JPH101431A - 充実性腫瘍治療法及び組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 腫瘍の標的化に有効であるリポソーム組成物
および方法を提供し、これによって全身性の血管外腫瘍
中に治療的用量レベルで結像剤または抗腫瘍剤を選択的
に局在化させること。 【解決手段】 充実性腫瘍中に、血流を介して腫瘍結像
剤または抗腫瘍剤を局在化するために使用されるリポソ
ーム組成物であって、小胞形成脂質と、ポリエチレング
リコール、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、およびポリ乳
酸／ポリグリコール酸コポリマーから選択される親水性
ポリマーで誘導体化された両親媒性小胞形成脂質１〜20
モル％とから成るリポソームであって、該腫瘍中への溢
出に充分なサイズを有するリポソーム、ならびにリポソ
ームに取り込まれた形態の腫瘍結像剤または抗腫瘍剤を
含む、リポソーム組成物。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はリポソーム組成物及
び方法、特に腫瘍診断および／または治療に使用するた
めのものに関する。

【０００２】

【従来の技術】血管外腫瘍診断および治療のためには、
結像化合物または治療化合物が血流を介して選択的に腫
瘍を標的化することが望ましい。診断学において、この
ような標的化は、腫瘍部位に高濃度の結像剤を提供し、
同時に、体の他の部分における結像剤のバックグラウン
ドのレベルを低減させるために使用されてきた。部位特
異的標的化は腫瘍の治療に有用であり、毒性の副作用を
低減し、かつ腫瘍部位へ安全に送達され得る薬剤の用量
を増加させる。

【０００３】リポソームは、結像化合物および治療化合
物の両者を包含する静脈内(IV)投与化合物のための薬剤
キャリヤーとして提案されている。しかし、血流を介す
る部位特異的標的化にリポソームを使用することは、網
内細胞系(RES)の細胞によるリポソームの迅速なクリア
ランスによって厳しく制限される。一般に、RESは１時
間以内にIV注射されたリポソームの用量の80〜95％を除
去し、リポソームの吸収について、選択された標的部位
と有効に競合する。

【０００４】RESのリポソーム吸収率を左右する種々の
ファクターが報告されている（たとえば、Gregoriadis,
1974（文献番号11）；Jonah（文献番号18）；Gregoria
dis,1972（文献番号10）；Juliano（文献番号19）；All
en, 1983（文献番号1b）；Kimelberg, 1976（文献番号2
1）；Richardson（文献番号29）；Lopez-Berestein（文
献番号24）；Allen, 1981（文献番号1a）；Scherphof
（文献番号32）；Gregoriadis, 1980（文献番号12）；H
wang（文献番号16）；Patel, 1983（文献番号39）；Sen
ior,1985（文献番号34）；Ellens（文献番号７）；Seni
or, 1982（文献番号33）；Ashwell（文献番号４）；Hak
omori（文献番号14）；Karlsson（文献番号20）；Schau
er（文献番号31）；Durocher（文献番号６）；Greenber
g（文献番号13）；Woodruff（文献番号38）；Czop（文
献番号５）；およびOkada（文献番号26））。簡単に述
べると、リポソームサイズ、電荷、脂質の飽和度、およ
び表面部分が、すべて、RESによるリポソームのクリア
ランスに関与する。しかし、長い血中半減期、およびよ
り詳細には、注射の24時間後の血流中のリポソームの比
較的高い百分率を提供するために有効なファクターは現
在までひとつも確認されていない。

【０００５】長い血中半減期に加えて、腫瘍部位への有
効な薬剤送達のためには、リポソームが、腫瘍に血液を
供給する血管の周囲の連続内皮細胞層およびその下の基
底膜に浸透することができることも要求される。腫瘍
は、損傷を受けた、漏れやすい内皮を与え得るが、特
に、腫瘍への血流が少ないこと、そのため循環するリポ
ソームに対する曝露が制限されることを考慮すると、リ
ポソームの有効量が腫瘍細胞に到達するためには、リポ
ソームが内皮細胞バリヤーおよび隣接する基底膜を通過
することを促進するメカニズムを有しなければならない
ことが一般に認識されている(Weinstein（文献番号3
7）)。ほとんどの腫瘍内で見いだされる、通常より高い
間隙圧によって、腫瘍からの液体の血管外への移動が生
じ、リポソームの溢出の機会が減少する傾向もある(Jai
n（文献番号17）)。指摘されているように、腫瘍中での
溢出に対するこれらのバリヤーを克服し、同時にRESに
よる認識および吸収を回避するリポソームを設計するこ
とは成功しそうもなかった(Poznanski（文献番号2
8）)。

【０００６】実際、いままで報告されている研究は、血
管への透過性が増大した場合でさえも、従来のリポソー
ムの管を通る溢出は著しく増加しないことを示している
(Poste)。これらの知見に基づき、疾病によって損なわ
れた毛管から、制限された検出レベル未満のリポソーム
の溢出が生じ得るとはいえ、その治療的有用性は最小で
あると結論された(Poste（文献番号27）)。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、腫瘍
の標的化に有効であるリポソーム組成物および方法を提
供することであり、これによって全身性の血管外腫瘍中
に治療的用量レベルで結像剤または抗腫瘍剤を選択的に
局在化させることである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明のリポソーム組成
物は、充実性腫瘍中に、血流を介して腫瘍結像剤または
抗腫瘍剤を局在化するために使用されるリポソーム組成
物であって、小胞形成脂質と、ポリエチレングリコー
ル、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、およびポリ乳酸／ポ
リグリコール酸コポリマーから選択される親水性ポリマ
ーで誘導体化された両親媒性小胞形成脂質１〜20モル％
とから成るリポソームであって、該腫瘍中への溢出に充
分なサイズを有するリポソーム、ならびにリポソームに
取り込まれた形態の腫瘍結像剤または抗腫瘍剤を含む。

【０００９】好適な実施態様によれば、上記親水性ポリ
マーは、約1,000〜5,000ダルトンの分子量を有するポリ
エチレングリコールである。

【００１０】好適な実施態様によれば、上記抗腫瘍剤の
少なくとも約80％は、リポソームに取り込まれた形態で
ある。

【００１１】好適な実施態様によれば、上記抗腫瘍剤は
アントラサイクリン抗生物質である。

【００１２】好適な実施態様によれば、上記アントラサ
イクリンは、ドキソルビシン、エピルビシン、およびダ
ウノルビシンならびに薬理学的に許容可能なその塩およ
び酸からなる群から選択される。

【００１３】好適な実施態様によれば、上記リポソーム
に取り込まれた上記抗腫瘍剤の濃度は、50μg(薬剤)/μ
mol(リポソーム脂質)を超える。

【００１４】本発明の方法は、充実性腫瘍中に血流を介
して局在化するためのリポソーム組成物の調製方法であ
って、腫瘍結像剤または抗腫瘍剤をリポソーム中に取り
込んで上記のリポソーム組成物を形成する工程を包含す
る。

【００１５】

【発明の実施の形態】本発明は、１つの局面によれば、
血流を介して下記の第IV章（腫瘍局在化法）に示すよう
に充実性腫瘍中に化合物を局在化させるために使用され
るリポソーム組成物であり、以下を包含する：この組成
物を形成するリポソームは、(i)小胞形成脂質、および
親水性ポリマーで誘導体化された両親媒性小胞形成脂質
１〜20モルパーセントから成り、かつ(ii)該腫瘍中への
溢出に充分なサイズを有する。好ましい実施態様におい
ては、上記リポソームは、約0.07〜0.12ミクロンの間の
範囲の選択された平均サイズを有する。化合物は取り込
まれた形でリポソーム中に含有される（すなわち、リポ
ソーム膜と結び付いているか、あるいはリポソーム内部
の水性部分内に内包される）。この文章中で、小胞形成
脂質とは、それ自体で、あるいは他の脂質と組み合わさ
れて二重層構造を形成するすべての脂質として定義され
る。

【００１６】好ましい実施態様において、親水性ポリマ
ーはポリエチレングリコール、ポリ乳酸、ポリグリコー
ル酸であり、約1,000〜5,000ダルトンの分子量を有し、
リン脂質へと誘導体化される。

【００１７】腫瘍の処置に使用するための、ある実施態
様における化合物は、アントラサイクリン抗生物質また
は植物アルカロイドであり、化合物の少なくとも約80％
は、リポソームに取り込まれた形であり、この薬剤は、
アントラサイクリン抗生物質の場合リポソーム中に少な
くとも約20μg(化合物)／μmol(リポソーム脂質)の濃度
で存在し、そして植物アルカロイドの場合１μg／μmol
（脂質）の濃度で存在する。

【００１８】関連する局面において、本発明は以下によ
って特徴付けられるリポソームの組成物を包含する： (a)小胞形成脂質、および親水性ポリマーで誘導体化さ
れた両親媒性小胞形成脂質１〜20モルパーセントから成
るリポソーム、(b)IV投与の24時間後に血液中に存在す
るリポソームマーカーのパーセントとして測定され、誘
導体化された脂質の不存在下でのリポソームのパーセン
トより数倍長い血中半減期、(c)約0.07〜0.12ミクロン
の間の選択されたサイズ範囲である平均リポソームサイ
ズ、および(d)リポソームに取り込まれた形の化合物。

【００１９】製剤がIV注射によって投与される場合、充
実性腫瘍中に局在化するための製剤を製造する方法も開
示される。この場合、IV投与の後、製剤は、注射後最初
の48時間の間、薬剤がほとんど漏れないリポソームに取
り込まれた形で血流中を運ばれる。この期間RESによる
吸収の割合が低いため、リポソームは腫瘍へと運ばれ、
そして腫瘍中に侵入する機会がある。一旦、腫瘍の間隙
空間に入ってしまえば、腫瘍細胞が実際にリポソームを
吸収(internalize)することは必要ではない。取り込ま
れた薬剤は、腫瘍の近傍で数日間から数週間にわたって
リポソームから放出される。この薬剤はさらに、腫瘍塊
中に（拡散プロセスによって）自由に浸透し、そして腫
瘍細胞中に直接侵入し、その抗増殖活性が作用する。こ
の方法は、上記で特徴付けたタイプのリポソームに薬剤
を取り込むことを包含する。アントラサイクリン抗生物
質または植物アルカロイド抗腫瘍剤を全身性充実性腫瘍
へと輸送させるために好適なリポソーム組成物の１つ
は、高相転移(high phase transition)リン脂質および
コレステロールを含む。このタイプのリポソームは、投
与後最初の24〜48時間、薬剤を放出する傾向がなく、そ
の間、血流中を循環するからである。

【００２０】他の局面において、本発明は被験体の充実
性腫瘍中に化合物を局在化する方法を包含する。この方
法は、(i)小胞形成脂質、および親水性ポリマーで誘導
体化された両親媒性小胞形成脂質１〜20モルパーセント
から成り、(ii)約0.07〜0.12ミクロンの間の選択された
サイズ範囲であり、かつ(iii)リポソームに取り込まれ
た形で化合物を含む、リポソームの組成物を調製するこ
とを包含する。組成物を、充実性腫瘍中に治療上有効な
用量の薬剤が局在化するに十分な量で患者にIV注射す
る。

【００２１】本発明のこれらの目的および他の目的なら
びに特徴は、以下の記載および実施例を添付図面と共に
読んだ場合に一層十分に明らかになる。

【００２２】（Ｉ．誘導体化された脂質の製造）図１
は、生体適合性親水性ポリマーで誘導体化される小胞形
成脂質を製造するための一般反応式を示す。生体適合性
親水性ポリマーの例としては、ポリエチレングリコール
(PEG)、ポリ乳酸、およびポリグリコール酸が挙げら
れ、これらは全て容易に水に溶解し、小胞形成脂質と結
合することができ、インビボで毒性作用なしに許容され
る。使用される親水性ポリマー、例えばPEGは、一方の
末端がメトキシ、エトキシ、または他の非反応性基によ
ってキャップされるか、あるいはその代わりに一方の末
端に他の末端よりもはるかに反応性が高い化学基を有す
ることが好ましい。ポリマーを下記のようにその末端の
一方で、適切な活性化剤、たとえばシアヌル酸、ジイミ
ダゾール、無水物試薬などで活性化する。次いで活性化
された化合物を小胞形成脂質、たとえばジアシルグリセ
ロールと反応させて、誘導体化された脂質を製造する。
このジアシルグリセロールは、ジアシルホスホグリセロ
ールを包含する。ここで２個の炭化水素鎖は、典型的に
は、炭素原子数14〜22の長さであり、種々の飽和度を有
する。ホスファチジルエタノールアミン(PE)がこの目的
に好適なリン脂質の例である。なぜなら活性化されたポ
リマーに結合するのに有利な反応性アミノ基を有するか
らである。あるいは、脂質基はポリマーとの反応のため
に活性化され得、あるいはこの２つの基は公知のカップ
リング法に従って協奏カップリング反応によって結合し
得る。一方の末端がメトキシ基またはエトキシ基でキャ
ップされたPEGは、種々のポリマーサイズ（たとえば、
分子量500〜20,000ダルトン）で市販されている。

【００２３】小胞形成脂質は、２個の炭化水素鎖、主と
してアシル鎖、および極性ヘッド基を有するものが好ま
しい。このクラスには、リン脂質、たとえばホスファチ
ジルコリン(PC)、PE、ホスファチジン酸(PA)、ホスファ
チジルイノシトール(PI)、およびスフィンゴミエリン(S
M)が包含され、ここで２個の炭化水素鎖は典型的には長
さが炭素原子数約14〜22であり、そして種々の度合の不
飽和度を有する。またこのクラスには、グリコ脂質、た
とえばセレブロサイドおよびモノシアロガングリオシド
が包含される。

【００２４】使用され得る他の小胞形成脂質は、コレス
テロールおよび関連するステロールである。一般に、コ
レステロールは、特にポリアルキルエーテルのような高
分子量ポリマーで誘導体化される場合、脂質二重層にあ
まりしっかりとは固定され得ない。従って、血流中でRE
Sからのリポソームの回避を促進するためにはあまり有
効ではない。

【００２５】さらに一般的には、本明細書中では「小胞
形成脂質」は、疎水性基と極性ヘッド基とを有するすべ
ての両親媒性脂質を包含することを意図する。そしてこ
れは(a)たとえばリン脂質のように水中でそれ自体で自
発的に二重層を形成し得るか、あるいは(b)リン脂質と
組み合わされて安定に脂質二重層中に組み込まれる（そ
の疎水性部分が二重層膜内部の疎水性領域と接し、そし
てその極性ヘッド基部分が膜の外部の極性表面に配向す
る）。後者のタイプの小胞形成脂質の例は、コレステロ
ール、ならびにコレステロールサルフェートおよびコレ
ステロールヘミサクシナートのようなコレステロール誘
導体である。

【００２６】本発明の１つの重要な特徴によれば、小胞
形成脂質は比較的流動的な脂質であり、典型的にはこれ
は、その脂質相が、比較的低い、液体から液晶への融点
（たとえば室温またはそれ以下）を有することを意味す
る。あるいは小胞形成脂質は比較的堅い脂質であり、こ
れは脂質が比較的高い融点（たとえば60℃まで）を有す
ることを意味する。原則として、より堅い脂質（すなわ
ち飽和脂質）は脂質二重層構造においてより高い膜硬度
に寄与し、そしてまた血清中でのより高い二重層の安定
性に寄与する。他の脂質成分、たとえばコレステロール
もまた、脂質二重層構造において膜の硬度および安定性
に寄与することが知られている。長鎖（たとえばC-18）
飽和脂質とコレステロールの組合せは、充実性腫瘍にア
ントラサイクリン抗生物質および植物アルカロイド抗腫
瘍剤を送達するために好適な組成物の１つである。これ
らのリポソームは、注射後最初の48時間の間に血流を通
って循環して腫瘍に入り、その間、血漿中に薬剤を放出
する傾向がないからである。アシル鎖が種々の飽和度で
あるリン脂質は市販されており、あるいは公開された方
法に従って製造することができる。

