RS63237B1 - Terminalno modifikovana rnk - Google Patents

Description

Opis

UNAKRSNA REFERENCA NA POVEZANE PATENTNE PRIJAVE

[0001] Ova patentna prijava zahteva pravo prvenstva u odnosu na SAD privremenu patentnu prijavu br. 61/729,933, podnetu 26. novembra 2012., pod naslovom Terminally Optimized Modified RNAs, SAD privremenu patentnu prijavu br.61/737,224, podnetu 14. decembra 2012., pod naslovom Terminally Optimized Modified RNAs, SAD privremenu patentnu prijavu br.

61/758,921, podnetu 31. januara 2013., pod naslovom Differential Targeting Using RNA Constructs, SAD privremenu patentnu prijavu br. 61/781,139, podnetu 14. marta 2013., pod naslovom Differential Targeting Using RNA Constructs, SAD privremenu patentnu prijavu br.

61/829,359, podnetu 31. maja 2013., pod naslovom Differential Targeting Using RNA Constructs, SAD privremenu patentnu prijavu br. 61/839,903, podnetu 27. juna 2013., pod naslovom Differential Targeting Using RNA Constructs, SAD privremenu patentnu prijavu br.61/842,709, podnetu 3. jula 2013., pod naslovom Differential Targeting Using RNA Constructs, SAD privremenu patentnu prijavu br. 61/857,436, podnetu 23. jula 2013., pod naslovom Differential Targeting Using RNA Constructs, SAD privremenu patentnu prijavu br. 61/775,509, podnetu 9. marta 2013., pod naslovom Heterologous Untranslated Regions for mRNA i SAD privremenu patentnu prijavu br. 61/829,372, podnetu 31. maja 2013., pod naslovom Heterologous Untranslated Regions for mRNA.

REFERENCA NA POPIS SEKVENCI

[0002] Predmetna patentna prijava se podnosi zajedno sa popisom sekvenci u elektronskom formatu. Popis sekvenci je obezbeđen u vidu dokumenta pod naslovom M39PCT2.txt koji je kreiran 1. oktobra 2013. i čija veličina iznosi 3,262,934 bajta.

OBLAST PRONALASKA

[0003] Pronalazak se odnosi na kompozicije i postupke za proizvodnju i upotrebu optimizovane mRNA i njenu upotrebu u kombinaciji sa jednom ili više modifikovanih ili prirodnih mRNA koje kodiraju RNK-vezujući protein.

OSNOV PRONALASKA

[0004] RNK molekuli koji se javljaju u prirodi sintetišu se od četiri osnovna ribonukleotida: ATP, CTP, UTP i GTP, ali mogu da sadrže i post-transkripciono modifikovane nukleotide. Dodatno, u RNK je identifikovana približno jedna stotina različitih nukleozidnih modifikacija (Rozenski, J, Crain, P, i McCloskey, J. (1999). The RNA Modification Database: 1999 update. Nucl Acids Res 27: 196-197).

[0005] U vezi sa prethodnim metodologijama kojima se utiče na ekspresiju proteina postoje brojni problemi. Na primer, heterologu dezoksiribonukleinsku kiselinu (DNK) koja se uvodi u ćeliju, mogu da naslede ćerke-ćelije (bez obzira na to da li se heterologa DNK integrisala u hromozom) ili potomci. Uvedena DNK može da se integriše u genomsku DNK ćelije-domaćina sa određenom učestalošću, što dovodi do izmena i/ili oštećenja genomske DNK ćelije-domaćina. Osim toga, neophodno je da se desi više koraka pre nego što se protein napravi. Kada je već ušla u ćeliju, DNK mora da se transportuje u nukleus gde se transkribuje u RNK. RNK transkribovana sa DNK mora zatim da uđe u citoplazmu gde se translatira u protein. Usled toga što su neophodni višestruki koraci obrade, javlja se odlaganje pre nego što se generiše protein od interesa. Dalje, u ćelijama se teško postiže ekspresija DNK; često DNK uđe u ćelije, ali se ne eksprimira ili se ne eksprimira brzinom ili u koncentraciji koja ima smisla. Ovo naročito može da predstavlja problem kada se DNK uvodi u ćelije kao što su primarne ćelije ili modifikovane ćelijske linije. Uloga nukleozidnih modifikacija u imuno-stimulatornom potencijalu, stabilnosti i translacionoj efikasnosti RNK, i njene posledične prednosti za poboljšanje ekspresije proteina i proizvodnju terapeutika, već su ispitivane. Ove studije su detaljno navedene u objavljenoj međunarodnoj objavi br. WO2012019168 podnetoj 5. avgusta 2011., međunarodnoj objavi br. WO2012045082 podnetoj 3. oktobra 2011., međunarodnoj objavi br. WO2012045075 podnetoj 3. oktobra 2011., međunarodnoj objavi br. WO2013052523 podnetoj 3. oktobra 2012., i međunarodnoj objavi br. WO2013090648 podnetoj 14. decembra 2012., istog podnosioca.

[0006] Upotreba modifikovanih polinukleotida ispitivana je u oblasti antitela, virusa i veterinarskih primena i nizu različitih in vivo sistema i prikazana u, na primer, međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/US2013/030062, podnetoj 9. marta 2013., pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Biologics and Proteins Associated with Human Disease; SAD patentnoj prijavi 13/791,922, podnetoj 9. marta 2013., pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Biologics and Proteins Associated with Human Disease; međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/US2013/030063, podnetoj 9. marta 2013., pod naslovom Modified Polynucleotides; međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/US2013/030064, pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Secreted Proteins; SAD patentnoj prijavi br.13/791,921, podnetoj 9. marta 2013., pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Secreted Proteins; međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/US2013/030059, podnetoj 9. marta 2013., pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Membrane Proteins; međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/US2013/030066, podnetoj 9. marta 2013., pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Cytoplasmic and Cytoskeletal Proteins; međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/US2013/030067, podnetoj 9. marta 2013., pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Nuclear Proteins; međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/US2013/030060, podnetoj 9. marta 2013., pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Proteins; međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/US2013/030061, podnetoj 9. marta 2013., pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease; SAD patentnoj prijavi br. 13/791,910, podnetoj 9. marta 2013., pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease; međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/US2013/030068, podnetoj 9. marta 2013., pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Cosmetic Proteins and Peptides; i međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/US2013/030070, podnetoj 9. marta 2013., pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Oncology-Related Proteins and Peptides; međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/US2013/031821, podnetoj 15. marta 2013., pod naslovom In Vivo Production of Proteins.

[0007] Formulacije i isporučivanje modifikovanih polinukleotida je opisano u, na primer, nerešenoj međunarodnoj objavi br. WO2013090648, istog podnosioca, podnetoj 14. decembra 2012., pod naslovom Modified Nucleoside, Nucleotide, Nucleic Acid Compositions i u SAD objavi br. US20130156849, podnetoj 14. decembra 2012., pod naslovom Modified Nucleoside, Nucleotide, Nucleic Acid Compositions.

[0008] WO 2011/012316 A2 se odnosi na poliribonukleotid sa sekvencom koja kodira protein ili proteinski fragment, pri čemu poliribonukleotid sadrži kombinaciju nemodifikovanih i modifikovanih nukleotida, gde 5 do 50% uridinskih nukleotida i 5 do 50% citidinskih nukleotida predstavlja modifikovane uridinske nukleotide ili modifikovane citidinske nukleotide.

[0009] U stanju tehnike, dakle, postoji potreba za biološkim modalitetima koji bi rešili modulaciju intracelularne translacije nukleinskih kiselina. Predmetni prikaz rešava ovu potrebu tako što obezbeđuje postupke i kompozicije za proizvodnju i optimizaciju modifikovanih molekula mRNA putem izmene terminalne arhitekture molekula.

KRATAK PREGLED PRONALASKA

[0010] Predmetni pronalazak obezbeđuje formulaciju lipidnih nanočestica mRNA za ciljanu ekspresiju polipeptida od interesa u specifičnim tipovima ćelija, pri čemu navedena mRNA sadrži 5' netranslatiran region, region povezanih nukleozida koji kodiraju polipeptid od interesa, 3' netranslatirani region koji sadrži najmanje jedno mesto vezivanja microRNA za microRNA eksprimiranu u specifičnom tipu ćelija, tako da ekspresija mRNA može da bude smajena, pri čemu mRNA predstavlja ciljni molekul koji podleže degradaciji ili smanjenju translacije u prisustvu microRNA, 3' repni region povezanih nukleozida, pri čemu je uracil ili uridin u mRNA zamenjen i do 100% modifikovanim uracilom, ili modifikovanim uridinom, redom.

[0011] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje formulaciju lipidnih nanočestica mRNA prema predmetnom pronalasku za upotrebu u terapeutskom postupku u kome se ekspresija mRNA usmerava u specifične tipove ciljnih ćelija.

[0012] Drugi aspekti pronalaska su obezbeđeni u patentnim zahtevima.

[0013] U ovom tekstu su prikazani postupci za stabilizaciju ili indukciju povećane ekspresije proteina na osnovu modifikovane mRNA. U drugom postupku, ćelija se dovodi u kontakt sa modifikovanom mRNA koja kodira polipetid od interesa u kombinaciji sa modifikovanom mRNA koja kodira jedan ili više RNK-vezujućih proteina.

[0014] U jednom slučaju, ovde su obezbeđene terminalno optimizovane mRNA koje sadrže prvi region povezanih nukleozida koji kodira polipeptid od interesa koji je lociran 5' u odnosu na prvi region, drugi terminalni region lociran 3' u odnosu na prvi terminalni region i 3'repni region. Prvi terminalni region može da sadrži najmanje jedan enhanserski element translacije (TEE) kao što su, ali ne i ograničeno na, TEE elementi opisani u tabeli 28 kao što su, ali ne i ograničeno na, TEE-001 - TEE-705.

[0015] Prvi terminalni region može da sadrži 5'netranslatirani region (UTR) koji može da bude nativni 5'UTR kodiranog polipeptida od interesa ili može da bude heterolog kodiranog polipeptida od interesa. U jednom aspektu, 5'UTR može da sadrži najmanje jednu sekvencu za inicijaciju translacije kao što je kozak sekvenca, unutrašnje mesto za ulazak u ribozom (IRES) i/ili njegov fragment. Kao neograničavajući primer, 5’UTR može da sadrži najmanje jedan fragment IRES regiona. Kao drugi neograničavajući primer, 5’UTR može da sadrži najmanje 5 fragmenata IRES regiona. U drugom aspektu, 5’UTR može da sadrži trukturirani UTR.

[0016] Drugi terminalni region može da sadrži najmanje jedno mesto za vezivanje microRNA, seme sekvencu ili mesto za vezivanje microRNA bez seme sekvence. U jednom aspektu, microRNA je microRNA specifična za imunske ćelije, ali nije ograničena na, mir-122, miR-142-3p, miR-142-5p, miR-146a i miR-146b.

[0017] U jednom slučaju, 3'repni region može da sadrži nukleoid za terminaciju lanca kao što je, ali ne i ograničeno na, 3'-dezoksiadenozin (kordicepin), 3'-dezoksiuridin, 3'-dezoksicitozin, 3'-dezoksiguanozin, 3'-dezoksitimin, 2',3'-didezoksinukleozide, 2',3'- didezoksiadenozin, 2',3'-didezoksiuridin, 2',3'-didezoksicitozin, 2',3'- didezoksiguanozin, 2',3'-didezoksitimin, 2'-dezoksinukleozid, i -0- metilnukleozid. U jednom aspektu, 3' repni region je drška petlja sekvenca ili poliA rep.

[0018] U jednom slučaju, ovde su obezbeđene terminalno optimizovane mRNA koje sadrže povezanih nukleozida koji kodira polipeptid od interesa koji je lociran 5' u odnosu na prvi region, drugi terminalni region lociran 3' u odnosu na prvi terminalni region i 3'repni region povezanih nukleozida i najmanje jedan nukleozid za terminaciju lanca lociran 3' u odnosu na terminalno optimizovanu mRNA. U jednom aspektu, drugi terminalni region može da sadrži najmanje jedno microRNA vezujuće mesto, seme sekvencu ili microRNA vezujuće mesto bez seme sekvence. U jednom aspektu, microRNA je microRNA specifična za imunske ćelije kao što je, ali ne i ograničeno na, mir-122, miR-142-3p, miR-142-5p, miR-146a i miR-146b.

[0019] Ovde opisana terminalno optimizovana mRNA može da sadrži najmanje jedan modifikovani nukleozid. U jednom slučaju, terminalno optimizovana mRNA sadrži pseudouridinski analog kao što je, ali ne i ograničeno na, 1-karboksimetil-pseudouridin, 1 -propinil-pseudouridin, 1-taurinometil-pseudouridin, 1-taurinometil-4-tio-pseudouridin, 1-metilpseudouridin (m<1>ψ), 1-metil-4-tio-pseudouridin (m<1>s<4>ψ), 4-tio-1-metil-pseudouridin, 3-metilpseudouridin (m<3>ψ), 2-tio-1-metil-pseudouridin, 1-metil-1-deaza-pseudouridin, 2-tio-1-metil-1-deaza-pseudouridin, dihidropseudouridin, 2-tio-dihidropseudouridin, 2-metoksiuridin, 2-metoksi-4-tio-uridin, 4-metoksi-pseudouridin, 4-metoksi-2-tio-pseudouridin, N1-metil-pseudouridin, 1-metil-3-(3-amino-3-karboksipropil)pseudouridin(acp<3>ψ), i 2'-0-metil-pseudouridin (ψm). U drugom slučaju, terminalno optimizovana mRNA sadrži pseudouridinski analog, 1-metilpseudouridin. U još jednom slučaju, terminalno optimizovana mRNA sadrži pseudouridinski analog, 1-metilpseudouridin i sadrži modifikovani nukleozid 5-metilcitidin.

[0020] Ovde opisana terminalno optimizovana mRNA može da sadrži najmanje jednu strukturu 5' kape, kao što je, ali ne i ograničeno na, Cap0, Cap1, ARCA, inozin, N1-metil-guanozin, 2'fluoroguanozin, 7-deaza-guanozin, 8-okso-guanozin, 2-amino-guanozin, LNA-guanozin, 2-azidoguanozin, Cap2, Cap4, i CAP-003-CAP-225.

[0021] U jednom aspektu, najmanje jedan region terminalno optimizovane mRNA može da bude sa optimizovanim kodonima. Kao neograničavajući primer, prvi region povezanih nukleozida može da bude sa optimizovanim kodonima.

[0022] Ovde su takođe obezbeđeni postupci za upotrebu terminalno optimizovanih mRNA.

[0023] U jednom slučaju, obezbeđen je postupak za smanjenje antigenom posredovanog imunskog odgovora u nekom organizmu, na taj način što se organizam dovodi u kontakt sa terminalno optimizovanom mRNA. Terminalno optimizovana mRNA može da sadrži prvi region povezanih nukleozida koji kodira polipeptid od interesa koji je lociran 5' u odnosu na prvi region, drugi terminalni region lociran 3' u odnosu na prvi terminalni region i 3'repni region. Drugi terminalni region može da sadrži najmanje jedno microRNA vezujuće mesto, seme sekvencu ili microRNA vezujuće mesto bez seme sekvence. U jednom aspektu, microRNA je microRNA specifična za imunske ćelije kao što je, ali ne i ograničeno na, mir-122, miR-142-3p, miR-142-5p, miR-146a i miR-146b.

[0024] U drugom slučaju, terminalno optimizovana mRNA koja smanjuje antigenom posredovani imunski odgovor može da sadrži najmanje jednu sekvencu enhenserskog elementa translacije (TEE) kao što je, ali ne i ograničeno na, TEE-001 - TEE 705, nukleozid za terminaciju lanca i/ili drška petlja sekvencu.

[0025] U još jednom slučaju, terminalno optimizovana mRNA koja smanjuje antigenom posredovani imunski odgovor može da sadrži najmanje jedan region koji je sa opitimizovanim kodonima. Kao neograničavajući primer, prvi region povezanih nukleozida može da bude sa optimizovanim kodonima.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0026]

SL. 1 je šema primarnog konstrukta prema predmetnom prikazu.

SL. 2 je raširena šema drugog oivičavajućeg regiona primarnog konstrukta prema predmetnom prikazu koja ilustruje senzorske elemente polinukleotida.

SL. 3 mapa klona koja je korisna u predmetnom prikazu.

SL. 4 je histogram koji prikazuje poboljšanu proizvodnju proteina na osnovu modifikovanih mRNA prema predmetnom prikazu, koje imaju progresivno duže poliA-repove, u dve koncentracije.

DETALJAN OPIS

[0027] Ovde su opisane kompozicije i postupci za proizvodnju i optimizaciju modifikovanih molekula mRNA putem izmena terminalne arkitekture molekula. Specifično su prikazani postupci za povećanje proizvodnje proteina putem izmena terminalnih regiona mRNA. Ovi terminalni regioni uključuju najmanje 5'netranslatirani region (UTR) i 3'UTR. Druga svojstva koja mogu da se modifikuju i da se nađu 5' ili 3' u odnosu na kodirajući region uključuju 5' kapu i poli-A rep modifikovanih mRNK (modifikovani RNK molekuli).

[0028] U principu, egzogene nukleinske kiseline, naročito virusne nukleinske kiseline, kada se uvedu u ćeliju, indukuju urođeni imunski odgovor koji dovodi do proizvodnje interferona (IFN) i ćelijske smrti. Međutim, od velikog je interesa za terpeutike, dijagnostiku, reagense i za biološke testove, da se nukleinska kiselina npr., ribonukleinska kiselina (RNK) isporuči unutar ćelije, bilo in vivo ili ex vivo, tako da dovede do unutarćelijske translacije nukleinske kiseline i proizvodnje kodiranog proteina. Od naročitog značaja je isporučivanje i funkcionisanje neintegrativne nukleinske kiseline, pošto je nukleinska kiselina koja se odlikuje integracijom u ciljnu ćeliju generalno neprecizna po svom nivou ekspresije, može oštećujuće da se prenosi na ćelije potomke i susedne ćelije, i nosi sa sobom značajan rizik od mutacija.

[0029] Terminalne modifikacije opisane u ovom tekstu mogu da se koriste u modifikovanim nukleinskim kiselinama koje kodiraju polipeptide od interesa, kao što su, ali ne i ograničeno na, polipeptidi od interesa opisani u SAD patentnoj prijavi br.61/618,953, podnetoj 2. aprila 2012., pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease, SAD patentnoj prijavi br. 61/681,704, podnetoj 10. avgusta 2012., pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease, SAD patentnoj prijavi br. 61/737,203, podnetoj 14. decembra 2012., pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease, međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/US2013/030062, podnetoj 9. marta 2013., pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Biologics and Proteins Associated with Human Disease; međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/US2013/030063, podnetoj 9. marta 2013., pod naslovom Modified Polynucloetides; međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/US2013/030064, pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Secreted Proteins; međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/US2013/030059, podnetoj 9. marta 2013., pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Membrane Proteins; međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/US2013/030066, podnetoj 9. marta 2013., pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Cytoplasmic and Cytoskeletal Proteins; međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/US2013/030067, podnetoj 9. marta 2013., pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Nuclear Proteins; međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/US2013/030060, podnetoj 9. marta 2013., pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Proteins; međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/US2013/030061, podnetoj 9. marta 2013., pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease; međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/US2013/030068, podnetoj 9. marta 2013., pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Cosmetic Proteins and Peptides; Međunarodnoj prijavi br.PCT/US2013/030070, podnetoj 9. marta 2013., pod naslovom Modifi Polynucleotides for the Production of Oncology-Related Proteins and Peptides; i međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/US2013/031821, podnetoj 15. marta 2013., pod naslovom In Vivo Production of Proteins, SAD privremenoj patentnoj prijavi br. 61/729,933, podnetoj 26. novembra 2012., pod naslovom Terminally Optimized Modified RNAs, SAD privremenoj patentnoj prijavi br. 61/737,224, podnetoj 14. decembra 2012., pod naslovom Terminally Optimized Modified RNAs, SAD privremenoj patentnoj prijavi br. US 61/758,921, podnetoj 31. januara 2013., pod naslovom Differential Targeting Using RNA Constructs, SAD privremenoj patentnoj prijavi US 61/781,139, podnetoj 14. marta 2013., pod naslovom Differential Targeting Using RNA Constructs, SAD privremenoj patentnoj prijavi 61/829,359, podnetoj 31. maja 2013., pod naslovom Differential Targeting Using RNA Constructs.

[0030] Ovde su delom obezbeđeni molekuli nukleinskih kiselina koji kodiraju polipeptide koji mogu da moduliraju status, funkciju i/ili aktivnost ćelije, i postupci za pravljenje i upotrebu ovih nukleinskih kiselina i polipeptida. Kao što je opisano ovde, i u i objavi međunarodne prijave br. WO2012019168, podnetoj 5. avgusta 2011., objavi međunarodne prijave br. WO2012045082, podnetoj 3. oktobra 2011., objavi međunarodne prijave br. WO2012045075 podnetoj 3. oktobra 2011., objavi međunarodne prijave br. WO2013052523 podnetoj 3. oktobra 2012., i objavi međunarodne prijave br. WO2013090648 podnetoj 14. decembra 2012., ovi modifikovani molekuli nukleinskih kiselina u stanju su da smanjuju urođenu imunsku aktivnost populacije ćelija u koje su uvedeni, čime se povećava efikasnost proizvodnje proteina u toj ćelijskoj populaciji.

[0031] Pored upotrebe neprirodnih nukleozida i nukleotida, kao što su nukleozidi i nukleotidi opisani u objavi SAD patenta br US20130115272, podnetoj 3. oktobra 2012., u modifikovanim molekulima RNK prema predmetnom prikazu, sada je otkriveno da istovremena upotreba izmenjene terminalne arhitekture takođe može da služi i da se proizvodnja proteina iz ćelijske populacije poveća.

I. Kompozicije prema prikazu

[0032] Ovaj prikaz obezbeđuje molekule nukleinske kiseline, uključujući RNK molekule kao što su molekuli mRNA, koji mogu da budu sintetički, a koji sadrže jedan ili više modifikovanih nukeozida (označeni kao "modifikovane nukleinske kiseline" ili "molekuli modifikovanih nukleinskih kiselina") i polinukleotida, primarne konstrukte i modifikovanu mRNA (mmRNA), koji imaju korisna svojstva uključujući odsustvo značajne indukcije urođenog imunskog odgovora ćelije u koju se mRNA uvodi. Zbog toga što ove modifikovane nukleinske kiseline imaju poboljšanu efikasnost proizvodnje proteina, unutarćelijsko zadržavanje nukleinskih kiselina i vijabilnost ćelija sa kojima dolaze u kontakt, a takođe imaju i smanjenu imunogenost, nukleinske kiseline koje imaju ova svojstva označene su u ovom dokumentu kao "poboljšane" nukleinske kiseline ili modifikovani RNK molekuli.

[0033] U jednom slučaju, polinukleotidi su transkripti nukleinskih kiselina koji kodiraju jedan ili više polipeptida od interesa koji, kada se translatiraju, isporučuju ćeliji signal koji dovodi do terapeutske koristi za organizam. Signalni polinukleotidi mogu dalje izborno da sadrže sekvencu (translatabilnu ili ne) koja registruje mikrookolinu polinukleotida i menja (a) ishodnu funkciju ili fenotip povezan sa peptidom ili proteinom koji se translatira, (b) nivo ekspresije signalnog polinukleotida, i/ili i jedno i drugo.

[0034] Termin "nukleinska kiselina", u svom najširem smislu, uključuje bilo koje jedinjenje i/ili supstancu koja sadrži polimer nukleotida. Ovi polimeri se često označavaju kao polinukleotidi.

[0035] Tipične nukleinske kiseline uključuju ribonukleinske kiseline (RNK), dezoksiribonukelinske kiseline (DNK), treozne nukleinske kiseline (TNA), glikolne nukleinske kiseline (GNA), peptidne nukleinske kiseline (PNAs), zaključane nukleinske kiseline (LNA) ili njihove hibride. One takođe mogu da uključuju RNAi indukujuće agense, RNAi agense, siRNA, shRNA, miRNA, antisens RNK, ribozime, katalitičku DNK, tRNA, RNK koje indukuju formiranje trostrukog heliksa, aptamere, vektore, itd. U poželjnim slučajevima, molekul modifikovane nukleinske kiseline je jedan ili više molekula informacione RNK (mRNA molekuli).

[0036] U poželjnim slučajevima, polinukleotid ili molekul nukleinske kiseline je informaciona RNK (mRNA). Kako se ovde koristi, termin "informaciona RNK" (mRNA) odnosi se na bilo koji polinukleotid koji kodira polipeptid od interesa i koji može da se translatira kako bi proizveo kodirani polipeptid od interesa in vitro, in vivo, in situ ili ex vivo. Polinukleotidi prema prikazu mogu da budu molekuli mRNA ili bilo koje nukleinske kiseline i mogu, ali ne moraju, da budu hemijski modifikovani.

[0037] Tradicionalno, osnovne komponente mRNA molekula uključuju najmanje kodirajući region, 5'UTR, 3'UTR, 5' kapu i poli-A rep. Polazeći od ove prirodne modularne strukture, predmetni prikaz proširuje obim funkcionalnosti tradicionalnih molekula mRNA tako što obezbeđuje polinukleotide ili primarne RNK konstrukte koji zadržavaju modularnu organizaciju, ali koji sadrže jednu ili više strukturnih i/ili hemijskih modifikacija ili izmena koje polinukleotidima daju korisna svojstva, uključujući, u nekim slučajevima, odsustvo značajne indukcije urođenog imunskog odgovora ćelije u koju se polinukleotid uvodi. U tom smislu, modifikovani molekuli mRNA, prema predmetnom prikazu, koji mogu da budu sintetički,

1

označavaju se "mmRNA." Kako se ovde koristi, "strukturno" svojstvo ili modifikacija je ono svojstvo ili modifikacija kod kojih su dva ili više povezanih nukleotida inserirani, deletirani, duplicirani, invertovani ili randomizirani u sintetičkom polinukleotidu, primarnom konstruktu ili u mmRNA bez značajne hemijske modifikacije samih nukleotida. Budući da će hemijske veze nužno biti prekinute i ponovo formirane kako bi se izvršile strukturne modifikacije, strukturne modifikacije su hemijske prirode i stoga predstavljaju hemijske modifikacije. Međutim, strukturne modifikacije će za rezultat imati različitu sekvencu nukleotida. Na primer, polinukleotid "ATCG" može da bude hemijski modifikovan u "AT-5meC-G". Isti polinukleotid može strukturno da se modifikuje iz "ATCG" u "ATCCCG". Ovde je inseriran dinukleotid "CC", što za rezultat ima strukturnu modifikaciju polinukleotida.

[0038] Obezbeđene su modifikovane nukleinske kiseline koje sadrže translatabilni region i jednu, dve ili više od dve različite modifikacije nukleozida. U nekim slučajevima, modifikovana nukleinska kiselina pokazuje smanjenje degradacije u ćeliji u kojoj je nukleinska kiselina uvedena, u odnosu na odgovarajuću nemodifikovanu nukleinsku kiselinu.

[0039] U nekim slučajevima, hemijske modifikacije mogu da budu locirane na šećernoj komponenti nukleotida.

[0040] U nekim slučajevima, hemijske modifikacije mogu da budu locirane na fosfatnom osnovnom lancu nukleotida.

[0041] U nekim slučajevima je poželjno da se modifikovana nukleinska kiselina uvedena u ćeliju degraduje unutar ćelije, na primer, ukoliko je poželjna proizvodnja proteina u precizno određenom trenutku. Dakle, prikaz obezbeđuje modifikovanu nukleinsku kiselinu koja sadrži degradacioni domen na koji je unutar ćelije moguće delovatni direktno.

Arhitektura polinukleotida, primarnog konstrukta ili mmRNA

[0042] Polinukleotidi prema predmetnom prikazu razlikuju se od prirodne mRNA po svojstvima svog funkcionalnog i/ili strukturnog dizajna, koja služe, kao što je ovde pokazano, da se prevaziđu postojeći problemi efikasne proizvodnje polipeptida uz pomoć terapeutika na bazi nukleinskih kiselina.

[0043] Slika 1 pokazuje reprezentativni polinukleotidni primarni konstrukt 100 iz predmetne objave. Kako se ovde koristi, termin "primarni konstrukt" ili "primarni mRNA konstrukt" označava polinukleotidni transkript koji kodira jedan ili više polipeptida od interesa i koji zadržava dovoljna strukturna i/ili hemijska svojstva da omogući translaciju polipeptida od interesa koji je njime kodiran. Primarni konstrukti mogu da budu polinukleotidi prema prikazu. Kada je strukturno ili hemijski modifikovan, primarni konstrukt može da se označi kao mmRNA.

[0044] Ako se vratimo na SL. 1, primarni konstrukt 100 ovde sadrži prvi region povezanih nukleotida 102 koji je oivičen prvim oivičavajućim regionom 104 i drugim oivičavajućim regionom 106. Kako se ovde koristi, "prvi region" može da se označava i kao "kodirajući region" ili "region koji kodira" ili jednostavno "prvi region." Ovaj prvi region može da uključuje, ali nije ograničen na, kodirani polipeptid od interesa. Polipeptid od interesa može da sadrži na svom 5' kraju jednu ili više signalnih peptidnih sekvenci koje kodira region 103 signalne peptidne sekvence. Oivičavajući region 104 može da sadrži region povezanih nukleotida koji sadrži jednu ili više potpunih ili nepotpunih sekvenci 5' UTR regiona. Oivičavajući region 104 može takođe da sadrži 5' terminalnu kapu 108. Drugi oivičavajući region 106 može da sadrži region povezanih nukleotida koji sadrži jednu ili više potpunih ili nepotpunih sekvenci 3' UTR regiona. Drugi oivičavajući region 106 može takođe da sadrži 3' repnu sekvencu 110 i 3'UTR 120.

[0045] Prvi operativni region 105 premošćuje 5' terminus prvog regiona 102 i prvi oivičavajući region 104. Tradicionalno, ovaj operativni region sadrži start kodon. Operativni region može alternativno da sadrži bilo koju sekvencu za inicijaciju translacije ili signal, uključujući start kodon.

[0046] Drugi operativni region 107 premošćuje 3' terminus prvog regiona 102 i drugi oivičavajući region 106. Tradicionalno, ovaj operativni region sadrži stop kodon. Operativni region može alternativno da sadrži bilo koju sekvencu za inicijaciju translacije ili signal, uključujući stop kodon. Prema predmetnom prikazu, takođe može da se koristi više stop kodona u seriji. U jednom slučaju, operativni region prema predmetnom prikazu može da sadrži dva stop kodona. Prvi stop kodon može da bude "TGA", a drugi stop kodon može da bude odabran iz grupe koja se sastoji od "TAA," "TGA" i "TAG." Operativni region može dalje da sadrži tri stop kodona. Treći stop kodon može da bude odabran iz grupe koja se sastoji od "TAA", "TGA" i "TAG."

[0047] Ako pogledamo sliku 2, 3'UTR 120 drugog oivičavajućeg regiona 106 može da sadrži jednu ili više more senzornih sekvenci 130. Ove senzorne sekvence, kao što se ovde razmatra, operišu kao pseudo-receptori (ili vezujuća mesta) za ligande iz lokalnog mikrookruženja primarnog konstrukta ili polinukleotida. Na primer, microRNA vezujuća mesta ili miRNA seme sekvence mogu da se koriste kao senzori tako što funkcionišu kao pseudoreceptori za bilo koje molekule microRNA prisutne u okruženju polinukleotida.

[0048] U principu, najmanja dužina prvog regiona primarnog konstrukta prema predmetnom prikazu može da bude dužina nukleinske kiseline koja je dovoljna da kodira dipeptid, tripeptid, tetrapeptid, pentapeptid, heksapeptid, heptapeptid, oktapeptid, nonapeptid, ili dekapeptid. U drugom slučaju, dužina može da bude dovoljna da kodira peptid od 2-30 amino kiselina, npr. 5-30, 10-30, 2-25, 5-25, 10-25, ili 10-20 amino kiselina. Dužina može da bude dovoljna da kodira peptid od najmanje 11, 12, 13, 14, 15, 17, 20, 25 ili 30 amino kiselina, ili peptid koji nije duži od 40 amino kiselina, npr. koji nije duži od 35, 30, 25, 20, 17, 15, 14, 13, 12, 11 ili 10 amino kiselina. Primeri dipeptida koje polinukleotidne sekvence mogu da kodiraju, uključuju, ali nisu ograničeni na, kamozin i anserin.

[0049] U principu, dužina prvog regiona koji kodira polipeptid od interesa prema predmetnom prikazu je veća od oko 30 nukleotida (npr., najmanje ili više od oko 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,100, 1,200, 1300, 1400, 1500, 1,600, 1,700, 1,800, 1,900, 2,000, 2,500, i 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, 10,000, 20,000, 30,000, 40,000, 50,000, 60,000, 70,000, 80,000, 90,000 ili najviše do, i uključujući 100,000 nukleotida). Kako se ovde koristi, "prvi region" može da se označava i kao "kodirajući region" ili "region koji kodira" ili jednostavno "prvi region."

[0050] U nekim slučajevima, polinuleotid, primarni konstrukt ili mmRNA uključuje od oko 30 do oko 100,000 nukleotida (npr., od 30 do 50, od 30 do 100, od 30 do 250, od 30 do 500, od 30 do 1,000, od 30 do 1,500, od 30 do 3,000, od 30 do 5,000, od 30 do 7,000, od 30 do 10,000, od 30 do 25,000, od 30 do 50,000, od 30 do 70,000, od 100 do 250, od 100 do 500, od 100 do 1,000, od 100 do 1,500, od 100 do 3,000, od 100 do 5,000, od 100 do 7,000, od 100 do 10,000, od 100 do 25,000, od 100 do 50,000, od 100 do 70,000, od 100 do 100,000, od 500 do 1,000, od 500 do 1,500, od 500 do 2,000, od 500 do 3,000, od 500 do 5,000, od 500 do 7,000, od 500 do 10,000, od 500 do 25,000, od 500 do 50,000, od 500 do 70,000, od 500 do 100,000, od 1,000 do 1,500, od 1,000 do 2,000, od 1,000 do 3,000, od 1,000 do 5,000, od 1,000 do 7,000, od 1,000 do 10,000, od 1,000 do 25,000, od 1,000 do 50,000, od 1,000 do 70,000, od 1,000 do 100,000, od 1,500 do 3,000, od 1,500 do 5,000, od 1,500 do 7,000, od 1,500 do 10,000, od 1,500 do 25,000, od 1,500 do 50,000, od 1,500 do 70,000, od 1,500 do 100,000, od 2,000 do 3,000, od 2,000 do 5,000, od 2,000 do 7,000, od 2,000 do 10,000, od 2,000 do 25,000, od 2,000 do 50,000, od 2,000 do 70,000, i od 2,000 do 100,000).

[0051] Prema predmetnom prikazu, prvi i drugi oivičavajući region mogu nezavisno da budu u opsegu dužine od 15-1,000 nukleotida (npr., više od 30, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, i 900 nukleotida ili najmanje 30, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, i 1,000 nukleotida).

[0052] Prema predmetnom prikazu, repna sekvenca može da bude u opsegu od odsutne do dužine od 500 nukleotida (npr., najmanje 60, 70, 80, 90, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450,

1

ili 500 nukleotida). Kada je repni region poliA rep, dužina može da se odredi u jedinicama ili kao funkcija vezivanja poliA vezujućih proteina. U ovom slučaju, poliA rep je dovoljno dugačak da vezuje najmanje 4 monomera poliA vezujućeg proteina. Monomeri poliA vezujućeg proteina vezuju se za nizove od približno 38 nukleotida. U tom slučaju, uočeno je da su poliA repovi od oko 80 nukleotida i 160 nukleotida funkcionalni.

[0053] Prema predmetnom prikazu, region kape može da sadrži jednu kapu ili seriju nukleotida koji formiraju kapu. Region kape može da bude dužine od 1 do 10, npr.2-9, 3-8, 4-7, 1-5, 5-10, ili najmanje 2, ili 10 ili manje nukleotida. U nekim slučajevima, region kape je odsutan.

[0054] Prema predmetnom prikazu, prvi i drugi operativni region može da bude u opsegu dužine od 3 do 40, npr.5-30, 10-20, 15, ili najmanje 4, ili 30 ili manje nukleotida, i može da sadrži, pored start i/ili stop kodona, jednu ili više signalnih i/ili restrikcionih sekvenci.

Ciklični polinukleotidi

[0055] Prema predmetnom prikazu, nukleinska kiselina, modifikovana RNK ili primarni konstrukt, mogu da budu ciklizovani, ili konkatemerizovani, kako bi se generisao translaciono kompetentan molekul koji pomaže interakcije između poli-A vezujućih proteina i 5'-kraj vezujućih proteina. Mehanizam ciklizacije ili konkatemerizacije može da se odvija preko najmanje 3 različita puta: 1) hemijskog, 2) enzimskog, i 3) ribozimom katalizovanog. Novoformirana 5'-/3'-veza može da bude intramolekulska ili intermolekulska.

[0056] U prvom putu, 5'-kraj i 3'-kraj nukleinske kiseline sadrže hemijski reaktivne grupe koje, kada su blizu jedna drugoj, formiraju novu kovalentnu vezu između 5'-kraja i 3'-kraja molekula.

5'-kraj može da sadrži NHS-estarsku reaktivnu grupu, a 3'-kraj može da sadrži 3'-amino-terminalni nukleotid tako da će u organskom rastvaraču 3'-amino- terminalni nukleotid na 3'-kraju sintetičkog mRNA molekula izvršiti nukleofilni napad na 5'-NHS-estarski deo formirajući novu 5'-/3'-amidnu vezu.

[0057] U drugom putu, T4 RNK ligaza može da se koristi za enzimsko povezivanje molekula 5'-fosforilisane nukleinske kiseline sa 3'-hidroksilnom grupom nukleinske kiseline, formirajući novu fosforodiestarsku vezu. U primeru reakcije, 1 µg molekula nukleinske kiseline se inkubira na 37 °C tokom 1 sata sa 1-10 jedinica T4 RNK ligaze (New England Biolabs, Ipswich, MA) u skladu sa protokolom proizvođača. Reakcija ligacije može da se odvija u prisustvu podeljenog oligonukleotida sposobnog za sparivanje baza i sa 5'- i 3'-regionom u jukstapoziciji kako bi se pomogla reakcija enzimske ligacije.

