JPH0314431B2

JPH0314431B2 -

Info

Publication number: JPH0314431B2
Application number: JP12527182A
Authority: JP
Inventors: Yutaka Moroishi; Yasuo Kihara; Isoji Sakai; Takashi Kawasaki; Isao So
Original assignee: Nitto Denko Corp
Current assignee: Nitto Denko Corp
Priority date: 1982-07-19
Filing date: 1982-07-19
Publication date: 1991-02-26
Also published as: JPS5914789A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は固定化酵素及びその製造方法に関す
る。

酵素反応は医薬品、食品等の製造の過程で一部
工業的にも実施されているが、従来は酵素を基質
の水溶液に溶解させて、この水溶液中で反応を行
なわせている。しかし、このような方法によれ
ば、反応条件を一定に維持しつつ、新鮮な酵素を
補給したり、また、反応後に酵素を失活させるこ
となく、生成物と酵素を分離することが非常に困
難であり、酵素が不経済に消費される。そのう
え、反応が回分式であるから生産性に劣る。

このような問題を解決するために、既に水不溶
性の担体に酵素を固定化し、この固定化酵素に基
質を反応させることが提案されている。このよう
な酵素の固定化方法の代表的なものに、水不溶性
の担体に酵素を共有結合、イオン結合又は物理吸
着によつて結合させる担体結合法が知られてい
る。しかし、従来、この方法において用いられて
いる担体は、通常、セルロース、デキストラン、
アガロース等の多糖類の誘導体、ポリアクリルア
ミドゲル、多孔性ガラス等の径１mm乃至数mmの粒
子であり、このような粒子に酵素が固定化された
固定化酵素は、通常、カラムに充填され、固定さ
れて、基質溶液と接触されるので、基質が高分子
量の場合、固定化酵素表面に拡散し難く、反応に
長時間を要すると共に、反応収率が低いという問
題がある。

特に、酵素を水不溶性担体にイオン結合にて固
定した固定化酵素は、例えば、イオン強度の高い
水溶液中で使用すると、酵素が容易に脱着して、
酵素活性が速やかに低下する欠点を有し、一方、
共有結合法によれば、酵素の脱着のおそれは小さ
いが、固定化する際の反応が繁雑であつて、酵素
が固定化の操作時に失活する場合も少なくなく、
更に費用も高価となる。

本発明は上記した問題を解決するためになされ
たものであつて、反応系において遊離の酵素と同
様に自由に移動でき、従つて、固定化酵素表面へ
の基質の拡散が殆ど問題にならない高活性の固定
化酵素及びその製造方法を提供することを目的と
する。また、本発明は従来の共有結合による酵素
の固定化方法に比べて遥かに簡単でありながら、
共有結合法による固定化酵素と同等若しくはそれ
以上に酵素が安定に固定化されており、その酵素
活性が長期にわたつて高く保持される固定化酵素
及びその製造方法を提供することを目的とする。

本発明による固定化酵素は、水分散型高分子重
合体粒子の表面に酵素がポリアミンとジアルデヒ
ドのシツフ塩基からなる重合体と共に沈着されて
いることを特徴とし、かかる固定化酵素は、本発
明に従つて、水分散型高分子重合体粒子の水分散
液中で酵素の存在下にポリアミンとジアルデヒド
とを反応させて、水分拡散型高分子重合体粒子の
表面に酵素を上記ポリアミンとジアルデヒドのシ
ツフ塩基からなる重合体と共に沈着させることに
よつて得られる。

