 gp90，Plt GPIV CO37 gp40-52 CO38 p45 CO39 gp70-100 CO40 gp50,NGF レセプタに対して相同 CO41 Plt GPllb-IIIa 複合体及びGPllb CO42a Plt GPIX,gp23 COw42b Plt GPIb，gp135／25 CO43 ロイコンアリン、gp95 表Ｃ CO44 Pgp-1,gp80-95 CO45 LCA,T200 CO45RA 制限処理されたT200，gp220 CO45RB 制限処理されたT200 CO45RO 制限処理されたT200，gp180 CO46 膜コファクター蛋白質(MCP)、gp66／56 CO47 gp47-52，Ｎ−連結グリカン CO48 gp41，Pl−連結 COw49b VLA-α2鎖、Plt GPIa COw49d VLA-α4鎖、gp150 COw49f VLA-α6 鎖、 Plt GPIc COw50 gp148／108 COw51 VNR-α鎖 COw52 カンフ−１，gp21-28 CO53 gp32-40 CD54 lCAM-1 CO55 DAF （デシル保追因子） CO56 gp220./135，NKHl，N-CANのアイソ型 CO57 gp110,HNKI CO58 LFA-3，gp40-65 CO59 gp18-20 COw60 NeuAc-NeuAc-Gal- CO61 Integrin β3-,VNR-β鎖、Plt GPIIIa CO62 GMP-140(PAOGEM)，gp140 CO63 gP53 CO64 FcR4，gp75 COw65 セラミド-ドデカサッカライド 4C CO66 ホスホプロテインgp180-200 CO67 P100，Pl-連結 CO68 gp110 CO69 gp32／28,AIM COw70 Ki-24 CO72 gp43／39 CO73 p69 CO74 gp41／35／33 COw75 P53 CO76 gp85／67 CD77 グロボトリアアオシルセラミド（Gb3） COｗ78 上記表Ｂは不発明のトランスジェニックマウスを免疫し、そしてヒト抗原に対 するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを発生させるためのヒトの分 化のクラスター（cluste「of differentiation)（ＣＤ）の例のリストである。 上記表Ｃは、本発明のトランスジェニックマウスを免疫し、そしてヒト抗原に対 するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを発生させるためのヒトの非 −ＣＤ抗原の例のリストである。 不発明のトランスジェニックマウスを表Ｄから選択されたヒト−病原体又は抗 原により免疫する。トランスジェニックマウスば、ヒト病厘i本と結台する抗i本 を生産する。免疫されたトランスジェニックマウスからのＢ細胞を用いて、前記 選択されたヒト病原体に対するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを 作製する。 表Ｄ ＯＫＴ３ ＯＫＴ４ 腫瘍壊死因子 ＩｇＥ Ｈｅｒ−２ ＩＬ−２レセプタ （ｐ５５，ｐ７５） Ｌｙｍ−１ フィブリン α−フエトプロテイン Ｍｙ９ インシュリン インシュリンレセプタ 癌胎児性抗原（ＣＥＡ） グルコース転送蛋白質 β−インターフェロン γ−インターフェロン 組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＰＢＡ） α−インターフェロン 神経成長因子（ＮＧＦ） 内皮成長因子（ＥＧＦ） ＮＧＦレセプタ ＥＧＦレセプタ 血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ） ＰＧＤＦレセプタ インシュリン様成長因子（ＩＧＦ−１） ＩＧＦ−１レセプタ 毛様体向神経因子（ＣＮＦＦ） ＣＮＦＦレセプタ 脳由来向神経因子（ＢＤＮＦ） ＢＤＮＦレセプタ 神経分化因子（ＮＤＦ） ＮＤＦレセプタ ヘパリン結合向神経因子（ＨＢＮＦ） ＨＢＮＦレセプタ 形質転換成長因子α（ＴＧＦ−α） ＴＧＦ−αレセプタ 形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β） ＴＧＦ−βレセプタ 骨成長因子−１ （ＢＭＰ−１，ＯＭＰ−１） ＢＭＰ−１レセプタ 骨成長因子−２（ＢＭＰ−２，ＯＭＰ−２） ＢＭＰ−２レセプタ インターロイキン−１（ＩＬ−１） ＩＬ−１レセプタ インタ−ロイキン−３（ＩＬ−３） ＩＬ−３レセプタ インタ−ロイキン−４（ＩＬ−４） ＩＬ−４レセプタ インターロイキン−６（ＩＬ−６） ＩＬ−６レセプタ インターロイキン−８（ＩＬ−８） ＩＬ−８レセプタ インタ−ロイキン−１２（ＩＬ−１２） ＩＬ−１２レセプタ インタ−ロイキン−１３（ＩＬ−１３） ＩＬ−１３レセプタ 顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ） 顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ） 幹細胞因子（ＳＣＧＦ） ＩＬ−１β転換酵素 ＧＭ−ＣＳＦレセプタ Ｇ−ＣＳＦレセプタ スロンモモシュリン 補体因子 補体レセプタ プロテインＣ カドヘリン ギャップジャンクションプロテイン ＵＬＡ−４ ＩＣＡＭ−１ ＬＦＡ−３ ＥＬＡＭ Ｐ−セレクチン Ｅ−セレクチン 多剤耐性蛋白質（ＭＤＲ） 心房性ナトリウム利尿ペプチド Ｔ−細胞レセプタ（ＴＣＲ）ペプチド サブスタンスＰ アンジオテンシン換換酵素（ＡＣＥ） 共通急性リンパ球性白血病抗原（ＣＡＬＬＡ） Ｂ１６（黒色腫抗原） じゅう毛性刺激ホルモン（ＦＳＨ） 黄体形成ホルモン（ＬＨ） 上記表Ｄは、本発明のトランスジェニックマウスを免疫し、そしてヒト病原体 に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを発生せしめるための、 ヒト病原体及びその抗原の例のリストである。 