[0058] U trećem putu, bilo 5'-, bilo 3'-kraj cDNA matrice kodira sekvencu ribozim ligaze tako da tokom in vitro transkripcije, dobijeni molekul nukleinske kiseline može da sadrži aktivnu sekvencu ribozima sposobnu za ligaciju 5'-kraja molekula nukleinske kiseline sa 3'-krajem molekula nukleinske kiseline. Ribozim ligaza može da bude poreklom iz introna grupe I, introna grupe I, virusa hepatitisa delta, ribozima ukosnice, ili može da bude odabrana pomoću SELEX (sistematska evolucija liganada pomoću eksponencijalnog obogaćivanja). Reakcija ribozim ligaze može da traje 1 do 24 sata na temperaturama između 0 i 37 °C.

Polinukleotidni multimeri

[0059] U skladu sa predmetnim prikazom, više različitih nukleinskih kiselina, modifikovanih RNK ili primarnih konstrukata može da bude međusobno povezano preko 3'-kraja pomoću nukleotida koji su modifikovani na 3'-terminusu. Hemijska konjugacija može da se koristi za kontrolu stehiometrije isporuke u ćelije. Na primer, enzimi glioksilatnog ciklusa, izocitrat liaza i malat sintaza, mogu da se dostavljaju u HepG2 ćelije u 1:1 odnosu kako bi se izmenio ćelijski metabolizam masnih kiselina. Ovaj odnos može da se kontroliše hemijskim povezivanjem nukleinskih kiselina ili modifikovanih RNK upotrebom 3'-azido terminalnog nukleotida na jednoj vrsti nukleinskih kiselina ili modifikovanih RNK i nukleotida koji sadrži C5-etinil ili alkinil na suprotnoj vrsti nukleinskih kiselina ili modifikovanih RNK. Modifikovani nukleotid se dodaje posttranskripciono pomoću terminalne transferaze (New England Biolabs, Ipswich, MA) u skladu sa protokolom proizvođača. Posle dodavanja 3'-modifikovanog nukleotida, dve vrste nukleinskih kiselina ili modifikovanih RNK mogu da se kombinuju u vodenom rastvoru, u prisustvu ili odsustvu bakra, kako bi se formirala nova kovalentna veza putem mehanizma „klik“ hemije kao što je opisano u literaturi.

[0060] U sledećem primeru, više od dva polinukleotida mogu da budu povezana zajedno upotrebom funkcionalizovanog linker molekula. Na primer, funkcionalizovani molekul saharida može da bude hemijski modifikovan tako da sadrži više hemijski reaktivnih grupa (SH-, NH2-, N3, itd...) kako bi reagovao sa srodnim delom na 3'-funkcionalizovanom mRNA molekulu (tj. 3'-maleimid estar, 3'-NHS-estar, alkinil). Broj reaktivnih grupa na modifikovanom saharidu može da se kontroliše na stehiometrijski način kako bi se direktno kontrolisao stehiometrijski odnos konjugovane nukleinske kiseline ili mRNA.

Konjugati i kombinacije modifikovane RNK

1

[0061] Kako bi se dodatno povećala proizvodnja proteina, nukleinske kiseline, modifikovana RNK, polinukleotidi ili primarni konstrukti prema predmetnom prikazu mogu da budu dizajnirani tako da su konjugovani sa drugim polinukleotidima, bojama, agensima za interkaliranje (npr. akridini), umreživačima (npr. psoralen, mitomicin C), porfirinima (TPPC4, teksafirin, safirin), policikličnim aromatičnim ugljovodonicima (npr. fenazin, dihidrofenazin), veštačkim endonukleaze (npr. EDTA), alkilujućim agensima, fosfat, amino, merkapto, PEG (npr. PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, poliamino, alkil, supstituisanim alkilom, radioaktivno obeleženim markerima, enzimima, haptenima (npr. biotin), sredstvima za olakšavanje transporta/apsorpcije (npr. aspirin, vitamin E, folna kiselina), sintetičkim ribonukleazama, proteinima, npr. glikoproteinima ili peptidima, npr. molekulima koji imaju specifičan afinitet za ko-ligand, ili antitelima, npr. antitelom koje se vezuje za specifično navedeni tip ćelije kao što je kancerska ćelija, endotelska ćelija, ili koštana ćelija, hormonima i receptorima hormona, ne-peptidnim vrstama, kao što su lipidi, lektini, ugljeni hidrati, vitamini, kofaktori, ili lek.

[0062] Konjugacija može da dovede do povećane stabilnosti i/ili poluživota, i može da bude posebno korisna prilikom usmeravanja nukleinskih kiselina, modifikovane RNK polinukleotida ili primarnih konstrukata na specifična mesta u ćeliji, tkivu ili organizmu.

[0063] Prema predmetnom prikazu, nukleinske kiseline, modifikovana RNK ili primarni konstrukt mogu da se primenjuju sa, ili dodatno, da kodiraju, jedan ili više RNAi agenasa, siRNA, shRNA, miRNA, miRNA vezujuća mesta, antisens RNK, ribozime, katalitičku DNK, tRNA, RNK koje indukuju formiranje trostrukog heliksa, aptamere ili vektore, i slično.

Bifunkcionalni polinukleotidi

[0064] Ovde su prikazani bifunkcionalni polinukleotidi (npr. bifunkcionalne nukleinske kiseline, bifunkcionalna modifikovana RNK ili bifunkcionalni primarni konstrukti). Kao što naziv implicira, bifunkcionalni polinukleotidi su polinukleotidi koji imaju ili su sposobni za najmanje dve funkcije. Ovi molekuli takođe mogu po dogovoru da se označavaju kao multifunkcionalni.

[0065] Višestruke funkcionalnosti bifunkcionalnih polinukleotida mogu da budu kodirane od strane RNK (funkcija se možda neće manifestovati dok se kodirani proizvod ne translatira) ili mogu da budu svojstvo samog polinukleotida. Može da bude strukturna ili hemijska. Bifunkcionalno modifikovani polinukleotidi mogu da sadrže funkciju koja je kovalentno ili elektrostatički povezana sa polinukleotidima. Dodatno, dve funkcije mogu da budu obezbeđene u kontekstu kompleksa modifikovane RNK i drugog molekula.

[0066] Bifunkcionalni polinukleotidi mogu da kodiraju peptide koji su antiproliferativni. Ovi peptidi mogu da budu linearni, ciklični, ograničena ili nasumična zavojnica. Oni mogu

1

funkcionisati kao aptameri, signalni molekuli, ligandi ili mimici ili mimetici istih. Antiproliferativni peptidi mogu, kao što su translatirani, biti dugački od 3 do 50 amino kiselina. Mogu da budu dugački 5-40, 10-30, ili približno 15 amino kiselina. Oni mogu da budu jednolančani, višelančani ili razgranati i mogu da formiraju komplekse, agregate ili bilo koju strukturu sa više jedinica posle translacije.

Nekodirajući polinukleotidi

[0067] Kako je ovde opisano, obezbeđene su nukleinske kiseline, modifikovana RNK, polinukleotidi i primarni konstrukti koji imaju sekvence koje delimično ili suštinski nisu translatabilne, npr. koje imaju nekodirajući region. Ovi molekuli se generalno ne translatiraju, ali mogu da imaju uticaj na proizvodnju proteina pomoću jednog ili više vezivanja za, i sekvestriranja, jedne ili više komponenti translacione mašinerije, kao što su ribozomski protein ili transportna RNK (tRNA), čime se efikasno redukuje ekspresija proteina u ćeliji ili modulira jedan ili više puteva ili kaskada u ćeliji što zauzvrat menja nivo proteina. Nukleinske kiseline, polinukleotidi, primarni konstrukti ili mRNA mogu da sadrže ili kodiraju jednu ili više dugih nekodirajućih RNK (lncRNA, ili lincRNA) ili njihov deo, malu nukleolusnu RNK (sno-RNA), mikro RNK (miRNA), malu interferirajuću RNK (siRNA) ili Piwi-interagujuću RNK (piRNA).

Polipeptidi od interesa

[0068] Prema predmetnom prikazu, primarni konstrukt je dizajniran tako da kodira jedan ili više polipeptida od ineteresa ili njihove fragmente. Polipeptid od interesa može da uključuje, ali nije ograničen na, cele polipeptide, mnoštvo polipeptida ili fragmente polipeptida, koji nezavisno mogu da budu kodirani jednom ili više nukleinskih kiselina, mnoštvom nukleinskih kiselina, fragmentima nukleinskih kiselina ili varijantama bilo čega od prethodno pomenutog. Kako se ovde koristi, termin "polipeptidi od interesa" se odnosi bilo koje polipeptide koji su odbrani da budu kodirani u primarnom konstruktu prema predmetnom pronalasku. Kako se ovde koristi, "polipeptid" označava polimer amino kiselinskih ostataka (prirodnih ili neprirodnih) povezanih zajedno najčešće peptidnim vezama. Termin, kako se ovde koristi, označava proteine, polipeptide, i peptide bilo koje veličine, strukture, ili funkcije. U nekim slučajevima kodirani polipeptid je manji od oko 50 amino kiselina i tada se polipeptid naziva peptid. Ukoliko je polipeptid peptid, biće dugačak najmanje oko 2, 3, 4, ili najmanje 5 amino kiselinskih ostataka. Stoga, polipeptidi uključuju genske proizvode, polipeptide koji se prirodno javljaju, sintetičke polipeptide, homologe, ortologe, paraloge, fragmente i druge ekvivalente, varijante, i analoge prethotno

1

pomenutog. Polipeptid može da bude jedan molekul ili može da bude multimolekulski kompleks, kao što su dimer, trimer ili tetramer. Oni takođe mogu sadržati jednolančane ili višelančane polipeptide kao što su antitela ili insulin i mogu da budu asocirani ili povezani. Najčešće se disulfidne veze nalaze u višelančanim polipeptidima. Termin polipeptid se takođe može odnositi na amino kiselinske polimere u kojima je jedan ili više amino kiselinskih ostataka veštački hemijski analog odgovarajuće amino kiseline koja se javlja u prirodi.

[0069] Termin "polipeptidna varijanta" odnosi se na molekule koji se po svojoj amino kiselinskoj sekvenci razlikuju od nativne ili referentne sekvence. Varijante amino kiselinske sekvence mogu posedovati supstitucije, delecije, i/ili insercije na određenim pozicijama unutar amino kiselinske sekvence, u poređenju sa nativnom ili referentnom sekvencom. Obično, varijante će posedovati najmanje oko 50% identičnosti (homologije) sa nativnom ili referentnom sekvencom, i poželjno će biti najmanje oko 80%, poželjnije najmanje oko 90% identične (homologne) sa nativnom ili referentnom sekvencom.

[0070] U nekim slučajevima su obezbeđeni "varijantni mimici". Kako se ovde koristi, termin "varijantni mimik" je onaj koji sadrži jednu ili više amino kiselina koje bi oponašale aktiviranu sekvencu. Na primer, glutamat može da služi kao mimik za fosforo-treonin i/ili fosforo-serin. Alternativno, varijantni mimici mogu da dovedu do deaktivacije ili inaktiviranog proizvoda koji sadrži mimik, npr. fenilalanin može da deluje kao inaktivirajuća supstitucija za tirozin; ili alanin može da deluje kao inaktivirajuća supstitucija za serin.

[0071] "Homologija", kada se odnosi na amino kiselinske sekvence, definisana je kao procenat ostataka u kandidat amino kiselinskoj sekvenci koji su identični sa ostacima u amino kiselinskoj sekvenci druge sekvence posle poravnanja sekvenci i introdukovanja praznina, ukoliko je potrebno, kako bi se postigao maksimalan procenat homologije. Postupci i računarski programi za poravnanje su dobro poznati u stanju tehnike. Podrazumeva se da homologija zavisi od izračunavanja procenta identičnosti, ali se može razlikovati u vrednosti zbog praznina i penala introdukovanih u proračun.

[0072] Pod "homolozima", kada se odnosi na polipeptidne sekvence, podrazumeva se odgovarajuća sekvenca drugih vrsta koje imaju značajnu identičnost sa drugom sekvencom druge vrste.

[0073] Podrazumeva se da "analozi" uključuju polipeptidne varijante koje se razlikuju po jednoj ili više amino kiselinskih izmena, npr. supstitucijama, adicijama ili delecijama amino kiselinskih ostataka koje i dalje održavaju jedno ili više svojstava roditeljskog ili početnog polipeptida.

[0074] Predmetni prikaz razmatra nekoliko tipova kompozicija na bazi polipeptida uključujući varijante i derivate. Oni uključuju supstitucione, insercione, delecione i kovalentne varijante i

1

derivate. Termin "derivat" se upotrebljava sinonimno sa terminom "varijanta" ali generalno označava molekul koji je modifikovan i/ili promenjen na bilo koji način u odnosu na referentni molekul ili početni molekul.

[0075] U tom smislu, prikazani su polinukleotidi koji kodiraju polipeptide od interesa koji sadrže supstitucije, insercije i/ili adicije, delecije i kovalentne modifikacije u odnosu na referentne sekvence. Na primer, oznake sekvence ili amino kiseline, kao što je jedan ili više lizina, mogu se dodati peptidnim sekvencama iz objave (npr. na N-terminalnim ili C-terminalnim krajevima). Oznake sekvence mogu se upotrebljavati za prečišćavanje ili lokalizaciju peptida. Lizini mogu se upotrebljavati za povećanje solubilnosti peptida ili za omogućavanje biotinilacije. Alternativno, amino kiselinski ostaci koji su locirani na karboksi i amino terminalnim regionima amino kiselinske sekvence peptida ili proteina mogu se opciono deletirati obezbeđujući skraćene sekvence. Određene amino kiseline (npr. C-terminalni ili N-terminalni ostaci) mogu se alternativno deletirati u zavisnosti od upotrebe sekvence, kao na primer, ekspresija sekvence kao deo veće sekvence koja je solubilna, ili povezana sa čvrstom podlogom.

[0076] "Supstitucione varijante" kada se poziva na polipeptide su one kod kojih je uklonjen najmanje jedan amino kiselinski ostatak u nativnoj ili početnoj sekvenci i insertovana druga amino kiselina na njegovo mesto na istoj poziciji. Supstitucije mogu da budu pojedinačne, gde je supstituisana samo jedna amino kiselina u molekulu, ili mogu da budu višestruke, gde su dve ili više amino kiselina supstituisane u istom molekulu.

[0077] Kako se ovde koristi, termin "konzervativna amino kiselinska supstitucija" označava supstituciju amino kiseline koja je normalno prisutna u sekvenci sa drugom amino kiselinom slične veličine, naelektrisanja, ili polarnosti. Primeri konzervativnih supstitucija uključuju supstituciju nepolarnog (hidrofobnog) ostatka, kao što su izoleucin, valin i leucin, sa drugim nepolarnim ostatkom. Slično, primeri konzervativnih supstitucija uključuju supstituciju jednog polarnog (hidrofilnog) ostatka sa drugim, kao što je između arginina i lizina, između glutamina i asparagina, i između glicina i serina. Dodatno, supstitucija baznog ostatka kao što su lizin, arginin ili histidin sa drugim, ili supstitucija jednog kiselog ostatka kao što su asparaginska kiselina ili glutaminska kiselina sa drugim kiselim ostatkom dodatni su primeri konzervativnih supstitucija. Primeri nekonzervativnih supstitucija uključuju supstituciju nepolarnog (hidrofobnog) amino kiselinskog ostatka kao što su izoleucin, valin, leucin, alanin, metionin sa polarnim (hidrofilnim) ostatkom kao što su cistein, glutamin, glutaminska kiselina ili lizin i/ili polarnog ostatka sa nepolarnim ostatkom.

[0078] "Insercione varijante" kada se poziva na polipeptide su one sa jednom ili više amino kiselina insertovanih neposredno pored amino kiseline na određenoj poziciji u nativnoj ili početnoj

1

sekvenci. "Neposredno pored" amino kiseline znači povezano sa bilo alfa-karboksi ili alfa-amino funkcionalnom grupom amino kiseline.

[0079] "Delecione varijante" kada se poziva na polipeptide su one sa jednom ili više amino kiselina uklonjenih u nativnoj ili početnoj amino kiselinskoj sekvenci. Uobičajeno, delecione varijante će imati jednu ili više amino kiselina deletiranih u određenom regionu molekula.

[0080] "Kovalentni derivati" kada se poziva na polipeptide uključuju modifikacije nativnog ili početnog proteina sa organskim proteinskim ili neproteinskim derivatizacionim agensom, i/ili posttranslacione modifikacije. Kovalentne modifikacije se tradicionalno introdukuju reagovanjem ciljanih amino kiselinskih ostataka proteina sa organskim derivatizacionim agensom koji je sposoban da reaguje sa odabranim bočnim lancima ili terminalnim ostacima, ili upotrebom mehanizama posttranslacionih modifikacija koje funkcionišu u odabranim rekombinantnim ćelijama domaćina. Rezultujući kovalentni derivati su korisni u programima usmerenim na identifikaciju ostataka važnih za biološku aktivnost, za imunološke testove, ili za pripremu antiprotein antitela za imunoafinitetno prečišćavanje rekombinantnog glikoproteina. Takve modifikacije su unutar prosečnog iskustva u struci i izvode se bez nepotrebnih eksperimenata.

[0081] Određene posttranslacione modifikacije su rezultat delovanja rekombinantnih ćelija domaćina na eksprimirani polipeptid. Glutaminil i asparaginil ostaci se često posttranslaciono deamiduju do odgovarajućih glutamil i aspartil ostataka. Alternativno, ovi ostaci se deamiduju pod blago kiselim uslovima. Bilo koji oblik ovih ostataka može da bude prisutan u polipeptidima proizvedenim u skladu sa predmetnom objavom.

[0082] Druge posttranslacione modifikacije uključuju hidroksilaciju prolina i lizina, fosforilaciju hidroksilnih grupa seril ili treonil ostataka, metilaciju alfa-amino grupa bočnih lanaca lizina, arginina, i histidina (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp.79-86 (1983)).

[0083] "Svojstva", kada se odnose na polipeptide, definisana su kao različite komponente molekula zasnovane na amino kiselinskoj sekvenci. Svojstva polipeptida kodiranih od strane mmRNA prema predmetnom prikazu uključuju površinske manifestacije, lokalni konformacioni oblik, nabore, petlje, polupetlje, domene, poludomene, mesta, terminuse ili bilo koju njihovu kombinaciju.

[0084] Kako se ovde koristi kada se poziva na polipeptide termin "površinska manifestacija" označava komponentu proteina zasnovanu na polipeptidu koja se pojavljuje na najspoljašnjijoj površini.

2

[0085] Kako se ovde koristi kada se poziva na polipeptide termin "lokalni konformacioni oblik" označava strukturnu manifestaciju proteina zasnovanu na polipeptidu koja je locirana unutar definisanog prostora proteina.

[0086] Kako se ovde koristi kada se poziva na polipeptide termin "nabor" označava rezultujuću konformaciju amino kiselinske sekvence nakon minimizacije energije. Nabor se može javiti na sekundarnom ili tercijarnom nivou procesa savijanja. Primeri nabora sekundarnog nivoa uključuju beta ploče i alfa helikse. Primeri tercijarnih nabora uključuju domene i regione formirane zbog agregacije ili razdvajanja energetskih sila. Regioni formirani na ovaj način uključuju hidrofobne i hidrofilne džepove, i slično.

[0087] Kako se ovde koristi, termin "zaokret" u odnosu na konformaciju proteina označava krivinu koja menja smer okosnice peptida ili polipeptida i može da uključuje jedan, dva, tri ili više amino kiselinskih ostataka.

[0088] Kako se ovde koristi kada se poziva na polipeptide termin "petlja" označava strukturne osobine polipeptida koje mogu poslužiti za preokretanje smera okosnice peptida ili polipeptida. Tamo gde se petlja nalazi u polipeptidu i menja samo smer okosnice, može da sadrži četiri ili više amino kiselinskih ostataka. Oliva et al. identifikovali su najmanje 5 klasa proteinskih petlji (J. Mol Biol 266 (4): 814-830; 1997). Petlje mogu da budu otvorene ili zatvorene. Zatvorene petlje ili "ciklične" petlje mogu sadržati 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više amino kiselina između premošćujućih delova. Takvi premošćujući delovi mogu sadržati most cistein-cistein (Cys-Cys) tipičan kod polipeptida koji imaju disulfidne mostove ili alternativno premošćujući delovi ne moraju biti na bazi proteina, kao što su ovde upotrebljeni dibromozilil agensi.

[0089] Kako se ovde koristi kada se poziva na polipeptide termin "polupetlja" označava deo identifikovane petlje koji ima najmanje polovinu broja amino kiselinskih ostataka kao petlja iz koje je poreklom. Podrazumeva se da petlje ne moraju uvek sadržati paran broj amino kiselinskih ostataka. Prema tome, u onim slučajevima gde petlja sadrži ili je identifikovano da sadrži neparan broj amino kiselina, polupetlja petlje sa neparnim brojem će sadržati deo petlje celog broja ili deo petlje sledećeg celog broja (broj amino kiselina petlje/2 /- 0,5 amino kiselina). Na primer, petlja identifikovana kao petlja sa 7 amino kiselina može da proizvede polupetlje od 3 amino kiseline ili 4 amino kiseline (7/2 = 3,5 /- 0,5 je 3 ili 4).

[0090] Kako se ovde koristi kada se poziva na polipeptide termin "domen" označava motiv polipeptida koji ima jednu ili više identifikacionih strukturnih ili funkcionalnih karakteristika ili svojstava (npr. kapacitet vezivanja, služi kao mesto za protein-protein interakcije).

[0091] Kako se ovde koristi kada se poziva na polipeptide termin "poludomen" označava deo identifikovanog domena koji ima najmanje polovinu broja amino kiselinskih ostataka kao domen iz kog je poreklom. Podrazumeva se da domeni ne moraju uvek sadržati paran broj amino kiselinskih ostataka. Prema tome, u onim slučajevima gde domen sadrži ili je identifikovano da sadrži neparan broj amino kiselina, poludomen domena sa neparnim brojem će sadržati deo domena celog broja ili deo domena sledećeg celog broja (broj amino kiselina domena/2 /- 0,5 amino kiselina). Na primer, domen identifikovan kao domen sa 7 amino kiselina može da proizvede poludomene od 3 amino kiseline ili 4 amino kiseline (7/2 = 3,5 /- 0,5 je 3 ili 4). Takođe se podrazumeva da se poddomeni mogu identifikovati unutar domena ili poludomena, pri čemu ovi poddomeni poseduju manje od svih strukturnih ili funkcionalnih svojstava identifikovanih u domenima ili poludomenima iz kojih su poreklom. Takođe se podrazumeva da amino kiseline koje sadrže bilo koji od tipova domena ovde ne moraju biti susedne duž okosnice polipeptida (tj. nesusedne amino kiseline mogu se strukturno naborati kako bi proizvele domen, poludomen ili poddomen).

[0092] Kako se ovde koristi, u vezi sa polipeptidima, termin "mesto" kada se odnosi na primere izvođenja koji se zasnivaju na amino kiselinama, upotrebljava se sinonimno sa "amino kiselinski ostatak" i "bočni lanac amino kiselina". Mesto predstavlja poziciju unutar peptida ili polipeptida koja može da se modifikuje, manipuliše, menja, derivatizuje ili varira unutar molekula na bazi polipeptida prema predmetnom prikazu.

[0093] Kako se ovde koriste, termini "terminusi" ili "terminus", kada se odnose na polipeptide, označavaju krajnji deo peptida ili polipeptida. Takav krajni deo nije ograničen samo na prvo ili krajnje mesto peptida ili polipeptida, već može da uključuje dopunske amino kiseline u terminalnim regionima. Molekuli zasnovani na polipeptidima iz predmetne objave mogu se okarakterisati kao da imaju i N-terminus (završen amino kiselinom sa slobodnom amino grupom (NH2)) i C-terminus (završen amino kiselinom sa slobodnom karboksilnom grupom (COOH)). Proteini iz objave su u nekim slučajevima sačinjeni od više polipeptidnih lanaca koji se drže zajedno disulfidnim vezama ili nekovalentnim silama (multimeri, oligomeri). Ove vrste proteina će imati više N- i C-terminusa. Alternativno, terminusi polipeptida mogu da budu modifikovani tako da oni počinju ili se završavaju, kao što to može da bude slučaj, sa delom koji nije zasnovan na polipeptidu, kao što je organski konjugat.

[0094] Jednom kada su neke od osobina identifikovane ili definisane kao željena komponenta polipeptida koji treba da bude kodiran primarnim konstruktom ili mmRNA iz objave, bilo koja od nekoliko manipulacija i/ili modifikacija ovih osobina može se izvesti pomeranjem, zamenom, invertovanjem, delecijom, randomizovanjem ili dupliciranjem. Pored toga, podrazumeva se da manipulacija osobinama može rezultovati istim ishodom kao i modifikacija na molekulima iz objave. Na primer, manipulacija koja uključuje deleciju domena rezultovala bi izmenom dužine molekula baš kao što bi i modifikacija nukleinske kiseline da kodira manje od molekula pune dužine.

[0095] Modifikacije i manipulacije mogu se postići postupcima poznatim u stanju tehnike, kao što je, ali bez ograničavanja na, mutagenezu usmerenu na mesto. Rezultujući modifikovani molekuli se zatim mogu testirati na aktivnost upotrebom in vitro ili in vivo testova, kao što su oni koji su ovde opisani, ili bilo koji drugi pogodan test pregledanja poznat u stanju tehnike.

[0096] U skladu sa predmetnom objavom, polipeptidi mogu sadržati konsenzus sekvencu koja se otkriva kroz krugove eksperimentisanja. Kako se ovde koristi, "konsenzus" sekvenca je jedna sekvenca koja predstavlja kolektivnu populaciju sekvenci koje omogućavaju varijabilnost na jednom ili više mesta.

[0097] Kao što prepoznaju stručnjaci u oblasti, takođe se smatra da su prikazani proteinski fragmenti, funkcionalni proteinski domeni, i homologi proteini. Na primer, ovde je obezbeđen bilo koji proteinski fragment (misli se na polipeptidnu sekvencu koja je najmanje za jedan amino kiselinski ostatak kraća od referentne polipeptidne sekvence, ali inače identičnu) referentnog proteina koji je dugačak 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ili više od 100 amino kiselina. U drugom primeru, bilo koji protein koji uključuje niz od oko 20, oko 30, oko 40, oko 50, ili oko 100 amino kiselina koje su oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 70%, oko 80%, oko 90%, oko 95%, ili oko 100% identične sa bilo kojom od ovde opisanih sekvenci može se koristiti u skladu sa objavom. U nekim slučajevima, polipeptid koji se koristi u skladu sa prikazom uključuje 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ili više mutacija, kao što je pokazano u bilo kojoj od sekvenci koje su ovde obezbeđene ili na koje se poziva.

Kodirani polipeptidi od interesa

[0098] Primarni konstrukti, modifikovane nukleinske kiseline ili mmRNA prema predmetnom prikazu, mogu da budu dizajnirani tako da kodiraju polipeptide od interesa kao što su peptidi i proteini.

[0099] U jednom slučaju, primarni konstrukti, modifikovane nukleinske kiseline ili mmRNA prema predmetnom prikazu, mogu da kodiraju varijantne polipeptide koji imaju izvesnu identičnost sa referentnom polipeptidnom sekvencom. Kako se ovde koristi, "referentna polipeptidna sekvenca" odnosi se na polaznu polipeptidnu sekvencu. Referentne sekvence mogu da budu prirodne sekvence ili bilo koja sekvenca na koju se poziva prilikom dizajniranja druge sekvence. "Referentna polipeptidna sekvenca" može, npr., da bude bilo koja od proteinskih sekvenci navedenih u SAD patentnoj prijavi br. 61/618,953, podnetoj 2. aprila 2012., pod

2

naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease, SAD patentnoj prijavi br. 61/681,704, podnetoj 10. avgusta 2012., pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease, SAD patentnoj prijavi br. 61/737,203, podnetoj 14. decembra 2012., pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease, međunarodnoj prijavi br. PCT/US2013/030062, podnetoj 9. marta 2013., pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Biologics and Proteins Associated with Human Disease; međunarodnoj prijavi br. PCT/US2013/030063, podnetoj 9. marta 2013., pod naslovom Modified Polynucloetides; međunarodnoj prijavi br. PCT/US2013/030064, pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Secreted Proteins; međunarodnoj prijavi br. PCT/US2013/030059, podnetoj 9. marta 2013., pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Membrane Proteins; međunarodnoj prijavi br. PCT/US2013/030066, podnetoj 9. marta 2013., pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Cytoplasmic and Cytoskeletal Proteins; međunarodnoj prijavi br.PCT/US2013/030067, podnetoj 9. marta 2013., pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Nuclear Proteins; međunarodnoj prijavi br. PCT/US2013/030060, podnetoj 9. marta 2013., pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Proteins; međunarodnoj prijavi br. PCT/US2013/030061, podnetoj 9. marta 2013., pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease; međunarodnoj prijavi br. PCT/US2013/030068, podnetoj 9. marta 2013., pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Cosmetic Proteins and Peptides; međunarodnoj prijavi br. PCT/US2013/030070, podnetoj 9. marta 2013., pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Oncology-Related Proteins and Peptides; i međunarodnoj prijavi br. PCT/US2013/031821, podnetoj 15. marta 2013., pod naslovom In Vivo Production of Proteins.

[0100] Termin "identičnost" kako je poznat u stanju tehnike, odnosi se na odnos između sekvenci dva ili više peptida, koji je određen poređenjem sekvenci. U stanju tehnike, identičnost takođe označava stepen srodnosti sekvenci različitih peptida, što se određuje brojem podudaranja između nizova dva ili više aminokiselinskih ostataka. Identičnost meri procenat identičnih podudaranja između manje od dve ili više sekvenci sa poravnanjima praznina (ako ih ima) kojima se bavi određeni matematički model ili kompjuterski program (tj. „algoritmi“). Identičnost srodnih peptida može lako da se izračuna poznatim metodama. Takve metode uključuju, ali nisu ograničene na, metode opisane u Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G, Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991; i Carillo et al., SIAM J. Applied Math.48,1073 (1988).

[0101] U nekim slučajevima, polipeptidna varijanta može da ima istu ili sličnu aktivnost kao i referentni polipeptid. Alternativno, varijanta može da ima izmenjenu aktivnost (npr. povećanu ili smanjenu) u odnosu na referentni polipeptid. U principu, varijante konkretnog polinukleotida ili polipeptida prema pronalasku, imaće najmanje oko 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ali manje od 100% identičnosti sekvence sa sekvencama koje su određene referentnim polinukleotidom ili polipeptidom kao što je određeno pomoću programa za poravnavanje sekvenci i parametara opisanih ovde i poznatih stručnjacima u oblasti. Takvi alati za poravnanje uključuju alate iz BLAST paketa (Stephen F. Altschul, Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, i David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res.25:3389-3402.) Drugi alati su ovde opisani, specifično u definiciji "identičnosti".

[0102] Podrazumevani parametri u BLAST algoritmu uključuju, na primer, očekivani prag od 10, veličinu reči 28, ocene podudaranja/neusklađenosti 1, -2, linearne troškove praznine. Može da se primenjuje bilo koji filter, kao i odabir ponovaka specifičnih za vrstu, npr. Homo sapiens.

[0103] U jednom slučaju, polinukleotidi, primarni konstrukti, modifikovane nukleinske kiseline i/ili mmRNA mogu da se koriste za lečenje bolesti, poremećaja i/ili stanja kod subjekta.

[0104] U jednom slučaju, polinukleotidi, primarni konstrukti, modifikovane nukleinske kiseline i/ili mmRNA mogu da se koriste za smanjenje, eliminaciju ili prevenciju rasta tumora kod subjekta.

[0105] U jednom slučaju, polinukleotidi, primarni konstrukti i/ili mmRNA mogu da se koriste za smanjenje i/ili poboljšanje najmanje jednog simptoma kancera kod subjekta. Simptom kancera može da uključuje, ali nije ograničen na, slabost, bolove i distres, groznicu, umor, gubitak težine, krvne ugruške, povećane nivoe kalcijuma u krvi, nizak broj belih krvnih zrnaca, kratak dah, vrtoglavicu, glavobolju, hiperpigmentaciju, žuticu, eritem, pruritis, prekomerni rast dlaka, promenu uobičajenog funkcionisanja creva, promenu funkcionisanja bešike, dugotrajne rane, bele mrlje u ustima, bele tačke na jeziku, neuobičajeno krvarenje ili iscedak, zadebljanje ili kvržicu na delovima tela, probavne smetnje, probleme sa gutanjem, promene na bradavicama ili mladežima, promena na novoj koži i dugotrajan kašalj ili promuklost. Dalje, polinukleotidi, primarni konstrukti, modifikovana nukleinska kiseina i/ili mmRNA mogu da smanjuju neželjene efekte povezane sa rakom kao što su, ali ne i ograničeno na, krvarenje u mozgu, perifernu neuropatiju,

2

umor, depresiju, mučninu, povraćanje, bol, anemiju, limfedem, infekcije, seksualne neželjene efekte, smanjenu plodnost ili neplodnost, stomu, nesanicu i gubitak kose.

Modifikacije terminalne arhitekture: netranslatirani regioni (UTR regioni)

[0106] Netranslatirani regioni (UTR regioni) gena se transkribuju, ali se ne translatiraju. 5'UTR počinje na start mestu transkripcije i nastavlja se do start kodona, ali ne uključuje start kodon; dok 3'UTR počinje odmah posle stop kodona i nastavlja se do signala za terminaciju transkripcije. Sve je više dokaza o regulatornim ulogama koje imaju UTR u pogledu stabilnosti molekula nukleinske kiseline i translacije. Regulatorna svojstva UTR mogu da se inkorporiraju u nukleinske kiseline ili modifikovanu RNK prema predmetnom prikazu, kako bi se poboljšala stabilnost molekula. Specifična svojstva takođe mogu da se inkorporiraju kako bi se obezbedilo kontrolisano smanjenje ekspresije transkripta u slučaju da je pogrešno usmeren na neželjena mesta u organima. Netranslatirani regioni mogu da budu inkorporirani u vektorski sistem koji može da proizvodi mRNA i/ili da se isporučuje u ćeliju, tkivo i/ili organizam kako bi se proizveo polipetid od interesa.

5' UTR i inicijacija translacije

[0107] Prirodni 5' UTR imaju osobine koje igraju ulogu u inicijaciji translacije. Oni nose otiske kao što su Kozak sekvence za koje je opšte poznato da su uključene u postupak kojim ribozom pokreće translaciju mnogih gena. Kozak sekvence imaju konsenzus CCR(A/G)CCAUGG, gde je R purin (adenin ili guanin) tri baze uzvodno od start kodona (AUG), iza kog sledi još jedan 'G'. Takođe je poznato da 5'UTR formira sekundarne strukture koje su uključene u vezivanje faktora elongacije.

[0108] Sekundarne strukture 5'UTR regiona uključene u vezivanje elongacionih faktora mogu da interaguju sa drugim RNK-vezujućim molekulima u 5’UTR ili 3'UTR regionima u cilju regulacije genske ekspresije. Na primer, vezivanje elongacionog faktora EIF4A2 za element sa sekundarnom strukturom u 5’UTR neophodno je za represiju posredovanu putem microRNA (Meijer HA et al., Science, 2013, 340, 82-85). Različite sekundarne strukture u 5’UTR mogu da budu inkorporirane u oivičavajući region kako bi ili stabilizovale ili selektivno destabilisale mRNA molekule u specifičnim tkivima ili ćelijama.

[0109] Konstruisanjem osobina koje se tipično nalaze u obilno eksprimiranim genima specifičnih ciljnih organa, može se poboljšati stabilnost i proizvodnja nukleinskih kiselina ili mRNA prema prikazu. Na primer, introdukovanje 5' UTR mRNA eksprimirane u jetri, kao što je albumin, serumski amiloid A, apolipoprotein A/B/E, transferin, alfa fetoprotein, eritropoetin, ili faktor VIII,

2

moglo bi se upotrebljavati za poboljšanje ekspresije molekula nukleinske kiseline, kao što je mmRNA, u hepatičkim ćelijskim linijama ili jetri. Slično, upotreba 5' UTR iz drugih tkivno specifičnih mRNA za poboljšanje ekspresije u tom tkivu je moguća - za mišiće (MyoD, miozin, mioglobin, miogenin, herkulin), za endotelske ćelije (Tie-1, CD36), za mijeloidne ćelije (C/EBP, AML1, G-CSF, GM-CSF, CD11b, MSR, Fr-1, i-NOS), za leukocite (CD45, CD18), za masno tkivo (CD36, GLUT4, ACRP30, adiponektin) i za epitelske ćelije pluća (SP-A/B/C/D).

[0110] Druge ne-UTR sekvence mogu da budu inkorporirane u 5' (ili 3' UTR) UTR regione. Na primer, sekvence introna ili delova introna mogu da budu inkorporirane u oivičavajuće regione nukleinskih kiselina ili mRNA prema prikazu. Inkorporacija intronske sekvence može da poveća proizvodnju proteina kao i nivoe mRNA.

[0111] U jednom slučaju, najmanje jedan fragment IRES sekvenci iz GTX gena može da bude uključen u 5’UTR. Kao neograničavajući primer, fragment može da bude sekvenca od 18 nukleotida iz IRES sekvence GTX gena. Kao drugi neograničavajući primer, fragment sekvence od 18 nukleotida iz IRES sekvence GTX gena može da bude tandemski ponovljen u 5’UTR ovde opisanog polinukleotida. Sekvenca od 18 nukleotida može da bude ponovljena u 5’UTR najmanje jedanom, najmanje dvaput, najmanje tri puta, najmanje četiri puta, najmanje pet puta, najmanje šest puta, najmanje sedam puta, najmanje osam puta, najmanje devet puta ili više od deset puta.

[0112] U jednom slučaju, 5'UTR može da uključuje najmanje pet fragmenata od 18 nukleotida IRES sekvence iz GTX gena koji mogu da budu uključeni u 5’UTR (videti npr., fragment od 18 nukleotida opisan u tabeli 62).

[0113] Nukleotidi mogu da budu mutirani, zamenjeni i/ili uklonjeni iz 5' (ili 3') UTR regiona. Na primer, jedan ili više nukleotida uzvodno od start kodona može da bude zamenjeno drugim nukleotidom. Nukleotid ili nukleotidi koji su zamenjeni mogu da budu 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 ili više od 60 nukleotida uzvodno od start kodona. Kao drugi primer, jedan ili više nukleotida uzvodno od start kodona može da bude uklonjeno iz UTR.

