ES2453941T5 - Anticuerpos monoclonales contra la proteína beta amiloide y usos de los mismos - Google Patents

Description

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suspensión madre se puede almacenar a temperaturas bajas, por ejemplo a aproximadamente -29ºC durante un periodo intermedio.

Como alternativa, el péptido o el derivado del mismo se pueden suspender en una solución ligeramente ácida,

5 preferentemente acuosa, por ejemplo una solución de HCl acuoso aproximadamente 10 mM. Tras un tiempo de incubación de aproximadamente unos minutos, los componentes insolubles se eliminan mediante centrifugación. Unos minutos a 10.000 g es conveniente. Estas etapas del procedimiento se llevan a cabo, preferentemente, a temperatura ambiente, es decir a una temperatura en el intervalo de 20 a 30 ºC. El sobrenadante obtenido tras la centrifugación contiene el péptido Aβ (X-Y) o derivado del mismo y se puede almacenar a temperatura baja, por ejemplo a aproximadamente -20ºC, durante un periodo temporal.

La siguiente exposición a un detergente se refiere a la oligomerización del péptido o el derivado del mismo, para dar el tipo intermedio de oligómeros (en la publicación de solicitud internacional nº WO 04/067561 se denominan oligómeros A). Con este fin, se permite que un detergente actúe sobre, opcionalmente, el péptido al menos

15 parcialmente desplegado o derivado del mismo hasta producir suficiente oligómero intermedio. Se da preferencia al uso de detergentes iónicos, en particular detergentes aniónicos.

De acuerdo con una realización concreta, un detergente de la fórmula (I):

R-X,

en la cual el radical “R” es alquilo no ramificado o ramificado que tiene de 6 a 20 y, preferentemente, de 10 a 14 átomos de carbono o alquenilo no ramificado o ramificado que tiene de 6 a 20 y, preferentemente, de 10 a 14 átomos de carbono y el radical “X” es un grupo ácido o sal del mismo, seleccionándose preferentemente X de entre

25 COO-M+, -SO3-M y es, más preferentemente, OSO3-M+, y M+ es un catión de hidrógeno o un catión inorgánico u orgánico seleccionado preferentemente de cationes de metales alcalinos, cationes de metales alcalino térreos y cationes de amonio. Los más ventajosos son detergentes de la fórmula (I) en la que R es un alquilo no ramificado del cual se deben mencionar los radicales alq-1-uilo, en particular. Se da particular preferencia a dodecilsulfato sódico (SDS). De forma ventajosa también se puede usar ácido láurico y ácido oleico. La sal de sodio del detergente lauroilsarcosina (también conocido como sarkosil NL-30 o Gardol®) también es particularmente ventajoso.

El tiempo de acción del detergente, en particular, depende de si, y en caso afirmativo, en qué medida, el péptido o derivado del mismo sujeto a oligomerización se ha desplegado. Si, de acuerdo con la etapa de desplegado, el péptido o derivado del mismo se ha tratado con anterioridad con un agente de rotura de puentes de hidrógeno (es

35 decir, en particular con hexafluoroisopropanol), los tiempos de acción en el intervalo de unas horas, de forma ventajosa desde aproximadamente 1 a 20 y, en particular, desde aproximadamente 2 a 10 horas, son suficientes cuando la temperatura de acción es de aproximadamente 20 a 50 ºC y, en particular, de aproximadamente 35 a 40 ºC. Si el punto de partida es un péptido o derivado del mismo menos desplegado o esencialmente no desplegado, son convenientes tiempos de acción consecuentemente más prolongados. Si péptido o derivado del mismo se ha pretratado, por ejemplo de acuerdo con el procedimiento indicado anteriormente como alternativa al tratamiento con HFIP o dicho péptido o derivado del mismo está directamente sometido a oligomerización, los tiempos de acción en e intervalo de aproximadamente 5 a 30 horas y, en particular, de aproximadamente 10 a 20 horas son suficientes cuando la temperatura de acción es de aproximadamente 20 a 50ºC y, en particular, de aproximadamente 35 a 40ºC. Tras la incubación, los componentes insolubles se eliminan de forma ventajosa mediante centrifugación. Unos

45 minutos a 10.000 g es conveniente.

La concentración del detergente a elegir depende del detergente usado. Si se usa SDS, se ha demostrado que una concentración en el intervalo de 0,01 a 1% en peso, preferentemente de 0,05 a 0,5 % en peso, por ejemplo, de aproximadamente 0,2% en peso, es conveniente. Si se usa ácido láurico u oleico, son convenientes concentraciones algo más altas, por ejemplo en el intervalo de 0,05 a 2 % en peso, preferentemente de 0,1 a 0,5 % en peso, por ejemplo, de aproximadamente 0,5 % en peso. La acción del detergente debería tener lugar a una concentración de sales aproximadamente en el intervalo fisiológico. Por tanto, en particular, son convenientes concentraciones de NaCl en el intervalo de 50 a 500 mM, preferentemente de 100 a 200 mM y, más particularmente, a aproximadamente 140 mM.

55 La posterior reducción de la acción del detergente y la continuación de la incubación se refiere a la oligomerización posterior, para dar el globulómero Aβ (X-Y) de loa invención (en la publicación de solicitud internacional nº WO 04/067561 se denominan oligómeros B). Dado que la composición obtenida de la etapa precedente contiene regularmente detergente y una concentración de sales en e intervalo fisiológico, es conveniente reducir la acción del detergente y, preferentemente, también la concentración de sales. Esto se puede llevar a cabo reduciendo la concentración del detergente y las sales, por ejemplo diluyendo convenientemente con agua o un tampón de menor concentración de sales, por ejemplo Tris-HCl, pH 7,3. Se ha demostrado que factores de dilución en el intervalo de aproximadamente 2 a 10, de forma ventajosa en el intervalo de aproximadamente 3 a 8 y, en particular, de aproximadamente 4, son adecuados. La reducción de la acción del detergente también se puede conseguir

65 añadiendo sustancias que pueden neutralizar esta acción del detergente. Ejemplos de estos incluyen sustancias capaces de formar complejos con los detergentes, como sustancias capaces de estabilizar las células durante las

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Los términos “homología”, 2homólogo”, “sustancialmente similar” y “correspondiente sustancialmente” se usan de forma intercambiable en el presente documento. Hacen referencia a fragmentos de ácido nucleico en los que los cambios de una o más bases de nucleótidos no afectan a la capacidad del fragmento de ácido nucleico a participar en expresión génica o producir un determinado fenotipo. Estos términos también hacen referencia a modificaciones

5 de los fragmentos de ácido nucleico de la presente invención, tales como deleción o inserción de uno o más nucleótidos que no alteran sustancialmente las propiedades funcionales del fragmento de ácido nucleico resultante respecto al fragmento inicial no modificado. Por tanto, se entiende que los expertos en la técnica apreciarán que la invención abarca más que las secuencias de ejemplo específicas.

“Gen” hace referencia a un fragmento de ácido nucleico que expresa una proteína específica, incluidas secuencias reguladoras precedentes (secuencias no codificantes en 5’) y posteriores (secuencias no codificantes en 3’) a la secuencia de codificación.

“Gen nativo” se refiere a un gen como se encuentra en la naturaleza con sus propias secuencias reguladoras. Por el

15 contrario, “construcción quimérica” hace referencia a una combinación de fragmentos de ácido nucleico que normalmente no se encuentran juntaos en la naturaleza. En consecuencia, una construcción quimérica puede comprender secuencias reguladoras y secuencias de codificación derivadas de diferentes fuentes o secuencias reguladoras y secuencias de codificación de la misma fuente, pero dispuestas de un modo distinto a como se encuentran normalmente en la naturaleza. (El término “aislado” significa que la secuencia se elimina de su ambiente natural).

