JPH04500911A - トランスジェニック動物からの抗体の産出 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は抗体（または免疫グロブリン）の産出に関するものである。

発明の概要 この発明の１つの局面に従うと、外来起源の免疫グロブリンの少なくとも一部に 対してコードするかまたは免疫グロブリンのレパートリ−をコードするために再 配列し得る遺伝物質をその生殖系列に挿入されたトランスジェニック動物の細胞 または体液から免疫グロブリンを得ることを含む、免疫グロブリンを産出する方 法が提供されている。

外来起源の免疫グロブリンは異なった動物源から得られる免疫グロブリンを意味 する。たとえばトランスジェニック動物かマウスの場合、挿入される遺伝物質は 、たとえば人のようなマウス以外の起源のものである。

挿入される遺伝物質は動物源から、産出されてもよく、または合成的に産出され てもよい。材料は知られた免疫グロブリンの少なくとも一部に対してコードして もよく、または変えられた免疫グロブリンの少な（とも一部に対してコードする ために修飾されてもよい。これらのプロセスに対する適当な技術はよく知られて いる。

挿入された遺伝物質はトランスジェニック動物において発現されてもよく、少な くとも一部は挿入された材料から得られる免疫グロブリンの産出の結果をもたら す。遺伝物質はトランスジェニック動物において再配列されるということが発見 され、そのため挿入された遺伝物質から一部分または複数の部分行られる免疫グ ロブリンのレパートリ−は、たとえもし挿入された遺伝物質が生殖系列において 間違った位置に、または間違った形状構造で組込まれたとしても、産出され得る 。挿入された物質の性質によって、動物は、たとえば混合されたマウス／ヒト起 源のキメラの免疫グロブリンを産出し得、そこでは外来起源の遺伝物質は免疫グ ロブリンの一部だけをコードし、または動物は、たとえばまったくヒト起源の、 完全に外来の免疫グロブリンを産出し得、そこでは外来起源の、遺伝物質は全体 の免疫グロブリンをコードする。ヒトでの使用に適する潜在的に治療上育苗な免 疫グロブリンは、こうしてこの発明の使用によって産出されてもよい。

ポリクローナル抗血清は免疫感作に続いてトランスジェニック動物から産出され てもよい。その代わりに、たとえば骨髄腫細胞を有する動物からの牌臓細胞を融 合しかつ所望される抗体を産出するものを選択するために結果として生じたハイ ブリドーマをふるい分けることによって、モノクローナル抗体がトランスジェニ ック動物から産出されてもよい。このようなプロセスに対する適当な技術は当業 者によく知られている。

代替の方策においては、遺伝物質は、血清のような体液または乳汁、初乳もしく は唾液のような動物の外部分泌において所望される抗体が産出されるように動物 に組込まれてもよい。たとえば、少なくとも一部の外来起源の免疫グロブリンに 対してコードするインビトロの遺伝物質を乳タンパク質に対してコードする哺乳 動物の遺伝子に挿入し、かつそれから、たとえば注入によって、哺乳動物の受精 卵に遺伝子を導入することによって、卵は、少なくとも一部は挿入された遺伝物 質から得られる免疫グロブリンを含む乳汁を産出する成人の雌性哺乳動物に発育 してもよい。それから所望される抗体は乳汁から収穫されてもよい。このような プロセスを実施するための適当な技術は当業者に知られている。

別の可能性は、関心がある免疫グロブリンを産出する細胞のインビトロ選択が続 く、遺伝物質の挿入後に動物によって生まれた免疫グロブリン産出細胞の動物か らの除去を含む。それから免疫グロブリンは知られた態様において選択された細 胞からインビトロで産出され得る。

トランスジェニック動物はその後動物に導入された免疫原に反応してキメラのま たは外来の免疫グロブリン（挿入された遺伝物質から得られる）を産出し得ると いうことが発見された。したがって、実質的に免疫グロブリンの全体の種付異的 な領域に対してコードする外来の、たとえばヒトの遺伝物質を導入することによ って、動物に対して導入されたいかなる抗原に対しても外来の免疫グロブリンを 産出するよう動物を刺激することは可能であり得る。こうしてトランスジェニッ ク動物は、広範囲の抗原に対するヒトの免疫グロブリンの非常に有益で、便利で かつ価値のある源を提供することができるであろう。