[0114] U jednom slučaju, najmanje jedan purin uzvodno od start kodona može da bude zamenjen pirimidinom. Purin koji je zamenjen može da bude 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 ili više od 60 nukleotida uzvodno od start kodona. Kao neograničavajući primer, adenin koji je tri nukleotida uzvodno od start kodona može da bude zamenjen timinom. Kao drugi neograničavajući primer, adenin koji je devet nukleotida uzvodno od start kodona može da bude zamenjen timinom.

[0115] U jednom slučaju, najmanje jedan nukleotid uzvodno od start kodon može da bude uklonjen iz UTR. U jednom aspektu, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,

2

23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 ili više od 60 nukleotida uzvodno od start kodona može da bude uklonjeno iz UTR ovde opisanih polinukleotida. Kao neograničavajući primer, devet nukleotida uzvodno od start kodona može da bude uklonjeno iz UTR (Videti npr., G-CSF 9del5' konstrukt opisan u tabeli 60).

5'UTR, 3'UTR i enhenserski elementi translacije (TEE elementi)

[0116] U jednom slučaju, 5’UTR polinukleotida, primarnih konstrukata, modifikovane nukleinske kiseline i/ili mmRNA može da uključuje najmanje jedan translacioni enhenserski polinukleotid, enhenserski element translacije, translacione enhenserske elemente (zajednički označeni kao "TEE" elementi). Kao neograničavajući primer, TEE može da bude lociran između promotora transkripcije i start kodona. Polinukleotidi, primarni konstrukti, modifikovane nukleinske kiseline i/ili mmRNA sa najmanje jednim TEE u 5’UTR mogu da uključuju kapu na 5’UTR regionu. Dalje, najmanje jedan TEE može da bude lociran u 5’UTR polinukleotida, primarnih konstrukata, modifikovanih nukleinskih kiselina i/ili mmRNA koji podležu translaciji zavisnoj od kape ili nezavisnoj od kape.

[0117] Termin "translacioni enhanserski element" ili "enhanserski element translacije" (ovde se zajedno označava kao "TEE") odnosi se na sekvence koje povećavaju količinu polipeptida ili proteina koji se proizvede od mRNA.

[0118] U jednom aspektu, TEE elementi su konzervativni elementi u UTR koji mogu da pospešuju translacionu aktivnost nukleinske kiseline kao što je, ali ne i ograničeno na, translacija zavisna od kape ili translacija nezavisna od kape. Konzervativnost ovih sekvenci prethodno su pokazali autori Panek et al (Nucleic Acids Research, 2013, 1-10) za 14 vrsta, uključujući ljude.

[0119] U jednom slučaju, TEE može da bude bilo koji od TEE elemenata navedenih u tabeli 32 u Primeru 45, uključujući njihove delove i/ili fragmente. TEE sekvenca može da uključuje najmanje 5%, najmanje 10%, najmanje 15%, najmanje 20%, najmanje 25%, najmanje 30%, najmanje 35%, najmanje 40%, najmanje 45%, najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 99% ili više od 99% TEE sekvenci prikazanih u tabeli 32 i/ili TEE sekvenca može da uključuje fragment od 5-30 nukleotida, fragment od 5-25 nukleotida, fragment od 5-20 nukleotida, fragment od 5-15 nukleotida, fragment od 5-10 nukleotida TEE sekvenci prikazanih u tabeli 32.

[0120] U jednom neograničavajućem primeru, poznati TEE elementi mogu da budu u 5'-liderskoj sekvenci proteina Gtx homeodomena (Chappell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:9590-9594, 2004).

2

[0121] U drugom neograničavajućem primeru, TEE elementi su prikazani kao sekvence SEQ ID NO: 1-35 u objavi SAD patenta br. US20090226470, SEQ ID NO: 1-35 u objavi SAD patenta br. US20130177581, SEQ ID NO: 1-35 u objavi međunarodnog patenta br. WO2009075886, SEQ ID NO: 1-5, i 7-645 u objavi međunarodnog patenta br. WO2012009644, SEQ ID NO: 1 u objavi međunarodnog patenta br. WO1999024595, SEQ ID NO: 1 u SAD patentu br. US6310197, i SEQ ID NO: 1 u SAD patentu br. US6849405.

[0122] U još jednom neograničavajućem primeru, TEE može da bude unutrašnje mesto za ulazak u ribozom (IRES), HCV-IRES ili IRES elementi kao što su, ali ne i ograničeno na, elementi opisani u SAD patentu br. US7468275, objavama SAD patenata br. US20070048776 i US20110124100 i objavama međunarodnih patenata br. WO2007025008 i WO2001055369. IRES elementi mogu da uključuju, ali nisu ograničeni na, Gtx sekvence (npr., Gtx9-nt, Gtx8-nt, Gtx7-nt) koje su opisali autori Chappell et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:9590-9594, 2004) i Zhou et al. (PNAS 102:6273-6278, 2005) i u objavama SAD patenata br. US20070048776 i US20110124100 i u objavi međunarodnog patenta br. WO2007025008.

[0123] "Translacioni enhenserski polinukleotidi" ili "enhenserske polinukleotidne sekvence translacije " su polinukleotidi koji uključuju jedan ili više specifičnih TEE koji su kao primeri dati u ovom dokumentu i/ili prikazani u stanju tehnike (videti npr., US6310197, US6849405, US7456273, US7183395, US20090226470, US20070048776, US20110124100, US20090093049, US20130177581, WO2009075886, WO2007025008, WO2012009644, WO2001055371 WO1999024595. kao i EP2610341A1 i EP2610340A1), ili njihove varijante, homologe ili funkcionalne derivate. Jedna ili više kopija specifičnog TEE mogu da budu prisutne u polinukleotidima, primarnim konstruktima, modifikovanim nukleinskim kiselinama i/ili mmRNA. TEE elementi u translacionim enhenserskim polinukleotidima mogu da budu organizovani u vidu jednog ili više segmenata sekvence. U segmentu sekvence može da se nalazi jedan ili više specifičnih TEE elemenata koji su ovde dati kao primeri, pri čemu je svaki TEE prisutan u jednoj ili u više kopija. Kada je više segmenata sekvence prisutno u translacionom enhenserskom polinukleotidu, oni mogu da budu homogeni ili heterogeni. Dakle, u više segmenata sekvence u translacionom enhenserskom polinukleotidu mogu da se nalaze isti ili različiti tipovi specifičnih TEE elemenata čiji su primeri dati u ovom dokumentu, isti ili različit broj kopija svakog od specifičnih TEE elemenata, i/ili ista ili različita organizacija TEE elemenata u okviru svakog segmenta sekvence.

[0124] U jednom slučaju, polinukleotidi, primarni konstrukti, modifikovane nukleinske kiseline i/ili mmRNA mogu da uključuju najmanje jedan TEE koji je opisan u objavama međunarodnih patenata br. WO1999024595, WO2012009644, WO2009075886, WO2007025008,

2

WO1999024595, objavama evropskih patenata br. EP2610341A1 i EP2610340A1, SAD patentima br. US6310197, US6849405, US7456273, US7183395, objavama SAD patenata br. US20090226470, US20110124100, US20070048776, US20090093049, i US20130177581. TEE mogu da budu locirani u 5’UTR polinukleotida, primarnih konstrukata, modifikovanih nukleinskih kiselina i/ili mmRNA.

[0125] U drugom slučaju, polinukleotidi, primarni konstrukti, modifikovane nukleinske kiseline i/ili mmRNA mogu da uključuju najmanje jedan TEE koji ima najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 99% identičnosti sa TEE elementima opisanim u objavama SAD patenata br. US20090226470, US20070048776, US20130177581 i US20110124100, objavama međunarodnih patenata br. WO1999024595, WO2012009644, WO2009075886 i WO2007025008, objavama evropskih patenata br. EP2610341A1 i EP2610340A1, SAD patentima br. US6310197, US6849405, US7456273, US7183395.

[0126] U jednom slučaju, 5’UTR polinukleotida, primarnih konstrukata, modifikovanih nukleinskih kiselina i/ili mmRNA može da uključuje najmanje 1, najmanje 2, najmanje 3, najmanje 4, najmanje 5, najmanje 6, najmanje 7, najmanje 8, najmanje 9, najmanje 10, najmanje 11, najmanje 12, najmanje 13, najmanje 14, najmanje 15, najmanje 16, najmanje 17, najmanje 18 najmanje 19, najmanje 20, najmanje 21, najmanje 22, najmanje 23, najmanje 24, najmanje 25, najmanje 30, najmanje 35, najmanje 40, najmanje 45, najmanje 50, najmanje 55 ili više od 60 TEE sekvenci. TEE sekvence u 5’UTR polinukleotida, primarnih konstrukata, modifikovanih nukleinskih kiselina i/ili mmRNA prema predmetnom prikazu mogu da budu iste ili različite TEE sekvence. TEE sekvence mogu da budu u obrascu kao što je ABABAB ili AABBAABBAABB ili ABCABCABC ili njihove varijante, ponovljene jednom, dvaput, ili više od tri puta. U ovim obrascima, svako od slova A, B, ili C predstavlja različitu TEE sekvencu na nivou nukleotida.

[0127] U jednom slučaju, 5’UTR može da uključuje spejser koji razdvaja dve TEE sekvence. Kao neograničavajući primer, spejser može da bude spejser od 15 nukleotida i/ili drugi spejseri poznati u stanju tehnike. Kao drugi neograničavajući primer, 5’UTR može da uključuje modul TEE sekvenca-spejser, ponovljen najmanje jednom, najmanje dvaput, najmanje 3 puta, najmanje 4 puta, najmanje 5 puta, najmanje 6 puta, najmanje 7 puta, najmanje 8 puta i najmanje 9 puta ili više od 9 puta u 5’UTR.

[0128] U drugom slučaju, spejser koji razdvaja dve TEE sekvence može da uključuje druge sekvence poznate u stanju tehnike koje mogu da ragulišu translaciju polinukleotida, primarnih konstrukata, modifikovanih nukleinskih kiselina i/ili mmRNA prema predmetnom prikazu kao što su, ali ne i ograničeno na, miR sekvence opisane u ovom dokumentu (npr., miR vezujuća mesta i miR seme sekvence). Kao neograničavajući primer, svaki spejser koji se koristi za razdvajanje dve TEE sekvence može da uključuje različitu miR sekvencu ili komponentu miR sekvence (npr., miR seme sekvencu).

[0129] U jednom slučaju, TEE u 5’UTR polinukleotida, primarnih konstrukata, modifikovanih nukleinskih kiselina i/ili mmRNA prema predmetnom prikazu može da uključuje najmanje 5%, najmanje 10%, najmanje 15%, najmanje 20%, najmanje 25%, najmanje 30%, najmanje 35%, najmanje 40%, najmanje 45%, najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 99% ili više od 99% TEE sekvenci koje su prikazane u objavama SAD patenata br. US20090226470, US20070048776, US20130177581 i US20110124100, objavama međunarodnih patenata br. WO1999024595, WO2012009644, WO2009075886 i WO2007025008, objavama evropskih patenata br. EP2610341A1 i EP2610340A1, SAD patentima br. US6310197, US6849405, US7456273, US7183395. U drugom slučaju, TEE u 5’UTR polinukleotida, primarnih konstrukata, modifikovanih nukleinskih kiselina i/ili mmRNA prema predmetnom prikazu mogu da uključuju fragment od 5-30 nukleotida, fragment od 5-25 nukleotida, fragment od 5-20 nukleotida, fragment od 5-15 nukleotida, fragment od 5-10 nukleotida of the TEE sekvence disclosed u objavama SAD patenata br. US20090226470, US20070048776, US20130177581 i US20110124100, objavama međunarodnih patenata br. WO1999024595, WO2012009644, WO2009075886 i WO2007025008, objavama evropskih patenata br. EP2610341A1 i EP2610340A1, SAD patentima br. US6310197, US6849405, US7456273, US7183395.

[0130] U jednom slučaju, TEE u 5’UTR polinukleotida, primarnih konstrukata, modifikovanih nukleinskih kiselina i/ili mmRNA prema predmetnom prikazu može da uključuje najmanje 5%, najmanje 10%, najmanje 15%, najmanje 20%, najmanje 25%, najmanje 30%, najmanje 35%, najmanje 40%, najmanje 45%, najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 99% ili više od 99% TEE sekvenci prikazanih kod autora Chappell et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:9590-9594, 2004) i Zhou et al. (PNAS 102:6273-6278, 2005), u dopunskoj tabeli 1 i u dopunskoj tabeli 2 koje su prikazali autori Wellensiek et al (Genome-wide profiling of human cap-independent translation-enhancing elements, Nature Methods, 2013; DOI:10.1038/NMETH.2522). U drugom slučaju, TEE u 5’UTR polinukleotida, primarnih konstrukata, modifikovanih nukleinskih kiselina i/ili mmRNA prema predmetnom prikazu može da uključuje fragment od 5-30 nukleotida, fragment od 5-25 nukleotida, fragment od 5-20 nukleotida, fragment od 5-15 nukleotida, fragment od 5-10 nukleotida TEE sekvenci prikazanih

1

kod autora Chappell et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:9590-9594, 2004) i Zhou et al. (PNAS 102:6273-6278, 2005), u dopunskoj tabeli 1 i u dopunskoj tabeli 2 koje su prikazali autori Wellensiek et al (Genome-wide profiling of human cap-independent translation-enhancing elements, Nature Methods, 2013; DOI:10.1038/NMETH.2522).

[0131] U jednom slučaju, TEE koji se koristi u 5’UTR polinukleotida, primarnih konstrukata, modifikovanih nukleinskih kiselina i/ili mmRNA prema predmetnom prikazu je IRES sekvenca kao što je, ali ne i ograničeno na, IRES sekvence opisane u SAD patentu br. US7468275 i objavi međunarodnog patenta br. WO2001055369.

[0132] U jednom slučaju, TEE elementi koji se koriste u 5’UTR polinukleotida, primarnih konstrukata, modifikovanih nukleinskih kiselina i/ili mmRNA prema predmetnom prikazu mogu da se identifikuju postupcima koji su opisani u objavama SAD patenata br.US20070048776 i US20110124100 i objavama međunarodnih patenata br. WO2007025008 i WO2012009644.

[0133] U drugom slučaju, TEE elementi koji se koriste u 5’UTR polinukleotida, primarnih konstrukata, modifikovanih nukleinskih kiselina i/ili mmRNA prema predmetnom prikazu može da bude regulatorni element transkripcije opisan u SAD patentima br. US7456273 i US7183395, objavi SAD patenta br. US20090093049, i objavi međunarodnog patenta br. WO2001055371. Regulatorni elementi transkripcije mogu da se mogu da se identifikuju postupcima poznatim u stanju tehnike, kao što su, ali ne i ograničeno na, postupke opisane u SAD patentima br. US7456273 i US7183395, objavi SAD patenta br. US20090093049, i objavi međunarodnog patenta br. WO2001055371.

[0134] U još jednom slučaju, TEE koji se koristi u 5’UTR polinukleotida, primarnih konstrukata, modifikovanih nukleinskih kiselina i/ili mmRNA prema predmetnom prikazu je oligonukleotid ili njegov deo, kao što je opisano u SAD patentima br. US7456273 i US7183395, objavi SAD patenta br.US20090093049, i objavi međunarodnog patenta br. WO2001055371.

[0135] 5' UTR koji sadrži najmanje jedan ovde opisani TEE može da bude inkorporiran u monocistronsku sekvencu kao što je, ali ne i ograničeno na, vektorski sistem ili vektor nukleinske kiseline. Kao neograničavajući primer, vektorski sistemi ili vektori nukleinskih kiselina mogu da uključuju one koji su opisani u SAD patentima br.7456273 i US7183395, objavama SAD patenata br. US20070048776, US20090093049 i US20110124100 i objavama međunarodnih patenata br. WO2007025008 i WO2001055371.

[0136] U jednom slučaju, ovde opisani TEE elementi mogu da budu locirani u 5’UTR i/ili 3'UTR polinukleotida, primarnih konstrukata, modifikovanih nukleinskih kiselina i/ili mmRNA. TEE elementi locirani u 3'UTR mogu da budu isti i/ili različiti kao i TEE elementi locirani u i/ili opisani za, inkorporiranje u 5’UTR.

2

[0137] U jednom slučaju, 3'UTR polinukleotida, primarnih konstrukata, modifikovanih nukleinskih kiselina i/ili mmRNA može da uključuje najmanje 1, najmanje 2, najmanje 3, najmanje 4, najmanje 5, najmanje 6, najmanje 7, najmanje 8, najmanje 9, najmanje 10, najmanje 11, najmanje 12, najmanje 13, najmanje 14, najmanje 15, najmanje 16, najmanje 17, najmanje 18 najmanje 19, najmanje 20, najmanje 21, najmanje 22, najmanje 23, najmanje 24, najmanje 25, najmanje 30, najmanje 35, najmanje 40, najmanje 45, najmanje 50, najmanje 55 ili više od 60 TEE sekvenci. TEE sekvence u 3'UTR polinukleotida, primarnih konstrukata, modifikovanih nukleinskih kiselina i/ili mmRNA prema predmetnom prikazu mogu da budu iste ili različite TEE sekvence TEE sekvence. TEE sekvence mogu da budu u obrascu kao što su ABABAB ili AABBAABBAABB ili ABCABCABC ili njihove varijante, ponovljene jednom, dvaput, ili više od tri puta. U ovim obrascima, svako od slova A, B, ili C predstavlja različitu TEE sekvencu na nivou nukleotida.

[0138] U jednom slučaju, 3'UTR može da uključuje spejser koji razdvaja TEE sekvence. Kao neograničavajući primer, spejser može da bude spejser od 15 nukleotida i/ili drugi spejseri poznati u stanju tehnike. Kao drugi neograničavajući primer, 3'UTR može da uključuje modul TEE sekvenca-spejser ponovljen najmanje jednom, najmanje dvaput, najmanje 3 puta, najmanje 4 puta, najmanje 5 puta, najmanje 6 puta, najmanje 7 puta, najmanje 8 puta i najmanje 9 puta, ili više od 9 puta, u 3'UTR.

[0139] U drugom slučaju, spejser koji razdvaja dve TEE sekvence može da uključuje druge sekvence poznate u stanju tehnike koje mogu da ragulišu translaciju polinukleotida, primarnih konstrukata, modifikovanih nukleinskih kiselina i/ili mmRNA prema predmetnom prikazu kao što su, ali ne i ograničeno na, miR sekvence opisane u ovom dokumentu (npr., miR vezujuća mesta i miR seme sekvence). Kao neograničavajući primer, svaki spejser koji se koristi za razdvajanje dve TEE sekvence može da uključuje različitu miR sekvencu ili komponentu miR sekvence (npr., miR seme sekvencu).

[0140] U jednom slučaju, inkorporiranje miR sekvence i/ili TEE sekvence menja oblik drška petlja regiona što može da pojača ili smanji translaciju. (videti npr, Kedde et al. A Pumilio-induced RNA structure switch in p27-3'UTR controls miR-221 and miR-22 accessibility. Nature Cell Biology.

2010).

Heterologi 5'UTR regioni

[0141] 5' UTR može da bude obezbeđen u vidu oivičavajućeg regiona za modifikovane nukleinske kiseline (mRNA), poboljšane modifikovane RNK ili ribonukleinske kiseline prema prikazu.

5'UTR može da bude homolog ili heterolog u odnosu na kodirajući region koji se nalazi u modifikovanim nukleinskim kiselinama (mRNA), poboljšanoj modifikovanoj RNK ili ribonukleinskim kiselinama prema prikazu. Više 5' UTR regiona može da bude uključeno u oivičavajući region i mogu da budu iste ili različitih sekvenci. Bilo koji deo oivičavajućih regiona, uključujući i nijedan, može da bude sa optimizovanim kodonima i svaki može nezavisno da sadrži jednu ili više različitih hemijskih modifikacija, pre i/ili nakon optimizacije kodona.

[0142] U produženoj tabeli 21 u SAD privremenoj patentnoj prijavi br. 61/7/5,509, podnetoj 9. marta 2013., pod naslovom Heterologous Untranslated Regions for mRNA i u produženoj tabeli 21 i u tabeli 22 u SAD privremenoj patentnoj prijavi br.61/829,372, podnetoj 31. maja 2013., pod naslovom Heterologous Untranslated Regions for mRNA, pri čemu je sadržaj svake od njih ovde uključen putem reference u celosti, prikazana je lista start i stop mesta modifikovane nukleinske kiseline (mRNA), poboljšane modifikovane RNK ili ribonukleinskih kiselina prema prikazu. U tabeli 21 svaki 5'UTR (5'UTR-005 do 5'UTR 68511) identifikovan je svojim start i stop mestom u odnosu na svoj nativni ili prirodni (homologi) transkript (ENST; oznaka koja se koristi u bazi podataka ENSEMBL).

[0143] Dodatni 5'UTR regioni koji mogu da se koriste sa modifikovanim nukleinskim kiselinama, poboljšanom modifikovanom RNK ili ribonukleinskim kiselinama prema prikazu, prikazani su u predmetnom prikazu u tabeli 6, tabeli 38 i tabeli 41.

[0144] Da bi se izmenilo jedno ili više svojstava polinukleotida, primarnih konstrukata ili mmRNA prema prikazu, 5'UTR regioni koji su heterologi sa kodirajućim regionom modifikovane nukleinske kiseline (mRNA), poboljšane modifikovane RNK ili ribonukleinskih kiselina prema prikazu, inženjeringom se dodaju u jedinjenja prema pronalasku. Modifikovane nukleinske kiseline (mRNA), poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline se zatim primenjuju na ćelije, tkivo ili organizme, a ishodi kao što je nivo proteina, lokalizacija i/ili poluživot se mere kako bi se evaluirali potencijalni korisni efekti heterologih 5'UTR na modifikovane nukleinske kiseline (mRNA), poboljšanu modifikovanu RNK ili ribonukleinske kiseline prema prikazu. Varijante 5' UTR regiona mogu da se koriste pri čemu na terminusima može da se doda ili ukloni jedan ili više nukleotida, uključujući A, T, C ili G. 5'UTR regioni mogu takođe da budu sa optimizovanim kodonima ili modifikovani na bilo koji ovde opisan način.

Inkorporiranje microRNA vezujućih mesta

[0145] U jednom slučaju modifikovane nukleinske kiseline (mRNA), poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline prema prikazu ne kodiraju samo polipeptid već i senzorsku

4

sekvencu. Senzorske sekvence uključuju, na primer, microRNA vezujuća mesta, vezujuća mesta za faktore transkripcije, strukturirane mRNA sekvence i/ili motive, veštačka vezujuća mesta dobijena inženjeringom, sa funkcijom pseudo-receptora za endogene molekule koji se vezuju za nukleinske kiseline.

[0146] U jednom slučaju, sprovodi se profilisanje microRNA (miRNA) ciljnih ćelija ili tkiva kako bi se utvrdilo da li su miRNA prisutne u ćelijama i tkivima, ili odsutne.

[0147] microRNA (ili miRNA) su nekodirajući RNK molekuli dugi 19-25 nukleotida koji se vezuju za 3'UTR molekula nukleinske kiseline i smanjuju gensku ekspresiju, tako što, ili smanjuju stabilnost molekula, ili inhibiraju translaciju. Modifikovane nukleinske kiseline (mRNA), poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline prema prikazu mogu da sadrže jednu ili više microRNA ciljnih sekvenci, microRNA sekvenci, ili microRNA seme sekvenci. Ove sekvence mogu da odgovaraju bilo kojoj poznatoj microRNA kao što su sekvence predstavljene u SAD objavi US2005/0261218 i SAD objavi US2005/0059005. Kao neograničavajući primer, poznate microRNA, njihove sekvence i seme sekvence u humanom genomu navedene su u nastavku teksta u tabeli 11.

[0148] MicroRNA sekvenca sadrži „seme“ region tj. sekvencu u regionu pozicija 2-8 zrele microRNA, čija sekvenca ima savršenu Votson-Krik (Watson-Crick) komplementarnost sa miRNA ciljnom sekvencom. Seme microRNA može sadržati pozicije 2-8 ili 2-7 zrele microRNA. U nekim slučajevima, microRNA seme može da sadrži 7 nukleotida (npr. nukleotide 2-8 zrele microRNA), pri čemu je mesto komplementarno semenu u odgovarajućem miRNA cilju omeđeno adeninom (A) suprotno microRNA poziciji 1. U nekim slučajevima, microRNA seme može da sadrži 6 nukleotida (npr. nukleotidi 2-7 zrele microRNA), pri čemu je mesto komplementarno semenu u odgovarajućem miRNA cilju omeđeno adeninom (A) suprotno microRNA poziciji 1. Videti, na primer, Grimson A, Fam KK, Johnston WK, Garrett-Engele P, Lim LP, Bartel DP; Mol Cell. 2007 July 6; 27(1):91-105. Baze u seme microRNA imaju potpunu komplementarnost sa ciljnom sekvencom. Uvođenje putem inženjeringa microRNA ciljnih sekvenci u 3' UTR nukleinskih kiselina ili mRNA prema prikazu može se ciljati molekul radi degradacije ili smanjene translacije, pod uslovom da je dostupna dotična microRNA. Ovaj postupak će redukovati opasnost od nespecifičnih efekata nakon isporuke molekula nukleinske kiseline. Saopšteni su identifikacija microRNA, microRNA ciljnih regiona, i njihovi obrasci ekspresije i uloge u biologiji (Bonauer et al., Curr Drug Targets 201011:943-949; Anand i Cheresh Curr Opin Hematol 2011 18:171-176; Contreras i Rao Leukemia 2012 26: 404-413 (2011 Dec 20. doi: 10.1038/leu.2011.356); Bartel Cell 2009 136:215-233; Landgraf et al, Cell, 2007 129:1401-1414; Gentner and Naldini, Tissue Antigens. 2012 80:393-403 i sve reference u tom radu).

[0149] Na primer, ukoliko mRNA nije namenjena da bude isporučena u jetru ali tamo završi, tada miR-122, microRNA bogato zastupljena u jetri, može inhibirati ekspresiju gena od interesa ukoliko je jedno ili više ciljnih mesta miR-122 projektovano u 3' UTR modifikovanih nukleinskih kiselina, poboljšane modifikovane RNK ili ribonukleinskih kiselina. Introdukcija jednog ili više vezujućih mesta za različite microRNA može se projektovati da dodatno smanji dugovečnost, stabilnost, i translaciju proteina modifikovanih nukleinskih kiselina, poboljšane modifikovane RNK ili ribonukleinskih kiselina. Kako se ovde koristi, termin "microRNA mesto" označava ciljno mesto microRNA ili mesto prepoznavanja microRNA, ili bilo koju nukleotidnu sekvencu za koju se microRNA vezuje ili sa kojom asocira. Treba razumeti da "vezivanje" može slediti pravila tradicionalne Votson-Krik hibridizacije ili može odražavati bilo kakvu stabilnu asociranost microRNA sa ciljnom sekvencom na ili pored microRNA mesta.

[0150] Nasuprot tome, za potrebe modifikovanih nukleinskih kiselina, poboljšane modifikovane RNK ili ribonukleinskih kiselina prema predmetnom prikazu, microRNA vezujuća mesta mogu se projektovati od (tj. ukloniti iz) sekvenci u kojima se prirodno javljaju kako bi se povećala ekspresija proteina u specifičnim tkivima. Na primer, miR-122 vezujuća mesta mogu da se uklone kako bi se poboljšala ekspresija proteina u jetri.

[0151] U jednom slučaju, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline prema predmetnom prikazu mogu da uključuju najmanje jedno mesto vezivanja miRNA u 3'UTR kako bi se citotoksični ili citoprotektivni mRNA terapeutik usmerio u specifične ćelije, kao što su, ali ne i ograničeno na, normalne i/ili kancerske ćelije (npr., HEP3B ili SNU449).

[0152] U drugom slučaju, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline prema predmetnom prikazu mogu da uključuju tri mesta vezivanja miRNA u 3'UTR kako bi se citotoksični ili citoprotektivni mRNA terapeutik usmerio u specifične ćelije, kao što su, ali ne i ograničeno na, normalne i/ili kancerske ćelije (npr., HEP3B ili SNU449).

[0153] Regulacija ekspresije u višestrukim tkivima može da se postigne uvođenjem ili uklanjanjem jednog ili više mesta vezivanja za microRNA. U nastavku teksta, u tabeli 12, prikazane su microRNA koje su različito eksprimirane u različitim tkivima i ćelijama, i često u vezi sa različitim tipovima bolesti (npr. ćelijama kancera). Odluka da se uklone ili inseriraju mesta vezivanja za microRNA, ili bilo koja kombinacija, zavisi od obrazaca ekspresije microRNA i njihovog profilisanja u bolestima.

[0154] Primeri tkiva gde je poznato da mikroRNK reguliše mRNA, i time ekspresiju proteina, uključuju, ali nisu ograničeni na, jetru (miR-122), mišiće (miR-133, miR-206, miR-208), endotelske ćelije (miR-17-92, miR-126), mijeloidne ćelije (miR-142-3p, miR-142-5p, miR-16, miR-21, miR-223, miR-24, miR-27), masno tkivo (let-7, miR-30c), srce (miR-1d, miR-149), bubreg (miR-192, miR-194, miR-204), i epitelne ćelije pluća (let-7, miR-133, miR-126).

[0155] Specifično, poznato je da su microRNA diferencijalno eksprimirane u imunskim ćelijama (koje se nazivaju i hematopoetske ćelije), na primer, antigen prezentujućim ćelijama (APC ćelije) (npr. dendritske ćelije i makrofagi), makrofagima, monocitima, B limfocitima, T limfocitima, granulocitima, ćelijama prirodnim ubicama, itd. MicroRNA specifične za imunske ćelije uključene su u imunogenost, autoimunost, imunski odgovor na infekciju, inflamaciju, kao i u neželjeni imunski odgovor posle genske terapije i transplantacije tkiva/organa. MicroRNA specifične za imunske ćelije takođe regulišu brojne aspekte razvoja, proliferacije, diferencijacije i apoptoze hematopoetskih ćelija (imunskih ćelija). Na primer, miR-142 i miR-146 se eksprimiraju isključivo u imunskim ćelijama, posebno su bogato zastupljene u mijeloidnim dendritskim ćelijama. U stanju tehnike je pokazano da se imunski odgovor na molekule egzogenih nukleinskih kiselina isključuje kada se miR-142 vezujuća mesta dodaju u 3'UTR isporučenog genskog konstrukta, čime se obezbeđuje stabilniji genski transfer u tkiva i ćelije. miR-142 efikasno degraduje egzogene mRNA u antigen prezentujućim ćelijama i suprimira citotoksičnu eliminaciju transdukovanih ćelija (Annoni A et al., blood, 2009, 114,5152-5161; Brown BD, et al., Nat med. 2006, 12(5), 585-591; Brown BD, et al., blood, 2007,110(13): 4144-4152).

[0156] Antigenom posredovani imunski odgovor može da se odnosi na imunski odgovor koji se inicira stranim antigenima, koji se, kada uđu u organizam, obrađuju u antigen prezentujućim ćelijama i prikazuju na površini antigen prezentujućih ćelija. T ćelije mogu da prepoznaju prezentovani antigen i da indukuju citotoksičnu eliminaciju ćelija koje eksprimiraju antigen.

[0157] Uvođenje miR-142 vezujućeg mesta u 3'-UTR polipeptida prema predmetnom prikazu može da dovede do selektivne represije genske ekspresije u antigen prezentujućim ćelijama putem miR-142 posredovane degradacije mRNA, čime se ograničava prezentacija antigena u APC ćelijama (npr. dendritskim ćelijama) i time spečava antigenom posredovani imunski odgovor nakon isporučivanja polinukleotida. Polinukleotidi su na taj način stabilno eksprimirani u ciljnim tkivima ili ćelijama, a da se pritom ne inicira citotoksična eliminacija.

[0158] U jednom slučaju, vezujuća mesta microRNA molekula za koja se zna da su eksprimirana u imunskim ćelijama, konkretno, u antigen prezentujućim ćelijama, mogu inženjeringom da se uvedu u polinukleotid kako bi suprimirala ekspresiju senzorsko-signalnog polinukleotida u APC ćelijama preko microRNA posredovane degradacije RNK, koja smanjuje antigenom posredovan imunski odgovor, dok se ekspresija polinukleotida održava u neimunskim ćelijama u kojima nisu eksprimirane microRNA specifične za imunske ćelije. Na primer, da bi se sprečila imunogena reakcija do koje dovodi ekspresija proteina specifičnih za jetru, miR-122 vezujuće mesto može da se ukloni, i miR-142 (i/ili mirR-146) vezujuća mesta mogu inženjeringom da se uvedu u 3-UTR polinukleotida.

[0159] U cilju dodatnog usmeravanja selektivne degradacije i supresije mRNA u APC ćelijama i makrofagima, polinukleotid može da uključuje još jedan negativan regulatorni element u 3-UTR, bilo sam, bilo u kombinaciji sa mir-142 i/ili mir-146 vezujućim mestima. Kao neograničavajući primer, jedan regulatorni element predstavljaju elementi konstitutivnog raspadanja (CDE elementi).

[0160] MicroRNA specifične za imunske ćelije uključuju, ali nisu ograničene na, hsa-let-7a-2-3p, hsa-let-7a-3p, hsa-7a-5p, hsa-let-7c, hsa-let-7e-3p, hsa-let-7e-5p, hsa-let-7g-3p, hsa-let-7g-5p, hsa-let-7i-3p, hsa-let-7i-5p, miR-10a-3p, miR-10a-5p, miR-1184, hsa-let-7f-1--3p, hsa-let-7f-2--5p, hsa-let-7f-5p, miR-125b-1-3p, miR-125b-2-3p, miR-125b-5p, miR-1279, miR-130a-3p, miR-130a-5p, miR-132-3p, miR-132-5p, miR-142-3p, miR-142-5p, miR-143-3p, miR-143-5p, miR-146a-3p, miR-146a-5p, miR-146b-3p, miR-146b-5p, miR-147a, miR-147b, miR-148a-5p, miR-148a-3p, miR-150-3p, miR-150-5p, miR-151b, miR-155-3p, miR-155-5p, miR-15a-3p, miR-15a-5p, miR-15b-5p, miR-15b-3p, miR-16-1-3p, miR-16-2-3p, miR-16-5p, miR-17-5p, miR-181a-3p, miR-181a-5p, miR-181a-2-3p, miR-182-3p, miR-182-5p, miR-197-3p, miR-197-5p, miR-21-5p, miR-21-3p, miR-214-3p, miR-214-5p, miR-223-3p, miR-223-5p, miR-221-3p, miR-221-5p, miR-23b-3p, miR-23b-5p, miR-24-1-5p,miR-24-2-5p, miR-24-3p, miR-26a-1-3p, miR-26a-2-3p, miR-26a-5p, miR-26b-3p, miR-26b-5p, miR-27a-3p, miR-27a-5p, miR-27b-3p,miR-27b-5p, miR-28-3p, miR-28-5p, miR-2909, miR-29a-3p, miR-29a-5p, miR-29b-1-5p, miR-29b-2-5p, miR-29c-3p, miR-29c-5p" miR-30e-3p, miR-30e-5p, miR-331-5p, miR-339-3p, miR-339-5p, miR-345-3p, miR-345-5p, miR-346, miR-34a-3p, miR-34a-5p, , miR-363-3p, miR-363-5p, miR-372, miR-377-3p, miR-377-5p, miR-493-3p, miR-493-5p, miR-542, miR-548b-5p, miR548c-5p, miR-548i, miR-548j, miR-548n, miR-574-3p, miR-598, miR-718, miR-935, miR-99a-3p, miR-99a-5p, miR-99b-3p i miR-99b-5p. MicroRNA koje su obilnije u specifičnim tipovima imunskih ćelija, navedene su u spisku u tabeli 13. Osim toga, u stanju tehnike su otkrivene nove microRNA u imunskim ćelijama, putem mikro-erej hibidizacije i mikrotomske analize (Jima DD et al, Blood, 2010, 116:e118-e127; Vaz C et al., BMC Genomics, 2010,11,288.)

[0161] MicroRNA za koje se zna da su eksprimirane u jetri, uključuju, ali nisu ograničene na, miR-107, miR-122-3p, miR-122-5p, miR-1228-3p, miR-1228-5p, miR-1249, miR-129-5p, miR-1303, miR-151a-3p, miR-151a-5p, miR-152, miR-194-3p, miR-194-5p, miR-199a-3p, miR-199a-5p, miR-199b-3p, miR-199b-5p, miR-296-5p, miR-557, miR-581, miR-939-3p, miR-939-5p. MicroRNA vezujuća mesta iz bilo kojih microRNA specifičnih za jetru mogu da se uvedu u ili uklone iz, polinukleotida, kako bi se regulisala ekspresija polinukleotida u jetri. microRNA vezujuća mesta specifična za jetru mogu inženjeringom da se uvedu, sama ili dodatno u kombinaciji sa vezujućim mestima microRNA iz imunskih ćelija (npr. APC ćelija), kako bi bila sprečena imunska reakcija na ekspresiju proteina u jetri.

[0162] MicroRNA za koje se zna da su eksprimirane u plućima, uključuju, ali nisu ograničene na, let-7a-2-3p, let-7a-3p, let-7a-5p, miR-126-3p, miR-126-5p, miR-127-3p, miR-127-5p, miR-130a-3p, miR-130a-5p, miR-130b-3p, miR-130b-5p, miR-133a, miR-133b, miR-134, miR-18a-3p, miR-18a-5p, miR-18b-3p, miR-18b-5p, miR-24-1-5p, miR-24-2-5p, miR-24-3p, miR-296-3p, miR-296-5p, miR-32-3p, miR-337-3p, miR-337-5p, miR-381-3p, miR-381-5p. MicroRNA vezujuća mesta iz bilo koje microRNA specifične za pluća mogu da se uvedu u, ili uklone iz polinukleotida, kako bi se regulisala ekspresija polinukleotida u plućima. MicroRNA vezujuća mesta specifična za pluća mogu inženjeringom da se uvedu, sama ili dodatno u kombinaciji sa vezujućim mestima microRNA iz imunskih ćelija (npr. APC ćelija), kako bi bila sprečena imunska reakcija na ekspresiju proteina u plućima.

[0163] MicroRNA za koje se zna da su eksprimirane u srcu uključuju, ali nisu ograničene na, miR-1, miR-133a, miR-133b, miR-149-3p, miR-149-5p, miR-186-3p, miR-186-5p, miR-208a, miR-208b, miR-210, miR-296-3p, miR-320, miR-451a, miR-451b, miR-499a-3p, miR-499a-5p, miR-499b-3p, miR-499b-5p, miR-744-3p, miR-744-5p, miR-92b-3p i miR-92b-5p. MicroRNA vezujuća mesta iz bilo koje microRNA specifične za srce mogu da se uvedu u, ili uklone iz polinukleotida, kako bi se regulisala ekspresija polinukleotida u srcu. MicroRNA vezujuća mesta specifična za srce mogu inženjeringom da se uvedu, sama ili dodatno u kombinaciji sa vezujućim mestima microRNA iz imunskih ćelija (npr. APC ćelija), kako bi bila sprečena imunska reakcija na ekspresiju proteina u srcu.