【００２７】図２は、PE-PEG脂質を製造する反応式を示
し、ここでPEGはシアヌルクロライド基によってPEに誘
導体化される。反応の詳細は例１に示す。簡潔に述べる
と、メトキシでキャップされたPEGを、炭酸ナトリウム
の存在下、図中に示す活性化されたPEG化合物を生じる
条件下で、シアヌルクロライドによって活性化する。こ
の材料を精製して、未反応のシアヌル酸を除去する。活
性化PEG化合物を、トリエチルアミンの存在下、PEと反
応させて、図中に示す所望のPE-PEG化合物を製造する。
収率はPEGの最初の量に対して約８〜10％である。

【００２８】いま記載した方法は、PE、コレステリルア
ミン、および糖−アミン基を有するグリコ脂質を包含す
る種々の脂質アミンに適用することができる。

【００２９】キャップされたPEGのようなポリアルキル
エーテルを脂質アミンにカップリングさせる第二方法
を、図３に示す。ここではキャップされたPEGをカルボ
ニルジイミダゾールカップリング試薬で活性化し、図３
中に示される活性化されたイミダゾール化合物を形成す
る。PEのような脂質アミンとの反応によって、図に示さ
れるポリエチレングリコール−ホスファチジルエタノー
ルアミン（PEG-PE）化合物で例示されるように、アミド
結合によって脂質と結合したPEGが導かれる。反応の詳
細は例２に示す。

【００３０】キャップされたポリアルキルエーテルを脂
質アミンにカップリングさせる第三の反応方法を図４に
示す。この場合、まずPEGをその一方の末端でトリメチ
ルシラン基で保護する。この末端保護反応を図中に示
す。この反応は、トリエチルアミンの存在下、トリメチ
ルシリルクロライドとPEGとを反応させることを包含す
る。次いで、保護されたPEGをトリフルオロメチルスル
ホナートの無水物と反応させて、トリフルオロメチルス
ルホナートで活性化されたPEG化合物を形成する。この
活性化された化合物とPEのような脂質アミンとをトリエ
チルアミンの存在下で反応させて、所望の誘導体化され
た脂質生成物、たとえばPEG-PE化合物を得る。この生成
物中で、脂質アミン基はポリエーテルポリマーの末端メ
チレン炭素を介してポリエーテルと結合する。トリメチ
ルシリル保護基は、図に示したような酸処理によって、
あるいは第４級アミンフルオライド塩、たとえばテトラ
ブチルアミンのフルオライド塩との反応によって脱離さ
れ得る。

【００３１】上記のような反応に加えて、公知の種々の
カップリング反応が、PEGのような親水性ポリマーによ
って誘導体化された小胞形成脂質の製造に適することが
理解される。たとえば、図４に示した無水スルホナート
カップリング試薬を、両親媒性脂質のヒドロキシル基、
たとえばコレステロールの5'-OHに、活性化されたポリ
アルキルエーテルを結合させるために使用することがで
きる。他の反応性脂質、たとえば酸またはエステル脂質
基もまた、公知のカップリング法に従ってカップリング
に使用することができる。たとえばホスファチジン酸の
酸基を、適切な無水物、たとえば無水酢酸と反応させて
活性化し、活性な脂質無水物を形成し、次いでこの反応
性脂質をイソチオシアナート試薬の存在下反応させて、
保護されたポリアルキルアミンに結合させることができ
る。

【００３２】他の実施態様においては、誘導体化された
脂質成分を、不安定な脂質−ポリマー結合、たとえばペ
プチド、エステル、またはジスルフィド結合を含むよう
に製造する。この結合は選択された生理的条件下、たと
えばペプチダーゼ酵素またはエステラーゼ酵素、あるい
はグルタチオンのような血流中に存在する還元剤の存在
下において切断され得る。図５は、(A)ペプチド含有結
合、(B)エステル含有結合、および(C)ジスルフィド含有
結合を介して結合した脂質の例を示す。ペプチド結合化
合物は、たとえば、まずポリアルキルエーテルをたとえ
ば図３で示した反応によって、図示したトリペプチドの
N-末端アミンにカップリングさせることによって製造さ
れ得る。次いでペプチドカルボキシル基を、常法に従っ
てカルボジイミドカップリング試薬によって脂質アミン
基に結合させ得る。エステル結合化合物は、たとえば、
ホスファチジン酸のような脂質酸を、無水物カップリン
グ剤によりアルコールを用いて、ポリアルキルエーテル
の末端アルコール基に結合させることによって製造され
得る。あるいは、内部エステル結合および適切な末端
基、たとえば第一アミン基を有する短い結合断片を用い
て、ポリアルキルエーテルを両親媒性脂質にアミドまた
はカルバメート結合によって結合させることができる。
同様に、図５のＣに示される化合物の形成に使用するた
めに、この結合断片は内部ジスルフィド結合を有し得
る。このような可逆的結合によってリン脂質に結合され
るポリマーは、注射後最初の数時間、これを含有するリ
ポソームの高い血中レベルを提供するために有用であ
る。この期間の後、血漿成分がこの可逆的結合を切断し
てポリマーが離脱し、そして「非保護」リポソームはRE
Sによって迅速に取り込まれる。

【００３３】図６は、ポリ乳酸をPEで誘導体化する方法
を示す。例４に詳述するように、ポリ乳酸をPEの存在下
にジシクロヘキシルカルボイミド(DCCI)と反応させる。
同様に、ポリグリコール酸で誘導体化した小胞形成脂質
もまた、例４に詳述するように、適切なカップリング
剤、たとえばDCCIの存在下に、ポリグリコール酸または
グリコール酸とPEとの反応によって形成し得る。ポリ乳
酸またはポリグリコール酸で誘導体化された小胞形成脂
質は、本発明の一部である。また本発明の一部を構成す
るものは、これらの誘導体化された脂質を１〜20モルパ
ーセント含有するリポソームである。

【００３４】（II．リポソーム組成物の製造） （Ａ．脂質成分）本発明のリポソームを形成する際に用
いられる脂質成分は、代表的にはリン脂質、スフィンゴ
脂質、およびステロールを包含する種々の小胞形成脂質
から選択され得る。以下に示すように、本発明のリポソ
ームの１つの必要条件は、長い血中循環寿命である。従
って、脂質成分の血中半減期に対する影響を評価するた
めに使用され得る血中寿命の標準化された測定を確立す
ることは有用である。

【００３５】インビボのリポソーム循環時間を評価する
ために用いられる１つの方法は、IV注射したリポソーム
の血流中およびRESの主要器官における分布を、注射後
選択された時間に測定することである。本明細書で用い
る標準化された方法において、RES吸収は、血流中の全
リポソームの、RESの主要な器官である肝臓および脾臓
中の全リポソームに対する割合として測定される。実際
には、例５で詳述するように、年齢および性別を合わせ
たマウスに放射性標識したリポソーム組成物を尾静脈に
IV注射し、そして各時間ポイントで、全血ならびに一緒
にした肝臓および脾臓で放射性標識カウントを測定して
決定する。

【００３６】肝臓および脾臓はRESによるリポソームの
初期吸収のほぼ100％を占めるので、上記の血液／RES割
合はインビボにおける血液からRESへの吸収程度を示す
良好な近似値を提供する。たとえば、約１またはそれ以
上の割合は注射されたリポソームのうち血流中に残存す
るものが優勢であることを示し、約１未満の割合はRES
中のリポソームが優勢であることを示す。目的とする脂
質組成物のほとんどに関して、血液／RES割合は注射後
１、２、３、４、および24時間後に算出した。

【００３７】本発明のリポソームは、第Ｉ章（誘導体化
された脂質の製造）に記載した親水性ポリマーで誘導体
化された小胞形成脂質の１〜20モルパーセントを含む。
本発明の１つの局面によれば、このリポソームの血中循
環半減期はこのリポソームを構成するリン脂質成分の飽
和度にほとんど依存しないことが見いだされた。すなわ
ち、リン脂質成分は、主に流動性の比較的不飽和のアシ
ル鎖、またはより飽和した堅いアシル鎖成分から成り得
る。本発明のこの特徴は例６中に示される。ここではPE
G-PE、コレステロール、およびPCで形成され、異なる飽
和度を有するリポソームの血液／RES割合を調べた（表
４）。この例の表５のデータから明らかなように、バル
クPCリン脂質における脂質不飽和の程度に関係なく、実
質的にすべてのリポソーム処方において高い血液／RES
割合が達成され、脂質飽和の程度の関数としての系統的
な傾向は全く観察されなかった。

【００３８】したがって、選択された度合の流動性また
は硬度を達成し、血清中のリポソームの安定性ならびに
リポソームからの取り込まれた薬剤の血流および／また
は腫瘍中への放出速度をコントロールするように、小胞
形成脂質を選択し得る。小胞形成脂質はまた、所望のリ
ポソーム製造特性を達成するように、脂質飽和特性にお
いて選択され得る。一般に、たとえばより流動性の脂質
は、より堅い脂質組成物よりも押出しおよび均質化方法
によって形成および小型化するのが容易である。

【００３９】同様に、リポソーム中のコレステロールの
百分率が、観察される血液／RES割合に対して著しい影
響を与えずに変化し得ることが見いだされた。例７Ａに
示した研究を表６と比較すると、０〜30モルパーセント
のコレステロールの範囲で血液／RES割合における実質
的な変化を示さない。

【００４０】さらに、本発明に従って行われた研究にお
いて、血液／RES割合が、荷電した脂質成分、たとえば
ホスファチジルグリセロール(PG)の存在によっても比較
的影響されないことが見いだされた。これは図７から明
らかである。これは、4.7モルパーセントのPG（三角
形）または14モルパーセントのPG（丸）のいずれかを含
むPEG-PGリポソームについて内包マーカーの損失率をプ
ロットしたものである。24時間にわたって血流中のリポ
ソーム保持の差は実質的に観察されなかった。RES吸収
に悪影響を与えることなくリポソーム中に負電荷を包含
させるという選択は、多くの可能性のある利点を提供す
る。負電荷を有するリポソーム懸濁液は、高いイオン強
度の緩衝液中における凝集にあまり敏感ではない傾向を
示し、それゆえ物理的安定性が増強される。また、リポ
ソーム膜中に存在する負電荷は、多量のカチオン性薬剤
を効果的に結合する処方手段として使用され得る。

【００４１】親水性ポリマーで誘導体化された小胞形成
脂質は、誘導体化された脂質のモルに基づき小胞形成脂
質の全モルの百分率として、好ましくは約１〜20モルパ
ーセントの量で存在する。より低いモル割合、たとえば
1.0モルパーセント未満は、より分子量の大きいポリマ
ー、たとえば100キロダルトンの分子量を有するポリマ
ーによる脂質誘導体に適切であり得ることが理解され
る。第Ｉ章（誘導体化された脂質の製造）に示したよう
に、誘導体化された脂質中の親水性ポリマーは、好まし
くは約200〜20,000ダルトン、より好ましくは約500〜5,
000ダルトンの分子量を有する。血液／RES割合に対する
極めて短いエトキシエーテル部分の影響を調べる例７Ｂ
によれば、血液／RES割合を著しく増加させるためには
炭素が約５個より大きいポリエーテル部分が必要とされ
ることが示される。

【００４２】（Ｂ．リポソーム組成物の製造）リポソー
ムを、Szoka等、1980（文献番号36）に詳述されている
ような種々の技術によって製造し得る。薬剤含有リポソ
ームを製造する１つの方法は、Szoka等によって記載さ
れ、そして米国特許第4,235,871号中に記載された逆相
蒸発法(reverse phase evaporation method)である。逆
相蒸発小胞(REV)は、約２〜４ミクロンの典型的な平均
サイズを有し、主にオリゴラメラであり、すなわち１つ
または数個の脂質二重層殻を有する。この方法を例４Ａ
中に詳述する。

【００４３】多重ラメラ小胞(MLV)を、簡単な脂質−フ
ィルム水和技術によって形成することができる。この操
作では、適切な有機溶媒中に溶解した上記タイプのリポ
ソーム形成脂質の混合物を容器中で蒸発させ、薄いフィ
ルムを形成する。次いで、このフィルムは例４Ｂ中で詳
述するように水性媒体によって覆われる。脂質フィルム
は水和されて、典型的には約0.1〜10ミクロンのサイズ
のMLVを形成する。

【００４４】本発明の１つの重要な局面に従って、リポ
ソームを、約0.07ミクロンと0.12ミクロンとの間の選択
されたサイズ範囲内で実質的に均一なサイズを有するよ
うに製造する。特に、このサイズ範囲内のリポソーム
は、以下の第III章（充実性腫瘍中のリポソームの局在
化）に記載するように、充実性腫瘍中に容易に溢出する
ことができ、そして同時に、実質的な量の積載薬剤を腫
瘍に運ぶことができる（薬剤積載能力が厳しく制限され
た小さな単ラメラ小胞とは異なる）。

【００４５】REVおよびMLVのための有効な分粒法(sizin
g)の１つは、0.03から0.2ミクロンの範囲、主として0.0
5、0.08、0.1、または0.2ミクロンの、選択された均一
な細孔サイズを有する一連のポリカーボネート膜を通し
てリポソームの水性懸濁液を押し出すことを伴う。膜の
細孔サイズは、特に同一の膜を通して２回またはそれ以
上押し出すことによって製造される場合、その膜を通し
て押し出されて製造されるリポソームの最も大きいサイ
ズにほぼ相当する。このリポソーム分粒の方法を、下記
例中に記載される均一サイズのREVおよびMLV組成物の製
造に用いる。より最近の方法は、非対称セラミックフィ
ルターを通す押出しを伴う。この方法は、1988年4月12
日に発行されたリポソーム押出しに関する米国特許第4,
737,323号に詳述されている。均質化方法もまた、100nm
またはそれ以下のサイズにリポソームを小型化するため
に有用である(マーチン（文献番号25）)。

【００４６】（Ｃ．化合物積載）１つの実施態様におい
て、本発明の組成物を、結像剤、たとえば⁶⁷Gaまたは
¹¹¹Inを含む放射性同位元素あるいは常磁性化合物を腫
瘍部位に局在化するために使用する。この適用において
は、放射性標識は比較的低濃度で検出され得るので、結
像剤を受動積載(passive loading)によって、すなわち
リポソーム形成の間に内包することで一般に十分であ
る。これは、たとえば内包される剤の水溶液で脂質を水
和することによって行われ得る。典型的な放射性標識剤
は、キレート形態の放射性同位元素、たとえば⁶⁷Ga-デ
スフェラルであり、実質的に取り込まれた形でリポソー
ム中に保持される。リポソーム形成および分粒の後、内
包されなかった材料を種々の方法のうちの１つで、たと
えばイオン交換またはゲル濾過クロマトグラフィーによ
って除去し得る。受動積載によって達成することができ
るキレート金属の濃度は水和媒体中の剤の濃度によって
限定される。

【００４７】放射性結像剤の能動積載(active loading)
もまた可能であり、これは高い親和性の水溶性キレート
剤（たとえばEDTAまたはデスフェロオキサミン）をリポ
ソームの水性コンパートメント内に取り込み、取り込ま
れなかったキレート剤をすべて透析またはゲル排除カラ
ムクロマトグラフィーによって除去し、より低い親和性
の脂溶性キレート剤（たとえば8-ヒドロキシキノリン）
に対してキレート形成した金属放射性同位元素の存在下
でこのリポソームをインキュベートすることによって行
われる。金属放射性同位元素は、脂溶性キレート剤によ
ってリポソーム中に運び込まれる。一旦リポソーム内に
入ると、放射性同位元素は、取り込まれた水溶性キレー
ト剤によってキレート形成され、リポソーム内部に放射
性同位体が効率的に捕捉される（ガビゾン，1988-1989
（文献番号９）)。

