JPH07503368A - 新規な生物活性ポリペプチド類，ならびにそれらの製造および含有薬学組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

１６　サツカロミセスまたはクルイベロミセス属の酵母菌であることを特徴とす る請求の範囲１５記載の組換え型細胞。 １７、請求の範囲１３から１６の１項記載の組換え型細胞を発現に適した条件下 で培養した後、産生されるポリペプチドを回収することを特徴とする請求の範囲 １から８の１項記載のポリペプチドの製造方法。 １８、請求の範囲１から８いずれか１項記載のポリペプチド類を１種以上含んで いる薬学組成物。 １９、遺伝治療で用いられ得る、請求の範囲９から１１いずれか１項記載のヌク レオチド配列を含んでいる薬学組成物。 明　細　書 新規な生物活性ポリペプチド類、ならびにそれらの製造および含有薬学組成物 本発明は、新規な生物活性ポリペプチド類、それらの製造、並びにそれらを含ん でいる薬学組成物に関する。 より詳細には、本発明は、アルブミンまたはアルブミンの変異体にカプリング（ ｃｏｕｐ　１　ｉｎｇ）させた、治療活性を示す、天然もしくはえ型のポリペプ チド類に関する。本発明のポリペプチド類が示す治療活性は直接的（病気の治療 ）または間接的（例えば、病気の予防、ワクチンの設計、医学画像形成技術など で用いられ得る）であり得ると理解する。 このアルブミン変異体は、下記の明細書において、与えられた同型のヒト血清ア ルブミンをコートする遺伝子を遺伝工学技術で修飾（変異、欠失および／または 付加）することによって得られる、高い血漿半減期を有する何らかの蛋白質、並 びに上記遺伝子がコートする蛋白質を生体外で修飾することによって得られる、 高い血漿半減期を有する何らかの巨大分子を示していると理解する。高度の多型 性を示すアルブミンである天然変異体が数多く同定され、分類分けされている［ ＷｉｔｋａｍｐＬ、　Ｒ，他「Ａｎｎ、　Ｈｕｍ、　Ｇｅｎｅｔ、　、３７　（ １９７３）　２１９］。 本発明の目的は、生物学的活性を示しそして薬学的に用いられ得る人玉量白質を 製造することにある。実際、薬学的に開発することができなかった、効力のある １種以上の治療活性を示すポリペプチド類が数多く存在している。これは種々の 理由を有している可能性があり、例えば特に、それらの生体内安定性が低い、− と、それらの構造が複雑であるか或は脆いこと、産業的に許容される規模でそれ らを製造するのが困難なことなどである。同様に、いくつかポリペプチド類は、 投与、包装、薬物動態学などに関する問題から、生体内において期待される程の 結果を与えていない。 本発明は、これらの欠点に打ち勝つことを可能にするものである。本発明は、実 際、これらのポリペプチド類が示す生物学的特性を最適に治療開発することを可 能にする新規な分子を提供するものである。本発明は、特に、生物学的活性を示 すポリペプチドから誘導した活性を示す構造のいずれかを、それらが示す上記生 物学的特性を損なうことなく遺伝学的に、アルブミンを含んでいる別の蛋白質構 造にカプリングさせることが可能であると言った証拠からもたらされたものであ る。本発明はまた、ヒト血清アルブミンを用いると活性部位が相互作用する部位 にそれが効率良く提示され得ることと本発明のポリペプチドに高い血漿安定性が 得られることを本出願者が示したことからもたらされたものである。 従って、本発明のポリペプチド類は、与えられた生物学的活性を体の中に長期間 に渡って維持することを可能にするものである。従って、これらは、投薬量を低 くすることを可能にし、そしである場合には、例えば投薬量が高いことによって 生じる副作用を低くすることによって治療効果を高めることを可能にするもので ある。加つるに、本発明のポリペプチド類は、非常に小さい従って所望効果に高 度に特異的な生物活性ポリペプチド類から誘導される構造を生じさせそして用い ることを可能にするものである。治療学的に興味の持たれている生物活性ペプチ ドはまた、例えばランダムなペプチドライブラリーから単離された非天然ペプチ ド配列に相当していてもよいと理解する。更に、本発明のポリペプチドは体の中 で特に有利な分布を示し、これによって、それらが示す薬学動態学的特性が修飾 され、そしてこれは、それが示す生物活性を開発しそしてそれを用いる補助にな る。加うるに、これらはまた、それらを用いる有機体に対して全く免疫原性を示 さないか或は示しても弱いと言った利点を有している。最後に、組換え有機体は 本発明のポリペプチド類を、それらを産業的に開発することを可能にするレベル で発現し得る（優先的に分泌し得る）。　従って、本発明の１つの目的は、アル ブミンまたはアルブミンの変異体にカプリングさせた、治療活性を示すポリペプ チドから誘導される活性部分を自んでいるポリペプチド類に関するものである。 特定の態様において、治療活性を示すこれらのペプチド類はヒト由来のものでな い。例えば、血液および間隙性区分室（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ　ｃｏｍｐａ ｒｔｍｅｎｔ）の病理学で有効性を示し得る特性を示すペプチド類またはそれら の誘導体、例えばヒルジン（ｈｉｒｕｄｉｎ）、トリグラミン（ｔ　ｒ　ｉｇｒ ａｍｉｎｅ）　、アンチスタチン（ａｎＴｉｓｔａｔｉｎｅ）、マダニ抗凝血性 ペプチド（ｔｉｃｋ　ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ）（ＴＡ Ｐ）、アリエチン（ａｒｉｅｔ、ｉｎ）、アブラギン（ａｐｐｌａｇｉｎ）など が挙げられ得る。 より詳細には、本発明の分子において、治療活性を示すポリペプチドは、ヒト由 来のポリペプチドまたは分子変異体である。例えば、これは、酵素、酵素阻害剤 、抗原、抗体、ホルモン、凝固調節に関与している因子、インターフェロン、サ イトカイン［インターロイキン類ばかりでなく、レセプタ（類）に結合する天然 の拮抗薬であるそれらの変異体、５Ｉｓ（誘発されて分泌される小型）型サイト カイン、並びに例えばマクロファージ炎症性蛋白質（ＭＩＰ）など］、成長因子 および／または分化因子［例えば形質転換した成長因子（ＴＧＦ）　、血液細胞 分化因子（エリスロポイエチン、Ｍ−Ｃ３Ｆ、Ｇ−Ｃ３Ｆ、ＧＭ−Ｃ３Ｆなど） 、インシュリンおよびそれに類似している成長因子（ＩＧＦ）、或はまた細胞透 過因子（ｃｅｌｌ　ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ　ｆａｃｔｏｒｓ）（ＶＰＦ／Ｖ ＥＧＦ）など］、骨組織の発生／吸収に関与している因子（例えばＯＩＦおよび オステオスポンチン（ｏｓｔｅｏｓｐｏｎｔｉｎ）、細胞運動性または移動に関 与している因子［例えばオートラリン運動性因子（ａｕｔｏｃｒｉｎｅ　ｍｏｔ ｉｌｉｔｙ　ｆａｃｔｏｒ）（ＡＭＦ）、移動刺激因子（ＭＳＦ）、或はまたス キャター因子（Ｓｃａｔｔｅｒ　ｆａｃｔｏｒ）（スキャター因子／肝細胞成長 因子）コ、殺菌もしくは抗真菌因子、化学走性因子［例えば血小板因子４　（Ｐ Ｆ４）　、或はまた単球化学誘引（ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔｉｎｇ）ペプチド 類（ＭＣＰ／ＭＣＡＦ）または好中球化学誘引ペプチド類（ＮＣＡＦ）などコ、 細胞増殖抑制性因子（例えばガラクトラド類に結合する蛋白質）、血漿（例えば フォンビルプラント因子（ｖｏｎ　Ｗｉ　Ｉ　Ｉｅｂｒａｎｄ因子）、フィブリ ノーゲンなど）または間隙性（ラミニン（ｌａｍｉｎｌｎ）、テナシン（ｔｅｎ ａｓｃｉｎ）、ビトロネクチン（ＶｉｔｒＯｎｅｃｔｉｎ）など）接着分子また は細胞外マトリックス、或はまた、循環および間隙性区分室の病理学［例えば動 脈および静脈の血栓形成、癌転移、腫瘍脈管形成、炎症性ショック、自己免疫病 、骨および骨関節病理学など］に関与している分子および／または細胞間相互作 用の拮抗薬または作動薬であるペプチド配列いずれかの、全てまたは一部であっ てもよい。 本発明のポリペプチド類の活性を示す部分は、例えば、治療活性全体を示すポリ ペプチド、それらから誘導される構造物、或はまたペプチドライブラリーから単 離される非天然ポリペプチドから成っていてもよい。 本発明の目的で、誘導される構造物は、治療活性を保持しているところの、修飾 によって得られるポリペプチドいずれかを意味していると理解する。修飾は、遺 伝的および／または化学的性質の変異、置換、欠失、付加または修飾いずれかを 意味していると理解すべきである。上記誘導体は、種々の理由、例えば特に、該 分子がそれの結合部位に対して示す親和力を上昇させる理由、それの産生レベル を改良する理由、プロテアーゼに対するそれの耐性を増大させる理由、それが示 す治療効果を向上させる理由、或はまたそれの副作用を低くする理由、或はそれ に新規な生物学的特性を与える理由などで生じさせ得る。例として、本発明のキ メラポリペプチド類は、病気の予防または治療で用いられ得る薬物動態学特性お よび生物活性を示す。 本発明の特に有利なポリペプチド類は、その活性部分が、（ａ）全ペプチド構造 、または （ｂ）構造的修飾（１種以上の残基の変異、置換、付加および／または欠失）に よって（ａ）から誘導される、治療活性を示す構造、を有しているポリペプチド 類である。 より詳細には、（ｂ）型の構造の中には、特定のＮ−もしくは。−グリコシル化 部位が修飾もしくは抑制されている分子、１個以上の残基が置換されている分子 、或は全てのシスティン残基が置換されている分子などが挙げられ得る。また、 考えられる結合部位との相互作用に関与していないか或はあまり関与していない 領域または望まれない活性を示す領域を欠失させることによって（ａ）から得ら れる分子、並びに（ａ）に比べて加えられた残基、例えばＮ末端メチオニンおよ び／または分泌用シグナルおよび／または結合用ペプチドなどを含んでいる分子 も挙げられ得る。 本発明の分子の活性を示す部分は直接か或は人工ペプチドを通してアルブミンに カプリングしていてもよい。更に、これは、この分子のＮ末端と共にＣ末端を構 成していてもよい。好適には、本発明の分子における活性を示す部分は、このキ メラのＣ末端部分を構成している。また、この生物学的活性を示す部分はそのキ メラ内で繰り返し存在していてもよいと理解する。本発明の分子に関する図式的 表示を図１に示す。 本発明の別の主題は、上に記述したキメラ分子の製造方法に関するものである。 より詳細には、この方法は、所望ポリペプチドをコートするヌクレオチド配列を 真核生物細胞または原核生物細胞宿主が発現するようにした後、それが産生じた ポリペプチドを収穫することにある。 本発明の枠内で用いられ得る真核生物細胞宿主の中には、動物細胞、酵母菌また は菌・カビが挙げられ得る。特に、酵母菌に関しては、サツカロミセス（Ｓａｃ ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）　 、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、シュヴｙ−オミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅ ｓ）またはハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属の酵母菌が挙げられ得る。動物 細胞に関しては、ＣＯＳ。 ＣＨＯおよびＣ１２７細胞などが挙げられ得る。本発明で用いられ得る菌・カビ の中には、より詳細には、アスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｆｌｕｓ　５ｓｐ ）またはトリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｓｓｐ）が挙げられ得る。原 核生物宿主に関しては大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）などの細菌 、或はコリネバクテリウム（Ｃ。 ｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｊｕｍ）、バチルス（Ｂａｃ　ｉ　１１ｕｓ）またはスト レプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する細菌を用いるのが好適で ある。 本発明の枠内で用いられ得るヌクレオチド配列は種々の方法で製造され得る。一 般に、これらは、このポリペプチドの機能的部分与々をコートする配列を読み段 階で組み立てることによって得られる。この後者は、本分野の技術者が有する技 術によって単離可能であり、例えば細胞のメッセンジ＋−ＲＮＡ　（ｍＲＮＡ） から直接が、或は相補ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）ライブラリーからの再クローニング によって単離可能であるか、或はまたこれらは、完全に合成されたヌクレオチド 配列であってもよい。更に、これらのヌクレオチド配列をまたその後、例えば遺 伝工学技術などによって修飾して、上記配列の誘導体または変異体を得ることも 可能であると理解する。 より好適には、本発明の方法におけるヌクレオチド配列は、コントロール下に置 かれているヌクレオチド配列の発現が宿主内で生じるのを可能にする、本発明の ポリペプチド類をコートする転写開始領域（プロモーター領域）を含んでいる発 現カセットの一部である。この領域は、用いる宿主細胞内で高度に発現する遺伝 子のプロモーター領域由来のものであってもよ（、ここで、この発現は構成的（ ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）または調節可能（ｒｅｇｕｌａｔａｂｌｅ）であっ てもよい。酵母菌に関するプロモーターは、ホスホグリセラードキナーゼ（ＰＧ Ｋ）、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（Ｇ　Ｐ　Ｄ） 、ラクターゼ（ＬＡＣ４）　、エノラーゼ類（ＥＮＯ）　、アルコールデヒドロ ゲナーゼ類（ＡＤ）（）などのための遺伝子のプロモーターであってもよい。