けれとも挿入された遺伝物質は成功した再配列のために近接ゲノム上に組込まれ るということが重要であるかもしれない。こうして、挿入された遺伝物質はプラ スミドおよびコスミドのような原核ベクタへとクローンされたＤＮＡの形状であ ってもよい。複合プラスミドまたはコスミドもまた使用されてもよく、しかしこ れらがゲノム上に近接して組込まれることがおそらく必要である。酵母人工染色 体ベクタを使用することによって（１９８７年、パーク（Ｂｕｒｋｅ）、ＤＴ、 カール（Ｃａｒ　］　ｅ）　、ＣＦおよびオルソン（０１５ｏｎ）　、ＭＶの［ 人工染色体ベクタによる酵母への外因性ＤＮＡの大きいセグメントのクローニン グＪ　（Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ｌａｒｇｅ　ｓｅｇｍｅｎｔｓ　ｏｆ　ｅｘｏ ｇｅｎｏｕｓ　ＤＮＡ　１ｎｔｏ　ｙｅａｓｔ　ｂｙ　ｍｅａｎｓ　ｏｆ　ａｒ ｔｉｆｉｃａｌｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　ｖｅｃｔｏｒｓ）サイエンス（Ｓｃｉｅ ｎｃｅ）、２３６号、８０６頁ないし８１２頁を見よ）、または染色体断片の導 入によって（リッチャ−（Ｒｉｃｈｅｒ）、ＪおよびＬｏ、ＣＷ、１９８９年「 全装のヒト染色体断片の注入によるヒトＤＮＡのマウス卵への導入Ｊ　（Ｉｎｔ ｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎＤＮＡ　１ｎｔｏ　ｍｏｕｓｅ　ｅｇｇ ｓ　ｂｙ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｉｓｓｅｃｔｅｄ　ｈｕｍａｎｃｈｒ ｏｍｏ　ｓｏｍｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２４５ 号、１７５頁ないし１７７頁を見よ）、より大きいＤＮＡ断片を挿入することも また可能であると判明し得る。

挿入された遺伝物質は、たとえば受精卵または胚の幹細胞への注入または他の方 法による従来の態様で宿主に導入されてもよい。

初めは免疫グロブリンの定常部をコードする遺伝物質を持たない宿主動物を使用 することか便利であってもよく、そのため結果として生じたトランスジェニック 動物は免疫グロブリンを産出するとき挿入された外来の遺伝物質だけを使用する であろう。これは、関連する遺伝物質を欠く自然に発生した突然変位体宿主を使 用する、二とによって、または関連する遺伝物質か取り除かれた宿主を最後に作 るために突然変位体を、たとえば細胞系において人工的に作ることに、よっての どちらかで達成され得る。

宿主動物か免疫グロブリン定常部をコードする遺伝物質を持つ場合、トランスジ ェニック動物は自然に発生した遺伝物質および挿入された遺伝物質を持ってあろ うし、かつ自然に発生した遺伝物質、挿入された遺伝物質および遺伝物質の両方 の型の混合物から得られる免疫グロブリンを産出するであろう。この場合におい ては、所望される免疫グロブリンはトランスジェニック動物から得られるハイブ リドーマをふるい分けることによって、たとえば抗体遺伝子発現の対立遺伝子排 除または異なった染色体喪失の現象を活用することによって得られることかでき る。

さらに他の局面において、この発明は、特にヒト以外の哺乳動物のトランスジェ ニック動物を産出し、それはその生殖系列に外来起源の免疫グロブリンの少なく とも一部に対してコードする、または免疫グロブリンのレパートリ−をコードす るために再配列できる遺伝物質を挿入される。