本発明において用いる水分散型高分子重合体粒
子は、その平均粒径が0.03μ〜2μ、好ましくは
0.07μ至1μである。粒径が小さすぎると、これを
担体とする固定化酵素を水中に分散させて酵素反
応を行なわせた後の回収が困難となり、一方、粒
径が大きすぎると、単位体当りの粒子表面積が小
さくなり、酵素の固定化量が少なくなると共に、
水中に分散させるのが困難となるので好ましくな
い。また、上記水分散型高分子重合体粒子は、酵
素反応の行なわれる温度より高いガラス転移点を
有する限りは、任意の重合体からなつていてよ
く、例えば、エチレン、プロピレン、塩化ビニ
ル、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、アクリル
酸エステル、メタクリル酸エステル、スチレン、
メチルスチレン、ビニルトルエン、ブタジエン、
イソプレン、アクリルアミド、メタクリルアミ
ド、アクリロニトリル、メタクリロニトリル等の
１種又は２種以上の単量体を、乳化剤を用いて、
又は用いずして、通常の方法に従つて乳化重合さ
せることにより得られる。

好ましくは、本発明において用いる水分散型高
分子重合体粒子は側鎖に極性基を有する重合体か
らなる。かかる極性基を有する水分散型高分子重
合体粒子は、極性基を有する単量体を上記のよう
な単量体（以下、共重合性単量体ということがあ
る。）と通常の方法に従つて乳化共重合させるこ
とにより得ることができる。ここに、極性基とし
ては、例えば、スルホン基、カルボキシル基、リ
ン酸基等の酸基、第３級アミノ基、第４級アミノ
基等の塩基性基等を挙げることができる。このよ
うな極性基を有する単量体の具体例としては、ス
チレンスルホン酸、スルホプロピルメタクリレー
トのようなスルホン酸基を有する単量体、アクリ
ル酸、メタクリル酸、イタコン酸のようにカルボ
キシル基を有する単量体、アシツドホスホキシエ
チルメタクリレート、３−クロロ−２−アシツド
ホスホキシエチルメタクリレートのようなリン酸
基を有する単量体、ジメチルアミノエチルメタク
リレート、ジメチルアミノプロピルメタクリルア
ミドのような第３級アミノ基を有する単量体、メ
タクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウム
クロライド、メタクリロイルオキシエチルトリメ
チルアンモニウムクロライドのような第４級アミ
ノ基を有する単量体を挙げることができる。

更に、本発明においては、極性基を有する単量
体及びこれと共重合性を有する前記共重合性単量
体に加えて、内部架橋用多官能性単量体を乳化共
重合させるのが好ましい。このような内部架橋用
多官能性単量体の具体例としては、エチレングリ
コールジメタクリレート、ジエチレングリコール
ジメタクリレート、トリエチレングリコールジメ
タクリレート、ジプロピレングリコールジメタク
リレート、１，３−ブチレングリコールジメタク
リレート、トリエチレングリコールジアクリレー
ト、トリメチロールプロパントリメタクリレー
ト、トリメチロールプロパントリアクリレート、
テトラメチロールメタンテトラアクリレート等の
ような多価アルコールの（メタ）アクリレートが
好ましく用いられる。ジビニルベンゼンも好まし
く用いられる。

内部架橋用多官能性単量体の使用は、極性基を
有する単量体と前記共重合性単量体との乳化共重
合において、好ましくない水溶性重合体の生成を
抑えると共に、重合の安定性を高めるのに役立
つ。

本発明においては、極性基を有する単量体0.2
〜30重量％と前記共重合性単量体70〜99.8重量％
とを乳化共重合させて水分散型高分子重合体粒子
を得るのが好ましいが、上記した内部架橋用多官
能性単量体をも共重合させる場合には、これを全
単量体組成の20重量％までの範囲で使用するのが
よい。余りに多量に使用すると、却つて重合の安
定性を損なうおそれがあるからである。

尚、本発明において、得られる水分散型高分子
重合体粒子に乳化剤が混在すると、酵素の固定化
に際して酵素が失活するおそれがるので、好まし
くは、上記のような単量体を乳化重合させるとき
に乳化剤を用いないのが良いが、しかし、乳化剤
が用いる酵素に対して有害な影響を与えないとき
は、乳化剤を必要に応じて用いてもよいのは勿論
である。