【００４８】受動積載はまた、比較的低い薬物用量（た
とえば約１〜15mg/m²）で治療上活性な、両親媒性の抗
腫瘍化合物、たとえばアルカロイドであるビンブラスチ
ンおよびビンクリスチンのために使用され得る。ここで
薬剤は、化合物の溶解度に応じて、脂質を水和するため
に使用される水性相中に溶解されるか、あるいはリポソ
ーム形成工程において脂質中に入れられるかのいずれか
である。リポソーム形成および分粒の後、遊離の（非結
合）薬剤は、上述のように、たとえばイオン交換または
ゲル排除クロマトグラフィー法によって除去され得る。

【００４９】抗腫瘍化合物がペプチドまたはタンパク質
薬剤、たとえばインターロイキン-2(IL-2)または組織壊
死因子(TNF)を含む場合、あるいはリポソームがペプチ
ド免疫調節物質、たとえばムラミルジ-またはトリ-ペプ
チド誘導体またはタンパク質免疫調節物質、たとえばマ
クロファージコロニー刺激因子(M-CSF)を含むように処
方される場合、リポソームは、上記逆相法によって、あ
るいはタンパク質と単ラメラ小胞の水による懸濁液との
凍結乾燥混合物を再水和することによって、製造される
ことが好ましい(キルビー（文献番号22）)。どちらの方
法も、受動積載を比較的高い内包効率、たとえば50％ま
での効率と結び付ける。内包されなかった材料は、たと
えば透析、透析濾過、または排除クロマトグラフィーに
よってリポソーム懸濁液から容易に除去することができ
る。

【００５０】リポソームに収容され得る疎水性薬剤の濃
度は、膜中の薬剤／脂質相互作用に依存するが、一般
に、約20μg(薬剤)/mg(脂質)未満の薬剤濃度に限定され
る。より詳細には、ドキソルビシンおよびエピルビシン
のような種々のアントラサイクリン抗生物質に関して、
受動積載によってリポソームの水性コンパートメントに
取り込むことができる、取り込まれる材料の最高濃度
は、（これらの化合物の固有水溶性が低いために）約10
〜20μg/μmol(脂質)である。PGのようなアニオン性リ
ン脂質が20〜30モルパーセント膜中に含まれると、積載
ファクターは約40μg/μmol(脂質)まで増加し得る。ア
ントラサイクリンは正に荷電しているので、負に荷電し
たPGと、膜界面で「イオン対」複合体を形成するからで
ある。しかし、このように荷電した複合体化したアント
ラサイクリンの処方物は、本発明の状況（IV投与の後、
最初の24〜48時間、薬剤がリポソームに取り込まれた形
で血流中を運ばれることが必要とされる）においては限
定された有用性を有しているに過ぎない。なぜならこの
薬剤は、血漿中に導入されたときリポソーム膜から迅速
に放出される傾向にあるからである。

【００５１】本発明の他の局面によれば、種々の両親媒
性抗腫瘍薬剤の治療上有効な薬用量を腫瘍に送達するた
めには、能動薬剤積載法によって高い薬剤濃度で薬剤を
リポソームに積載することが必須であることが見いださ
れた。たとえばアントラサイクリン抗生物質薬剤、たと
えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、
カルシノマイシン、N-アセチルアドリアマイシン、ルビ
ダゾン、5-イミドダウノマイシン、およびN-アセチルダ
ウノマイシンについては、リポソームに取り込まれる薬
剤の最終濃度は、約25μg/μmol(脂質)よりも高く、好
ましくは50μg/μmol(脂質)が望ましい。100〜200μg/
μmol(脂質)という高い内部薬剤濃度が企図される。

【００５２】両親媒性薬剤のリポソームへの能動積載の
ための１つの方法は、共有に係る米国特許第5192549号
に記載されている。この方法においては、リポソームを
比較的高濃度のアンモニウムイオン（たとえば0.125Mの
硫酸アンモニウム）の存在下で製造する。所望のサイズ
にリポソームを分粒した後、リポソーム膜を横切って内
側から外側へのアンモニウムイオン勾配が生じるように
リポソーム懸濁液を処理する。勾配は、アンモニウムを
含まない媒体、たとえば等張のグルコース媒体に対して
透析するか、あるいはゲル濾過、たとえば0.15MのNaCl
またはKClで平衡化したSephadex G-50カラム上でのゲル
濾過によって、外側の相のアンモニウムイオンをナトリ
ウムまたはカリウムイオンで効率的に置換することによ
って、生じさせることができる。あるいは、リポソーム
懸濁液をアンモニウムを含まない溶液で希釈して、これ
によって、外相のアンモニウムイオン濃度を低下させる
ことができる。リポソームの内側のアンモニウム濃度
は、外部リポソーム相の、好ましくは少なくとも10倍、
そしてより好ましくは少なくとも100〜1000倍である。

【００５３】次いで、このアンモニウムイオン勾配によ
って、アンモニウムがリポソーム膜を横切って放出され
プロトンがリポソームの内部水性相中に捕捉されるにつ
れ、pH勾配が生じる。リポソームに選択された薬剤を積
載するためには、リポソーム懸濁液（たとえば約20〜20
0mg/ml(脂質)）を薬剤の水溶液と混合し、そしてこの混
合物をある期間（たとえば数時間）にわたって、室温か
ら60℃までの温度（リポソームを形成するために使用す
る脂質の相転移温度に応じる）で平衡化させる。１つの
典型的な方法において、脂質濃度が50μmol/mlのリポソ
ーム懸濁液を、濃度約5〜8mg/mlのアントラサイクリン
薬剤の等容量と混合する。インキュベート期間の終わり
に、懸濁液を処理して遊離の（非結合）薬剤を除去す
る。アントラサイクリン薬剤についての薬剤除去の好ま
しい１つの方法は、Dowex 50 WX-4のような、この薬剤
と結合し得るイオン交換樹脂を通すことである。

【００５４】上記のように、ビンクリスチンのような植
物アルカロイドは抗腫瘍活性が本質的に高いので高い積
載ファクターでリポソームに積載される必要はなく、従
って受動取り込み法によって積載され得るが、能動法に
よってこれらの薬剤を積載することもまた可能である。
ビンクリスチンは両親媒性であり、かつ弱い塩基なの
で、ビンクリスチンおよび同様な分子は、アントラサイ
クリン抗生物質について上で述べたように、硫酸アンモ
ニウムを取り込むことによって形成されるpH勾配を用い
てリポソーム中に積載することができる。

【００５５】ここで記載した間接(remote)積載法は、例
10中に示される。そこでは、最終濃度約80〜100μg/μm
ol(脂質)までドキソルビシンを積載した0.1ミクロンのM
LVの製造が記載される。このリポソームを４℃で貯蔵し
た場合、薬剤の漏れ速度は極めて低い。

【００５６】（III．充実性腫瘍中のリポソームの局在
化） （Ａ．延長された血流半減期）本発明によれば、標的と
する腫瘍中のリポソームの局在化のための必要条件の１
つは、IVリポソーム投与の後の血流中における延長され
たリポソーム寿命である。血流中でのリポソーム寿命の
測定の１つは、上記のようにリポソーム投与から選択さ
れた時間の後に決定される血液／RES割合である。種々
のリポソーム組成物についての血液／RES割合を例５の
表３に示す。PEG誘導体化脂質の非存在下では血液／RES
割合は0.03またはそれ以下である。PEG誘導体化脂質の
存在下では血液／RES割合は、低分子量PEGについては0.
2から、いくつかの処方物については1.7〜４の間の範囲
であった。これらの処方物のうち１つはコレステロール
を欠き、そして３つは荷電したリン脂質（たとえばPG）
が添加されていない。

【００５７】例６の表５に示したデータは、約1.26と3.
27との間の血液／RES割合（回収率が低い２点を除く）
を示し、表３に示すデータと一致する。上記第II章（リ
ポソーム組成物の製造）に示したように、血中寿命の値
は、リポソーム脂質の飽和度、コレステロールの存在、
および荷電した脂質の存在に実質的に無関係である。

【００５８】上述の血液／RES値を、共有に係る米国特
許第4,920,016号で報告された血液／RES値と比較するこ
とができる。この特許では、表３および５で示されるデ
ータを得るために使用されたのと同様の血液／RES測定
法を用いた。上記特許で報告された最高の24時間での血
液／RES割合は、モノシアロガングリオシド（GM₁）、飽
和PC、およびコレステロールからなる処方物について
の、0.9であった。次に高い24時間での血液／RES割合を
与える処方物の値は約0.5であった。従って、本発明に
よる処方物のうちの多くで得られる典型的な24時間での
血液／RES割合は、いままで報告されてきた最も優れた
処方より２倍も高い。さらに、GM₁またはHPI脂質による
高い血液／RESを達成する能力は、主としてリポソーム
中の飽和脂質およびコレステロールの存在に依存した。

【００５９】血流中におけるリポソームマーカーの血漿
薬物動態は、本発明のリポソーム処方によって達成され
る延長されたリポソーム寿命の、別の尺度を提供し得
る。図７および図８は、典型的なPEG−リポソーム処方
物において、マーカーが脂質であるかあるいは内包され
た水溶性化合物であるかに実質的に関係なく、リポソー
ムマーカーが血流から24時間にわたってゆっくりと失わ
れることを示す（図８）。どちらのプロットでも、リポ
ソーム注射の24時間後に存在するリポソームマーカーの
量は、元々注射される材料の10％より多い。

【００６０】図９は、典型的なPEG-リポソーム処方物お
よびPEG誘導体化脂質を含まない同様のリポソームにつ
いて、血流からのリポソームの損失のキネティックスを
示す。24時間後、PEG-リポソーム中に残存するマーカー
の百分率は約20％より高いが、通常のリポソームでは、
血液中で３時間後には保持率が５％未満であり、そして
24時間の時点ではマーカーは実質的に検出されなかっ
た。

【００６１】図７〜９に示した結果は、種々のリポソー
ム処方物について測定され、以下の例５〜８の表３およ
び表５〜７に記載された24時間での血中リポソーム値と
整合する。例５の表３に示されるように、従来のリポソ
ームでは24時間における血中残存薬用量の百分率は１％
未満であるのに対し、PEG-リポソームでは少なくとも５
％であった。最良の処方では、約20〜40％の間の値が得
られた。例６の表５においても同様に、24時間後の血中
リポソームレベルは投与された総薬用量の12％と約25％
との間であった（回収値の少ない２つは再び無視す
る）。同様の結果が、例７の表６および７に報告され
る。

【００６２】リポソームが全身性腫瘍に到達し、かつ侵
入する機会を提供するために必要とされる、リポソーム
が24〜48時間にわたって血流中で両親媒性抗腫瘍薬剤を
保持する能力もまた研究された。例11で報告される研究
において、PEG-リポソームに積載されたドキソルビシ
ン、遊離形態で与えられるドキソルビシン、および水素
化ホスファチジルイノシトール(HPI)を含むリポソーム
中に積載されたドキソルビシンの血漿薬物動態を、ビー
グル犬で調べた。HPIリポソームは、ほぼ飽和したPC脂
質とコレステロールとから処方され、共有に係る上記米
国特許で記載された最適処方の１つを代表する。薬剤投
与から72時間までの血液中でのドキソルビシンのキネテ
ィックスを図１０に示す。どちらのリポソーム処方物も
薬剤の一次指数関数的減少を示すが、対照的に遊離薬剤
は二次指数関数的パターンを示す。しかし、72時間にお
ける血流中の薬剤保持量は、PEG-リポソームが約８〜10
倍多かった。

【００６３】血液／RES割合および血流中のリポソーム
保持時間の両方に関して、モデル動物系から得られるデ
ータから、ヒトおよび目的とする家畜用動物に対して合
理的な推定をすることができる。これは、肝臓および脾
臓によるリポソームの吸収が、マウス、ラット、サル、
およびヒトを含むいくつかの哺乳類において同様の速度
で生じることが見いだされているからである(Gregoriad
is, 1974（文献番号11）; Jonah（文献番号18）; Kimel
berg, 1976（文献番号21）; Juliano（文献番号19）; R
ichardson（文献番号29）; Lopez-Berestein（文献番号
24）)。この結果は、RESによるリポソームの吸収におい
て最も重要であると考えられる生化学的因子−血清リポ
タンパク質によるオプシン化、サイズに依存する吸収効
果、および表面部分による細胞保護を包含する−が、試
験された全ての哺乳類において共通する特徴であるとい
う事実を反映していると思われる。

【００６４】（Ｂ．腫瘍への溢出）本発明によれば、充
実性腫瘍を標的化する高活性リポソームのために要求さ
れる他の特徴は、毛細血管によって供給を受ける腫瘍細
胞から毛細血管を分離する内皮細胞バリヤーおよびその
下の基底膜を通って、リポソームが腫瘍中に溢出するこ
とである。この特徴は、0.07ミクロンと0.12ミクロンと
の間のサイズのリポソームにおいて最適化される。

【００６５】選択された薬剤の標的化のためにはリポソ
ームの腫瘍への送達が必要とされ、このことは例12で報
告される研究によって示され得る。マウスにJ-6456リン
パ腫を皮下接種し、このリンパ腫は１〜２週間後に約１
cm³の充実性腫瘍塊を形成した。次に、この動物に、遊
離のドキソルビシンかあるいはPEG-リポソームに積載さ
れたドキソルビシンのいずれかを体重１kg当り10mgの薬
用量で注射した。薬剤投与の４時間後、24時間後、およ
び48時間後に、薬剤の組織分布（心臓、筋肉、および腫
瘍）を検定した。図１１のＡは、遊離薬剤について得ら
れた結果を示す。腫瘍中への選択的な薬剤蓄積は起こら
ず、実際、初期薬剤レベルが最も高いのは、最も高い毒
性が生じる心臓であった。

【００６６】比較すると、PEG-リポソームは４〜24時間
の間、腫瘍中への薬剤の蓄積の増加を示し、そして24時
間と48時間との間、高い選択的腫瘍レベルを示した。心
臓および筋肉組織による薬剤の吸収は両方とも、対照的
に、遊離薬剤よりも低い。図１１のＢにおいてプロット
されたデータからわかるように、注射24時間後には、腫
瘍は健康な筋肉に比べて８倍、そして心臓に比べて６倍
の量の薬剤を含んでいた。

【００６７】PEG-リポソームがより多くの抗腫瘍薬剤を
腹腔内腫瘍に送達することを確認するために、マウスの
グループに10⁶のJ-6456リンパ腫細胞を腹腔内(IP)注射
した。５日後、IP腫瘍が確立され、そして遊離薬剤形態
またはPEG-含有リポソームに取り込まれた形態のいずれ
かで、10mg/kgのドキソルビシンでこの動物をIV処置し
た。薬剤の組織分布を例12の表９に示す。示されたよう
に、リポソーム送達では遊離薬剤よりも腫瘍／心臓割合
は24時間で約272倍高く、そして48時間では約47倍高か
った。

【００６８】表９に示された結果がリポソームがそのま
まで腫瘍の管外領域に入るためであることを例証するた
めに、腫瘍組織を細胞画分および上清画分（細胞間液
体）に分離し、両画分中のリポソームに結び付いた薬剤
および遊離薬剤の存在を検定した。図１２は、薬剤の全
量（黒菱形）、ならびに腫瘍細胞中に存在する薬剤量
（黒まる）およびリポソームに結び付いた形で上清中に
存在する薬剤量（黒三角）を、注射後48時間にわたって
示す。リポソームに結び付いた薬剤を検定するために、
上清をイオン交換樹脂に通して遊離薬剤を除去し、上清
中に残存する薬剤を検定した（黒三角）。示されるよう
に、腫瘍中の薬剤のほとんどはリポソームに結び付いて
いる。