細 菌に関するプロモーターは、ラムダバクテリオファージ由来の右側または左側遺 伝子のプロモーター（ｐｔ、Ｐ、）、或はまた、ｌ・リブトファン（Ｐ、、、） またはラクトース（Ｐ、、ｅ）オペロンのための遺伝子のプロモーターであって もよい。加つるに、このコントロール領域を、例えば追加的コントロール要素ま たは合成した配列を導入するか、或は元のコントロール要素を欠失させるが或は 置き換えることによるインビトロ変異誘発によって修飾してもよい。この発現カ セットはまた、本発明のポリペプチドをコートするヌクレオチド配列の直ぐ下流 に位置している、当該宿主内で機能を果す転写停止領域を含んでいてもよい。 好適な様式において、真核生物または原核生物宿主内にヌクレオチド配列が発現 しそして上記配列の発現の産物が培養培地に分泌される結果として、本発明のポ リペプチド類が得られる。この組換えルートを用いるとその培養培地内で分子を 直接得ることができることは、実際特に有利である。この場合、本発明のポリペ プチドをコートするヌクレオチド配列の前に、その用いる宿主の分泌経路におけ る発生期ポリペプチドの方向付けを行う「リーダ刊配列（またはシグナル配列） が存在している。この「リーダー」配列は、生物学的活性を示すポリペプチドの 天然シグナル配列［この場合、この後者は天然に分泌される蛋白質である］であ るか、或は安定化構造のシグナル配列であってもよいが、これはまた他の何らか の機能的「リーダー」配列であるか或は人工の「リーダー」配列であってもよい 。これらの配列の１つまたはその他の選択は、特に、その用いる宿主に従う。機 能的シグナル配列の例には、性フェロモンまたは酵母菌の「キラー」トキシンの ための遺伝子のシグナル配列が含まれる。 この発現カセットに加えて、この組換え型宿主を選択することを可能にするマー カーを１つまたはいくつが加えてもよく、例えば、酵母菌Ｓ。 セレビシェ（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＵＲＡ３遺伝子、或はゲネチシ ン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）（Ｇ４１８）（７）如き抗生物質ニ対スる耐性を与え るか或は特定の金属イオンの如き他の何らがの毒性化合物に対する耐性を与える 遺伝子などを加えてもよい。 この発現カセットおよび選択マーカーによって生じるユニットを、当該宿主細胞 に直接導入してもよいが、或は前辺て機能的自己複製ベクターに挿入してもよい 。上記１番目の場合として、好適には、宿主細胞のゲノムの中に存在している領 域に相同性を示す配列を上記ユニットに加えた後、相同組換えによるこれらの配 列の組み込みを目標として、その宿主のゲノムの中にそのユニットが組み込まれ る頻度を上昇させるように、上記配列をその発現カセットおよび選択遺伝子の各 側面に位置させる。この発現カセットを複製システムに挿入する場合、クルイベ ロミセス属の酵母菌に好適な複製システムは、Ｋ、ドロソフィラルム（Ｋ、ｄｒ ｏｓｏｐｈｉ　Ｉａｒｕｍ）由来の単離したプラスミドｐＫＤｌから誘導された ものであり、そしてサツカロミセス属の酵母菌に好適な複製システムは、Ｓ　セ レビシェ由来の２μプラスミドから誘導されたものである。更に、この発現プラ スミドは、上記複製システムの全てまたは−部を含んでいてもよいか、或はプラ スミドｐＫＤ１および２μプラスミド両方から誘導された要素を組み合わせても よい。 加うるに、これらの発現プラスミドは、大腸菌の如き細菌宿主と選択した宿主細 胞との間のシャトルベクターであってもよい。この場合、この細菌宿主内で機能 を果す複製開始点および選択マーカーが必要である。 この発現ベクターの上に、その細菌を取り巻いている制限部位およびユニークな 配列を位置させることも可能であり、これは、宿主細胞の形質転換を行う前にそ の端を切り取ったベクターをインビトロで切断して再連結することによって上記 配列をザブレスする（ｓｕｐｐｒ、ｅｓｓ）ことを可能にし、そしてこれによっ て、コピー数の増加がもたらされると共に、上記宿主における発現プラスミドの 安定性が上昇し得る。例えば、上記制限部位は、これらの部位が極めて希であり そして一般に発現ベクターから失われている限り、５°　−ＧＧＣＣＮＮＮＮＮ ＧＧＣＣ−３’（ＳｆｉＩ）または５’　−ＧＣＧＧＣＣＧＣ−３’　（Ｎｏｔ ｌ）の如き配列に相当していてもよい。 上記ベクターまたは発現カセットの構築を行った後、この後者を、文献に記述さ れている通常技術に従って、その選択した宿主細胞の中に導入する。これに関し て、細胞の中に外来ＤＮＡを導入することを可能にする如何なる方法も用いられ 得る。これは、特に形質転換、エレクトロポレーション、接合、或は本分野の技 術者に知られている他の何らがの技術であってもよい。酵母菌型宿主の例として 、用いる種々のクルイベロミセス株の全細胞を、Ｉｔｏ他が記述した技術［Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１５３　（１，９８３）１６３コに従い、酢酸リチウムと ポリエチレングリコールの存在下で処理することによって、これらの株の形質転 換を行う。エチレングリコールおよびジメチルスルホキサイドを用いた、Ｄｕｒ ｒｅｎｓ他が記述した形質転換技術［Ｃｕｒｒ、Ｇｅｎｅｔ。 １８　（１９９０）７］　も用いた。Ｋａｒｕｂｅ他が記述した方法［ＦＥＢＳ 　Ｌｅｔｔｅｒｓ　１８２　（１９８５）９０］に従うエレクトロポレーション でこれらの酵母菌の形質転換を行うことも可能である。代替操作をまた以下の実 施例の中に詳述する。 その形質転換した細胞を選択した後、上記ポリペプチド類を発現する細胞を接種 し、そして「連続」方法ではその細胞が増殖している間か、或は「バッチ」培養 ではその増殖が終了した時点で、上記ポリペプチド類の回収を実施することがで きる。次に、本発明の主題であるポリペプチド類をその培養上澄み液から精製し て、それらの分子特徴付け、薬物動態学特徴付けおよび生物学的特徴付けを行う 。 本発明のポリペプチド類に好適な発現システムは、宿主細胞としてクルイベロミ セス属の酵母菌を用い、Ｋ、マルキシアヌス・ベル・ドロソフィラルム（Ｋ、ｍ ａｒｘｊａｎｕｓ　ｖａｒ、　ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）由来の単離した染 色体外レプリコンｐＫＤ１から誘導した特定のベクターで形質転換することにあ る。これらの酵母菌、特にに、ラクチス（Ｋ、１ａｃｔｉＳ）およびに、フラギ リス（Ｋ、ｆｒａｇｉｌｉｓ）は、一般に、上記ベクターを安定に複製する能力 を有していることに加えて、Ｇ、Ｒ，Ａ、Ｓ、（ｒＧｅｎｅｒａｌｌｙ　Ｒｅｃ ｏｇｎｉｚｅｄ　Δｓ　Ｓａ　ｆ　ｅＪ　）有機体のリストに含まれていると言 った利点を有している。好ましい酵母菌は、好適には、プラスミドｐＫＤｌから 誘導される上記プラスミドを安定に複製する能力を有しておりそして本発明のポ リペプチド類を高レベルで分泌することを可能にする選択マーカーと共に発現カ セットが挿入されている、産業用クルイベロミセス属酵母菌である。 本発明はまた、上記キメラポリペプチド類をコートするヌクレオチド配列、並び に上記配列を含んでいる真核生物もしくは原核生物の組換え型細胞にも関する。 本発明はまた、本発明に従うポリペプチド類を医学製品として応用することにも 関係している。より詳細には、本発明の主題は、上述した如きポリペプチド類ま たはヌクレオチド配列を１種以上含んでいる全ての薬学組成物である。実際、こ れらのヌクレオチド配列は遺伝治療で用いられ得る。 説明的であり非制限的であると見なされるべき下記の実施例を用いて本発明を更 に詳しく記述する。 図のリスト 下記の図の中に示すプラスミドの表示は、一定の割合でプロットしたものでなく 、実施したクローニングを理解するに重要な制限部位のみを示したものである。 図１：５ＡＨ−ペプチド型（Ａ）またはペプチド−３ＡＨ型（Ｂ）またはペプチ ド−３ＡＨ−ペプチド型（Ｃ）のキメラの図式的表示。用いる省略形は下記の通 りである＋Ｍ／ＬＰ　−翻訳開始メチオニン残基（任意に、分泌のためのシグナ ル配列が後に続いている）；５ＡＨ−成熟したアルブミンまたはそれの分子変異 体の１つ、ＰＥＰ　−与えられた治療特性を示す天然もしくは人工源のペプチド 。このＰＥＰ配列は、Ａ型、Ｂ型またはＣ型分子内に数回存在している可能性が ある。 黒色矢印は、この成熟した蛋白質のＮ末端を示している。 図２　：　ｐｒｅｐｒｏ−３ＡＨ−ペプチド型のキメラ蛋白質をコートするＨ４ ｎｄｌｌＩ制限フラグメントのヌクレオチド配列の例。黒色矢印は、ＳＡＨの「 前（ｐｒｅ）Ｊと「後ろ（ｐｒｏ）Ｊ領域の末端を示している。ＭｓｔｌＩ制限 部位にアンダーラインを引き、そして翻訳の停止を指定するコドンを太字で示す 。 図３ニブラスミドｐＹＧ１０５に関する制限地図、並びに本発明のキメラ蛋白質 を発現させるためのプラスミドの構築を行う遺伝方策。用いる省略形：Ｐ　−転 写プロモーター二Ｔ　−転写ターミネーター：ＩＲ−プラスミドｐＫＤ１の逆方 向反復配列、ＬＰ　−分泌用シグナル配列、Ａｐ’とＫｍ’はそれぞれアンピシ リン（大腸菌）およびＧ４１８（酵母菌）に対する耐性のための遺伝子を示して いる。 図４−フォンビルプラント因子から誘導したＭｓｔＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限フ ラグメントのヌクレオチド配列の例。プラスミドｐＹＧ１２４８（パネルＡ）　 、ｐＹＧ１２１４　（パネルＢ）　、ｐＹＧ１２０６　［パネルＣ１この特別な キメラでは、このｖＷＦのＬｅｕ６９４残基もまたこのＳＡＨの最終残基（Ｌ　 ｅ　ｕ　５８５）である］およびｐＹＧ１２２３（パネルＤ）のＭｓ　ｔ　Ｉ　 ｌ−Ｈｌｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉフラグメントの構造の表示：これらのアミノ酸の番号 付けは、Ｔｉｔａｎｉ他［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２５（１９８６）３１７ １−３１８４］に従う成熟ｖＷＦの番号付けに相当している。これらのＭｓｔｌ ＩおよびＨｉｎｄｌｌｌ制限部位にアンダーラインを引き、そして翻訳停止コド ンを太字で示す。 パネルＥ、プラスミドｐＹＧ１２４８のＭｓ　ｔ　Ｉ　ｌ−Ｈｌｎｄ　Ｉ　Ｉ　 Ｉ制限フラグメントのヌクレオチド配列。これらのアミノ酸の番号付け（右側の コラム）は、成熟したキメラ蛋白質５ＡＨ−ｖＷＦ４７０→７１３（８２９個の 残基）に相当している。この成熟ｖＷＦのＴｈｒ４７０、Ｌｅｕ４９４、Ａｓｐ ４９８、Ｐｒｏ５０２、Ｔｙｒ５０８、Ｌｅｕ６９４、Ｐｒｏ７０４およびＰｒ ｏ７０８残基にアンダーラインを引（。 図５＝プラスミドｐＹＧ１２４８　（ＳＡＨ−ｖＷＦ　Ｔｈｒ４７０→Ｖａ１７ １３のキメラを発現させるためのプラスミド）およびｐＫａｎ７０７（コントロ ールプラスミド）で形質転換した菌株ＣＢ５２９３゜９１を４日間培養（三角フ ラスコ）した後分泌される材料の特徴。この実験では、パネルＡ、ＢおよびＣで 得られるものを同じゲル（８，５％の５ＤＳ−ＰＡＧＥ）上で泳動させた後、個 別に処理した。 Ａ、クーマシーブルー染色；分子量標準（レーン２）；ＹＰＬ培地内においてプ ラスミドｐＫａｎ７０７で形質転換した培養物の５０μＬに相当する上澄み液（ レーン１）、またはＹＰＤ培地内におけるｐＹＧ１２４８（レーン３）またはＹ ＰＬ培地内におけるｐＹＧ１２４８　（、レーン４）。 Ｂ１ヒトｖＷＦに特異的なマウス抗体を用いた後分泌される材料の免疫学的特徴 ：ビオチニル化した分子量標準を用いる以外はＡと同じレジエンド。 Ｃ、ヒトアルブミンに特異的なラビット抗体を用いた後分泌される材料の免疫学 的特徴：ＹＰＬ培地内においてプラスミドｐＫａｎ７０７で形質転換した培養物 の５０μＬに相当する上澄み液（レーン１）、またはＹＰＤ培地内におけるｐＹ Ｇ１２４８　（レーン２）またはＹＰＬ培地内におけるｐＹＧ１２４８　（レー ン３）。 図６；プラスミドｐＹＧ１２０６で形質転換した菌株ＣＢ５２９３゜９１が本発 明のキメラを分泌する時の速度論（ＳＡＨ−ｖＷＦ　Ｌｅｕ６９４−Ｐｒｏ７０ ８）。 Ａ、クーマシーブルー染色：分子量標準（レーン１）；　ｒＦｅｄバッチ」培養 物をＹＰＤ培地に２．５μＬ入れて２４時間（レーン２）、４０時間（レーン３ ）または４６時間（レーン４）増殖させたものに相当する上澄み液。 Ｂ１ヒトｖＷＦに特異的なマウス抗体を用いた後分泌される材料の免疫学的特徴 ：ビオチニル化した分子量標準を用いる以外はＡと同じレジエンド。 図７＝プラスミドｐＫａｎ７０７　（コントロールプラスミド、レーン２）　、 ｐＹＧ１２０６　（レーン３）　、ｐＹＧ１２１４　（レーン４）およびｐＹＧ １２２３　（レーン５）で形質転換したに、ラクチスが分泌する材料の特徴；分 子量標準（レーン１）。これらの堆積物は、ＹＰＤ培地中で増殖させた後の静置 培養物から得られる上澄み液の５０１．ＬＬを８゜５％のアクリルアミドゲル上 で泳動させた後クーマシーブルーで染色したものに相当している。 図８＝プラスミドｐＹＧ１３４１のＭｓ　ｔ　Ｉ　ｌ−Ｈｌｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ制 限フラグメントのヌクレオチド配列（ＳＡＨ−ＵＫＩ→１３５）。プラスミドｐ ＹＧ１３４０のＭｓｔＩＩ−ＨｉｎｄＴＩＩ制限フラグメントの中に存在してい るＥＧＦ様ドメイン（ＵＫＩ→４６）の範囲を示している。これらのアミノ酸の 番号付けは、成熟したキメラ蛋白質５ＡＵ−ＵＫ１→１３５　（７２０個の残基 ）に相当している。 図９ニブラスミドｐＹＧ１３４３　（ＳＡＨ−ＵＫＩ−４６）およびｐＹＧ１３ ４５　（ＳＡＨ−ＵＫＩ−１３５）で個別に形質転換した菌株ＣＢ５２９３．９ １を用い、４日間増殖させた後（ＹＰＬ十Ｇ４１８培地）の５ＡＨ−ＵＫＩ−４ ６および５ＡＨ−ＵＫＩ−１３５キメラ分泌。これらの堆積物（５０μＬの培養 物に相当している）を、８．