この発明はまた、その範囲において、この発明に従ってトランスジェニック動物 から産出されたまたはこの発明の方法によって産出された免疫グロブリンも含む 。

１つの例においては、生殖系列配置免疫グロブリンＶＨ遺伝子、Ｄセグメントの いくつか、およびすべてのＪＨおよびＣｍｕ遺伝子断片を含むそれらの生殖系列 に導入されたＤＮＡセグメントを持つトランスジェニックマウスの系統が確立さ れた。ＶＨ遺伝子の１つ、すへてのＪＨ上セグメントよびＩｇＭ抗体の分泌され たＨ鎖定常部をコードするエキソンはヒト起源であり、残りの物質はマウス起源 であった。遺伝子セグメントは、血清における結果として生したヒト／マウスキ メラのＩｇＭ抗体の合成を伴い、トランスジェニックマウスのリンパ組織におけ る生産性のあるＶＨ−Ｄ−ＪＨ結合を受ける。

免疫感作に続いて、ハイプリト−マはＮＳＯ骨髄腫を有するトランスジェニック マウスからの牌臓細胞間での融合により確立されてきた。ハイブリッドの多くは ヒトキメラのＩｇＭモノクローナル抗体を分泌する。したかって、トランスジェ ニックマウスのこれらの系統はキメラのヒト抗血清またはモノクローナル抗体の 産出のために使用され得る。

さらに、マウスはヒト抗原による免疫感作に続いて、導入された抗原に対してキ メラの抗体を産出する反応をし、かつしたがってこの方策はヒトのおよび異種の 抗原に対して向けられる従来のヒトのまたはキメラのヒト抗体のレパートリ−の 産出のためにもまた有益であることが判明するはずであり、なぜならトランスジ ェニックマウスはヒト抗原の決定基に対して寛容でないであろうからである。

別の例においては、ヒトＶＨ，ＤＳＪＨおよびＣｍｕ配列のみを持つトランスジ ェニックマウスが、受精マウス卵にヒトＶＨ遺伝子、Ｄセグメント、Ｊセグメン トおよびＣｍｕ定常部を含むコスミドを注入することによって生産された。結果 として生じたマウスは、マウスＴｇＭか約２００ｕｇ／ｍｌで存在する状態で、 それらの血清においてヒトｍｕ鎖を含むｌＯと１１００ｕ／ｍｌの間の抗体を産 出した。

この発明はさらに添付の図面に関連する以下の例において例示として説明される であろうか、そこにおいては図１はプラスミドＤＮＡの構造を示し、図２は図１ のＤＮＡか生殖系列に組込まれたトランスジェニックマウスから得られるハイブ リドーマからのおよび組織からのＤＮＡのサザンプロット分析であり、図３はト ランスジェニックマウスからのハイブリドーマからの細胞質ＲＮＡのノーザンプ ロット分析であり、図４はトランスジェニックマウスから確立されたハイブリド ーマの２つによって分泌された免疫グロブリンの分析であり、 図５はＩｇＡラムダプラスミドＤＮＡの構造を示し、図６は細胞数に対してプロ ットされた細胞の固定数の蛍光強度を示す一連のＦＡＣＳヒストグラムであり、 図７は、散点に対してプロットされた細胞の固定数の蛍光強度を示す一連のＦＡ ＣＳプロフィルであり、各点は細胞を表わし、 図８は図６と同様のさらに他の一連のＦＡＣＳヒスドグ図１において示される構 造を有するプラスミドＤＮＡはマウス卵に注入された。この図においてはヒト配 列は塗りつぶされた棒によって表わされ、マウス配列は塗りつぶされていない棒 によって表わされ、ベクタは細かい平行な線か交差する棒によって表わされ、か つＤ要素は逆に平行な線を引かれた棒によって表わされる。制限エンドヌクレア ーゼ開裂部位は以下のように略され、それらは、ＢｇｌｌＩｈ＜Ｂｇに、Ｐｖｕ ｌがＰに、ＥｃｏＲＩがＲに、ＫｐｎｌがＫに、ＢａｍＨＩがＢに、Ｘｂａｌが Ｘに、ＨｉｎｄＩＩＩがＨにである。