表Ｅ ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２ウィルス抗原（ｇｐ１２０，ｇｐ１６０等） ＨＩＶプロテアーゼ ＨＩＶ ＲＮアーゼＨ サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）及びＣＭＶウィルス抗原（ｇＨ，ｇｐ等） ヒトＴ−細胞向リンパ性ウィルス−１（ＨＴＬＶ−２）及びその表面抗原 ヒトＴ−細胞向リンパ性ウィルス−２（ＨＴＬＶ−２）及び表面抗原 肝炎Ａウィルス及びウィルス抗原 肝炎Ｂウィルス及びウィルス抗原（例えば、HBsAg，HBcAg，HBeAg） 肝炎Ｃウィルス及びウィルス抗原 肝炎Ｄウィルス及びウィルス抗原 肝炎Ｘウィルス及びウィルス抗原 ヒトパピローマウィルス（ＨＰＶ）及びウィルス抗原 バリセラ・ゾスター（Varicella zoster）ウィルス及びウィルス抗原 単純ヘルペスＩウィルス及びウィルス抗原 単純ヘルペスllウィルス及びウィルス抗原 エボラ（又はアハブルグ）ウィルス及びウィルス抗原 日本脳炎Ｂウィルス（ＪＢＥ）及びウィルス抗原 カリホルニア脳炎ウィルス及びウィルス抗原 灰白髄炎ウィルス及びウィルス抗原 コクサッキ−ウィルス及びウィルス抗原 リノウィルス及びウィルス抗原 狂犬病（ラブドビリデー科）ウィルス及びウィルス抗原 インフルエンザ（オルトミキソウィルス科）ウィルス及びウィルス抗原 パラミキソウィルス科(パラインフルエンザ１〜５、mumps)ウィルス及び抗原 麻疹ウィルス及びウィルス抗原 呼吸シンキチアルウィルス（ＲＳＶ）及びウィルス抗原 バリオラウィルス（天然痘）及びウィルス抗原 アデノウィルス（マスタデノウィルス）及びウィルス抗原 エプスタイン−バール（単該症）ウィルス及びウィルス抗原 プラスモジウム ファルシパルム(Plasmodiumfalciparum)及びウィルス抗原 コリネバクテリウム・ジフテリア及び表面抗原及び毒素 コリネバクテリウム・ヘモリティクム及び表面抗原及び毒素 サルモネラ・スペーシス及び表面抗原及びＬＰＳ シゲラ・スペーシス及び表面抗原及びＬＰＳ プロテウス・ミラビリス・スペーシス及び表面抗原及びＬＰＳ シュードモナス・アエルギノーサ及び表面抗原 ビブリオ・コリラ及び表面抗原及び毒素 ビブリオ・パラヘモリティクス及び表面抗原及び毒素 ナイゼリア・メニンジティディス及び表面抗原 ナイゼリア・ゴノルホエア及び表面抗原 バジルス・アンスラシス及び表面抗原 クロストリジウム ボツリヌム及び表面抗原及び毒素 クロストリジウム・テタニ及び表面抗原及び毒素 クロストリジウム・ペルフリンゲンス及び表面抗原及び毒素 ヘモフィルス・インフルエンザ及び表面抗原 トレコネマ・パリドウム及び表面抗原 リステリア モノシトゲネス及び表面抗原 ノカルジア・アステロイデス及び表面抗原 ニューモシスティス・カルニー及び表面抗原 パステウレラ・ロイコトキシン スタフィロコッカス・エンテロトキシン及びヒアルロニダーゼ及びコアギュラ −ゼ ストレプトコッカス（β−溶血性）及びヘモリシン及びストレプトキナーゼ グラム陰性リポポリサッカライド複合体（ＬＰＳ） 上記の表Ｅは、不発明のトランスジェニックマウスを免疫し、そしてヒト病原 体に対するモノクロ−ナル抗体を生産するハイブリドーマを発生させるためのヒ ト病原体及びそれらの抗原の例のリストである。 本発明を理解の明確化の目的で例示によって幾分詳細に記截してきたが、請求 の範囲内で幾つかの変更および改良を行えることは明らかであろう。 図面の簡単な説明 図１ 図１は、再配列されていないゲノムＤＮＡ中および再配列された免疫グロプ リン重鎖遣伝子から発現されるｍＲＮＡ中の相補性決定領域ＣＤＲ１，ＣＤＲ２ およびＣＤＲ３、並びにフレームワーク領域ＦＲ１，ＦＲ２，ＦＲ３およびＦＲ ４を表す。 図２ 図２はヒトλ鎖鎮遺伝子座を表す。 図３ 図３はヒトκ鎖遺伝子座を表す。 図４ 図４はヒト重鎖遺伝子座を表す。 図５ 図５は、ヒトγ３およびγ１定常領域を含有する２５kb断片に次いでラット鎖 ３′エンハンザ−配列を含む７００bp断片に連結された再配列されたＩｇＭ遺伝 子を含有するトランスジェン構成物を表す。 図６ 図６は、生体内相同キ目同組換えによって軽鎖トランスジェンを形成させるた めに使うことができる断片を表す、ヒトκ鎖遺伝子座の制限地図である。 図７ 図７はｐＧＰ１の作製を示す。 図８ 図８はｐＧＰ１中に含まれるポリリンカ−の構成を示す。 図９ 図９は、本発明のヒト重鎖トランスジェンを作製するのに使う断片を示す。 図１０ 図１０はｐＨＩＧ１およびｐＣＯＮ１の作製を示す。 図１１ 図１１は、ｏＲＥＧ２を形成させるためにｐＲＥ３（ラットエンハンサー３′ ）中に挿入されるヒトＣγ１断片を示す。 図１２ 図１２は ｐＨＩＧ３′およびｐＣＯＮの作製を示す。 図１３ 図１３は、本発明のトランスジュンの作製に使われるヒトＤ領域セグメントを 含む断片を示す。 図１４ 図１４は、ｐＨＩＧ２（Ｄセグメント含有プラスミド）の作製を示す。 図１５ 図１５は、本発明のトランスジェンの作製に使われるヒトＪκおよびヒトＣκ 遺伝子セグメントを包含する断片を示す。 図１６ 図１６はｐＥμの構造を示す。 図１７ 図１７はｐＫａｐＨの作製を示す。 図１８ 図１８は、マウスの内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を機能的に破壊するた めのポジティブ−ネガティブ選別ベクターの作製を示す。 図１９ 図１９は、マウスの内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を機能的に破壊するた めのポジティブ−ネガティブ選択ベクターの作製を示す。 図２０ 図２０は、マウスの内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を機能的に破壊するた めのポジティブ−ネガティブ選択ベクターの作製を示す。 図２１ 図２１は、マウスの内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を機能的に破壊するた めのポジティブ−ネガティブ選択ベクターの作製を示す。 図２２ 図２２は、マウスの内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を機能的に破壊するた めのポジティブ−ネガティブ選択ベクターの作製を示す。 図２３ 図２３は、マウスの内因性免役グロブリン軽鎖遺伝子座を機能的に破壊するた めのポジティブ−ネガティブ選別ベクターの作製を示す。 図２４ 図２４は、マウスの内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を機能的に破壊するた めのポジティブ−ネガティブ選択ベクターの作製を示す。 図２５ 図２５はκ軽鎖標的用ベクターの構造を示す。 図２６ 図２６はマウス重鎖標的用べクターの構造を示す。 