５％のＰＡＧＥ−３ＤＳゲル上で泳動させた後、ク ーマシーブルーで染色したニブラスミドｐＫａｎ７０７　（レーン１）　、ｐＹ Ｇ１３４３　（レーン３）またはｐＹＧ１３４５　（レーン４）で形質転換した クローンから得られる上澄み液：分子量標準（レーン２）。 図１０ニブラスミドｐＹＧ１２５９のＭｓ　ｔ　Ｉ　ｌ−Ｈｌｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ 制限フラグメントのヌクレオチド配列（ＳＡＨ−Ｇ、Ｃ３Ｆ）。Ｇ−Ｃ３Ｆ部分 の範１１Ｕ（ＬＬ４個の残基）を示している。Ａｐａｌおよび５ｓｔ１（Ｓｓｔ Ｉ）制限部位にアンダーラインを引く。これらのアミノ酸の番号付けは、成熟し たキメラ蛋白質５ＡＨ−Ｇ、Ｃ３Ｆ　（７５９個の残基）に相当している。 図１１；プラスミドｐＹＧ１３０１のＨｉｎｄｌｌＩ制限フラグメントのヌクレ オチド配列（キメラＧ、Ｃ３Ｆ−Ｇ１　ｙ４　５ＡＨ）。黒色矢印は、ＳＡＨの ［前（ｐｒｅ）Ｊと「後ろ（ｐｒｏ）Ｊ領域の末端を示している。Ａｐａ　Ｌ　 Ｓｓ　ｔ　Ｉ　（Ｓａｃ　Ｉ）およびＭｓ　ｔ　Ｉ　Ｉ制限部位にアンダーライ ンを引＜、Ｇ、Ｃ３Ｆ　（１７４個の残基）と５ＡＨ（５８５個の残基）ドメイ ンを合成リンカ−ＧＧＧＧが分離してＬ）る。 これらのアミノ酸の番号付けは、成熟したキメラ蛋白質Ｇ、Ｃ５Ｆ−ＧＩ　ｙ＜ 　ＳＡＨ（７６３個の残基）に相当している。翻訳停止コドンとＨｉｎｄＩＩＴ 部位との間に存在しているヌクレオチド配列は、ヨー口・ツバ特許出願公開第３ ６１　９９１号の中に記述されている如きＳＡＨ相補ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）由来 のものである。 図１２．プラスミドｐＹＧ１２６６　（ＳＡＨ−Ｇ、Ｃ３Ｆ型のキメラを発現さ せるためのプラスミド）およびｐＫａｎ７０７　（コントロールプラスミド）で 形質転換した菌株ＣＢ５２９３．９１を４日間培養（三角フラスコ）した後分泌 される材料の特徴。この実験では、パネルＡ。 ＢおよびＣで得られるものを同じゲル（８，５％の５ＤＳ−ＰＡＧＥ）上で泳動 させた後、個別に処理した。 Ａ、クーマシーブルー染色；分子量標準（レーン２）：ＹＰＬ培地内においてプ ラスミドｐＫａｎ７０７で形質転換した培養物の１００μＬに相当する上澄み液 （レーン１）、またはＹＰＤ培地内におけるｐＹＧ１２６６　（レーン３）また はＹＰＬ培地内におけるｐＹＧｌ、２６６　（レーン３）。　゛ Ｂ、ヒトＧ−Ｃ８Ｆに特異的な一次抗体を用いた後分泌される材料の免疫学的特 徴：Ａと同じレジエンド。 Ｃ、ヒトアルブミンに特異的な一次抗体を用いた後分泌される材料の免疫学的特 徴：Ａと同じレジエンド。 図１３ニブラスミドｐＹＧ１２６７（キメラ５ＡＨ−Ｇ、Ｃ３Ｆ）、ｐＹＧ１３ ０３　（キメラＧ、Ｃ３Ｆ　ＧＩ　Ｙ４−３ＡＨ）およびｐＹＧ１３５２　（キ メラ５ＡＨ−Ｇ１　ｙａ　Ｇ、Ｃ３Ｆ）で形質転換した菌株ＣＢ５２９３．９１ を４日間培養（三角フラスコ、ＹＰＤ培地中）した後分泌される材料を８．５％ の５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で泳動させた後の特徴。 Ａ、クーマシーブルー染色ニブラスミドｐＹＧ１３０３　（レーン１）、ｐＹＧ １２６７　（レーン２）またはｐＹＧ１３５２　（レーン３）で形質転換した培 養物の１００μＬに相当する上澄み液；分子量標準（レーン４）。 Ｂ、ヒトＧ−Ｃ３Ｆに特異的な一次抗体を用いた後分泌される材料の免疫学的特 徴、八と同じレジエンド。 図１４＝プラスミドｐＹＧｉ３８２のＭｓｔｌｌ−Ｈｉｎｄｌｌ！制限フラグメ ントのヌクレオチド配列（ＳＡＨ−Ｆｖ’　）。このＦｖ’　フラグメントのＶ Ｈ（１２４個の残基）とＶＬ（１，０７個の残基）ドメインを合成リンカ−（Ｇ ＧＧＧＳ）−ｓが分離している。これらのアミノ酸の番号付けは、成熟したキメ ラ蛋白質５ＡＨ−Ｆｖ’　（８３１個の残基）に相当している。 図〕、５ニブラスミドｐＹＧ１３８３　（ＬＡＣ４）で形質転換した菌株ＣＢ５ ２９３．９１を、三角フラスコ中２８℃で、ＹＰＤ培地（レーン２）またはＹＰ Ｌ　（レーン３）内で４日間増殖した後のキメラ５ＡＨ−Ｆｖ’　分泌；分子量 標準（レーン１）。２００μＬの培養物に相当している堆積物（エタノールで沈 澱）をＰＡＧＥ−３ＤＳゲル（８，５％）上で泳動させる。 Ａ１このゲルのクーマシーブルー染色。 Ｂ、ＳＡＨに特異的な一次抗体を用いた後分泌される材料の免疫学的特徴。 図１６＝ホルムアルデヒドで固定したヒト血小板凝集に関するインビトロ拮抗作 用のアッセイ・標準ＲＧ１２９８６と比較したハイブリッド５ＡＨ−ｖＷＦ６９ ４−７０８、［５ＡＨ−ｖＷＦ４７０−７１３　Ｃ４７１Ｇ、Ｃ４７４Ｇコおよ び［５ＡＨ−ｖＷＦ４７０−７０４　Ｃ４７１Ｇ１Ｃ４７４Ｇ］のＩＣ５０゜Ｃ ，Ｐｒ１ｏｒ他が記述した方法［Ｂｉｏ／ＴｅｃｈｎｏｌｏｇＹ（１９９２）１ ０　６６］に従い、ヒトｖＷＦの存在下３７°Ｃで撹拌しながらボトロセチン（ ｂｏｔｒｏｃｅｔｉｎ）（８，２ｍｇ／ｍＬ）と種々の希釈率の試験産物が示す 光学透過率の変動を記録する血小板凝集計を用い、この血小板凝集の用量依存阻 害測定を実施する。次に、コントロール凝集（産物の存在なし）を半分阻害する ことを可能にするその産物の濃度を決定する（ＩＣ５０）。 図１７：マウス株ＮＦＳ６０のインビトロ細胞増殖に対する活性。６時間インキ ュベートした後、細胞核の中に取り込まれる放射能（ｓＨ−チミジン）をＸ軸上 に示しくｃｐｍ）、そしてＸ軸上に表す産物の量をモル濃度（任意単位）で示す 。 図１８：ラットにおける顆粒球形成に対するインビボ活性。好中球の数（７匹の 動物の平均）を時間の関数としてＸ軸上に示す。試験した産物ハ、＋メ５ＳＡＨ −Ｇ、Ｃ３Ｆ　（ｐＹＧ１２６６）（４または４０ｍｇ／ラット／日）、参照Ｇ −Ｃ３Ｆ　（１０ｍｇ／ラット／日）、クルイベロミセス・ラクチス上澄み液か ら精製した組換え型ＳＡＨ（ＳＡＨ。 ３０ｍｇ／ラット７日、ヨーロッパ特許出願公開第３６１　９９１号を参照）、 または生理食塩水である。 衷應男 一般クローニング技術 分子生物学で通常に用いられている方法、例えばプラスミドＤＮＡの予備抽出、 塩化セシウム勾配におけるプラスミドＤＮＡの遠心分離、アガロースまたはアク リルアミドゲル上の電気泳動、電気溶離によるＤＮＡフラグメントの精製、フェ ノールまたはフェノール−クロロホルムを用いた蛋白質の抽出、食塩水培地内Ｄ ＮＡのエタノールまたはイソプロパツール沈澱、大腸菌における形質転換などは 、本分野の技術者によ（知られており、そして文献の中に幅広（記述されている ［ＭａｎｉａｔｉｓＴ、他ｒＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、ａ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙ　ＭａｎｕａｌＪ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａ ｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ。 Ｙ、、１９８２　；Ａｕ５ｕｂｅ　ｌ　Ｆ、Ｍ、他（編集）ｒＣｕｒｒｅｎｔＰ ｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＢｉｏｌｏｇｙＪ、Ｊｏｈｎ　 Ｗｉｌｅｙ　＆　ＳｏｎｓＳＮｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９８７］。 これらの制限酵素はＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　（Ｂｉｏｌａｂ ｓ）、Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　（Ｂ ＲＬ）またはＡｍｅｒｓｈａｍから供給されたものであり、そして供給業者の推 奨に従って用いた。 ｐＢＲ３２２およびｐＵＣ型のプラスミドおよびＭ１３ンリーズのファージは市 販のものである（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ ｅｓ）。 連結反応に関しては、アガロースもしくはアクリルアミドゲル上の電気泳動によ り大きさに従ってＤＮＡフラグメントを分離し、フェノールまたはフェノール／ クロロホルム混合物を用いた抽出を行い、エタノールで沈澱させた後、製造業者 の推奨に従い、ファージＴ４　ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在下でイ ンキュベートした。 大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメント（Ｂｉｏｌａｂｓ）を用 い、供給業者の仕様書に従って、突き出ている５゛末端の充填を実施する。ファ ージＴ４　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在下、この製造業者の推 奨に従って、その突き出ている３゛末端の破壊を実施する。Ｓ１ヌクレアーゼを 用いて調節した処理を行うことによって、その突き出ている５°末端の破壊を実 施する。 Ａｍｅｒｓｈａｍが市販しているキットを用い、Ｔａｙｌｏｒ他が開発した方法 ［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１３　（１９８５）８７４９−８７６ ４１に従って、合成オリゴデオキシヌクレオチド類を用いたインビトロ部位特異 的変異誘発を実施する。 ｒＤＮＡサーマルサイクラ−Ｊ　（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）を 用い、この製造業者の仕様書に従って、いわゆるＰＣＲ技術［ポリメラーゼ触媒 連鎖反応、５ａｉｋｉ　Ｒ，に、他、５ｃｉｅｎｃｅ　２３０　（１９８５）１ ３５０−１３５４；Ｍｕｌｌｉｓ　Ｋ、Ｂ。 およびＦａｌｏｏｎａ　Ｆ、Ａ、　、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍ、、１５５　（１９ ８７）３３５−３５０１によるＤＮＡフラグメントの酵素的増幅を実施する。 Ａｍｅｒｓｈａｍが市販しているキットを用い、Ｓａｎｇｅ　を他が開発した方 法［Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７４（１９７７）５４ ６３−５４６７３により、ヌクレオチド配列の立証を実施する。 本発明の蛋白質を発現させるためのプラスミド由来ＤＮＡを用いたＫ。 ラクチスの形質転換を、本分野の技術者に知られている技術いずれかを用いて実 施するが、この実施例を本明細書の中に示す。 特に明記されていない限り、用いる菌株は大腸菌ＭＣ１０６０（Ｌａｃ　ＩＰＯ ＺＹＡＳＸ７４、ｇａ　ＩＵＳｇａ　ＩＫＳｓ　ｔ　ｒＡ’）または大腸菌ＴＧ Ｉ　（Ｉａｃ、ｐｒｏＡ、Ｂ、５ｕｐＥ、ｔｈｉ、ｈｓｄＤ５／ＦｔｒａＤ３６ 、ｐｒｏＡ″″Ｂ′″、Ｉａｃｌ’、ＩａｃＺＳＭ１５）である。 用いる酵母菌は、出芽酵母菌に属しており、より詳細には、クルイベロミセス属 の酵母菌に属している。特にに、ラクチスＭＷ９８−８Ｃ（ａ％ｕｒａＡ、ａｒ ｇ、Ｉｙｓ、Ｋ”５ｐＫＤ１’　）およびに、ラクチスＣＢ５２９３．９１株を 用い、そしてＭＷ９８−８Ｃ株のサンプルを、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ　 ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｋｕｌ　ｔｕｒｅｎ　（ＣＢＳ）　、Ｂａａｒｎ　 （オランダ）に１９８８年９月１８日付けで寄託し、番号ＣＢ５５７９．８８の 下で登録された。 プラスミドｐＥＴ−８ｃ５２にで形質転換した細菌株（大腸菌）を番号ＡＴＣＣ ６８３０６の下でＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃ ｔｉｏｎに１９９０年４月１７日付けで寄託した。 本発明の蛋白質をコートする発現プラスミドで形質転換した酵母菌株を、三角フ ラスコまたは２１パイロット発酵器（Ｓ　ＥＴＲＩ　Ｃ，フランス）中、豊富培 地（ＹＰＤ：１％の酵母菌抽出液、２％のバクトペプトン、２％のグルコース； 或はＹＰＬ　：　１％の酵母菌抽出液、２％のバクトベブトン、２％のラクトー ス）の中で一定撹拌しながら２８°Ｃで培養する。 実施例１：ＳＡＨのＣ末端におけるカプリングプラスミドｐＹＧ４０４はヨーロ ッパ特許出願公開第３６１　９９１号の中に記述されている。このプラスミドは 、Ｓ、セレビシェのＰＧＫ遺伝子を翻訳するための開始ＡＴＧの直ぐ上流に元々 存在している２１個のヌクレオチドの後に、ｐｒｅｐｒｏ−３ＡＨ遺伝子をコー トするＨｉｎｄｌｌｌ制限フラグメントを含んでいる。この制限フラグメントの ヌクレオチド配列を図２の中に含める。コーディング配列の中に位置しているＭ ｓ　ｔ　Ｉ　Ｉ部位、即ち翻訳の終了を指定するコドンから３個の残基は、翻訳 段階でＳＡＨのＣ末端にカプリングさせることが望まれている生物活性ペプチド をクローニングするための部位として特に有効であＧＣＴＴ−３°型のＭｓ　ｔ 　Ｔ　ｌ−Ｈｌｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ制限フラグメントがコートする配列で表される ペプチドを用いるのが有効であり、ここで、この配列は生物学的活性を示すペプ チドをコートする（ｐ個の残基は［３ｘＮ］、である）。３個のＣ最末端アミノ 酸（ロイシン−グリシン−ロイシン残基）を除く、ＳＡＨをコートする遺伝子全 体に相当するＨｉｎｄｌｌＩ−ＭｓｔＩＩ制限フラグメントへの上記フラグメン トの連結反応により、ＳＡＨのｒｐｒｅｐｒｏＪエクスポート（ｅｘｐ、ｏｒｔ ）領域の直ぐ後に５Ａ）Ｉ−ペプチド型のキメラ蛋白質をコートするハイブリッ ド遺伝子（図１、パネルＡ）を含んでいるＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ制限フラグメント が生じる。