【００６９】腫瘍細胞中へのリポソームの溢出のさらな
る例証は、例14に詳述するように、正常な肝組織および
充実性腫瘍におけるリポソームの分布を顕微鏡で直接観
察することによって得られた。図１３は、PEG-リポソー
ムのIV注射24時間後の正常な肝組織中でのリポソームの
分布（小さい、濃く染色された部分）を示す。リポソー
ムはもっぱらクッパー細胞中に限定され、正常肝組織の
肝細胞中または細胞間液体中のいずれにも存在しない。

【００７０】図１４は、マウスの肝臓中に移植されたC-
26結腸癌の領域の、PEG-リポソーム注射から２４時間後
を示す。図中、毛細血管領域中、内皮細胞バリヤーおよ
び基底膜上の腫瘍組織側でリポソームの濃縮が明らかで
ある。リポソームはまた腫瘍細胞の細胞間液体中にも豊
富に存在し、これは毛細内腔から腫瘍への通過のさらな
る証拠である。図１５の顕微鏡写真は腫瘍の別の領域を
示し、ここでもまた細胞間液体中にリポソームが豊富で
あることが明らかである。同様な知見が、図１６に示さ
れるように皮下注射されたC-26結腸癌細胞領域へのリポ
ソームの溢出について得られた。

【００７１】（IV.腫瘍局在化法）上で詳述したよう
に、血流中でのリポソームの延長された寿命、ならびに
腫瘍中に溢出することを可能にし、比較的高い薬剤運搬
能力を可能にし、かつリポソームが腫瘍に分配され侵入
するのに必要とされる時間（注射後、最初の24〜48時
間）の間、取り込まれた薬剤の漏れを最小にとどめるこ
とを可能にするリポソームサイズのために、本発明のリ
ポソームは特に充実性腫瘍領域に局在化するに有効であ
る。従って、このリポソームは、このようなリポソーム
に化合物を取り込み、そしてこのリポソームを被験体に
IV注射することによって化合物を選択的に充実性腫瘍に
局在化させる有効な方法を提供する。本明細書におい
て、充実性腫瘍とは（たとえば、白血病のような血液性
腫瘍とは対照的に）血流の外側の解剖学的部位で増殖
し、そしてこの増殖する腫瘍塊に栄養等を供給する小血
管および毛細管の形成が必要とされる腫瘍として定義さ
れる。この場合、IV注射されたリポソーム（および取り
込まれた抗腫瘍薬剤）が腫瘍部位に到達するためには、
リポソームは血流から離れ、腫瘍中へと侵入しなければ
ならない。１つの実施態様において、この方法は抗腫瘍
薬剤を選択的に腫瘍中に局在化させることによる腫瘍の
処置のために使用される。使用され得る抗腫瘍薬剤は任
意の化合物であり、以下に挙げる化合物を包含し、これ
らの化合物は、適切な積載ファクターでリポソーム中に
安定に取り込まれることができ、かつ治療上有効な薬用
量（各化合物の後のかっこの中に示す）で投与すること
ができる。これらの化合物は両親媒性抗腫瘍化合物、た
とえば植物アルカロイドであるビンクリスチン(1.4mg/m
²)、ビンブラスチン(4〜18mg/m²)、およびエトポサイド
(35〜100mg/m²)、ならびにドキソルビシン(65〜75mg/
m²)、エピルビシン(60〜120mg/m²)、およびダウノルビ
シン(25〜45mg/m²)を含むアントラサイクリン抗生物質
を包含する。メトトレキセート(3mg/m²)、シトシンアラ
ビノサイド(100mg/m²)、およびフルオロウラシル(10〜1
5mg/m²)のような水溶性抗代謝産物、ブレオマイシン(10
〜20単位/m²)、マイトマイシン(20mg/m²)、プリカマイ
シン(25〜30μg/m²)、およびダクチノマイシン(15μg/m
²)のような抗生物質、ならびにシクロホスファミド(3〜
25mg/kg)、チオテパ(0.3〜0.4mg/kg)、およびBCNU(150
〜200mg/m²)を含むアルキル化剤もまた、この目的にお
いて有用である。上述のように、ビンクリスチンによっ
て例示される植物アルカロイドならびにドキソルビシ
ン、ダウノルビシン、およびエピルビシンを含むアント
ラサイクリン抗生物質は、好ましくは能動的にリポソー
ムに積載され、受動積載によって達成され得るよりも数
倍高い薬剤／脂質割合を達成する。また上述のように、
リポソームは内包された、IL-2のような腫瘍治療用のペ
プチド薬剤およびタンパク質薬剤、および／またはTN
F、および／またはM-CSFのような免疫調節剤を含み得、
これらは単独で存在するか、あるいはアントラサイクリ
ン抗生物質薬剤のような抗腫瘍薬剤と組み合わされて存
在する。

【００７２】本発明によって充実性腫瘍を有効に処置す
る能力は、種々のインビボ系で示された。例15で報告さ
れる方法では、C-26結腸癌を皮下移植された動物におい
て腫瘍の増殖速度を比較する。遊離形態または本発明に
よるPEG-リポソームに取り込まれた形態のいずれかでの
エピルビシンによる処置を行い、結果を図１７のＡ〜Ｃ
に示した。示されるように、そしてさらに例15で詳細に
述べられるように、エピルビシンを積載したPEG-リポソ
ームによる処置によって腫瘍増殖が著しく抑制され、そ
して通常の致死量の腫瘍細胞を接種された動物のグルー
プの中で長期間生存するに至った。さらに、エピルビシ
ン積載PEG-リポソームによる動物の遅延処置によって、
確立された皮下腫瘍の退化が生じた。遊離薬剤による処
置では見られない結果である。

【００７３】例16で詳述するように、同様の結果がマウ
スの腹腔内に移植されたリンパ腫の処置について得られ
た。ここでは、遊離形態またはPEG-リポソームに取り込
まれた形態のドキソルビシンで動物を処置した。腫瘍移
植および薬剤処置から100日間にわたる生存率を図１８
に示す。その結果は上述の結果と同様であり、PEG-リポ
ソームによって、遊離薬剤処置に比べて生存時間中間値
および生存率の著しい上昇が見られた。

【００７４】従来のリポソームに取り込まれたドキソル
ビシンによる腫瘍の処置ではモデル動物系および臨床試
験において毒性の低下が観察されているので（たとえば
米国特許第4,898,735号で報告されているように）、本
発明の腫瘍処置法で提供される毒性保護の度合を決定す
ることは興味深い。例17で報告される研究において、遊
離形態あるいは従来のリポソームまたはPEG-リポソーム
に取り込まれた形態のドキソルビシンまたはエピルビシ
ンの薬用量を増加させて、動物にIV注射した。種々の薬
剤処方についての最大許容薬用量(MTD)をこの例の表11
に示す。どちらの薬剤でも、PEG-リポソームへ取り込む
ことによって、薬剤のMTDはおよそ２倍になる。同様の
保護は従来のリポソームによって達成された。

【００７５】毒性の低下は上記で報告された腫瘍処置の
効力の増加に寄与し得るが、リポソーム溢出による薬剤
の選択的な局在化もまた薬剤の効力の増加のために重要
である。このことは例18に記載される薬剤処置法におい
て例証される。ここではドキソルビシンを含む従来のリ
ポソーム（IV投与した場合、溢出による腫瘍での吸収を
ほとんど示さないかあるいは全く示さない）を、皮下移
植腫瘍の増殖速度を低減させる同一の薬用量(10mg/kg)
で、遊離薬剤と比較した。図１９では、生理食塩水コン
トロール（実線）、遊離薬剤（黒丸）、および従来のリ
ポソーム（黒三角）について腫瘍移植の後の日数での腫
瘍サイズをプロットする。明らかなように、従来のリポ
ソームは同一の薬用量の遊離薬剤よりも大きい度合での
腫瘍の増殖の抑制はしない。この知見は、図１７のＡ〜
Ｃおよび図１８に示された結果ときわだって対照的であ
る。これらの図においては、PEGリポソームに取り込ま
れたアントラサイクリン抗腫瘍薬剤によって腫瘍を有す
る動物を処置すると、遊離の薬剤に比べて生存率および
腫瘍増殖の抑制が向上することが示されている。

【００７６】このように、この腫瘍処置法はリポソーム
中の薬剤毒性の低下によって投与すべき薬剤のレベルを
高めることを可能とし、かつ腫瘍の細胞間液体中のリポ
ソームの選択的局在化によって薬剤の効力を高めること
を可能とする。

【００７７】リポソーム溢出によって腫瘍中に選択的に
化合物を局在化させる能力はまた、腫瘍の診断のために
結像剤の腫瘍への標的化を改良するためにも利用できる
ことが理解される。この場合、結像剤、典型的にはキレ
ート形態の放射性同位体または常磁性分子がリポソーム
中に取り込まれ、次いで検査される被験体にIV投与され
る。選択された期間（典型的には24〜48時間）の後に、
たとえば放射性同位体の場合にはガンマシンチレーショ
ンラジオグラフィーによって、あるいは常磁性剤の場合
にはNMRによって被験体をモニターし、結像剤の局所的
な吸収領域を検出する。

【００７８】

【実施例】以下の実施例は、循環時間が増大したリポソ
ームの製造法、およびインビボおよびインビトロにおけ
る循環時間の評価の例示である。これらの例は本発明の
特定のリポソーム組成物および方法の具体例を例示する
ことを意図し、本発明の範囲を限定することをいかなる
意味でも意図しない。

【００７９】（材料）コレステロール（Chol）は、シグ
マ（セントルイス、MO）から入手した。スフィンゴミエ
リン（SM）、卵ホスファチジルコリン（レシチン又はP
C）、組成IV40、IV30、IV20、IV10、及びIV1（表４を参
照のこと）を有する部分的に水素化されたPC、ホスファ
チジルグリセロール（PG）、ホスファチジルエタノール
アミン（PE）、ジパルミトイル−ホスファチジルグリセ
ロール（DPPG）、ジパルミトイルPC（DPPC）、ジオレイ
ルPC（DOPC）及びジステアロイルPC（DSPC）は、アバン
チ極性脂質（バーミンガム、AL）又はオースチンケミカ
ル社（シカゴ、IL）から入手した。

【００８０】〔¹²⁵Ｉ〕−チラミニル−イヌリンを、公
知処理に従って製造した。⁶⁷ガリウム-8-ヒドロキシキ
ノリンは、NENネオスカン（ボストン、MA）によって供
給された。ドキソルビシンHCl及びエピルビシンHClを、
アドリア研究所（コロンバス、OH）又はファルミタリア
カルロエルバ（ミラノ、イタリー）から入手した。

【００８１】（例１：シアヌル酸クロライドによって結
合されたPEG-PEの製造） （Ａ．活性化されたPEGの製造）活性化されたPEGとこれ
まで呼ばれている2-O-メトキシポリエチレングリコール
1900-4,6-ジクロロ-1,3,5トリアジンを、次の変法を伴
って J. Biol. Chem.、252: 3582(1977)中に記載した様
に製造した。

【００８２】シアヌル酸クロライド（5.5g：0.03モル）
を、無水炭酸ナトリウム10gを含有する無水ベンゼン400
ml中に溶解し、PEG-1900（19g；0.01モル）を加え、混
合物を一晩室温で撹拌した。溶液を濾過し、石油エーテ
ル600ml（沸騰範囲、35〜60°）を、撹拌しながらゆっ
くり加えた。微細な沈殿をフィルター上に集め、ベンゼ
ン400ml中に再溶解した。沈殿及び濾過工程を、石油エ
ーテルが残存シアヌル酸クロライドを含有しなくなるま
で数回くり返した。これは5-m“リクロソルブ(LiChroso
rb)”（イー・メルク社）のカラム（250×3.2mm）上で
ヘキサンで展開され、紫外線検出器で検出される高圧液
体クロマトグラフィーによって測定された。水性緩衝液
中でpH10.0、室温で一晩の加水分解の後、活性化された
PEG-1900を硝酸銀で滴定して、PEGモルあたり離脱した
クロライド1.7モルの値が得られた。

【００８３】生成物のTLC分析を、J.T. Baker社（フィ
リップスバーグ、NJ）から入手したTLC逆相プレート
で、展開剤としてメタノール−水、４：１；v/vを用い
て視覚化のためにヨウ素蒸気にさらして行った。この条
件下で、出発メトキシポリグリコール1900はR_f＝0.54〜
0.60で現われた。活性化されたPEGはR_f＝0.41で現われ
た。未反応シアヌル酸クロライドは、R_f=0.88で現わ
れ、除かれた。

【００８４】活性化されたPEGを、窒素について分析
し、適当な修正を、次の合成工程に使用する反応成分の
量の選択の際に用いた。従って、生成物が理論量の20％
しか窒素を含有しなかった場合、次の合成工程で使用さ
れる材料の量を、100/20まで、すなわち５倍まで増加し
た。生成物が理論量の50％の窒素を含有した場合、100/
50すなわち２倍の増加が必要とされた。

【００８５】（Ｂ．N-(4-クロロ-ポリグリコール1900)-
1,3,5-トリアジニル卵ホスファチジルエタノールアミン
の製造）ねじブタ付き試験管中で、クロロホルム中に卵
ホスファチジルエタノールアミンの100mg/ml（0.100mmo
l）貯蔵溶液の0.74mlを、窒素を流しながら蒸発乾固
し、Ａ欄に記載した活性化されたPEGの残部に205mg（0.
100mmol）の供給量で加えた。この混合物に、５mlの無
水ジメチルホルムアミドを加えた。トリエチルアミン27
マイクロリットル（0.200mmol）を混合物に加え、空気
を窒素ガスで置換した。混合物を、110℃で保った砂浴
中で一晩加熱した。

【００８６】次いで混合物を減圧下で蒸発乾固し、結晶
性固体ののり状塊を得た。この固体を、アセトン４容量
及び酢酸１容量の混合物５ml中に溶解した。生じた混合
物を、シリカゲル（メルクシリカゲル60，70−230メッ
シュ）で充填された21mm×240mmクロマトグラフィー吸
着カラムの頭部に置いた。このシリカゲルは先にアセト
ン及び酢酸、80/20；v/vから成る溶剤で湿らせた。

【００８７】カラムクロマトグラフィーを、同一の溶剤
混合物で展開し、別々の溶出液の一部20〜50mlを集め
た。展開剤として2-ブタノン／酢酸／水；40/25/5；v/v
/vを用いて及び視覚化のためにヨウ素蒸気さらして、シ
リカゲル被覆されたプレート上でTLCにより溶出液の各
々の部分を検定した。R_f＝約0.79の材料しか含有しない
画分を一緒にし、減圧下で蒸発乾固した。高減圧下で恒
量まで乾燥して、リンを含有するほとんど無色の固体N-
(4-クロロ-ポリグリコール1900)-1,3,5-トリアジニル卵
ホスファチジルエタノールアミン86mg（31.2マイクロモ
ル）を得た。

【００８８】固体化合物を、24mlのエタノール／クロロ
ホルム；50/50クロロホルム中に取り、遠心分離して、
不溶性物質を除去した。澄明化された溶液の減圧下での
蒸発乾固により、無色固体21mg（7.62マイクロモル）を
得た。

【００８９】（例２：カルバマート及びアミドで連結さ
れた親水性ポリマーとPEの製造） （Ａ．ポリエチレングリコールメチルエーテル1900のイ
ミダゾールカルバマートの製造）Aldrich Chemical co.
から入手したポリエチレングリコールメチルエーテル19
00 9.5グラム（５mmol）をモレキュラーシーブで乾燥し
たベンゼン45ml中に溶解した。純粋なカルボニルジイミ
ダゾール0.89グラム（5.5mmol）を加えた。純度を赤外
スペクトルで調べた。反応容器中の空気を窒素で置換し
た。容器を密封し、砂浴中で75℃で16時間加熱した。

【００９０】反応混合物を冷却し、室温で澄明な溶液が
形成した。溶液を乾燥ベンゼンで50.0mlに希釈し、PEG
エーテル1900のイミダゾールカルバマートの100マイク
ロモル/ml貯蔵溶液として冷蔵庫中に保存した。