成分たるＤＮＡセグメントの起源は以下のようである。

”−’７９　充填されたＮａｒＩ部位にクローンされたＢｇＩＩＩリンカを含む ｐＵｃＩ２誘導体のＥｃｏＲＩおよびＢｇ１１１部位間で全体の「ミニＩｇＨ遺 伝子座」はクロがある。ＶＨ２６はヒト起源のものでありかつファージラムダＶ Ｈ２６からＢｇｌ　Ｉ　Ｉ−ＥｃｏＲＩｏ、８５Ｋｂ断片として得られた（７９ ８０年、マティセンズ・アンド・ラビッツ（Ｍａｔｔｈｙｓｓｅｎｓ　＆　Ｒａ ｂｂｉｔｔｓ）ＰＮＡＳ、７７巻、６５６１頁ないし６５６５頁）。

ＶＨ−１８６，２はＣ５７ＢＬ／６マウスからの生殖系列ＶＨ遺伝子であり、か つ２．５Ｋｂ　Ｓａｃ　Ｉ−Ｋｐｎ　１匹片として得られた（ボースウェル（Ｂ ｏ　ｔ　ｈｗｅ　１１）、パスキンド（Ｐａｓｋ　１ｎｄ）、リース（Ｒｅｔｈ ）、イマニシーカリ（Ｉｍａｎｉｓｈｉ−Ｋａｒｉ）、ラジェウスキ（Ｒａ　ｊ 　ｅｗｓｋｙ）およびバルチモア（Ｂａ　ｌ　ｔ　ｉｍｏｒｅ）１９８１年、細 胞（Ｃｅ　Ｉ　１）　、２４巻、６２５頁ないし６３７頁）。

Ｄセグメント　Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスＤ−Ｑ５２要素は２２１　ｎｔ　 Ｘｈｏｌ−３ａｃＩ断片として得られた。Ｍ１３ｔｇ１３１の５ａｃＩおよび５ ａｉ１部位間でのクローニングに続き、オリゴヌクレオチド ５’　−ＧＣＧＴＣＡＣＣＧＴＧＧＴＡＧＣＴＧＣＴＡＣＣＧＴＡＧＴＡＡＴＡ ＡＡＣＡＣＴＧＴＧＧＴＣＣまたは５’　−ＧＣＧＴＣＡＣＣＧＴＧＧＴＣＧＴ ＡＡＣＣＡＴＡＧＴＡＧＡＣＡＣＴＧＴＧＧＴＧＣ のどちらかを有する部位定方向突然変異が、マウスＳＰ２およびＦＬＩ６系統群 のものにそれぞれ関連があるＤ要素をもつＭ１３ｔｇ１３１クローンをつくるた めに使用された。これらのＤ系統群はマウスおよびヒトの両方において見つけら れる。別のＤ要素−ヒトＤ−Ｑ５２−はヒトＪＨクラスタ（以下を見よ）内にお いて含まれた。

ＪＨクラスタ　６つの機能的なヒトＪＨセグメント、３つの擬似ＪＨおよびヒト Ｄ−Ｑ５２要素を含むヒトＤＮＡからの３．５Ｋｂ　ＢｇｌｌＩ断片か使用され た（ラベツチ（Ｒａｖｅｔｃｈ）他、１９８１年細胞（Ｃｅ　Ｉ　１）、２７巻 、５８３頁ないし５９１頁） ＩｇＨエンハンサ　ヒトＩｇＨエンハンサの部分はＪＨクラスタを含むＢｇｌｌ ｌ断片内において含まれる。マウスエンハンサの完全な複製はｌＫｂ　Ｘｂａｌ 断片内断片−て含まれる。

Ｓ領域およびＣｍｕ領域　ヒトＤＮＡの７．５ＫｂＸｂａｌ断片がｒｎｕＳ領域 およびｍｕＨＭ定常部のエキソンｌないし４を含む。ｍｕ膜エキソンおよびＣｍ ｕ４エキソンとＣｍｕＭＩ膜エキソンの間のイントロンの塊は、マウスｍｕＣＨ 遺伝子の２．５Ｋｂ　ＨｉｎｄｌＩＩ−３ｐｈｌ断片によって与えられ、ｓｐｈ 　１部位はリンカの使用によってＢｇ１１１部位に変換された。