別の態様において、この生物学的活性を示すペプチドは、そのキメラ の中に２回以上存在していてもよい。 実施例２　：　ＳＡＨのＮ末端におけるカプリング特定態様において、部位特異 的変異誘発とＰＣＲ増幅を一緒にした技術を用いることで、シグナルペプチド（ 例えばＳＡＨのｐｒｅｐｒｏ領域）と、生物学的活性を示すペプチドを含んでい る配列と、成熟形態のＳＡＨまたはそれの分子変異体の１つとの間の翻訳カプリ ングの結果として生じる、キメラ蛋白質をコートするハイブリッド遺伝子を構築 することも可能である。これらのハイブリッド遺伝子は、好適には、翻訳開始Ａ ＴＧの５″および翻訳停止コドンの３゛で、Ｈｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ制限部位に境を 接しており、そしてこれらは、ペプチド−８ＡＨ型（図１、パネルＢ）のキメラ 蛋白質をコートする。さらなる特定態様において、この生物学的活性を示すペプ チドは、そのキメラ内に２回以上存在してぃてもよい。 実施例３　：　ＳＡＨのＮ末端およびＣ末端におけるカプリング実施例１および ２に記述した部位特異的変異誘発とＰＣＲ増幅を一緒にした技術を用いることで 、成熟形態のＳＡＨまたはそれの分子変異体の１つと、ＳＡＨのＮ末端およびＣ 末端にカプリングさせた生物活性ペプチドとの間の翻訳カプリングの結果として 生じる、キメラ蛋白質をコートするハイブリッド遺伝子を構築することができる 。これらのハイブリッド遺伝子は、好適には、翻訳開始ＡＴＧの５°および翻訳 停止コドンの３゛で、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位に境を接しており、そしてこれら は、ＳＡＨのｒｐｒｅｐｒｏＪエクスポート領域の直ぐ後に存在しているペプチ ド−３ＡＨ−ペプチド型（図１、パネルＣ）のキメラ蛋白質をコートする。さら なる特定態様において、この生物学的活性を示すペプチドは、そのキメラ内に２ 回以上存在していてもよい。 実施例４：発現プラスミド類 機能的、調節可能または構成的プロモーター、例えばプラスミドｐＹ０１０５（ クルイベロミセス・ラクチスのＬＡＣ４プロモーター）、ｐＹＧ１０６　（サツ カロミセス・セレビシェのＰＧＫプロモーター）、ｐＹＧ５３６　（Ｓ、セレビ シェのＰＨ０５プロモーター）の中に存在しているプロモーター、或はハイブリ ッドプロモーター、例えばヨーロッパ特許出願公開第３６１　９９１号に記述さ れている如きプロモーターを用いて、上記実施例のキメラ蛋白質を酵母菌内で発 現させることができる。本明細書では、これらのプラスミドｐＹＧ１０５および ｐＹＧ１０６が特に有効である、と言うのは、これらは、Ｋ　ラクチス内で機能 を果す調節可能（ｐＹＧ１０５）または構成的（ｐＹＧ１０６）プロモーターを 用いて、上記実施例に記述した如きＨｉｎｄｌｌｌ制限フラグメントによってコ ートされそしてＨｉｎｄｌ１１部位に産生配向（転写のためのプロモーターに関 して基部にアルブミンのｒｐｒｅｐｒｏＪ領域を位置させる配向として定義する ）でクローン化した遺伝子の発現を可能にするからである。このプラスミドｐＹ Ｇ１０５は、ヨーロッパ特許出願公開第３６１　９９１号に記述されているプラ スミドｐＫａ　ｎ　７０７に相当しており、ここでは、ユニークでありそしてゲ ネチシン（Ｇ４１８）に対する耐性のための遺伝子の中に位置しているＨｉｎｄ ｌＩＩ制限部位が部位特異的変異誘発で壊されているが未変化蛋白質を保存して いる（オリゴデオキシヌクレオチド５’　−ＧＡＡＡＴＧＣＡＴＡＡＧＣＴＣＴ ＴＧＣＣＡＴＴＣＴＣＡＣＣＧ−３°）。その後、その変異プラスミドのＵＲＡ ３遺伝子をコートする５ａｌＩ−３ａｃＴフラグメントを、Ｋ、ラクチスのＬＡ Ｃ４プロモーター（Ｓａ　ｌ　ｌ−Ｈｌｎｄ　Ｉ　ＩＩフラグメントの形態で） およびＳ、セレビシェのＰＧＫ遺伝子のターミネータ−（Ｈｉｎｄｌ　Ｉ　ｌ− ３ａｃｌの形態で）から成る発現カセットを含んでいる５ａｉｌ−８ａｃｌ制限 フラグメントで置き換えた。このプラスミドｐＹＧ１０５はクルイベロミセス酵 母菌内で分裂的に非常に高い安定性を示し、それの制限地図を図３に示す。プラ スミドｐＹＧ１０５とｐＹＧ１０６が互いに異なっているのは、５ａｉｌ−Ｈｉ ｎｄＩＩＩフラグメントがコートする転写用プロモーターの性質のみである。 実施例５．酵母菌の形質転換 例えば、下記の如く適合させた、酢酸リチウムで全細胞を処理する技術［Ｉｔｏ Ｈ，他ｒＪ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１５３　（１９８３）　１６３−１６８ １を用いて、クルイベロミセス属に属する酵母菌、特にＫ。 ラクチスのＭＷ９８−８Ｃ株およびＣＢ５２９３．９１株の形質転換を行う。５ ０ｍＬｏ′）ＹＰＤ培地中２８℃で撹拌しながら、６００ｎｍにおける光学密度 （ＯＤ＠。。）が０６から０．８になるまで、これらの細胞の増殖を行い、そし て低速遠心分離で細胞を収穫し、ＴＥの無菌溶液（１０ｍＭのトリスＨＣＩ、ｐ Ｈ７，４；　１ｍＭのＥＤＴＡ）で洗浄し、３−４ｍＬの酢酸リチウムＣＴＥ中 ０．１Ｍ）の中に再懸濁させることによって、細胞密度が約２ｘｌＯ’個細胞／ 　丁ＴＩ　Ｌになるようにした後、穏やかに撹拌しながら１時間３０℃でインキ ュベートする。その得られる受容能のある細胞懸濁液の一定分ＪＩ０．１ｍＬを 、ＤＮＡの存在下、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ４゜ｏｏｓ　Ｓ　ｉ　ｇｍ ａ）の最終濃度が３５％になるようにして、１時間３０℃でインキュベートする 。４２℃で５分間熱シヨツクを与えた後、これらの細胞を２度洗浄し、０．２ｍ Ｌの無菌水の中に再懸濁させ、そして２ｍＬのＹＰＤ培地中２８℃で１６時間イ ンキュベートすることにより、Ｐｋｌプロモーター制御制御発現する６４１８耐 性遺伝子の表現型発現を可能にしくヨーロッパ特許出願公開第３６１　９９１号 参照）、そして次に、この細胞懸濁液の２００μＬを選択ＹＰＤ皿（Ｇ４１８． ２００　ｕ　ｇ／ｍＬ）上で平板培養した。これらの皿を２８８Ｃでインキュベ ートし、モして２から３日間細胞増殖を行った後、形質転換体が現れる。 実施例６：キメラの分泌 Ｇ４１８を補った豊富培地上で選択した後、組換えクローンを、キメラ蛋白質の 成熟形態を分泌する能力を有しているか否かに関して試験した。ＳＡＨと生物活 性部分との間のキメラを発現させるためのプラスミドによって形質転換した株Ｃ Ｂ５２９３゜９１またはＭＷ９８−８Ｃに相当しているいくつかのクローンを、 ２８℃のＹＰＤまたはＹＰＬ培地内でインキュベートする。これらの細胞が定常 増殖段階に到達した時点で、細胞上澄み液を遠心分離で回収し、エタノールの最 終濃度が６０％になるように一２０℃で３０分間沈澱させることによって任意に １０倍濃縮し、そして次に、８．５％５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル使用電気泳動にかけ た後、クーマシーブルーを用いたゲル染色によって直接的にか、或は生物活性部 分に特異的な一次抗体またはＳＡＨに特異的なラビットポリクロ−六ル血清を用 いた免疫プロッティングを行った後、それらの試験を行った。免疫学的検出のた めの実験を行っている間、最初にニトロセルロースフィルターを特異的−次抗体 の存在下でインキュベートし、数回洗浄し、この−次抗体に特異的なりギ抗体の 存在下でインキュベートした後、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ　（Ｂｉｏｓｙｓ　Ｓ、 Ａ、　、Ｃｏｐｉａｇｎｅ、フランス）が市販しているｒＡＢＣキット」を用い 、アビジン−ペルオキシダーゼ複合体の存在下でインキュベートした。次に、３ ゜３′−ジアミノベンジジン四塩酸塩（ｐｒｏｌａｂｏ）を添加し、この製造業 者の推奨に従って、過酸化水素の存在下で免疫学的反応を明らかにする。 実施例７・フォンビルプラント因子から誘導したキメラＥ、７．　１．　血小板 に対するｖＷＦの結合に拮抗するフラグメントＥ、７．　１．　１．　ｖＷＦの Ｔｈｒ４７０−Ｖａ　ｌ　７１３残基プラスミドｐＥＴ−８ｃ５２には、ヒトｖ ＷＦの残基４４５から７３３をコートするｖＷＦ　ｃＤＮＡのフラグメントを含 んでおり、従って一方ではｖＷＦと血小板との間の相互作用に関する重要な決定 基をいくつか含んでおり、そして他方では、基底膜および内皮下（ｓｕｂ−ｅｎ ｄｏｔｈｅｌｉａｌ）組織の特定要素を含んでおり、特にｖＷＦとＧＰｌｂ［Ｍ ｏｒｉ　Ｈ，他ｒＪ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６３　（１９８８）１７９ ０１−１７９０４１の間の相互作用に拮抗するペプチドＧＩＯとＤ５を含んでい る。このペプチド配列は、Ｔｉｔａｎｉ他［Ｂ　４　ｏ　ｃ　ｈｅｍｉｓｔｒｙ 　２５（１９８６）３１７１−３１８４１が記述した相当する配列と同じである 。これらの遺伝決定基の増幅は、例えば増幅すべき配列のどちらかの側に位置し ている隣接残基をコートするオリゴデオキシヌクレオチドをプライマーとして用 いたＰＣＲ増幅技術により、プラスミドｐＥＴ８ｃ５２Ｋを用いて実施され得る 。次に、この増幅したフラグメントをＭ１３型のベクターにクローン化し、多重 クローニング部位のどちらかの側に位置している普遍プライマーを用いるか或は いくつかの同型を示す配列が知られているｖＷＦ遺伝子の増幅領域に特異的なオ リゴデオキシヌクレオチドを用いた配列決定を行うことによって、それらの立旺 を行う［５ａｄｌｅｒ　Ｊ、Ｅ、他ｒＰｒｏｃ、Ｎａ　ｔ　ＩＡｃａｄ、Ｓｃｉ 、８２　（１９８５）６３９４−６３９８；ＶｅｒｗｅｉｊＣ，Ｌ、他ｒＥＭＢ ｏ　Ｊ、　５　（１９８６）　１８３９−１８４７；５ｈｅｌｔｏｎ−Ｉｎｌｏ ｅｓ　Ｂ、Ｂ、他ｒＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２５　（１９８６）　３１６４ −３１７１　；Ｂｏｎｔｈｒｏｎ　Ｄ。 他ｒＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１７　（１９８６）　７１２５− ７１２７３゜このように、オリゴデオキシヌクレオチドである５′−ＣＣＣＧＧ ＧＡＴＣＣＣＴＴＡＧＧＣＴＴＡＡＣＣＴＧＴＧＡＡＧＣＣＴＧＣ−３’　（Ｓ ｑ１９６９、ＭｓｌｌＩ部位ニア部位−アンダーラインおよび５’　−ＣＣＣＧ ＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＡＧＡＣＴＴＧＴＧＣＣＡＴＧＴＣＧ−３’　（Ｓｑ ２０２９、Ｈｉｎｄｌ１１部位にアンダーラインを引く）を用いたプラスミドｐ ＥＴ−８ｃ５２にのＰＣＲ増幅により、ｖＷＦのＴｈｒ４７０からＶａ１７１３ 残基を含んでいるＭｓｔＩＴ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントが生じる（図４ 、パネルＥ）。 ３個のＣ最末端アミノ酸を除き（図２参照）、ＳＡＨをコートする遺伝子全体に 相当しているＨｉｎｄｌＩＩ−ＭｓｔＩＩ制限フラグメントに上記フラグメント を連結することにより、ＳＡＨのｒｐｒｅｐｒｏＪエクスポート領域の直ぐ後に ５ＡＨ−ペプチド型のキメラ蛋白質をコートするハイブリッド遺伝子を含んでい るＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ制限フラグメントが生じる（図１、パネルＡ）。この制限 フラグメントを、プラスミドｐＹＧ　ｉ　Ｏ５のＨｉｎｄＴＩＩ部位に産生配向 でクローン化し、これによって、発現プラスミドｐＹＧ１２４８が生じる（ＳＡ Ｈ−ｖＷＦ４７０−７１３）。 Ｅ、７．　］、、２．　分子変異体・ 別の態様において、ｖＷＦの結合部位は、成熟ｖＷＦのＴｈｒ４７０からＡＳ＋ ）４９８残基を含んでいるペプチドである。ペプチドＧＩＯを含んでいる上記配 列（Ｃｙｓ４７４−Ｐｒｏ４８８）は、Ｍｏｒｉ他［Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、 ２６３　（１９８８）１７９０１−１７９０４コに記述されており、ヒト血小板 のＧＰｌｂとヒトｖＷＦとの相互作用に拮抗し得る。例えば、オリゴデオキシヌ クレオチド５ｑ１９６９および５’　−ＣＣＣＧＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＡＧ ＴＣＣＴＣＣＡＣＡＴＡＣＡＧ−３’　（Ｓｑ１９７０、ＨｉｎｄＩ１１部位に アンダーラインを引く）を用いたプラスミドｐＥＴ−８ｃ５２にのＰＣＲ増幅に より、最初に、Ｍｓｔｌｌ−ＨｉｎｄＩＩＴ制限フラグメント（図４、パネルＢ ）の中に、上記ペプチドＧ　］、　Ｏに相当している配列を含め、これによって 、ペプチドＧ１０を含んでいるＭｓｔｌＩ−Ｈｉｎｄ１１１制限フラグメントが 生じ、そしてこれの配列は、５’　−ＣＣＴＴＡＧＧＣＴＴＡＡＣＣＴＧＴＧＡ ＡＧＣＣＴＧＣＣＡＧＧＡＧＣＣＧＧＧＡＧＧＣＣＴＧＧＴＧＧＴＧＣＣＴＣＣ ＣＡＣＡＧＡＴＧＣＣＣＣＧＧＴＧＡＧＣＣＣＣＡＣＣＡＣＴＣＴＧＴＡＴＧＴ ＧＧＡＧＧＡＣＴＡＡＧＣＴＴ−３′である（このペプチドＧ１０をコートする 配列を太字で示す）。３個のＣ最末端アミノ酸を除き（図２参照）　、ＳＡＨを コートする遺伝子全体に相当しているＨｉｎｄｌＩＩ−ＭｓｔＩＩ制限フラグメ ントに上記フラグメントを連結することにより、ＳＡＨのｒｐｒｅｐｒｏＪエク スポート領域の直ぐ後に５ＡＨ−ペプチド型のキメラ蛋白質をコートするハイブ リッド遺伝子を含んでいるＨｉｎｄｌＩＩ制限フラグメントが生じる（図１、パ ネルＡ）。この制限フラグメントを、プラスミドｐＹＧ１０５のＨｉｎｄｌ１１ 部位に産生配向でクローン化し、これによって、発現プラスミドｐＹＧ１２１４ が生じる。 別の態様において、合成オリゴデオキシヌクレオチド、例えばオリゴデオキシヌ クレオチド５’　−ＴＴＡＧＧＣＣＴＣＴＧＴＧＡＣＣＴＴＧＣＣＣＣＴＧＡＡ ＧＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＴＡＣＴＣＴＧＣＣＣＣＣＣＴＡＡＧＣＴＴＡ−３’お よび５’　−ＧＡＴＣＴＡＡＧＣＴＴＡＧＧＧＧＧＧＣＡＧＡＧＴＡＧＧＡＧＧ ＡＧＧＧＧＣＴＴＣＡＧＧＧＧＣＡＡＧＧＴＣＡＣＡＧＡＧＧＣＣ−３’を用い て、ｖＷＦをＧＰｌｂに結合させるための部位を直接設計する。これらのオリゴ デオキシヌクレオチドを対にすることにより、ｖＷＦのＬｅｕ６９４からＰｒｏ ７０８残基が範囲を限定しているペプチドＤ５に相当しているＭｓｔｌｌ−Ｈ４ ｎｄＩＩＩフラグメント（図４、パネルＣ）を含んでいるＭｓｔＩＩ−Ｂｇｌｌ Ｉ制限フラグメントが生じる。３個のＣ最末端アミノ酸を除き（図２参照）　、 ＳＡＨをコートする遺伝子全体に相当しているＨｉｎｄＩＩＩ−ＭｓｔＩＩ制限 フラグメントに上記ＭｓｔＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを連結することに より、ＳＡＨのｒｐｒｅｐｒｏＪエクスポート領域の直ぐ後に５ＡＩ（−ペプチ ド型のキメラ蛋白質をコートするハイブリッド遺伝子を含んでいるＨｉｎｄＩ　 Ｉ　Ｉ制限フラグメントが生じる（図１、パネルＡ）。この制限フラグメントを 、プラスミドｐＹＧ１０５のＨｉｎｄＩ１１部位に産生配向でクローン化