図２７ 図２７はマウス重鎖標的用べクターの構造を示す。 図２８ 図２８はべクターｐＧＰｅの地図を示す。 図２９ 図２９はベクターｐＪＭ２の構造を示す。 図３０ 図３０はベクターｐＣＯＲ１の構造を示す。 図３１ 図３１はｐＩＧＭ１，ｐＨＣ１およびｐＨＣ２のトランスジェン構成物を示す 図３２ 図３２はｐγｅ２の構造を示す。 図３３ 図３３はｐＶＧＥ１の構造を示す。 図３４ 図３４はｐＨＣ１トランスジェニックマウス中でのヒトＩｇ発現のアッセイ結 果を示す。 図３５ 図３５はｐＪＣＫ１の構造を示す。 図３６ 図３６は合成重鎖可変領域の作製を示す。 図３７ 図３７は、重鎖小遺伝子座構成物ｐＩＧＭ1，ｐＨＣ１およびｐＨＣ２の略図 である。 図３８ 図３８は、重鎖小遺伝子座構成物ｐＩＧＧ１並びにκ軽鎖小遺伝子座構成物ｐ ＫＣ１．ｐＫＶｅ１およびｐＫＣ２の略図である。 図３９ 図３９は、機能的に再配列された軽鎖遺伝子を再構成するための方策を表す。 図４０ 図４０は血清ＥＬＩＳＡ結果を表す。 図４１ 図４１は、８匹のトランスジェニックマウスからの血清のＥＬＩＳＡアッセイ の結果を表す。 図４２ 図４２はプラスミドｐＢＣＥ１の略図である。 図４３ 図４３は、ＫＬＨ−ＤＮＰ（４３Ａ）．ＫＬＨ（４３Ｂ）およびＢＳＡ−ＤＮ Ｐ（４３Ｃ）に特異的なＩｇＧおよびＩｇＭレベルを測定することによる、ＫＬ Ｈ−ＤＮＰに対する本発明のトランスジェニックマウスの免疫応答を表す。 図４４ 図４４は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に結合しそしてヒトμ鎖を含んで成る 抗体の存在を証明するＥＬＩＳＡデータを示す：各パネルは、免疫処置後の指示 日においてマウスから得られたプールした血清試料からの逆数系列希釈を示す。 図４５ 図４５は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に結合しそしてヒトγ鎖を含んで成る 抗体の存在を証明するＥＬＩＳＡデータを示す：各パネルは、免疫処置後の指示 日においてマウスから得られたプールした血清試料からの逆数系列希釈を示す。 図４６ 図４６は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）によって免疫処置されたＨＣ１トラン スジェニックマウスのリンパ系組織から得られたｍＲＮＡより生成された２３個 の無作為選択ｃＤＮＡの整列された可変領域配列を、生殖細胞トランスジェン配 列（最上行）に比較して示す。各行において、生殖細胞配列に対するヌクレオチ ド変化は推定アミノ酸配列中の変化の上に表示される（もしあれば）。重鎖ＣＤ Ｒ１．ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に相当する領域が示されている。生殖細胞によっ てコードされないヌクレオチドは大文字で示されている。推定アミノ酸配列は、 慣例的な一文字表記法を使ってヌクレオチド配列の下に与えられている。 図４７ 図４７は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）によって免疫処置されたＨＣ１トラ ンスジェニックマウスのリンパ系組織から得られたｍＲＮＡより生成された２３ 個の無作為選択ｃＤＮＡの整列された可変領域配列を、生殖細胞トランスジェン 配列（最上行）に比較して示す。各行において、生殖細胞配列に対するヌクレオ チド変化は推定了ミノ酸配列中の変化の上に表示される（もしあれば）。重鎖Ｃ ＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に相当する領域が示されている。生殖細胞によ ってコードされないヌクレオチドは大文宇で示されている。推定アミノ酸配列は 、慣例的な一文字表記法を使ってヌクレオチド配列の下に与えられている。 図４８ 図４８は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）によって免疫処置されたＨＣ１トラン スジェニックマウスのリンパ系組織から得られたｍＲＮＡより生成された２３個 の無作為選択ｃＤＮＡの整列された可変領域配列を、生殖細胞トランスジェン配 列（最上行）に比較して示す。各行において、生殖細胞配列に対するヌクレオチ ド変化は推定アミノ酸配列中の変化の上に表示される（もしあれば）。重鎖ＣＤ Ｒ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に相当する領域が示されている。生殖細胞によっ てコードされないヌクレオチドは大文字で示されている。推定アミノ酸配列は、 慣例的な一文字表記法を使ってヌクレオチド配列の下に与えられている。 図４９ 図４９は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）によって免疫処置されたＨＣ１トラン スジェニックマウスのリンパ系組織から得られたｍＲＮＡより生成された２３ 個の無作為選択ｃＤＮＡの整列された可変領域配列を、生殖細抱トランスジェン 配列（最上行）に比較して示す。各行において、生殖細胞配列に対するヌクレオ チド変化は推定アミノ酸配列中の変化の上に表示される（もしあれば）。重鎖Ｃ Ｄ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に相当する領域が示されている。生殖細胞によっ てコードされないヌクレオチドは大文字で示されている。推定アミノ酸配列は、 慣例的な一文字表記法を使ってヌクレオチド配列の下に与えられている。 図５０ 図５０は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）によって免疫処置されたＨＣ１トラン スジェニックマウスのリンパ系組織から得られたｍＲＮＡより生成された２３個 の無作為選択ｃＤＮＡの整列された可変領域配列を、生殖細胞トランスジェン配 列（最上行）に比較して示す。各行において、生殖細胞配列に対するヌクレオチ ド変化は推定アミノ酸配列中の変化の上に表示される（もしあれば）。重鎖ＣＤ Ｒ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に相当する領域が示されている。生殖細胞によっ てコードされないヌクレオチドは大文字で示されている。推定アミノ酸配列は、 慣例的な一文字表記法を使ってヌクレオチド配列の下に与えられている。 