トランスジェニックマウス プラスミドＤＮＡはＢｇｌＩＩで線状にされ、アガロースゲルにおいて電気誘導 の後精製されかつ前述のようにＣ５７ＢＬ／６ＪＸＣＢＡ／Ｃａ７ウスの受精卵 の雄性前核の中に注入された（レイク（Ｒｅｉｋ）他、１９８７年、ヨーロッパ ・ジャーナル・免疫学（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、）１７巻、４６５頁ない し４６９頁）。尾部ＤＮＡのサザンプロット分析は、生まれた３２匹のマウスの うち１２匹がミニ遺伝子座を持っていたことを明らかにした。

最終的な研究は、それらすべてがミニ遺伝子座の少数の複製（２ないし５）を持 つ３匹の基礎となるマウス−Ｈ１ｇ１７．１９および２９の子孫において行なわ れた。

血清検定 基礎となるマウスの血清は、ヒトＩｇＭの抗原の決定基特性を含む抗体の存在に 対してＥＬＩＳＡによって検査された。免疫されていないトランスジェニックマ ウスはそれらの血清においてｌＯと１１００ｕ／ｍｌとの間でキメラのヒトＩｇ Ｍを含むことが判明した。末梢血におけるリンパ球の蛍光抗体分析もまた、ビオ チニル化された種付異的な抗ヒトＩｇＭ抗体およびフルオレセイン結合されたス トレプトアビジンによる細胞の染色の存在を明らかにした。

トランスジェニックマウスからのハイブリドーマトランスジェニックマウスはヒ トの赤血球細胞または羊の赤血球細胞のどちらかで腹膜内で免疫処置された。牌 臓は免疫感作の後様々な時に取り除かれ、ＨＡＴ培地において選択されたＮＳＯ 骨髄腫およびハイブリッドで融合される。これらのハイブリッドの多くはＥＬＩ ＳＡ検定によって明らかにされるようにキメラのヒトＩｇＭを作った。

ミニ遺伝子座のＤＮＡ再配列 ハイブリドーマからと同様にトランスジェニックマウスからの組織からのＤＮＡ のサザンプロット分析は、トランスジェニックマウスのリンパ球組織におけるミ ニ１ｇ遺伝子座内において高頻度のＤＮＡ再配列があることを明らかにした。

トランスジェニックマウスから確立された組織またはハイブリドーマからのＤＮ ＡはＥｃｏＲＩで消化され、かつミニ遺伝子座においてヒトＪ６要素とマウスＩ ｇＨエンハンサとの間の領域に対して交雑するヒトＩｇＨエンハンサプローブ（ Ｂａ　Ｉ　Ｉ−Ｂｇ　Ｉ　Ｉ　Ｉ断片）と交雑された。ＤＮＡのサザンプロット 分析の結果は図２において示される。

標識断片のＫｂにおけるサイズは図において与えられる。

ミニ遺伝子座の転写 ＮＳＯ融合のパートナ−からのまたはトランスジェニックマウスからのハイブリ ドーマからの細胞質ＲＮＡ（５ｕｇ）はヒ）Ｃｍｕ、ヒ１−ＶＨ２６またはマウ スＶＨ１８６ブローブでプローブされた。細胞質ＲＮＡのノーザノブロット分析 の結果は図３において示され、それは、ハイブリドーマが１（２６、ＶＨ１８６ Ｖ遺伝子のとちらかまたは両方に対すると同様にヒトｍｕに対するプローブと交 雑したｒｎ　ＲＮ　Ａを含むことを明らかにする。こうしてヒトＶＨ２６および マウスＶＨ１８６の両方は再配列できかつこうしてキメラのヒトＴｇＭ抗体を分 泌する細胞系統を造るこクローンされたハイブリドーマ細胞系統によるタンパク 質産出は、Ｌ−［”　Ｓ］　メチオニンによる生合成の標識の使用およびその後 の抗ヒトｍｕ抗血清ての精製により分析された。待に、細胞は、Ｌ−［”　Ｓ］ 　メチオニンおよび免疫沈降により培養上澄みから精製されたＩｇＭ抗体ならび に抗ヒトｍｕ抗血清を含む培地にてひと晩インキコベートされ／こ。トランスジ エニ・ツクハイブリドーマ３５．５および２４ａの上澄みからの精製は、図４に おいて「十」によって示されるように非放射性の、精製されたマウスモノク＋Ｊ −ナルＩｇＭ抗体（Ｂｌ−８）の大過剰（５０ｕｇ）の？ｒ在下て達成された。