Un gen “extraño” hace referencia a un gen que normalmente no se encuentra en el organismo huésped, pero que se introduce en el organismo huésped mediante transferencia génica. Los genes extraños pueden comprender genes nativos insertados en un organismo no nativo o construcciones quiméricas. Un “transgén” es un gen que se ha

25 introducido en el genoma mediante un procedimiento de transformación.

“Secuencia de codificación” hace referencia a una secuencia de ADN que codifica una secuencia de aminoácidos específica. “Secuencias reguladoras” se refieren a secuencias nucleotídicas localizadas cadena arriba (secuencias no codificantes en 5’), dentro, o cadena abajo (secuencias no codificantes en 3’) de una secuencia de codificación y que influyen sobre la transcripción, el procesamiento o la estabilidad del ARN o la traducción de la secuencia de codificación asociada. Las secuencias reguladoras pueden incluir, entre otros, promotores, secuencias líder de la traducción, intrones y secuencias de reconocimiento de la poliadenilación.

“Promotor” o “secuencia génica reguladora” hace referencia a una secuencia de ADN capaz de controlar la

35 expresión de una secuencia de codificación o ARN funcional. La secuencia consiste en elementos cadena arriba proximales y más distales, estos últimos elementos a menudo se denominan potenciadores. De acuerdo con esto, un “potenciador” es una secuencia de ADN que puede estimular la actividad de la secuencia génica del promotor o reguladora y puede ser un elemento innato del promotor o un elemento heterólogo insertado para potenciar el nivel de especificidad e tejido de un promotor. Las secuencias del promotor también se pueden localizar dentro de las porciones transcritas de los genes y/o cadena debajo de las secuencias transcritas. Los promotores pueden derivar en su totalidad de un gen nativo o estar compuestos por diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados en la naturaleza, o incluso comprender segmentos de ADN sintético. Los expertos en la técnica entienden que diferentes promotores pueden dirigir la expresión de un gen en diferentes tejidos o tipos celulares, o en diferentes etapas de desarrollo, o en respuesta a diferentes condiciones ambientales o ambientales. Los

45 promotores que hacen que un gen se exprese en la mayoría de los tipos de células huésped se denominan, en la mayoría de los casos, “promotores constitutivos”. Constantemente se están descubriendo nuevos promotores de varios tipos útiles en células vegetales; se pueden encontrar numerosos ejemplos en la recopilación de Okamuro y Goldberg, Biochemistry of Plants 15:1 -82 (1989). Además se reconoce que, ya que en la mayoría de los casos los límites exactos de las secuencias reguladoras no se han definido completamente, los fragmentos de ADN de alguna variación pueden tener una actividad promotora idéntica.

Un “intrón” es una secuencia intermedia en un gen que no codifica una porción de la secuencia proteica. Por tanto, dichas secuencias se transcriben en ARN pero después se escinden y no se traducen. El término también se usa para las secuencias de ARN escindidas. Un “exón” es una porción de la secuencia génica que se transcribe y se

55 encuentra en el ARN mensajero maduro derivado del gen pero no necesariamente es una parte de la secuencia que codifica el producto génico final.

La “secuencia líder de traducción” hace referencia a una secuencia de ADN localizada entre la secuencia promotora de un gen y la secuencia de codificación. La secuencia líder de traducción está presente en el ARNm completamente procesado cadena arriba de la secuencia de iniciación de la traducción. La secuencia líder de traducción puede afectar al procesamiento del tránscrito primario en ARNm, a la estabilidad del ARNm o a la eficiencia de la traducción. Se han descrito ejemplos de secuencias líder de traducción (Turner, R. and Foster, G. D. (1995) Molecular Biotechnology 3:225).

65 Las “secuencias no codificantes en 3'” hacen referencia a secuencias de ADN localizadas cadena abajo de una secuencia de codificación e incluyen secuencias de reconocimiento de poliadenilación y otras secuencias que

codifican señales reguladoras capaces de afectar al procesamiento del ARNm o a la expresión génica. La señal de poliadenilación normalmente se caracteriza porque afecta a la adición de tramos de ácido poliadenílico al extremo 3' del precursor de ARNm. El uso de diferentes secuencias no codificantes en 3' lo ilustran Ingelbrecht et al., Plant Cell

1:671 -680 (1989).

5 “Tránscrito de ARN” hace referencia al producto resultante de la transcripción catalizada por la ARN polimerasa de una secuencia de ADN. Cuando el tránscrito de ARN es una copia complementaria perfecta de la secuencia de ADN, se denomina tránscrito primario o puede ser una secuencia de ARN derivada del procesamiento postranscripcional del tránscrito primario y se denomina ARN maduro. “ARN mensajero (ARNm)” se refiere al ARN que no tiene intrones y que se puede traducir en proteínas en la célula. “ADNc” hace referencia a un ADN que es complementario y se sintetiza a partir de un molde de ARNm usando la enzima transcriptasa inversa. El ADNc puede ser monocatenario o convertirse en bicatenario usando el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I. ARN “sentido” hace referencia a un tránscrito de ARN que incluye el ARNm y se puede traducir en proteínas dentro de una célula o in vitro. “ARN antisentido” se refiere a un tránscrito de ARN que es complementario a todo o parte de un

15 tránscrito primario diana o ARNm y que bloquea la expresión de un gen diana (patente de EE.UU. Nº 5.107.065). La complementariedad de un ARN antisentido puede ser cualquier parte del tránscrito génico específico, es decir en la secuencia no codificante en 5’, la secuencia no codificante en 3’, intrones o la secuencia de codificación. “ARN funcional” se refiere a ARN antisentido, ARN de ribozima u otro ARN que puede no traducirse, auque tiene un efecto sobre los procesos celulares. Los términos y expresiones “complementario” y “complementario inverso” se usan de forma intercambiable en el presente documento con respecto a los tránscritos de ARNm y se pretende que definan el ARN antisentido del mensaje.

La expresión “ARN endógeno” hace referencia a cualquier ARN que está codificado por una secuencia de ácido nucleico presente en el genoma del huésped antes de la transformación con la construcción recombinante de la

25 presente invención, sea de origen natural o no natural, es decir, introducido por medios recombinantes, mutagénesis etc.

La expresión “de origen no natural” significa artificial, no consistente con lo que normalmente se encuentra en la naturaleza.

La expresión “operablemente unido” se refiere a la asociación de secuencias de ácido nucleico en un único fragmento de ácido nucleico de modo que la función de una está regulada por la otra. Por ejemplo, un promotor está operablemente unido a una secuencia de codificación cuando es capaz de regular la expresión de dicha secuencia de codificación (es decir, que la secuencia de codificación está bajo el control transcripcional del promotor). Las

35 secuencias de codificación pueden estar operablemente unidas a secuencias reguladoras en orientación sentido o antisentido. En otro ejemplo, las regiones de ARN complementarias de la invención pueden estar unidas operablemente, bien directa o indirectamente, en 5’ del ARNm diana o en 3’ del ARNm diana o dentro del ARNm diana, o una primera región complementaria está en 5’ y su complementaria está en 3’ del ARNm diana.