図５１ 図５１は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）によって免疫処置されたＨＣ１トラン スジェニックマウスのリンパ系組織から得られたｍＲＮＡより生成された２３個 の無作為選択ｃＤＮＡの整列された可変領域配列を、生殖細胞トランスジェン配 列（最上行）に比較して示す。各行において、生殖細胞配列に対するヌクレオチ ド変化は推定アミノ酸配列中の変化の上に表示される（もしあれば）。重鎖ＣＤ Ｒ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に相当する領域が示されている。生殖細胞によっ てコードされないヌクレオチドは大文字で示されている。推定了ミノ酸配列は、 慣例的な一文字表記法を使ってヌクレオチド配列の下に与えられている。 図５２ 図５２は、Ｖκ遺伝子セグメントを含有するvk65.3と命名されたヒトDNA断片 のヌクレオチド配列を示す；Ｖκコード領域推定アミノ酸配列も示される；スプ ライシング配列と組換えシグナル配列（ヘプタマー／ノナマー）は枠内に示され る。 図５３ 図５３はＶκ遺伝子セグメントを含有するｖｋ６５．５と命名されたヒトＤＮ Ａ断片のヌクレオチド配列を示す；Ｖκコード領域推定アミノ酸配列も示される ；スプライシング配列と組換えングナル配列（ヘプタマー／ノナマー）は枠内に 示される。 図５４ 図５４は、Ｖκ遺伝子セグメントを含有するｖｋ６５．８と命名されたヒトＤ ＮＡ断片のヌクレオチド配列を示す；Ｖκコード領域推定アミノ酸配列も示され る；スプライシング配列と組換えシグナル配列（ヘプタマー／ノナマー）は枠内 に示される。 図５５ 図５５は、Ｖκ遺伝子セグメントを含有するｖｋ６５．１５と命名されたヒト ＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を示す；Ｖκコード領域推定アミノ酸配列も示さ れる；スプライシング配列と組換えシグナル配列（ヘプタマー／ノナマー）は枠 内に示される。 図５６ 図５６は、同時に注入された２つの重複断片の間での相同組換ええによる軽鎖 小遺伝子座の形成を示す。 図５７ 抗原結合の特異性を示すＣＥＡ及び非ＣＥＡ抗原と反応性あるモノクロ−ナル 抗体についてのＥＬＩＳＡの結果を示す。 図５８ ヒトＶＤＪ及びフウス恒常領域配列を有する写しを増幅するべくＰＣＲにより 増幅された１０個のＣＤＮＡのＤＮＡ配列を示す。 図５９ ヒト重鎖ミニ遺伝子座トランスジーン及びヒトκミニ遺伝子座トランスジーン の両方を支持するマウスから得た血清のさまざまな希釈度に対するＥＬＩＳＡの 結果を示している；マウスはヒトＣＤ４で免疫化されたものであり、示されてい るデータは、ヒトＣＤ４と反応性をもちそれぞれヒトκ、ヒトμ、又はヒトγエ ピトープを有する抗体を表わしている。 図６０ ３つのマウス遺伝子型についてＦＡＣＳにより決定される、ヒトμ又はマウス μについてのリンパ球染色の相対的分布を示す。 図６１ ３つのマウス遺伝子型についてＦＡＣＳにより決定される、ヒトκ又はマウス κについてのリンパ球染色の相対的分布を示す。 図６２ ３つのマウス遺伝子型についてＦＡＣＳにより決定される、マウスλについて のリンパ球染色の相対的分布を示している。 図６３ ４つのマウス遺伝子型についてＦＡＣＳにより決定される、マウスλ又はヒト κについてのリンパ球染色の相対的分布を示す。 図６４ 免疫化されていない0011マウスの血清中のヒトμ、ヒトγ、ヒトκ、マウスμ 、マウスγ、マウスκ、及びマウスλ鎖の量を示す。 図６５ さまざまな遺伝子型の免疫化されていない００１１マウスの血清中のヒトμ、 ヒトγ、ヒトκ、マウスμ、マウスγ、マウスκ、及びマウスλ鎖の量を示す散 乱プロットを示している。 図６６ ００１１マウスにおける抗ヒトＣＤ４タイターを示す。 図６７ ヒトＣＤ４での００１１マウスの免疫化に続く免疫化後３週間目又は７週間目 に採取した血清中の抗−ＣＤ４抗体内のヒトμ、ヒトγ、又はヒトκ鎖を含む抗 休力価を示す。 図６８ ヒト重鎖ミニ遺伝子座トランスジーンＰＨＣ１及びＰＨＣ２、反び軽鎖ミニ遺 伝子座トランスジーンｐＫＣ１，ｐＫＣ１ｅ及び指示された部位でＰＫＣ２とＣ ｏ４の間の相同組換えにより作り出された軽鎖ミニ遺伝子座トランスジーンの概 略図である。 図６９ Storb et al．（1989）前掲書中、からとられた、ネズミラムダ軽鎖遺伝子座 の連鎖地図を示す。点刻囲みは偽遺伝子を表わす。 図７０ 相同遺伝子ターゲティングによるマウスλ遺伝子座の失活を概略的に表わして いる。 図９１ 遺伝子、例えば重鎖定常領域遺伝子を欠失するための相同組換えターゲティン グトランスジーンの構造を概略的に示す。 図７１ 「免疫グロブリン遺伝子」、Honjo，T，AIt，FW，及びRabbits TH（eds）Acad emic Press，NY（1989）p129 から取られたＢＡＬＢ／ｃマウス重鎖遺伝子座の 地図を示す。構造遺伝子は上部ラインに閉じた囲みで示されている。第２及び第 ３のラインは表示された記号を伴って制限部位を示している。 図７２ マウス重鎖遺伝子座α恒常領域遺伝子のヌクレオチド配列を示す。 図７３ マウス重鎖遺伝子座Ｊ4遺伝子内に２つのbpフレームソフトを導入するための フレームシフトベクター（プラスミドＢ）の構成を示す。 図７４ 高度免疫中のトランスジェニック動物のアイソタイプ特異応答を示す。反応性 のヒトμ及びγ１の相対的レベルは、比色ＥＬＩＳＡ検定法（ｙ−軸）によって 示されている。我々は、フロイントアジュバント中のＣＥＡの腹腔内注入により 、同型接合のＪＨＤバックグラウンド内で３匹の生後７〜１０週目の雄のＨＣ１ 系統５７のトランスジェニック動物（＃１９９１，＃２３５６，＃２３５７）を 免疫化した。図は、ＣＥＡでコーティングされたマイクロタイターウエルに対す るプールした血清（各注入に先立って収集したもの）の２５０倍希釈液の結合を 描いている。 図７５ クラススイッチ組換えにより媒介されたトランスジーンでコードされたγ１ア イソタイプの発現を示す。 ２つの異なるヒトγ１発現ハイブリドーマ内の組込まれたトランスジーンのゲ ノミック構造は、μ及びγ１スイッチ領域の間の組換えと一貫性をもつ。図７５ は、３つのトランスジーン発現ハイブリドーマから分離したＰａｃ１／Ｓｆｉ１ 消化されたＤＮＡのサザンブロットを示す。左から右へ：クローン９２−０９Ａ −５Ｈ１−５、ヒトγ１+／μ-；クローン９２−９０Ａ−４Ｇ２−２、ヒトγ１+ ／μ-；クローン９２−０９Ａ−４Ｆ７−Ａ５−２、ヒトγ１-．