マウスＩｇＭ分泌細胞系統を使用して見られるように、抗ヒｈ　ｍ　Ｌｌ抗血清 はマウスｍｕと交差反応するかしかしこの交差反応は非放射性のマウスＢ１−８ １ｇＭ抗体によって競争され得る一図４の左の４つのレーンを見よ。

これは、異なったヒｔ−ｍ　ｕ鎖を有する抗体を分泌するこれらのｌ・ランスジ ェニックマウスからのハイブリドーマを確立することか可能であることを示す。

例２ それらの体液および外部の分泌において特異的な抗体を産出するトランスジェニ ック動物か造られ得る。例示として、この例は、抗原特異的キメラのヒトＩｇＡ ２抗体のＨおよびＩ［をコードする遺伝子をそれらの生殖系列に組込まれて持つ トランスジェニックマウスに関するものである。

図５において示されているＤＮＡの生殖系列の組込みを持つ９つのトランスジェ ニックマウス系統が確立された。

図５において、厚く塗られた線はマウスＩｇＤＮＡを描き、斜めに細かい平行線 が引かれた線はヒトＤＮＡを、空白の箱はマウスＩｇＨおよびＳＶ４０エンハン サを、かつ薄く塗られた線はｐＳＶ２ｇｐｔベクタを描く。制限部位の略語は図 １において示されるようになっている。プラスミドは前述のｐＳＶ−ＶＮＰＨα ２の誘導体であり（ブルゲマン（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ）他、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅ ｄ、１９８７年、１６６巻、１３５１頁ないし１３６１頁）かつマウスＨＯＰＣ ２０２０ブラスマ細胞腫の再配列されたラムダ１遺伝子を含む７゜４ｋｂ　Ｅｃ ｏＲＩ断片を含む（パーナート（Ｂｅｒｎａｒｄ）他、１９７８年、細胞（Ｃｅ ｌｌ）１５巻、１１３３頁ないし１１４０頁）。プラスミドＤＮＡは前述のよう に得られるベクタおよびトランスジェニックマウスにおけるＰｖｕ　１部位にお いて線状にされた（レイク（Ｒｅｉｋ）他、ＥＵＲ，Ｆ、ＩＭＭＵＮＯＬ、１９ ８７年、１７巻、４６５頁ないし４６９頁）。

トランスジェニックＩｇＡ２ラムダ抗体はノ＼ブテン４−ヒドロキシー３−二１ 〜ロフエンアセチル（ＮＰ）に対して特異性を存する。トランスジェニック抗体 の発現は、プラスチックプレートに結合されたＮＰウシ血清アルブミンを使用し か一つビオチニル化された抗ヒトアルファ抗血清で展開するＥＬＩＳＡ検定によ って測定された。全体のＩｇは抗マウス１ｇ被覆されたプラスチ・ツタを使用し かつビオチニル化された抗マウスカッパ抗血清で展開し測定された。

キメラの抗ＮＰＩｇＡ２の濃度は７匹のトランスジエニ・ユｌクマウスおよび１ 匹の対照マウスからの初乳、血清および乳汁におい”Ｃ決定され、かつ結果は表 １において与えられる。初乳は出産から２４時間以内にホルモン注射に続いて母 親からとられ、かつ乳汁は同腹子か１３ないし１５日目下あったとき母親からと られ、血清は乳汁と同じときに得られた。