【００９１】（Ｂ．ポリエチレングリコールメチルエー
テル1900のホスファチジルエタノールアミンカルバマー
トの製造）ポリエチレングリコールメチルエーテル1900
のイミダゾールカルバマートの100mmol/ml貯蔵溶液の1
0.0ml（１mmol）を10mlナス型フラスコ中にピペットで
入れた。溶剤を減圧下に除去した。クロロホルム（0.5m
mol）中の卵ホスファチジルエタノールアミンの100mg/m
l溶液の3.7mlを加えた。溶剤を減圧下で蒸発した。1,1,
2,2-テトラクロロエチレン2ml及び139マイクロリットル
（1.0mmol）のトリエチルアミンを加えた。容器を閉
じ、95℃に保たれた砂浴中で６時間加熱した。この時、
薄層クロマトグラフィー分析を上記混合物の画分を用い
て行い、ブタノン／酢酸／水；40/5/5；v/v/v；を展開
剤として使用して、SiO₂被覆されたTLCプレート上に結
合する程度を測定した。Ｉ₂蒸気視覚化により、R_f＝0.6
8の遊離ホスファチジルエタノールアミンのほとんどが
反応し、 R_f＝0.78〜0.80のリン含有脂質によって置換
されたことが明らかとなった。

【００９２】残存する反応混合物中の溶剤を、減圧下で
蒸発した。残留物をメチレンクロライド10ml中に入れ、
予めメチレンクロライドで洗浄したメルクシリカゲル60
（70-230メッシュシリカゲル）で充填されたクロマトグ
ラフィー吸着カラム21mm×270mmの頭部に置いた。混合
物を下記の溶剤を順番に用いてカラムに通過させた。

【００９３】

【表１】

【００９４】溶出液の一部を50ml集め、各々の部分を、
SiO₂被覆されたプレー卜上でTLCによって検定した。そ
の際クロロホルム／メタノール／水／濃水酸化アンモニ
ウム；130/70/8/0.5％；v/v/v/vで展開後、視覚化のた
めにＩ₂蒸気吸着を用いた。ホスファートのほとんど
が、画分11，12，13及び14中に見い出された。

【００９５】これらの画分を一緒にし、減圧下で蒸発乾
固し、高減圧で恒量まで乾燥した。これにより、ポリエ
チレングリコールメチルエーテルのホスファチジルエタ
ノールアミンの無色のワックス状物669mgを得た。これ
は263マイクロモルであり、ホスファチジルエタノール
アミンを基準に52.6％の収率を示した。

【００９６】重クロロホルム中に溶解された生成物のNM
Rスペクトルは、δ＝3.4ppmでエチレンオキサイド鎖の
メチレン基に帰因する強いシングレットと共に、卵PEの
スペクトルに相当するピークを示した。エチレンオキサ
イドからのメチレンプロトンとPEアシル基の末端メチル
プロトンとの割合は、所望の生成物ポリエチレングリコ
ール結合ホスファチジルエタノールアミンカルバマート
(分子量2,654)の分子のポリエチレンオキサイド部分の
約2000の分子量を確認するのに十分な大きさであった。

【００９７】（Ｃ．ホスファチジルエタノールアミンの
ポリ乳酸アミドの製造）ポリ（乳酸）、分子量＝2,000
（ICN，クリーブランド、オハイオ州）200mg（0.1mmo
l）を、ジメチルスルホキシド2.0ml中に、材料が完全に
溶解する様に撹拌しながら加熱して溶解した。次いで溶
液を直ちに65℃まで冷却し、ジステアロイルホスファチ
ジル−エタノールアミン（Cal. Biochem, La Jolla）75
mg（0.1mmol）とジシクロヘキシルカルボジイミド41mg
（0.2mmol）の混合物上に注いだ。次いでトリエチルア
ミン28ml（0.2mmol）を加え、空気を窒素ガスでチュー
ブから追い出し、チューブに栓をし、65℃で48時間加熱
した。

【００９８】この時間の後に、チューブを室温まで冷却
し、クロロホルム６mlを加えた。クロロホルム溶液を、
３回続けて６ml容量の水で洗浄し、各々の洗浄の後に、
遠心分離し、相をパスツールピペットで分離した。残存
するクロロホルム相を、吸引濾過して、懸濁したジステ
アロイルホスファチジルエタノールアミンを除去した。
濾液を、減圧下で乾燥し、半結晶性固体212mgを得た。

【００９９】この固体を、エタノール４容量と水１容量
の混合物15ml中に溶解し、深さ50mm及び直径21mmのＨ⁺
Dowex 50カチオン交換樹脂の吸着床を通過させ、同一溶
剤100mlで洗浄した。

【０１００】濾液を、蒸発乾固し、無色ワックス状物13
1mgを得た。

【０１０１】この様なワックス状物291mgを、クロロホ
ルム2.5ml中に溶解し、クロロホルムで湿らせたシリカ
ゲルの21mm×280mmカラムの頭部に移した。下記クロロ
ホルム各々100mlを順番にカラムに通して、クロマトグ
ラムを展開した： 100％クロロホルム、０％（メタノール中１％ NH₄OH）； 90％クロロホルム、10％（メタノール中１％ NH₄OH）； 85％クロロホルム、15％（メタノール中１％ NH₄OH）； 80％クロロホルム、20％（メタノール中１％ NH₄OH）； 70％クロロホルム、30％（メタノール中１％ NH₄OH）。

【０１０２】個々に25ml部の溶出液をとっておき、SiO₂
被覆されたプレート上でTLCによって検定し、その際展
開剤としてCHCl₃、CH₃OH、H₂O、濃NH₄OH、130、70、
８、0.5v/v及び視覚化のためにＩ₂蒸気吸収を使用し
た。

【０１０３】カラム溶出液の275〜325ml部分は、R_f＝0.
89の単一材料（PO₄＋）を含有していた。

【０１０４】一緒にし、蒸発乾固すると、これらは無色
ワックス状物319mgを生じた。

【０１０５】ホスファート分析は、約115,000の分子量
と一致した。

【０１０６】明らかに、ポリ（乳酸）の重合が、ホスフ
ァチジルエタノールアミンとの反応速度と匹敵する速度
で起こった。

【０１０７】この副反応は、より希釈された反応成分溶
液を用いて行うことによって恐らく最小にすることがで
きる。

【０１０８】（Ｄ．DSPEのポリ（グリコール酸）アミド
の製造）グリコール酸266mg（3.50mmol）、ジシクロヘ
キシルカルボジイミド745mg（3.60mmol）、ジステアロ
イルホスファチジルエタノールアミン75mg（0.10mmo
l）、トリエチルアミン32マイクロリットル（0.23mmo
l）、及び乾燥ジメチルスルホキシド5.0mlの混合物を窒
素雰囲気下で75℃で加熱し、室温まで冷却し、次いで同
容量のクロロホルムで希釈し、次いで３回続けて同量の
水で洗浄し、ジメチルスルホキシドを除去した。遠心分
離し、相をパスツールピペットでその都度分離する。

【０１０９】クロロホルム相を吸引濾過し、少量の懸濁
する物質を除き、濾液を減圧で蒸発乾固し、薄いコハク
色のワックス状物572mgを得る。

【０１１０】クロロホルム2.5ml中にこの材料を再溶解
し、クロロホルムで湿らせたシリカゲル（メルクシリカ
ゲル60）の21mm×270mmカラムの頭部に移す。

【０１１１】下記クロロホルム各々100mlを順番にカラ
ムに通して、クロマトグラムを展開する： 100％クロロホルム、０％（メタノール中１％ NH₄OH）； 90％クロロホルム、10％（メタノール中１％ NH₄OH）； 85％クロロホルム、15％（メタノール中１％ NH₄OH）； 80％クロロホルム、20％（メタノール中１％ NH₄OH）； 70％クロロホルム、30％（メタノール中１％ NH₄OH）。

【０１１２】個々に25ml部の溶出液を集め、SiO₂被覆さ
れたプレート上でTLCによって各々検定し、その際展開
剤としてCHCl₃、CH₃OH、H₂O、濃NH₄OH；130、70、８、
0.5v/vを使用する。

【０１１３】ほとんどすべてのPO₄＋物質は、溶出液の2
75−300ml部分中に存在する。これを減圧下で蒸発乾固
し、高減圧乾燥し、無色ワックス状物281mgを得る。

【０１１４】ホスファート分析は、分子量924,000を示
した。反応の間の溶剤容量及びグルコール酸とジシクロ
ヘキシルカルボジイミドとのモル割合を操作することに
より、恐らく他の大きさの分子を得る。

【０１１５】（例３：エチレン結合したPEG-PEの製造） （Ａ．1-トリメチルシリルオキシ-ポリエチレングリコ
ールの製造）1-トリメチルシリルオキシ-ポリエチレン
グリコールの製造は、図４に示した反応式中に示され
る。

【０１１６】ポリエチレングリコール、分子量1500（Ad
rich Chemical）15.0グラム（10mmol）をベンゼン80ml
中に溶解した。クロロトリメチルシラン（Adrich Chemi
cal社）1.40ml（11mmol）及びトリエチルアミン1.53ml
（１mmol）を加えた。混合物を、室温で不活性雰囲気下
で５時間撹拌した。

【０１１７】混合物を、吸引濾過して、トリエチルアン
モニウムクロライドの結晶を分離し、結晶をベンゼン５
mlで洗浄した。濾液及びベンゼン洗浄液を一緒にした。
この溶液を、減圧下で蒸発乾固し、無色油状物15.83グ
ラムを得、これは放置すると固まった。

【０１１８】展開剤としてエタノール４容量と水１容量
の混合物を用いるSi-C₁₈逆相プレート上での生成物のTL
C、及びヨウ素蒸気視覚化は、すべてのポリグリコール1
500（R_f＝0.93）が使い果され、R_f＝0.82の物質に代っ
ていることを示した。赤外スペクトルは、ポリグリコー
ルのみに特徴のある吸収ピークを示した。

【０１１９】1-トリメチルシリルオキシポリエチレング
リコール（分子量1500）の収量は、ほぼ定量的であっ
た。

【０１２０】（Ｂ．1-トリメチルシリルオキシ-ポリエ
チレングリコールのトリフルオロメタンスルホニルエス
テルの製造）上記で得られた、結晶性1-トリメチルシリ
ルオキシポリエチレングリコール15.74グラム（10mmo
l）を、無水ベンゼン40ml中に溶解し、粉砕した氷の浴
中で冷却した。トリエチルアミン1.53ml（11mmol）及び
Aldrich Chemical Co.から得られる無水トリフルオロメ
タンスルホン酸1.85ml（11mmol）を加え、反応混合物が
褐色に変わるまで、混合物を不活性雰囲気下で一晩撹拌
した。

【０１２１】次いで溶剤を減圧下で蒸発し、残存するシ
ロップ状ペーストをメチレンクロライドで希釈して100.
0mlにした。トリフルオロメタンスルホン酸エステルの
反応性は高いので、1-トリメチルシリルオキシポリエチ
レングリコールのトリフルオロメタンスルホニルエステ
ルの更なる精製は行わなかった。

【０１２２】（Ｃ．N-1-トリメチルシリルオキシポリエ
チレングリコール1500PEの製造）1-トリメチルシリルオ
キシポリエチレングリコールのトリフルオロメタンスル
ホニルエステルのメチレンクロライド貯蔵溶液10mlを減
圧下で蒸発乾固し、残留物約1.2グラム（約0.7mmol）を
得た。この残留物に、卵PE 372mg（0.5mmol）を含有す
るクロロホルム溶液3.72mlを加えた。生じた溶液に、ト
リエチルアミン139マイクロリットル（1.0mmol）を加
え、溶剤を減圧下で蒸発した。得られた残留物に、乾燥
ジメチルホルムアミド５ml及びトリエチルアミン（IV）
70マイクロリットル（0.50mmol）を加えた。反応容器の
空気を窒素で置換した。容器を閉じ、砂浴中で110℃で2
2時間加熱した。溶剤を減圧下で蒸発し、褐色がかった
油状物1.58グラムを得た。

【０１２３】シリカゲル60シリカ70−230メッシュで充
填された21×260mmクロマトグラフィー吸着カラムを調
製し、ブタノン40容量、酢酸25容量及び水５容量から成
る溶剤で洗浄した。粗生成物を、同一の溶剤３ml中に溶
解し、クロマトグラフィーカラムの頭部に移した。クロ
マトグラムを同一溶剤で展開し、連続して溶出液30ml部
を各々TLCによって検出した。

【０１２４】TLC検出システムは、ブタノン／酢酸／水
の溶剤混合物、40/25/5；v/v/vを用いて、シリカゲル被
覆されたガラスプレートを使用した。ヨウ素蒸気吸収
は、視覚化に役立った。この溶剤系で、N-1-トリメチル
シリルオキシポリエチレングリコール1500PEは、R_f＝0.
78で現われた。未変化PEはR_f＝0.68で現われた。

【０１２５】所望のN-1-トリメチルシリルオキシポリエ
チレングリコール1500PEは、カラム溶出液の170〜300ml
部分の主たる成分であった。減圧で蒸発乾固すると、こ
の部分は薄い黄色油状の化合物111mgを生じた。

【０１２６】（Ｄ．N-ポリエチレングリコール1500の製
造：ホスファチジル−エタノールアミン酢酸脱保護）一
度クロマトグラフィー分離されたPE化合物を、テトラヒ
ドロフラン２ml中に溶解した。これに酢酸６ml及び水２
mlを加えた。得られる溶液を３日間、23℃で放置した。
反応混合物からの溶剤を、減圧で蒸発し、恒量まで乾燥
し、薄い黄色ワックス状物75mgを得た。エタノール４容
量部と水１容量部の混合物で展開されたSi-C₁₈逆相プレ
ート上でのTLCは、いくつかの遊離PE及びいくつかのポ
リグリコール様物質が加水分解中に形成されたことを示
した。

【０１２７】残留物をテトラヒドロフラン0.5ml中に溶
解し、エタノール水（80；20；ｖ：ｖ）の溶液３mlで希
釈した。混合物を、オクタデシルが結合した相のシリカ
ゲルで充填された10mm×250mmクロマトグラフィー吸着
カラムの頭部に供給し、カラムをエタノール水80：20容
量％で展開し、連続して溶出液20ml部を集めた。溶出液
を、逆相TLCによって検定した。R_f＝0.08〜0.15の生成
物しか含有しない画分を一緒にした。これは、主として
溶出液の20〜100ml部分であった。減圧で蒸発乾固した
場合、これらの部分は無色ワックス状物PEG-PE 33gを生
じ、これは出発ホスファチジルエタノールアミンを基準
にしてわずか３％の収率に相当した。

【０１２８】NMR分析は、生成物はPE残基もポリエチレ
ングリコール残基も含んでいるが、一見好ましい元素分
析にかかわらず、ポリグリコール鎖の鎖長がエチレンオ
キシド残基約３個〜４個に減少したことを示した。製造
された生成物を、PEG-PEリポソームの製造に使用した。

【０１２９】（Ｅ．フルオライド脱保護によるN-ポリエ
チレングリコール1500P.E.の製造）粗N-1-トリメチルシ
リルオキシポリエチレングリコール PE500mgを、テトラ
ヒドロフラン５ml中に溶解し、テトラブチルアンモニウ
ムフルオライド189mg（0.600ミリモル）を加え、溶解す
るまで撹拌した。反応成分を、室温（20℃）で一晩放置
した。

【０１３０】溶剤を減圧下で蒸発し、残留物をクロロホ
ルム10ml中に溶解し、２回続けて10mlずつの水で洗浄
し、遠心分離してクロロホルム相と水相を分けた。クロ
ロホルム相を減圧下で蒸発し、橙褐色ワックス状物390m
gが得られ、これは不純なN-ポリエチレングリコール150
0PE化合物であることを示した。