μ+。３つのハ イブリドーマは全て、ＨＣ１−５７の組込みについて半接合でＪＨＤ分断につい て同型接合の生後７カ月のマウス（マウス＃１９９１）から誘導される。プロッ トは、ヒトγ１スイッチ領域の３′半部分にまたがる２．３kbのＢｇIII／Ｓｆ ｉＩ［ ＤＮＡフラグメントから誘導されたブローブでハイブリッド形成される 。μ発現ハイブリドーマの中にはいかなるスイッチ産物も見い出せないが、２つ のγ１発現ハイブリドーマ９２−０９Ａ−５Ｈ１−５及び９２−０９Ａ−４Ｇ２ −２は、それぞれ、５．１kb及び５．３kbのＰａｃＩ／ＳｆｉＩ［フラグメント を結果としてもたらすスイッチ産物を含む。 図７６ 図７６は、μからγ１へのクラススイッチを産生させることのできる考えられ る２つの欠失メカニズムの図である。ヒトμ遺伝子には、μを決失するべく組換 えできる４００bpの直接的反復（σμ及びΣμ）がフランキングしている。この メカニズムによるクラススイッチングはつねに６．４kbι11,;bのＰａｃ１／Ｓ ｆｉＩフラグメントを生成するが、一方μ及びγ１スイッチ領域の間の組換えに よるクラススイッテは、個々のスイッチ事象の間でサイズの変動を示しながら、 ４kbと７kbの間のＰａｃＩ／ＳｆｉＩフラグメントを生成する。図７５で検討さ れている２つのγ１発現ハイブリドーマは、μ及びγ１スイッテ領域の間で組換 えを受けていると思われる。 図７７ トランススイッチにより生成されたキメラヒト／マウス免疫グロブリン重鎖を 示す。トランススイッチ産物のｃＤＮＡクローンは、高度免疫されたＨＣ１トラ ンスジェニック−ＪＨＤマウス（＃２３５７；動物及び免疫計画の説明について は図７４に対する凡例を参照のこと）から分離した脾臓とリンパ筋のＲＮＡの混 合物の逆転写及びＰＣＲ増幅により生成された。１０個の無作為にとり出したク ローンの部分的ヌクレオチド配列が示されている。小文字は、コードされた生殖 細胞系を表わし、大文字は、既知の生殖細胞系配列に割当てることのできないヌ クレオチドを示す。これらは体細胞突然変異、Ｎヌクレオチド又は切形Ｄセグメ ントであることが考えられる。両面タイプはマウスγ配列を表わす。 図７８および図７９ 再配置されたＶＨ２５１トランスジーンが高度免疫されたものの中での体細胞 突然変異を受けることを示している。 図７８では抗原に対する一次反応を図７９では二次反応を示すＣＨ１系統２６ のマウスからのＩｇＧ重鎖可変領域ｃＤＮＡクローンの部分的ヌタレオチド配列 。生殖細胞系配列が上部に示され；生殖細胞系からのヌクレオチド変更は、各ク ロ−ンについて表わされている。１つの周期は、生殖細胞系配列との同一性を示 し、大文字はいかなる生殖細胞系源も同定されないことを示している。配列は、 Ｊセグメントの用途に応ってまとめられている。Ｊセグメントの各々の生殖細胞 系配列が示されている。ＣＤＲ３配列円の小文字はＨＣ１トランスジーン円に含 まれている既知のＤセグメントに対丁する同一性を表わす。割当てられたＤセグ メントは、各配列の最後に表されている。割当てされていない配列は、Ｎ領域の 付加又は体細胞突然変異から誘導されうる。又は、場合によって、これらな単に あまりにも短かすぎて既知のＤセグメントから無作為のＮ個のヌクレオチドを区 別できないこともある。図７８の一次応答：１３の無作為にとり上げたＶＨ２５ １−γ１ｃＤＮＡクローン。生後４週間の雌のＨＣ１系統２６−ＪＨＤマウス（ ＃２５９９）にＫＬＨ及び完全フロイントアジュバントを一回だけ注入した。５ 日後に脾臓細胞ＲＮＡを分離した。Ｖセグメントてグメント内の体細胞突然変異 の電体的頻度は０．０６％（２／３，１９８bp）である。図７９の二次応答：１ ３の無作為 にとり上げたＶＨ２５１−γ１ｃＤＮＡクローン。生後２カ月の雌ＨＣ１系統２ ６−ＪＨＤマウス（＃３２０４）に対して１カ月にわたり３回ＨＥＬ及びフロイ ントアジュバントを注入した（一次注入は完全アジュバントで、又追加免疫は１ 週間目と３週間目に不完全アジュバントで）；４カ月後に脾臓とリンパ節のＲＮ Ａを分離した。Ｖセグメント内での体液性突然変異の全体的頗度は１．６％（５ ２／３．１９８bp）。 図８０および図８１ 広範な体細胞突然変異がγ１配列に制限されていることを示している：体細 胞突然変異及びクラススイッチはＢ細胞の同じ集団で発生する。ＣＥＡに対し高 度免疫された（免疫化計画については図７４参照）ＨＣ１系統５７のトランスジ ェニック−ＪＨＤマウス（＃２３５７）の脾臓及びリンパ節細胞から分離したＶ Ｈ２５１ ｃＤＮＡクロ−ンの部分的ヌクレオチド配列。図８０：ＩｇＭ：２３ の無作為にとり上げたＶＨ２５１−μｃＤＮＡクロ−ン。ＣＤＲｓ１及び２の周 囲残基を含む１５６bpのセグメントのヌクレオチド配列。体細胞突然変異の全体 的レベルは０．１％（５／３，７４４bp）である。 図８１：ＩｇＧ：２３の無作為にとり上げたＶＨ２５１−γ１ｃＤＮΛクロ −ン。ＣＤＲｓ１〜３及び周囲残基を含むセグメントのヌクレオチド配列。Ｖセ グメント内の体細胞突然変異の全体的頻度は１．１％（６５／５．６５８bp）で ある。図８０中のμ配列との比較のため；最初の１５６個のヌクレオチドに対す る突然変異頻度は１．１％（４１／３，５８８bpである）。記号の説明について は、図７８及び７９の凡例を参照のこと。 図８２ ＶＨ５１Ｐ１及びＶＨ５６Ｐ１が、免疫化を受けていないマウス内の広範な体 細胞突然変異を示す。生後９週目の免疫化を受けていない雌のＨＣ２系統２５５ ０のトランスジェニック−ＪＨＤマウス（＃５２５０）からのＩｇＧ重鎖可変領 域ｃＤＮＡクローンの部分的ヌクレオチド配列。１９ＶＨ５６ｐ１でグメントで の体細胞突然変異の全休的頻度は、２．２％（１０１／４，６７４bp）である。 単一のＶＨ５１ｐ１セグメント内の体細胞突然変異の全体的頻度は２．０％（５ ／２４６bp）である。記号の説明については図７８及び７９に対する凡例を参照 のこと。 図８３ 分析された内因性Ｉｇ遺伝子座をもつ２重トランスジェニックマウスは、ヒト ＩｇＭκ陽性Ｂ細胞を含んでいる。異なる遺伝子型をもつ４匹のマウスの脾臓か ら分離された細胞のＦＡＣＳ。左欄：対照マウス（＃９９４４、生後６週目の雌 、ＪＨ÷／−，ＪＣκ÷／−；異型接合野生型マウス重鎖及びκ−軽鎖遺伝子座 、非トランスジェニック）。第２欄：ヒト重鎖トランスジェニック（＃９８７７ 、生後６週目の雌ＪＨ−／−，ＪＣκ−／−，ＨＣ２系統２５５０±；分断され たマウスの重鎖及びκ−軽鎖遺伝子座について同型接合で、ＨＣ２トランスジー ンについて半接合）。