[0164] MicroRNA za koje se zna da su eksprimirane u nervnom sistemu uključuju, ali nisu ograničene na, miR-124-5p, miR-125a-3p, miR-125a-5p, miR-125b-1-3p, miR-125b-2-3p, miR-125b-5p,miR-1271-3p, miR-1271-5p, miR-128, miR-132-5p, miR-135a-3p, miR-135a-5p, miR-135b-3p, miR-135b-5p, miR-137, miR-139-5p, miR-139-3p, miR-149-3p, miR-149-5p, miR-153, miR-181c-3p, miR-181c-5p, miR-183-3p, miR-183-5p, miR-190a, miR-190b, miR-212-3p, miR-212-5p, miR-219-1-3p, miR-219-2-3p, miR-23a-3p, miR-23a-5p,miR-30a-5p, miR-30b-3p, miR-30b-5p, miR-30c-1-3p, miR-30c-2-3p, miR-30c-5p, miR-30d-3p, miR-30d-5p, miR-329, miR-342-3p, miR-3665, miR-3666, miR-380-3p, miR-380-5p, miR-383, miR-410, miR-425-3p, miR-425-5p, miR-454-3p, miR-454-5p, miR-483, miR-510, miR-516a-3p, miR-548b-5p, miR-548c-5p, miR-571, miR-7-1-3p, miR-7-2-3p, miR-7-5p, miR-802, miR-922, miR-9-3p i miR-9-5p. MicroRNA koje su zastupljenije u nervnom sistemu dalje uključuju microRNA specifično eksprimirane u neuronima, uključujući, ali ne i ograničeno na, miR-132-3p, miR-132-3p, miR148b-3p, miR-148b-5p, miR-151a-3p, miR-151a-5p, miR-212-3p, miR-212-5p, miR-320b, miR-320e, miR-323a-3p, miR-323a-5p, miR-324-5p, miR-325, miR-326, miR-328, miR-922, kao i microRNA specifično eksprimirane u ćelijama glije, uključujući, ali ne i ograničeno na, miR-1250, miR-219-1-3p, miR-219-2-3p, miR-219-5p, miR-23a-3p, miR-23a-5p, miR-3065-3p, miR-3065-5p, miR-30e-3p, miR-30e-5p, miR-32-5p, miR-338-5p, miR-657. MicroRNA vezujuća mesta iz bilo koje microRNA specifične za CNS mogu da se uvedu u, ili uklone iz polinukleotida, kako bi se regulisala ekspresija polinukleotida u nervnom sistemu. MicroRNA vezujuća mesta specifična za nervni sistem mogu inženjeringom da se uvedu, sama ili dodatno u kombinaciji sa vezujućim mestima microRNA iz imunskih ćelija (npr. APC ćelija), kako bi bila sprečena imunska reakcija na ekspresiju proteina u nervnom sistemu.

[0165] MicroRNA za koje se zna da su eksprimirane u pankreasu uključuju, ali nisu ograničene na, miR-105-3p, miR-105-5p, miR-184, miR-195-3p, miR-195-5p, miR-196a-3p, miR-196a-5p, miR-214-3p, miR-214-5p, miR-216a-3p, miR-216a-5p, miR-30a-3p, miR-33a-3p, miR-33a-5p, miR-375, miR-7-1-3p, miR-7-2-3p, miR-493-3p, miR-493-5p i miR-944. MicroRNA vezujuća mesta iz bilo koje microRNA specifične za pankreas mogu da se uvedu u, ili uklone iz polinukleotida, kako bi se regulisala ekspresija polinukleotida u pankreasu. MicroRNA vezujuća mesta specifična za pankreas mogu inženjeringom da se uvedu, sama ili dodatno u kombinaciji sa vezujućim mestima microRNA iz imunskih ćelija (npr. APC ćelija), kako bi bila sprečena imunska reakcija na ekspresiju proteina u pankreasu.

[0166] MicroRNA za koje se zna da su eksprimirane u bubrezima dalje uključuju, ali nisu ograničene na, miR-122-3p, miR-145-5p, miR-17-5p, miR-192-3p, miR-192-5p, miR-194-3p, miR-194-5p, miR-20a-3p, miR-20a-5p, miR-204-3p, miR-204-5p, miR-210, miR-216a-3p, miR-216a-5p, miR-296-3p, miR-30a-3p, miR-30a-5p, miR-30b-3p, miR-30b-5p, miR-30c-1-3p, miR-30c-2-3p, miR30c-5p, miR-324-3p, miR-335-3p, miR-335-5p, miR-363-3p, miR-363-5p i miR-562. MicroRNA vezujuća mesta iz bilo koje microRNA specifične za bubreg mogu da se uvedu u, ili uklone iz polinukleotida, kako bi se regulisala ekspresija polinukleotida u bubrezima. MicroRNA vezujuća mesta specifična za bubreg mogu inženjeringom da se uvedu, sama ili dodatno u kombinaciji sa vezujućim mestima microRNA iz imunskih ćelija (npr. APC ćelija), kako bi bila sprečena imunska reakcija na ekspresiju proteina u bubrezima.

[0167] MicroRNA za koje se zna da su eksprimirane u mišićima dalje uključuju, ali nisu ograničene na, let-7g-3p, let-7g-5p, miR-1, miR-1286, miR-133a, miR-133b, miR-140-3p, miR-143-3p, miR-143-5p, miR-145-3p, miR-145-5p, miR-188-3p, miR-188-5p, miR-206, miR-208a, miR-208b, miR-25-3p i miR-25-5p. MicroRNA vezujuća mesta iz bilo koje microRNA specifične za mišiće mogu da se uvedu u, ili uklone iz polinukleotida, kako bi se regulisala ekspresija

4

polinukleotida u mišićima. MicroRNA vezujuća mesta specifična za mišiće mogu inženjeringom da se uvedu, sama ili dodatno u kombinaciji sa vezujućim mestima microRNA iz imunskih ćelija (npr. APC ćelija), kako bi bila sprečena imunska reakcija na ekspresiju proteina u mišićima.

[0168] MicroRNA su diferencijalno eksprimirane u različitim tipovima ćelija, kao što su endotelske ćelije, epitelne ćelije i adipociti. Na primer, microRNA koje su eksprimirane u endotelskim ćelijama uključuju, ali nisu ograničene na, let-7b-3p, let-7b-5p, miR-100-3p, miR-100-5p, miR-101-3p, miR-101-5p, miR-126-3p, miR-126-5p, miR-1236-3p, miR-1236-5p, miR-130a-3p, miR-130a-5p, miR-17-5p, miR-17-3p, miR-18a-3p, miR-18a-5p, , miR-19a-3p, miR-19a-5p, miR-19b-1-5p, miR-19b-2-5p, miR-19b-3p, miR-20a-3p, miR-20a-5p, miR-217, miR-210, miR-21-3p, miR-21-5p, miR-221-3p, miR-221-5p, miR-222-3p, miR-222-5p, miR-23a-3p, miR-23a-5p, miR-296-5p, miR-361-3p, miR-361-5p, miR-421, miR-424-3p, miR-424-5p, miR-513a-5p, miR-92a-1-5p, miR-92a-2-5p, miR-92a-3p, miR-92b-3p i miR-92b-5p. Brojne nove microRNA su otkrivene u endotelskim ćelijama putem analize dubokim sekvenciranjem (Voellenkle C et al., RNA, 2012,18,472-484) microRNA vezujuća mesta iz bilo koje microRNA specifične za endotelske ćelija, može da se uvede u, ili ukloni iz polinukleotida, kako bi se modulisala ekspresija polinukleotida u endotelskim ćelijama u različitim uslovima.

[0169] Kao dodatni primer, microRNA koje su eksprimirane u epitelnim ćelijama uključuju, ali nisu ograničene na, let-7b-3p, let-7b-5p, miR-1246, miR-200a-3p, miR-200a-5p, miR-200b-3p, miR-200b-5p, miR-200c-3p, miR-200c-5p, miR-338-3p, miR-429, miR-451a, miR-451b, miR-494, miR-802 i miR-34a, miR-34b-5p, miR-34c-5p, miR-449a, miR-449b-3p, miR-449b-5p specifično u respiratornim cilijarnim epitelnim ćelijama; let-7 family, miR-133a, miR-133b, miR-126 specifično u epitelnim ćelijama pluća; miR-382-3p, miR-382-5p specifično u bubrežnim epitelnim ćelijama i miR-762 specifično u epitelnim ćelijama rožnjače. MicroRNA vezujuća mesta iz bilo koje microRNA specifične za epitelne ćelije mogu da se uvedu u ili uklone iz polinukleotida kako bi se modulisala ekspresija polinukleotida u epitelnim ćelijama u različitim uslovima.

[0170] Osim toga, postoji velika grupa microRNA koje su zastupljenije u embrionalnim matičnim ćelijama i koje kontrolišu samoobnavljanje matičnih ćelija kao i razvoj i/ili diferencijaciju različitih ćelijskih loza, kao što su nervne ćelije, srčane, hematopoetske, ćelije kože, osteogene ćelije i mišićne ćelije (Kuppusamy KT et al., Curr. Mol Med, 2013, 13(5), 757-764; Vidigal JA and Ventura A, Semin Cancer Biol. 2012, 22(5-6), 428-436; Goff LA et al., PLoS One, 2009, 4:e7192; Morin RD et al., Genome Res,2008,18, 610-621; Yoo JK et al., Stem Cells Dev.2012, 21(11), 2049-2057). MicroRNA koje su zastupljenije u embrionalnim matičnim ćelijama, uključuju, ali nisu ograničene na, let-7a-2-3p, let-a-3p, let-7a-5p, let7d-3p, let-7d-5p, miR-103a-2-3p, miR-103a-5p, miR-106b-3p, miR-106b-5p, miR-1246, miR-1275, miR-138-1-3p, miR-1382-3p, miR-138-5p, miR-154-3p, miR-154-5p, miR-200c-3p, miR-200c-5p, miR-290, miR-301a-3p, miR-301a-5p, miR-302a-3p, miR-302a-5p, miR-302b-3p, miR-302b-5p, miR-302c-3p, miR-302c-5p, miR-302d-3p, miR-302d-5p, miR-302e, miR-367-3p, miR-367-5p, miR-369-3p, miR-369-5p, miR-370, miR-371, miR-373, miR-380-5p, miR-423-3p, miR-423-5p, miR-486-5p, miR-520c-3p, miR-548e, miR-548f, miR-548g-3p, miR-548g-5p, miR-548i, miR-548k, miR-548l, miR-548m, miR-548n, miR-548o-3p, miR-548o-5p, miR-548p, miR-664a-3p, miR-664a-5p, miR-664b-3p, miR-664b-5p, miR-766-3p, miR-766-5p, miR-885-3p, miR-885-5p,miR-93-3p, miR-93-5p, miR-941, miR-96-3p, miR-96-5p, miR-99b-3p i miR-99b-5p. Brojne nove microRNA čije je postojanje predviđeno, otkrivene su dubokim sekvenciranjem u humanim embrionalnim matičnim ćelijama (Morin RD et al., Genome Res,2008,18, 610-621; Goff LA et al., PLoS One, 2009, 4:e7192; Bar M et al., Stem cells, 2008, 26, 2496-2505).

[0171] U jednom slučaju, vezujuća mesta za microRNA koje su specifične za embrionalne matične ćelije mogu da budu uključena u, ili uklonjena iz 3-UTR polinukleotida u cilju modulacije razvoja i/ili diferencijacije embrionalnih matičnih ćelija, kako bi se inhibirala senescencija matičnih ćelija u degenerativnom stanju (npr. kod degenerativnih bolesti), ili stimulisala senescencija i apoptoza matičnih ćelija u stanju bolesti (npr. matičnih ćelija kancera).

[0172] Brojna ispitivanja microRNA ekspresije su sprovedena u oblasti kako bi se profilisala diferencijalna ekspresija microRNA molekula u različitim ćelijama/tkivima kod kancera i drugih bolesti. Neke microRNA su abnormalno prekomerno eksprimirane u pojedinim ćelijama kancera, dok je ekspresija drugih manja od normalne. Na primer, microRNA su diferencijalno eksprimirane u ćelijama kancera (WO2008/154098, US2013/0059015, US2013/0042333, WO20111157294); matičnim ćelijama kancera (US2012/0053224); kancerima i bolestima pankreasa (US2009/0131348, US2011/0171646, US2010/0286232, US8389210); kod astme i inflamacije (US8415096); kancera prostate (US2013/0053264); hepatocelularnog karcinoma (WO2012/151212, US2012/0329672, WO2008/054828, US8252538); ćelija plućnog kancera (WO2011/076143, WO2013/033640, WO2009/070653, US2010/032335/); kožnih T ćelijskih limfoma (WO2013/011378); ćelija kolorektalnog kancera (WO2011/0281756, WO2011/076142); u kancer-pozitivnim limfnim čvorovima (WO2009/100430, US2009/0263803); nazofaringealnom karcinomu (EP2112235); hroničnoj opstruktivnoj bolesti pluća (US2012/0264626, US2013/0053263); kanceru štitne žlezde (WO2013/066678); u ćelijama kancera jajnika (US2012/0309645, WO2011/095623); ćelijama kancera dojke (WO2008/154098, WO2007/081740, US2012/0214699), leukemiji i limfomu (WO2008/073915, US2009/0092974, US2012/0316081, US2012/0283310, WO2010/018563.)

[0173] Kao neograničavajući primer, microRNA mesta koja su prekomerno eksprimirana kod pojedinih ćelija kancera i/ili tumora mogu da se uklone iz 3-UTR polinukleotida koji kodira polipeptid od interesa, čime se ponovo uspostavlja ekspresija koja je bila suprimirana prekomerno eksprimiranim microRNA u ćelijama kancera, a što poboljšava ko-responsivnu biološku funkciju, na primer, stimulaciju i/ili represiju transkripcije, zastoj u ćelijskom ciklusu, apoptozu i ćelijsku smrt. Normalne ćelije i tkiva u kojima ekspresija microRNA molekula nije pojačana, ostaju bez ovog delovanja.

[0174] MicroRNA takođe može da reguliše kompleksne biološke procese kao što je angiogeneza (miR-132) (Anand and Cheresh Curr Opin Hematol 2011 18:171-176). U modifikovanim nukleinskim kiselinama, poboljšanoj modifikovanoj RNK ili ribonukleinskim kiselinama prema prikazu, vezujuća mesta za microRNA koje su uključene u ove procese mogu da se uklone ili uvedu, kako bi se ekspresija modifikovanih nukleinskih kiselina, poboljšane modifikovane RNK ili ribonukleinskih kiselina podesila u skladu sa biološki relevantnim tipovima ćelija ili sa kontekstom relevantnih bioloških procesa. U ovom kontekstu, mRNA se definišu kao auksotrofne mRNA.

[0175] Na gensku regulaciju putem microRNA može da ima uticaja okolna sekvenca microRNA kao što je, ali ne i ograničeno na, vrsta sekvence, tip sekvence (npr., heterologa, homologa i veštačka), regulatorni elementi u okolnoj sekvenci i/ili strukturni elementi u okolnoj sekvenci. Na microRNA mogu da imaju uticaja 5’UTR i/ili 3'UTR. Kao neograničavajući primer, ne-humani 3'UTR može da poveća regulatorni efekat microRNA sekvence na ekspresiju polipeptida od interesa u poređenju sa humanim 3'UTR sa sekvencom istog tipa.

[0176] U jednom slučaju, drugi regulatorni elementi i/ili strukturni elementi 5'-UTR regiona mogu da utiču na gensku regulaciju posredovanu putem microRNA. Jedan primer regulatornog elementa i/ili strukturnog elementa je strukturirana IRES sekvenca (unutrašnje mesto za ulazak u ribozom) u 5’UTR, koja je neophodna za vezivanje elongacionih faktora translacije kako bi se inicirala translacija proteina. Vezivanje EIF4A2 za ovaj sekundarni strukturni element u 5’UTR je neophodno za gensku ekspresiju posredovanu putem microRNA (Meijer HA et al., Science, 2013, 340, 82-85). Modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline prema prikazu mogu dodatno da budu modifikovane tako da uključuju ovaj strukturirani 5'-UTR kako bi se poboljšala genska regulacija posredovana putem microRNA.

[0177] Najmanje jedno microRNA mesto može inženjeringom da se uvede u 3' UTR modifikovanih nukleinskih kiselina, poboljšane modifikovane RNK ili ribonukleinskih kiselina prema predmetnom prikazu. U ovom kontekstu, najmanje dve, najmanje tri, najmanje četiri, najmanje pet, najmanje šest, najmanje sedam, najmanje osam, najmanje devet, najmanje deset ili

4

više microRNA mesta može inženjeringom da se uvede u 3' UTR ribonukleinskih kiselina prema predmetnom prikazu. U jednom slučaju, microRNA mesta inkorporirana u modifikovane nukleinske kiseline, poboljšanu modifikovanu RNK ili ribonukleinske kiseline, mogu da budu ista ili mogu da budu različita microRNA mesta. U drugom slučaju, microRNA mesta inkorporirana u modifikovane nukleinske kiseline, poboljšanu modifikovanu RNK ili ribonukleinske kiseline mogu da budu usmerena na ista ili različita tkiva u telu. Kao neograničavajući primer, putem uvođenja mesta vezivanja za microRNA koja su specifična za tkivo, tip ćelije ili za bolest, u 3' UTR mRNA modifikovanih nukleinskih kiselina, stepen ekspresije u specifičnim tipovima ćelija (npr. hepatocitima, mijeloidnim ćelijama, endotelskim ćelijama, ćelijama kancera, itd.) može da se smanji.

[0178] U jednom slučaju, microRNA mesto može inženjeringom da se uvede blizu 5' terminusa 3'UTR regiona, otprilike na pola puta između 5' terminusa i 3' terminusa 3'UTR regiona i/ili blizu 3'terminusa 3'UTR regiona. Kao neograničavajući primer, microRNA mesto može inženjeringom da se uvede blizu 5' terminusa 3'UTR regiona i otprilike na pola puta između 5' terminusa i 3'terminusa 3'UTR regiona. Kao drugi neograničavajući primer, microRNA mesto može inženjeringom da se uvede blizu 3'terminusa 3'UTR regiona i otprilike na pola puta između 5' terminusa i 3'terminusa 3'UTR regiona. Kao još jedan neograničavajući primer, microRNA mesto može inženjeringom da se uvede blizu 5' terminusa 3'UTR regiona i blizu 3' terminusa 3'UTR regiona.

[0179] U drugom slučaju, 3'UTR može da sadrži 4 microRNA mesta. MicroRNA mesta mogu da budu potpuna microRNA vezujuća mesta, microRNA seme sekvence i/ili sekvence microRNA vezujućih mesta bez seme sekvence.

[0180] U jednom slučaju, nukleinska kiselina prema prikazu inženjeringom može da se obradi tako da uključuje najmanje jednu microRNA u cilju prigušivanja prezentacije antigena od strane antigen prezentujućih ćelija. MicroRNA može da bude potpuna microRNA sekvenca, microRNA seme sekvenca, microRNA sekvenca bez semena ili njihova kombinacija. Kao neograničavajući primer, microRNA inkorporirana u nukleinsku kiselinu može da bude specifična za hematopoetski sistem. Kao drugi neograničavajući primer, microRNA koja je inkorporirana u nukleinsku kiselinu prema prikazu kako bi se prigušila prezentacija antigena, je miR-142-3p.

[0181] U jednom slučaju, nukleinska kiselina inženjeringom može da se obradi tako da uključuje microRNA mesta koja su eksprimirana u različitim tkivima subjekta. Kao neograničavajući primer, modifikovana nukleinska kiselina, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinska kiselina prema predmetnom prikazu mogu da se obrade inženjeringom tako da uključuju miR-192 i miR-122 u cilju regulacije ekspresije modifikovane nukleinske kiseline, poboljšane modifikovane RNK ili ribonukleinske kiseline u jetri i bubrezima subjekta. U drugom slučaju, modifikovana nukleinska kiselina, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinska kiselina mogu da se obrade inženjeringom tako da uključuju više od jednog microRNA mesta za isto tkivo. Na primer, modifikovana nukleinska kiselina, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinska kiselina prema predmetnom prikazu mogu da se obrade inženjeringom tako da uključuju miR-17-92 i miR-126 u cilju regulacije ekspresije modifikovane nukleinske kiseline, poboljšane modifikovane RNK ili ribonukleinske kiseline u endotelnim ćelijama subjekta.

[0182] U jednom slučaju, terapeutski prozor i ili diferencijalna ekspresija asocirana sa ciljnim polinukleotidom koji je kodiran modifikovanom nukleinskom kiselinom, poboljšanom modifikovanom RNK ili ribonukleinskom kiselinom koja kodira signal (ovde označena i kao polinukleotid) prema prikazu, može da se izmeni. Na primer, polinukleotidi mogu da budu dizajnirani tako da je signal za umiranje više eksprimiran u ćelijama kancera (ili signal za preživljavanje u normalnoj ćeliji) posredstvom miRNA otiska ovih ćelija. Kada kancerska ćelija eksprimira niži nivo konkretne miRNA, polinukleotid koji kodira vezujuće mesto za tu miRNA (ili te miRNA) biće intenzivnije eksprimiran. Usled toga, ciljni polipeptid koga kodira polinukleotid, bira se u vidu proteina koji pokreće ili indukuje ćelijsku smrt. Susedne ne-kancerske ćelije, u kojima je ekspresija miRNA viša, biće manje pod uticajem kodiranog signala za umiranje, pošto će polinukleotid biti eksprimiran u nižem nivou usled efekata vezivanja miRNA za vezujuće mesto ili za "senzor" koji je kodiran u 3'UTR. Suprotno tome, opstanak ćelije ili citoprotektivni signali mogu da se isporučuju u tkiva koja sadrže kancerske i ne-kancerske ćelije, kada miRNA ima višu ekspresiju u kancerskim ćelijama-što za posledicu ima niži signal za preživljavanje za kancerske ćelije i veći otisak preživljavanja za normalnu ćeliju. Moguće je dizajnirati i primenjivati višestruke polinukleotide koji imaju različite signale u skladu sa prethodno izloženom paradigmom.

[0183] U jednom slučaju, ekspresija nukleinske kiseline može da se kontroliše inkorporiranjem najmanje jedne senzorske sekvence u nukleinsku kiselinu i formulisanjem nukleinske kiseline. Kao neograničavajući primer, nukleinska kiselina može da se usmeri ka ortotopnom tumoru tako što se u nukleinsku kiselinu inkorporira miR-122 vezujuće mesto i ona se formuliše u lipidnoj nanočestici koja sadrži katjonski lipid DLin-KC2-DMA (videti npr., eksperimente opisane u primerima 49A i 49B).

[0184] Prema predmetnom prikazu, polinukleotidi mogu da budu modifikovani kako bi se izbegli nedostaci drugih molekula koji kodiraju polipeptide, poznatih u stanju tehnike. Dakle, u ovom slučaju polinukleotidi se označavaju kao modifikovani polinukleotidi.

4

[0185] Ako se razumeju obrasci ekspresije microRNA u različitim tipovima ćelija modifikovane nukleinske kiseline, poboljšane modifikovane RNK ili ribonukleinske kiseline kao što su polinukleotidi mogu da se konstruišu inženjeringom u cilju usmerenije ekspresije u specifičnim tipovima ćelija ili samo u specifičnim biološkim uslovima. Uvođenjem tkivno specifičnih microRNA vezujućih mesta, mogu da se dizajniraju modifikovane nukleinske kiseline, poboljšane modifikovane RNK ili ribonukleinske kiseline koje bi bile optimalne za ekspresiju proteina u tkivu ili u kontekstu neke biološke uslovljenosti.

[0186] Eksperimenti transfekcije mogu da se sprovedu u relevantnim ćelijskim linijama, pomoću inženjeringom dobijenih modifikovanih nukleinskih kiselina, poboljšane modifikovane RNK ili ribonukleinskih kiselina, a proizvodnja proteina može da se testira u različitim vremenskim tačkama nakon transfekcije. Na primer, ćelije mogu da se transfektuju nukleinskim kiselinama i mRNA sa različitim inženjeringom dobijenim microRNA vezujućim mestima, i upotrebom ELISA kita na relevantni protein i testiranjem proteina proizvedenih na 6 sati, 12 sati, 24 sata, 48 sati, 72 sata i 7 dana nakon transfekcije. In vivo eksperimenti takođe mogu da se sprovedu pomoću molekula koji imaju inženjeringom dobijena microRNA vezujuća mesta, kako bi se ispitale promene tkivno specifične ekspresije formulisanih modifikovanih nukleinskih kiselina, poboljšane modifikovane RNK ili ribonukleinskih kiselina.

[0187] Neograničavajući primeri ćelijskih linija koje mogu da budu korisne u ovim ispitivanjima uključuju ćelijske linije iz ATCC (Manassas, VA) uključujući MRC-5, A549, T84, NCI-H2126 [H2126], NCI-H1688 [H1688], WI-38, WI-38 VA-13 podliniju 2RA, WI-26 VA4, C3A [HepG2/C3A, derivat Hep G2 (ATCC HB-8065)], THLE-3, H69AR, NCI-H292 [H292], CFPAC-1, NTERA-2 cl.D1 [NT2/D1], DMS 79, DMS 53, DMS 153, DMS 114, MSTO-211H, SW 1573 [SW-1573, SW1573], SW 1271 [SW-1271, SW1271], SHP-77, SNU-398, SNU-449, SNU-182, SNU-475, SNU-387, SNU-423, NL20, NL20-TA [NL20T-A], THLE-2, HBE135-E6E7, HCC827, HCC4006, NCI-H23 [H23], NCI-H1299, NCI-H187 [H187], NCI-H358 [H-358, H358], NCI-H378 [H378], NCI-H522 [H522], NCI-H526 [H526], NCI-H727 [H727], NCI-H810 [H810], NCI-H889 [H889], NCI-H1155 [H1155], NCI-H1404 [H1404], NCI-N87 [N87], NCI-H196 [H196], NCI-H211 [H211], NCI-H220 [H220], NCI-H250 [H250], NCI-H524 [H524], NCI-H647 [H647], NCI-H650 [H650], NCI-H711 [H711], NCI-H719 [H719], NCI-H740 [H740], NCI-H748 [H748], NCI-H774 [H774], NCI-H838 [H838], NCI-H841 [H841], NCI-H847 [H847], NCI-H865 [H865], NCI-H920 [H920], NCI-H1048 [H1048], NCI-H1092 [H1092], NCI-H1105 [H1105], NCI-H1184 [H1184], NCI-H1238 [H1238], NCI-H1341 [H1341], NCI-H1385 [H1385], NCI-H1417 [H1417], NCI-H1435 [H1435], NCI-H1436 [H1436], NCI-H1437 [H1437], NCI-H1522 [H1522], NCI-H1563 [H1563], NCI-H1568 [H1568], NCI-H1573 [H1573], NCI-H1581 [H1581],

4

NCI-H1618 [H1618], NCI-H1623 [H1623], NCI-H1650 [H-1650, H1650], NCI-H1651 [H1651], NCI-H1666 [H-1666, H1666], NCI-H1672 [H1672], NCI-H1693 [H1693], NCI-H1694 [H1694], NCI-H1703 [H1703], NCI-H1734 [H-1734, H1734], NCI-H1755 [H1755], NCI-H1755 [H1755], NCI-H1770 [H1770], NCI-H1793 [H1793], NCI-H1836 [H1836], NCI-H1838 [H1838], NCI-H1869 [H1869], NCI-H1876 [H1876], NCI-H1882 [H1882], NCI-H1915 [H1915], NCI-H1930 [H1930], NCI-H1944 [H1944], NCI-H1975 [H-1975, H1975], NCI-H1993 [H1993], NCI-H2023 [H2023], NCI-H2029 [H2029], NCI-H2030 [H2030], NCI-H2066 [H2066], NCI-H2073 [H2073], NCI-H2081 [H2081], NCI-H2085 [H2085], NCI-H2087 [H2087], NCI-H2106 [H2106], NCI-H2110 [H2110], NCI-H2135 [H2135], NCI-H2141 [H2141], NCI-H2171 [H2171], NCI-H2172 [H2172], NCI-H2195 [H2195], NCI-H2196 [H2196], NCI-H2198 [H2198], NCI-H2227 [H2227], NCI-H2228 [H2228], NCI-H2286 [H2286], NCI-H2291 [H2291], NCI-H2330 [H2330], NCI-H2342 [H2342], NCI-H2347 [H2347], NCI-H2405 [H2405], NCI-H2444 [H2444], UMC-11, NCI-H64 [H64], NCI-H735 [H735], NCI-H735 [H735], NCI-H1963 [H1963], NCI-H2107 [H2107], NCI-H2108 [H2108], NCI-H2122 [H2122], Hs 573.T, Hs573.Lu, PLC/PRF/5, BEAS-2B, Hep G2, Tera-1, Tera-2, NCI-H69 [H69], NCI-H128 [H128], ChaGo-K-1, NCI-H446 [H446], NCI-H209 [H209], NCI-H146 [H146], NCI-H441 [H441], NCI-H82 [H82], NCI-H460 [H460], NCI-H596 [H596], NCI-H676B [H676B], NCI-H345 [H345], NCI-H820 [H820], NCI-H520 [H520], NCI-H661 [H661], NCI-H510A [H510A, NCI-H510], SK-HEP-1, A-427, Calu-1, Calu-3, Calu-6, SK-LU-1, SK-MES-1, SW 900 [SW-900, SW900], Malme-3M, i Capan-1.

[0188] U nekim slučajevima, modifikovana informaciona RNK može da bude tako dizajnirana da ima inkorporirana mesta microRNA vezujućih regiona koja ili imaju 100% identičnosti sa poznatim seme sekvencama ili imaju manje od 100% identičnosti sa seme sekvencama. Seme sekvence mogu da budu parcijalno mutirane tako da smanjuju afinitet vezivanja microRNA i tako dovode do smanjene modulacije u smeru isključenja tog mRNA transkripta. U suštini, stepen sparivanja ili pogrešnog sparivanja između ciljne mRNA i seme sekvence microRNA deluje kao reostat koji fino podešava sposobnost microRNA da moduliše ekspresiju proteina. Osim toga, mutacija u regionu van seme sekvence u microRNA vezujućem mestu može takođe da utiče na sposobnost microRNA da moduliše ekspresiju proteina.

[0189] U jednom slučaju, miR sekvenca može da bude inkorporirana u petlju drška petlje.

[0190] U drugom slučaju, miR seme sekvenca može da bude inkorporirana u petlju drška petlje, a miR vezujuće mesto može da bude inkorporirano u 5' ili 3' dršku drška petlje.

[0191] U jednom slučaju, TEE može da bude inkorporiran na 5'kraju petlje drška petlje i miR seme može da bude inkorporirano u petlju drška petlje. U drugom slučaju, TEE može da bude inkorporiran na 5'kraju petlje drška petlje, a miR seme može da bude inkorporirana u petlju drška

4

petlje i miR vezujuće mesto može da bude inkorporirano na 3'kraju petlje ili sekvence posle drška petlje. miR seme i miR vezujuće mesto mogu da budu za istu i/ili različite miR sekvence.

[0192] U jednom slučaju, inkorporacija miR sekvence i/ili TEE sekvence menja oblik drška petlja regiona, što može da pojača i/ili smanji translaciju. (videti npr, Kedde et al. A Pumilio-induced RNA structure switch in p27-3'UTR controls miR-221 and miR-22 accessibility. Nature Cell Biology. 2010).

[0193] U jednom slučaju, inkorporacija miR sekvence i/ili TEE sekvence menja oblik drška petlja regiona što može da pojača i/ili smanji translaciju. (videti npr, Kedde et al. A Pumilio-induced RNA structure switch in p27-3'UTR controls miR-221 and miR-22 accessibility. Nature Cell Biology. 2010).

[0194] U jednom slučaju, 5’UTR može da sadrži najmanje jednu microRNA sekvencu. MicroRNA sekvenca može da bude, ali nije ograničena na, sekvencu od 19 ili 22 nukleotida i/ili sekvencu microRNA bez seme sekvence.

[0195] U jednom slučaju, microRNA sekvenca u 5’UTR regionu može da se koristi kako bi se stabilisale ovde opisane nukleinske kiseline i/ili mRNA.

[0196] U drugom slučaju, microRNA sekvenca u 5’UTR regionu može da se koristi kako bi se smanjila pristupačnost mesta za inicijaciju translacije kao što je, ali ne i ograničeno na, start kodon. Autori Matsuda et al (PLoS One. 2010 11(5):e15057) koristili su oligonukleotide antisens zaključane nukleinske kiseline (LNA) i komplekse egzonskog spoja (EJC kompleksi) oko start kodona (-4 do 37 gde je A u AUG kodonima 1) kako bi smanjili pristupačnost prvog start kodona (AUG). Matsuda je pokazao da menjanje sekvence oko start kodona sa LNA ili EJC utiče na efikasnost, dužinu i strukturnu stabilnost nukleinske kiseline ili mRNA. Nukleinske kiseline ili mRNA prema predmetnom prikazu mogu da sadrže microRNA sekvencu, umesto LNA ili EJC sekvence koju su opisali Matsuda et al, blizu mesta za inicijaciju translacije, kako bi se smanjila pristupačnost mesta za inicijaciju transklacije. Mesto za inicijaciju translacije može da bude pre, iza ili unutar microRNA sekvence. Kao neograničavajući primer, mesto za inicijaciju translacije može da bude locirano unutar microRNA sekvence kao što je seme sekvenca ili vezujuće mesto. Kao drugi neograničavajući primer, mesto za inicijaciju translacije može da bude locirano unutar miR-122 sekvence kao što je seme sekvenca ili mir-122 vezujuće mesto.

[0197] U jednom slučaju, nukleinske kiseline ili mRNA prema predmetnom prikazu mogu da uključuju najmanje jednu microRNA kako bi se prigušilo prezentovanje antigena od strane antigen prezentujućih ćelija. MicroRNA može da bude microRNA sekvenca, microRNA seme sekvenca, microRNA sekvenca bez seme sekvence ili njihova kombinacija. Kao neograničavajući primer, microRNA inkorporirana u nukleinske kiseline ili mRNA prema predmetnom prikazu može da

4

budu specifična za sistem hematopoeze. Kao drugi neograničavajući primer, microRNA inkorporirana u nukleinske kiseline ili mRNA prema predmetnom prikazu u cilju prigušivanja prezentacije antigena je miR-142-3p.

[0198] U jednom slučaju, nukleinske kiseline ili mRNA prema predmetnom prikazu mogu da uključuju najmanje jednu microRNA kako bi se prigušila ekspresija kodiranog polipetida u ćeliji od interesa. Kao neograničavajući primer, nukleinske kiseline ili mRNA prema predmetnom prikazu mogu da uključuju najmanje jedno miR-122 vezujuće mesto kako bi bila prigušena ekspresija kodiranog polipeptida od interesa u jetri. Kao drugi neograničavajući primer, nukleinske kiseline ili mRNA prema predmetnom prikazu mogu da uključuju najmanje jedno miR-142-3p vezujuće mesto, miR-142-3p seme sekvencu, miR-142-3p vezujuće mesto bez seme sekvence, miR-142-5p seme sekvencu, miR-142-5p seme sekvencu, miR-142-5p vezujuće mesto bez seme sekvence, miR-146 vezujuće mesto, miR-146 seme sekvencu i/ili miR-146 vezujuće mesto bez seme sekvence (videti npr., eksperiment izložen u Primerima 24, 25, 26, 26, 36 i 48).

[0199] U jednom slučaju, nukleinske kiseline ili mRNA prema predmetnom prikazu mogu da sadrže najmanje jedno microRNA vezujuće mesto u 3'UTR regionu kako bi se selektivno degradovao mRNA therapeutik u imunim ćelijama u cilju sprečavanja neželjenih imunogenih reakcija do kojih dolazi usled terapeutskog isporučivanja. Kao neograničavajući primer, microRNA vezujuće mesto mogu da budu modifikovane nukleinske kiseline koje su nestabilnije u antigen prezentujućim ćelijama. Neograničavajući primeri ovih microRNA uključuju mir-142-5p, mir-142-3p, mir-146a-5p i mir-146-3p.

[0200] U jednom slučaju, nukleinske kiseline ili mRNA prema predmetnom prikazu sadrže najmanje jednu microRNA sekvencu u regionu nukleinske kiseline ili mRNA, koja može da reaguje sa RNK vezujućim proteinom.

RNK motivi za RNK vezujuće proteine (RBP proteine)

[0201] RNK vezujući proteini (RBP proteini) mogu da regulišu brojne aspekte kotranskripcione i posttranskripcione genske ekspresije, kao što su, ali ne i ograničeno na, RNK splajsovanje, lokalizacija, translacija, obnavljanje, poliadenilacija, obrazovanje kape, modifikacija, eksport i lokalizacija. RNK-vezujući domeni (RBD domeni), kao što su, ali ne i ograničeno na, motiv za prepoznavanje RNK (RR) i domeni hnRNP K-homologije (KH), tipično regulišu asocijaciju sekvence između RBP proteina i njihovih ciljnih RNK (Ray et al. Nature 2013.499:172-177). U jednom slučaju, kanonski RBD domeni mogu da vezuju kratke RNK sekvence. U drugom slučaju, kanonski RBD domeni mogu da prepoznaju strukturne RNK.

4

[0202] Neograničavajući primeri RNK vezujućih proteina i srodnih sekvenci nukleinskih kiselina i proteina prikazani su u tabeli 26 u primeru 23.

[0203] U jednom slučaju, kako bi se povećala stabilnost mRNA od interesa, mRNA koja kodira HuR može da se kotransfektuje ili koinjecira zajedno sa mRNA od interesa u ćelije ili u tkivo. Ovi proteini takođe mogu da se vežu za mRNA od interesa in vitro i da se zatim primene na ćelije zajedno. Protein za vezivanje za poli A rep, PABP interaguje sa eukariotskim inicijacionim faktorom translacije eIF4G kako bi stimulisao inicijaciju translacije. Primena mRNA molekula koji kodiraju ove RBP proteine, zajedno sa mRNA leka i/ili vezivanje ovih proteina za mRNA leka in vitro i primena mRNA vezane za protein na ćelije, može da poveća efikasnost translacije mRNA. Isti koncept može da se proširi na primenu mRNA zajedno sa mRNA molekulima koji kodiraju različite faktore i fasilitatore translacije, kao i zajedno sa samim proteinima kako bi se uticalo na stabilnost RNK i/ili translacionu efikasnost.