【八こ れによって、発現プラスミドｐＹＧ１２０６が生じる。 ペプチドＧ１０と６５の間の部位特異的変異誘発、例えばコラーゲンおよび／ま たはヘパリンおよび／またはポトロセチンおよび／またはスルファチドおよび／ またはりストセチンに結合する部位に特異的な変異誘発により、プラスミドｐＥ Ｔ−８ｃ５２にの有効な変異体を削除する。 １つの例は、残基Ｃｙｓ５０９と１１ｅ６６２との間を部位特異的変異誘発によ って削除したプラスミドｐＭＭＢ９である。オリゴデオキシヌクレオチド５ｑ１ ９６９および５Ｑ２０２９を用いた上記プラスミドのＰＣＲ増幅により、Ｔｈｒ ４７０からＴｙｒ５０８およびＡｒｇ６６３からＶａ１７１３残基、特にｖＷＦ のペプチドＧ１０およびＤ５を含んでいるが特に残基Ｇ１ｕ５４２とＭｅｔ６２ ２の間に位置しているコラーゲン結合部位が欠失しているＭｓ　ｔ　Ｉ　ｌ−Ｈ ｌｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ制限フラグメントが生じる（図４、パネルＤ）［Ｒｏｔｈ　 Ｇ、Ｊ、他ｒＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２５（１９８６）８３５７−８３６１ １．３個のＣ最末端アミノ酸を除き（図２参照）　、ＳＡＨをコートする遺伝子 全体に相当しているＨｉｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ　−Ｍｓ　ｔ　Ｉ　Ｉ制限フラグメン トに上記フラグメントを連結することにより、ＳＡＨのｒｐｒｅｐｒｏＪエクス ポート領域の直ぐ後に５ＡＨ−ペプチド型のキメラ蛋白質をコートするハイブリ ッド遺伝子を含んでいるＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントが生じる（図１、パネ ルＡ）。この制限フラグメントを、プラスミドｐＹＧ１０５のＨｉｎｄＩ　Ｉ　 １部位に産生配向でクローン化し、これによって、発現プラスミドｐＹＧ１２２ ３が生じる。 別の態様において、部位特異的変異誘発とＰＣＲ増幅を一緒にした技術を用いる ことにより、スルファチドおよび／またはボトロセチンおよび／またはヘパリン および／またはコラーゲンに結合する部位が１個以上欠失しておりそして／また はＩＩＢ型病型炉状ＷＦに関連して現れることに関与している何らかの残基で置 換されている、図４のノくネルＡのＭｓｔｌ　ｌ−Ｈｌｎｄｌ　Ｉ　Ｉ制限フラ グメントの変異体を自由自在に生じさせることができる。 プラスミドｐＥＴ−８ｃ５２にの他の有効な変異体において、例えば部位特異的 変異誘発による変異を導入して、ヒトｖＷＦの４７１．４７４．５０９および６ ９５位に存在している１組のシスティンの全てまたは一部を置き換えるか或はサ プレスする。特定例は、一方では４７１および４７４位に存在しているシスティ ン、他方では４７１．４７４．５０９および６９５位に存在しているシスティン が、それぞれグリシン残基で置き換えられているところの、プラスミドｐ５Ｅお よびｐ７Ｅである。オリゴデオキシヌクレオチド５Ｑ２１４９　（５’　−ＣＣ ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＴＴＡＧＧＣＴＴＡＡＣＣＧＧＴＧＡＡＧＣＣＧＧＣ−３’ 、Ｍｓ　ｔ　Ｉ　Ｉ部位にアンダーラインを引く）および５ｑ２０２９を用いた 上記プラスミドのＰＣＲ増幅により、少なくとも４７１と４７４位のシスティン 残基がグリシン残基に変異している以外は天然ｖＷＦのＴｈｒ４７０からＶａ１ ７１３残基を含んでいるＭｓｔＩＩ−Ｈｉｎｄｌｌ！制限フラグメントを生じさ せることができる。３個のＣ最末端アミノ酸を除き（図２参照）、ＳＡＨをコー トする遺伝子全体に相当しているＨｉｎｄＩＩＩ−Ｍｓｔｌｌ制限フラグメント に上記フラグメントを連結することにより、ＳＡＨのｒｐｒｅｐｒｏＪエクスポ ート領域の直ぐ後に５ＡＨ−ペプチド型のキメラ蛋白質をコートするハイブリッ ド遺伝子を含んでいるＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントが生じる（図１、パネル Ａ）。これらの制限フラグメントを、プラスミドｐＹＧ１０．５のＨｉｎｄＩＩ Ｔ部位に産生配向でクローン化し、これによって、発現プラスミドｐＹＧ１２８ ３　（キメラ５ＡＨ−ｖＷＦ４７０　７１３、Ｃ４７１Ｇ。 Ｃ４７４Ｇ）およびｐＹＧ１２７９　（キメラ５ＡＨ−ｖＷＦ４７０−７１３、 Ｃ４７１Ｇ、Ｃ４７４Ｇ、０５０９Ｇ、０６９５Ｇ）が生じる。 他の特に有効な変異は、ｖＷＦ関連ＩＩＢ型病状に関与している少な（とも１つ の残基、例えば残基Ａｒｇ５４３、Ａｒｇ５４５、Ｔｒｐ５５０、Ｖａ　１５５ １、Ｖａ１５５３、Ｐｒｏ５７４またはＡｒｇ５７８などに対して影響を与える ものである（ＧＰｌｂに対してｖＷＦが示す固有親和力の向上）。インビトロに おける遺伝組換え技術を用いることでもまた、ｖＷＦの配列に１個以上の追加的 残基を自由自在に導入することができ、例えば位置Ａｓｐ５３９とＧＩｕ５４２ の間に余分のメチオニンを導入することができる。 Ｅ、７．　２．　内皮下に対するｖＷＦの結合に拮抗するフラグメント特定態様 において、例えばオリゴデオキシヌクレオチドＳｑ２２５８ＴＧＧＡＣＣＴＧＧ ＴＣ−３’　、Ｍｓ　ｔ　１１部位にアユ／グーラインを引く）および５ｑ２２ ５９　（５’　−ＧＡ、ＡＴＴＣＡＡＧＣＴＴＡＡＣＡＧＡＧＧＴＡＧＣＴＡＡ ＣＧＡＴＣＴＣＧＴＣＣＣ−３’　Ｈｉ　ｎｄ　Ｉ　Ｉ　１部位にアンダーライ ンを引く）を用いたプラスミドｐＥＴ−８ｃ５２にのＰＣＲ増幅［これは、天然 ｖＷＦのＣｙｓ５０９からＣｙｓ６９５残基をコートするＭｓｔｌＩ−Ｈｉｎｄ ｌｌＴ制限フラグメントを生じさせる］により、内皮上組織の成分、例えばコラ ーゲンにｖＷＦが結合する部位を作り出す。スルファチドおよび／またはボトロ セチンおよび／またはヘパリンおよび／またはコラーゲンそして／またはＧＰｌ ｂに対してｖＷＦが示す親和性（ｖＷＦ関連ＩＴ型病状）を修飾する一因となる 何らかの残基に対してｖＷＦが結合する部位間の何らかの所望組み合わせを含ん でいる、欠失分子変異体または修飾変異体も生じる。別の態様において、このコ ラーゲンに結合し害るドメインはまた、Ｐａｒｅｔｌ他［Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ ｍ、（１９８７）２６２＋１３８３５−１３８４１１が記述した、残基９１１と １１１４との間に存在しているＶＷＦフラグメント由来のものであってもよい。 ３個のＣ最末端アミノ酸を除き（図２参照）、ＳＡＨをコートする遺伝子全体に 相当しているＨｉｎｄＩｉｌ−Ｍｓｔｌｌ制限フラグメントに上記フラグメント を連結することにより、ＳＡＨのｒｐｒｅｐｒｏｊエクスポー！・領域の直ぐ後 に５ＡＨ−ペプチド型のキメラ蛋白質をコートするハイブリッド遺伝子を含んで いるＨｉｎｄｌｌｌ制限フラグメントが生じる（図１１パネルＡ）。これらの制 限フラグメントを、プラスミドｐＹＧ１０５のＨｉ　ｎｄＩＴ１部位に産生配向 でクローン化し、これによって、相当する発現プラスミド、例えばプラスミドｐ ＹＧ１２７７　（ＳＡＨ−ｖＷＦ５０９−６９５）が生じる。 Ｅ、７．３．　ＳＡＨとｖＷＦとの間のキメラの精製および分子特徴例えば実施 例Ｅ、７．　１．およびＥ、７．　２．に従う発現プラスミドを用いて形質転換 したＣＢ５２９３．９１株に相当している培養物上澄み液の中に存在しているキ メラの特徴付けを、最初の場合として、ＳＡＨ部分およびｖＷＦ部分に特異的な 抗体を用いて行う。図５から７の結果は、ＳＡＨとｖＷＦのフラグメントとの間 のキメラ蛋白質を酵母菌Ｋ。 ラクチスが分泌する能力を有しており、そしてこれらのキメラが免疫学的反応性 を示すことを表している。これらのキメラのいくっがを精製することもまた望ま しい可能性がある。次に、この培養物を遠心分離（１飢　０００ｇ、３０分間） にかけ、その上澄み液を０．２２ｍｍフィルター（Ｍｉ　］　ｌ　１ｐｏｒｅ） に通した後、分別閾値が３０ｋＤａの所にある膜を用いた限外濾過（Ａｍｉｃｏ ｎ）で濃縮した。この得られる濃した後、カラムを用いた精製を行う。例えば、 Ｂｌｕｅ−Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ　（ＩＢＦ）使用アフィニティークロマトグラフ ィーにより、プラスミドｐＹＧ１２０６で形質転換したＣＢ５２９３．９１株の 培養上澄み液に相当する濃縮物の精製を行う。イオン交換クロマトグラフィーに よる精製もまた用いられ得る。例えば、キメラ５ＡＨ−ｖＷＦ４７０−７１３の 場合、限外濾過後に得られる濃縮物をトリス−ＨＣｌ溶液（５０ｍＭ、ｐＨ８） に対して透析した後、同じ緩衝液内で平衡にしてカチオン交換カラム（５ｍＬ） （Ｓ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の上にその両分２０ｍＬを置 く。次に、このカラムをトリス−ＨＣｌ溶液（５０ｍＭ、ｐＨ８）で数回洗浄し た後、ＮａＣ１勾配（０がらＬＭ）により、そのキメラ蛋白質をそのカラムから 溶離させる。次に、このキメラ蛋白質を含んでいる画分をプールし、５０　ｍ　 Ｍのトリス−■）Ｃ１溶液（ｐ　Ｈ８）に対して透析した後、再びＳ　Ｆａｓｔ 　Ｆｌｏｗカラムの上に置く。このカラムの溶離を行った後、蛋白質を含んでい る両分をプールし、水に対して透析し１．凍結乾燥した後、例えば下記の特徴を 示す　酵母菌ＣＢ５２９３．９１が分泌する蛋白質の配列決定［５ＡＨ−ｖＷＦ ４７０−７０４　Ｃ４７１Ｇ、Ｃ４７４Ｇ］を行うことにより（Ａｐｐｌｉｅｄ 　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）、ＳＡＨで期待されるＮ末端配列（Ａｓ　ｐ−Ａ　］　 ａ　−Ｈｉ　ｓ、　、　、　）が得られ、このことは、ＳＡＨのｒｐ　ｒｏＪ領 域の残基Ａｒｇ−Ａｒｇの二重項のＣ末端に接して。 このキメラの妥当な成熟が生じていることを示している。５ＡＩ−ＩとＶＷＦと の間のキメラ蛋白質が示す必須単量体特徴もまた、ＴＳＫ３０００カラム［東洋 曹達株式会社（Ｔｏｙｏ　５ｏｄａ、Ｃｏｍｐａｎｙ）、０．２ＭのＮ　ａ　２ 　Ｓ　Ｏ４が入っているカコジル酸塩溶液（ｐＨ７）で平衡にした］を用いた時 得られる溶離プロファイルによって立証され、例えばキメラ［５ＡＨ−ｖＷＦ４ ７０−７０４　Ｃ４７１Ｇ、Ｃ４７４Ｇ］は、この条件下で、見掛は分子量が９ ５ｋＤａの蛋白質であるような挙動を示し、このことは、それが単量体特徴を有 していることを示している。 実施例８　ウロキナーゼから誘導したキメラＥ、８．　１．　構築物 例えばＰｂａｒｍａｃｉａが市販しているＲＴ−ＰＣＲキット・を用い、特定ヒ ト癌細胞の相当するメンセンジャーＲＮＡから、ウロキナーゼのアミノ末端フラ グメントに相当しているフラグメント（ＡＴＦ　：　ＥＧＦ様ドメイン＋クリン グル（ｋｒｉｎｇｌｅ）　ドメイン）を入手することができる。ヒトウロキナー ゼのＡＴＦを含んでいるＭｓｔｌｌ−Ｈｉｎｄｌｌｌ制限フラグメ制限フラグメ ントナ。このＭｓｔＩＩ−ＨｉｎｄｌＩＩ７ラグメントにプラスミドｐＹＧ４０ ４のＨｉｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ　−Ｍｓ　ｔＩＩフラグメントを連結させることによ り、ＳＡＨ分子が遺伝的にＡＴＦにカプリングしているキメラ蛋白質をコートす るプラスミドｐＹＧ１３４１のＨｉｎｄｌｌｌフラグメントを生じさせることが できる（ＳＡＨ−ＵＫ１→１３５）。同様に、プラスミドｐＹＧ１３４０は、ヒ トウロキナーゼの最初の４６残基の直ぐ前にＳＡＨを含んでいるキメラをコート するＨｉｎｄｌｌｌフラグメントを含んでいる（ＳＡＨ−ＵＫＩ→４６、図８参 照）。このプラスミドｐＹＧ１３４０　（ＳＡＨ−ＵＫＩ→４６）のＨｉｎｄＴ ＩＩ制限フラグメントをプラスミドｐＹＧ１０５（ＬＡＣ４）およびｐＹＧ１０ ６　（ＰＧＫ）のＨｉｎｄｌ１１部位に産生配向でクローニングすることにより 、それぞれ発現プラスミドｐＹＧ１３４３およびｐＹＧ１３４２が生じる。同様 に、このプラスミドｐＹＧ１３４１　（ＳＡ、Ｈ−ＵＫＩ→１３５）のＨ４ｎｄ Ｉ　Ｉ　Ｉ制限フラグメントをプラスミドｐＹＧ１０５　（ＬＡＣ４）およびｐ ＹＧ１０６　（ＰＧＫ）のＨｉｎｄｌ１１部位に産生配向でクローニングするこ とにより、それぞれ発現プラスミドｐＹＧ１３４５およびｐＹＧ１３４４が生じ る。 Ｅ　８２．　ハイブリッドの分泌 Ｇ４１８を補った豊富培地上で選択を行った後、キメラ蛋白質５ＡＨ−ＵＫを成 熟形態で分泌する能力を有しているか否かに関して、これらの組換えクローンを 試験する。実施例Ｅ、９．　１．に従う発現プラスミドで形質転換した、Ｋ　ラ クチスＣＢ５２９３．９１株に相当しているいくつかのクローンを、２８℃の選 択完全液状培地内でインキュベートする。次に、この細胞上澄み液を、８．