また、本発明においては、極性基を有する水分
散型高分子重合体粒子を得るに際して、上記のよ
うに、予め極性基を有する単量体を前記共重合性
単量体と乳化共重合させてもよいが、重合後に極
性基に変換し得る官能性基を有する単量体を、必
要ならば前記共重合性単量体と共に乳化共重合さ
せて水分散型高分子重合体粒子を得、この後にこ
の重合体の有する官能性基を化学反応により極性
基に変換してもよい。極性基に変換し得る官能性
基を有する単量体として、例えば、アクリル酸エ
ステルやメタクリル酸エステルを挙げることがで
き、このような単量体成分を含む重合体粒子を酸
又はアルカリで処理すれば、極性基としてカルボ
キシル基を有する水分散型高分子重合体粒子を得
ることができる。また、グリシジル基を有する単
量体成分を含む重合体粒子に第３級アミンを反応
させると、第４級アミノ基を有する重合体粒子を
得ることができる。

本発明において用いるポリアミンは、アルデヒ
ド基と反応し得るアミノ基を分子内に２個又はそ
れ以上有するアミン化合物又は重合体を意味し、
好ましくは芳香族、脂肪族又は脂環族のジアミン
やトリアミンが好ましく用いられ、具体的にはフ
エニレンジアミン、キシリレンジアミン、フエニ
レントリアミン、トリアミノトルエン、エチレン
ジアミン、ヘキサメチレンジアミン等が用いられ
る。また、ポリエチレンイミンも用いることがで
きる。

次に、本発明においては、ジアルデヒドも芳香
族や脂肪族のジアルデヒドが好ましく用いられる
が、具体的にはグルタルアルデヒド、コハク酸ジ
アルデヒド、グリオキザール、マレインジアルデ
ヒド、テレフタルジアルデヒド等が用いられる。

本発明によれば、上記した水分散型高分子重合
体粒子を水中に分散させ、酵素の存在下に上記ポ
リアミンとジアルデヒドとを反応させることによ
り、酵素をポリアミンとジアルデヒドとからなる
シツフ塩基の重合体と共に沈着させるのである。
ここに、ポリアミンとジアルデヒドとの当量比は
10：１〜１：10であり、好ましくは５：１〜１：
５である。この範囲を越えていずれか一方を過多
に用いるときは、形成されるシツフ塩基重合体量
が少なすぎ、従つて、この重合体に沈着される酵
素の量も少なくなるので好ましくない。

上記の反応は、例えば、酵素の失活の起こらな
い温度及びPHにおいて、水分散型高分子重合体粒
子の分散液と酵素水溶液とを混合し、次いでポリ
アミンとジアルデヒドとのそれぞれの水溶液を加
え、必要に応じて撹拌することにより行なうが、
ポリアミンとジアルデヒドとのそれぞれの水溶液
を加える順序は特に制限されない。反応は通常、
塩酸等により酸性にした条件下で行なうことによ
り円滑に進行する。また、反応は通常、常温で行
なうが、酵素が失活するおそれがあるような場合
には、低温で行なう。反応に要する時間は、常温
での反応の場合、通常数時間乃至10時間程度であ
る。

以上のようにして、水分散型高分子重合体粒子
の分散液中に酵素を存在させて、ポリアミンとジ
アルデヒドとを反応させた後、固定化されなかつ
た酵素及び未反応のポリアミンとジアルデヒドと
を遠心分離、膜分離等の適宜の手段によつて除去
すれば、本発明による固定化酵素を得ることがで
きる。

本発明において、上記のような方法により水分
散型高分子重合体粒子の表面に酵素が固定化され
る機構は必ずしも明らかではないが、ポリアミン
とジアルデヒドとが反応してシツフ塩基を生じ、
これが分子量が大きくなるに従つて水不溶性とな
り、分散している高分子重合体粒子表面に沈着す
る際に酵素をこの重合体に包み込んで固定化する
のであろう。また、酵素の一部はポリアミンの有
するアミノ基及び／又はジアルデヒドの有するア
ルデヒド基に共有結合にて結合し、シツフ塩基重
合体と共に高分子重合体粒子に沈着するのであろ
う。