[0204] U jednom slučaju, nukleinske kiseline i/ili mRNA mogu da sadrže najmanje jedan RNK vezujući motiv kao što je, ali ne i ograničeno na, RNK vezujući domen (RBD).

[0205] U jednom slučaju, RBD može da bude bilo koji od RBD domena, njihovih fragmenata ili varijanti, koje su opisane kod autora Ray et al. (Nature 2013.499:172-177).

[0206] U jednom slučaju, nukleinske kiseline ili mRNA prema predmetnom prikazu može da sadrži sekvencu za najmanje jedan RNK vezujući domen (RBD domeni). Kada nukleinske kiseline ili mRNA prema predmetnom prikazu sadrži više od jednog RBD, RBD domeni ne moraju da budu iz iste vrste ili čak ni iste strukturne klase.

[0207] U jednom slučaju, najmanje jedan oivičavajući region (npr., 5’UTR i/ili 3'UTR) može da sadrži najmanje jedan RBD. U drugom slučaju, i prvi oivičavajući region i drugi oivičavajući region mogu da sadrže najmanje jedan RBD. RBD domeni mogu da budu isti ili svaki od RBD domena može da ima najmanje 60% identičnosti sekvence sa drugim RBD. Kao neograničavajući primer, najmanje jedan RBD može da bude lociran pre, posle i/ili unutar 3'UTR nukleinske kiseline ili mRNA prema predmetnom prikazu. Kao drugi neograničavajući primer, najmanje jedan RBD može da bude lociran pre ili unutar prvih 300 nukleozida 3'UTR regiona.

[0208] U drugom slučaju, nukleinske kiseline i/ili mRNA prema predmetnom prikazu može da sadrži najmanje jedan RBD u prvom regionu vezanih nukleozida. RBD može da bude lociran pre, posle ili unutar kodirajućeg regiona (npr., ORF).

[0209] U još jednom slučaju, prvi region vezanih nukleozida i/ili najmanje jedan oivičavajući region može da sadrži najmanje jedan RBD. Kao neograničavajući primer, prvi region vezanih nukleozida može da sadrži RBD u vezi sa faktorima splajsovanja i najmanje jedan oivičavajući region može da sadrži RBD za stabilnost i/ili faktore translacije.

[0210] U jednom slučaju, nukleinske kiseline i/ili mRNA prema predmetnom prikazu mogu da sadrže najmanje jedan RBD lociran u kodirajućem i/ili nekodirajućem regionu nukleinske kiseline i/ili mRNA.

[0211] U jednom slučaju, najmanje jedan RBD može da bude inkorporiran u najmanje jedan oivičavajući region kako bi se povećala stabilnost nukleinske kiseline i/ili mRNA prema predmetnom prikazu.

[0212] U jednom slučaju, microRNA sekvenca u RNK vezujućem proteinskom motivu može da se koristi kako bi se smanjila pristupačnost mesta za inicijaciju translacije kao što je, ali ne i ograničeno na, start kodon. Nukleinske kiseline ili mRNA prema predmetnom prikazu mogu da sadrže microRNA sekvencu, umesto LNA ili EJC sekvence koju su opisali Matsuda et al, blizu mesta za inicijaciju translacije, kako bi se smanjila pristupačnost mesta za inicijaciju translacije. Mesto za inicijaciju translacije može da bude pre, posle ili unutar microRNA sekvence. Kao neograničavajući primer, mesto za inicijaciju translacije može da bude locirano unutar microRNA sekvence kao što je seme sekvenca ili vezujuće mesto. Kao drugi neograničavajući primer, mesto za inicijaciju translacije može da bude locirano unutar miR-122 sekvence kao što je seme sekvenca ili mir-122 vezujuće mesto.

[0213] U drugom slučaju, oligonukleotidi antisens zaključane nukleinske kiseline (LNA) i kompleksi egzonskog spoja (EJC kompleksi) mogu da se koriste u RNK vezujućem proteinskom motivu. LNA i EJC kompleksi mogu da se koriste oko start kodona (-4 do 37 pri čemu je A u AUG kodonima 1) kako bi se smanjila pristupačnost prvog start kodona (AUG).

Drugi regulatorni elementi u 3'UTR

[0214] Osim mesta za vezivanje microRNA, druge regulatorne sekvence u 3'-UTR prirodne mRNA, koje regulišu stabilnost i translaciju mRNA u različitim tkivima i ćelijama, mogu da budu uklonjene iz, ili uvedene u modifikovanu informacionu RNK. Ovi cis-regulatorni elementi mogu da uključuju, ali nisu ograničeni na, Cis- RNP (ribonukleoprotein)/RBP (RNK vezujući protein) regulatorne elemente, AU-bogate elemente (AUE), strukturirane drška-petlja sekvence, elemente konstitutivnog raspadanja (CDE elemente), GC-bogate i druge strukturirane mRNA motive (Parker BJ et al., Genome Research, 2011, 21, 1929-1943). Na primer, CDE elementi su klasa regulatornih motiva koji posreduju prilikom degradacije mRNA putem svoje interakcije sa Roquin proteinima. Konkretno, CDE elementi se nalaze u mnogim molekulima mRNA koji kodiraju regulatore razvoja i inflamacije, kako bi ograničili proizvodnju citokina u makrofagima (Leppek K et al., 2013, Cell, 153, 869-881).

1

[0215] U jednom slučaju, u nukleinske kiseline ili mRNA može da se uvede konkretan CDE kada je poželjna degradacija polipeptida u ćeliji ili u tkivu. Konkretan CDE takođe može i da se ukloni iz nukleinske kiseline ili mRNA kako bi se zadržala stabilnija mRNA u ćeliji ili tkivu, u cilju održavanja ekspresije proteina.

Auksotrofna mRNA

[0216] U jednom slučaju, nukleinske kiseline ili mRNA prema predmetnom prikazu mogu da budu auksotrofne. Kako se ovde koristi, termin "auksotrofna" odnosi se na mRNA koja sadrži najmanje jedno svojstvo koje aktivira, olakšava ili indukuje, degradaciju ili inaktivaciju mRNA kao odgovor na prostorne ili vremenske signale, tako da se ekspresija proteina u značajnoj meri sprečeva ili smanjuje. Ovi prostorni ili vremenski signali uključuju lokaciju mRNA koja se translatira, kao što je okruženje konkretnog tkiva, organa ili ćelije. Takođe se razmatraju signali koji uključuju temperaturu, pH, jonsku snagu, sadržaj vlage, i slično.

[0217] U jednom slučaju, svojstvo je locirano u terminalnom regionu nukleinskih kiselina ili mRNA prema predmetnom prikazu. Kao neograničavajući primer, auksotrofna mRNA može da sadrži miR vezujuće mesto u terminalnom regionu koje se vezuje za miR eksprimiranu u odabranom tkivu tako da se ekspresija auksotrofne mRNA u značajnoj meri sprečava ili smanjuje u odabranom tkivu. U ovom cilju, i na primer, auksotrofna mRNA koja sadrži miR-122 vezujuće mesto neće proizvesti protein ako je lokalizovana u jetri, pošto je miR-122 eksprimirana u jetri i vezivanje miR bi dovelo do uništavanja auksotrofne mRNA. Kao neograničavajući primer, HEK293 ćelije ne eksprimiraju miR-122 tako da bi bilo malo ili nimalo smanjenja ekspresije nukleinske kiseline ili mRNA prema predmetnom prikazu koje imaju miR-122 sekvencu u HEK293 ali bi za hepatocite koji obavljaju ekspresiju miR-122 bilo smanjenja ekspresije nukleinske kiseline ili mRNA prema predmetnom prikazu koja ima miR-122 sekvencu u hepatocitima (videti npr., studiju opisanu u primeru 14). Kao još jedan neograničavajući primer, nivo miR-122 može da se meri u HeLa ćelijama, primarnim humanim hepatocitima i primarnim hepatocitima pacova, pre nego što se na njih primeni nukleinska kiselina ili mRNA prema predmetnom prikazu koja kodira najmanje jedno miR-122 vezujuće mesto, miR-122 vezujuće mesto bez seme sekvence ili miR-122 vezujuće mesto. Nakon primene, ekspresija modifikovane nukleinske kiseline sa microRNA sekvencom može da se meri kako bi se utvrdio efekat prigušivanja miR-122 u modifikovanoj nukleinskoj kiselini (videti npr., studije opisane u primerima 28, 29, 30, 35, 45, 46 i 47). Kao još jedan neograničavajući primer, efikasnost miR-122 vezujućeg mesta, miR-122 seme sekvence ili miR-122 vezujućeg mesta bez seme sekvence u

2

različitim 3'UTR regionima može da se ocenjuje kako bi se odredilo koji je pravi UTR za željeni ishod, kao što je, ali ne i ograničeno na, najviši efekat prigušivanja (videti npr., studiju opisanu u primeru 35 i 46).

[0218] U jednom slučaju, degradacija ili inaktivacija auksotrofne mRNA može da sadrži svojstvo koje reaguje na promene pH vrednosti. Kao neograničavajući primer, auksotrofna mRNA može da se aktivira u okruženju koje ima pH vrednost između pH 4.5 i 8.0 kao što je na pH od 5.0 do 6.0 ili pH od 6.0 do 6.5. Promena pH vrednosti može da bude promena od 0.1 jedinice, 0.2 jedinica, 0.3 jedinice, 0.4 jedinice, 0.5 jedinica, 0.6 jedinica, 0.7 jedinica, 0.8 jedinica, 0.9 jedinica, 1.0 jedinice, 1.1 jedinice, 1.2 jedinice, 1.3 jedinice, 1.4 jedinice, 1.5 jedinica, 1.6 jedinica, 1.7 jedinica, 1.8 jedinica, 1.9 jedinica, 2.0 jedinice, 2.1 jedinice, 2.2 jedinice, 2.3 jedinice, 2.4 jedinice, 2.5 jedinica, 2.6 jedinica, 2.7 jedinica, 2.8 jedinica, 2.9 jedinica, 3.0 jedinice, 3.1 jedinice, 3.2 jedinice, 3.3 jedinice, 3.4 jedinice, 3.5 jedinica, 3.6 jedinica, 3.7 jedinica, 3.8 jedinica, 3.9 jedinica, 4.0 jedinice ili više.

[0219] U drugom slučaju, degradacija ili inaktivacija auksotrofne mRNA može da se aktivira ili indukuje promenama temperature. Kao neograničavajući primer, promena temperature od sobne temperature do temperature tela. Promena temperature može da bude manja od 1°C, manja od 5°C, manja od 10°C, manja od 15°C, manja od 20°C, manja od 25°C ili veća od 25°C.

[0220] U još jednom slučaju, degradacija ili inaktivacija auksotrofne mRNA može da se aktivira ili indukuje promenom nivoa jona u subjektu. Joni mogu da budu katjoni ili anjoni kao što su, ali ne i ograničeno na, joni natrijuma, joni kalijuma, joni hlorida, joni kalcijuma, joni magnezijuma i/ili fosfatni joni.

3' UTR i AU bogati elementi

[0221] Poznato je da 3'UTR regioni imaju u sebi nizove adenozina i uridina. Ovaj AU bogat otisak posebno preovlađuje u genima sa visokom stopom obnavljanja. Na osnovu svojstava svoje sekvenca i funkcionalnih osobina, AU bogati elementi (ARE elementi) mogu da se podele na tri klase (Chen et al, 1995): ARE elementi klase I sadrže nekoliko raštrkanih kopija AUUUA motiva unutar U-bogatih regiona. C-Myc i MyoD sadrže ARE elemente klase I. ARE elementi klase II poseduju dva ili više UUAUUUA(U/A)(U/A) nonamera koji se preklapaju. Molekuli koji sadrže ovaj tip ARE elemenata uključuju GM-CSF i TNF-a. ARES elementi klase III su slabije definisani. Ovi U bogati regioni ne sadrže AUUUA motiv. c-Jun i miogenin su dva dobro izučena primera ove klase. Za većinu proteina koji se vezuju za ARE elemente zna se da destabilizuju informaciju, dok je za članove ELAV familije, na, pre svega za HuR, zabeleženo da povećavaju stabilnost mRNA. HuR se vezuje za ARE elemente sve tri klase. Uvođenje HuR specifičnih vezujućih mesta u 3' UTR molekula nukleinske kiseline putem inženjeringa, dovešće do vezivanja HuR i time do stabilizacije informacije in vivo.

[0222] Uvođenje, uklanjanje ili modifikacija 3' UTR AU bogatih elemenata (ARE elementi) može da se koristi za modulaciju stabilnosti nukleinskih kiselina ili mRNA prema prikazu. Kada se inženjeringom kreiraju specifične nukleinske kiseline ili mRNA, jedna ili više kopija ARE elementa može da se uvede ako bi se to make nukleinske kiseline ili mRNA prema prikazu učinile manje stabilnim i time ograničila translacija i smanjila proizvodnja rezultujućeg proteina. Slično tome, ARE elementi mogu da se identifikuju i uklone ili mutiraju kako bi se povećala intracelularna stabilnost i tako povećale translacija proizvodnja rezultujućeg proteina. Eksperimenti transfekcije mogu da se sprovode u relevantnim ćelijskim linijama, pomoću nukleinskih kiselina ili mRNA prema prikazu i proizvodnja proteina može da se proverava u različitim vremenskim tačkama nakon transfekcije. Na primer, ćelije mogu da se transfektuju različitim molekulima dobijenim inženjeringom od ARE i pomoću ELISA kita za relevantne proteine uz proveravanje proteina proizvedenih 6 sati, 12 sati, 24 sata, 48 sati, i 7 dana nakon transfekcije.

3' UTR i trostruke zavojnice

[0223] U jednom slučaju, nukleinske kiseline prema predmetnom prikazu mogu da uključuju trostruku zavojnicu na 3' kraju modifikovane nukleinske kiseline, poboljšane modifikovane RNK ili ribonukleinske kiseline. 3' kraj nukleinskih kiselina prema predmetnom prikazu može da uključuje trostruku zavojnicu, samu ili u kombinaciji sa poli-A repom.

[0224] U jednom slučaju, nukleinska kiselina prema predmetnom prikazu može da sadrži najmanje prvi i drugi U-bogati region, konzervativni drška petlja region između prvog i drugog regiona i A-bogati region. Prvi i drugi U-bogati region i A-bogati region mogu da se povežu tako da obrazuju trostruku zavojnicu na 3' kraju nukleinske kiseline. Ova trostruka zavojnica može da stabilizuje nukleinsku kiselinu, pojača translacionu efikasnost nukleinske kiseline i/ili zaštiti 3' kraj od degradacija. Tipične trostruke zavojnice uključuju, ali nisu ograničene na, sekvencu trostruke zavojnice transkripta 1 plućnog adenokarcinoma povezanog sa metastazama (MALAT1), MEN-β i nukleusne RNK sa poliadenilacijom (PAN) (Videti Wilusz et al., Genes & Development 2012 26:2392-2407). U jednom slučaju, 3' kraj modifikovanih nukleinskih kiselina, poboljšane modifikovane RNK ili ribonukleinskih kiselina prema predmetnom prikazu sadrži prvi U-bogati region koji sadrži TTTTTCTTTT (SEQ ID NO: 1), drugi U-bogati region koji sadrži

4

TTTTGCTTTTT (SEQ ID NO: 2) ili TTTTGCTTTT (SEQ ID NO: 3), A-bogati region U koji sadrži AAAAAGCAAAA (SEQ ID NO: 4). U drugom slučaju, 3' kraj nukleinskih kiselina prema predmetnom prikazu sadrži strukturu koja obrazuje trostruku zavojnicu, a koji sadrži prvi U-bogati region, konzervativni region, drugi U-bogati region i A-bogati region.

[0225] U jednom slučaju, trostruka zavojnica može da se obrazuje isecanjem MALAT1 sekvence pre strukture lista deteline. Premda bez namere da bude ograničena teorijom, MALAT1 je dugačka nekodirajuća RNK koja, kada se iseče, obrazuje trostruku zavojnicu i strukturu lista deteline nalik na tRNK. MALAT1 transkript se za tim lokalizuje u nukleusnim pegama, a list deteline nalik na tRNK se lokalizuje u citoplazmi (Wilusz et al. Cell 2008135(5): 919-932).

[0226] Kao neograničavajući primer, terminalni kraj nukleinske kiseline prema predmetnom prikazu koji sadrži MALAT1 sekvencu može zatim da obrazuje trostruku zavojnicu, nakon isecanja RNazomP iz strukture lista deteline, čime se nukleinska kiselina stabilizuje (Peart et al. Non-mRNA 3' end formation: how the other half lives; WIREs RNA 2013).

[0227] U jednom slučaju, ovde opisane nukleinske kiseline ili mRNA sadrže MALAT1 sekvencu. U drugom slučaju, nukleinske kiseline ili mRNA mogu da budu sa poliadenilacijom. U još jednom slučaju, nukleinske kiseline ili mRNA nisu sa poliadenilacijom ali imaju povećanu otpornost na degradaciju u poređenju sa nemodifikovanim nukleinskim kiselinama ili mRNA.

[0228] U jednom slučaju, nukleinske kiseline prema predmetnom prikazu mogu da sadrže MALAT1 sekvencu u drugom oivičavajućem regionu (npr., 3'UTR). Kao neograničavajući primer, MALAT1 sekvenca može da bude humana ili mišija (videti npr., polinukleotide opisane u tabeli 37 u primeru 38).

[0229] U drugom slučaju, struktura deteline MALAT1 sekvence može takođe da se obrađuje RnazomZ i enzimom za dodavanje CCA, kako bi se obrazovala struktura nalik na tRNK koja je označena kao mascRNA (MALAT1-povezana mala citoplazmatska RNK). Kao neograničavajući primer, mascRNA može da kodira protein ili njegov fragment i/ili može da sadrži microRNA sekvencu. mascRNA može da sadrži najmanje jednu ovde opisanu hemijsku modifikaciju.

Drška petlja

[0230] U jednom slučaju, nukleinske kiseline prema predmetnom prikazu mogu da uključuju drška petlju kao što je, ali ne i ograničeno na, histonska drška petlja. Drška petlja može da bude nukleotidna sekvenca koja je dugačka oko 25 ili oko 26 nukleotida, kao što su, ali ne i ograničeno na, sekvence SEQ ID NO: 7-17 kao što su opisane u objavi međunarodnog patenta br. WO2013103659. Histonska drška petlja može da bude locirana 3' u odnosu na kodirajući region (npr., na 3' terminusu kodirajućeg regiona). Kao neograničavajući primer, drška petlja može da bude locirana na 3' kraju ovde opisane nukleinske kiseline.

[0231] U jednom slučaju, drška petlja može da bude locirana u drugom terminalnom regionu. Kao neograničavajući primer, drška petlja može da bude locirana unutar netranslatiranog regiona (npr., 3'UTR) u drugom terminalnom regionu.

[0232] U jednom slučaju, nukleinska kiselina kao što je, ali ne i ograničeno na mRNA, koja sadrži histonsku drška petlju može da se stabilizuje dodavanjem najmanje jednog nukleozida za terminaciju lanca. Bez želje za vezivanjem teorijom, dodavanje najmanje jednog nukleozida za terminaciju lanca može da uspori degradaciju nukleinske kiseline i tako produži poluživot nukleinske kiseline.

[0233] U jednom slučaju, nukleozid za terminaciju lanca može da bude, ali nije ograničen na, nukleozide opisane u objavi međunarodnog patenta br. WO2013103659. U drugom slučaju, nukleozidi za terminaciju lanca koji mogu da se koriste sa predmetnim prikazom, uključuju, ali nisu ograničeni na, 3'-dezoksiadenozin (kordicepin), 3'-dezoksiuridin, 3'-dezoksicitozin, 3'-dezoksiguanozin, 3'-dezoksitimin, 2',3'-didezoksinukleozide, kao što su 2',3'- didezoksiadenozin, 2',3'-didezoksiuridin, 2',3'-didezoksicitozin, 2',3'-didezoksiguanozin, 2',3'-didezoksitimin, 2'-dezoksinukleozid, ili -O- metilnukleozid.

[0234] U drugom slučaju, nukleinska kiselina kao što je, ali ne i ograničeno na mRNA, koja sadrži histonsku drška petlju, može da se stabilizuje modifikacijom 3'regiona nukleinske kiseline koja može da spreči i/ili inhibira dodavanje oligio(U) (videti npr., objavu međunarodnog patenta br. WO2013103659).

[0235] U još jednom slučaju, nukleinska kiselina kao što je, ali ne i ograničeno na mRNA, koja sadrži histonsku drška petlju, može da se stabilizuje dodavanjem oligonukleotida koji se završava 3'-dezoksinukleozidom, 2',3'-didezoksinukleozid 3'-0- metilnukleozidima, 3'-0-etilnukleozidima, 3'-arabinozidima, i drugim modifikovanim nukleozidima koji su poznati u stanju tehnike i/ili opisani u ovom dokumentu.

[0236] U jednom slučaju, nukleinske kiseline prema predmetnom prikazu mogu da uključuju histonsku drška petlju, sekvencu poliA repa i/ili strukturu 5’kape. Histonska drška petlja može da se nalazi pre i/ili posle sekvence poliA repa. Nukleinske kiseline koje sadrže histonsku drška petlju i sekvencu poliA repa mogu da uključuju ovde opisani nukleozid za terminaciju lanca.

[0237] U drugom slučaju, nukleinske kiseline prema predmetnom prikazu mogu da uključuju histonsku drška petlju i strukturu 5'kape. Strukturu 5'kape može da uključuje, ali nije ograničena na, strukture koje su opisane u ovom dokumentu i/ili poznate u oblasti.

[0238] U jednom slučaju, konzervativni region drška petlje može da sadrži ovde opisanu miR sekvencu. Kao neograničavajući primer, drška petlja region može da sadrži seme sekvencu ovde opisane miR sekvence. U drugom neograničavajućem primeru, drška petlja region može da sadrži miR-122 seme sekvencu.

[0239] U drugom slučaju, konzervativni drška petlja region može da sadrži ovde opisanu miR sekvencu, a takođe može da uključuje TEE sekvencu.

[0240]U jednom slučaju, inkorporacija miR sekvence i/ili TEE sekvence menja oblik drška petlja regiona što može da poveća i/ili smanji translaciju. (videti npr, Kedde et al. A Pumilio-induced RNA structure switch in p27-3'UTR controls miR-221 and miR-22 accessibility. Nature Cell Biology. 2010).

[0241] U jednom slučaju, ovde opisane modifikovane nukleinske kiseline mogu da sadrže najmanje jednu histonsku drška-petlju i poliA sekvencu ili signal za poliadenilaciju. Neograničavajući primeri sekvence nukleinske kiseline koja kodira najmanje jednu histonsku drška-petlju, poliA sekvencu ili signal za poliadenilaciju, opisani su u objavama međunarodnih patenata br. WO2013120497, WO2013120629, WO2013120500, WO2013120627, WO2013120498, WO2013120626, WO2013120499 i WO2013120628. U jednom slučaju, nukleinska kiselina koja kodira histonsku drška petlju i poliA sekvencu ili signal za poliadenilaciju može da kodira antigen patogena ili njegov fragment, kao na primer, sekvenca nukleinske kiseline opisana u objavama međunarodnih patenata br. WO2013120499 i WO2013120628. U drugom slučaju, nukleinska kiselina koja kodira histonsku drška petlju i poliA sekvencu ili signal za poliadenilaciju može da kodira terapeutski protein, kao na primer sekvenca nukleinske kiseline opisana u objavama međunarodnih patenata br. WO2013120497 i WO2013120629. U jednom slučaju, nukleinska kiselina koja kodira histonsku drška petlju i poliA sekvencu ili signal za poliadenilaciju može da kodira tumorski antigen ili njegov fragment, kao na primer sekvence nukleinske kiseline opisane u objavama međunarodnih patenata br. WO2013120500 i WO2013120627. U drugom slučaju, nukleinska kiselina koja kodira histonsku drška petlju i poliA sekvencu ili signal za poliadenilaciju može da kodira antigen alergena ili autoimuni sopstveni antigen, kao na primer, sekvenca nukleinske kiseline opisana u objavama međunarodnih patenata br. WO2013120498 i WO2013120626.

Dodavanje 5' kape

[0242] Struktura 5' kape na mRNA je uključena u eksport iz nukleusa, povećava stabilnost mRNA i vezuje protein koji se vezuje za mRNA kapu (CBP), koji je odgovoran za stabilnost mRNA u ćeliji i translacionu kompetenciju, putem asocijacije CBP sa poli(A) vezujućim proteinom, kako bi se obrazovale zrele ciklične mRNA vrste. Kapa dodatno pomaže prilikom uklanjanja 5' proksimalnih introna tokom splajsovanja mRNA.

[0243] Endogeni molekuli mRNA mogu da imaju kapu na 5' kraju usled čega nastaje 5'-ppp-5'-trifosfatna veza između terminalnog guanozinskog ostatka kape i 5'-terminalnog transkribovanog sens nukleotida u mRNA. Ova 5'-guanilatna kapa može zatim da se metiluje tako da se generiše N7-metil-guanilatni ostatak. Ribozni šećeri terminalnih i/ili anteterminalnih transkribovanih nukleotida na 5' kraju mRNA, mogu takođe opciono da se 2'O-metiluju i da im se ukoloni 5'-kapa putem hidrolize, i razgradnja strukture guanilatne kape može da usmeri molekul nukleinske kiseline, kao što je molekul mRNA, ka degradaciji.

[0244] Modifikacije nukleinskih kiselina prema predmetnom prikazu mogu da generišu strukturu kape koja nema mogućnost da hidrolizuje čime se sprečava uklanjanje kape i tako produžava vreme poluživota mRNA. Pošto hidroliza strukture koja čini kapu zahteva raskidanje 5'-ppp-5' fosfodiestarskih veza, tokom reakcije obrazovanja kape mogu da se koriste modifikovani nukleotidi. Na primer, enzim koji obrazuje kapu kod vakcinije, Vaccinia Capping Enzyme, proizvođača New England Biolabs (Ipswich, MA) može da se koristi sa α-tio-guanozinskim nukleotidima prema uputstvima proizvođača, kako bi se formirala fosforotioatna veza u 5'-ppp-5' kapi. Drugi modifikovani guanozinski nukleotidi, kao što su α-metil-fosfonatni i seleno-fosfatni nukleotidi, takođe mogu da se koriste.

[0245] Dodatne modifikacije uključuju, ali nisu ograničene na, 2'-O-metilaciju riboznih šećera na 5'-terminalnim i/ili 5'-anteterminalnim nukleotidima u mRNK (kao što je pomenuto prethodno u tekstu) na 2'-hidroksilnoj grupi na prstenu šećera. Više različitih struktura 5' kape može da se koristi kako bi se kreirala 5' kapa na molekulu nukleinske kiseline, kao što je molekul mRNA.

[0246] Analozi kape, koji se u ovom tekstu označavaju i kao sintetički analozi kape hemijske kape, analozi hemijske kape, ili strukturni ili funkcionalni analozi kape, razlikuju se od prirodnih (tj. endogenih, prirodnih ili fizioloških) 5' kapa po svojoj hemijskoj strukturi, ali istovremeno zadržavaju funkciju kape. Analozi kape mogu da se sintetišu hemijski (tj., neenzimski) ili enzimski i/povezani su sa molekulom nukleinske kiseline.

[0247] Na primer, kapa pod imenom anti-reverzni analog kape (ARCA) sadrži dva guanina koji su povezani 5'-5'-trifosfatnom grupom, pri čemu jedan guanin sadrži N7 metil grupu kao i 3'-O-metil grupu (tj., N7,3'-O-dimetil-guanozin-5'-trifosfat-5'-guanozin (m<7>G-3'mppp-G; koji ekvivalentno može da se označi kao 3' O-Me-m7G(5')ppp(5')G). 3'-O atom drugog, nemodifikovanog guanina vezuje se sa 5'-terminalnim nukleotidom molekula nukleinske kiseline koji ima kapu (npr. mRNA ili mmRNA). N7- i 3'-O-metilovani guanin obezbeđuje terminalnu komponentu molekula nukleinske kiseline koji ima kapu (npr. mRNA ili mmRNA).

[0248] Drugi primer kape je mCAP, koja je slična ARCA analogu ali ima 2'-O-metil grupu na guanozinu (tj., N7,2'-O-dimetil-guanozin-5'-trifosfat-5'-guanozin, m<7>Gm-ppp-G).

[0249] U jednom slučaju, kapa je dinukleotidni analog kape. Kao neograničavajući primer, dinukleotidni analog kape može da bude modifikovan na različitim fosfatnim pozicijama pomoću boranofosfatne grupe ili fosforoselenoatne grupe, kao što su dinukleotidni analozi kape opisani u SAD patentu br. US 8,519,110.

[0250] U drugom slučaju, kapa je analog kape koji je N7-(4-hlorofenoksietil) supstituisani oblik analoga kape koji je poznat u stanju tehnike i/ili opisan u ovom dokumentu. Neograničavajući primeri N7-(4-hlorofenoksietil) supstituisani dinukleotidni oblik analoga kape uključuje N7-(4-hlorofenoksietil)-G(5')ppp(5')G i N7-(4-hlorofenoksietil)-m<3'-0>G(5')ppp(5')G analog kape (Videti npr., različite analoge kape i metode za sintezu analoga kape koji su opisani u Kore et al. Bioorganic & Medicinal Chemistry 201321:4570-4574). U drugom slučaju, analog kape prema predmetnom prikazu je 4-hloro/bromofenoksietil analog.

[0251] Premda analozi kape omogućavaju prateće dodavanje kape na molekul nukleinske kiseline u reakciji transkripcije in vitro, i do 20% transkripata ostaje bez kape. Ovo, kao i strukturne razlike analoga kape u odnosu na strukturu endogenih 5'-kapa na nukleinskim kiselinama koje proizvodi endogena mašinerija za ćelijsku transkripciju, može da dovede do smanjene translacione kompetencije i smanjene ćelijske stabilnosti.

[0252] Modifikovane nukleinske kiseline prema prikazu mogu takođe da dobiju kapu nakon transkripcije, pomoću enzima, kako bi se obrazovale autentičnije strukture 5'-kape. Kako se ovde koristi, fraza "autentičnije" odnosi se na svojstvo koje verno odslikava ili imitira, bilo strukturno, bilo funkcionalno, endogeno ili prirodno svojstvo. To jest, "autentičnije" svojstvo bolje predstavlja endogenu, prirodnu, naturalnu ili fiziološku ćelijsku funkciju i/ili strukturu u poređenju sa sintetičkim svojstvima ili analozima, itd., iz prethodnog stanja tehnike, ili koje ima bolje performanse u odnosu na odgovarajuće endogeno, prirodno, naturalno ili fiziološko svojstvo, u jednom ili više aspekata. Neograničavajući primeri autentičnijih struktura 5'kape prema predmetnom prikazu su oni, koji, između ostalog, imaju poboljšano vezivanje proteina koji se vezuju za kapu, duži poluživot, smanjenu podložnost na delovanje 5' endonukleaza i/ili smanjeno uklanjanje 5'kape, u poređenju sa sintetičkim strukturama 5'kape koje su poznate u stanju tehnike (ili sa prirodnim, naturalnim ili fiziološkim strukturama 5'kape). Na primer, rekombinantni enzim za dodavanje kape iz vakcinija virusa i rekombinantni enzim 2'-O-metiltransferaza mogu da obrazuju kanonsku 5'-5'-trifosfatnu vezu između 5'-terminalnog nukleotida iz mRNA i guaninskog nukleotida kape pri čemu guanin kape sadrži N7 metilaciju i 5'-terminalni nukleotid iz mRNA sarži 2'-O-metil. Ova struktura je označena kao Cap1 struktura. Ova kapa dovodi do više translacione kompetencije i ćelijske stabilnosti, kao i do smanjene aktivacije ćelijskih proinflamatornih citokina, u poređenju, npr., sa drugim strukturama analoga 5'kape, koji su poznati u stanju tehnike. Strukture kape uključuju 7mG(5')ppp(5')N,pN2p (cap 0), 7mG(5')ppp(5')NlmpNp (cap 1), 7mG(5')-ppp(5')NlmpN2mp (cap 2) i m(7)Gpppm(3)(6,6,2')Apm(2')Apm(2')Cpm(2)(3,2')Up (cap 4).

[0253] Pošto modifikovane nukleinske kiseline mogu da dobiju kapu nakon translacije, i pošto je ovaj proces efikasniji, približno 100% modifikovanih nukleinskih kiselina može da bude sa kapom. Ovo je u suprotnosti sa ~80% kada je analog kape povezan sa mRNK tokom reakcije transkripcije in vitro.

[0254] Prema predmetnom prikazu, 5' terminalne kape mogu da uključuju endogene kape ili analoge kape. Prema predmetnom prikazu, 5' terminalna kapa može da sadrži guaninski analog. Korisni guaninski analozi uključuju inozin, N1-metil-guanozin, 2'fluoro-guanozin, 7-deazaguanozin, 8-okso-guanozin, 2-amino-guanozin, LNA-guanozin, i 2-azido-guanozin.

[0255] U jednom slučaju, ovde opisane nukleinske kiseline mogu da sadrže modifikovanu 5'kapu. Modifikacija na 5'kapi može da poveća stabilnost mRNA, da poveća poluživot mRNA, i može da poveća translacionu efikasnost mRNA. Modifikovana 5'kapa može da uključuje, ali nije ograničena na, jednu ili više od sledećih modifikacija: modifikaciju na 2' i/ili 3' poziciji guanozin trifosfata (GTP) sa kapom, zamenu kiseonika u prstenu šećera (što proizvodi karbociklični prsten) metilenskom komponentom (CH2), modifikaciju na trifosfatnoj komponenti mosta u strukturi kape, ili modifikaciju na nukleobaznoj (G) komponenti.

[0256] Struktura 5'kapa koja može da bude modifikovana uključuje, ali nije ograničena na, ovde opisane kape kao što je CapO koja ima strukturu supstrata za translaciju zavisnu od kape:

ili Cap1 koja ima strukturu supstrata za translaciju zavisnu od kape:

[0257] Kao neograničavajući primer, modifikovana 5'kapa može da ima strukturu supstrata za translaciju zavisnu od kape:

1

�

pri čemu su R1i R2definisani u tabeli 1: Tabela 1

4

idit)

ili

pri čemu su R1i R2definisani u tabeli 2:

Tabela 2

[0258] U tabeli 1, "MOM" označava metoksimetil, "MEM" označava metoksietoksimetil, "MTM" označava metiltiometil, "BOM" označava benziloksimetil i "MP" označava monofosfonat. U tabeli 1 i 2, "F" označava fluor, "Cl" označava hlor, "Br' označava brom i "I" označava jod.

[0259] U neograničavajućem primeru, modifikovana 5'kapa može da ima strukturu supstrata za enzim vakcinije koji dodaje kapu na mRNA:

pri čemu su R1i R2definisani u tabeli 3:

Tabela 3

1

2

ili

pri čemu su R1i R2definisani u tabeli 4:

Tabela 4

Struktura kape broj R1 R2

CAP-211 NH2(amino) H

CAP-212 H NH2(amino) CAP-213 NH2(amino) NH2(amino) CAP-214 N3(azido) H

CAP-215 H N3(azido) CAP-216 N3(azido) N3(azido) CAP-217 X (halo: F, Cl, Br, I) H

CAP-218 H X (halo: F, Cl, Br, I) CAP-219 X (halo: F, Cl, Br, I) X (halo: F, Cl, Br, I)

4

[0260] U tabeli 3, "MOM" označava metoksimetil, "MEM" označava metoksietoksimetil, "MTM" označava metiltiometil, "BOM" označava benziloksimetil i "MP" označava monofosfonat. U tabeli 3 i 4, "F" označava fluor, "Cl" označava hlor, "Br' označava brom i "I" označava jod.

[0261] U drugom neograničavajućem primeru supstrata za modifikovanu strukturu kape CAP-112 - CAP-225 mogu da se dodaju u prisustvu enzima za dodavanje kape iz vakcinije sa komponentom za kreiranje enzimske aktivnosti kao što je, ali ne i ograničeno na, S-adenozilmetionin (AdoMet), u cilju formiranja modifikovane kape mRNA.

[0262] U jednom slučaju, zamena kiseonika iz prstena šećera (što proizvodi karbociklični prsten) metilenskom komponentom (CH2), može da kreira veću stabilnost C-N veze u odnosu na fosfore, pošto je C-N veza otporna na kiselinu ili na enzimsku hidrolizu. Metilenska komponenta može takođe da poveća stabilnost komponente trofosfornog mosta i da time poveća stabilnost mRNA. Kao neograničavajući primer, stuktura kape kao supstrata za translaciju zavisnu od kape može da ima strukturu kao što je, ali ne i ograničeno na, CAP-014 i CAP-015 i/ili stukturu kape kao supstrata za enzim vakcinije za dodavanje kape na mRNA, kao što je, ali ne i ograničeno na, CAP-123 i CAP-124. U drugom primeru, CAP-112 - CAP-122 i/ili CAP-125 - CAP-225, mogu da budu modifikovani tako što se kiseonik iz prstena šećera (što proizvodi karbociklični prsten) zameni metilenskom komponentom (CH2).

[0263] U drugom slučaju, trifosfatni most može da se modifikuje zamenom najmanje jednog kiseonika sumporom (tio), boranskom (BH3) komponentom, metil grupom, etil grupom, metoksi grupom i/ili njihovim kombinacijama. Ova modifikacija može da poveća stabilnost mRNA u odnosu na enzime koji uklanjaju kapu. Kao neograničavajući primer, struktura kape kao supstrat za translaciju zavisnu od kape može da ima strukturu kao što je, ali ne i ograničeno na, CAP-016 - CAP-021 i/ili stukturu kape kao supstrata za enzim vakcinije za dodavanje kape na mRNA, kao što je, ali ne i ograničeno na, CAP-125 - CAP-130. U drugom primeru, CAP-003 - CAP-015, CAP022 - CAP-124 i/ili CAP-131 - CAP-225, može da se modifikuje na trifosfatnom mostu tako što se najmanje jedan od kiseonika u trifosfatnom mostu zameni sumporom (tio), boranskom (BH3) komponentom, metil grupom, etil grupom, metoksi grupom i/ili njihovim kombinacijama.