これらのデータから、トランスジェニック動物は、特異的な抗体の産出のために 使用され得、そして特異的で有用な抗体を投与された乳汁を生ずる動物の繁殖を 可能にするとともに乳汁、初乳、血清、唾液等からの大規模な産出を可能にする ということは明らかである。トランスジェニック抗体の濃度は乳汁においてより も初乳においての方がより高いということもまた明らかである。さらに、トラン スジーンの存在は、大量の内因性の抗体を作るという動物の能力に影響を及はさ ない。動物は著しく免疫不全または不健康な状態の徴候を示さない。

氾 この例においては、トランスジェニックマウスからヒトｍｕ鎖を使用して抗原特 異ハイブリドーマが産出された。

例１において記述されるトランスジェニックマウスが、抗原組合せ部位に対する Ｈ鎖寄与がトランスジェニックヒトＨ鎖ミニ遺伝子座によって与えられる抗原特 異抗体を産出するために使用され得ることを示すために、トランスジェニックマ ウスはＩＯ２羊の赤血球（ＳＲＣ）で免疫された。牌臓細胞は６日後ＮＳＯブラ スマ細胞腫で融合された（コーラ（ＫＯｈｌｅｒ）およびミルスタイン（Ｍｉｌ ｓｔｅｉｎ）、自然（Ｎａｔｕｒｅ）、２５６号、４９５頁ないし４９７頁、１ ９７５年）。細胞は予期される播種頻度かウェル毎に１ハイブリドーマであるよ うに９６−ウェルコースタプレートで培養された。ヒトｍｕポジティブハイブリ ッドはビオチニル化された抗ヒトＩｇＭを使用しＥＬＩＳＡにおいて検出された 。抗原特異／Ｓイブ１ルノトは羊の赤血球を使用し赤血球凝集抗体において同定 された。ＥＬＩＳＡによって決定されたように、羊の赤血球に特異的な抗体を含 み、かつヒトｍｕを含み、しかしマウスｍｕまたはマウスガンマＨ鎖のどちらも 含まないウェルか選ばれた。

選択されたハイブリドーマによって分泌された抗体が本当にヒトｍｕ／マウスＩ ｆ抗ＳＲＣ免疫グロブリンであったことを示すために、蛍光活性化されたセルソ ータ（ＦＡＣ８）における分析が使用された。ＦＡＣＳ分析のためには、１０７ 羊の赤血球は３０分間２０ｕｌ培養上澄みでインキュベートされ、リン酸緩衝溶 液で一度洗われ、かつさらにビオチニル化された抗ヒトｍｕＨ鎖抗血清、ビオチ ニル化された抗マウスｍｕ抗血清またはビオチニル化された抗マウスカッパＬＭ 抗血清のどれかでインキュベ−１・される。３０分後細胞は前のように洗われか つＦＩＴＣ結合されたストレプトアビジンとともにインキュベートされた。

細胞は３０分後に洗われ、かつゆるやかな破壊の後分析のための用意ができた。

羊の赤血球抗原に対して向けられるＩｇＭを産出する３つの異なったハイブリッ ドに対する結果は図６、図７および図８のＦＡＣＳヒストグラムにそれぞれ示さ れている。

これらの図における文字Ａ、ＢＳＣおよびＤは異なった染色を表示する。図６Ａ 、図７Ａ、図８Ａは、羊の赤血球だけを、抗体でインキュベートされた羊の赤血 球を、またはフルオレセイン化された（ＦＩＴＣ）第２の抗体（抗ヒトｍｕ抗マ ウスｍｕ、抗マウスカッパのとれか）でインキュベートされた羊の赤血球を、使 用した負のコントロールに対する結果である。図６Ｂ、図７Ｂ、図８Ｂは、ハイ ブリッド培養上澄みおよびフルオレセイン化された（ＦＩＴＣ）抗ヒトｍｕでイ ンキュベートされた羊の赤血球を使用した結果である。図６０、図７Ｃ，図８Ｃ はトランスジェニックハイブリッドからの培養上澄みおよびフルオレセイン化さ れた（ＦＩＴＣ）抗マウスｍｕでインキュベートされた羊の赤血球を使用した結 果である。図６Ｄはハイブリッド培養上澄みおよびフルオレセイン化された（Ｆ ＩＴＣ）抗マウスカッパでインキュベートされた羊の赤血球を使用した結果であ る。