本発明による固定化酵素は水分散液として用い
られ、基質と接触される。固定化酵素の使用量
は、固定化酵素の粒径や酵素の固定化量、必要と
する反応速度、基質濃度等により適宜に決定され
る。

本発明において固定化される酵素は菌体内酵素
でもよく、菌体外酵素でもよい。また、酵素は必
ずしも高度に精製されている必要はなく、抽出液
や部分精製品も用いられる。更に、本発明に従つ
て、単一の酵素を固定化してもよいが、複数の酵
素を同時に固定化してもよい。

本発明において酵素は特に制限されず、種々の
酵素が用いられる。具体例として、アミノ酸オキ
シダーゼ、カタラーゼ、キサンチンオキシター
ゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース−６−
リン酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロ
ゲナーゼ、チトクロムＣオキシダーゼ、チロシナ
ーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ペルオキシダー
ゼ、６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、リ
ンゴ酸デヒドロゲナーゼのような酸化還元酵素、
アスパラギン酸アセチルトランスフエラーゼ、ア
スパラギン酸アミノトランスフエラーゼ、グリシ
ンアミノトランスフエラーゼ、グルタミン酸−オ
キザロ酢酸アミノトランスフエラーゼ、グルタミ
ン酸−ピルビン酸アミノトランスフエラーゼ、ク
レアチンホスホキナーゼ、ヒスタミンメチルトラ
ンスフエラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、フラクト
キナーゼ、ヘキソキナーゼ、δ−リジンアセチル
トランスフエラーゼ、ロイシンアミノペブブチタ
ーゼのような転移酵素、アスパラギナーゼ、アセ
チルコリンエステラーゼ、アミノアシラーゼ、ア
ミラーゼ、アルギナーゼ、Ｌ−アルギニンデイミ
ナーゼ、インベルターゼ、ウレアーゼ、ウリカー
ゼ、ウロキナーゼ、エステラーゼ、β−ガラクト
シダーゼ、カリクレイン、キモトリプシン、トリ
プシン、トロンビン、ナリンギナーゼ、ヌクレオ
チダーゼ、パパイン、ヒヤウロニダーゼ、プラス
ミン、ペクチナーゼ、ヘスペリジナーゼ、ペプシ
ン、ペニシリナーゼ、ペニシリンアミダーゼ、ホ
スホリパーゼ、ホスフアターゼ、ラクターゼ、リ
パーゼ、リボヌクレアーゼ、レンニンのような加
水分解酵素、アスパラギン酸デカルボキシラー
ゼ、アスパルターゼ、クエン酸リアーゼ、グルタ
ミン酸デカルボキシラーゼ、ヒスチジンアンモニ
アリアーゼ、フエニルアラニンアンモニアリアー
ゼ、フマラーゼ、フマール酸ヒドラターゼ、リン
ゴ酸シンテターゼのようなリアーゼ、アラニンラ
セマーゼ、グルコースイソメラーゼ、グルコース
ホスフエートイソメラーゼ、グルタミン酸ラセマ
ーゼ、乳酸ラセマーゼ、メチオニンラセマーゼの
ような異性化酵素、アスパラギンシンターゼ、グ
ルタチオンシンターゼ、ピルビン酸シンターゼの
ようなリガーゼ等を挙げることができる。

本発明による固定化酵素は以上のように、酵素
が水分散型高分子重合体粒子に固定化されてお
り、従来のセルロース誘導体粒子等の場合と異な
り、固定化酵素自体が遊離の酵素と同様に反応系
内を自由に移動できるため、基質の拡散が反応に
殆ど影響を与えず、従つて、高分子量の基質の場
合には遊離の酵素と同様の高い反応速度で酵素反
応を行なわせることができる。また、従来の共有
結合法その他による酵素の固定化と異なり、固定
化方法が簡単であるうえに、酵素の固定化条件が
緩やかであるため、固定化時の酵素の失活が少な
く、活性収率が高いという利点を有し、更に、固
定された酵素が長期にわたる使用によつても、共
有結合法による場合と同等又はそれ以上に酵素活
性が高く維持される。しかも、本発明による固定
化酵素は水不溶性の担体に固定されているため、
酵素反応後には遠心分離、塩析、凝集剤を用いる
凝集沈澱、多孔性膜による膜分離等によつて容易
に回収でき、長時間にわたつて繰返して使用する
ことができる。