[0264] U jednom slučaju, CAP-001 - 134 i/ili CAP-136 - CAP-225 mogu da se modifikuju tako da budu tioguanozinski analog slično kao CAP-135. Tioguanozinski analog može da sadrži dodatne modifikacije kao što su, ali ne i ograničeno na, modifikacija na trifosfatnoj komponenti (npr., tio, BH3, CH3, C2H5, OCH3, S i S sa OCH3), modifikacija na poziciji 2' i/ili 3' u 6-tio guanozinu kao što je ovde opisano, i/ili zamena kiseonika u prstenu šećera (što proizvodi karbociklični prsten) kao što je ovde opisano.

[0265] U jednom slučaju, CAP-001-121 i/ili CAP-123 - CAP-225 mogu da se modifikuju tako da budu modifikovana 5'kapa slično kao CAP-122. Modifikovana 5'kapa može da sadrži dodatne modifikacije kao što su, ali ne i ograničeno na, modifikacija na trifosfatnoj komponenti (npr., tio, BH3, CH3, C2H5, OCH3, S i S sa OCH3), modifikacija na poziciji 2' i/ili 3' u 6-tio guanozinu kao što je ovde opisano, i/ili zamena kiseonika u prstenu šećera (što proizvodi karbociklični prsten) kao što je ovde opisano.

[0266] U jednom slučaju, modifikacija 5' kape može da bude vezivanje biotina ili konjugacija na 2' ili 3' poziciji GTP.

[0267] U drugom slučaju, modifikacija 5' kape može da uključuje CF2modifikovanu trifosfatnu komponentu.

3' UTR i virusne sekvence

[0268] Dodatne virusne sekvence kao što su, ali ne i ograničeno na, enhenserska sekvenca translacije žutog patuljastog virusa ječma (BYDV-PAV) mogu da se dobiju inženjeringom i inseriraju u 3' UTR nukleinskih kiselina ili mRNA prema prikazu i mogu da stimulišu translaciju konstrukta in vitro i in vivo. Eksperimetni transfekcije mogu da se sprovedu u relevantnim ćelijskim linijama i proizvodnja proteina može da se testira ELISA testom nakon 12 sati, 24 sata, 48 sati, 72 sata i 7 dana nakon transfekcije.

IRES sekvence

[0269] Dodatno, obezbeđene su nukleinske kiseline koje sadrže unutrašnje mesto za ulazak u ribozom (IRES). Prvi put identifikovan kao svojstvo RNK iz Picorna virusa, IRES igra važnu ulogu u inicijaciji sinteze proteina u odsustvu strukture 5' kape. IRES može da deluje kao jedino vezujuće mesto za ribozom, ili može da posluži kao jedno od više vezujućih mesta za ribozom na mRNA. Nukleinske kiseline ili mRNA koje sadrže više od jednog funkcionalnog vezujućeg mesta za ribozom mogu da kodiraju nekoliko peptida ili polipeptida koji se nezavisno translatiraju pomoću ribozoma ("multicistronski molekuli nukleinske kiseline"). Kada su nukleinske kiseline ili mRNA obezbeđeni sa IRES, dodatno je opciono obezbeđen drugi translatabilni region. Primeri IRES sekvenci koje mogu da se upotrebljavaju u skladu sa prikazom uključuju, ali nisu i ograničeni na, sekvence iz pikornavirusa (npr. FMDV), virusa štetočina (CFFV), polio virusa (PV), virusa encefalomiokarditisa (ECMV), virusa slinavke i šapa (FMDV), virusa hepatitisa C (HCV), virusa klasične svinjske kuge (CSFV), virusa leukemije miša (MLV), majmunskog virusa imunodeficijencije (SIV) ili virusa paralize zrikavaca (CrPV)

Modifikacije terminalne arhitekture: Poli-A repovi

[0270] Tokom obrade RNK, dugačak niz adeninskih nukleotida (poli-A rep) normalno se dodaje na molekule informacione RNK (mRNA) kako bi se stabilnost molekula povećala. Odmah posle transkripcije, 3' kraj transkripta se iseca kako bi se oslobodio 3' hidroksil. Zatim poli-A polimeraza dodaje lanac adeninskih nukleotida na RNK. Proces, nazvan poliadenilacija, dodaje poli-A rep koji je dugačak između 100 i 250 ostataka.

[0271] Otkriveno je da jedinstvene dužine poli-A repa obezbeđuju određene prednosti za modifikovane RNK molekule prema predmetnom prikazu.

[0272] U principu, dužina poli-A repa prema predmetnom prikazu je veća od 30 nukleotida. U drugom slučaju, poli-A rep je duži od 35 nukleotida. U drugom slučaju, dužina iznosi najmanje 40 nukleotida. U drugom slučaju, dužina iznosi najmanje 45 nukleotida. U drugom slučaju, dužina iznosi najmanje 55 nukleotida. U drugom slučaju, dužina iznosi najmanje 60 nukleotida. U drugom slučaju, dužina iznosi najmanje 60 nukleotida. U drugom slučaju, dužina iznosi najmanje 80 nukleotida. U drugom slučaju, dužina iznosi najmanje 90 nukleotida. U drugom slučaju, dužina iznosi najmanje 100 nukleotida. U drugom slučaju, dužina iznosi najmanje 120 nukleotida. U drugom slučaju, dužina iznosi najmanje 140 nukleotida. U drugom slučaju, dužina iznosi najmanje 160 nukleotida. U drugom slučaju, dužina iznosi najmanje 180 nukleotida. U drugom slučaju, dužina iznosi najmanje 200 nukleotida. U drugom slučaju, dužina iznosi najmanje 250 nukleotida. U drugom slučaju, dužina iznosi najmanje 300 nukleotida. U drugom slučaju, dužina iznosi najmanje 350 nukleotida. U drugom slučaju, dužina iznosi najmanje 400 nukleotida. U drugom slučaju, dužina iznosi najmanje 450 nukleotida. U drugom slučaju, dužina iznosi najmanje 500 nukleotida. U drugom slučaju, dužina iznosi najmanje 600 nukleotida. U drugom slučaju, dužina iznosi najmanje 700 nukleotida. U drugom slučaju, dužina iznosi najmanje 800 nukleotida. U drugom slučaju, dužina iznosi najmanje 900 nukleotida. U drugom slučaju, dužina iznosi najmanje 1000 nukleotida. U drugom slučaju, dužina iznosi najmanje 1100 nukleotida. U drugom slučaju, dužina iznosi najmanje 1200 nukleotida. U drugom slučaju, dužina iznosi najmanje 1300 nukleotida. U drugom slučaju, dužina iznosi najmanje 1400 nukleotida. U drugom slučaju, dužina iznosi najmanje 1500 nukleotida. U drugom slučaju, dužina iznosi najmanje 1600 nukleotida. U drugom slučaju, dužina iznosi najmanje 1700 nukleotida. U drugom slučaju, dužina iznosi najmanje 1800 nukleotida. U drugom slučaju, dužina iznosi najmanje 1900 nukleotida. U drugom slučaju, dužina iznosi najmanje 2000 nukleotida. U drugom slučaju, dužina iznosi najmanje 2500 nukleotida. U drugom slučaju, dužina iznosi najmanje 3000 nukleotida.

[0273] U nekim slučajevima, nukleinska kiselina ili mRNA uključuje od oko 30 do oko 3,000 nukleotida (npr., od 30 do 50, od 30 do 100, od 30 do 250, od 30 do 500, od 30 do 750, od 30 do 1,000, od 30 do 1,500, od 30 do 2,000, od 30 do 2,500, od 50 do 100, od 50 do 250, od 50 do 500, od 50 do 750, od 50 do 1,000, od 50 do 1,500, od 50 do 2,000, od 50 do 2,500, od 50 do 3,000, od 100 do 500, od 100 do 750, od 100 do 1,000, od 100 do 1,500, od 100 do 2,000, od 100 do 2,500, od 100 do 3,000, od 500 do 750, od 500 do 1,000, od 500 do 1,500, od 500 do 2,000, od 500 do 2,500, od 500 do 3,000, od 1,000 do 1,500, od 1,000 do 2,000, od 1,000 do 2,500, od 1,000 do 3,000, od 1,500 do 2,000, od 1,500 do 2,500, od 1,500 do 3,000, od 2,000 do 3,000, od 2,000 do 2,500, i od 2,500 do 3,000).

[0274] U jednom slučaju, poli-A rep može da bude dugačak 80 nukleotida, 120 nukleotida, 160 nukleotida na ovde opisanom modifikovanom RNK molekulu kao što je, ali ne i ograničeno na, dužina poliA repa na modifikovanoj RNK koja je opisana u primeru 13.

[0275] U drugom slučaju, poli-A rep može da bude dugačak 20, 40, 80, 100, 120, 140 ili 160 nukleotida na ovde opisanom modifikovanom RNK molekulu, kao što je, ali ne i ograničeno na, dužina poliA repa na modifikovanoj RNK koja je opisana u primeru 44.

[0276] U jednom slučaju, poli-A rep je dizajniran u odnosu na ukupnu dužinu modifikovanog RNK molekula. Ovaj dizajn može da se zasniva na dužini kodirajućeg regiona modifikovane RNK, dužini konkretnog svojstva ili regiona modifikovane RNK (kao što je mRNA), ili da se zasniva na dužini konačnog proizvoda eksprimiranog sa modifikovane RNK. Kada se posmatra u odnosu na bilo koje dodatno svojstvo modifikovane RNK (npr., neko drugo, koje nije deo mRNA koji uključuje poli-A rep) poli-A rep može da bude 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ili 100% duži od dodatnog svojstva. Poli-A rep takođe može da se dizajnira kao frakcija modifikovane RNK kojoj pripada. U ovom kontekstu, poli-A rep može da bude 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, ili 90% ili više, duži od konstrukta ili ukupne dužine konstrukta minus poli-A rep.

[0277] U jednom slučaju, inženjeringom dobijena vezujuća mesta i/ili konjugacija nukleinskih kiselina ili mRNA sa poli-A vezujućim proteinom mogu da se koriste u cilju poboljšavanja ekspresije. Inženjeringom dobijena vezujuća mesta mogu da budu senzorske sekvence koje funkcionišu kao vezujuća mesta za ligande u lokalnom mikrookruženju kiselina i/ili mRNA. Kao neograničavajući primer, nukleinske kiseline i/ili mRNA mogu da sadrže najmanje jedno inženjeringom dobijeno vezujuće mesto kako bi se promenio afinitet vezivanja poli-A vezujućeg proteina (PABP) i njegovih analoga. Inkorporiranje najmanje jednog inženjeringom dobijenog vezujućeg mesta povećava afinitet vezivanja PABP i njegovih analoga.

[0278] Osim toga, više različitih nukleinskih kiselina ili mRNA mogu zajedno da se vežu za PABP (poli-A vezujući protein) preko 3'-kraja, koristeći modifikovane nukleotide na 3'-terminusu poli-A repa. Eksperimenti transfekcije mogu da se sprovedu u relevantnim ćelijskim linijama i proizvodnja proteina može da se proverava ELISA testom 12 sati, 24 sata, 48 sati, 72 sata i 7 dana nakon transfekcije. Kao neograničavajući primer, eksperimenti transfekcije mogu da se koriste kao bi se procenio efekat na afinitet vezivanja PABP ili njegovih analoga, koji se dobija dodavanjem najmanje jednog inženjeringom dobijenog vezujućeg mesta.

[0279] U jednom slučaju, poliA rep može da se koristi za modulaciju inicijacije translacije. Bez želje za ograničenjem teorijom, poliA rep regrutuje PABP koji sa svoje strane može da interaguje sa kompleksom za inicijaciju translacije i tako može da bude od suštinskog značaja za sintezu proteina.

[0280] U drugom slučaju, poliA rep takođe može da se koristi u predmetnom prikazu kao zaštita od 3'-5' digestije egzonukleazama.

[0281] U jednom slučaju, nukleinske kiseline ili mRNA prema predmetnom prikazu dizajnirane su tako da uključuju poliA-G kvartet. G-kvartet je ciklični niz od četiri guaninska nukleotida vezana vodoničnom vezom, koji mogu da obrazuju G-bogate sekvence i u DNK i u RNK. U ovom slučaju G-kvartet je inkorporiran na kraju poli-A repa. Stabilnost, proizvodnja proteina i drugi parametri, uključujući poluživot dobijenih nukleinskih kiselina ili mRNA, mogu da se testiraju u različitim vremenskim tačkama. Otkriveno je da poliA-G kvartet dovodi do proizvodnje proteina ekvivalentne iznosu od najmanje 75% proizvodnje koja se beleži kada se koristi samo poli-A rep od 120 nukleotida.

[0282] U jednom slučaju, nukleinske kiseline ili mRNA prema predmetnom prikazu mogu da sadrže poliA rep i mogu da se stabilizuju dodavanjem lanca nukleozida za terminaciju lanca. Nukleinske kiseline i/ili mRNA sa poliA repom mogu dalje da sadrže strukturu 5'kape.

[0283] U drugom slučaju, nukleinske kiseline ili mRNA prema predmetnom prikazu mogu da sadrže poliA-G kvartet. Nukleinske kiseline i/ili mRNA sa poliA-G kvartetom mogu dalje da sadrže strukturu 5'kape.

[0284] U jednom slučaju, nukleozid za terminaciju lanca koji može da se koristi za stabilizaciju nukleinske kiseline ili mRNA koja sadrži poliA rep ili poliA-G kvartet može da bude, ali nije ograničen na, nukleozide opisane u objavi međunarodnog patenta br. WO2013103659. U drugom slučaju, nukleozid za terminaciju lanaca koji može da se koristi sa predmetnim prikazom, uključuje, ali nije ograničen na, 3'-dezoksiadenozin (kordicepin), 3'-dezoksiuridin, 3'-dezoksicitozin, 3'-dezoksiguanozin, 3'-dezoksitimin, 2',3'-didezoksinukleozide, kao što su 2',3'-didezoksiadenozin, 2',3'-didezoksiuridin, 2',3'-didezoksicitozin, 2',3'- didezoksiguanozin, 2',3'-didezoksitimin, 2'-dezoksinukleozid, ili -O- metilnukleozid.

[0285] U drugom slučaju, nukleinska kiselina kao što je, ali ne i ograničeno na, mRNA, koja sadrži poliA rep ili poliA-G kvartet može da bude stabilizovana modifikacijom 3'regiona nukleinske kiseline koji može da spreči i/ili inhibira dodavanje oligio(U) (videti npr., objavu međunarodnog patenta br. WO2013103659).

[0286] U još jednom slučaju, nukleinska kiselina kao što je, ali ne i ograničeno na, mRNA, koja sadrži poliA rep ili poliA-G kvartet može da bude stabilizovana dodavanjem oligonukleotida koji se završava 3'-dezoksinukleozidom, 2',3'-didezoksinukleozid 3'-0- metilnukleozidima, 3'-0-etilnukleozidima, 3'-arabinozidima, i drugim modifikovanim nukleozidima koji su poznati u oblasti i/ili opisani u ovom dokumentu.

Kvantifikacija

[0287] U jednom slučaju, polinukleotidi, primarni konstrukti, modifikovane nukleinske kiseline ili mmRNA prema predmetnom prikazu mogu da se kvantifikuju u egzozomima koji su dobijeni iz jedne ili više telesnih tečnosti. Kako se ovde koristi "telesne tečnosti" uključuje perifernu krv, serum, plazmu, ascites, urin, likvor (CSF), sputum, pljuvačku, koštanu srž, sinovijalnu tečnost, očnu vodicu, amnionsku tečnost, cerumen, majčino mleko, bronhoalveolarnu tečnost za ispiranje , spermu, prostatičnu tečnost, Kauperovu tečnost ili tečnost pre ejakulacije, znoj, fekalne materije, kosu, suze, tečnost iz ciste, pleuralnu i peritonealnu tečnost, perikardijalnu tečnost, limfu, himus, žuč, intersticijsku tečnost, menstrualnu krv, gnoj, sebum, ispovraćani sadržaj, vaginalni sekret, sekret sluzokože, vodu iz stolice, sok pankreasa, tečnosti za ispiranje sinusnih šupljina, bronhopulmonalne aspirate, tečnost šupljine blastocista i krv iz pupčane vrpce. Alternativno, egzozomi mogu da se uzimaju iz organa izabranog iz grupe koja se sastoji od pluća, srca, pankreasa, želuca, creva, bešike, bubrega, jajnika, testisa, kože, debelog creva, dojke, prostate, mozga, jednjaka, jetre i placente.

[0288] U metodi kvantifikacije, uzorak od najviše 2 mL se dobija od subjekta i egzozoma izolovanih hromatografijom isključivanja po veličini, centrifugiranjem u gradijentu gustine, diferencijalnim centrifugiranjem, nanomembranskom ultrafiltracijom, imunoabsorbentnim hvatanjem, afinitetnim prečišćavanjem, mikrofluidnom separacijom ili njihovim kombinacijama. U analizi, nivo ili koncentracija polinukleotida, primarnog konstrukta, modifikovane nukleinske kiseline ili mmRNK može da bude nivo ekspresije, prisustvo, odsustvo, skraćenje ili izmena primenjenog konstrukta. Korisno je da se nivo poveže sa jednim ili više kliničkih fenotipova ili sa testom za biomarker humane bolesti. Test može da se izvodi korišćenjem proba specifičnih za konstrukt, citometrije, qRT-PCR, PCR u realnom vremenu, PCR, protočne citometrije, elektroforeze, masene spektrometrije ili njihovih kombinacija, dok egzozomi mogu da se izoluju imunohistohemijskim metodama kao što je metode enzimskog imunosorbentnog testa (ELISA). Egzozomi takođe mogu da se izoluju hromatografijom isključivanja po veličini, centrifugiranjem u gradijentu gustine, diferencijalnim centrifugiranjem, nanomembranskom ultrafiltracijom, imunoabsorbentnim hvatanjem, afinitetnim prečišćavanjem, mikrofluidnom separacijom ili njihovim kombinacijama.

[0289] Ove metode obezbeđuju istraživaču da prati, u realnom vremenu, zaostali ili isporučeni nivo polinukleotida, primarnih konstrukata, modifikovane nukleinske kiseline ili mmRNA. Ovo je moguće zbog toga što se polinukleotidi, primarni konstrukti, modifikovana nukleinska kiselina ili mmRNA prema predmetnom prikazu razlikuju od endogenih oblika usled strukturnih, i/ili hemijskih modifikacija.

II. Dizajniranje i sinteza polinukleotida

[0290] Polinukleotidi, primarni konstrukti, modifikovane nukleinske kiseline ili mmRNA prema predmetnom prikazu mogu da se pripremaju u skladu sa bilo kojom dostupnom tehnikom uključujući, ali bez ograničavanja na hemijsku sintezu; enzimsku sintezu, koja se generalno naziva in vitro transkripcija (IVT); ili enzimsko ili hemijsko isecanje dužeg prekursora itd. Postupci sinteze RNK su poznati u stanju tehnike (videti, npr., Gait, M.J. (ed.) Oligonucleotide synthesis: a practical approach, Oxford [Oxfordshire], Washington, DC: IRL Press, 1984; i Herdewijn, P. (ed.) Oligonucleotide synthesis: methods and applications, Methods in Molecular Biology, v. 288 (Clifton, N.J.) Totowa, N.J.: Humana Press, 2005).

[0291] Postupak dizajniranja i sinteze primarnih konstrukata prema prikazu generalno uključuju korake konstrukcije gena, sintetičke proizvodnje mRNA (bilo sa ili bez modifikacija) i prečišćavanje. U postupku enzimske sinteze, ciljna polinukleotidna sekvenca koja kodira

1

polipeptid od interesa je prvo odabrana za inkorporaciju u vektor koji će biti umnožen kako bi se proizvela cDNA matrica. Opciono, ciljna polinukleotidna sekvenca i/ili bilo koje oivičavajuće sekvence mogu da budu sa optimizovanim kodonima. cDNA matrica se zatim upotrebljava za proizvodnju mRNA preko in vitro transkripcije (IVT). Posle proizvodnje, mRNA može da prođe kroz postupke prečišćavanja i čišćenja. Njihovi koraci su detaljnije obezbeđeni u nastavku.

Konstrukcija gena

[0292] Korak konstrukcije gena može da uključuje, ali bez ograničenja, sintezu gena, umnožavanje vektora, prečišćavanje plazmida, linearizaciju i čišćenje plazmida, i sintezu i čišćenje cDNA templejta.

Sinteza gena

[0293] Kada se za proizvodnju odabere polipeptid od interesa, ili ciljni molekul, dizajnira se primarni konstrukt. Unutar primarnog konstrukta, prvi region povezanih nukleozida koji kodira polipeptid od interesa može da se konstruiše upotrebom otvorenog okvira čitanja (ORF) odabranog transkripta nukleinske kiseline (DNK ili RNK). ORF može da sadrži prirodni ORF, njegovu izoformu, varijantu ili fragment. Kako se ovde koristi, predviđeno je da "otvoreni okvir čitanja" ili "ORF" označava sekvencu nukleinske kiseline (DNK ili RNK) koja je sposobna da kodira polipeptid od interesa. ORF okviri često počinju start kodonom, ATG i završavaju se nonsens ili terminacionim kodonom ili signalom.

[0294] Dodatno, nukleotidna sekvenca prvog regiona može da bude sa optimizovanim kodonim. Postupci optimizacije kodona su poznati u stanju tehnike i mogu da budu korisni u nastojanjima da se postigne jedan ili više od nekoliko ciljeva. Ovi ciljevi uključuju usklađivanje učestalosti kodona u ciljnim i organizmima domaćina kako bi se osiguralo pravilno nabiranje, pristrasnost GC sadržaja kako bi se povećala stabilnost mRNA ili redukovale sekundarne strukture, minimalizovanje tandem ponovak kodona ili baznih pokreta koji mogu narušiti konstrukciju ili ekspresiju gena, prilagođavanje transkripcionih i translacionih kontrolnih regiona, insertovanje ili uklanjanje sekvenci za transport proteina, ukloniti/dodati posttranslaciona mesta za modifikaciju u kodiranom proteinu (npr. mesta glikozilacije), dodati, ukloniti ili premeštati proteinske domene, inserirati ili deletirati mesta restrikcije, modifikovati vezujuća mesta za ribozome i mRNA mesta degradacije, kako bi se podesile translacione stope da omoguće da se različiti domeni proteina pravilno naboraju, ili da redukuju ili eliminišu problematične sekundarne strukture unutar mRNA. Alati za optimizaciju kodona, algoritmi i usluge poznati su u stanju tehnike, neograničavajući

2

primeri uključuju usluge od GeneArt (Life Technologies) i/ili DNA2.0 (Menlo Park, CA). U jednom slučaju, ORF sekvenca je optimizovana upotrebom algoritama za optimizaciju. Opcije kodona za svaku amino kiselinu date su u tabeli 5.

Tabela 5. Mogući kodoni

[0295] U jednom slučaju, nakon što su kodoni u nukleotidnoj sekvenci optimizovani, ona može dalje da se oceni za regione koji sadrže restrikciona mesta. Najmanje jedan nukleotid unutar regiona restrikcionog mesta može da bude zamenjen drugim nukleotidom kako bi se restrikciono mesto uklonilo iz sekvence, ali zamena nukleotida menja amino kiselinsku sekvencu koja je kodirana nukleotidnom sekvencom sa optimizovanim kodonima.

[0296] Svojstva koja mogu da se smatraju korisnim u nekim slučajevima prema predmetnom prikazu, mogu da budu kodirana primarnim konstruktom i mogu da oivičavaju ORF u vidu prvog i drugog oivičavajućeg regiona. Oivičavajući regioni mogu da budu inkorporirani u primarni konstrukt pre i/ili nakon optimizacije ORF. Nije neophodno da primarni konstrukt sadrži i 5' i 3' oivičavajući region. Primeri ovakvih svojstava uključuju, ali nisu ograničeni na, netranslatirane regione (UTR regione), Kozak sekvence, oligo(dT) sekvencu i detektabilne markere i može da uključuje više mesta za prepoznavanje koja mogu da imaju Xbal prepoznavanje.

[0297] U nekim slučajevima, 5' UTR i/ili 3' UTR mogu da budu obezbeđeni u vidu oivičavajućih regiona. Više 5' ili 3' UTR regiona može da bude uključeno u oivičavajuće regione i oni mogu da budu iste ili različite sekvence. Bilo koji deo oivičavajućih regiona, uključujući nijedan, može da bude optimizovan za kodon i bilo koji može nezavisno da sadrži jednu ili više različitih strukturnih ili hemijskih modifikacija, pre i/ili nakon optimizacije za kodon. Kombinacije osobina mogu da budu uključene u prvi i drugi bočni region i mogu da budu sadržane unutar drugih svojstava. Na primer, ORF može da bude oivičen 5' UTR regionom koji može da sadrži jak Kozak signal za inicijaciju translacije i/ili 3' UTR regionom koji može da uključuje oligo(dT) sekvencu za matrično dodavanje poli-A repa.

[0298] Tabele 2 i 3 obezbeđuju spisak tipičnih UTR regiona koji mogu da se koriste u primarnom konstruktu prema predmetnom prikazu kao oivičavajući regioni. U tabeli 6 je prikazan reprezentativni spisak 5'-netranslatiranih regiona prema prikazu. Varijante 5' UTR regiona mogu

4

da se koriste, pri čemu se jedan ili više nukleotida dodaje ili uklanja sa terminusa, uključujući A, T, C ili G.

Tabela 6. 5' netranslatirani regioni

[0299] U drugom slučaju, 5' UTR može da sadrži prvi polinukleotidni fragment i drugi polinukleotidni fragment pri čemu prvi i drugi fragment mogu da budu iz istog ili iz različitih gena. (Videti npr., US20100293625 i US20110247090). Kao neograničavajući primer, prvi polinukleotid može da bude fragment psećeg, humanog ili mišijeg SERCA2 gena i/ili drugi polinukleotidni fragment predstavlja fragment goveđeg, mišijeg ili ovčijeg gena za beta-kazein.

[0300] U jednom slučaju, prvi polinukleotidni fragment može da bude lociran na 5' kraju drugog polinukleotidnog fragmenta. (Videti npr., US20100293625 i US20110247090).

[0301] U drugom slučaju, prvi polinukleotidni fragment može da sadrži drugi intron gena za kalcijum ATPazu sarkoplazmatičnog/endoplazmatičnog retikuluma i/ili drugi polinukleotidni fragment sadrži najmanje deo 5' UTR eukariotskog gena za kazein. (Videti npr., US20100293625 i US20110247090). Prvi polinukleotidni fragment može takođe da sadrži najmanje deo egzona 2 i/ili egzona 3 gena za kalcijum ATPazu sarkoplazmatičnog/endoplazmatičnog retikuluma. (Videti npr., US20100293625 i US20110247090).

[0302] U tabeli 7 je prikazan reprezentativni spisak 3'-netranslatiranih regiona prema prikazu. Varijante 3' UTR regiona mogu da se koriste, pri čemu se jedan ili više nukleotida dodaje ili uklanja sa terminusa, uključujući A, T, C ili G.

Tabela 7. 3' netranslatirani regioni

3'UTR Ime/Opis Sekvenca SEQ

3'UTR Ime/Opis Sekvenca SEQ

1

2

[0303] Trebalo bi razumeti da su u prethodnim tabelama navedeni primeri i da bilo koji UTR iz bilo kog gena može da bude ugrađen u odgovarajući prvi ili drugi bočni region primarnog konstrukta. Štaviše, može se koristiti višestruki prirodni UTR bilo kog poznatog gena. Takođe je u okviru razmatranja prema predmetnom prikazu da se obezbede veštački UTR regioni koji nisu varijante prirodnog gena. Ovi UTR regioni ili njihovi delovi mogu da budu postavljeni u istoj orijentaciji kao u transkriptu iz koga su odabrani ili mogu da budu izmenjeni u orijentaciji ili lokaciji. Stoga 5' ili 3' UTR može da budu obrnut, skraćen, produžen, napravljen himernim sa jednim ili više drugih 5' UTR ili 3' UTR. Kako se ovde koristi, termin "promenjen" jer se odnosi na UTR sekvencu, znači da je UTR na neki način promenjen u odnosu na referentnu sekvencu. Na primer, 3' ili 5' UTR može da bude izmenjen u odnosu na prirodni ili nativni UTR promenom orijentacije ili lokacije kao što je navedeno prethodno u tekstu ili može da bude izmenjen uključivanjem dodatnih nukleotida, delecijom nukleotida, zamenom ili transpozicijom nukleotida. Bilo koja od ovih promena koje proizvode „izmenjeni“ UTR (bilo da je 3' ili 5') sadrži varijantu UTR regiona.

[0304] U jednom slučaju, moguće je koristiti dvostruki, trostruki ili četvorostruki UTR kao što je 5' ili 3' UTR. Kako se ovde koristi, "dvostruki" UTR je onaj u kome su dve kopije istog UTR regiona kodirane, bilo u seriji, ili suštinski u seriji. Na primer, dvostruki beta-globinski 3' UTR može da se koristi, kao što je opisano u objavi SAD patenta 20100129877.

[0305] Takođe je u okvirima razmatranja predmetnog prikaza činjenica da postoje UTR regioni sa obrascima. Kako se ovde koristi "UTR regioni sa obrascima" su oni UTR regioni koji odražavaju ponavljajući ili aternirajući obrazac, kao što je ABABAB ili AABBAABBAABB ili ABCABCABC ili njihove varijante, ponovljene jednom, dvaput ili više od 3 puta. U ovim obrascima, svako slovo, A, B, ili C predstavlja različiti UTR na nukleotidnom nivou.

[0306] U jednom slučaju, oivičavajući regioni se biraju iz familije transkripata čiji proteini imaju istu funkciju, strukturu, svojstvo ili osobinu. Na primer, polipeptidi od interesa mogu da pripadaju familiji proteina koji se eksprimiraju u konkretnoj ćeliji, tkivu ili u nekom trenutku tokom razvoja. UTR regioni iz bilo kog od ovih gena mogu da se zamene bilo kojim drugim UTR regionom iz iste ili različite familije proteina, kako bi se kreirao novi himerni primarni transkript. Kako se ovde koristi, "familija proteina " koristi se u najširem smislu, za označavanje grupe od dva ili više polipeptida od interesa koji imaju najmanje jednu zajedničku funkciju, strukturu, svojstvo, lokalizaciju, poreklo ili obrazac ekspresije.

[0307] Posle optimizacije (po želji), komponente primarnog konstrukta se rekonstituišu i transformišu u vektore kao što su, ali bez ograničavanja na, plazmidi, virusi, kozmidi, i veštački hromozomi. Na primer, optimizovani konstrukt može biti rekonstituisan i transformisan pomoću ovde opisanih postupaka u hemijski kompetentnu E. coli, kvasac, neurosporu, kukuruz, drozofilu, itd. gde se javljaju plazmidu-slične ili hromozomske strukture u velikom broju kopija. Stop kodoni [0308] U jednom slučaju, primarni konstrukti prema predmetnom prikazu mogu da uključuju najmanje dva stop kodona pre 3' netranslatiranog regiona (UTR). Stop kodon može da se izabere od TGA, TAA i TAG. U jednom slučaju, primarni konstrukti prema predmetnom prikazu

4

uključuju stop kodon TGA i jedan dodatni stop kodon. U dodatnom slučaju, stop kodon može da bude TAA.

Umnožavanje plazmida

[0309] Vektor koji sadrži primarni konstrukt se zatim umnožava i plazmid se izoluje i prečišćava upotrebom postupaka poznatih u stanju tehnike, kao što je, ali ne i ograničeno na, maksi prep upotrebom kita Invitrogen PURELINK™ HiPure Maxiprep (Carlsbad, CA).

Linearizacija plazmida

[0310] Plazmid se zatim može linearizovati upotrebom postupaka poznatih u stanju tehnike, kao što su, ali bez ograničavanja na, upotreba restrikcionih enzima i pufera. Reakcija linearizacije može da se prečisti upotrebom postupaka uključujući, na primer, Invitrogenov PURELINK™ PCR mikro kit (Carlsbad, CA), i postupaka prečišćavanja zasnovanih na HPLC kao što su, ali bez ograničavanja na, jaku anjonsko izmenjivačku HPLC, slabu anjonsko izmenjivačku HPLC, HPLC na reverznim fazama (RP-HPLC), i HPLC sa hidrofobnom interakcijom (HIC-HPLC) i Invitrogenovog standardnog kita PURELINK™ PCR (Carlsbad, CA). Postupak prečišćavanja može da se modifikuje u zavisnosti od veličine reakcije linearizacije koja je izvedena. Linearizovani plazmid se zatim upotrebljava za generisanje cDNA za reakcije in vitro transkripcije (IVT).

Sinteza cDNA matrice

[0311] cDNA matrica može da se sintetiše tako što će linearni plazmid proći lančanu reakciju polimerazom (PCR). Tabela 8 predstavlja spisak prajmera i proba koje mogu da budu korisne u PCR reakcijama prema predmetnom prikazu. Treba razumeti da spisak nije iscrpan i da dizajniranje prajmer i proba za bilo koju amplifikaciju spada u obim veština stručnjaka u oblasti. Probe takođe mogu da sadrže hemijski modifikovane baze kako bi se povećala vernost sparivanja baza sa ciljnim molekulom i jačina sparivanja baza. Ove modifikacije mogu da uključuju 5-metilcitidin, 2,6-di-amino-purin, 2'-fluoro, fosforotioat, ili zaključane nukleinske kiseline.

Tabela 8. Prajmeri i probe

Q

[0312] U jednom slučaju, cDNA može da se sekvencira pre nego što se podvrgne transkripciji.

Proizvodnja polinukleotida

[0313] Postupak proizvodnje polinukleotida može da uključuje, ali nije ograničen na, in vitro transkripciju, uklanjanje cDNA matrice i prečišćavanje RNK, i reakcije dodavanja kape i/ili repa.

In Vitro transkripcija

[0314] cDNA proizvedena u prethodnom koraku može se transkribovati upotrebom sistema za in vitro transkripciju (IVT). Sistem tipično sadrži transkripcioni pufer, nukleotid trifosfate (NTP), inhibitor RNaze i polimerazu. NTP se mogu proizvesti u sopstvenoj laboratoriji, mogu se odabrati od dobavljača, ili se mogu sintetisati kao što je ovde opisano. NTP se mogu odabrati od, ali nisu ograničeni na ovde opisane, uključujući prirodne i neprirodne (modifikovane) NTP. Polimeraza se može odabrati od, ali nije ograničena na, T7 RNK polimerazu, T3 RNK polimerazu i mutantne polimeraze kao što su, ali ne i ograničeno na, polimeraze sposobne da se inkorporiraju u modifikovane nukleinske kiseline.

RNK polimeraze

[0315] Bilo koji broj RNK polimeraza ili varijanti može da se koristi u dizajnu primarnih konstrukata prema predmetnom prikazu.

[0316] RNK polimeraze mogu se modifikovati insertovanjem ili deletiranjem amino kiselina sekvence RNK polimeraze. Kao neograničavajući primer, RNK polimeraza se može modifikovati tako da pokaže povećanu sposobnost da inkorporiše 2'-modifikovani nukleotid trifosfat u poređenju sa nemodifikovanom RNK polimerazom (videti međunarodnu publikaciju WO2008078180 i S.A.D. patent 8.101.385

[0317] Varijante se mogu dobiti evolucijom RNK polimeraze, optimizacijom sekvence amino kiselina i/ili nukleinske kiseline RNK polimeraze i/ili upotrebom drugih postupaka poznatih u stanju tehnike. Kao neograničavajući primer, varijante T7 RNK polimeraze mogu evoluirati upotrebom sistema kontinuirane usmerene evolucije koji su postavili Esvelt et al. (Nature (2011) 472(7344):499-503) gde klonovi T7 RNK polimeraze mogu kodirati najmanje jednu mutaciju kao što je, ali bez ograničavanja na, lizin na poziciji 93 supstituisan treoninom (K93T), 14M, A7T, E63V, V64D, A65E, D66Y, T76N, C125R, S128R, A136T, N165S, G175R, H176L, Y178H, F182L, L196F, G198V, D208Y, E222K, S228A, Q239R, T243N, G259D, M2671, G280C, H300R, D351A, A354S, E356D, L360P, A383V, Y385C, D388Y, S397R, M401T, N410S, K450R, P451T, G452V, E484A, H523L, H524N, G542V, E565K, K577E, K577M, N601S, S684Y, L699l, K713E, N748D, Q754R, E775K, A827V, D851N ili L864F. Kao drugi neograničavajući primer, varijante T7 RNK polimeraze mogu kodirati najmanje mutaciju kao što je opisano u SAD objavama br. 20100120024 i 20070117112. Varijante RNK polimeraze mogu takođe uključivati, ali nisu ograničene na, supstitucione varijante, konzervativnu amino kiselinsku supstituciju, insercione varijante, delecione varijante i/ili kovalentne derivate.

[0318] U jednom slučaju, primarni konstrukt može da bude dizajniran tako da bude prepoznat od strane RNK polimeraze prirodne ili varijantne. Pritom se primarni konstrukt može modifikovati tako da sadrži mesta ili regione promena sekvence iz prirodnog ili roditeljskog primarnog konstrukta.

[0319] U jednom slučaju, primarni konstrukt može da bude dizajniran tako da uključuje najmanje jednu supstituciju i/ili inserciju ushodno od mesta za vezivanje ili prepoznavanje RNK polimeraze, nishodno od mesta za vezivanje ili prepoznavanje RNK polimeraze, ushodno od TATA boks sekvence, nishodno od TATA boks sekvence primarnog konstrukta, ali ushodno od kodirajućeg regiona primarnog konstrukta, u okviru 5’UTR, pre 5’UTR i/ili posle 5’UTR.

[0320] U jednom slučaju, 5’UTR primarnog konstrukta može da se zameni insercijom najmanje jednog regiona i/ili lanca nukleotida sa istom bazom. Region i/ili lanac nukleotida može da uključuje, ali nije ograničen na, najmanje 3, najmanje 4, najmanje 5, najmanje 6, najmanje 7 ili najmanje 8 nukleotida i i nukleotidi mogu da budu prirodni i/ili neprirodni. Kao neograničavajući primer, grupa nukleotida može da uključuje 5-8 adenina, citozina, timina, niz bilo kojih drugih nukleotida koji je ovde prikazan, i/ili njihove kombinacije.

[0321] U jednom slučaju, 5’UTR primarnog konstrukta može da se zameni insercijom najmanje dva regiona i/ili niza nukleotida dve različite baze kao što su, ali bez ograničavanja na, adenin, citozin, timin, bilo koje od drugih nukleotida koji se ovde objavljuju i/ili njihove kombinacije. Na primer, 5'UTR može da se zameni insercijom 5-8 adeninskih baza, nakon čega sledi insercija 5-8 citozinskih baza. U sledećem primeru, 5'UTR može da se zameni insercijom 5-8 citozinskih baza, nakon čega sledi insercija 5-8 adeninskih baza.