【０１３１】ワックス状物を、クロロホルム５ml中に再
溶解し、クロロホルムで湿らせたシリカゲルを有する21
×270mmカラムの頭部に移した。

【０１３２】溶剤100mlをカラムに通してカラムを展開
した。表２の溶剤を、順番に用いた：

【０１３３】

【表２】

【０１３４】分離したカラム溶出液の画分50mlをとって
おいた。カラムの画分を、TLCによってSi-C₁₈逆相プレ
ート上で分離した。TLCプレートを、水１容量と混合さ
れたエタノール４容量で展開した。視覚化を、ヨウ素蒸
気にさらすことによって行った。

【０１３５】R_f約0.20のヨウ素吸収脂質を含有する画分
のみを一緒にし、減圧下で蒸発乾固し、恒量まで高減圧
で乾燥した。この方法でワックス状の結晶性固体94mg
が、分子量2226で得られた。重クロロホルム中に溶解さ
れたこの物質のプロトンNMRスペクトルは、ポリエチレ
ングリコールに帰因すると考えられるいくつかのメチレ
ンプロトンと共に分子のホスファチジルエタノールアミ
ン部分に原因があると予測されるピークを示した（δ＝
3.7）。

【０１３６】（例４：REV及びMLVの製造） （Ａ．分粒されたREV）下記の例中に示されるモル割合
で、全部で15μmolの選択された脂質成分をクロロホル
ム中に溶解し、ロータリーエバポレーターによって薄い
フイルムとして乾燥した。この脂質フイルムを、蒸留水
で洗浄されたジエチルエーテル１ml中に溶解した。この
脂質溶液に５mMトリス、100mM NaCl、0.1mM EDTAを含有
する水性緩衝溶液、pH7.4、0.34mlを加え、混合物を、
１分間音波処理によって乳化し、溶液の温度を室温又は
それ以下に保った。内包された〔¹²⁵Ｉ〕チラミニル−
イヌリンを含有するようにリポソームを製造した場合、
チラミニル−イヌリンは約４μCi/ml緩衝液の濃度でホ
スファート緩衝液中で含まれた。

【０１３７】エーテル溶剤を減圧下で室温で除去し、生
じるゲルを、上記緩衝液0.1ml中に、取り、激しく振っ
た。生じるREV懸濁液は、顕微鏡検査によって測定され
る約0.1ないし20ミクロンの粒子サイズを有し、１個又
はほんの僅かの二重層ラメラを有する比較的大きい（１
ミクロンより大きい）小胞から主に成っていた。

【０１３８】リポソームを、選択された細孔サイズ0.4
ミクロン又は0.2ミクロンを有するポリカーボネートフ
イルター（Szoka，1978）を２回通して押し出した。0.4
ミクロンフィルターを通して押し出されたリポソーム
は、0.17±（0.05）ミクロン直径、0.2ミクロンフィル
ターを通したものは、0.16（0.05）ミクロン直径を平均
とした。内包されていない〔¹²⁵Ｉ〕チラミニル−イヌ
リンを、押し出されたリポソームをセファデックスG-50
（ファルマシア）通過させることによって除去した。

【０１３９】（Ｂ．分粒されたMLV）多重ラメラ小胞（M
LV）リポソームを、標準操作に従って、脂質混合物を主
にCHCl₃を含有する有機溶剤中に溶解し、減圧下で回転
によって薄いフイルムとして脂質を乾燥して、製造し
た。ある場合には、脂質相のための放射性標識を、乾燥
前に脂質溶液に加えた。脂質フイルムを、所望の水性相
及び３mmガラスビーズの添加によって水和し、次いでボ
ルテックスで撹拌し、少なくとも１時間リン脂質成分の
相転移温度以上で振とうした。ある場合には、水性相の
ための放射性標識を、緩衝液中に含有させた。ある場合
には、次の押出し工程を容易にするために、水和された
脂質を、繰り返し３回凍結し解凍した。

【０１４０】リポソームサンプルのサイズを、加圧され
た窒素ガスを用いて、定められた細孔ポリカーボネート
フィルターを通して押し出してコントロールした。ある
操作では、リポソームを0.4μmの細孔を有するフィルタ
ーを１回通し、次いで0.1μmの細孔を有するフィルター
を10回通し押し出した。別の操作では、リポソームを0.
2μmの細孔を有するフィルターを３回通し、その後粒子
の平均直径がDLSにより測定された場合に100nm以下にな
るまで、0.05μmの細孔での押出しをくり返した。空隙
容量のリポソームを包含容量の小分子から分離するゲル
パーミエーションカラムに、押し出されたサンプルを通
すことによって非内包水性成分を除去した。

【０１４１】（Ｃ．⁶⁷GaのDF含有リポソームへの積載）
Ga⁶⁷-DF標識されたリポソームを製造するプロトコル
は、公知手順（ガビゾン，1989（文献番号８））に適合
するようにした。簡単に述べると、リポソームを内部水
性相中にイオンキレーターデスフェラルメシラートが内
包されるように製造し、ヒドロキシキノリン（オキシ
ン）によって二重層を通って運搬されたGaを不可逆的に
結合した。

【０１４２】（Ｄ．動的光散乱）リポソーム粒子サイズ
分布測定が、Brookhaven Instruments BI-2030ATオート
コリレーターを備えたNICOMPモデル200を用いてDLSによ
って得られた。機器を、製造業者による指示書に従って
操作した。NICOMP結果は、平均直径及び相対容量による
小胞のガウス分布の標準偏差として表わした。

【０１４３】（例５：リポソーム血中寿命測定） （Ａ．血中循環時間及び血液／RES割合の測定）リポソ
ームのインビボ試験を、２つの異なる動物モデルで行っ
た：各25ｇのスイス−ウェブスターマウス及び各200〜3
00gの実験用ラット。マウス試験は、１μMリン脂質／マ
ウスにリポソームサンプルの尾静脈注射を行い、次いで
動物を一定の時間後屠殺し、ガンマカウンティングによ
って標識を定量するために組織除去することを包含し
た。各組織中で注射された薬用量の重量及びパーセント
を測定した。ラットの試験は、大腿静脈中に長時間持続
するカテーテルの確立を包含した。この長時間持続する
カテーテルは、３〜４μMリン脂質／ラットで他の大腿
動脈中のカテーテル中にリポソームサンプルを注射した
後の一定の時間に血液サンプルを除去するためのカテー
テルである。血液中に残存する注射された薬用量のパー
セントを24時間までのいくつかの時点で測定した。

【０１４４】（Ｂ．血流中のリポソーム保持の時間経
過）メトキシPEG(分子量1900)及び１-パルミトイル-2-
オレイル-PE（POPE）から成るPEG-PEを例２と同様に製
造した。PEG-POPE脂質を約0.1：２の脂質：脂質モル割
合で部分的に水素化された卵PC（PHEPC）と一緒にし、
脂質混合物を水和し、例４中に記載した様に0.1ミクロ
ンポリカーボナート膜を通して押し出し、平均サイズ約
0.1ミクロンのMLVを生じた。MLV脂質は少量の放射性標
識された脂質マーカー¹⁴C-コレステリルオレアート、及
び内包されたマーカー³H-イヌリンを含んでいた。

【０１４５】リポソーム組成物を注射し、マウス中の初
期の注射薬用量に対するパーセントを、注射後１、２、
３、４及び24時間で例４中に記載した様に測定した。脂
質マーカー及び内包されたマーカーは両方とも24時間後
最初に注射された薬用量の10％より大きいことを示し
た。

【０１４６】（Ｃ．24時間血中リポソームレベル）血液
中に注射される薬用量に対するパーセント、及びリポソ
ームマーカーの血液／RES割合を静脈内リポソーム注射
後24時間で測定するための試験を、上述の様に実施し
た。下記表３中の左欄に示した組成を有するリポソーム
処方物を上述の様に製造した。特に明記しない限り、脂
質誘導体化されたPEGはPEG-1900であり、リポソームサ
イズは0.1ミクロンであった。静脈内投与後24時間で血
液中に残存する薬用量パーセント、及び測定された24時
間血液／RES割合を、表の中央及び右欄にそれぞれ示
す。

【０１４７】

【表３】

【０１４８】＊すべての処方物は、33％のコレステロー
ル及び7.5％の充填成分を含有し、記載される場合以外
は100nm平均直径であった。PEG-DSPEは、記載される場
合以外はPEG₁₉₀₀から成った。

【０１４９】明らかな様に、注射後24時間の血液中に残
存する薬用量パーセントは、PEG誘導体化された脂質を
含有するリポソームに関して５〜40％の間であった。対
照的に、PEG誘導体化された脂質のない両方のリポソー
ム処方物においては、24時間後に残存するリポソームマ
ーカーは、１％より小さかった。また表３から明らかな
様に、血液／RES割合は、コントロールリポソーム中の
0.01〜0.03から、PEG誘導体化されたリポソームを含有
するリポソーム中で少なくとも0.2に増加し、4.0の高さ
まで増加した。

【０１５０】（Ｄ．ポリ乳酸誘導体化されたPEを用いる
血中寿命測定）静脈内リポソーム注射後、数回血液中の
注射された薬用量パーセントを測定するための試験を、
上述の様に実施した。２：3.5：１又は１：3.5：１重量
％のどちらかの組成のポリ乳酸‐PE：HSPC：Cholを有す
るMLVリポソーム処方物を製造した。

【０１５１】このデータは、ポリ乳酸被覆リポソームの
クリアランスがポリ乳酸誘導体化されたPEを含有しない
類似の処方物よりも数倍遅いことを示す。

【０１５２】（Ｅ．ポリグリコール酸誘導体化されたPE
を用いる血中寿命測定）静脈内リポソーム注射後、数回
血液中の注射された薬用量パーセントを測定するための
試験を、上述の様に実施した。２：3.5：１重量％で組
成のポリグリコール酸‐PE：HSPC：Cholを有する押し出
されたMLVリポソーム処方物を製造した。

【０１５３】これらのデータは、ポリグリコール酸被覆
リポソームのクリアランスがポリグリコール酸誘導体化
されたPEを含有しない類似の処方物よりも数倍遅いこと
を示す。

【０１５４】（例６：PEG‐PEリポソーム中の血液／RES
割合に対するリン脂質アシル鎖飽和の作用）メトキシPE
G（分子量1900）及びジステアリルPE（DSPE）から成るP
EG‐PEを、例２と同様に製造した。PEG‐PE脂質を、ス
フィンゴミエリン（SM）、完全に水素化された大豆PC
（PC）、コレステロール（Chol）、部分的に水素化され
た大豆PC（PHSPC）、及び表４中にPC IV1、IV10、IV2
0、IV30、及びIV40として同定される一部水素化されたP
C脂質のうちから選択された脂質を用いて処方した。脂
質成分を、表５中の左欄に示されるモル割合で混合し、
例４中に示した様に0.1ミクロンに分粒されたMLVを形成
するのに使用した。

【０１５５】

【表４】

【０１５６】

【表５】

【０１５７】注射後24時間で、血液中、ならびに肝臓
（Ｌ）及び脾臓（Ｓ）中に残存する（¹⁴C-コレステリル
オレアートのパーセントによって測定される様に）注射
された物質のパーセントを測定した。血液及びＬ＋Ｓ
（RES）値を、各組成物に関する血液／RES値を算出する
のに使用した。表５の右欄（％残存率）は、24時間後の
動物の放射能の全量から決定した、投与後24時間におけ
る動物に残存する投与されたリポソーム用量の百分率を
示す。表中の２つの低い全回収値は、異常クリアランス
挙動を示す。

【０１５８】表からの結果は、血液／RES割合がリポソ
ームを形成するリン脂質成分の流動性又は飽和度と全く
無関係であることを示す。特に、飽和度の高いPC成分
（たとえばIV1 PC及びIV10 PC)、ほとんど不飽和のPC成
分（たとえばIV40）、及び中間的な飽和成分（たとえば
IV20）を含有するリポソームの間で観察される血液／RE
S割合で系統的な変化はない。

【０１５９】更に、比較的飽和したPEG-DSPE化合物及び
比較的不飽和のPEG-POPE化合物（例５）を用いて得られ
た血液／RES割合の比較は、誘導体化された脂質の飽和
度がそれ自体ではRESによって吸収を逃れるリポソーム
の能力に対して重要ではないことを示す。

【０１６０】（例７：PEG‐PEリポソーム中、血液／RES
割合に対するコレステロールとエトキシ化コレステロー
ルの作用） （Ａ．添加されたコレステロールの作用）メトキシPEG
(分子量1900)およびDSPEから成るPEG‐PEを例２に記載
した様に製造した。PEG‐PE脂質を下表６中の左欄に示
した様にスフィンゴミエリン（SM）、完全に水素化され
た大豆PC（PC）及びコレステロール（Chol）の中から選
ばれた脂質を用いて処方した。表中に示した３つの処方
物は、約30,15及び０モルパーセントのコレステロール
を含有する。REV（0.3ミクロンサイズ）及びMLV（0.1ミ
クロンサイズ）をともに、実質上例４に於ける様に、ト
リチウム標識されたイヌリンを内包して製造した。

【０１６１】投与後２及び24時間で血液中に残存する内
包されたイヌリンパーセントは、下表６の右に示す様に
０〜30モルパーセントの範囲でコレステロールの測定で
きる影響を示さない。

【０１６２】

【表６】

【０１６３】（Ｂ．エトキシ化コレステロールの作用）
メトキシ‐エトキシ‐コレステロールを、第Ｉ章（誘導
体化された脂質の製造）で記載したトリフルオロスルホ
ナートカップリング法を経てメトキシエタノールをコレ
ステロールにカップリングすることによって製造した。
メトキシPEG(分子量1900)およびDSPEから成るPEG‐PE
を、例２に記載した様に製造した。PEG‐PE脂質を表７
の右に示す様なジステアリルPC（DSPC）、部分的に水素
化された大豆PC（PHSPC）、コレステロール及びエトキ
シ化コレステロールの中から選択された脂質を用いて処
方した。データは、(a)エトキシ化コレステロールは（P
EG‐PEと組み合わせて）、PEG‐PE単独とほぼ同一の血
液中のリポソーム寿命の増加度を生じることを示す。単
独では、エトキシ化コレステロールは、リポソーム寿命
の中程度の増加度を生じるが、PEG‐PEによって得られ
るものよりも実質的に小さい。

【０１６４】

【表７】

【０１６５】（例８：PEG‐PEリポソームにおける血液
／RES割合に対する荷電した脂質成分の作用）メトキシP
EG(分子量1900)およびDSPEから成るPEG‐PEを、例２に
記載した様に製造した。PEG‐PE脂質を、図７中に示し
た様に、卵PG（PG）、部分的に水素化された卵PC（PHEP
C）、及びコレステロール（Chol）の中から選択された
脂質を用いて処方した。図中に示された２つの処方物
は、約4.7モルパーセント（三角）又は14モルパーセン
ト（まる）PGを含有していた。脂質を、例４に於けると
同様に0.1ミクロンに分粒したMLVとして製造した。

【０１６６】注射後0.25、１、２、４、及び24時間で存
在する注射されたリポソーム薬用量のパーセントを、図
７に両処方物に関してプロットする。明らかな様に、組
成物中のPGパーセントは、血流中リポソーム保持に関し
てほとんど又は全く作用を有しなかった。また示された
内包されたマーカーの損失速度は、PCを含有する、同様
に製造されたリポソームに対して観察された損失速度と
同様である。

【０１６７】（例９：PEG‐被覆リポソーム及び非被覆
リポソームの血漿のキネティックス）メトキシPEG(分子
量1900)及びジステアリルPE（DSPE）から成るPEG‐PE
を、例２に於ける様に製造した。PEG‐PE脂質をPHEPC、
及びコレステロールを用いて0.15：1.85：１のモル割合
で処方した。第二の脂質混合物は、同一脂質を含有して
いたが、PEG‐PEは含まなかった。リポソームを、例５
に記載した様にデスフェラルメシラートの存在下に脂質
水和によって２つの脂質混合物から製造し、0.1ミクロ
ンに分粒し、ゲル濾過によって取り込まれなかったデス
フェラルを除去し、次いでリポソームに⁶⁷Ga-オキシン
を積載した。非内包⁶⁷Gaを、セファデックスG-50ゲル排
除カラムの通過の間に除いた。両組成物は0.15M NaCl、
0.5mMデスフェラル中に10μmol/mlを含有する。