以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本
発明はこれら実施例により限定されるものではな
い。

実施例１メタクリロイルオキシエチルトリメチルアンモ
ニウムクロライド３ｇ、メチルメタクリレート80
ｇ、トリエチレングリコールジメタクリレート２
ｇ及びアクリルニトリル15ｇを蒸留水230ｇに加
え、２，2′−アゾビス−２−アミジノプロパン二
塩酸塩0.3ｇを水10ｇに溶解した重合開始剤水溶
液を60℃の温度で窒素気流下に加え、120rpmで
撹拌しつつ８時間重合させて、固形分30％、平均
粒径0.3μの重合体粒子の水分散液を得た。

この水分散液に蒸留水を加えて固形分10％と
し、ウレアーゼ１ｇを水10mlに溶解した酵素水溶
液を上記重合体粒子分分散液100mlに加え、均一
に撹拌した後、塩酸でPHを６に調整した１％のｍ
−キシリレンジアミン水溶液８mlを加えて撹拌
し、次に、１％のグルタルアルデヒド水溶液10ml
を加えて、５℃で５時間撹拌して反応させた。反
応終了後、遠心分離し、沈降した重合体粒子を
0.1Mリン酸水素二カリウム及び0.1Mリン酸二水
素カリウムから調製した緩衝液（PH７）で洗滌し
て、未固定のウレアーゼ、未反応のキシリレンジ
アミン及びグルタルアルデヒドを除去し、再び緩
衝液中に分散させて、本発明による固定化酵素を
得た。

この固定化酵素のウレアーゼの固定化量は重合
体粒子１ｇ当り38mgであり、また、固定化された
酵素の活性の理論値に対する実際の活性の割合と
して定義される活性収率は55％であつた。活性収
率は、0.03Mの尿素水溶液を基質とし、35℃で10
分間固定化酵素を反応させ、生成したアンモニア
量（μモル／分）を塩酸滴定で求めて活性を測定
し、これと等しい活性を有する遊離の酵素量を酵
素固定化量で除して求めた。

この固定化酵素について、上記のように活性を
測定した後、緩衝液にて洗滌し、再び活性を測定
するという操作を５回繰り返したが、このときの
活性は当初の96％であつて、繰返し使用によつて
も、活性が高く保持された。

また、この固定化酵素の水分散液を５℃の温度
で４か月間保存した後、活性を測定したが、この
場合も殆ど活性の低下は認められなかつた。

実施例２ジメチルアミノエチルメタクリレート３ｇ、ス
チレン50ｇ、メチルメタクリレート25ｇ、ジビニ
ルベンゼン２ｇ及びアクリロニトリル20ｇを蒸留
水230ｇに加え、２，2′−アゾビス−２−アミジ
ノプロパン二塩酸塩0.3ｇを水10ｇに溶解した重
合開始剤水溶液を60℃の温度で窒素気流したに加
え、120rpmで撹拌しつつ８時間重合させて、固
形分30％、平均粒径0.2μの重合体粒子の水分散液
を得た。

この水分散液に蒸留水を加えて固形分10％と
し、α−アミラーゼ１ｇを水10mlに溶解した酵素
水溶液を上記重合体粒子分散液100mlに加え、均
一に撹拌した後、塩酸でPH６に調整した１％のヘ
キサメチレンジアミン水溶液12mlを加えて撹拌
し、次に、１％のグルタルアルデヒド水溶液10ml
を加えて、５℃で５時間撹拌して反応させた。反
応終了後、遠心分離し、沈降した重合体粒子を
0.1Mリン酸垂素二カリウム及び0.1Mリン酸二水
素カリウムから調製した緩衝液（PH７）で洗滌し
て、未固定のα−アミラーゼ、未反応のヘキサメ
チレンジアミン及びグルタルアルデヒドを除去
し、再び緩衝液中に分散させて、本発明による固
定化酵素を得た。