第３欄：ヒトκ−軽鎖トランスジェニック（＃９８７８、 生後６週目の雌ＪＨ−／−，ＪＣκ−／−，ＫＣｏ４系統４４３７÷；分断され たマウスの重鎖及びκ−軽鎖遺伝子座について同型接合で、ＫＣｏ４トランスジ ーンについて半接合）。右欄：２重トランスジェニック（＃９８７９、生後６週 目の雌、ＪＨ−／−ｍ ＪＣκ−／−，ＨＣ２系統２５５０÷，ＫＣｏ４系統４ ４３７÷；分断されたマウスの重鎖及びκｋ−軽鎖遺伝子座について同型接合で 、ＨＣ２及びＫＣｏ４トランスジーンについて半接合）。上段：マウスλ軽鎖（ ｘ軸）及びヒトκ軽鎖（ｙ軸）の発現について染色された脾細胞。第２段：ヒト μ重鎖（ｘ軸）及びヒトκ軽鎖（ｙ軸）の発現について染色された脾細胞、第３ 段：マウスのμ重鎖（ｘ軸）及びマウスのκ軽鎖（ｙ軸）の発現について染色さ れた脾細胞。下段：マウスＢ２２０抗原の発現について染色された脾細抱のヒス トグラム（対数螢光：Ｘ軸：細胞数：ｙ軸）。２つの色図版の各々について、表 示された象眼の各々の中の細胞の相対数は、ヨウ化プロピジウム染色及び光散乱 に基づくｅ−パラメータゲートの百分率として与えられている。下段に表示され ている試料の各々におけるＢ２２０÷細胞の分画は、リンパ球光散乱ゲートの百 分率として与えられている。 図８４ ２重トランスジェニックマウスの血清中の分泌された免疫グロブリンレベル。 内因性重鎖及びκ−軽鎖遺伝子座分断について同型接合の１８の個々のＨＣ２／ ＫＣｏ４ ２重トランスＡジェニックマウスからのマウスγ及びλ及びヒトμ． γ 及びκ。マウス：（÷）ＨＣ２系統２５５０（組込み１回につき最高５つのＨＣ ２コピー）、ＫＣｏ４系統４４３６（組込み１回につき１〜２つのＫＣｏ４コピ ー）；（〇）ＨＣ２系統２５５０，ＫＣｏ４系統４４３７（組込み一回につき最 高１０個のＫＣｏ４コピ）；（×）ＨＣ２系統２５５０，ＫＣｏ４系統４５８３ （組込み一回につき最高５つのＫＣｏ４コピー）；（□）ＨＣ２系統２５７２（ 組込み１回につき３０〜５０のＨＣ２コピー、ＫＣｏ４系統４４３７；（△）Ｈ Ｃ２系統５４６７（組込み１回につき２０〜３０個のＨＣ２コピー、ＫＣｏ４系 統４４３７。 図８５および図８６ ヒト抗原に対するヒト抗体応答を示す。図８５：組換え型ヒト可溶性ＣＤ４に 対する一次応答。ヒトＩｇＭ及びヒトκ軽鎖のレベルが、４つの２重トランスジ ェニックマウスからの出血前（○）及び免役化後（●）の血清について報告され ている。 図８６：インヒボでヒトＩｇＧに対するスイッチが起こる。非特異的交叉反応 性を阻害するべく１．５μ／mlの余分なＩｇＥ，κ及び１％の正常なマウス血清 の存在下で使用されたベルオキシダーゼ接合されたポリクローナル抗ヒトＩｇＧ を用いて、ヒトＩｇＧ（円）を検出した。ヒトκ軽鎖（正万形）は、１％の正常 なマウスの血清の存在下でベルオキシダーゼ接合されたポリクローナル抗ヒトκ 試薬を用いて、検出した。１匹のマウス（＃９３４：ＨＣ２系統２５５０．ＫＣ ｏ４系統４４３６）からの代表的結果が示されている。各々の点は、重複ウエル の平均からバックグラウンド吸収を引いたものを表わしている。 図８７ ヒトＣＤ８＋リンパ球からヒトＣＤ４＋リンパ球を弁別するハイブリドーマ上 清を用いたヒトＰＢＬのＦＡＣＳ分析を示す。 図８８ トランスジェニックマウスの血清内のヒトα−ＣＤ４ＩｇＭ ａｎｆ ＩｇＧ を示す。 図８９ トランスジェニックマウスのα−ヒトＣＤ４ハイブリドーマモノクローナル、 ２Ｃｌｌ−８をＲＰＡ−ＴＡ及びＬｅｕ−３Ａモノクローナルと比較する競合結 合実験を示す。 図９０ 培養された２Ｃ１１−８ハイブリドーマのＩｇ発現についての産生データを示 す。 図92は、HCo7トランスジーンを構成するプラスミド挿入部 （inserts）の重 複する組を示す。 図93Aは、pGP2bプラスミドベクターのヌクレオチド配列および制限酵素地図を 示す。 図93Bは、pGP2bプラスミドベクターの制限酵素地図を示す。 図94（部分ＡおよびＢ）は、大きいトランスジーンを組み立てるためのクロー ニング法を示す。 図95は、大きな挿入部が、高複写（high-copy）pUC誘導プラスミドにおいて不 安定であることを示す。 図96は、ファージP1クローンP1-570を示す。挿入部は、スウイッチ要素と共に 、γ３およびγ１をカバーするヒト重鎖定常領域の部分に及ぶ。N、NotI；S、Sa lI、X、XhoI。 図97は、HCo7トランスジェニック創立動物におけるヒトμおよびγ１の血清発 現を示す。 図98は、HCo7/KCo4二重トランスジェニック／二重欠失マウスにおけるヒト免 疫グロブリンの血清発現を示す。 図99は、HCo7トランスジェニックマウス脾臓RNAにおけるヒトγ１およびγ ３転写のRT PCR欠失を示す。 図100は、インビトロでのLPSおよびIL−4によるヒトIqG1およびIgG3の誘導を 示す。 図101、YAC DNAの濃縮のためのアガロースゲル電気泳動装置。 図102、HC2／KCo5／JHD／JKDおよびHC2／KCo4／JHD／JKDマウスからの骨髄細 胞の二色FACS分析。B220+／CD43-、B220+／CD43+およびB220+／IgM+ゲートのそ れぞれにおける細胞の画分はパーセントで示 される。 図103、HC2／KCo5／JHD／JKDおよびHC2／KCo4／JHD／JKDマウスからの脾臓細 胞の二色FACS分析。B220明るい／IgM+およびB220曇っている／IgM+ゲートのそれ ぞれにおける細胞の画分はパーセントで示される。 図104、IgGk抗-nCD4モノクローナル抗体のCD4＋ SupT1細胞への結合。 図105、フローサイトメトリーによるIgG抗-nCD4モノクローナル抗体のエピト ープ測定。SupT1細胞は、緩衝液（左のカラム）、2.5mg／ml RPA−T4（真中のカ ラム）または2.5 mg／ml Leu3a（右のカラム）で、次いで10のヒトIgGモノクロ ーナル抗体（１：２に希釈した上清中）の１つまたはキメラLeu3aで、プレイン キュベートされた。３つの典型的ヒトIgGモノクローナル抗体についての結果を この図に示す。 図106、ヒトIgGk抗-CD4モノクローナル抗体によるMLRの阻害。 本発明のトランスジェニックマウスを、下記の表Ｂ及びＣから選択されたヒト 抗原により免疫する。トランスジェニックマウスは前記ヒト抗原に結合するヒト 抗体を生産する。免疫されたトランスジェニックマウスからのＢ細胞を用いて、 前記選択されたヒト抗原に対するモノクローナル抗体を分泌するハイフリドーマ を作製する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ (72)発明者 カイ，ロバート，エム. アメリカ合衆国，カリフォルニア州 94115，サンフランシスコ，ブロードウエ ー ５，2127