[0322] U jednom slučaju, primarni konstrukt može da uključuje najmanje jednu supstituciju i/ili inserciju nizvodno od mesta početka transkripcije koje može biti prepoznato od strane RNK polimeraze. Kao neograničavajući primer, najmanje jedna supstitucija i/ili insercija se može javiti nizvodno od mesta početka transkripcije supstituisanjem najmanje jedne nukleinske kiseline u regionu neposredno nizvodno od mesta početka transkripcije (kao što je, ali bez ograničavanja na, 1 do 6). Promene u regionu nukleotida neposredno nizvodno od mesta početka transkripcije mogu uticati na stope inicijacije, povećati očigledne vrednosti konstante reakcije nukleotid trifosfata (NTP), i povećati disocijaciju kratkih transkripata iz kompleksa transkripcije koji započinje inicijalnu transkripciju (Brieba et al, Biochemistry (2002) 41: 5144-5149). Modifikacija, supstitucija i/ili insercija najmanje jedne nukleinske kiseline može uzrokovati tihu mutaciju sekvence nukleinske kiseline ili može uzrokovati mutaciju u amino kiselinskoj sekvenci.

[0323] U jednom slučaju, primarni konstrukt može da uključuje supstituciju najmanje 1, najmanje 2, najmanje 3, najmanje 4, najmanje 5, najmanje 6, najmanje 7, najmanje 8, najmanje 9, najmanje 10, najmanje 11, najmanje 12 ili najmanje 13 guaninskih baza nizvodno od mesta početka transkripcije.

[0324] U jednom slučaju, primarni konstrukt može da uključuje supstituciju najmanje 1, najmanje 2, najmanje 3, najmanje 4, najmanje 5 ili najmanje 6 guaninskih baza u regionu neposredno nizvodno od mesta početka transkripcije. Kao neograničavajući primer, ukoliko su nukleotidi u regionu GGGAGA, guaninske baze mogu da budu supstituisane sa najmanje 1, najmanje 2, najmanje 3 ili najmanje 4 adeninska nukleotida. U sledećem neograničavajućem primeru, ukoliko su nukleotidi u regionu GGGAGA, guaninske baze mogu da budu supstituisane sa najmanje 1, najmanje 2, najmanje 3 ili najmanje 4 citozinske baze. U sledećem neograničavajućem primeru, ako su nukleotidi u regionu GGGAGA, guaninske baze mogu da budu supstituisane sa najmanje 1, najmanje 2, najmanje 3 ili najmanje 4 timina, i/ili bilo kojim od ovde opisanih nukleotida.

[0325] U jednom slučaju, primarni konstrukt može da uključuje najmanje jednu supstituciju i/ili inserciju uzvodno od start kodona. Radi jasnoće, stručnjak u oblasti bi podrazumevao da je start kodon prvi kodon kodirajućeg regiona proteina, dok je mesto početka transkripcije mesto gde počinje transkripcija. Primarni konstrukt može da uključuje, ali nije ograničen na, najmanje 1, najmanje 2, najmanje 3, najmanje 4, najmanje 5, najmanje 6, najmanje 7 ili najmanje 8 supstitucija i/ili insercija nukleotidnih baza. Nukleotidne baze mogu da budu inserirane ili supstituisane na 1, najmanje 1, najmanje 2, najmanje 3, najmanje 4 ili najmanje 5 lokacija uzvodno od start kodona. Insertovani i/ili supstituisani nukleotidi mogu da budu ista baza (npr. svi A ili svi C ili svi T ili svi G), dve različite baze (npr. A i C, A i T, ili C i T), tri različite baze (npr. A, C i T ili A, C i T) ili najmanje četiri različite baze. Kao neograničavajući primer, guaninska baza uzvodno od kodirajućeg regiona u primarnom konstruktu može biti supstituisana sa adeninom, citozinom, timinom, ili bilo kojim od ovde opisanih nukleotida. U sledećem neograničavajućem primeru, supstitucija guaninskih baza u primarnom konstruktu može biti dizajnirana tako da napusti jednu guaninsku bazu u regionu nizvodno od mesta početka transkripcije i pre start kodona (videti Esvelt et al. Nature (2011) 472(7344):499-503). Kao neograničavajući primer, najmanje 5 nukleotida može biti insertovano na 1 lokaciju nizvodno od mesta početka transkripcije ali uzvodno od start kodona i najmanje 5 nukleotida mogu da budu isti tip baza.

Uklanjanje i prečišćavanje cDNA matrice

[0326] cDNA matrica se može ukloniti upotrebom postupaka poznatih u stanju tehnike, kao što je, ali bez ograničavanja na, tretman dezoksiribonukleazom I (DNaza I). Čišćenje RNK može takođe da uključuje postupak prečišćavanja kao što je, ali bez ograničavanja na, AGENCOURT<®>CLEANSEQ<®>sistem od Beckman Coulter (Danvers, MA), postupke prečišćavanja zasnovane na HPLC kao što su, ali bez ograničavanja na, jaku anjonsko izmenjivačku HPLC, slabu anjonsko izmenjivačku HPLC, HPLC na reverznim fazama (RP-HPLC), i HPLC sa hidrofobnom interakcijom (HIC-HPLC)..

Reakcije dodavanja kape i/ili repa

[0327] Primarni konstrukt ili mmRNA takođe mogu da se izlože reakcijama dodavanja kape i/ili postavljanja repa. Reakcija dodavanja kape može se izvesti postupcima poznatim u stanju tehnike za dodavanje 5' kape na 5' kraj primarnog konstrukta. Postupci za dodavanje kape uključuju, ali nisu ograničeni na, upotrebu enzima Vaccinia Capping Enzyme (New England Biolabs, Ipswich, MA).

[0328] Reakcija postavljanja poli-A repa može da se izvodi postupcima poznatim u stanju tehnike, kao što je, ali bez ograničavanja na, 2'O-metiltransferaza i postupcima kao što je ovde opisano. Ukoliko primarni konstrukt generisan iz cDNA ne uključuje poli-T, moglo bi biti korisno izvršiti reakciju postavljanja poli-A-repa pre nego što se očisti primarni konstrukt.

Prečišćavanje

[0329] Prečišćavanje primarnog konstrukta ili mmRNA može da uključuje, ali nije ograničeno na, čišćenje mRNA ili mmRNA, osiguranje kvaliteta i kontrolu kvaliteta. Čišćenje mRNA ili mmRNA se može izvesti postupcima poznatim u stanju tehnike, kao što su, ali bez ograničavanja na, AGENCOURT<®>perle (Beckman Coulter Genomics, Danvers, MA), poli-T perle, LNA™ oligo-T probe za zarobljavanje (EXIQON<®>Inc, Vedbaek, Danska) ili postupke prečišćavanja zasnovane na HPLC, kao što su, ali bez ograničavanja na, jaku anjonsko izmenjivačku HPLC, slabu anjonsko izmenjivačku HPLC, HPLC na reverznim fazama (RP-HPLC), i HPLC sa hidrofobnom interakcijom (HIC-HPLC) ili tretiranje RNAzom III. Termin "prečišćen" kada se upotrebljava u odnosu na polinukleotid, kao što je "prečišćena mRNA ili mmRNA", označava onu koja je odvojena od najmanje jednog kontaminanta. Kako se ovde koristi, "kontaminant" je bilo koja supstanca koja čini drugu neprikladnom, nečistom ili inferiornom. Stoga, prečišćeni polinukleotid (npr. DNK i RNK) prisutan je u obliku ili postavci različitoj od one u kojoj se nalazi u prirodi, ili u obliku ili postavci različitoj od one koja je postojala pre nego što je podvrgnut postupku tretiranja ili prečišćavanja.

[0330] Provera osiguranja kvaliteta i/ili kontrole kvaliteta mogu se izvesti upotrebom postupaka kao što su, ali bez ograničavanja na, gel elektroforezu, UV apsorbancu, ili analitičku HPLC.

[0331] U drugom slučaju, mRNA ili mmRNA mogu da se sekvenciraju postupcima koji uključuju, ali nisu ograničeni na, PCR nakon reverzne transkripcije.

[0332] U jednom slučaju, mRNA ili mmRNA mogu da se kvantifikuju upotrebom postupaka kao što je, ali bez ograničavanja na, ultraviolentnu vidljivu spektroskopiju (UV/Vis). Neograničavajući primer UV/Vis spektrometra je NANODROP<®>spektrometar (ThermoFisher, Waltham, MA). Kvantifikovana mRNA ili mmRNA mogu se analizirati kako bi se odredilo da li mRNA ili

1

mmRNA mogu da budu odgovarajuće veličine, proveriti da nije došlo do degradacije mRNA ili mmRNA. Degradacija mRNA i/ili mmRNA može se proveriti postupcima kao što su, ali bez ograničavanja na, elektroforezu na agaroznom gelu, postupke prečišćavanja zasnovane na HPLC kao što su, ali bez ograničavanja na, jaku anjonsko izmenjivačku HPLC, slabu anjonsko izmenjivačku HPLC, HPLC na reverznim fazama (RP-HPLC), i HPLC sa hidrofobnom interakcijom (HIC-HPLC), tečnu hromatografiju-masenu spektrometriju (LCMS), kapilarnu elektroforezu (CE) i kapilarnu gel elektroforezu (CGE).

Signalni peptidi ili proteini

[0333] Primarni konstrukti ili mmRNK mogu takođe da kodiraju dodatna svojstva koja olakšavaju transport polipeptida do terapeutski relevantnih mesta. Jedno takvo svojstvo koje pomaže prilikom transporta proteina je signalna sekvenca peptida. Kako se ovde koristi, "signalna sekvenca" ili "signalni peptid" je polinukleotid ili polipeptid, redom, koji je dugačak 9 do 200 nukleotida (3-60 amino kiselina) koji su inkorporirani na 5' (ili N-terminusu) kodirajućeg regiona ili kodiranog polipeptida, redom. Dodavanje ovih sekvenci dovodi do transporta kodiranog polipeptida u endoplazmatski retikulum, jednim ili više sekretornih puteva. Neki signalni peptidi isecaju se iz proteina signalnom peptidazom, nakon što se proteini transportuju.

[0334] Tabela 9 je reprezentativni spisak signalnih proteina ili peptida koji mogu da se inkorporiraju kako bi ih kodirali polinukleotidi, primarni konstrukti ili mmRNA prema prikazu.

1 1

Tabela 9. Signalni peptidi

12 ID Opis NUKLEOTIDNA SEQ KODIRANI PEPTID SEQ

1

14 ID Opis NUKLEOTIDNA SEQ KODIRANI PEPTID SEQ

1

ID Opis NUKLEOTIDNA SEQ KODIRANI PEPTID SEQ

1

ID Opis NUKLEOTIDNA SEQ KODIRANI PEPTID SEQ

1

ID Opis NUKLEOTIDNA SEQ KODIRANI PEPTID SEQ

1

ID Opis NUKLEOTIDNA SEQ KODIRANI PEPTID SEQ

1

11

[0335] U tabeli 9, SS je signal za sekreciju, a MLS mitohondrijalni liderski signal. Primarni konstrukti ili mmRNA prema predmetnom prikazu mogu da budu dizajnirani tako da kodiraju bilo koju od signalnih peptidnih sekvenci iz SEQ ID NO 98-159, ili njihove fragmente ili varijante. Ove sekvence mogu da budu uključene na početku regiona koji kodira polipeptid, u sredini ili na terminusima ili alternativno, u oivičavajući region. Osim toga, bilo koji od polinukleotidnih primarnih konstrukata prema predmetnom prikazu može takođe da sadrži jednu ili više sekvenci definisanih u SEQ ID NO 36-97. One mogu da budu u prvom regionu ili bilo kom od oivičavajućih regiona.

[0336] Dodatne signalne peptidne sekvence koje mogu da se koriste u predmetnom prikazu uključuju sekvence prikazane u, na primer, bazama podataka, kao što su baze koje se mogu naći na internet adresama http://www.signalpeptide.de/ ili http://proline.bic.nus.edu.sg/spdb/. Pogodne su i baze podataka koje su opisane u SAD patentima 8,124,379; 7,413,875 i 7,385,034.

[0337] U jednom slučaju, molekuli modifikovane nukleinske kiseline mogu da uključuju sekvencu nukleinske kiseline koja kodira signal za lokalizaciju u jedru (NLS) i/ili signal za eksport iz jedra (NES). U jednom aspektu, molekuli modifikovane nukleinske kiseline mogu da uključuju sekvencu nukleinske kiseline koja kodira signal za lokalizaciju u jedru (NLS). Molekuli modifikovane nukleinske kiseline koji kodiraju NLS mogli bi da budu u stanju da transportuju polipeptid u jedro i isporučuju signal za preživljavanje ili smrt u mikrookolinu u jedru U drugom aspektu, molekuli modifikovane nukleinske kiseline mogu da uključuju sekvencu nukleinske kiseline koja kodira signal za eksport iz jedra kao što je NES1 i/ili NES2. Kao neograničavajući primer, molekuli modifikovane nukleinske kiseline mogu da kodiraju NES1, NES2 i NLS signal i onkološki polipeptid ili ispremeštanu sekvencu koja nije translatabilna, kako bi došlo do interakcije sa HIF1 -alfa kojom se menja transkriptom ćelija kancera.

Odabir ciljnog molekula

[0338] Prema predmetnom prikazu, primarni konstrukti sadrže najmanje prvi region povezanih nukleozida koji kodira najmanje jedan polipeptid od interesa. Polipeptidi od interesa ili "ciljni molekuli" ili proteini i peptidi prema predmetnom prikazu navedeni su u međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/US2013/030062, podnetoj 9. marta 2013., pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Biologics and Proteins Associated with Human Disease; međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/US2013/030063, podnetoj 9. marta 2013., pod naslovom Modified Polynucleotides; međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/US2013/030064, pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Secreted Proteins; međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/US2013/030059, podnetoj 9. marta 2013., pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Membrane Proteins; međunarodnoj prijavi br. PCT/US2013/030066, podnetoj 9. marta 2013., pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Cytoplasmic and Cytoskeletal Proteins; međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/US2013/030067, podnetoj 9. marta 2013., pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Nuclear Proteins; međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/US2013/030060, podnetoj 9. marta 2013., pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Proteins; međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/US2013/030061, podnetoj 9. marta 2013., pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Proteins Associated with Human Disease; neđunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/US2013/030068, podnetoj 9. marta 2013., pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Cosmetic Proteins and Peptides; međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/US2013/030070, podnetoj 9. marta 2013., pod naslovom Modified Polynucleotides for the Production of Oncology-Related Proteins and Peptides; i međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/US2013/031821, podnetoj 15. marta 2013., pod naslovom In Vivo Production of Proteins.

Signali i mesta za isecanje proteina

[0339] U jednom slučaju, polipeptidi prema predmetnom prikazu mogu da uključuju najmanje jedan signal za isecanje proteina koji sadrži najmanje jedno mesto za isecanje proteina. Mesto za isecanje proteina može da bude locirano na N-terminusu, C-terminusu, na bilo kom mestu između N- i C- terminusa, kao što je, ali ne i ograničeno na, na pola puta između N- i C-terminusa, između N-terminusa i tačke na pola puta, između tačke na pola puta i C- terminusa, i njihovim kombinacijama.

[0340] Polipeptidi prema predmetnom prikazu mogu da uključuju, ali nisu ograničeni na, signal za isecanje proteina proprotein konvertazom (ili prohormon konvertaze), trombinom ili Faktorom Xa. Proprotein konvertaze su familija od devet proteinaza, koja obuhvata sedam basic amino acidspecific subtilisin-like serin proteinaza sličnih serinu koje su specifične za bazne amino kiseline i srodne keksinu iz kvasca, a koje su poznate kao prohormon konvertaza 1/3 (PC1/3), PC2, furin, PC4, PC5/6, enzim za isecanje sparenih amino kiselina 4 (PACE4) i PC7, i dve druge suptilaze koje isecanje vrše na ostacima koji nisu bazni, a koje se zovu suptilizin keksin izozim 1 (SKI-1) i proprotein konvertaza suptilizin keksin 9 (PCSK9). Neograničavajući primeri amino kiselinskih sekvenci signala za isecanje proteina su dati na spisku u tabeli 10. U tabeli 10, "X" predstavlja bilo koju amino kiselinu, "n" može da bude 0, 2, 4 ili 6 amino kiseline i "*" označava mesto za isecanje proteina. U tabeli 10, SEQ ID NO: 162 se odnosi na slučaj kada je n=4, a SEQ ID NO:163 se odnosi na slučaj kada je n=6. ;;Tabela 10. Sekvence mesta za isecanje proteina ;;; ;;;; 11 ; ;; [0341] U jednom slučaju, primarni konstrukti, modifikovane nukleinske kiseline i mmRNA prema predmetnom prikazu mogu inženjeringom da se izmene tako da primarni konstrukt, modifikovana nukleinska kiselina ili mmRNA sadrži najmanje jedan signal za isecanje kodiranog proteina. Signal za isecanje kodiranog proteina može da bude lociran pre start kodon, posle start kodon, pre kodirajućeg regiona, unutar kodirajućeg regiona kao recimo, ali ne i ograničeno na, na polovini kodirajućeg regiona, između start kodona i tačke na polovini, između tačke na polovini i stop kodona, posle kodirajućeg regiona, pre stop kodona, između dva stop kodona, posle stop kodona, i njihovih kombinacija. ;[0342] U jednom slučaju, primarni konstrukti, modifikovane nukleinske kiseline ili mmRNA prema predmetnom prikazu mogu da uključuju najmanje jedan signal za isecanje kodiranog proteina koji sadrži najmanje jedno mesto za isecanje proteina. Signal za isecanje kodiranog proteina može da uključuje, ali nije ograničen na, signal za isecanje protein iz proproteina konvertaze (ili prohormona konvertaze), trombina i/ili Faktora Xa. Stručnjak u oblasti može da koristi tabelu 5 iz teksta koji prethodi, ili druge poznate metode za određivanje signala za isecanje kodiranog proteina koji je pogodan za uključivanje u primarne konstrukte, modifikovane nukleinske kiseline ili mmRNA prema predmetnom prikazu. Na primer, polazeći od signala iz tabele 10 i uzimajući u obzir kodone iz tabele 5, moguće je dizajnirati signal za primarni konstrukt koji može da proizvede proteinski signal u dobijenom polipeptidu. ;[0343] U jednom slučaju, polipeptidi prema predmetnom prikazu uključuju najmanje jedan signal i/ili mesto za isecanje proteina. ;[0344] Kao neograničavajući primer, u SAD pat. br.7,374,930 i obj. SAD pat. br.20090227660, koristi se furinsko mesto za isecanje kako bi se isekao N-terminalni metionin iz GLP-1 u proizvodu ekspresije iz Goldži aparata u ćelijama. U jednom slučaju, polipeptidi prema predmetnom prikazu uključuju najmanje jedan signal i/ili mesto za isecanje proteina, pod uslovom da polipeptid nije GLP-1. ;[0345] U jednom slučaju, primarni konstrukti, modifikovane nukleinske kiseline ili mmRNA prema predmetnom prikazu uključuju jedan signal i/ili mesto za isecanje kodiranog proteina. ;[0346] U jednom slučaju, primarni konstrukti, modifikovana nukleinska kiselina ili mmRNA prema predmetnom prikazu uključuju najmanje jedan signal i/ili mesto za isecanje kodiranog proteina, pod uslovom da primarni konstrukt, modifikovana nukleinska kiselina ili mmRNA ne kodiraju GLP-1. ;[0347] U jednom slučaju, primarni konstrukti, modifikovana nukleinska kiselina ili mmRNA prema predmetnom prikazu mogu da uključuju više od jednog kodirajućeg regiona. Kada je u primarnom konstruktu, modifikovanoj nukleinskoj kiselini ili mmRNA prema predmetnom prikazu prisutno više kodirajućih regiona, oni mogu da budu razdvojeni kodiranim mestima za isecanje proteina. Kao neograničavajući primer, primarni konstrukt, modifikovana nukleinska kiselina ili mmRNA mogu da budu organizovane u uređenom obrascu. Jedan takav obrazac prati AXBY oblik u kome su A i B kodirajući regioni koji mogu da budu isti ili različiti kodirajući regioni i/ili mogu da kodiraju iste ili različite polipeptide, a X i Y signali za isecanje kodiranih proteina koji mogu da kodiraju isti ili različite signale za isecanje proteina. Drugi ovakav obrazac prati oblik AXYBZ gde su A i B kodirajući regioni koji mogu da budu isti ili različiti kodirajući regioni i/ili mogu da kodiraju iste ili različite polipeptide, a X, Y i Z su signali za isecanje kodiranih proteina koji mogu da kodiraju iste ili različite signale za isecanje proteina. Treći obrazac prati oblik ABXCY gde su A, B i C kodirajući regioni koji mogu da budu isti ili različiti kodirajući regioni i/ili mogu da kodiraju iste ili različite polipeptide, a X i Y su signali za isecanje kodiranih proteina koji mogu da kodiraju isti ili različite signale za isecanje proteina. ;[0348] U jednom slučaju, polipeptidi, primarni konstrukti, modifikovane nukleinske kiseline i mmRNA takođe mogu da sadrže sekvence koje kodiraju mesta za isecanje proteina tako da polipeptidi, primarni konstrukti, modifikovane nukleinske kiseline i mmRNA mogu da se otpuste iz nosačkog regiona ili od fuzionog partnera putem tretmana proteazom specifičnom za navedeno mesto za isecanje proteina. ;[0349] Tabela 11 je nepotpuni spisak miRs i miR vezujućih mesta (miR BS) i njihovih sekvenci, koja mogu da se koriste sa predmetnim prikazom. ;;Tabela 11. Mirs sekvence i mir vezujuća mesta ;;; ;;;; 11 ; ;;; 11 microRNA mir MIR BS microRNA mir MIR BS ; ;;; 11 ;microRNA mir MIR BS microRNA mir MIR BS ; ; ;;; 11 ;microRNA mir MIR BS microRNA mir MIR BS ; ;;; 11 ;microRNA mir MIR BS microRNA mir MIR BS ; ;;; 12 ;microRNA mir MIR BS microRNA mir MIR BS ; ; microRNA mir MIR BS microRNA mir MIR BS ; ; microRNA mir MIR BS microRNA mir MIR BS ; ;;; 12 ;microRNA mir MIR BS microRNA mir MIR BS ; ; microRNA mir MIR BS microRNA mir MIR BS ; ;;; 12 ;microRNA mir MIR BS microRNA mir MIR BS ; ;;; 12 ;microRNA mir MIR BS microRNA mir MIR BS ; ;;; 12 ;microRNA mir MIR BS microRNA mir MIR BS ; ;;; 12 ;microRNA mir MIR BS microRNA mir MIR BS ; ;;; 12 ;microRNA mir MIR BS microRNA mir MIR BS ; ;;; 1 ;microRNA mir MIR BS microRNA mir MIR BS ; ;;; 11 ;microRNA mir MIR BS microRNA mir MIR BS ; ;;; 12 ;microRNA mir MIR BS microRNA mir MIR BS ; ;;; 1 ;S ; ;;; 14 ;microRNA mir MIR BS microRNA mir MIR BS ; ;;; 1 ;microRNA mir MIR BS microRNA mir MIR BS ; ;;; 1 ;microRNA mir MIR BS microRNA mir MIR BS ; ;;; 1 ;microRNA mir MIR BS microRNA mir MIR BS ; ;;; 1 ;microRNA mir MIR BS microRNA mir MIR BS ; ; ;;; 1 ;microRNA mir MIR BS microRNA mir MIR BS ; ;;; 14 ;microRNA mir MIR BS microRNA mir MIR BS ; ; microRNA mir MIR BS microRNA mir MIR BS ; ; microRNA mir MIR BS microRNA mir MIR BS ; ;;; 14 ;microRNA mir MIR BS microRNA mir MIR BS ; ; microRNA mir MIR BS microRNA mir MIR BS ; ;;; 14 ;microRNA mir MIR BS microRNA mir MIR BS ; ;;; 14 ;microRNA mir MIR BS microRNA mir MIR BS ; ;;; 14 ;microRNA mir MIR BS microRNA mir MIR BS ; ;;; 14 ;microRNA mir MIR BS microRNA mir MIR BS ; ;;; 14 ;microRNA mir MIR BS microRNA mir MIR BS ; ;;; 1 ;microRNA mir MIR BS microRNA mir MIR BS ; ;;; 11 ;microRNA mir MIR BS microRNA mir MIR BS ; ;;; 12 ;microRNA mir MIR BS microRNA mir MIR BS ; ;;; 1 ;microRNA mir MIR BS microRNA mir MIR BS ; ;;; 14 ;microRNA mir MIR BS microRNA mir MIR BS ; ;;; 1 ;microRNA mir MIR BS microRNA mir MIR BS ; ;;; 1 ;microRNA mir MIR BS microRNA mir MIR BS ; ;;; 1 ; ;;; 1 microRNA mir MIR BS microRNA mir MIR BS ; ;;; 1 ;microRNA mir MIR BS microRNA mir MIR BS ; ;;; 1 ;microRNA mir MIR BS microRNA mir MIR BS ; ;;; 11 ;microRNA mir MIR BS microRNA mir MIR BS ; ;;; 12 ;microRNA mir MIR BS microRNA mir MIR BS SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID ; ;;; 1 ; ;;; 14 ;;; 1 microRNA mir MIR BS microRNA mir MIR BS ; ;;; 1 ;microRNA mir MIR BS microRNA mir MIR BS ; ; ;;; 1 ;microRNA mir MIR BS microRNA mir MIR BS ; ; ;;; 1 ;microRNA mir MIR BS microRNA mir MIR BS ; ;;; 1 ;microRNA mir MIR BS microRNA mir MIR BS ; ;;; 1 ;microRNA mir MIR BS microRNA mir MIR BS ; ;;; 11 ;microRNA mir MIR BS microRNA mir MIR BS ; ;;; 12 ;microRNA mir MIR BS microRNA mir MIR BS SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID ; ;;; 1 ;microRNA mir MIR BS microRNA mir MIR BS SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID ; ;;; 1 4 ; ;;; 1 ;;; 1 S ; ;;; 1 ; ;;; 1 microRNA mir MIR BS microRNA mir MIR BS ; ;;; 1 ;microRNA mir MIR BS microRNA mir MIR BS ; ;;; 1 ;microRNA mir MIR BS microRNA mir MIR BS ; ;;; 11 ;microRNA mir MIR BS microRNA mir MIR BS SEQ ID SEQ ID SEQ ID SEQ ID ; ;;; 1 2 ; ;; [0350] Kao što je prikazano u tabeli 12, microRNA su različito eksprimirane u različitim tkivima i ćelijama, i često su povezane sa različitim tipovima bolesti (npr. ćelijama kancera). Odluka o deletiranju ili inserciji mesta vezivanja za microRNA, ili bilo kojoj kombinaciji, zavisi od obrazaca ekspresije microRNA i njihovog profilisanja u ćelijama kancera. U tabeli 12, "HCC" predstavlja hepatocelularni karcinom, "ALL" označava akutnu limfoblastnu leukemiju, "RCC" označava karcinom bubrežnih ćelija, "CLL" označava hroničnu limfocitnu leukemiju i "MALT" označava limfoidno tkivo povezano sa sluzokožom. ;;Tabela 12 mirs sekvence, ekspresija u tkivima/ćelijama, i bolesti ;;;1 ;microRNA mir BS SE Tkiva/ćelie Povezana bolest Biološka ; ;;; 14 ; ;;; 1 ;;; 1 microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 1 ; ;;; 1 microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 1 ; ;;; 1 ;;; 11 microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 1 2 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 1 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 1 4 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 1 ; ;;; 1 microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 1 ; ;;; 1 microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 1 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 1 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 2 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka SEQ ID funkcija ID ; ;;; 2 4 ; ;;; 2 microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka SEQ ID funkcija ID ; ;;; 2 ; ;;; 2 ;;; 2 ;;; 2 microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 21 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ; microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ; ;;; 21 microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ; ;;; 21 microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 21 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 21 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 21 ;i i i ;;i ;; ;;; 21 ; ;;; 22 microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ; ; microRNA mir BS SE Tkiva/ćeli e Povezana bolest Biološka ; ;;; 22 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ; microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 22 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 22 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka SEQ ID funkcija ID ; ;;; 22 ; ;;; 22 ;;; 22 microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 1 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 2 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 4 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 24 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ; microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ; microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 24 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ; microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 24 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 24 ; ;;; 24 microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 24 ; ;;; 24 ;;; 2 microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 1 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 2 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 4 ; ;;; 2 microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 1 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 2 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelie Povezana bolest Biološka ; ;;; 24 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 1 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 2 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 4 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 1 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 2 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 4 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 ; ;;; 2 microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 1 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 2 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka SEQ ID funkcija ID ; ;;; 2 4 ; ;;; 2 ;;; 2 microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ; microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 1 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ; microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 4 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ; microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ; microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ; microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ; microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ; microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 1 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 11 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 12 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 1 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 14 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 1 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 1 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 1 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 1 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 1 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 21 ; ;;; 22 microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 24 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 ; ;;; 2 microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ; microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 1 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ; microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 4 ; ; microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ; microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ; microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ; microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ; microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 4 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 41 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 42 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 4 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 44 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 4 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 4 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 4 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 4 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 4 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ; ;;; 1 microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ; microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 4 ; ; microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ; microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ; microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ; microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ; microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ; microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 1 ; ;;; 2 microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ; microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 4 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ; microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ; microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ; microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ; microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ; microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ; microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 1 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 2 ;microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ; microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ;;; 4 ;microRNA mir BS SE Tkiva/ćeli e Povezana bolest Biološka ; ; microRNA mir BS SEQ Tkiva/ćelije Povezana bolest Biološka ; ; ;; [0351] MicroRNA kojima su obogaćeni specifični tipovi imunskih ćelija navedene su u tabeli 13. Osim toga, u stanju tehnike su otkrivene nove miroRNA u imunskim ćelijama putem mikro-erej hibridizacije i mikrotomske analize (Jima DD et al, Blood, 2010, 116:e118-e127; Vaz C et al., BMC Genomics, 2010, 11,288). U tabeli 13, "HCC" označava hepatocelularni karcinom, "ALL" označava akutnu limfoblastnu leukemiju i "CLL" označava hroničnu limfocitnu leukemiju. ;;Tabela 13. microRNA u imunskim ćelijama ;;; ; ; ; ; ;;; 1 ;;; 2 ; ;;; 4 ; ; ; ; microRNA mir BS tkiva/ćelije sa povezane bolesti biološke ; ; microRNA mir BS tkiva/ćelije sa povezane bolesti biološke ; ; ;;; III. Modifikacije ;;[0352] U ovom dokumentu, u nukleotidu, nukleozidu, polinukleotidu (kao što su nukleinske kiseline prema prikazu, npr. modifikovana RNK, modifikovani molekul nukleinske kiseline, modifikovane RNK, nukleinska kiselina i modifikovane nukleinske kiseline), termini "modifikacija" ili, prema potrebi, "modifikovani" odnose se na modifikaciju u pogledu A, G, U ili C ribonukleotida. Uopšteno, ovde, ovi termini nisu namenjeni da se odnose na modifikacije ribonukleotida u prirodnim fragmentima 5'-terminalne kape mRNA. U polipeptidu, termin "modifikacija" se odnosi na modifikaciju u poređenju sa kanonskim skupom od 20 aminokiselina. ;[0353] Modifikacije mogu da budu različite modifikacije. U nekim slučajevima, gde nukleinske kiseline ili modifikovana RNK, kodirajući region, oivičavajući regioni i/ili terminalni regioni mogu da sadrže jednu, dve ili više (opciono različitih) nukleozidnih ili nukleotidnih modifikacija. U nekim slučajevima, modifikovane nukleinske kiseline ili modifikovana RNK koja je uvedena u ćeliju mogu da ispolje smanjenu degradaciju u ćeliji, u poređenju sa nemodifikovanom nukleinskom kiselinom ili modifikovanom RNK. ;;;1 ;[0354] Polinukleotid, primarni konstrukt, nukleinske kiseline ili modifikovana RNK mogu da uključuju bilo koju korisnu modifikaciju, kao što je modifikacija šećera, nukleobaze ili internukleozidne veze (npr. modifikacija povezujućeg fosfata/fosfodiestarske veze/fosfodiestarskog osnovnog lanca). Jedan ili više atoma pirimidinske nukleobaze mogu da budu zamenjeni ili supstituisani sa opciono supstituisanim amino, opciono supstituisanim tiolom, opciono supstituisanim alkilom (npr. metil ili etil) ili halo (npr., hloro ili fluoro). U određenim slučajevima, modifikacije (npr. jedna ili više modifikacija) su prisutne u oba, šećeru i internukleozidnoj vezi. Modifikacije u skladu sa ovim prikazom mogu da budu modifikacije ribonukleinskih kiselina (RNK) u dezoksiribonukleinske kiseline (DNK), npr., supstitucija 2'OH ribofuranizilnog prstena u 2'H, treozne nukleinske kiseline (TNA), glikolne nukleinske kiseline (GNA), peptidne nukleinske kiseline (PNA), zaključane nukleinske kiseline (LNA) ili njihovih hibrida). Dodatne modifikacije su ovde opisane. ;[0355] Kao što je ovde opisano, polinukleotidi, primarni konstrukt, nukleinske kiseline ili modifikovana RNK prema prikazu suštinski ne indukuju urođeni imunski odgovor ćelije u koju su uvedeni polinukleotidi, primarni konstrukti, nukleinske kiseline ili modifikovana RNK (npr. mRNA). Karakteristike indukovanog urođenog imunskog odgovora uključuju 1) povećanu ekspresiju proinflamatornih citokina, 2) aktivaciju intracelularnih PRR (RIG-I, MDA5, itd., i/ili 3) prekid ili smanjenje translacije proteina. ;[0356] U određenim slučajevima, može biti poželjno da se modifikovani molekul nukleinske kiseline uveden u ćeliju razgradi intracelularno. Na primer, degradacija modifikovanog molekula nukleinske kiseline može da bude poželjna ako se želi precizno vreme proizvodnje proteina. Stoga, u nekim slučajevima, prikaz obezbeđuje modifikovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži degradacioni domen, na koji može da se deluje na usmeren način unutar ćelije. U drugom aspektu, ovaj prikaz obezbeđuje polinukleotide, primarne konstrukte, nukleinske kiseline ili modifikovanu RNK koja sadrži nukleozid ili nukleotid koji može da poremeti vezivanje interagujućeg, npr., vezujućeg, partnera glavnog žleba, sa polinukleotidima, primarnim konstruktima, nukleinskim kiselinama ili modifikovanom RNK (npr. gde modifikovani nukleotid ima smanjen afinitet vezivanja za partnera u interakciji sa glavnim žlebom, u poređenju sa nemodifikovanim nukleotidom). ;[0357] Polinukleotidi, primarni konstrukti, nukleinske kiseline ili modifikovana RNK mogu opciono da uključuju druge agense (npr. agense koji indukuju RNAi, RNAi agense, siRNA, shRNA, miRNA, antisens RNK, ribozime, katalitičku DNK, tRNA, RNK koje indukuju formiranje trostrukog heliksa, aptamere, vektore, itd.). U nekim slučajevima, polinukleotidi, primarni konstrukti, nukleinske kiseline ili modifikovana RNK mogu da uključuju jednu ili više ;;;2 ;informacionih RNK (mRNA) koje imaju jedan ili više modifikovanih nukleozida ili nukleotida (tj. modifikovanih molekula mRNA). Slede detalji za ove nukleinske kiseline ili modifikovanu RNK. ;Modifikovani molekuli mRNA ;;[0358] Polinukleotidi, primarni konstrukti, nukleinske kiseline ili modifikovana RNK prema prikazu uključuje prvi region vezanih nukleozida koji kodira polipeptid od interesa, prvi oivičavajući region smešten na 5' kraju prvog regiona, i drugi oivičavajući region smešten na 3' kraju prvog regiona. Prvi region vezanih nukleozida može da bude region koji može da se translatira. ;[0359] U nekim slučajevima, polinukleotid, primarni konstrukt, ili mmRNA (npr., prvi region, prvi oivičavajući region, ili drugi oivičavajući region) uključuje broj n vezanih nukleozida koji imaju bilo koju bazu, šećer, osnovni lanac, gradivni blok ili drugu strukturu ili formulu, uključujući, ali bez ograničenja one sa formulama I do IX ili bilo koje njihove podstrukture opisane u međunarodnoj prijavi PCT/US12/58519 podnetoj 3. oktobra 2012, (oznaka akta kod patentnog punomoćnika: M009.20). Takve strukture uključuju modifikacije šećera, nukleobaze, internukleozidne veze, ili njihovih kombinacija. ;[0360] Kombinacije hemijskih modifikacija uključuju, ali bez ograničenja, one opisane u međunarodnoj prijavi PCT/US12/58519 podnetoj 3. oktobra 2012, (oznaka akta kod patentnog punomoćnika: M009.20). ;[0361] Sinteza polinukleotida, primarnih konstrukata ili mmRNA predmetnog prikaza može da bude u skladu sa postupcima opisanim u međunarodnoj prijavi PCT/US12/58519 podnetoj 3. oktobra 2012, (oznaka akta kod patentnog punomoćnika: M009.20). ;[0362] U nekim slučajevima, nukleobaza je odabrana iz grupe koja se sastoji od citozina, guanina, adenina i uracila. ;[0363] U nekim slučajevima, modifikovana nukleobaza je modifikovani uracil. Ilustrativne nukleobaze i nukleozidi koji imaju modifikovani uracil uključuju pseudouridin (ψ), piridin-4-on ribonukleozid, 5-aza-uridin, 6-aza-uridin, 2-tio-5-aza-uridin, 2-tiouridin (s<2>U), 4-tio-uridin (s<4>U), 4-tio-pseudouridin, 2-tio-pseudouridin, 5-hidroksiuridin (ho<5>U), 5-aminoalil-uridin, 5-halo-uridin (npr., 5-jodo-uridin ili 5-bromo-uridin), 3-metiluridin (m<3>U), 5-metoksi-uridin (mo<5>U), uridin 5-oksisirćetnu kiselinu (cmo<5>U), metil estar uridin 5-oksisirćetne kiseline (mcmo<5>U), 5-karboksimetil-uridin (cm<5>U), 1-karboksimetil-pseudouridin, 5-karboksihidroksimetil-uridin (chm<5>U), metil estar 5-karboksihidroksimetil-uridina (mchm<5>U), 5-metoksikarbonilmetil-uridin (mcm<5>U), 5-metoksikarbonilmetil-2-tio-uridin (mcm<5>s<2>U), 5-aminometil-2-tio-uridin (nm<5>s<2>U), 5-metilaminometil-uridin (mnm<5>U), 5-metilaminometil-2-tio-uridin (mnm<5>s<2>U), 5-metilaminometil-2-seleno-uridin (mnm<5>se<2>U), 5-karbamoilmetil-uridin (ncm<5>U), 5-karboksimetilaminometil-uridin (cmnm<5>U), 5-karboksimetilaminometil-2-tio-uridin (cmnm<5>s<2>U), 5-propinil-uridin, 1-propinil-pseudouridin, 5-taurinometiluridin (τm<5>U), 1-taurinometilpseudouridin, 5-taurinometil-2-tio-uridin (τm<5>s<2>U), 1-taurinometil-4-tio-pseudouridin, 5-metiluridin (m<5>U, tj., koji ima nukleobazu dezoksitimin), 1-metil-pseudouridin (m<1>ψ), 5-metil-2-tiouridin (m<5>s<2>U), 1-metil-4-tio-pseudouridin (m<1>s<4>ψ), 4-tio-1-metil-pseudouridin, 3-metilpseudouridin (m<3>ψ), 2-tio-1-metil-pseudouridin, 1-metil-1-deaza-pseudouridin, 2-tio-1-metil-1-deaza-pseudouridin, dihidrouridin (D), dihidropseudouridin, 5,6-dihidrouridin, 5-metildihidrouridin (m<5>D), 2-tio-dihidrouridin, 2-tio-dihidropseudouridin, 2-metoksiuridin, 2-metoksi-4-tio-uridin, 4-metoksi-pseudouridin, 4-metoksi-2-tio-pseudouridin, N1-metil-pseudouridin, 3-(3-amino-3-karboksipropil)uridin (acp<3>U), 1-metil-3-(3-amino-3-karboksipropil)pseudouridin (acp<3>ψ), 5-(izopentenilaminometil)uridin (inm<5>U), 5-(izopentenilaminometil)-2-tio-uridin (inm<5>s<2>U), α-tio-uridin, 2'-O-metil-uridin (Um), 5,2'-O-dimetil-uridin (m<5>Um), 2'-O-metilpseudouridin (ψm), 2-tio-2'-O-metil-uridin (s<2>Um), 5-metoksikarbonilmetil-2'-O-metil-uridin (mcm<5>Um), 5-karbamoilmetil-2'-O-metil-uridin (ncm<5>Um), 5-karboksimetilaminometil-2'-O-metil-uridin (cmnm<5>Um), 3,2'-O-dimetil-uridin (m<3>Um), i 5-(izopentenilaminometil)-2'-O-metiluridin (inm<5>Um), 1-tio-uridin, dezoksitimidin, 2'-F-ara-uridin, 2'-F-uridin, 2'-OH-ara-uridin, 5-(2-karbometoksivinil) uridin, i 5-[3-(1-E-propenilamino)uridin. ;[0364] U nekim slučajevima, modifikovana nukleobaza je modifikovani citozin. Ilustrativne nukleobaze i nukleozidi koji imaju modifikovani citozin uključuju 5-aza-citidin, 6-aza-citidin, pseudoizocitidin, 3-metil-citidin (m<3>C), N4-acetil-citidin (ac<4>C), 5-formilcitidin (f<5>C), N4-metilcitidin (m<4>C), 5-metil-citidin (m<5>C), 5-halo-citidin (npr., 5-jodo-citidin), 5-hidroksimetilcitidin (hm<5>C), 1-metil-pseudoizocitidin, pirolo-citidin, pirolo-pseudoizocitidin, 2-tio-citidin (s<2>C), 2-tio-5-metil-citidin, 4-tio-pseudoizocitidin, 4-tio-1-metil-pseudoizocitidin, 4-tio-1-metil-1-deaza-pseudoizocitidin, 1-metil-1-deaza-pseudoizocitidin, zebularin, 5-azazebularin, 5-metil-zebularin, 5-aza-2-tio-zebularin, 2-tio-zebularin, 2-metoksi-citidin, 2-metoksi-5-metil-citidin, 4-metoksi-pseudoizocitidin, 4-metoksi-1-metil-pseudoizocitidin, lizidin (k2C), αtio-citidin, 2'-O-metil-citidin (Cm), 5,2'-O-dimetil-citidin (m<5>Cm), N4-acetil-2'-O-metil-citidin (ac<4>Cm), N4,2'-O-dimetil-citidin (m<4>Cm), 5-formil-2'-O-metil-citidin (f<5>Cm), N4,N4,2'-O-trimetil-citidin (m<4>2Cm), 1-tio-citidin, 2'-F-ara-citidin, 2'-F-citidin, i 2'-OH-ara-citidin. ;[0365] U nekim slučajevima, modifikovana nukleobaza je modifikovani adenin. Ilustrativne nukleobaze i nukleozidi koji imaju modifikovani adenin uključuju 2-aminopurin, 2, 6-diaminopurin, 2-amino-6-halo-purin (npr., 2-amino-6-hloro-purin), 6-halo-purin (npr., 6-hloro- ;;;4 ;purin), 2-amino-6-metil-purin, 8-azido-adenozin, 7-deaza-adenin, 7-deaza-8-aza-adenin, 7-deaza-2-amino-purin, 7-deaza-8-aza-2-amino-purin, 7-deaza-2,6-diaminopurin, 7-deaza-8-aza-2,6-diaminopurin, 1-metiladenozin (m<1>A), 2-metil-adenin (m<2>A), N6-metiladenozin (m<6>A), 2-metiltio-N6-metil-adenozin (ms<2>m<6>A), N6-izopenteniladenozin (i<6>A), 2-metiltio-N6-izopenteniladenozin (ms<2>i<6>A), N6-(cis-hidroksiizopentenil)adenozin (io<6>A), 2-metiltio-N6-(cishidroksiizopentenil)adenozin (ms<2>io<6>A), N6-glicinilkarbamoiladenozin (g<6>A), N6-treonilkarbamoiladenozin (t<6>A), N6-metil-N6-treonilkarbamoil-adenozin (m<6>t<6>A), 2-metiltio-N6-treonil karbamoiladenozin (ms<2>g<6>A), N6,N6-dimetil-adenozin (m<6>2A), N6-hidroksinorvalilkarbamoil-adenozin (hn<6>A), 2-metiltio-N6-hidroksinorvalilkarbamoil-adenozin (ms<2>hn<6>A), N6-acetil-adenozin (ac<6>A), 7-metiladenin, 2-metiltio-adenin, 2-metoksi-adenin, α-tioadenozin, 2'-O-metil-adenozin (Am), N6,2'-O-dimetil-adenozin (m<6>Am), N6,N6,2'-O-trimetiladenozin (m<6>2Am), 1,2'-O-dimetil-adenozin (m<1>Am), 2'-O-riboziladenozin (fosfat) (Ar(p)), 2-amino-N6-metil-purin, 1-tio-adenozin, 8-azido-adenozin, 2'-F-ara-adenozin, 2'-F-adenozin, 2'-OH-ara-adenozin, i N6-(19-amino-pentaoksanonadecil)-adenozin. ;[0366] U nekim slučajevima, modifikovana nukleobaza je modifikovani guanin. Ilustrativne nukleobaze i nukleozidi koji imaju modifikovani guanin uključuju inozin (I), 1-metil-inozin (m<1>l), viozin (imG), metilviozin (mimG), 4-demetil-viozin (imG-14), izoviozin (imG2), vibutozin (yW), peroksivibutozin (o2yW), hidroksivibutozin (OHyW), nedovoljno modifikovani hidroksivibutozin (OHyW*), 7-deaza-guanozin, kjuozin (Q), epoksikjuozin (oQ), galaktozil-kjuozin (galQ), manozil-kjuozin (manQ), 7-cijano-7-deaza-guanozin (preQ0), 7-aminometil-7-deaza-guanozin (preQ1), arhaozin (G+), 7-deaza-8-aza-guanozin, 6-tio-guanozin, 6-tio-7-deaza-guanozin, 6-tio-7-deaza-8-aza-guanozin, 7-metilguanozin (m<7>G), 6-tio-7-metil-guanozin, 7-metil-inozin, 6-metoksiguanozin, 1-metilguanozin (m<1>G), N2-metil-guanozin (m<2>G), N2,N2-dimetil-guanozin (m<2>2G), N2,7-dimetil-guanozin (m<2,7>G), N2, N2,7-dimetil-guanozin (m<2,2,7>G), 8-okso-guanozin, 7-metil-8-okso-guanozin, 1-metil-6-tio-guanozin, N2-metil-6-tio-guanozin, N2,N2-dimetil-6-tioguanozin, α-tio-guanozin, 2'-O-metil-guanozin (Gm), N2-metil-2'-O-metil-guanozin (m<2>Gm), N2,N2-dimetil-2'-O-metil-guanozin (m<2>2Gm), 1-metil-2'-O-metil-guanozin (m<1>Gm), N2,7-dimetil-2'-O-metil-guanozin (m<2,7>Gm), 2'-O-metil-inozin (Im), 1,2'-O-dimetil-inozin (m<1>Im), 2'-O-ribozilguanozin (fosfat) (Gr(p)), 1-tio-guanozin, O6-metil-guanozin, 2'-F-ara-guanozin, i 2'-F-guanozin.