図６および図８において固定数の細胞の蛍光強度は細胞数に対してプロットされ る。図７においては、固定数の細胞の蛍光強度は散点に対してプロットされ、各 点は細胞を表わす。

プロフィルの右へのシフトは（増加された蛍光）、ヒトｍｕＨ鎖およびマウスカ ッパＬ鎖を含む抗体に対してのみ見られ得るが、マウスｍｕＨ鎖またはマウスガ ンマＨ＃Ｉを含む抗体に対しては見られ得ない（図示せず）ポジティブ染色を表 示する。

表１ マウス　血清　乳汁　初乳　乳汁　初乳ＴＧＩ　１０　０．６　２．１　９６０ 　６００ＴＧ２　６．３　０．５６　１．４　１０００　４２０ＴＧ３　１１． ３　１．３　ＮＤ　７３５　ＮＤＴＧ４　７．３　０．８　１．４　７８０　６ ６０ＴＧ５　３０　７．６　１０．０　１２５０　ＮＤＴＧ８　３４．６　５． ０　１０．０　５００　６００ＴＧ７　６．３　０．６４　０．９３　７８０　 ６００対照　０　０　０　１１３６　６６Ｏ ＮＤ、決定されず すべての濃度はｕｇ／ｍｌである ＠　Ｐ　ＲＲＫｅ　Ｘ　ＲＸ　ＲＲＸＨＫＸ　ａＱ悶曝誼審鰯告 ””””””’”””””””ｒＣＴ／ＧＢ８９１０１２０７国際調査報告 ＰＣＴ／ＧＯＢ９１０１２０７ ＳＡ　３１７７６

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．外来起源の免疫グロブリンの少なくとも一部をコードするか、または免疫グ ロブリンのレパートリーをコードするために再配列できる遺伝物質が、その生殖 系列に挿入されたトランスジェニック動物の細胞または体液から免疫グロブリン を得ることを含む、免疫グロブリンを産出する方法。
2. ２．免疫グロブリンを含むポリクローナル抗血清は動物から得られる、請求項１ に記載の方法。
3. ３．免疫グロブリンを含むモノクローナル抗体は動物から得られた細胞を使用し て産出される、請求項１に記載の方法。
4. ４．免疫グロブリンは動物の体液または分泌において産出される、請求項１に記 載の方法。
5. ５．免疫グロブリンは動物から得られた細胞からインビトロで産出される、請求 項１に記載の方法。
6. ６．挿入された遺伝物質は免疫グロブリンの全体の種特異的な領域を実質的にコ ードし、かつ特定の抗原に対する外来の免疫グロブリンは動物へのその後の抗原 の導入に反応して産出される、先行のいずれかの請求項に記載の方法。
7. ７．挿入された遺伝物質がヒト起源のものである、先行のいずれかの請求項に記 載の方法。
8. ８．挿入された遺伝物質が全体の免疫グロブリンをコードする、先行のいずれか に記載の方法。
9. ９．挿入された遺伝物質はプラスミドまたはコスミド、複合プラスミドまたはコ スミド、酵母人工染色体または哺乳動物染色体断片を含む、先行のいずれかの請 求項に記載の方法。
10. １０．遺伝物質が受精卵または胚の幹細胞に注入または他の方法によって挿入さ れる、先行のいずれかの請求項に記載の方法。
11. １１．動物が免疫グロブリンの定常部をコードする遺伝物質を最初は持たない、 先行のいずれかの請求項に記載の方法。
12. １２．先行のいずれかの請求項の方法によって産出された外来起源の免疫グロブ リン。
13. １３．外来起源の免疫グロブリンの少なくとも一部をコードするか、または免疫 グロブリンのレパートリーをコードするように再配列できる遺伝物質をその生殖 系列に挿入された、特に人以外の哺乳動物の、トランスジェニック動物。