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．下記工程を含むヒト配列免疫グロブリンポリペプチドを作る方法 （Ａ）トランスジェニックマウスを得ること、ここで該トランスジェニックマ ウスは、機能的に破壊された内因性重鎖対立遺伝子のホモ接合の一対、機能的 に破壊された内因性軽鎖対立遺伝子のホモ接合の一対、ヒト免疫グロブリン軽 鎖トランスジェンの少なくとも１つのコピー、及びヒト免疫グロブリン重鎖ト ランスジェンの少なくとも一つのコピーを含む、 （Ｂ）該トランスジェニックマウスを所定の抗原により免疫化すること、ここ で免疫応答が誘発され、そしてそれによりマウスのトランスジェンがＶ-Ｄ-Ｊ 再配列を受け、それにより再配列されたトランスジェンが作られる、 （Ｃ）再配列されたトランスジェンの可変領域の少なくとも一部をエンコード する核酸を単離しかつ配列決定し、そして該再配列されたトランスジェンの配 列決定された部分によりエンコードされる免疫グロブリンポリペプチドのアミ ノ酸配列を決定すること、 （Ｄ）第２の免疫グロブリンポリペプチドをエンコードする人工的遺伝子を作 ること、ここで該第２の免疫グロブリンポリペプチドは、上記再配列されたト ランスジェンの配列決定された部分によりエンコードされる免疫グロブリンポ リペプチドのアミノ酸配列に実質的に同じアミノ酸配列を有する、 （Ｅ）該人工的遺伝子を転写プロモーター配列に結合すること、そして （Ｆ）該人工的遺伝子を細胞内へ導入すること、これによりヒト配列免疫グロ ブリンポリペプチドが作られる。 ２．第２の免疫グロブリンポリペプチドが、再配列されたトランスジェンの配列 決定された部分によりエンコードされる免疫グロブリンポリペプチドのアミノ酸 配列と同じアミノ酸配列を含む、請求項１の方法。 ３．工程（Ｃ）の核酸が、ヒト配列免疫グロブリンを分泌するハイブリドーマか ら単離される請求項１の方法。 ４．再配列されたトランスジェンがヒト免疫グロブリン重鎖トランスジェンであ る請求項１の方法。 ５．人工的遺伝子がガンマイソタイプ定常領域をエンコードする請求項４の方法 。 ６．工程（Ｆ）の細胞中に第２の人工的遺伝子を導入することを更に含み、ここ で該第２の人工的遺伝子は、再配列されたトランスジェンがヒト免疫グロブリン 軽鎖トランスジェンであることを除いては請求項４の工程（Ａ）〜（Ｅ）に従っ て作られ、かつここで細胞は免疫グロブリンを作るところの請求項４の方法。 ７．ヒト免疫グロブリン重鎖トランスジェン及びヒト免疫グロブリン軽鎖トラン スジェンが、トランスジェニックマウスからの単一のＢ細胞を１つの不死細胞へ 融合させることにより作られたハイブリドーマ内で発現される請求項６の方法。 ８．細胞が、少なくとも約108Ｍ-1の親和性定数（Ｋa）で所定の抗原を結合する 免疫グロブリンを作る請求項６の方法。 ９．請求項１の方法により作られた免疫グロブリン。 10．免疫グロブリンポリペプチドの少なくとも一部をエンコードする少なくとも １つの人工的遺伝子を含む細胞において、該細胞は所定のヒト抗原を結合する免 疫グロブリンの検出可能量を作り、該免疫グロブリンポリペプチドはトランスジ ェニックマウスから得られたハイブリドーマにより分泌される免疫グロブリンポ リペプチドと実質的に同じ配列を有し、該マウスは、機能的に破壊された内因性 重鎖対立遺伝子のホモ接合の一対、機能的に破壊された内因性軽鎖対立遺伝子の ホモ接合の一対、ヒト免疫グロブリン軽鎖トランスジェンの少なくとも１つのコ ピー、及びヒト免疫グロブリン重鎖トランスジェンの少なくとも一つのコピーを 含むところの、細胞。 11．請求項10の真核細胞。 12．免疫グロブリンが、ヒトＣＤ４またはその抗原的フラグメントを結合する、 請求項11の細胞。 13．ヒトＣＤ４を特異的に結合する免疫グロブリンにおいて、該免疫グロブリン が、配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．１、配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．２、配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．３、配 列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．４、配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．５、配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．６、配列Ｉ． Ｄ．Ｎｏ．７、配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．８、配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．９、または配列Ｉ． Ｄ．Ｎｏ．10によりエンコードされるアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列 を含むヒト配列軽鎖可変領域を含むところの、免疫グロブリン。 14.免疫グロブリンが配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．６１又は配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．62の配列 を含む、請求項13の免疫グロブリン。 15．