El término “expresión” tal como se usa en el presente documento, hace referencia a un producto final funcional. La expresión de un gen implica la transcripción del gen y la traducción del ARNm en una proteína precursora o madura. “Inhibición antisentido” hace referencia a la producción de tránscritos de ARN antisentido capaces e suprimir la expresión de la proteína diana. “Cosupresión” hace referencia a la producción de tránscritos de ARN sentido capaces e suprimir la expresión de genes endógenos o extraños idénticos o sustancialmente similares (patente de

45 EE.UU. Nº 5.231.020).

Una “proteína madura” hace referencia a un polipéptido procesado postraduccionalmente, es decir uno del que se ha eliminado cualquier pre o propéptido presente en el producto primario de la traducción. Proteína “precursora” hace referencia al producto primario de la traducción del ARNm, es decir cuando todavía hay pre y propéptidos. Los prepéptidos y los propéptidos pueden ser, entre otros, señales de localización intracelular.

“Transformación estable” se refiere a la transferencia de un fragmento de ácido nucleico en un genoma de un organismo huésped, que tiene como resultado una herencia genéticamente estable. Por el contrario, “transformación transitoria” se refiere a la transferencia de un fragmento de ácido nucleico en el núcleo u orgánulo que contiene

55 ADN, de un organismo huésped, que tiene como resultado la expresión sin integración o herencia estable. Los organismos huésped que contienen los fragmentos de ácido nucleico transformados se denominan organismos “transgénicos”. El término “transformación”, tal como se usa en el presente documento, hace referencia tanto a la transformación estable como a la transformación transitoria.

Las técnicas convencionales de ADN recombinante y de clonación molecular usadas en el presente documento son bien conocidas en la materia y se describen más completamente en Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989 (en lo sucesivo en el presente documento "Sambrook").

65 El término “recombinante” hace referencia a una combinación artificial de dos segmentos de secuencia, por lo demás separados, por ejemplo mediante síntesis química o mediante la manipulación de segmentos aislados de

ácidos nucleicos mediante técnicas de ingeniería genética.

“PCR” o “Reacción en cadena de la polimerasa” es una técnica para la síntesis de grandes cantidades de segmentos de ADN específicos y consiste en una serie de ciclos repetidos (Perkin Elmer Cetus Instruments,

5 Norwalk, CT). Normalmente, el ADN bicatenario se desnaturaliza por calor, los dos cebadores complementarios a los extremos 3’ del segmento diana se hibridan a temperatura baja y después se extienden a una temperatura intermedia. Un conjunto de estas tres etapas consecutivas se denomina ciclo.

La reacción en cadena de la polimerasa (“PCR”) es una potente técnica usada para amplificar ADN millones de veces mediante replicación repetida de un molde en un periodo de tiempo corto. (Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263 -273 (1986); Erlich et al., solicitud de patente europea Nº 50.424; solicitud de patente europea 84.796; solicitud de patente europea Nº 258.017; solicitud de patente europea Nº 237.362; Mullis, solicitud de patente europea Nº 201.184; Mullis et al., patente de EE.UU. Nº 4.683,202; Erlich, patente de EE.UU. Nº 4.582,788; y Saiki et al., patente de EE.UU. Nº 4.683,194). El proceso usa conjuntos de oligonucleótidos específicos

15 sintetizados in vitro para cebar la síntesis de ADN. El diseño de los cebadores depende de las secuencias de ADN que se van a analizar. La técnica se lleva a cabo a través de muchos ciclos (normalmente 20-50) de fusión del molde a temperatura alta, o que permite a los cebadores hibridad con secuencias complementarias dentro del molde y después replicar el molde con la ADN polimerasa.

Los productos de las reacciones de PCR se analizan mediante electroforesis en gel de agarosa seguido de tinción con bromuro de etidio y visualización con transiluminación UV. Como alternativa, se pueden añadir dNTP radioactivos a la PCR con el fin de incorporar marcadores en los productos. En este caso, los productos de la PCR se visualizan mediante exposición del gel a una película de rayos X. La ventaja añadida de radiomarcar los productos de PCR es que los niveles de los productos de amplificación individuales se pueden cuantificar.

25 Las expresiones “construcción recombinante”, “construcción de la expresión” y “construcción de expresión recombinante” En el presente documento, los términos “de acción rápida” y “de acción veloz" se usan de forma intercambiable en el presente documento. Estos términos hacen referencia a una unidad funcional de material genético que se puede insertar en el genoma de una célula usando metodología estándar bien conocida por un experto en la técnica. Dicha construcción puede usarse sola o junto con un vector. Si se usa un vector, la elección del vector depende del método que se usará para transformar plantas huésped como es bien conocido por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se puede usar un plásmido. El experto en la técnica conoce bien los elementos genéticos que deben estar presentes en el vector con el fin de transformar con éxito, seleccionar y propagar células huésped que comprenden cualquiera de los fragmentos de ácido nucleico aislados de la invención. El experto en la

35 técnica también reconocerá que diferentes acontecimientos de transformación independientes tendrán como resultado diferentes niveles y patrones de expresión (Jones et al., (1985) EMBO J. 4:2411 -2418; De Almeida et al., (1989) Mol. Gen. Genetics 218:78 -86) y, por tanto, que se pueden someter a detección selectiva múltiples acontecimientos para obtener líneas que muestran el nivel y patrón de expresión deseados. Dicha detección selectiva se puede conseguir mediante análisis de tipo Southern de ADN, análisis de tipo Northern de la expresión de ARNm, análisis de tipo Western o análisis fenotípico.

Con un “anticuerpo monoclonal”, como se usa en el presente documento, se pretende hacer referencia a una de una preparación de moléculas de anticuerpo que contienen anticuerpos que comparten una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada común o la cadena ligera común, en contraste con un anticuerpo a partir de una preparación

45 de anticuerpo “policlonal” que contiene una mezcla de diferentes anticuerpos. Los anticuerpos monoclonales se pueden generar mediante varias tecnologías nuevas, como fagos, bacterias, levaduras o expresión ribosómica, así como procedimientos clásicos ilustrados por anticuerpos derivados de hibridoma (p. ej., un anticuerpo secretado por un hibridoma preparado mediante tecnología de hibridoma, tal como la metodología convencional de hibridomas de Kohler y Milstein ((1975) Nature 256:495 -497). Por tanto, un anticuerpo agonista no derivado de hibridoma de la invención todavía se denomina anticuerpo monoclonal, aunque puede obtenerse mediante metodologías no clásicas.

Con un “anticuerpo aislado”, como se usa en el presente documento, se pretende hacer referencia a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (p. ej., un

55 anticuerpo aislado que se une específicamente a un globulómero está sustancialmente libre de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos distintos a un globulómero). Un anticuerpo aislado que se une específicamente a un globulómero puede, por tanto, tener reactividad cruzada con otros antígenos. Además, un anticuerpo asilado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o sustancias químicas.

La expresión "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo (o simplemente “fragmento de anticuerpo”), como se usa en el presente documento, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad para unirse específicamente a un antígeno. Se ha demostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo se puede realizar mediante fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Dichas realizaciones de anticuerpos también pueden tener formatos de biespecíficos, específicos dobles o multiespecíficos; específicamente se unen a 65 dos o más antígenos diferentes. Ejemplos de fragmentos de unión abarcados dentro del término “porción de unión a antígeno” de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab es un fragmento monovalente compuesto por los dominios

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por el antígeno. Dicho enfoque se describe con mayor detalle en la publicación de la solicitud internacional Nº WO 03/016466A2y las patentes de EE.UU. Nº 5.714.350 y 6.350.861.