５％ アクリルアミドゲル使用電気泳動にかけた後、クーマシーブルーを用いたゲル染 色により直接か、或はヒトアルブミンに特異的か或はヒトウロキナーゼに特異的 なラビットポリクローナル血清を一次抗体として用いた免疫プロッティングにか けた後、それらの試験を行う。図９の結果は、ハイブリッド蛋白質である５ＡＨ −ＵＫＩ→４６および５ＡＨ−ＵＫＩ→１３５を酵母菌クルイベロミセスが特に 良好に分泌することを示している。 Ｅ、８．３．　３ＡＨとウロキナーゼとの間のキメラの精製実施例Ｅ、８．　１ ．に従う発現プラスミドで形質転換したＣＢ５２９３．９１株の培養物を遠心分 離にかけた後、この細胞上澄み液を、０゜２２ｍｍのフィルター（Ｍｉ　１１１ ｐｏｒｅ）に通し、そして次に、分別閾値が３０ｋＤａの所にある膜を用いた限 外濾過（Ａｍｉｃｏｎ）で濃縮した。この得られる濃縮物を、次に、１Ｍのトリ ス−ＨＣｌストック溶液（ｐＨ７）で始めて５０ｍＭのトリス−）（ＣＩに調整 した後、同じ緩衝液内で平衡にしたアニオン交換カラム（３ｍＬ）（Ｄ−Ｚｅｐ ｈｙｒ、５ｅｐｒａｃｏｒ）の上にその画分２０ｍＬを置く。次に、ＮａＣ１勾 配（０からＩＭ）により、そのキメラ蛋白質（ＳＡＨ−ＵＫＩ→４６または５Ａ Ｈ−ＵＫＩ→１３５）をそのカラムから溶離させる。次に、このキメラ蛋白質を 含んでいる両分をプールし、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ溶液（ｐＨ６）に対して 透析した後、再び同じ緩衝液で平衡にしたＤ−Ｚｅｐｈｙｒカラムの上に置く。 このカラムの溶離を行った後、蛋白質を含んでいる画分をプールし、水に対して 透析し、凍結乾燥した後、それらが示す生物活性の特徴付け、特に細胞のレセプ タからウロキナーゼ７−５０３３６８　（１２） ナーゼを追い出す能力に関する特徴付けを行う。 実施例９：Ｇ−Ｃ３Ｆから誘導したキメラＥ、９．　１．　構築物 Ｅ、９．　１．　１．　ＳＡＨのＣ末端におけるカプリング例えば下記の方策に 従い、ヒトＧ−Ｃ３Ｆの成熟形態を含んでいるＭｓｔＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限 フラグメントを生じさせる。最初に、鋳型として働くプラスミドＢＢＧ１３に対 するプライマーとしてオリゴデオキシヌクレオチド５ｑ２２９１　（５’　−Ｃ ＡＡＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣエエＣＡＧＧＧＣＴＧＣＧＣＡＡＧＧＴＧＧＣＧＴＡ Ｇ−３，’　、Ｈｉ　ｎｄＩＩＬ部位にアンダーラインを引く）および５ｑ２２ ９２　（５’　−ＣＧＧＧＧＴＡＣＣＴＴＡＧＧＣＴＴＡＡＣＣＣＣＣＣＴＧＧ ＧＣＣＣＴＧＣＣＡＧＣ−３’　、Ｋｐｎ　１部位にアンダーラインを引く）を 用いた酵素的ＰＣＲ増幅技術により、Ｋｐｎｌ−Ｈｉｎｄｌ　ＩＩ制限フラグメ ントを入手する。プラスミドＢＢＧ１３は、Ｂｒ１ｔｉｓｈ　Ｂｉｏ−ｔｅｃｈ ｎｏｌｏｇｙ　Ｌｉｍ１ｔｅｄ、０ｘｆｏｒｄ、英国から入手した、Ｂ形態の成 熟ヒトＧ−Ｃ３Ｆ　（１７４個のアミノ酸）をコートする遺伝子を含んでいる。 次に、約５５０個のヌクレオチドから成る酵素増幅産物を、制限酵素ＫｐｎＩお よびＨｉｎｄＩＩＩで消化させた後、同じ酵素で切断したベクターｐＵｃ１９に クローン化し、これによって組換え型プラスミドｐＹＧ１２５５が生じる。この プラスミドは、ＳＡＨの直ぐ下流にＧ−Ｃ３Ｆを融合させることを可能にするＭ ｓｔＩＩ−ＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ制限フラグメントの給源であり、これのヌクレオ チド配列を図１０に示す。 ＳＡＨ部分とＧ−Ｃ３Ｆとの間にペプチドリンカ−を挿入して、例えば形質導入 部分の機能的提示を良好にするのも望ましい可能性がある。 例えば、オリゴデオキシヌクレオチド５Ｑ２７４２　（５’　−ＴＴＡＧＧＣＴ ＴＡＧＧＴＧＧＴＧＧＣＧＧＴＡＣＣＣＣＣＣＴＧＧＧＣＣ−３’、この特別な リンカ−のグリシン残基をコートするコドンにアンダーラインを引く）および５ Ｑ２７４１　（５’　−ＣＡＧＧＧＧＧＧＴＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＣＣＴＡＡＧ ＣＣ−３”）［これらは対になってＭｓ　ｔ　Ｉ　１−ＡｐａＩフラグメントを 生じる］を用い、プラスミドｐＹＧ１２５５のＭｓ　ｔ　Ｔ　Ｉ−Ａｐａ　Ｉフ ラグメントの置換を行うことによって、Ｍｓｔｌｌ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグ メントを生じさせる。従って、このようにして生じさせたプラスミドはＭｓｔＩ Ｉ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントを含んでおり９．この配列は、Ｍｓ　ｔ　 Ｉ　Ｉ−Ａｐａ　Ｉフラグメントを除き図１０のそれと同じである。 プラスミドｐＹＧ１２５５のＭｓｔｌｌ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントにプラス ミドｐＹＧ４０４のＨｉｎｄｌＩＩ−ＭｓｔＩＩフラグメントを連結させること により、キメラ蛋白質をコートするプラスミドｐＹＧ１２５９のＨｉｎｄＩ　Ｉ 　Ｉフラグメントを生じさせることが可能であり、ここでは、翻訳段階における 遺伝的カプリングにより、そのＳＡＨ分子のＣ末端にそのＢ形態の成熟Ｇ−Ｃ３ Ｆが位置する（ＳＡＨ−Ｇ。 Ｃ３Ｆ）。 翻訳段階における遺伝的カプリングにより該ＳＡＨ分子のＣ末端にそのＢ形態の 成熟Ｇ−Ｃ３Ｆが位置するキメラ蛋白質と共に特定のペプチドリンカ−をコート するところの、Ｍｓ　ｔ　Ｉ　Ｉ−Ａｐａ　Ｉフラグメント以外は同じＨｉｎｄ ＩＩＩ制限フラグメントもまた容易に生じさせ得る。 例えば、このリンカ−は、プラスミドｐＹＧ１３３６のＨｉｎｄＩＩＩフラグメ ントの中に４個のグリシン残基を含んでいる（キメラ５ＡＨ−ｃｌｙ４　ｃ、Ｃ ５Ｆ）。 プラスミドｐＹＧ１２５９のＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントを、発現プラスミ ドｐＹＧ１０５のＨｉｎｄＩＩＩ制限部位に産生配向でクローン化し、これによ って、発現プラスミドｐＹＧ１２６６が生じる（ＳＡＨ−Ｇ、Ｃ５Ｆ）。別の例 において、プラスミドｐＹＧ１２５９のＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントを、プ ラスミドｐＹＧ１０６のＨｉｎｄＩＩＩ制限部位に産生配向でクローン化するこ とにより、プラスミドｐＹＧ１２６７が生じる。プラスミドｐＹＧ１２６６とｐ ＹＧ１２６７は、Ｋ、ラクチスのＬＡＣ４プロモーター（プラスミドｐＹＧ１２ ６６）またはＳ、セレビシェのＰＧＫプロモーター（プラスミドｐＹＧ１２６７ ）をコートするＳａ　Ｉ　ｌ−Ｈｌｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ制限フラグメントを除き互 いに同質の遺伝子である。 別の例において、プラスミドｐＹＧ１３３６（キメラＳＡＨＧｌｙａ−Ｇ、Ｃ５ Ｆ）のＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントを、プラスミドｐｙＧ１０５　（ＬＡＣ ４）およびｐＹ０１０６　（ＰＧＫ）のＨｉｎｄｌｌＩ部位に産生配向でクロー ン化することにより、それぞれ発現プラスミドｐＹＧ１３５１およびｐＹＧ１３ ５２が生じる。 Ｅ、９．　１．　２．　ＳＡＨのＮ末端におけるカプリング特定態様において、 部位特異的変異誘発とＰＣＲ増幅を一緒にした技術を用いることで、シグナルペ プチド（例えばＳＡＨのｐｒｅｐｒｏ領域）と、Ｇ−Ｃ３Ｆ活性を示す遺伝子を 含んでいる配列と、成熟形態のＳＡＨまたはそれの分子変異体の１つとの間の翻 訳カプリングの結果として生じる、キメラ蛋白質をコートするハイブリッド遺伝 子を構築することができる（パネルＢのキメラ、図１参照）。これらのハイブリ ッド遺伝子は、好適には、翻訳開始ＡＴＧの５′および翻訳停止コドンの３゛で 、Ｈｉｎｄｌ　１１制限部位に境を接している。例えば、オリゴデオキシヌクレ オチド５ｑ２３６９　（５’　−ＧＴＴＣＴＡＣＧＣＣＡＣＣＴＴＧＣＧＣＡＧ ＣＣＣＧＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＴＧＡＴＧＣＡＣＡＣＡＡＧＡＧＴＧＡＧＧＴＴ ＧＣＴＣＡＴＣＧＧ−３’　、アンダーラインを引いた残基（任意）は、この特 別なキメラにおいて、４個のグリシン残基を含んでいるペプチドリンカ−に相当 している）を用いた部位特異的変異誘発により、プラスミドＢＢＧ１３が有する 成熟形態のヒトＧ−ＣＳＦを成熟形態の５ＡＴ（の直ぐ上流に翻訳段階で位置さ せることができ、これによって、中間プラスミドＡが生じる。同様に、オリボデ オキＡＡＴＡＡＧＣＣＧＡＧＣＴ−３’　（非コーディングストランド）、成熟 形態のヒトＧ−Ｃ３Ｆが有する最初のＮ末端残基をコートするヌクレオチドに相 補的なヌクレオチドにアンダーラインを引く］を用いた部位特異的変異誘発によ り、成熟形態のヒトＧ−Ｃ８Ｆの直ぐ上流にＳＡＨのｐｒｅｐｒｏ領域を翻訳読 み段階でカプリングさせることができ、これによって、中間プラスミドＢが生じ る。次に、このプラスミドＢのＨｉｎｄ　Ｉ　Ｉ　ｌ−３ｓ　ｔ　Ｉフラグメン ト（ＳＡＨの結合用ｐｒｅｐｒｏ領域＋成熟Ｇ−Ｃ３ＦのＮ末端フラグメント） とプラスミドＡの５ＳｔＩ−ＨｉｎｄｌＩＩ−フラグメント［結合用成熟Ｇ−Ｃ ３Ｆ−（グリツジ）１４−成熟ＳＡＨ］を結合させることによって、ペプチド− ３Ａ、Ｈ型のキメラ蛋白質をコートするＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉフラグメントが生じ る（図１、パネルＢ参照）。プラスミドｐＹＧ１３０１は、ＳＡＨのｐｒｅｐｒ 。 領域の直ぐ下流に融合しているキメラＧ、Ｃ３Ｆ　Ｇｌｙｉ　ＳＡＨをコートす る上記特異的Ｈｉｎｄｌｌｌ制限フラグメントを含んでいる（図１１）。このＨ ｉｎｄｌＩＩ制限フラグメントをプラスミドｐＹＧ１０５　（ＬＡＣ４）および ｐＹＧ１０６　（ＰＧＫ）のＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ部位に産生配向でクローン化す ることにより、それぞれ発現プラスミドｐＹＧ１３０２およびｐＹＧ１３０３が 生じる。 Ｅ、９．　２．　ハイブリッドの分泌 ６４１８を補った豊富培地上で選択した後、組換えクローンを、ＳＡＨとＧ−Ｃ ＳＦとの間のキメラ蛋白質の成熟形態を分泌する能力を有しているか否かに関し て試験した。プラスミドｐＹＧ１２６６またはｐＹＧ１２６７　（ＳＡＨ−Ｇ、 Ｃ３Ｆ）　、ｐＹＧ１３０２またはｐＹＧ１３０３　（Ｇ、Ｃ３Ｆ−ＧＩｙ４− ３ＡＨ）或はまたｐＹＧ１３５１またはｐＹＧ１３５２　（ＳＡＨＧＩ　ｙ＜　 Ｇ、Ｃ３Ｆ）で形質転換した株Ｋ。 ラクチスＣＢ５２９３．９１に相当しているいくつかのクローンを、２８℃の選 択完全液状培地内でインキュベートする。次に、これらの細胞上澄み液を、８． ５％アクリルアミドゲル使用電気泳動にかけた後、クーマシーブルーを用いたゲ ル染色によって直接的にか、或はヒトＧ−Ｃ３Ｆに特異的なラビッＩ・ポリクロ ーナル抗体またはヒトアルブミンに特異的なラビットポリクローナル血清を一次 抗体として用いた免疫プロッティングを行った後、それらの試験を行った。図１ ２の結果は、ヒトアルブミン（パネルＣ）およびヒトＧ−Ｃ３Ｆ　（パネルＢ） 両方に特異的な抗体がそのハイブリッド蛋白質５ＡＨ−Ｇ、Ｃ３Ｆを認識するこ とを示している。図１３の結果は、酵母菌タルイベロミセスがキメラ５ＡＨＧＩ ７４　Ｇ、Ｃ３Ｆ　（レーン３）を特に良好に分泌することを示しいるが、これ は恐らくは、このキメラが分泌経路内を通っている間これらの２つの部分が独立 して折り畳まれるにはそのＳＡＨ部分とＧ−Ｃ３Ｆ部分との間にペプチドリンカ −が存在している方が好ましいことによるものであろう。更に、この酵母菌クル イベロミセスはまたＮ末端融合物（Ｇ、Ｃ３Ｆ−ＧＩ　Ｖ４　５ＡＨ）も分泌す る（図１３、レーン１）。 Ｅ、９．３．　ＳＡＨとＧ−Ｃ３Ｆとの間のキメラの精製および分子特徴 例えば実施例Ｅ　９１．に従う発現プラスミドを用いて形質転換したＣＢ５２９ ３．９１株の培養物を遠心分離にかけた後、その培養上澄み液を０．２２ｍｍフ ィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に通し、そして次に、分別閾値が３０ｋＤａの 所にある膜を用いた限外濾過（Ａｍｉｃｏｎ）で濃縮した。この得られる濃縮物 を、次に、１Ｍのトリス−ＨＣｌストック溶液（ｐ　Ｈ６）を用い５０ｍ、Ｍの トリス−ＨＣｌに調整した後、同じ緩衝液内で平衡にしたイオン交換カラム（５ ｍＬ）（Ｑ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の上にその画分２０ｍ Ｌを置く。 次に、ＮａＣｌ勾配（０からＬＭ）により、そのキメラ蛋白質をそのカラムから 溶離させる。次に、このキメラ蛋白質を含んでいる画分をプールし、５０ｍＭの トリス−ＨＣｌ溶液（ｐＨ６）に対して透析した後、再び同じ緩衝液で平衡にし たＱ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗカラム（１ｍＬ）の上に置く。このカラムの溶離を行 った後、蛋白質を含んでいる画分をプールし、水に対して透析し、凍結乾燥した 後、例えば下記の特徴を示す・酵母菌ＣＢ５２９３．９１が分泌スル蛋白ｆｆｆ ｓＡＨ−Ｇ、Ｃ３Ｆの配列決定を行うことにより（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙ ｓｔｅｍ）。 ＳＡＨで期待されるＮ末端配列（Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｈｉｓ、、、）が得られ、こ のことは、ＳＡＨのｒｐｒｏＪ領域の残基Ａｒｇ−Ａｒｇの二重項のＣ末端に接 して、このキメラの妥当な成熟が生じていることを示している（図２）。 