予め選択された抗原を特異的に結合するヒト配列免疫グロブリンを分泌する ハイブリドーマを選択する方法において、 （ａ）トランスジェニックマウスからＢ細胞を得ること、ここで該トランスジ ェニックマウスは、機能的に破壊された内因性重鎖対立遺伝子のホモ接合の一 対、機能的に破壊された内因性軽鎖対立遺伝子のホモ接合の一対、ヒト免疫グ ロブリン軽鎖トランスジェンの少なくとも１つのコピー、及びμならびに非μ セグメントをエンコードする配列を含むヒト免疫グロブリン重鎖トランスジェ ンの少なくとも一つのコピーを含み、かつここで該マウスは該所定の抗原によ り予め免疫化されている、 （ｂ）該Ｂ細胞を不死細胞に融合させること、ここでハイブリドーマが作られ る、 （ｃ）非μ、非δイソタイプ免疫グロブリンを分泌するハイブリドーマの第１ 群を同定すること、 （ｄ）ハイブリドーマの第２群を同定すること、ここで該第２群は、ハイブリ ドーマの第１群のサブセットであり、第２群内のハイブリドーマは所定の抗原 を特異的に結合する免疫グロブリンを分泌する、 （ｅ）ハイブリドーマの第２群から、予め選択された抗原に特異的に結合する ヒト配列免疫グロブリンを分泌するハイブリドーマを選択すること の各工程を含む方法。 16．ハイブリドーマの第１の群がＩｇＧ免疫グロブリンを分泌する、請求項15の 方法。 17．工程（ｅ）のヒト配列免疫グロブリンが、少なくとも約109Ｍ-1の親和性定 数（Ｋa）で所定の抗原を結合する、請求項15の方法。 18．ヒトからのＣＤ４を特異的に結合し、かつ少なくとも１つの非ヒト霊長類か らのＣＤ４を特異的に結合する、ヒト抗ＣＤ４免疫グロブリン。 19．非ヒト霊長類がリーサスモンキー、シノモルガスモンキー、又はチンパンジ ーである請求項18の免疫グロブリン。 20．ヒト抗ＣＤ４免疫グロブリンが、リーサスモンキー及びシノモルガスモンキ ーの両者からのＣＤ４を特異的に結合する請求項19の免疫グロブリン。 21．ヒト抗ＣＤ４免疫グロブリンが、リーサスモンキー、シノモルガスモンキー 及びチンパンジーからのＣＤ４を特異的に結合する請求項19の免疫グロブリン。 22．ＶＨ４ - ３４セグメント、ＤＸＰ′１セグメント、ＪＨ４セグメント、及 び配列ＤＩＴＭＶＲＧＰＨ（配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．６３）を含む重鎖ＣＤＲ３領域 を含むヒト配列免疫グロブリン。 23．ＶＨ５ - ５１セグメント、ＤＨＱ５２セグメント、ＪＨ２セグメント、及 び 配列ＰＡＮＷＮＷＹＦＶＬ（配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．６４）を含む重鎖ＣＤＲ３領域 を含むヒト配列免疫グロブリン。 24．ＶＨ４ - ３４セグメント、ＪＨ５セグメント、及び配列ＶＩＮＷＦＤＰ（ 配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．６５）を含む重鎖ＣＤＲ３領域を含むヒト配列免疫グロブリ ン。 25．ＶＨ５ - ５１セグメント、ＤＨＱ５２セグメント、ＪＨ４セグメント、及 び配列ＤＱＬＧＬＦＤＹ（配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．６６）を含む重鎖ＣＤＲ３領域を 含むヒト配列免疫グロブリン。 26．ＶｋＡ２７／Ａ１１セグメント、Ｊｋ４セグメント、及び配列ＱＱＹＧＳＳ ＰＬＴ（配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．６７）を含む軽鎖ＣＤＲ３領域を含むヒト配列免疫 グロブリン。 27．ＶｋＬ１８セグメント、Ｊｋ４セグメント、及び配列ＱＱＦＩＳＹＰＱＬＴ （配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．６８）を含む軽鎖ＣＤＲ３領域を含むヒト配列免疫グロブ リン。 28．ＶｋＬ１９セグメント、Ｊｋ２セグメント、及び配列ＱＱＡＮＳＦＰＹＴ（ 配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．６９）を含む軽鎖ＣＤＲ３領域を含むヒト配列免疫グロブリ ン。 29．ＶｋＬ１５セグメント、Ｊｋ２セグメント、及び配列ＱＱＹＤＳＹＰＹＴ（ 配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．７０）を含む軽鎖ＣＤＲ３領域を含むヒト配列免疫グロブリ ン。 30．免疫グロブリンを分泌するハイブリドーマにおいて、免疫グロブリンが、Ｖ Ｈ４ - ３４セグメント、ＤＸＰ′１セグメント、ＪＨ４セグメント、及び配列 ＤＩＴＭＶＲＧＰＨ（配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．６３）を含む重鎖ＣＤＲ３領域を含む ヒト配列免疫グロブリン；ＶＨ５ - ５１セグメント、ＤＨＱ５２セグメント、 ＪＨ２セグメント、及び配列ＰＡＮＷＮＷＹＦＶＬ（配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．６４） を含む重鎖ＣＤＲ３領域を含むヒト配列免疫グロブリン；ＶＨ４ - ３４セグメ ント、ＪＨ５セグメント、及び配列ＶＩＮＷＦＤＰ（配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．６５） を含む重鎖ＣＤＲ３領域を含むヒト配列免疫グロブリン；ＶＨ５ - ５１セグメ ント、ＤＨＱ５２セグメント、ＪＨ４セグメント、及び配列ＤＱＬＧＬＦＤＹ（ 配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．６６）を含む重鎖ＣＤＲ３領域を含むヒト配列免疫グロブリ ン；ＶｋＡ２７／Ａ１１セグメント、Ｊｋ４セグメント、及び配列ＱＱＹＧＳＳ ＰＬＴ（配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．６７）を含む軽鎖ＣＤＲ３領域を含むヒト配列免疫 グロブリン；ＶｋＬ１８セグメント、Ｊｋ４セグメント、及び配列ＱＱＦＩＳＹ ＰＱＬＴ（配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．６８）を含む軽鎖ＣＤＲ３領域を含むヒト配列免 疫グロブリン；ＶｋＬ１９セグメント、Ｊｋ２セグメント、及び配列ＱＱＡＮＳ ＦＰＹＴ（配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．６９）を含む軽鎖ＣＤＲ３領域を含むヒト配列免 疫グロブリン：及びＶｋＬ１５セグメント、Ｊｋ２セグメント、及び配列ＱＱＹ ＤＳＹＰＹＴ（配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．７０）を含む軽鎖ＣＤＲ３領域を含むヒト配 列免疫グロブリン より成る群から選ばれるところのハイブリドーマ。
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