Adicionalmente o como alternativa, se puede fabricar un anticuerpo modificado que tiene un tipo alterado de

5 glicosilación, tal como un anticuerpo hipofucosilado que tiene cantidades mejores de residuos de fucosilo o un anticuerpo que tiene mayores estructuras de GlcNac de bisección. Se ha demostrado que dichos patrones de glicosilación alterada incrementan la capacidad de ADCC de los anticuerpos. Dichas modificaciones en el hidrato de carbono se pueden conseguir mediante, por ejemplo, expresión del anticuerpo en una célula huésped con una maquinaria de glicosilación alterada. Las células con una maquinaria de glicosilación alterada se han descrito en la técnica y se pueden usar como células huésped en las que expresar anticuerpos recombinantes de la presente invención para producir, de este modo, un anticuerpo con glicosilación alterada. (Véase, por ejemplo, Shields, R.L. y col., (2002) J. Biol. Chem. 277:26733 -26740; Umana y col., (1999) Nat. Biotech. 17:176 -1, así como la patente europea Nº EP 1.176.195; la publicación de solicitud internacional número WO 03/035835 y WO 99/5434280.)

15 La glicosilación de proteínas depende de la secuencia de aminoácidos de la proteína de interés, así como la célula huésped en la que se expresa la proteína. Diferentes organismos pueden producir diferentes enzimas de glicosilación (p. ej., glicosiltransferasas y glicosidasas) y tener diferentes sustratos (azúcares de nucleótidos) disponibles. Debido a estos factores, el patrón de glicosilación de proteínas y la composición de los residuos de glicosilo pueden diferir en función del sistema del huésped en el que se expresa la proteína concreta. Los residuos de glicosilo útiles en la invención pueden incluir, entre otros, glucosa, galactosa, manosa, mucosa, nacetilglucosamina y ácido siálico. Preferentemente, la proteína de unión glicosilada comprende residuos de glicosilo de modo que el patrón de glicosilación es humano.

Los expertos en la técnica saben que una glicosilación proteica diferente puede tener como resultado características

25 de proteína diferentes. Por ejemplo, la eficacia de una proteína terapéutica producida en un huésped microorganismo, tal como levaduras, y glicosilada usando la vía endógena de levaduras se puede reducir en comparación con la de la misma proteína expresada en una célula de mamífero, tal como una línea celular CHO. Dichas glicoproteínas también pueden ser inmunogénicas en seres humanos y mostrar una semivida reducida in vivo tras la administración. Receptores específicos en seres humanos y otros animales pueden reconocer residuos glicosilo específicos y estimular el rápido aclaramiento de la proteína de la circulación sanguínea. Otros efectos adversos pueden incluir cambios en el plegamiento, solubilidad, susceptibilidad de la proteína a las proteasas, tráfico, transporte, compartimentalización, secreción, reconocimiento por otras proteínas o factores, antigenicidad o alergenicidad. De acuerdo con esto, el encargado de ponerla en práctica puede preferir una proteína terapéutica con una composición y patrón de glicosilación específicos, por ejemplo una composición y patrón de glicosilación

35 idénticos, o al menos similares, a los producidos en células humanas o en las células específicas de la especie del animal sujeto objetivo.

La expresión de proteínas glicosiladas diferente de la de una célula huésped se puede conseguir modificando genéticamente la célula huésped para expresar encimas de glicosilación heterólogas. Usando técnicas conocidas en la técnica, un encargado de ponerlas en práctica puede generar anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos que exhiben glicosilación de proteínas humanas. Por ejemplo, las cepas de levaduras se han modificado genéticamente para expresar encimas de glicosilación de origen no natural de modo que las proteínas glicosiladas (glicoproteínas) producidas en estas cepas de levadura exhiben una glicosilación de proteínas idéntica a la de las células de animales, especialmente células humanas (publicación de la solicitud de patente de EE.UU. Nº

45 20040018590 y 20020137134 y la publicación de solicitud internacional WO 05/100584 A2).

Además, el experto en la técnica apreciará que una proteína de interés se puede expresar usando una biblioteca de células huésped modificada genéticamente para expresar varias enzimas de glicosilación, de modo que las células huésped miembros de la biblioteca producen la proteína de interés con patrones de glicosilación variables. Un encargado de la puesta en práctica puede seleccionar y aislar la proteína de interés con nuevos patrones de glicosilación concretos. Preferentemente, la proteína que tiene un nuevo patrón de glicosilación particularmente seleccionado exhibe propiedades biológicas mejoradas o alteradas.

La invención también proporciona un procedimiento para fabricar los anticuerpos monoclonales de la invención a

55 partir de animales no humanos, no ratones mediante la inmunización de animales transgénicos no humanos que comprenden loci de inmunoglobulina humana. Se pueden producir estos animales usando procedimientos conocidos en la técnica. En una forma de realización preferida, los animales no humanos pueden ser ratas, ovejas, cerdos, cabras, ganado vacuno o caballos. Se pueden preparar hibridomas inmortalizados productores de anticuerpos a partir del animal inmunizado. Tras la inmunización, se sacrifica al animal y las células B esplénicas se condensan con células de mieloma inmortalizadas como se conoce bien en la técnica. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane, ant. En una forma de realización preferida, las células de mieloma no secretan polipéptidos de inmunoglobulina (una línea de células no secretoras). Tras la fusión y selección de anticuerpos, los hibridomas se someten a detección selectiva usando un antígeno (por ejemplo, un globulómero) o una porción del mismo o una célula que expresa en antígeno de interés. En una forma de realización preferida, la detección selectiva inicial se realiza usando un

65 inmunoensayo unido a enzimas (ELISA) o un radioinmunoensayo (RIA), preferentemente un ELISA. Un ejemplo de detección selectiva con ELISA se proporciona en la publicación de solicitud internacional Nº WO 00/37504.

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mutageneizadas mediante sustitución, inserción o deleción de al menos un residuo de aminoácido, de modo que la CDR o el residuo de estructura en el punto no corresponde ni con el anticuerpo donante ni con la estructura consenso. Por tanto, en una forma de realización preferida, dichas mutaciones no serán extensas. Normalmente, al menos el 80%, preferentemente al menos el 85%, más preferentemente al menos el 90% y, lo más preferentemente,

5 al menos el 95% de los residuos de anticuerpos humanizados corresponderá a los de las secuencias FR y CDR parentales. Como se usa en el presente documento, la expresión “estructura consenso” se refiere a la región de estructura en la secuencia de inmunoglobulina consenso. Además, como se usa en el presente documento, la expresión “secuencia de inmunoglobulina consenso” hace referencia a la secuencia formada por los aminoácidos (o nucleótidos) más frecuentes en una familia de secuencias de inmunoglobulina (véase, por ejemplo, Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania, 1987). En una familia de inmunoglobulinas, cada posición en la secuencia consenso está ocupada por el aminoácido que está con mayor frecuencia en dicha posición en la familia. Si hay dos aminoácidos igualmente frecuentes, cada uno se puede incluir en la secuencia consenso.

El término “actividad” incluye actividades tales como especificidad/afinidad de unión de un anticuerpo por un 15 antígeno.

El término “epítopo” incluye cualquier polipéptido determinante capaz de unirse de forma específica a una inmunoglobulina o receptor de células T. En ciertas realizaciones, los determinantes epitópicos incluyen grupos de superficie químicamente de moléculas, tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcar, fosforilo, orosulfonilo y, en ciertas realizaciones, pueden tener características estructurales tridimensionales, así como características de carga específicas. Un epítopo es una región de un antígeno que está unido a un anticuerpo. En ciertas realizaciones, se dice que un anticuerpo está unido específicamente a un antígeno cuando reconoce preferentemente su antígeno diana en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas.

25 La expresión “resonancia de plasmón superficial”, como se usa en la presente memoria descriptiva, se refiere a un fenómeno óptico que permite el análisis de las interacciones bioespecíficas en tiempo real mediante la detección de alteraciones en las concentraciones de proteínas dentro de una matriz biosensora, usando, por ejemplo, el sistema BIAcore system (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia y Piscataway, N.J.). Para descripciones adicionales, véase Jönsson, U., y col. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19 -26; Jönsson, U., y col., (1991) Biotechniques 11:620 -627; Johnsson, B., y col., (1995) J. Mol. Recognit. 8:125 -131; y Johnnson, B., y col., (1991) Anal. Biochem. 198:268

277.