実施例１０：免疫グロブリンから誘導したキメラＥ、１０．　１．　構築物 リンカ−ペプチド［Ｂｉｒｄ他、ｒＳｃｉｅｎｃｅ　（１９８８）２４２：４２ ３：Ｈｕｓｔｏｎ他（１９８８）ｒＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、８ ５：５８７９］により免疫グロブリン（Ｉｇ）の重鎖と軽鎖を互いに連結させた 可変フラグメントをコートするＦｖ’　フラグメントを、遺伝工学技術で構築す ることができる。図式的には、与えられたｒｇが有する重鎮と軽鎖の可変領域（ 約１２０個の残基）を、例えばＰｈａｒｍａｃｉａが市販しているＲＴ−ＰＣＲ キット（マウス５ｃＦｖモジユール）を用いて、相当するハイブリドーマのメツ センジャーＲＮＡからクローン化する。第二段階で、合成した連結用ペプチド、 例えばリンカ−（ＧＧＧＧＳ）−ｓを用いた遺伝工学により、これらの可変領域 を遺伝的にカプリングさせる。マウスのハイブリドーマが分泌する免疫グロブリ ンのＦｖ’　フラグメントを含んでいるＭｓｔＩＩ−ＨｉｎｄｌｌＩ制限フラグ メ制限フラグメントポす。このＭｓｔｌｌ−Ｈ４ｎｄｌｌｌフラグメントにプラ スミドｐＹＧ４０４のＨｉｎｄｌｌｌ−Ｍｓｉｒフラグメントを連結させること により、プラスミドｐＹＧ１３８２のＨｊｎｄｌＩＩフラグメントを生じさせる ことが可能であり、これは、図１４のＦｖ’　フラグメントにＳＡＨ分子が遺伝 的にカプリングしているキメラ蛋白質（キメラ５ＡＨ−Ｆｖ’　）をコートする 。プラスミドｐＹＧ１３８２のＨｉｎｄｌｌＩ制限フラグメントを、プラスミド ｐＹＧ１０５　（ＬＡＣ４）およびｐＹＧ１０６　（ＰＧＫ）のＨｉｎｄｌ１１ 部位に産生配向でクローン化することにより、それぞれ発現プラスミドｐＹＧ１ ３８３およびｐＹＧ１３８４が生じる。 Ｅ、１０．　２．　ハイブリッドの分泌Ｇ４１８を補った豊富培地上で選択した 後、組換えクローンを、キメラ蛋白質５ＡＨ−Ｆｖ’　の成熟形態を分泌する能 力を有しているか否かに関して試験した。プラスミドｐＹＧ１３８３またはｐＹ Ｇ１３８４（ＳＡＨ−Ｆｖ’　）で形質転換した株に、ラクチスＣＢ５２９３． ９１に相当しているいくつかのクローンを、２８℃の選択完全液状培地内でイン キュベートする。次に、これらの細胞上澄み液を、８．５％アクリルアミドゲル 使用電気泳動にかけた後、クーマシーブルーを用いたゲル染色によって直接的に か、或はヒトアルブミンに特異的なラビ・ントポリクローナル血清を一次抗体と して用いた免疫プロッティングを行った後、それらの試験を行うか、或はマウス 由来の免疫グロブリンに特異的なビオチニル化抗体と一緒に直接培養する。図１ ５の結果は、その７１イブ１月ソド蛋白質５ＡＨ−Ｆｖ’　がヒトアルブミンに 特異的な抗体によって認識され（パネルＣ）そしてマウス免疫グロブリンに対し て免疫学的反応性を示すビオチニル化ヤギ抗体と反応する（パネルＢ）ことを示 している。 実施例１１　キメラが示す生物学的活性Ｅ、１１．　１．　インビトロにおける 生物学的活性Ｅ、１１．　１．　１．　ＳＡＨとｖＷＦとの間のキメラＰｒ１ｏ ｒ他［Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　（１９９２）１０：６６］が記述した方 法に従って、パラホルムアルデヒドで固定したヒト血小板凝集の用量依存阻害を 測定することによって、これらの産物が示ＨｏｒｓｈａｍＳＰＡＳＵＳＡ）内で 上記測定を実施するが、これは、ｖＷＦの存在下３７℃で撹拌しながら、ポトロ セチン（８，２ｍｇ／ｍＬ）と種々の希釈率（濃度）の試験産物が示す光学透過 率の経時的変動を記録するものである。各測定において、パラホルムアルデヒド （０゜５％）で安定化した後、［ＮａＣ１（１３７ｍＭ）；ＭｇＣ１ｔ（１ｍＭ ）；ＮａＨ２ＰＯ４（０，３６ｍＭ）；ＮａＨＣＯｓ　（１０ｍＭ）；ＫＣｌ　 （２，７ｍＭ）；グルコース（５，６ｍＭ）；　ＳＡＨ（３，５ｍｇ／ｍＬ）； ＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７，３５）］の中に再懸濁させたヒト血小板 の懸濁液の４００ｍＬ　（８ｘ　１０’（ｔｉの血小板）を、該血小板凝集計に 備わっている筒状タンク（８，７５ｘ　５０ｍｍＳＷｅ１１ｃｏｍ　Ｄｉｓｔｒ ｉｗｅｌｌ、１５９　ｒｕｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌｅ、パリ）の中で４分間３７℃ で前インキュベートした後、非発熱性調剤用賦形剤［マンニトール（５０ｇ／Ｌ ）：クエン酸（１９２ｍｇ／Ｌ）、Ｌ−リジン−塩酸塩（１８２，６ｍｇ／Ｌ） ；ＮａＣ１（８８ｍｇ／Ｌ）：ＮａＯＨ（ＬＭ）を添加することによってｐＨを ３．５に調整］の中で試験産物を種々の希釈率で希釈した溶液またはこの調剤用 賦形剤単独（コントロールアッセイ）を３０ｍＬ補充する。次に、その得られる 懸濁液を３７℃で１分間インキュベートした後、ヒトｖＦＷ［Ａｍｅｒｉｃａｎ 　Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ、ｔＪｓＡ　、ホルム アルデヒド（２ｘｌＯ″′個の血小板／　ｍ　Ｌ　）で固定した血小板と、ｖＦ Ｗを０から１００％含んでいるヒト血漿とりストセチン（１０ｍｇ／ｍＬ）を用 いたＰＡＰ−４（Ｐｌａｔｅｌｅｔ　Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｆｉｌｅ ｒ（商標））の使用に関する推奨に従って測定したフォンビルプラント活性１１ ％、３６−４５頁参照：ｖＷ　Ｐｒｏｇｒａｍ（商標）］の１１２．５ｍを加え 、３７℃で１分間インキュベートした後、１２．５ｍＬのポトロセチン溶液［Ｓ ｕｇｉｍｏｔｏ他、Ｂｉ　ｏｃｈｅｍｉ　ｓ　ｔ　ｒｙ　（１９９１）２６６　 ：１８１７２が記述した操作に従って、ボトロブス・ジャララカ（Ｂｏｔｈｒｏ ｐｓ　ｊａｒａｒａｃａ）の凍結乾燥毒液（３ｉ　ｇｍａ）から精製］を添加す る。次に、そのタンクの中に入れた磁気棒（Ｗｅ　Ｉ　ｌ　ｃ、ｏｍｅ　Ｄｉｓ ｔｒｉｗｅｌｌ）を用いこの血小板凝集計が与える１、１１００ｒｐの磁気撹拌 で撹拌しながら２分間、その透過率の読みを時間の関数として記録する。従って 、経時的光学透過率の平均変動（各希釈毎にｎ３５）は、この試験産物が種々の 濃度で存在しているか或は存在していない場合の、ｖＷＦとポトロセチンが存在 していることが原因となる血小板凝集の尺度である。次に、このような記録から 、その産物の各濃度によって生じる血小板凝集の阻害％を決定し、そしてｌｏｇ −１ｏｇ目盛りの中に、その産物希釈率の逆数の関数として、その阻害％を与え る直線をプロットする。次に、ＩＣ５０（即ち、この凝集の５０％阻害をもたら す産物濃度）を上記直線から決定する。図６の表は、本発明のＳＡＨ−ｖ　Ｗ　 Ｆキメラのいくつかが示すＩＣ５０値を比較したものであり、これらのいくつか は、Ｐｒ１ｏｒ他［Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）１０・６６］が 記述しそして標準値としてそのアッセイの中に含めている産物ＲＧ１２９８６よ りも良好な、血小板凝集の拮抗薬であることを示している。ブタ血漿のｖＷＦ　 （Ｓ　ｉ　ｇｍａ）存在下で同じヒト血小板凝集阻害試験を行うことにより、更 に、本発明のハイブリッドのいくつか、特にいくつかのＩＩＢ型変移体が、ボト ロセチン型補助因子の存在なしで血小板凝集の非常に良好な拮抗薬であることを 示すことが可能である。また、Ｗａｒｅ他［Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ。 Ｓｃ　ｉ、（１９９１）８８　：　２９４６］が最初に記述した操作に従い、新 鮮な血小板存在下（１０ｓ個の血小板／ｍＬ）２２℃で３０分間インキュベート すると、血小板ＧＰＩｂ［Ｈａｎｄａ　Ｍ、他（１９８６）、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃ ｈｅｍ、２６１：１２５７９］にｖＷＦが結合するのを競合的に阻害する阻害剤 であるモノクローナル抗体＋２８１−ＬＪ−ＩＢｌ　（１０ｍｇ／ｒ＋’＋Ｌ） が追い出されることにより、これらの特定キメラが示すポトロセチン非依存拮抗 作用が実証され得る。 Ｅ、１１．　１．　２．　ＳＡＨとＧ−Ｃ３Ｆとの間のキメラ本質的にＴｓｕｃ ｈｉｙａ他［Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　Ｉ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（１９８６）８３　７ ６３３］が記述した操作に従い、トリチウム化したチミジンの取り込みを測定す ることにより、その精製したキメラがＩＬ３依存マウス系ＮＦＳ６０をインビト ロ増殖させる能力を有するか否かを試験する。各キメラにおいて、１ゾーン内の ３地点試験（産物の３種希釈率）において３回から６回測定を実施する、即ち活 性を示す産物の量と標識チミジン（Ａｍｅ　ｒ　ｓ　ｈ　ａｍ）の取り込みとの 間の関係は直線関係にある。哺乳動物細胞内で発現する組換え型ヒトＧ−Ｃ３Ｆ から成る参照産物が示す活性もまた、各ミクロタイタープレートの中に計画的に 組み入れる。図１７の結果は、酵母菌クルイベロミセスが分泌しそして実施例Ｅ 、９．　３．に従って精製したキメラ５ＡＨ−Ｇ、Ｃ３Ｆ　（ｐＹＧ１２６６） はＮＦＳ６０系が細胞増殖するためのシグナルをインビトロで形質導入する能力 を有していることを示している。この特別の場合において、このキメラが示す特 異的活性（ｃｐｍ１モル濃度）は、参照Ｇ−Ｃ３Ｆ　（カプリングしていない） のそれよりも約７倍低い。 Ｅ、１１．　２．　インビボにおける生物学的活性ラット（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄ ａｗｌ　ｅｙ／ＣＤ、２５０−３００ｇ−８−９週）に皮下注射した後、ＳＡＨ ／Ｇ−Ｃ８Ｆキメラがインビボで顆粒球形成に対して示す刺激活性を試験し、モ して哺乳動物細胞を用いて発現させた参照Ｇ−Ｃ８Ｆのそれと比較する。７匹の 動物がら成る割合で試験する各産物を、連続して７日間（ＤＩ−Ｄ７）１００ｍ Ｌの割合で背肩甲領域に皮下注射する。日Ｄ−６、Ｄ２（２回目の注射をする前 ）　、Ｄ５　（５回目の注射を行う前）およびＤ８に５００ｍＬの血液を採取し 、そして血球算定を実施する。この試験においてキメラ５ＡＨ−Ｇ、Ｃ３Ｆ　（ ｐＹＧ１２６６）が示す特異的活性（好中球形成（ｎｅｕｔｒｏｐｏｉｅｓｉｓ ）単位／注射モル）は参照Ｇ−Ｃ３Ｆのそれと同じである（図１８）。この特異 的キメラはインビトロで参照Ｇ−Ｃ３Ｆのそれよりも７倍低い特異的活性を示し ていたことから（図１７）、これは従って、ＳＡＨ上にＧ−Ｃ３Ｆを遺伝的にカ プリングさせるとそれの薬物動態学特性が好適に修飾されることを示している。 配列表 （２）配列同定番号１に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ・１８５９個の塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：２本鎖 （Ｄ）トポロジー二線形 （ｉ　ｉ）分子型二ｃＤＮＡ （ｊｉｉ）仮定・なし くｉ　ｉ　ｉ）アンチセンス：なし くｉｘ）性質。 （Ａ、）名称／ＩＩ：ＣＤ５ （Ｂ）位置：２６．、．１８５５ （Ｃ）他の情報・／産物＝　ｒＳＡＨ−ペプチド型キメラ」（ｉｘ）性質： （Ａ）名称／鍵、混ざり合った性質（ｍｉｓｃ　ｆｅａｔｕｒｅ）（Ｂ）位置： １８４２．、．１８４８ （Ｃ）他の情報：／標準芯＝ｒＭｓｔ　１１部位」（２）配列同定番号２に関す る情報： （１）配列特徴。 （Ａ）長さニア５０個の塩基対 （Ｂ）種類、核酸 （Ｃ）鎮・２本鎖 （Ｄ）トポロジー：線形 （ｉ　ｉ）分子型：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）仮定・なし くｉ　ｉ　ｉ）アンチセンス：なし くｉｘ）性質・ （Ａ）名称／鍵：ＣＤ５ （Ｂ）位置：３．、．７４６ （Ｃ）　他ノ［ｊ　：　／産物＝［キメラ５ＡＨ−ｖＷＦ４７０のＣ末端（Ｃ− ｔｅｒ）フラグメント」 （２）配列同定番号３に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ＝４２３個の塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖　２本鎖 （Ｄ）トポロジー、線形 （ｉｉ）分子型：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）仮定：なし く１ｉｉ）アンチセンス、なし くｉｘ）性質： （Ａ）名称／Ｉ！：ＣＤ５ （Ｂ）位置：３．　、　、　４１９ （Ｃ）他の情報：／産物−［キメラ５ＡＨ−ＵＫＩ−１３５のＣ末端フラグメン ト」 （２）配列同定番号４に関する情報： （１）配列特徴： （Ａ）長さ１５４１個の塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖：２本鎖 （Ｄ）トポロジー、線形 （ｉ　ｉ）分子型：　ｃＤＮＡ （ｉ　ｉ　ｉ）仮定：なし くｊｉｉ）アンチセンス：なし くｉｘ）性Ｗ： （Ａ）名称／鍵：　ＣＤ５ （Ｂ）位置＋３．、．５３６ （Ｃ）他の情報：／産物＝　ｒキメ５ＳＡＨ−Ｇ、Ｃ８ＦのＣ末ｍ７ラグメント 」 （２）配列同定番号５に関する情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ：　２４５５個の塩基対 （Ｂ）種類、核酸 （Ｃ）鎖：２本鎖 （Ｄ）トポロジー・線形 （ｉ　ｉ）分子型：ｃＤＮＡ （ｉ　ｉ　ｉ）仮定：なし くｔｉｔ）アンチセンス：なし くｉｘ）性質： （Ａ）名称／鍵：　ＣＤ５ （Ｂ）位置：　２６．、．２３８９ （Ｃ）他の情報：／産物＝　ｒＳＡＨのｐｒｅｐｒｏ領域の下流にあるキメラＧ 、Ｃ３Ｆ−Ｇｌ　ｙ４５ＡＨＪ （ｉｘ）性質： （Ａ）名称／鍵：ｍ１ｓｃ　ｒｅｃｏｍｂ（Ｂ）位置：６２０．．