この固定化酵素のα−アミラーゼの固定化量は
重合体粒子１ｇ当り25mgであり、また、活性収率
は40％であつた。活性収率は、１％デンプン水溶
液を基質として固定化酵素を35℃で10分間反応さ
せ、ヨウ素デンプン反応からデンプンの分解量を
求めることにより、固定化酵素の活性、即ち、デ
ンプン分解速度（mg／分）を得、これと等しい活
性を有する遊離の酵素量を酵素固定化量で除して
求めた。

実施例３メチルメタクリレート80ｇ、アクリロニトリル
17ｇ及びトリメチロールパロパントリメタクリレ
ート２ｇを蒸留水230ｇに加え、過硫酸アンモニ
ウム0.3ｇを水10ｇに溶解した重合開始剤水溶液
を70℃の温度で窒素気流下に加え、120rpmで撹
拌しつつ８時間重合させて、固形分30％、平均粒
径0.4μの重合体粒子の水分散液を得た。

この水分散液に蒸留水を加えて固形分10％と
し、トリプシン１ｇを水10mlに溶解した酵素水溶
液を上記重合体粒子分散液100mlに加え、均一に
撹拌した後、塩酸でPHを６に調整した１％のｍ−
キシレンジアミン水溶液８mlを加えて撹拌し、次
に、１％のグルタルアルデヒド水溶液10mlを加え
て、５℃で５時間撹拌して反応させた。反応終了
後、遠心分離し、沈降した重合体粒子を0.1Mリ
ン酸水素二カリウム及び0.1Mリン酸二水素カリ
ウムから調製した緩衝液（PH７）で洗滌して、未
固定のトリプシン、未反応のｍ−キシリレンジア
ミン及びグルタルアルデヒドを除去し、再び緩衝
液中に分散させて、本発明による固定化酵素を得
た。

この固定化酵素のトリプシンの固定化量は重合
体粒子１ｇ当り12mgであり、また、活性収率は45
％であつた。活性収率は、0.05mMのＮ−ベンゾ
イル−Ｌ−アルギニンエチルエステルを基質と
し、PH7.0で固定化酵素を30℃で発明させること
により、生成するカンホン酸を水酸化カリウム滴
定により求めて、固定化酵素の活性を得、これと
等しい活性を有する遊離の酵素量を酵素固定量で
除して求めた。

Claims

【特許請求の範囲】１水分散型高分子重合体粒子の表面に酵素がポ
リアミンとジアルデヒドのシツフ塩基からなる重
合体と共に沈着されていることを特徴とする固定
化酵素。２水分散型高分子重合体粒子が0.03〜2μの平均
粒径を有することを特徴とする特許請求の範囲第
１項記載の固定化酵素。３水分散型高分子重合体が側鎖に酸基及び／又
は塩基性基を有することを特徴とする特許請求の
範囲第１項又は第２項記載の固定化酵素。４水分散型高分子重合体粒子の水分散液中で酵
素の存在下にポリアミンとジアルデヒドとを反応
させて、水分散型高分子重合体粒子の表面に酵素
を上記ポリアミンとジアルデヒドのシツフ塩基か
らなる重合体と共に沈着させることを特徴とする
固定化酵素の製造方法。５水分散型高分子重合体粒子が0.03〜2μの平均
粒径を有することを特徴とする特許請求の範囲第
４項記載の固定化酸素の製造方法。６水分散型高分子重合体が側鎖に酸基及び／又
は塩基性基を有することを特徴とする特許請求の
範囲第４項又は第５項記載の固定化酵素の製造方
法。