Con el término "Kon", como se usa en el presente documento, se pretende hacer referencia a la constante "on rate" de asociación de un anticuerpo al antígeno para formar el complejo anticuerpo/antígeno como se conoce en la

35 técnica.

Con el término "Koff", como se usa en el presente documento, se pretende hacer referencia a la constante "off rate" de disociación de un anticuerpo del complejo anticuerpo/antígeno como se conoce en la técnica.

Con el término "Kd", como se usa en el presente documento, se pretende hacer referencia a la “constante "de disociación” de una interacción anticuerpo-antígeno concreta como se conoce en la técnica.

La expresión “proteína de unión marcada”, como se usa en el presente documento, hace referencia a una proteína con un marcador incorporado que proporciona la identificación de la proteína de unión. Preferentemente, la marca es

45 un marcador detectable, por ejemplo, la incorporación de un aminoácido radiomarcado o la fijación a un polipéptido de restos de biotiniló que se puede detectar mediante avidina marcada (p. ej., estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o actividad enzimática que se puede detectar mediante procedimientos ópticos o colorimétricos). Ejemplos de marcadores para polipéptidos incluyen, entre otros, los siguientes: radioisótopos o radionúclidos (p. ej., 3H, 14C, 35S, 90Y, 99TC, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho o 153Sm); marcadores fluorescentes (p. ej., FITC, rodamina, fósforos lantánidos), marcadores enzimáticos (p. ej., peroxidasa de rábano, luciferasa o fosfatasa alcalina), marcadores quimioluminiscentes, marcadores de hapteno tales como grupos de biotinilo y epítopos polipeptídicos predeterminados reconocidos por un indicador secundario (p. ej., pares de secuencias en cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metal, marcadores de epítopos); y agentes magnéticos, tales como quelatos de gadolinio.

55 La expresión “conjugado de anticuerpo” hace referencia a una proteína de unión, tal como un anticuerpo, químicamente unida a un segundo resto químico, tal como un agente terapéutico o citotóxico. En la presente memoria descriptiva, el término “agente” se usa para indicar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica o un extracto hecho de materiales biológicos. Preferentemente, los agentes terapéuticos y citotóxicos incluyen, entre otros, la toxina pertussis, taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihIdroxiantracina diona, mitoxantrona, mitramIcina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, timidina cinasa, endonucleasa, ARNasa y puromicina, así como análogos y homólogos de estos agentes.

65

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4.

Reactivo de bloqueo para ELISA; Roche Diagnostics GmbH Nº de cat.: 1112589

5.

Tampón PBST:

NaH2PO4 20 mM; NaCl 140 mM; 0,05 % de Tween 20; a pH 7,4 5

6.

Fracción V de albúmina bovina sin proteínas; Serva Nº de Cat. 11926,03; almacenar a 4° C.

7.

PBST + 0,5 % de tampón -BSA: NaH2PO4 20 mM; NaCl 140 mM; 0,05 % de Tween 20; a pH 7,4 + 0,5 % BSA

8.

Madre patrón del globulómero de Aß(1 -42):

15 Solución en NaH2PO4 5 mM; NaCl 35 mM a pH7,4; conc.: 10,77 mg/ml; almacenar a -20ºC

9.

Madre patrón del monómero Aß(1 -42) tratado con HFIP:

Solución en NaH2PO4 3 mM; NaCl 21 mM; 0,15 % de Pluronic F68 a pH7,4; conc.: 0,45 mg/ml; almacenar a -20ºC

10.

Madre patrón del monómero Aß(1 -42) en NH4OH; solución en 0,1% de NH4OH conc.: 2 mg/ml; almacenar a -20ºC

25 11. Solución madre patrón del monómero Aß(1 -40) tratado con HFIP en DMSO conc.: 21,7 mg/ml; almacenar a -20ºC

12.

Clon 8F5 de mAb 6G1 biotinilado anti-Aß de ratón; solución en PBS; conc.: 0,24 mg/ml; almacenar a -80ºC

13.

Conjugado de estreptavidina-POD; Fa.Roche nº de cat. : 1089153

14.

Tinción

TMB; Roche Diagnostics GmbH Nº de cat.: 92817060; 42 mM en DMSO; 3 % de H2O2 en agua; acetato sódico 100 mM a pH 4,9

15.

Tinción de detención añadiendo solución de ácido sulfónico 2M

35 Preparación de reactivos:

Se usó el protocolo siguiente:

1.

Anticuerpo de unión Descongelar la solución de reserva de mMAb 6G1 y diluir a 1:400 en tampón de recubrimiento.

2.

Reactivo de bloqueo:

45 Disolver el reactivo de bloqueo en 100 ml de agua para preparar la solución madre de bloqueo y almacenar los alícuotas de 10 ml a -20ºC. Diluir 3 ml de la solución madre de bloqueo con 27 ml de agua para bloquear cada placa.

3. Soluciones patrón de Aß:

a) Globulómero Aß(1 -42)

-Añadir 1 µl de la solución madre patrón del globulómero Aß(1 – 42) a 1076 µl de PBST + 0,5 % de

55 BSA = 10 µg/ml -Añadir 50 µl a 10 µg/ml de la solución patrón del globulómero Aß(1 – 42) a 4950 µl de PBST + 0,5 % de BSA = 100 ng/ml

b) Monómero Aß(1 -42) tratado con HFIP

-Añadir 10 µl de la solución madre patrón del monómero Aß(1 – 42) pretratado con HFIP a 440 µl de PBST + 0,5 % de BSA = 10 µg/ml -Añadir 50 µl a 10 µg/ml de la solución patrón del monómero Aß(1 – 42) pretratado con HFIP a 4950 µl de PBST + 0,5 % de BSA = 100 ng/ml

65 c) Monómero Aß(1 -42) en NH4OH

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EJEMPLO III

UNIÓN DE 8F5 Y 8C5 A LAS FIBRILLAS Aß(1 -42)

5 Dado que el anticuerpo 8F5 se generó contra globulómeros solubles, se postuló la hipótesis de que 8F5 no debería unirse a la placa depositada o al material de fibrillas. Por tanto, la unión de 8F5 a suspensiones de fibrillas Aß polimerizadas se analizó como se ha descrito en el ejemplo siguiente.

-Preparación de las fibrillas Aß(1 -42):

1 mg de Aß(1 -42) (Bachem Inc., Nº Cat. H-1368) se disolvió en 500 µl de NH4OH al 0,1% acuoso (tubo Eppendorff) y la muestra se agitó durante 1 minuto a temperatura ambiente, seguido de 5 minutos de centrifugación a 10000 g. El sobrenadante se pipeteó en un nuevo tubo Eppendorff y se midió la concentración de Aß(1 -42) de acuerdo con el ensayo de concentración proteica de Bradford (procedimiento de ensayo BIO-RAD Inc.).