６３１ （Ｃ）他の情報：／標準芯＝ｒＰｏｌｙＧ１ｙリンカ−」（ｉｘ）性質： （Ａ）名称／鍵：ｍ１ｓｃ　ｆｅａｔｕｒｅ（Ｂ）位置：１０６．．１１１ （Ｃ）他の情報：／標準基＝ｒＡｐａ　１部位」（２）配列同定番号６に関する 情報： （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さニア５６個の塩基対 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖＝２本鎖 （Ｄ）トポロジー：線形 （１１）分子型：ｃＤＮＡ （ｉ　ｉ　ｉ）仮定：なし く１ｉｉ）アンチセンス：なし くｉｘ）性質： （Ａ）名称／鍵：　ＣＤ５ （Ｂ）位（Ｊ：　３．、．７５２ （Ｃ）他の情報：／産物＝「キメラ５ＡＨ−Ｆｖ’のＣ末端フラグメント」 （ｉｘ）性質： （Ａ）名称／鍵：ｍ１ｓｃ　ｒｅｃｏｍｂ（Ｂ）位置：３８４１．４２８ （Ｃ）他の情報：／標準名＝「合成リンカ−」Ｆｉｇｕｒｅ　Ｉ　Ａ （任意）　Ｆｉｇｕｒｅ　ＩＢ （任意）　（任意） 配列番号　１ 丁＾ＴＣＴＴｅへｃｅｘｙＣＣＡ１”ＩＴｃ入＾ｃｘｃ＾ＴＭ＾＾＾＾ＴｒＡＧ ＴＣ＾＾丁Ｇ＾＾ＧＴＡλＣＴＧＡＡｍｑｒ　ｔａｕ　Ｇｉｎ　ａｌｎ　Ｃｙｓ 　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　ｌｓｏ　Ｈｌｓ　Ｖａｌ　Ｌ、ｙｘ　Ｌａｕ　Ｖａ ｌ　Ａｉｎ　Ｇｌｕ@Ｖｇｌ　Ｔｈｒ　Ｃ１ｕ　Ｐ？＋ｏ　４９［Ｆ］斌Ｕユ胃 Ｉπτユ↑ＸでτｍＭＴτズ斌１コニα１αｍ人１ａ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ 　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｊｐ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｏｌｕ　Ａｉｎ　ｃｙｇ 　＾ｇ＋　ｂｙｓ　ｓｅｒ@ｕｕ　ｓ＝−丁ｈｒＬａｕ　６９ 丁ＴＴＣｍＣ入Ｃ入入＾ＴＴＡＴｏｅ八ｃ＾ＧＴＴＯ二＾＾ｃｒＣ丁丁０７Ｇ＾ ＾八：Ｃτ＾丁。ｍＧ入ＡＬＴＣｒＣＡＣＰｈｅＣ１ｙ＾５ｐＬ７ｙＭＬｅｕＣ ’ｆＳ丁ｈｒＶａｌＡｌｊ丁ｈｒＬｓｕ入ｒｇＧｌｕＴｔ＋ｒＴｙｒＧｌｙＧｌ ｕｍｔ入１ａＡｓｐ＠X ’Ｉ’ＯＣ胃寵ｎ黒ｍｃ触τ×に心Ｍ↑Ｇ紡力真π１■ＣＡＣｋ）Ｊｋ　ＣＡＴ χ紡ＣＣｙ客ＣｙｓＡｌａＬｙｇに１ｎＧｌｕＰｒ６Ｇｌｕ＾ｒ９＾５ｎＣ１ｕ Ｃｙ霧ＰｈｅＬ＃ｕＧｉｎＨ１ｃＬｑｇ入ｘｐ＾ｊｐ＾１ｎ１０９ＣＣＡＡＪｆ ’ＣＴＣＣＣＣＣＣλ丁７ｃｃＴｃＡＧ入ｃｃ＾Ｃ八ｃｃ’ｒｒａ＾丁ｃ’ｒり ＾↑Ｇ丁Ｇこ＾Ｃ丁（ｒｌ′Ｔ丁丁Ｃ＾ＴＧＡb Ｐｒｏ入５ｎＩＪｕＰｒｅ八ｒａしｅｕＶａｌ＾、ｒｇＰｒｏＣ１ｕＶａｌ入＄ ｐＶａｌｓｅ【ａｙｓ？）ｗＡｉｍＦ’ｈ＊）ｌｉｅ＾ｑ１Q９ 人＾Ｔα＾＾ｃＡＧ＾ＣＡＴｒＴ丁Ｔｃ入＾＾＾八＾丁＾ご丁子Ａ丁λ〒Ｇ＾＾ Ａ丁丁。Ｃ口へＧ＾＾Ｇ＾仁＾丁ＣＣＴ丁＾Ｃ丁丁Ｔ＾１ｎＧｌｕに１ｕＴｈｒ Ｐｈ＠ｔａｕＬｙｓＬｙｓ〒ｙｒし・Ｕ↑ｙｒＣ１ｕＴｉｅ＾１ａ入ｒＯムｒロ Ｈ１ｔＰｒｏ〒ｙｒＰｈｔ１４９丁＾↑ｃ＝’ＣＣＣｃ入ＡｃＴロＣ丁丁丁ＴＣ Ｔ丁ＴＧｃＴ入入Ａ＾Ｄ３Ｔ＾丁八八八Ｇコ丁。Ｃ丁丁Ｔ丁＾仁＾Ｇ入＾丁Ｃ丁 丁ＯＣ↑ｙｒＮａＰｒｏＧｌｕＬ＠ｕしｍｕＰｈｅＰｈｅ＾１ａＬｙｅ＾ｎ↑Ｙ ｒＬＶＩＩＡｌ＠＾１ａＰｈｅＴｈｒＧｌｕｃｙｉｃｙｓ１６９ＣＡＡＧｃＴｌ ｌｒｌｒＯＡ丁入ＡＡＣｘ：ｒＧＣ口丁０ｃｃＴｃτ丁ａｃｅ＾八＾へｃｉ’ｃ ｃ＾丁Ｇ八八へへＴＣＯＧＱＮＴＧ＾＾Ｇｏf ＧｉｎＡｌａＮａＡｓｐＬＹ１１入１ａＡｈａＣｙｓしｅｌＪＬａｕＰｒｏしｙ ｓしｅｕ＾ｘｐＧｌｕＬａｕＡｒｇ＾ｘｐに１ｕＧｌｙ１＠X ＡＡＣｃｘ：ｒ〒口ｃＴｃ＋ｒＧｃｃ入＾λＣ＾Ｇ入Ｇ＾Ｃ〒Ｃ入＾ａＴｃ丁。 ：Ｃ＾ａ丁ｃｒｃｃ＾八＾へＡｍＯ：＾Ｇ＾＾＾α＾ＬｙｇＡｌａＳｅｒＳｅｒ ＡｌａしｙｓＧｉｎ入ｒ９しｅｕしｙｓｃＹｓ＾ｌａｓｅｒＬｅｕＧｉｎＬｙｇ ＰｈｅａｌｙＧｌｕＡｒｇ２０９ワコ丁’ｎ’：入ＡＡＧｃＡＴＣＣＣ；こＡＣ 丁ＡｃｃＴＣＣＣＣ〒Ｃ＾ｃｃｃ八へＭ、＾ｍＣＣＣＡ＾Ａ（ｒ了ＣＸＧ丁ｒｒ ｃこ＾Ａ、ＩａＰｎｅＬｙｓＡｌａＴｒｐＡｌａＶａｌＡｌａ＾ｒｖしｅｕ５＠ ｒＧｉｎ＾ＱＰｈｅＰｒｏしｙｉ＾１ａＧｌｕＰｉ１＾１ａ２２９Ｃ＾Ａｃ＝ｒ Ｔ’：（ＡＡＧＴＴ＾ＣＴＣＡＣ＾Ｃ＾丁ＣＴ’ｒ＾ＣＣ入＾＾Ｃ丁ｃｃ＾Ｃん ｍＧ＾入↑ＧＣ↑ｃｃＣＡＴＧ；＾Ｃ＆丁Ｃ１ｕＶ＝ｌＳ＠ｒＬｙｓＩＪｕＶａ ｌＴｈｒＪｕｐＬ＠ｕ丁ｈｒＬｙｓＶａｌＨ１ｓ↑ｈｒＧｌｕｃｙｓＣｙｓ）Ｉ ＩｓＧｌｙ入ｓｐ２４X ｒｉｑｕｒｅ２ｆａｌ ＣＴ６ＣＴ丁Ｃ＾＾％Ｔ（ｆｒＧ＾↑Ｇ八〔＾ｌｌＸ１＋ＣＴｈＧＸ：Ｃ丁了Ｇ Ｃτ入＾σ丁＾ＴＡＴＣ丁Ｃ丁Ｇ入ＡＡＡ↑Ｃ八＾Ｃ入丁Ｌａｕ　Ｌａｕ　にｉ ｌｕ　Ｃｙｃ　ＡＩＩＩ　Ａｊｐ　Ａｇｐ　Ａｒ９＾１ゐ　＾５ｐし〜Ａｌａ　 Ｌｙｃ　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　Ｃ’ｙｓ　fｌｕ　Ａｉｎ　Ｇｌｎ　Ａｓ；　Ｘ？ π幻てｉ工Ａｌ７ｒＡＪ傷ａ℃ｖ心ωす賀℃賀πω端Ｖ講αテａηｆｌ’Ｇ　Ｇ ＡＡ　Ａ）ＩＡ　Ｗ　ＣＡＣＴ（Ｋ：ｓｅｒ　Ｉｌｅ　ｓｅｒ　Ｓｅｒ　ｔ、ｙ ｇ　ｔａｕ　Ｌｙｉ　Ｇｌｕ　Ｃｙｔ　ｃｙｉ　Ｇｌｕ　ｙｃ　Ｆ’ｒ６　Ｌａ ｕ　Ｌａｕ　Ｇｌ普@Ｌｙｓ　５＋ｒ　ＭｊＳ　ｑＳ　２８９＾Ｔ？ヴ！　ＧＩ Ａ　ＧＴＧ　Ｇ鮎へ人Ｔコ〒■Ｃ＾παゴαゴリＣ７ｒ’Ｇαゴπユ丁ＴＡαテ ａテＣＡＴ　Ｔ１丁Ｘ１ａ　Ａｌｅ　Ｇｌｕ　Ｖａｔ　Ｃ１ｕ　Ｍｎ　）ＩＪｐ Ｃｌｕ　Ｖａｔ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｊｕｅｐ　ｔａｕ　Ｐｒ６　ｊｉｅｒ　［ｚ 浮■PにＬａＭヤＰｈｅ　３０９ ＧＴＴＧＡ＾＾ＧＴＡＡＧＣ入ＴＣＴＴ丁ｏＣ入＾八Ａ＾Ｃ↑八〒ＧＣＴＧ八Ｇ ＯＣ＾入＾ＧＧ＾ＴＧＴＣ丁７’ＣＣＴＣＣ＆に＾Ｔ。 ｖａｌ　Ｇｌｕ　ｓｅｒ　Ｌｌｆｇ　ｋ巾Ｖａｌ　ｃｙｓ　ＩＪ／Ｓ　ｋｍＴｙ Ｔ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　ｂｙｓ　Ａｓｐ　ＶａＩＰｈ■@ＬＪＩＬＩ　Ｇ Ｉｙｓｅｃ　３２９ Ｔ丁テＴＴＧ〒＾丁Ｇ八＾丁ＡＴＣＣ八八Ｇ入＾ＯＣＣ＾ＴＣＣＴＧＡＴ↑＾Ｃ テＣ〒ＧＴＣσＴＡＣＴＧＣＴＧＣＴＣ＾ａｘｃＴＴＰ？ｗ　ｌａｕ　Ｔｙｒ　 （ｉｌｕ　’？ｙｒＡ１６〜１〜１ｇ　Ｈｌｓ　Ｐｒｏんｙ　Ｔｙｒ　５ｅｒ　 Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｌａｕ　Ｌａｕ@［ａｕ　ｋｇ　Ｌｅｕ　３４９ ０ＣＣＷ　）ａ　’ｒＡＴ　ＱＭ　ＡｃＣＡＣＴ　ＣＴＡ　Ｃ＆　ＡＡＧ　ＴＧ Ｃ％Ｔ　ＯＩＴ　ＱＣ”ｒ　（Ｋ：入　ＧＡＴ０ｊ（ＪＬτ@ａＸ＾　ＴＧＣ Ａｉｍ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　ＩｌｅｕＧｌｕ　 Ｌｙｍ　Ｃｙｓ　Ｃｙｍ　Ａｌａ　＾１６　八ｌａ　八ｓｐ@Ｐｒｏ　Ｈｌｇ　 Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　３６９Ｔｈ丁（ｊｃＡＡＡｃｒＧ’１ｍ：（ａＴＣＪＪＴＴＴ ＆八ＡＣＣＴＣＴＴへＴＣＧ入λＧλＣＣσＴＣ＾Ｃ八λ丁丁Ｔλ＾Ｔへ入＾＾ 〒Ｗ入１ａＬｙ町ＶａｌＰｈ−入５ｐＧｌｕＰｎａＬｙｓＦＴＱＬＪＩＩシム１ Ｃ１ｕＧｌｕＰｒｏＧｌｎ八５ｎＬａｕ１］ｅＬｙｓ３＠９ＣＡＮＡＡＴ〒Ｇ丁 ＧｋＧＣＴｒＴＴｒ（ＪＬＧＣＡＧＣ丁ＴＧＧＡＧＫＴ八ＣＡ入Ａ丁へＣＣ＾Ｇ ＾入ＴＧｌ：ＧＣＴＣＴｒＡＣＴＴｃ１．ｎ　Ａｉｎ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｌａｕ 　Ｐｈｅ　Ｃ１ｕ　Ｃ１−ｎ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　Ｃ１ｕ↑ｙｒ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ 　Ｇｉｎ　八ｓ氏@八ｌａ　Ｌａｕ　ＬＲｕ　Ｖａｌ　噛０９Ｃａｔ丁＾Ｃ＾Ｃ Ｃ＾ＡＧＡＡＡＣ丁＾ｃｏ＝ｃｗｃ丁ＣＴＣ＾＾ＣＴＣＣ入＾ＣＴＣＴＴＣＴ＾ （ＪＬＧにＴＣ’ＩＹ：＾八Ｃ＾入八ＣＡへ’Ｑ　へｙｒ　τｌｙ　Ｌｙｃ　Ｌ ｙｃ　ＶＦＩＩ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｖｈｌ　Ｓｅｒ　丁ｈｒ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　 Ｌｅｕ　Ｖａｔ　Ｇjｕ　Ｖａｔ　Ｓｏｒ　Ａｒ９　八Ｓｎ　４２９ＣＴＡＧＩ ＪＡ入ＡＧＴＣ；ＧＯＩ：Ａｏ：ＡＪＪＴＧＴＴＧＴ入ＡＡＣｋＴＣＣＴｃＡＡ ＱＣＡＭＡＡＣＡＡＴＣＣＭ！ＧＣＡＩＪｕ　Ｃ１ｙ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｃ１ｙ 　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ｃ’ｙｓ　Ｌｙｇ　）ｌｉｔ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ＾ｌ ａ　Ｌａｙｓ　Ａ窒■@Ｍｅｔ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　４４９Ｇ＾Ａα入Ｃ 丁λ丁　ＣＴＡＴＣＣ［７］Ｙｉ　ＧＴＣＣＴＣ入へ〇Ｃ＾ＧＴＴ＾ＴＣＴ　Ｃ ＴＣＴｒＧ　ＣへＴＧ＾ＣへへＡ　入ＣＧ　Ｏ普@ＧＴＴ Ｃｌｕ　Ａｓｐ　Ｔｆｒ　ＬＪｕ　ｓｅｒ　Ｖｓｌ　Ｖａｌ　ｌｚｕ＾Ｓｎ　Ｇ ｉｎ　Ｌｚｕ　Ｃ’／Ｓνδｌ　ｔａｕ　Ｈｌｓ　Ｇｌｕ　kｉ２Ｓ　Ｔｈｒ　 ｈ℃Ｖａｌ　４６９ 人Ｃ丁ＣＡＣ八Ｃ＾ＣＴＣ入ＣＣ入八＾↑Ｃ（↑ＣＣ入Ｃ＾Ｃ入ＡテｃｃＴＴｃ ｃ７Ｃ八入へ人ＣへＣＧ＾Ｃ仁ＡＴＧＣＴＴＴ〒（ＩＪＳｅｒｆｉｓｐ入ｒＭＶ ａｌＴｈｒＬｙｓＣｆＳＣＹ５ＴｈｒＧｌｕｓｅｒｌＪｕＶａｌ＾ｓｎ八ｒｇＡ ｒｇＰｒへｃｙ＋；１ｌｈｅｂｒ４P１９ ｃｌ？ｒＣ？’Ｃ（Ｊｕ（７ＣＣＪｋＴＣＡＡＡＣＡＴＡＣＧ？ＴＣＣＣＡＡＡ ＧＡＧＴｒＴｋｌＴ（ｆｆＴｍＡＣＡＴＴＣＡＯ：ｆｆ＾１ａＬｚｕＧｌｕＶａ ｌ＾５ＤＧｌｕＴｈｒｔｙｒＶａｔｐｒｏＬｙｓＧｌｕＰｈ＋＾ＳロＡＮ！１Ｇ ｌｕ丁ｈｒＰｈｏＴｈｒＰｂｅ５０X ＣＡＴＯ二＾Ｇ八丁−丁Ａ〒ＯＣ＾〔＾Ｃ丁丁ＴＣＴＧ八へ入八へ〇八へ八へＡ Ｃ入＾＾丁ＣＡ＾Ｇ＾＾ＡＣ八＾八ＣＴＧＩＩＪＣＴ丁Ｈ１ｓ　Ａｌａ　Ａｓｐ 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Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. １．アルブミンまたはアルブミンの変異体に遺伝的にカプリングしている、治療 学的活性を示すポリペプチドから誘導される活性部分を含んでいる組換え型ポリ ペプチド。
2. ２．治療学的活性を示す該ポリペプチドがヒト由来のポリペプチドである請求の 範囲１記載のポリペプチド。
3. ３．治療学的活性を示す該ポリペプチドが、酵素、酵素阻害剤、抗原、抗体、ホ ルモン、凝固因子、インターフェロン、サイトカイン、成長因子および／または 分化因子、骨組織の発生／吸収に関与している因子、化学走性因子、細胞運動性 または移動因子、細胞増殖抑制性因子、殺菌または抗真菌因子、或は血漿または 間隙性接着分子または細胞外マトリックスの、全てまたは一部から選択されるこ とを特徴とする請求の範囲２記載のポリペプチド。
4. ４．治療学的活性を示す該ポリペプチドが、循環および間隙性区分室の病理学に 関与している分子および／または細胞相互作用の作動薬または拮抗薬である何ら かのペプチド配列から選択されることを特徴とする請求の範囲１から３の１項記 載のポリペプチド。
5. ５．該活性部分が、 （ａ）全ペプチド構造、または （ｂ）（ａ）のフラグメントまたは機造的修飾（１積以上の残基の変異、置換、 付加および／または欠失）によって（ａ）から誘導されそして治療学的活性を保 持している構造、 から選択される構造を有していることを特徴とする請求の範囲１から４の１項記 載のポリペプチド。
6. ６．該活性部分をアルブミンのＮ末端にカプリングさせることを特徴とする請求 の範囲１から５の１項記載のポリペプチド。
7. ７．該活性部分をアルブミンのＣ末端にカプリングさせることを特徴とする請求 の範囲１から５の１項記載のポリペプチド。
8. ８．該活性部分が数回現れていることを特徴とする請求の範囲１から７の１項記 載のポリペプチド。
9. ９．請求の範囲１から８いずれか１項記載のポリペプチドをコートするヌクレオ チド配列。
10. １０．発現したポリペプチドの分泌を可能にする「リーダー」配列を含んでいる ことを特徴とする請求の範囲９記載のヌクレオチド配列。
11. １１．転写開始領域および任意の転写停止領域の制御下で請求の範囲９または１ ０の１項記載のヌクレオチド配列を含んでいる発現カセット。
12. １２．請求の範囲１１記載の発現カセットを含んでいる自己複製プラスミド。
13. １３．請求の範囲９または１０の１項記載のヌクレオチド配列または請求の範囲 １１記載の発現カセットまたは請求の範囲１２記載のプラスミドが挿入されてい る真核生物もしくは原核生物の組換え型細胞。
14. １４．酵母菌、動物細胞、菌・カビまたは細菌であることを特徴とする請求の範 囲１３記載の組換え型細胞。
15. １５．酵母菌であることを特徴とする請求の範囲１４記載の組換え型細胞。
16. １６．サッカロミセスまたはクルイベロミセス属の酵母菌であることを特徴とす る請求の範囲１５記載の組換え型細胞。
17. １７．請求の範囲１３から１６の１項記載の組換え型細胞を発現に適した条件下 で培養した後、産生されるポリペプチドを回収することを特徴とする請求の範囲 １から８の１項記載のポリペプチドの製造方法。
18. １８．請求の範囲１から８いずれか１項記載のポリペプチド類を１種以上含んで いる薬学組成物。
19. １９．遺伝治療で用いられ得る、請求の範囲９から１１いずれか１項記載のヌク レオチド配列を含んでいる薬学組成物。