【０１６８】２つのリポソーム組成物（0.4ml）を例６
に記載した様に動物にIV注射した。注射後0.25、１、３
又は５及び24時間で、血液サンプルを取り、血液中に残
存するイヌリン量を検出し、注射直後に測定された量の
百分率として表わす。結果を、図９中に示す。明らかな
様に、PEG彼覆リポソームは、約11時間の血中半減期を
有し、注射された材料のほぼ30％は、24時間後の血液中
に存在する。対照的に、非被覆リポソームは、１時間よ
り少ない血液中の半減期を示す。24時間で、注射された
物質の量は、検出不可能であった。

【０１６９】（例10：ドキソルビシンリポソームの製
造）0.3：0.3：1.4：１のモル割合で、PEG‐PE、PG、PH
EPC、及びコレステロールを含有する小胞形成脂質をク
ロロホルム中に溶解し、25μmolリン脂質／mlの最終脂
質濃度とした。遊離塩基形でアルファ−トコフェロール
（α-TC）を、クロロホルム：メタノール（２：１）溶
液中に加え、0.5％の最終モル割合とした。脂質溶液を
乾燥して薄い脂質フィルムとし、次いで１mM デスフェ
ラルを含有する125mM 硫酸アンモニウムの熱い（60℃）
溶液で水和した。水和を、リン脂質50μmolにつき水溶
液１mlを用いて実施した。脂質材料を10回の凍結／解凍
サイクルで、液体窒素及び熱い水浴を用いて水和した。

【０１７０】リポソーム分粒を、２個の核細孔ポリカー
ボネート膜、３サイクル0.2ミクロンフィルター、次い
で10サイクル0.05ミクロンフィルターを通して押出しす
ることによって実施した。最終リポソームサイズは100n
mであった。次いで分粒されたリポソームを、24時間の
間３回５％グルコース50〜100容量に対して透析した。
第４サイクルを１時間pH6.5〜7.0に滴定された５％グル
コースに対して実施した。

【０１７１】0.9％ NaCl及び１mMデスフェラル中にドキ
ソルビシン10mg/mlを含有する溶液を製造し、透析され
たリポソーム製造物の等容量と混合した。混合物中の薬
剤の濃度は、約５mg/ml薬剤50μmol/mlリン脂質であっ
た。混合物を１時間60℃で水浴中で振とうしながらイン
キュベートした。取り込まれていない薬剤を、小さいカ
ラム中に充填されたDowex 50WXを通して除去した。カラ
ムをベンチトップ遠心分離器中で５分間遠心分離して、
完全にリポソーム懸濁液を溶離した。混合物の滅菌を、
0.45ミクロン膜の通過によって行い、リポソームを５℃
で保存した。

【０１７２】（例11：遊離ドキソルビシン及びリポソー
ムドキソルビシンの血漿のキネティックス）メトキシPE
G(分子量1900)及びジステアリルPE（DSPE）から成るPEG
‐PEを、例２と同様に製造した。PEG-PE脂質を水素化さ
れた大豆PC（HSPC）及びコレステロールで0.15：1.85：
１（PEG‐Dox）のモル割合で処方した。第二脂質混合物
は、水素化されたホスファチジルイノシトール（HP
I）、HSPCコレステロールを１：10：５（HPI‐Dox）の
モル割合で含有していた。各脂質処方物を、例10と同様
に、アンモニウムイオン勾配を有する、分粒されたMLV
の製造に使用した。

【０１７３】リポソームを、例15と同様にドキソルビシ
ン溶液の等容量(10mg/ml)プラス１mMデスフェラルと混
合して、ドキソルビシンを積載した。２つの組成物を、
図１０及び下記表８にPEG‐DOX及びHPI‐DOXリポソーム
としてそれぞれ示す。ドキソルビシンHCl溶液（市販の
生成物、遊離Dox）を、病院薬局から入手した。遊離DO
X，PEG‐Dox及びHPI‐Doxを、注射日に非緩衝の５％グ
ルコースを用いて同一濃度（1.8mg/ml）に希釈した。犬
を３つのグループ（雌２匹、雄１匹）に無作為に選び体
重をはかった。18ケージヴェンフロン（Venflon）IVカ
テーテルを、各々の動物の表面の四肢静脈に挿入した。
薬剤及びリポソーム懸濁液を、急速濃縮塊(quick bolu
s)によって注射した（15秒）。４ml血液サンプルを、注
射前、及び注射後５、10、15、30、45分、１、２、４、
６、８、10、12、24、48及び72時間で採取した。また、
リポソームグループでは、血液を96、120、144、及び16
8時間後採取した。血漿を、遠心分離によって全血の形
成成分から分離し、そしてドキソルビシン濃度を標準蛍
光技術によって検出した。血液中に残存するドキソルビ
シンの量を、注射直後に測定された標識された薬剤のピ
ーク濃度の百分率として表わした。その結果を、図１０
中にプロットし、PEG-DOX及びHPI-DOX組成物ともに線形
対数プロット（シングル−モード指数関数）を生じ、遊
離薬剤は下記表８中に示す様な２次モデル(bimodel)指
数関数曲線を生じる。これらの曲線から測定される２つ
のリポソーム処方物の半減期を表８中に示す。

【０１７４】また表８中に、72時間のテスト期間にわた
って血漿のキネティックス曲線を積分することによって
決定される曲線下の領域（AUC）も示す。AUC結果は、注
射後72時間でPEG-DOXリポソームからの薬剤の全利用可
能性がHPI-DOXリポソームの利用可能性のほぼ２倍であ
ったことを示す。このことはPEG-DOXリポソームのほぼ
２倍大きい半減期と一致する。表８中の「CL」記載は、
体内からの薬剤の除去速度（mg/hr）を示す。

【０１７５】

【表８】

【０１７６】（例12：ドキソルビシンの組織分布） （Ａ．皮下腫瘍）ドキソルビシンが積載されたPEG‐リ
ポソームを、例11と同様に製造した（PEG-DOXリポソー
ム）。使用される遊離薬剤は、病院薬局から得られる臨
床材料であった。

【０１７７】12匹のマウスの２つのグループに、10⁶のJ
-6456腫瘍細胞を皮下注射した。14日後、腫瘍が皮下空
間で約１cm³サイズに成長し、動物に遊離薬剤として
（グループ１）又はPEGリポソーム中に内包された形で
（グループ２）ドキソルビシン10mg/kgをIV注射（尾静
脈）した。薬剤注射後４、24、及び48時間で、各グルー
プ中の４匹の動物を屠殺し、腫瘍、心臓及び筋肉組織の
箇所を切除した。各組織をはかりホモジネートし、標準
蛍光検定処理（ガビゾン，1989（文献番号８））を用い
るドキソルビシン濃度の測定のために抽出した。各ホモ
ジネート物中で測定された全薬剤を、組織１ｇあたりの
μg薬剤として表わした。

【０１７８】心臓、筋肉及び肝臓中の薬剤分布に関する
データを、それぞれ図１１のＡ及び図１１のＢ中に遊離
及びリポソームに結び付いたドキソルビシンに対してプ
ロットする。図１１のＡ中、最初に薬剤は心臓中に優先
的に吸収されるが、すべての３つの組織タイプは組織１
ｇあたりほぼ同一量の薬剤を吸収することが分る。対照
的に、PEG‐リポソーム中に取り込まれている時、薬剤
は心臓及び筋肉組織中で減少したレベルを有しながら、
腫瘍中に強い選択的局在化を示す。

【０１７９】（Ｂ．腹水腫瘍）15匹のマウスを有する２
つのグループに、10⁶J-6456リンパ腫細胞を腹腔内注射
した。腫瘍を１−２週間成長させ、その時腹水液５mlが
蓄積していた。次いでマウスにドキソルビシン10mg/kg
を遊離薬剤形で（グループ１）又は例11に記載された様
なPEGリポソーム中に取り込まれた形のどちらかでIV注
射した。腹水液を、処理後１、４、15、24及び48時間で
各グループ中の３匹の動物から採取した。更に腹水腫瘍
を細胞成分と液体成分に遠心分離（15分、5000rpm）に
よって分画した。上清中の遊離及びリポソーム結合薬剤
を、上述のDowex WX樹脂に液体を通して遊離薬剤を除去
して測定した。腹水液、腫瘍細胞、上清、及び樹脂処理
された上清中のドキソルビシン濃度を次いで測定し、こ
れらの値からμg(ドキソルビシン)／１グラム(組織)を
算出した。腹水液中のドキソルビシンの総濃度（黒菱
形）、上清中のリポソームが結び付いた形のドキソルビ
シンの総濃度（上清から遊離薬剤除去後）（黒三角）、
及び単離された腫瘍細胞中のドキソルビシンの総濃度
（黒まる）に関する値を図１２中にプロットする。明ら
かな様に、腹水液中の全ドキソルビシンは、約24時間ま
で一定に増加し、次いで次の24時間にわたって僅かに減
少した。腫瘍中のほとんどのドキソルビシンは、リポソ
ームに取り込まれた形であり、リポソームがそのままの
形で充実性腫瘍中に溢出することができることを示す。

【０１８０】同様な実験で、12匹のマウスの２つのグル
ープに、J-6456リンパ腫をIP移植し、腫瘍を上述の様に
生じさせた。いったん腹水腫瘍が約５mlに達すると、動
物の１グループに、遊離ドキソルビシン10mg/kgを、及
び他のグループにPEGリポソーム中に取り込まれたドキ
ソルビシン10mg/kgを注射した。処理後４、24及び48時
間で、腹水液及び血液サンプルを、各グループの動物４
匹から採取し、動物を屠殺した。肝臓及び心臓の組織の
部分を各動物から切除し、ホモジネート化し、上述の様
に薬剤濃度を検出した。血漿を、遠心分離によって全血
液から分離し、薬剤濃度を上述の様に検出した。腹水液
中のドキソルビシン濃度も測定した。結果を表９中に表
わす。血漿及び腹水液レベルを、mlあたりのμgドキソ
ルビシンとして、肝臓及び心臓の組織値を１グラムの組
織あたりのμgドキソルビシンとして表わす。各測定に
関する標準偏差をかっこ内に示す。示されている様に、
すべての時間点でPEGリポソームに取り込まれた形で薬
剤を摂取するグループに関して、血漿中にかなり多くの
ドキソルビシンが存在する。腹水腫瘍レベルも、特によ
り長い時間点（24及び48時間）でリポソームグループに
於てより一層高い。これらのデータから、PEGリポソー
ムによって薬剤が腫瘍に選択的に送達されることが確認
される。

【０１８１】

【表９】

【０１８２】（例13：通常のリポソームと比較したPEG
リポソームの腫瘍による吸収）６匹のマウスの２つのグ
ループに10⁵〜10⁶のC−26結腸癌細胞を皮下注射し、腫
瘍を約１cm³のサイズに達するまで（注射後約２週間）
皮下空間内で成長させた。次いで動物の各グループに、
例４中に記載した様に放射性ガリウムが積載された通常
のリポソーム（100nm DSPC/Chol，１：１）又はPEGリポ
ソーム（100nmDSPC/Chol/PEG-DSPE，10：３：１）のど
ちらかの0.5mgを注射した。各グループからマウス３匹
を、処理後２、24及び48時間で屠殺し、腫瘍を切除し、
体重をはかり、ガンマカウンターを用いて放射能の量を
定量した。結果を次表中に示し、１グラムの組織あたり
の注射された薬用量のパーセントとして表わす。

【０１８３】

【表１０】

【０１８４】（例14：無傷の腫瘍へのリポソーム溢出） （直接顕微鏡視覚化）メトキシPEG(分子量1900)及びジ
ステアリルPE（DSPE）から成るPEG-PEを例２の様に製造
した。PEG-PE脂質をHSPC、及びコレステロールととも
に、0.15：1.85：１のモル割合で処方した。コロイド状
金(gold)粒子を含有するようにPEG-リポソームを製造し
た（ホング）。生じるMLVを、上述の様に押出しによっ
て分粒し、平均0.1ミクロンサイズとした。取り込まれ
ていない材料をゲル濾過によって除去した。懸濁液中の
最終リポソーム濃度は約10μmol/mlであった。

【０１８５】最初の実験で、正常マウスに上記リポソー
ム処方物0.4mlをIV注射した。注射後24時間で、動物を
屠殺し、除去された肝臓の切片を、標準水溶性プラスチ
ック樹脂に固定した。厚い部分をミクロトームで切断
し、Jannsen Life Sciences, Inc.(Kingsbridge, Pisca
taway, N.J.)による“インテンス２”システムキットで
提供される説明書に従って硝酸銀溶液を用いてその切片
を着色した。更にその切片をエオシン及びへマトキシリ
ンで着色した。

【０１８６】図１３は、典型的な肝臓切片の写真であ
り、より小さい、不規則な形のクッパー細胞、たとえば
細胞20が、より大きいもっと規則的な形の肝細胞、たと
えば肝細胞22の間に示される。クッパー細胞は、無傷の
リポソームの大きい濃度を示し、これは、小さい、暗く
着色されたかたまり、たとえば図１３中の24として示さ
れる。肝細胞は、予想される様に全くリポソームを含ま
ない。

【０１８７】第二実験で、C-26結腸癌（約10⁶細胞）
を、マウス肝臓中に移植した。移植後14日で、動物に上
記リポソーム0.5mgをIV注射した。24時間後、動物を屠
殺し、肝臓を灌流し、包埋し、切開し、上述の様に着色
した。切片を毛管供給腫瘍域に関して調べた。１つの例
となる域を、図１４に示し、それは癌細胞、たとえば細
胞28の域に供給する毛管26を示す。これらの細胞は、特
徴的な着色パターンを有し、しばしば有糸分裂の種々の
段階で暗く着色された核を含む。図中の毛管は、内皮バ
リヤー30、及び下記の様に基底膜32に沿って並ぶ。

【０１８８】リポソーム、たとえばリポソーム34は、内
皮バリヤー及び基底膜の腫瘍側の毛管に隣接した腫瘍域
中で濃密に濃縮され、多くのリポソームも、腫瘍細胞の
まわりの細胞間液体中に分散されることが、図１４に見
いだされる。

【０１８９】図１５は、上記動物からの肝臓腫瘍の他の
域を示す。リポソームは、癌細胞を浸した細胞間液体中
に見られる。

【０１９０】第三実験に於て、C26結腸癌細胞を、動物
に皮下注射し、28日間動物中で成長させた。その後、動
物に上記リポソーム0.5mgをIV注射した。24時間後、動
物を屠殺し、腫瘍塊を切除した。包埋後、腫瘍塊をミク
ロトームで切開し、上述の様に着色した。図１６は腫瘍
細胞の領域を示し、有糸分裂の終りの段階である図中の
中央の細胞36を有する。小さい、暗く着色されたリポソ
ームは、細胞間液体中に見られる。

【０１９１】（例15：腫瘍処置法）PEG‐PE，PG，PHEPC
及びコレステロール及びα-TCをモル割合0.3：0.3：1.
4：１：0.2で含有する小胞形成脂質を、クロロホルム中
に溶解し、25μmolリン脂質／mlの最終脂質濃度とし
た。脂質混合物を減圧下で薄いフィルムにまで乾燥し
た。フィルムを、0.125M 硫酸アンモニウム溶液で水和
し、MLVを形成した。MLV懸濁液を、ドライアイスアセト
ン浴中での凍結及び解凍を３回し、分粒して80〜100nm
とした。アンモニウムイオン勾配を実質上例10に記載し
た様に生じさせた。リポソームにエピルビシンを積載
し、ドキソルビシンに関して例10に記載した様に、遊離
のもの（未結合薬剤）を除いた。取り込まれた薬剤の最
終濃度は、約50〜100μg薬剤／μmol脂質であった。エ
ピルビシンHCl及びドキソルビシンHClの市販生成物は、
病院薬局から入手した。