15 100 µl de esta solución de Aß(1 -42) recién preparada se neutralizaron con 300 µl de NaH2PO4 20 mM; NaCl 140 mM a pH 7,4, seguido de 2 % de HCl para ajustar el pH a 7,4. La muestra se incubó durante otras 20 horas a 37° C y se centrifugó (10 min, 10000 g). El sobrenadante se desechó y el sedimento de fibrillas se resuspendió con 400 µl de NaH2PO4 20 mM; NaCl 140 mM a pH 7,4 en 1 minuto de agitación en un mezclador de tipo Vortex, seguido de centrifugación (10 min, 10000 g). Después de desechar el sobrenadante, este procedimiento de resuspensión se repitió y la suspensión de fibrillas final se precipitó mediante otra centrifugación (10 min, 10000 g). El sobrenadante se desechó de nuevo y el sedimento de fibrillas se resuspendió con 380 µl de NaH2PO4 20 mM; NaCl 140 mM a pH 7,4 en 1 minuto de agitación en un mezclador de tipo Vortex. Los alícuotas de la muestra se almacenaron a -20ºC en un congelador.

25 80 µl de la suspensión de fibrillas se mezclaron con 320 µl de NaH2PO4 20 mM; NaCl 140 mM; 0,05 % de Tween 20 a pH 7,4, tampón y se agitaron durante 5 minutos a temperatura ambiente, seguido de sonicación (20 segundos). Después de la centrifugación (10 min, 10.000 g), el sedimento se resuspendió con 190 µl de NaH2PO4 20 mM; NaCl 140 mM; 0,05 % de Tween 20 a pH 7,4 en agitación en un mezclador de tipo Vortex.

-Unión de los anticuerpos a las fibrillas Aß(1 -42)

Alícuotas de 10 µl de esta suspensión de fibrillas se incubaron con:

35 a) 10 µl de Na Pi 20 mM; NaCl 140 mM; pH 7,4 b) 10 µl de 0,1 µg/µl de mMAb 6E10 Signet Inc. Nº de cat. 9320 en 20 mM c) NaH2PO4; NaCl 140 mM; pH 7,4 d) 10 µl de 0,1 µg/µl de mMAb 4G8 SignetInc. Nº de Cat. 9220 en Na Pi 20 mM; NaCl 140 mM; pH 7,4 e) 10 µl de 0,1 µg/µl de mMAb 8F5 (8C5) en Na Pi 20 mM; NaCl 140 mM; pH 7,4

Las muestras se incubaron durante 20 horas a 37ºC. Por último, las muestras se centrifugaron (10 minutos a 10.000 g). Los sobrenadantes que contienen la fracción del anticuerpo no unido se recogieron y mezclaron con 20 µl de tampón de muestra de SDS-PAGE. Las fracciones del sedimento se lavaron con 50 µl de NaH2PO4 20 mM; NaCl 140 mM a pH 7,4 tampón en 1 minuto en agitación en un mezclador de tipo Vortex, seguido de centrifugación (10

45 min, 10000 g). Los sedimentos finales se resuspendieron en 20 µl de Na Pi 20 mM, NaCl 140 mM, 0,025 % de Tween 20; pH 7,4 tampón y se resolvieron en 20 µl de tampón SDS PAGE.

- ANÁLISIS SDS-PAGE

Los sobrenadantes y las muestras de sedimentos resuspendidas se calentaron durante 5 minutos a 98ºC y se cargaron sobre un gel de Tris/Glicina 4 -20 % en las condiciones siguientes:

Tampón de muestra SDS: 0,3 g de SDS; 0,77 g de DTT; 4 ml de Tris/HCl 1M a pH 6,8; 8 ml de glicerol; 1 ml de 1 % de azul de bromofenol en etanol; añadir agua hasta 50 ml de 4 -20 % de Tris/Glicina Gel:Invitrogen

55 Inc., Nº EC6025BOX

Tampón de carrera: 7,5 g de Tris; 36 g de Glicina; 2,5 g de SDS; añadir agua hasta 2,51

El PAGE se efectuó a 20 mA. Los geles se tiñeron con azul de Coomassie R250.

Resultados:

La tinción con azul de Coomassie del SDS-PAGE indicó la presencia de cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos, predominantemente en e sobrenadante de la suspensión de fibrillas (Calle 7, figura 2), la suspensión de

65 fibrillas restantes mostró muy poco material de anticuerpos al mismo tiempo que mostraba una Abeta parcialmente despolimerizado a 4,5 kDa. En contraste con 8F5 and 8C5, otros anticuerpos anti-Aß no aparecieron en la fracción

soluble (6E10, calle 3, Figura 2) o solo parcialmente (4G8, Calle 5, Figura 2) en comparación con la fracción unidad de fibrillas (Calle 6, Figura 2).

La unión relativa del Abeta de tipo fibrillas se evaluó a partir del análisis SDS-PAGE midiendo los valores de la 5 densidad de reflexión de la cadena pesada de los anticuerpos en la fibrilla unida y las fracciones del sobrenadante y se calcularon de acuerdo con la fórmula siguiente.

Fracción de Ab unidos a fibrillas= DRfracción de fibrillas x 100%/(DRfracción de fibrillas + DRfracción sobrenadante)

10 Se obtuvieron los valores siguientes:

Anticuerpo

Fracción de Ab unidos a fibrillas

6E10

98 %

8F5

16 %

8C5

21 %

Estos datos indican una reducción significativa de 8F5 y 8C5 unidos en comparación con el anticuerpo estándar 6E10. 15 EJEMPLO IV

UNIÓN PREFERENCIAL DE LOS GLOBULÓMEROS Aß(1 -42) ENDÓGENOS EN COMPARACIÓN CON Aß(1 40)

20 En base al concepto de oligómero de Aß, es importante que los anticuerpos del oligómero anti-Aß también pueden demostrar una unión preferencial para los oligómeros Aß(1 -42) in vivo, en particular sobre Aß(1 -40) en pacientes con deterioro cognitivo leve y EA. E concepto de disminución de las especies de Aß(1 -42) sobre Aß(1 -40) se usa en un abordaje terapéutico para el tratamiento de la EA mediante AINE (Weggen et al., Nature 414, 212 -216

25 (2001)). Se supone que dichos AINE que disminuyen Aß(1 -42) en relación con Aß(1 -40) muestran la mejor eficacia en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. La proporción Aß(1 -42)/Aß(1 -40) es importante para una terapia selectiva, así como para fines diagnósticos.

Se realizó un análisis con muestras de LCR de pacientes con enfermedad de Alzheimer y pacientes con ICL. A partir

30 de los resultados mostrados en la Figura 3 y descritos más adelante, se puede concluir que 8F5 tiene una ventaja principal sobre los anticuerpos Aß como 6E10 porque 8F5 detecta una proporción más alta de Aß(1 -42) sobre Aß(1 -40) menos agregante. Esta ventaja permitirá diagnosticar más selectivamente y neutralizar los oligómeros de tipo Aß(1 -42) en pacientes con ICL y EA.

35 A) NIVELES DE AMILOIDE ß(1 -42) Y AMILOIDE ß(1 -40) ENDÓGENOS EN LCR DE PACIENTES CON ICL Y EA TRAS INMUNOPRECIPITACIÓN CON MAB 8F5 ANTI-Aß MURINO:

Inmovilización de mMAB anti-Aß frente a Sefarosa 4B activada por CNBr:

40 a) mMAb 6E10 Signet Inc., Nº de cat. 9320 b) mMAb 8F5

0,4 g de Sefarosa 4B activada con CNBr (Amersham Pharmacia Bio-tech AB, Uppsala, Suecia, Inc., Nº 17 -0430 01) se añadieron a 10 ml de HCl acuoso 1 mM y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. La 45 Sefarosa 4B activada con CNBr se lavó tres veces con 10 ml de HCl 1 mM y dos veces con 10 ml de NaHCO 100 mM; NaCl 500 mM a pH 8,3. Para cada uno de los anticuerpos inmovilizados, se añadieron 100 µl de la matriz de Sefarosa 4B activada con CNBr a 950 µl de ,5 mg/ml de solución de mMAb anti-Aß en NaHCO3 100 mM, NaCl 500 mM a pH 8,3. Tras 2 horas de agitación a temperatura ambiente, las muestras se centrifugaron durante 5 minutos a

10.000 g. Después se añadieron 500 µl de etanolamina 100 mM, NaHCO3 100 mM, NaCl 500 mM a pH 8,3, se

50 añadió tampón a las esferas y las muestras se agitaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las muestras de mMAb anti-Aß – Sefarosa se centrifugaron durante 5 minutos a 10.000 g y se lavaron 5 veces con 500 µl de NaH2PO4 20 mM, NaCl 140 mM a pH 7,4. Antes de almacenar a 6ºC, las muestras se estabilizaron añadiendo azida sódica hasta una concentración final del 0,02 %.

55 Inmunoprecipitación:

a) mMAb 6E10-Sefarosa b) mMAb 8F5 -Sefarosa

60

200 µl de muestras de líquido cefalorraquídeo se diluyeron con 2,00 µl de NaH2PO4NaH2P04 20 mM, NaCl 140 mM; 0,05 % de Tween 20 a pH 7,4. Estas muestras se añadieron a 2 µl de la matriz de sefarosa-mMAb anti-Aß y se agitaron durante 2 horas a temperatura ambiente. Las muestras se centrifugaron durante 5 minutos a 10.000 g. Los sobrenadantes se desecharon y mMAb anti-Aß –Sefarosa se lavaron dos veces con 50 µl de PBS, se agitaron

5 durante 1 minuto y se centrifugaron (5 minutos a 10.000 g). Los sobrenadantes se desecharon y las esferas de sefarosa se suspendieron en 50 µl de NaH2P04NaH2PO4 2 mM, NaCl 14 mM a pH7,4, seguido de 1 minuto de agitación a temperatura ambiente y 5 minutos de centrifugación a 10.000 g. En la siguiente etapa, las esferas de mMAb anti-Aß – sefarosa se trataron con 50 µl de 50 % de CH3CN, 0,2 % de TFA en agua. Tras 10 minutos de agitación a temperatura ambiente, las muestras se centrifugaron 5 minutos a 10.000 g. Los sobrenadantes se recogieron y transfirieron a tubos Eppendorf de 1,5 ml. Las muestras se mezclaron con 50 µl de agua y se evaporaron en un concentrador Speed Vac.

El sedimento se redisolvió en 4 µl de 70 % de HCOOH, se agitó durante 10 min a temperatura ambiente y se neutralizaron con 76 µl de solución Tris 1M y 720 µl de NaH2P04NaH2PO4 20 mM, NaCl 140 mM y 0,05 % de Tween

15 20 a pH 7,4.

Muestras para la determinación de las formas monoméricas Aß(1 -40); (1 -42) en LCR:

a) contenido de Aß en muestras de LCR sin inmunoprecipitación:

158 µl de LCR se diluyeron con 342 µl de NaH2PO4 20 mM; NaCl 140 mM; 0,05 % de Tween 20 a pH 7,4. Esta dilución a 1:3,16 se cogió para el ELISA de tipo sándwich y se tuvo en cuenta durante la evaluación.

b) contenido de Aß en muestras de LCR después de la inmunoprecipitación: 25 Las muestras del procedimiento mencionado anteriormente se cogieron para el análisis.

Protocolo de ELISA de tipo sándwich usado para la determinación de Aß(1 -40) en LCR

Lista de reactivos:

1.

F96 Cert. Maxisorp NUNC-Immuno Plate Nº cat.: 439454

2.

Anticuerpo de unión

Clon 6E10 de MAb anti-Aß; Signet Nº de cat. 9320; conc.: 0,4 mg/ml de Bradford (BioRad); almacenar a -20° 35 C

3.

Tampón de acoplamiento Hidrogenocarbonato de sodio 100 mM; pH 9,6

4.

Reactivo de bloqueo para ELISA; Roche Diagnostics GmbH Nº de cat.: 1112589

5.

tampón PBST NaH2PO4NaH2PO4 20 mM; NaCl 140 mM; 0,05 % de Tween 20; pH7,4

6.

Patrón de Aß(1 -40): Polvo sólido Aß(1 -40); Bachem Nº de cat.: H-1194; almacenar a -20° C

7.

Anticuerpo principal:

45 pAb anti-Aß(1 -40) de conejo; purificado por afinidad; solución en PBS conc.: 0,039 mg/ml; Signet Nº de cat. 9130 -005; almacenar a -20° C

8.

Reactivo indicador:

Conjugado POD-anti-conejo; Fa.Jackson ImmunoResearch Nº de cat. 111 -036 -045;

9.

Tinción:

10.

Solución de detención ácido sulfónico 2M

55 TMB; Roche Diagnostics GmbH Nº de cat.: 92817060; 42 mM en DMSO; 3 % de H2O2 en agua; acetato sódico 100 mM a pH 4,9

Protocolos usados para la preparación de reactivos:

1. Anticuerpo de unión:

El mAb 6E10 anti-Aß (Signet Inc, Nº de catálogo 9320) se diluye hasta una concentración final de 0,7 65 microg/ml.

2. Reactivo de bloqueo:

Para la preparación de la solución madre de bloqueo, el reactivo de bloqueo se disuelve en 100 ml de H2O y se almacena a -20° C en alícuotas de 10 ml cada una. 3 ml de la solución madre de bloqueo se diluyen con 5 27 ml de H2O para bloquear una placa de ELISA.

3. Monómero Aß(1 -40) para dilución patrón:

A) Madre patrón del monómero Aß(1 -40): Disolver 0,5 mg de Aß(1 -40) en 250 µl de NH4OH conc. al 0,1%:

10 2 mg/ml ; recién preparados; usar inmediatamente. B) Añadir 5 µl de la solución madre patrón del monómero Aß(1 – 40) a 995 µl de PBST = 10 µg/ml C) Añadir 5 µl de la solución patrón del monómero Aß(1 – 40) a 4995 µl de PBST = 10 ng/ml

Curva patrón: Nº Conc. final Madre PBST 1 2mlB 0ml 10000 pg/ml 2 0,633 ml (1) 1,367 ml 3160 pg/ml 3 0,633 ml (2) 1,367 ml 1000 pg/ml 4 0,633 ml (3) 1,367 ml 316 pg/ml 5 0,633 ml (4) 1,367 ml 100 pg/ml 6 0,633 ml (5) 1:367 ml 31,6 pg/ml 7 0,633 ml (6) 1,367 ml 10 pg/ml 8 0ml 2ml 0,0 pg/ml

15 Muestras:

IP : Muestras inmunoprecipitadas Nº de factor de dilución Muestra PBST 1 0,4 ml IP 0 ml directamente 2 0.ml (1) 0,4 ml

1:5 3 0,1 ml (2) 0,4 ml

1:25 4 0,1 ml (3) 0,4 ml

1:125

4. Anticuerpo principal:

20 Diluir el pAb anti-Aß(1 -40) concentrado en tampón PBST. El factor de dilución es 1/200 = 0,2 µg/ml. Usar inmediatamente.

5. Anticuerpo secundario:

25 El conjugado POD-anti-conejo liofilizado se disuelve en 0,5 ml de H2O y se mezclan con 500 µl de glicerol. Después, el anticuerpo concentrado se almacena a -20ºC en alícuotas de 100 µl. El concentrado se diluye a

1:10.000 en tampón PBST. La solución de anticuerpo se usa inmediatamente.

30 6. Solución TMB:

20 ml de acetato sódico 100 mM a pH 4,9 se mezclan con 200 µl de la solución de TMB y 29,5 µl de solución peróxido al 3 %. Esta solución se usa inmediatamente.