【０１９２】約10⁶細胞のC-26結腸癌細胞を、マウス35
匹を有する３つのグループに皮下注射した。グループを
５つの７匹の動物サブグループに分けた。

【０１９３】図１７のＡ中に示された腫瘍抑制実験に関
して、各サブグループに腫瘍細胞移植後１，８及び15日
目に生理食塩水ベヒクルコントロール（白まる）、エピ
ルビシン６mg/kg（白三角）、ドキソルビシン６mg/kg
（黒まる）又は２つの薬用量で薬剤積載されたリポソー
ム（PEG-DOXリポソーム）、６mg/kg（黒三角）及び12mg
/kg（白四角）のどれかを0.5ml IV注射した。各グルー
プを28日間追跡した。腫瘍サイズを、各動物で５、７、
12、14、17、21、24及び28日目で測定した。各時点で、
各サブグループ中の腫瘍の成長（個々の動物の平均腫瘍
サイズとして表わす）を、図１７のＡ中にプロットす
る。

【０１９４】この図に関して、６mg/kgでは遊離ドキソ
ルビシンも遊離エピルビシンも、生理食塩水コントロー
ルと比較して腫瘍成長を著しく抑制しなかった。対照的
に、両方の薬用量でPEGリポソームに取り込まれたエピ
ルビシンは、著しく腫瘍成長を抑制する。腫瘍移植後12
0日で動物の生存に関して、生理食塩水、エピルビシン
又はドキソルビシングループ中の動物は生き残らなかっ
たが、６mg/kgリポソームエピルビシン及び12mg/kgリポ
ソームエピルビシングループ中では、７匹のうち５匹及
び７匹のうち７匹がそれぞれ生存した。

【０１９５】同一の腫瘍モデルを用いて遅延処置実験の
結果を、図１７のＢ及び図１７のＣに示す。同一数の動
物に、上述の様に同一数の腫瘍細胞を接種した。図１７
のＢ及び図１７のＣの処置グループは、生理食塩水（実
線）、エピルビシン６mg/kg（黒まる）、遊離エピルビ
シンプラス空のPEG リポソーム６mg/kg（白まる）及びP
EGリポソーム中に取り込まれたエピルビシンの２つの薬
用量、６mg/kg（黒三角）及び９mg/kg（白四角）から成
っていた。図１７のＡに示した結果と対照的に、２回の
処置しかこの実験で行わなかった：図１７のＢにプロッ
トされた結果に関して３及び10日目；図１７のＣにプロ
ットされた結果に関して10及び17日目。重要なことは、
PEGリポソームに取り込まれた薬剤の場合、両方の薬用
量レベルでの２つの遅延処置スケジュールは、腫瘍退化
を生じるが、遊離薬剤、及び遊離薬剤プラス空のリポソ
ームでの処置グループは、腫瘍成長の速度のおだやかな
抑制しか示さなかった。

【０１９６】（例16：腫瘍処置法）PEG-DOXリポソーム
を、ドキソルビシンをリポソームに積載して、60〜80μ
g/μmol全脂質の最終レベルとした以外は、例15と同様
に製造した。遊離薬剤コントロールとして使用されるド
キソルビシンHCl溶液は、病院薬局で入手した。全部で3
0匹のマウスに、10⁶のJ-6456リンパ腫細胞をIP注射し
た。動物を３つの10匹の動物グループに分け、各々に、
生理食塩水ベヒクル、ドキソルビシン溶液10mg/kg、又
は10mg/kgでリポソームに積載されたドキソルビシンの
どれか0.4mlをIV注射した。各グループを、100日間、生
き残る動物の数に関して追跡した。各処置グループに対
する生存率を、図１８中にプロットする。

【０１９７】明らかな様に、遊離薬剤（黒まる）は、生
理食塩水グループ（黒四角）より生存の点でほとんど向
上がない。しかしドキソルビシン積載PEG-リポソーム
（黒三角形）で処置された動物に於て、40日間生き残っ
た動物は約50％、70日間20％、実験を100日で終了する
まで生き残ったもの10％を示した。

【０１９８】（例17：PEG-リポソームの減少された毒
性）遊離ドキソルビシンHCl、エピルビシンHClを有する
溶液を、上述の様にして得た。薬剤濃度70−90μg(化合
物)／μmol(リポソーム脂質)でドキソルビシン又はエピ
ルビシンのどちらかを含有するPEG-リポソーム処方物
を、例16中に記載した様に製造した。通常のリポソーム
（PEG‐誘導体化された脂質ではない）に、ドキソルビ
シンを標準技術を用いて40μg/μmol脂質の薬剤濃度で
積載した。

【０１９９】５つの処方物の各々を、５mg/kgの増加量
で、10〜40mg薬剤／kg体重の間の薬用量で35匹のマウス
に投与し、各薬用量に対して５匹をあてた。下記表11中
に示した最大許容薬用量は、14日以内に注射された動物
中で死亡又は劇的な体重損失を生じない最高薬用量であ
る。データから明らかな様に、DOX-リポソームもPEG-DO
X リポソームも遊離形での薬剤のドキソルビシンの許容
薬用量の２倍以上であり、PEG-DOX リポソームは、少し
高い許容薬用量を示す。同様な結果が、許容エピルビシ
ンの薬用量に関して遊離及びPEG-リポソーム形で得られ
た。

【０２００】

【表１１】

【０２０１】（参考例：腫瘍処置法）通常のドキソルビ
シンリポソーム（L-DOX）を、公知方法に従って製造し
た。簡単に述べると、モル割合0.3：1.4：１：0.2で卵P
G、卵PC、コレステロール及びα-TCを有する混合物をク
ロロホルム中で調製した。溶剤を、減圧下で除き、乾燥
脂質フィルムを２−５mg ドキソルビシンHClを含有する
NaCl 155mMの溶液で水和した。生じるMLV製造物を一連
のポリカーボネート膜を通して押し出して小型化し、約
250nmの最終サイズとした。遊離の（取り込まれていな
い）薬剤を懸濁液のDowex樹脂床上の通過によって除去
した。最終ドキソルビシン濃度は、脂質１μmolにつき
約40であった。

【０２０２】マウス７匹の３つのグループに、例15に詳
述した様に10⁵〜10⁶のC−26 結腸癌細胞を皮下接種し
た。動物を３つの７匹動物処置グループに分け、グルー
プの１つはコントロールとして生理食塩水ベヒクル0.5m
lを与えた。他の２つのグループに、ドキソルビシンを
遊離薬剤溶液として又は薬用量10mg/kgのL-DOX リポソ
ームの形のいずれかで処置した。処置を、腫瘍細胞接種
後、８、15及び22日目に行った。腫瘍サイズを処置した
日及び28日目に測定した。図１９から明らかな様に、遊
離薬剤（黒まる）は腫瘍成長を生理食塩水コントロール
（実線）に比して中程度まで抑制した。L-Dox-処置され
たグループ（黒三角）中の腫瘍は、遊離薬剤処置グルー
プに比して僅かに速く、かつ未処置グループの場合より
もほんの少し遅く成長した。この結果は、L-DOX製造物
の抗腫瘍活性が遊離薬剤とほぼ同一であり、確かに遊離
薬剤の同一薬用量よりも良好でないことを示す。これ
は、同等の薬用量では、PEG-リポソーム中に取り込まれ
たエピルビシンが、この同一腫瘍モデル中で遊離薬剤よ
りも極めて良好な抗腫瘍活性を有することを示す例15
（及び図１７のＡ〜Ｃ）に示した結果と著しく対照的で
ある。

【０２０３】本発明は、特に誘導体化された脂質組成
物、リポソーム組成物、及びその使用に関して記載し、
説明したが、種々の変更及び変化が本発明から離れるこ
となく行われ得ることは明白である。

【０２０４】以下に本発明に関連する文献を文献番号と
共に示す。

【０２０５】

【表１２】

【０２０６】

【表１３】

【０２０７】

【発明の効果】本発明によれば、腫瘍の標的化に有効で
あるリポソーム組成物および方法を提供され、これによ
って全身性の血管外腫瘍中に治療的用量レベルで結像剤
または抗腫瘍剤を選択的に局在化させるという効果が得
られる。

【図面の簡単な説明】

【図１】小胞形成脂質アミンをポリアルキルエーテルで
誘導体化する、一般反応式を示す。

【図２】シアヌルクロライド結合剤を介してポリエチレ
ングリコールで誘導体化されたホスファチジルエタノー
ルアミン(PE)を製造する反応式である。

【図３】ジイミダゾール活性化剤によってポリエチレン
グリコールで誘導体化されたホスファチジルエタノール
アミン(PE)を製造する反応式を示す。

【図４】トリフルオロメタンスルホナート試薬によって
ポリエチレングリコールで誘導体化されたホスファチジ
ルエタノールアミン(PE)を製造する反応式を示す。

【図５】ペプチド(A)、エステル(B)、およびジスルフィ
ド(C)結合によってポリエチレングリコールで誘導体化
された小胞形成脂質を示す。

【図６】ポリ乳酸、またはポリグリコール酸で誘導体化
されたホスファチジルエタノールアミン(PE)を製造する
反応式を示す。

【図７】血液中のリポソーム存在時間のプロットであ
り、これは種々の量のホスファチジルグリセロールを含
有するポリエチレングリコール−ホスファチジルエタノ
ールアミン（PEG-PE）リポソームに関してIV注射後時間
の関数として注射された薬用量パーセントで表される。

【図８】図７のプロットと同様のプロットであり、これ
は主として不飽和のリン脂質成分から成るリポソームの
血中存在時間を示す。

【図９】図７のプロットと同様のプロットであり、これ
はPEG被覆されたリポソーム（黒三角）、および従来の
被覆されていないリポソーム（黒丸）の血中存在時間を
示す。

【図１０】ビーグル犬の血中からのドキソルビシンのク
リアランスのキネティックスを示すプロットであり、遊
離形態で（白丸）、飽和リン脂質および水素化ホスファ
チジルイノシトール(HPI)によって形成されたリポソー
ムによって（白四角）、およびPEGで被覆されたリポソ
ームによって（白三角）IV投与された薬剤に関する。

【図１１】遊離形態(図１１のＡ)およびPEG-リポソーム
形態(図１１のＢ)でIV投与された薬剤について、心臓
（黒菱形）、筋肉（黒丸）、および腫瘍（黒三角）によ
る血中からのドキソルビシンの吸収の時間経過のプロッ
トである。

【図１２】マウスの腹腔内(IP)に移植されたJ-6454腫瘍
細胞による血中からのドキソルビシンの吸収の時間経過
のプロットであり、薬剤全体（黒菱形）を、腫瘍に結び
付いた薬剤（黒丸）およびリポソームに結び付いた形態
（黒三角）として測定した。

【図１３】正常肝臓中のクッパー細胞中におけるリポソ
ームの局在化（濃く染色された小さい粒子）を示す光学
顕微鏡写真である。

【図１４】肝臓の毛細管が腫瘍細胞に供給する領域に移
植されたC-26結腸癌の間質液中におけるリポソームの局
在化（濃く染色された小さい粒子）を示す光学顕微鏡写
真である。

【図１５】肝臓に移植されたC-26腫瘍細胞の活発に分裂
する領域におけるリポソームの局在化（濃く染色された
小さい粒子）を示す光学顕微鏡写真である。

【図１６】または皮下に移植されたC-26腫瘍細胞の活発
に分裂する領域におけるリポソームの局在化（濃く染色
された小さい粒子）を示す光学顕微鏡写真である。

【図１７】C-26結腸癌の皮下移植後の日数に対する腫瘍
サイズの生長を示すプロットであって、生理食塩水コン
トロール（白丸）、6mg/kgのドキソルビシン（黒丸）、
6mg/kgのエピルビシン（白三角）、またはPEG-リポソー
ムに取り込まれたエピルビシンの２種の薬用量（6mg/kg
（黒三角）または12mg/kg（白四角））で、１日目、８
日目、および15日目に処置されたマウス；生理食塩水
（実線）、6mg/kgのエピルビシン（黒丸）、6mg/kgのエ
ピルビシンおよび空のリポソーム（白丸）、またはPEG-
リポソームに取り込まれた２種の薬用量（6mg/kg（黒三
角）および９mg/kg（白四角））で、３日目および10日
目（図１７のＢ)、または10日目および17日目(図１７の
Ｃ)に処置されたマウスに関する。

【図１８】J-6456リンパ腫の腹腔内移植後の日数に対す
る生存率を示すプロットであり、遊離形態（黒丸）また
はPEG-リポソーム形態（黒三角）のドキソルビシンで処
置された動物、または未処置の動物（黒四角）に関す
る。

【図１９】C-26結腸癌の皮下移植後の日数における腫瘍
サイズの生長を、図１７と同様にプロットしたものであ
り、生理食塩水コントロールで処置された動物（実
線）、または10mg/kgのドキソルビシンの遊離形態（黒
丸）または従来のリポソーム（黒三角）で処置された動
物に関する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 597037142 960 Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｃｏｕｒｔ，Ｍ ｅｎｌｏ Ｐａｒｋ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉ ａ 94025，Ｕ．Ｓ．Ａ. (72)発明者 マーチン・シー・ウッドル アメリカ合衆国、カリフォルニア州、 94025 メンロー・パーク、オーク・グロ ーブ・ナンバー３、445 (72)発明者 カール・リードマン アメリカ合衆国、カリフォルニア州、 94598 ウォルナット・クリーク・エバ ノ・ドライヴ、3144 (72)発明者 ヤング・アニー・ヤウ アメリカ合衆国、カリフォルニア州、 94306 パロ・アルト・クロスビー・プレ イス、4162

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 充実性腫瘍中に、血流を介して腫瘍結像
   剤または抗腫瘍剤を局在化するために使用されるリポソ
   ーム組成物であって、 小胞形成脂質と、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸、
   ポリグリコール酸、およびポリ乳酸／ポリグリコール酸
   コポリマーから選択される親水性ポリマーで誘導体化さ
   れた両親媒性小胞形成脂質１〜20モル％とから成るリポ
   ソームであって、該腫瘍中への溢出に充分なサイズを有
   するリポソーム、およびリポソームに取り込まれた形態
   の腫瘍結像剤または抗腫瘍剤を含む、リポソーム組成
   物。
2. 【請求項２】 前記親水性ポリマーが約1,000〜5,000ダ
   ルトンの分子量を有するポリエチレングリコールであ
   る、請求項１に記載のリポソーム組成物。
3. 【請求項３】 前記抗腫瘍剤の少なくとも約80％がリポ
   ソームに取り込まれた形態である、請求項１または２に
   記載のリポソーム組成物。
4. 【請求項４】 前記抗腫瘍剤がアントラサイクリン抗生
   物質である、請求項３に記載の組成物。
5. 【請求項５】 前記アントラサイクリンがドキソルビシ
   ン、エピルビシン、およびダウノルビシンならびに薬理
   学的に許容可能なその塩および酸からなる群から選択さ
   れる、請求項４に記載のリポソーム組成物。
6. 【請求項６】 前記リポソームに取り込まれた前記抗腫
   瘍剤の濃度が50μg(薬剤)/μmol(リポソーム脂質)を超
   える、請求項４または５に記載のリポソーム組成物。
7. 【請求項７】 充実性腫瘍中に血流を介して局在化する
   ためのリポソーム組成物の調製方法であって、腫瘍結像
   剤または抗腫瘍剤をリポソーム中に取り込んで請求項１
   から６のいずれかに１項に記載のリポソーム組成物を形
   成する工程を包含する方法。