35

Organización de una placa de muestras (Obsérvese que todos los patrones y muestras se realizan por duplicado).

1 2 3456789101112 A 10000 10000 U1 U1 B 3160 3160 U2 U2 C 1000 1000 U3 U3 D 316 316 U4 U4 E 100 100 U5 U5 F 31,6 31,6 U6 U6 G 10 10 U7U7 H 0,0 0,0 U8 U8 U1-U# = Muestras desconocidas

Procedimiento usado:

5 1. Aplicar 100 µl de la solución del anticuerpo de unión por pocillo e incubar durante la noche a 4ºC.

2.

Desechar la solución del anticuerpo y lavar los pocillos con 250 µl de tampón PBST tres veces.

3.

Añadir 260 µl de la solución de bloqueo por pocillo e incubar 2 horas a temperatura ambiente.

4.

Desechar la solución de bloqueo y lavar los pocillos con 250 µl de tampón PBST tres veces.

5.

Después de la preparación de los patrones y las muestras, aplicar 100 µl por pocillo de los patrones y las 10 muestras a la placa e incubar durante 2 horas a temperatura ambiente y durante la noche a 4 ºC.

6.

Desechar la solución patrón/muestra y lavar los pocillos con 250 µl de tampón PBST tres veces.

7.

Añadir 200 µl de la solución de anticuerpo principal por pocillo e incubar 1,5 horas a temperatura ambiente.

8.

Desechar la solución del anticuerpo y lavar los pocillos con 250 µl de tampón PBST tres veces.

9.

Añadir 200 µl de la solución marcadora por pocillo e incubar 1 horas a temperatura ambiente. 15 10. Desechar la solución marcador y lavar los pocillos con 250 µl de tampón PBST tres veces.

11.

Añadir 100 de la solución de TMB a cada pocillo e incubar a temperatura ambiente (5-15 minutos).

12.

Observar la tinción y aplicar 50 µl de la solución de detención por pocillo.

13.

Leer a 450 nm.

14. Calcular los resultados a partir de la curva estándar. 20 15. Evaluación:

Si la extinción de muestras desconocidas no está en el intervalo de linealidad de la curva de calibración, repetir el ELISA con la dilución de la muestra adecuada.

25 Protocolo de ELISA de tipo sándwich usado para la determinación de la forma monomérica Aß(1 -42) en LCR

Lista de reactivos:

1. F96 Cert. Maxisorp NUNC-Immuno Plate Nº cat.: 439454

30 2. Anticuerpo de unión Clon 6E10 de MAb anti-Aß; Signet Nº de cat. 9320; conc.: 0,4 mg/ml de Bradford (BioRad); almacenar a -20° C

3.

Tampón de recubrimiento Hidrogenocarbonato de sodio 100 mM; pH 9,6

4.

Reactivo de bloqueo para ELISA; Roche Diagnostics GmbH Nº de cat.: 1112589

35 5. Tampón PBST: NaH2PO4NaH2PO4 20 mM; NaCl 140 mM; 0,05 % de Tween 20; pH7,4

6. Patrón de Aß(1 -42)

Polvo sólido Aß(1 -42); Bachem Nº de cat.: H-1368; almacenar a --20° C 40

7. Anticuerpo principal:

pAb anti-Aß(1 -42) de conejo; purificado por afinidad; biotinilado; solución en PBS co 50% de glicerol conc.: 0,25 mg/ml; Signet Nº de cat. 9137 -005; almacenar a -20° C 45

8. Reactivo indicador:

Conjugado POD-anti-conejo; Fa. Jackson ImmunoResearch Nº de cat.: 111 -036 -045

50 9. Tinción:

TMB; Roche Diagnostics GmbH Nº de cat.: No.: 92817060; 42 mM en DMSO 3 % de H2O2 en agua

55 Acetato sódico 100 mM, pH 4,9Solución de terminación: Ácido sulfónico 2M

imagen20

Diluir el pAb anti-Aß(1 -42) concentrado en tampón PBST. El factor de dilución es 1/1250 = 0,2 µg/ml. Usar inmediatamente.

5 2. Reactivo indicador:

Reconstituir el conjugado de POD anti-conejo liofilizado en 0,5 ml de agua. Añadir 500 µl de glicerol y almacenar los alícuotas de 100 µl a -20° C para su uso posterior. Diluir el reactivo marcador concentrado en tampón PBST. El factor de dilución es 1/5000. Usar

10 inmediatamente.

3. Solución TMB: Mezclar 20 ml de acetato sódico 100 mM a pH 4,9 con 200 µl de la solución de TMB y 29,5 µl de solución

15 peróxido al 3 %. Usar inmediatamente. Organización de una placa de muestras (Obsérvese que todos los patrones y muestras se realizan por duplicado).

1

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

10000 10000 U1 U1

B

3160 3160 U2 U2

C

1000 1000 U3 U3

D

316 316 U4 U4

E

100 100 U5 U5

F

31,6 31,6 U6 U6

G

10 10 U7 U7

H

0,0 0,0 U8 U8

U1-U# = Muestras desconocidas

Procedimiento usado: 20

1.

Aplicar 100 µl de la solución del anticuerpo de unión por pocillo e incubar durante la noche a 4ºC.

2.

Desechar la solución del anticuerpo y lavar los pocillos con 250 µl de tampón PBST tres veces.

3.

Añadir 260 µl de la solución de bloqueo por pocillo e incubar 2 horas a temperatura ambiente.

4.

Desechar la solución de bloqueo y lavar los pocillos con 250 µl de tampón PBST tres veces.

25 5. Después de la preparación de patrones y muestras, aplicar 100 µl por pocillo de los patrones a la placa. Incubar 2 horas a temperatura ambiente y durante la noche a 4ºC.

6.

Desechar la solución patrón/muestra y lavar los pocillos con 250 µl de tampón PBST tres veces.

7.

Añadir 200 µl de la solución de anticuerpo principal por pocillo e incubar 1,5 horas a temperatura ambiente.

8.

Desechar la solución del anticuerpo y lavar los pocillos con 250 µl de tampón PBST tres veces.

30 9. Añadir 200 µl de la solución marcadora por pocillo e incubar 1 horas a temperatura ambiente.

10.

Desechar la solución marcador y lavar los pocillos con 250 µl de tampón PBST tres veces.

11.

Añadir 100 µl de la solución de TMB a cada pocillo e incubar a temperatura ambiente (5-15 minutos).

12.

Observar la tinción de color y aplicar 50 µl de la solución de detención por pocillo.

13. Leer a 450 nm. 35 14. Calcular los resultados a partir de la curva estándar.

15. Evaluación:

Si la extinción de muestras desconocidas no está en el intervalo de linealidad de la curva de calibración, repetir el ELISA con la dilución de la muestra adecuada. 40 RESULTADOS:

ELISA de Aß40 (Signet) ELISA de Aß42 (Signet) AßA2/40 Muestras de ICL (n= 4) Aß(1 -40) SEM Aß(1 -42) SEM Sin IP 11678,9 2879,4 1242,0 353,5 7,84 % 6E10 IP 8282,4 2185,7 2035,1 280,9 17,35 % 8F5 IP 8586,1 2396,8 2654,6 411,4 20,95 % Muestras de EA (n=2) Aß(1 -40) SEM Aß(1 -42) SEM Sin IP 7297,5 1464,5 843,0 157,5 10,95 % 6E10 IP 5610,2 28,3 1453,0 14,5 20,57 % 8F5 IP 4133,9 86,9 1670,2 12,3 28,78 %

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Claims (1)

1. imagen1

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