[0367] Fosforotioatna DNK i RNK imaju povećanu otpornost na nukleazu i posledično duži poluživot u ćelijskom okruženju. Takođe se očekuje da nukleinske kiseline vezane za fosforotioat redukuju urođeni imunski odgovor putem slabijeg vezivanja/aktivacije ćelijskih urođenih imunskih molekula.

[0368] Nukleobaza nukleotida može nezavisno da bude odabrana od purina, pirimidina, analoga purina ili pirimidina. Na primer, svaka nukleobaza može nezavisno da bude odabrana od adenina, citozina, guanina, uracila, ili hipoksantina. U drugom slučaju, nukleobaza može takođe da uključuje, na primer, prirodne i sintetičke derivate baze, uključujući pirazolo[3,4-d]pirimidine, 5-metilcitozin (5-me-C), 5-hidroksimetil citozin, ksantin, hipoksantin, 2-aminoadenin, 6-metil i druge alkil derivate adenina i guanina, 2-propil i druge alkil derivate adenina i guanina, 2-tiouracil, 2-tiotimin i 2-tiocitozin, 5-propinil uracil i citozin, 6-azo uracil, citozin i timin, 5-uracil (pseudouracil), 4-tiouracil, 8-halo (npr., 8-bromo), 8-amino, 8-tiol, 8-tioalkil, 8-hidroksil i druge 8-supstituisane adenine i guanine, 5-halo, posebno 5-bromo, 5-trifluorometil i druge 5-supstituisane uracile i citozine, 7-metilguanin i 7-metiladenin, 8-azaguanin i 8-azaadenin, deazaguanin, 7-deazaguanin, 3-deazaguanin, deazaadenin, 7-deazaadenin, 3-deazaadenin, pirazolo[3,4-d]pirimidin, imidazo[1,5-a]1,3,5 triazinone, 9-deazapurine, imidazo[4,5-d]pirazine, tiazolo[4,5-d]pirimidine, pirazin-2-one, 1,2,4-triazin, piridazin; i 1,3,5 triazin. Kada su nukleotidi prikazani upotrebom skraćenica A, G, C, T ili U, svako slovo se odnosi na reprezentativnu bazu i/ili njene derivate, npr., A uključuje adenin ili analoge adenina, npr., 7-deaza adenin).

Modifikacije internukleozidne veze

[0369] Modifikovani nukleotidi, koji mogu da budu ugrađeni u nukleinsku kiselinu ili modifikovani molekul RNK, mogu da budu modifikovani na internukleozidnoj vezi (npr., fosfatni osnovni lanac). Ovde, u kontekstu polinukleotida, primarnih konstrukata, nukleinskih kiselina ili osnovnog lanca modifikovane RNK, izrazi "fosfat" i "fosfodiestar" se koriste kao sinonimi. Fosfatne grupe osnovnog lanca mogu da budu modifikovane zamenom jednog ili više atoma kiseonika drugačijim supstituentom. Dalje, modifikovani nukleozidi i nukleotidi mogu da uključuju sveobuhvatnu zamenu nemodifikovanog fosfatnog fragmenta drugom internukleozidnom vezom, kao što je ovde opisano. Primeri modifikovanih fosfatnih grupa uključuju, ali nisu ograničeni na, fosforotioat, fosforoselenate, boranofosfate, boranofosfatne estre, hidrogen fosfonate, fosforamidate, fosforodiamidate, alkil ili aril fosfonate, i fosfotriestre. Fosforoditioati imaju oba nevezujuća kiseonika zamenjena sumporom. Fosfatni linker može takođe da bude modifikovan zamenom vezujućeg kiseonika azotom (premošćeni fosforamidati), sumporom (premošćeni fosforotioati), i ugljenikom (premošćeni metilen-fosfonati).

[0370] Fosfatni fragment supstituisan sa α-tio obezbeđen je da bi doprineo stabilnosti polimera RNK i DNK kroz neprirodne fosforotioatne veze osnovnog lanca. Fosforotioatna DNK i RNK imaju povećanu otpornost na nukleazu i posledično duži poluživot u ćelijskom okruženju. Bez želje za vezivanjem za neku određenu teoriju, takođe se očekuje da fosforotioatno vezani polinukleotidi, primarni konstrukti, nukleinske kiseline ili modifikovani molekuli RNK redukuju urođeni imunski odgovor putem slabijeg vezivanja/aktivacije ćelijskih urođenih imunskih molekula.

[0371] U specifičnim slučajevima, modifikovani nukleozid uključuje alfa-tio-nukleozid (npr., 5'-O-(1-tiofosfat)-adenozin, 5'-O-(1-tiofosfat)-citidin (α-tio-citidin), 5'-O-(1-tiofosfat)-guanozin, 5'-O-(1-tiofosfat)-uridin, ili 5'-O-(1-tiofosfat)-pseudouridin).

[0372] Ostale internukleozidne veze koje mogu da se upotrebe prema predmetnom prikazu, uključujući internukleozidne veze koje ne sadrže atom fosfora, opisane su u nastavku teksta.

Kombinacije modifikovanih šećera, nukleobaza, i internukleozidnih veza

[0373] Nukleinske kiseline ili modifikovana RNK prema prikazu mogu da uključuju kombinaciju modifikacija šećera, nukleobaze, i/ili internukleozidne veze. Ove kombinacije mogu da uključuju bilo koju ili više ovde opisanih modifikacija. Na primer, bilo koji od ovde opisanih nukleotida u formulama (Ia), (Ia-1)-(Ia-3), (Ib)-(If), (IIa)-(IIp), (IIb-1), (IIb-2), (IIc-1)-(IIc-2), (IIn-1), (IIn-2), (IVa)-(IVI), i (IXa)-(IXr) može da se kombinuje sa bilo kojom od ovde opisanih nukleobaza (npr., u formulama (b1)-(b43) ili bilo kojom drugom ovde opisanom).

Sinteza nukleinskih kiselina ili modifikovanih molekula RNK (modifikovane RNK)

[0374] Nukleinske kiseline za upotrebu u skladu sa prikazom mogu da se pripreme bilo kojom korisnom tehnikom koja je ovde opisana ili bilo kojom dostupnom tehnikom uključujući, ali bez ograničenja, hemijsku sintezu, enzimsku sintezu, uopšteno označenu kao in vitro transkripcija, enzimskim ili hemijskim cepanjem dužeg prekursora, itd. Postupci sinteze RNK su poznati u stanju tehnike (videti, npr., Gait, M.J. (ed.) Oligonucleotide synthesis: a practical approach, Oxford [Oxfordshire], Washington, DC: IRL Press, 1984; i Herdewijn, P. (ed.) Oligonucleotide synthesis: methods and applications, Methods in Molecular Biology, v.288 (Clifton, N.J.) Totowa, N.J.: Humana Press, 2005).

[0375] Modifikovani nukleozidi i nukleotidi koji se koriste u sintezi modifikovane RNK koji su ovde opisani mogu da se pripreme iz lako dostupnih polaznih materijala upotrebom sledećih opštih postupaka i procedura. Podrazumeva se da kada su dati uobičajeni ili poželjni procesni uslovi (tj., reakcione temperature, vremena, molski odnosi reaktanata, rastvarači, pritisci, itd.); mogu da se koriste i drugi procesni uslovi, osim ako nije drugačije naznačeno. Optimalni reakcioni uslovi mogu da variraju sa konkretnim upotrebljenim reaktantima ili rastvaračem, ali takve uslove stručnjak u ovoj oblasti može da odredi rutinskim procedurama optimizacije.

[0376] Ovde opisani postupci mogu da se prate bilo kojom pogodnom metodom poznatom u stanju tehnike. Na primer, formiranje proizvoda može da se prati spektroskopski, na primer nuklearnom magnetnom rezonantnom spektroskopijom (npr.,<1>H ili<13>C), infracrvenom spektroskopijom, spektrofotometrijom (npr., u UV-vidljivom spektru), ili masenom spektrometrijom, ili hromatografijom, kao što je tečna hromatografija visokih performansi (HPLC) ili tankoslojna hromatografija.

[0377] Priprema modifikovanih nukleozida i nukleotida koji se koriste u proizvodnji ili sintezi modifikovanih RNK predmetnog pronalaska može da uključuje dodavanje i uklanjanje zaštitnih grupa na različite hemijske grupe. Stručnjak u ovoj oblasti može lako da utvrdi postojanje potrebe za dodavanjem i uklanjanjem zaštitnih grupa, i izbor odgovarajućih zaštitnih grupa.

[0378] Hemija zaštitnih grupa može da se nađe, na primer, u Greene, et al., Protective Groups in Organic Synthesis, 2d. Ed., Wiley & Sons, 1991.

[0379] Reakcije ovde opisanih postupaka mogu da se izvedu u pogodnim rastvaračima, koje stručnjak u oblasti organske sinteze može lako da odabere. Pogodni rastvarači mogu da budu suštinski nereaktivni sa polaznim materijalima (reaktantima), intermedijerima, ili proizvodima na temperaturama na kojima se izvode reakcije, tj., temperaturama koje mogu da variraju od temperature zamrzavanja rastvarača do temperature ključanja rastvarača. Data reakcija može da bude izvedena u rastvaraču ili smeši više od jednog rastvarača. U zavisnosti od konkretnog koraka reakcije, mogu da budu odabrani pogodni rastvarači za taj konkretan korak reakcije.

[0380] Razdvajanje racemskih smeša modifikovanih nukleozida i nukleotida može da se izvede bilo kojom od brojnih metoda poznatih u stanju tehnike. Primer metode uključuje frakcionu rekristalizaciju upotrebom "kiseline za hiralno razdvajanje" koja je optički aktivna, organska kiselina koja formira so. Pogodni agensi za razdvajanje za metode frakcione rekristalizacije su, na primer, optički aktivne kiseline, kao što su D i L oblici vinske kiseline, diacetil vinske kiseline, dibenzoil vinske kiseline, bademove kiseline, jabučne kiseline, mlečne kiseline ili različitih optički aktivnih kamforsulfonskih kiselina. Razdvajanje racemskih smeša takođe može da se izvede eluiranjem sa kolone pakovane sa optički aktivnim agensom za razdvajanje (npr., dinitrobenzoilfenilglicin). Stručnjak u ovoj oblasti može da odredi pogodan sastav rastvarača za eluiranje.

[0381] Modifikovani nukleozidi i nukleotidi (npr., molekuli gradivnog bloka) mogu da se pripreme sintetičkim postupcima opisanim u Ogata et al., J. Org. Chem. 74:2585-2588 (2009); Purmal et al., Nucl. Acids Res.22(1): 72-78, (1994); Fukuhara et al., Biochemistry, 1(4): 563-568 (1962); i Xu et al., Tetrahedron, 48(9): 1729-1740 (1992).

[0382] Modifikovani nukleozidi i nukleotidi (npr., molekuli gradivnog bloka) mogu da se pripreme sintetičkim postupcima opisanim u Ogata et al., J. Org. Chem. 74:2585-2588 (2009); Purmal et al., Nucl. Acids Res.22(1): 72-78, (1994); Fukuhara et al., Biochemistry, 1(4): 563-568 (1962); i Xu et al., Tetrahedron, 48(9): 1729-1740 (1992).

[0383] Modifikovane nukleinske kiseline prema prikazu mogu, ali ne moraju da budu uniformno modifikovane celom dužinom molekula. Različite nukleotidne modifikacije i/ili strukture osnovnog lanca mogu da postoje na različitim pozicijama u nukleinskoj kiselini. Stručnjak u ovoj oblasti će znati da nukleotidni analozi ili jedna ili više drugih modifikacija mogu da se nalaze na bilo kojoj/kojim pozicijama nukleinske kiseline tako da funkcija nukleinske kiseline nije suštinski smanjena. Modifikacija može da bude i 5' ili 3' terminalna modifikacija. Nukleinske kiseline mogu da sadrže najmanje jedan i najviše 100% modifikovanih nukleotida, ili bilo koji procenat između ovih vrednosti, kao što je najmanje 50% modifikovanih nukleotida, najmanje 80% modifikovanih nukleotida, ili najmanje 90% modifikovanih nukleotida. Na primer, jedan ili više ili svi tipovi nukleotida (npr., purin ili pirimidin, ili bilo koji ili više ili svi A, G, U, C) mogu, ali ne moraju da budu uniformno modifikovani u nukleinskim kiselinama ili modifikovanoj RNK prema prikazu, ili u datom unapred određenom regionu njene sekvence. U nekim slučajevima, svi nukleotidi X u nukleinskim kiselinama ili modifikovanoj RNK prema prikazu (ili u datom regionu njene sekvence) su modifikovani, pri čemu X može da bude bilo koji od nukleotida A, G, U, C, ili bilo koja od kombinacija A+G, A+U, A+C, G+U, G+C, U+C, A+G+U, A+G+C, G+U+C ili A+G+C.

[0384] Različite modifikacije šećera, nukleotidne modifikacije, i/ili internukleozidne veze (npr., strukture osnovnog lanca) mogu da se javljaju na različitim pozicijama u nukleinskim kiselinama ili modifikovanoj RNK. Stručnjak u ovoj oblasti će znati da nukleotidni analozi ili jedna ili više drugih modifikacija mogu da se nalaze nabilo kojoj poziciji/pozicijama nukleinske kiseline ili modifikovane RNK, tako da funkcija nukleinskih kiselina ili modifikovane RNK nije suštinski smanjena. Modifikacija može da bude i 5' ili 3' terminalna modifikacija. Nukleinske kiseline ili modifikovana RNK mogu da sadrže od oko 1% do oko 100% modifikovanih nukleotida (bilo u odnosu na ukupan sadržaj nukleotida, ili u odnosu na jedan ili više tipova nukleotida, tj. bilo koji ili više A, G, U ili C) ili bilo koji obuhvaćeni procenat (npr., od 1% do 20%, od 1% do 25%, od 1% do 50%, od 1% do 60%, od 1% do 70%, od 1% do 80%, od 1% do 90%, od 1% do 95%, od 10% do 20%, od 10% do 25%, od 10% do 50%, od 10% do 60%, od 10% do 70%, od 10% do 80%, od 10% do 90%, od 10% do 95%, od 10% do 100%, od 20% do 25%, od 20% do 50%, od 20% do 60%, od 20% do 70%, od 20% do 80%, od 20% do 90%, od 20% do 95%, od 20% do 100%, od 50% do 60%, od 50% do 70%, od 50% do 80%, od 50% do 90%, od 50% do 95%, od 50% do 100%, od 70% do 80%, od 70% do 90%, od 70% do 95%, od 70% do 100%, od 80% do 90%, od 80% do 95%, od 80% do 100%, od 90% do 95%, od 90% do 100%, i od 95% do 100%).

[0385] U nekim slučajevima, nukleinske kiseline ili modifikovana RNK uključuju modifikovani pirimidin (npr., modifikovani uracil/uridin/U ili modifikovani citozin/citidin/C). U nekim slučajevima, uracil ili uridin (uopšteno: U) u nukleinskim kiselinama ili modifikovanom molekulu RNK može da bude zamenjen sa od oko 1% do oko 100% modifikovanog uracila ili modifikovanog uridina (npr., od 1% do 20%, od 1% do 25%, od 1% do 50%, od 1% do 60%, od 1% do 70%, od 1% do 80%, od 1% do 90%, od 1% do 95%, od 10% do 20%, od 10% do 25%, od 10% do 50%, od 10% do 60%, od 10% do 70%, od 10% do 80%, od 10% do 90%, od 10% do 95%, od 10% do 100%, od 20% do 25%, od 20% do 50%, od 20% do 60%, od 20% do 70%, od 20% do 80%, od 20% do 90%, od 20% do 95%, od 20% do 100%, od 50% do 60%, od 50% do 70%, od 50% do 80%, od 50% do 90%, od 50% do 95%, od 50% do 100%, od 70% do 80%, od 70% do 90%, od 70% do 95%, od 70% do 100%, od 80% do 90%, od 80% do 95%, od 80% do 100%, od 90% do 95%, od 90% do 100%, i od 95% do 100% modifikovanog uracila ili modifikovanog uridina). Modifikovani uracil ili uridin može da bude zamenjen jedinjenjem koje ima jednu jedinstvenu strukturu ili mnoštvom jedinjenja koja imaju različite strukture (npr., 2, 3, 4 ili više jedinstvenih struktura, kao što je ovde opisano). U nekim slučajevima, citozin ili citidin (uopšteno: C) u nukleinskoj kiselini ili modifikovanom molekulu RNK može da bude zamenjen sa od oko 1% do oko 100% modifikovanog citozina ili modifikovanog citidina (npr., od 1% do 20%, od 1% do 25%, od 1% do 50%, od 1% do 60%, od 1% do 70%, od 1% do 80%, od 1% do 90%, od 1% do 95%, od 10% do 20%, od 10% do 25%, od 10% do 50%, od 10% do 60%, od 10% do 70%, od 10% do 80%, od 10% do 90%, od 10% do 95%, od 10% do 100%, od 20% do 25%, od 20% do 50%, od 20% do 60%, od 20% do 70%, od 20% do 80%, od 20% do 90%, od 20% do 95%, od 20% do 100%, od 50% do 60%, od 50% do 70%, od 50% do 80%, od 50% do 90%, od 50% do 95%, od 50% do 100%, od 70% do 80%, od 70% do 90%, od 70% do 95%, od 70% do 100%, od 80% do 90%, od 80% do 95%, od 80% do 100%, od 90% do 95%, od 90% do 100%, i od 95% do 100% modifikovanog citozina ili modifikovanog citidina). Modifikovani citozin ili citidin može da bude zamenjen jedinjenjem koje ima jednu jedinstvenu strukturu ili mnoštvom jedinjenja koja imaju različite strukture (npr., 2, 3, 4 ili više jedinstvenih struktura, kao što je ovde opisano).

[0386] Druge komponente nukleinske kiseline su opcione, i korisne u nekim slučajevima. Na primer, obezbeđeni su 5' netranslatirani region (UTR) i/ili 3'UTR, pri čemu bilo koji ili oba mogu nezavisno da sadrže jednu ili više različitih nukleotidnih modifikacija. U takvim slučajevima,

4

nukleotidne modifikacije mogu da budu prisutne i u regionu koji može da se translatira. Obezbeđene su i nukleinske kiseline koje sadrže Kozak sekvencu koja može da uključuje IRES sekvencu ili da ne uključuje IRES sekvencu (videti npr., polinukleotide opisane u tabeli 30 u primeru 31).

[0387] Dodatno, obezbeđene su nukleinske kiseline koje sadrže jednu ili više intronskih nukleotidnih sekvenci koje mogu da budu isečene iz nukleinske kiseline.

Kombinacije nukleotida

[0388] Sledeći primeri modifikovanih nukleotida i kombinacija modifikovanih nukleotida su dati ispod u tabeli 14. Ove kombinacije modifikovanih nukleotida mogu da se koriste za formiranje nukleinskih kiselina ili modifikovane RNK prema prikazu. Osim ako nije drugačije navedeno, prirodni nukleotidi nukleinskih kiselina ili modifikovane RNK prema prikazu mogu potpuno da budu supstituisani modifikovanim nukleotidima. Kao neograničavajući primer, prirodni nukleotid uridin može da bude supstituisan ovde opisanim modifikovanim nukleozidom. U drugom neograničavajućem primeru, prirodni nukleotid uridin može da bude delimično supstituisan (npr., oko 0.1%, 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 99.9%) najmanje jednim ovde opisanim modifikovanim nukleozidom.

Tabela 14. Hemijske modifikacije

4 1

42

4

[0389] Pronalazači ovog pronalaska su istraživali određene modifikovane nukleotide i kombinacije nukleotida. Ti nalazi su opisani u SAD patentnoj prijavi br.13/251,840, podnetoj 3. oktobra 2011, pod nazivom Modified Nucleotides, and Nucleic Acids, and Uses Thereof, sada napuštenoj, SAD patentnoj prijavi br 13/481,127, podnetoj 25. maja 2012, pod nazivom Modified Nucleotides, and Nucleic Acids, and Uses Thereof, međunarodnoj patentnoj objavi br. WO2012045075, podnetoj 3. oktobra 2011, pod nazivom Modified Nucleosides, Nucleotides, And Nucleic Acids, and Uses Thereof, SAD patentnoj objavi br. US20120237975 podnetoj 3. oktobra 2011, pod nazivom Engineered Nucleic Acids and Method of Use Thereof, i međunarodnoj patentnoj objavi br. WO2012045082.

[0390] Sledeći primeri kombinacija modifikovanih nukleotida dati su ispod u tabeli 15. Ove kombinacije modifikovanih nukleotida mogu da se upotrebe za formiranje nukleinskih kiselina prema prikazu.

Tabela 15. Hemijske modifikacije

4 4

[0391] U nekim slučajevima, najmanje 25% citozina je zamenjeno jedinjenjem formule (b10)-(b14), (b24), (b25), ili (b32)-(b35) (npr., najmanje oko 30%, najmanje oko 35%, najmanje oko 40%, najmanje oko 45%, najmanje oko 50%, najmanje oko 55%, najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, ili oko 100%, npr., jedinjenjem formule (b10) ili (b32)).

[0392] U nekim slučajevima, najmanje 25% uracila je zamenjeno jedinjenjem formule (b1)-(b9), (b21)-(b23), ili (b28)-(b31) (npr., najmanje oko 30%, najmanje oko 35%, najmanje oko 40%, najmanje oko 45%, najmanje oko 50%, najmanje oko 55%, najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, ili oko 100%, npr., jedinjenjem formule (b1), (b8), (b28), (b29), ili (b30)).

[0393] U nekim slučajevima, najmanje 25% citozina je zamenjeno jedinjenjem formule (b10)-(b14), (b24), (b25), ili (b32)-(b35) (npr. formula (b10) ili (b32)), i najmanje 25% uracila je zamenjeno jedinjenjem formule (b1)-(b9), (b21)-(b23), ili (b28)-(b31) (npr. formula (b1), (b8), (b28), (b29), ili (b30)) (npr., najmanje oko 30%, najmanje oko 35%, najmanje oko 40%, najmanje oko 45%, najmanje oko 50%, najmanje oko 55%, najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje

4

oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, ili oko 100%).

Modifikacije koje uključuju linker i opterećenje lekom

Opterećenje lekom

[0394] Ovde opisani postupci i kompozicije korisni su za isporuku opterećenja lekom do biološkog cilja. Opterećenje lekom može da se koristi, npr., za obeležavanje (npr., detektabilni agens kao što je fluorofor), ili u terapeutske svrhe (npr., citotoksin ili drugi terapeutski agens).

Opterećenje lekom: Terapeutski agensi

[0395] U nekim slučajevima opterećenje lekom je terapeutski agens kao što je citotoksin, radioaktivni jon, hemoterapeutik, ili drugi terapeutski agens. Citotoksin ili citotoksični agens uključuje bilo koji agens koji je štetan za ćelije. Primeri uključuju taksol, citohalazin B, gramicidin D, etidijum bromid, emetin, mitomicin, etopozid, tenopozid, vinkristin, vinblastin, kolhicin, doksorubicin, daunorubicin, dihidroksi antracin dion, mitoksantron, mitramicin, aktinomicin D, 1-dehidrotestosteron, glukokortikoide, prokain, tetrakain, lidokain, propranolol, puromicin, majtanzinoide, npr., majtanzinol (videti SAD pat. br. 5,208,020), CC-1065 (videti SAD pat. br.

5,475,092, 5,585,499, 5,846,545) i njihove analoge ili homologe. Radioaktivni joni uključuju, ali nisu ograničeni na jod (npr., jod 125 ili jod 131), stroncijum 89, fosfor, paladijum, cezijum, iridijum, fosfat, kobalt, itrijum 90, Samarijum 153 i prazeodimijum. Drugi terapeutski agensi uključuju, ali nisu ograničeni na, antimetabolite (npr., metotreksat, 6-merkaptopurin, 6-tioguanin, citarabin, 5-fluorouracil dekarbazin), alkilujuće agense (npr., mehloretamin, tiotepa, hlorambucil, CC-1065, melfalan, karmustin (BSNU) i lomustin (CCNU), ciklofosfamid, busulfan, dibromomanitol, streptozotocin, mitomicin C, i cis-dihlorodiamin platina (II) (DDP) cisplatin), antracikline (npr., daunorubicin (ranije daunomicin) i doksorubicin), antibiotike (npr., daktinomicin (ranije aktinomicin), bleomicin, mitramicin, i antramicin (AMC)), i anti-mitotičke agense (npr., vinkristin, vinblastin, taksol i majtanzinoidi).

Opterećenje lekom: Detektabilni agensi

[0396] Primeri detektabilnih supstanci uključuju različita organska jedinjenja malih molekula, neorganska jedinjenja, nanočestice, enzime ili enzimske supstrate, fluorescentne materijale, luminiscentne materijale, bioluminiscentne materijale, hemiluminiscentne materijale, radioaktivne materijale, i kontrastne agense. Takve optički-detektabilne oznake uključuju na primer, bez

4

ograničenja, 4-acetamido-4'-izotiocijanatostilben-2,2'disulfonsku kiselinu; akridin i derivate: akridin, akridin izotiocijanat; 5-(2'-aminoetil)aminonaftalen-1-sulfonsku kiselinu (EDANS); 4-amino-N-[3-vinilsulfonil)fenil]naftalimid-3,5 disulfonat; N-(4-anilino-1-naftil)maleimid; antranilamid; BODIPY; briljantno žutu; kumarin i derivate; kumarin, 7-amino-4-metilkumarin (AMC, Kumarin 120), 7-amino-4-trifluorometilkumarin (Kumarin 151); cijaninske boje; cijanozin; 4',6-diaminidino-2-fenilindol (DAPI); 5'5"-dibromopirogalol-sulfonaftalein (bromopirogalol crveno); 7-dietilamino-3-(4'-izotiocijanatofenil)-4-metilkumarin; dietilentriamin pentaacetat; 4,4'-diizotiocijanatodihidro-stilben-2,2'-disulfonsku kiselinu; 4,4'-diizotiocijanatostilben-2,2'-disulfonsku kiselinu; 5-[dimetilamino]-naftalen-1-sulfonil hlorid (DNS, dansilhlorid); 4-dimetilaminofenilazofenil-4'-izotiocijanat (DABITC); eozin i derivate; eozin, eozin izotiocijanat, eritrozin i derivate; eritrozin B, eritrozin, izotiocijanat; etidijum; fluorescein i derivate; 5-karboksifluorescein (FAM), 5-(4,6-dihlorotriazin-2-il)aminofluorescein (DTAF), 2',7'-dimetoksi-4'5'-dihloro-6-karboksifluorescein, fluorescein, fluorescein izotiocijanat, QFITC, (XRITC); fluoreskamin; IR144; IR1446; malahit zeleni izotiocijanat; 4-metilumbeliferonorto krezolftalein; nitrotirozin; pararosanilin; fenol crveno; B-fikoeritrin; oftaldialdehid; piren i derivate: piren, piren butirat, sukcinimidil 1-piren; kvantne tačke butirata; reaktivno crveno 4 (CibacronTM briljantno crveno 3B-A), rodamin i derivate: 6-karboksi-X-rodamin (ROX), 6-karboksirodamin (R6G), lisamin rodamin B sulfonil hlorid rodamin (Rhod), rodamin B, rodamin 123, rodamin X izotiocijanat, sulforodamin B, sulforodamin 101, sulfonil hloridni derivati sulforodamina 101 (Teksas crveno); N, N, N', N'tetrametil-6-karboksirodamin (TAMRA); tetrametil rodamin; tetrametil rodamin izotiocijanat (TRITC); riboflavin; rosolnu kiselinu; helatne derivate terbijuma; cijanin-3 (Cy3); cijanin-5 (Cy5); cijanin-5.5 (Cy5.5), cijanin-7 (Cy7); IRD 700; IRD 800; Alexa 647; La Jolta plavo; ftalo cijanin; i naftalo cijanin. U nekim slučajevima, detektabilna oznaka je fluorescentna boja, kao što su Cy5 i Cy3.

[0397] Primeri luminiscentnog materijala uključuju luminol; primeri bioluminiscentnih materijala uključuju luciferazu, luciferin, i ekvorin.

[0398] Primeri pogodnog radioaktivnog materijala uključuju<18>F,<67>Ga,<81m>Kr,<82>Rb,<111>In,<123>I,<133>Xe,<201>Tl,<125>I,<35>S,<14>C, ili<3>H,<99m>Tc (npr., kao pertehnetat (tehnetat(VII), TcO4-) bilo direktno ili indirektno, ili druge radioizotope detektabilne direktnim očitavanjem radio emisije ili scintilacionim brojanjem.

[0399] Dodatno, mogu da se upotrebe kontrastni agensi, npr., kontrastni agensi za MRI ili NMR, za CT rendgenskih zraka, Raman snimanje, optičku koherentnu tomografiju, apsorpciono snimanje, ultrazvučno snimanje, ili termičko snimanje. Ilustrativni kontrastni agensi uključuju zlato (npr., zlatne nanočestice), gadolinijum (npr., helirani Gd), okside gvožđa (npr.,

4

superparamagnetski oksid gvožđa (SPIO), nanočestice monokristalnog gvožđe oksida (MION), i takođe mogu da se upotrebe ultra male superparamagnetne čestice oksida gvožđa (USPIO)), helati mangana (npr., Mn-DPDP), barijum sulfat, jodirani kontrastni medijum (joheksol), mikromehurići, ili perfluorougljenici.

[0400] U nekim slučajevima, detektabilni agens je nedetektabilni prekursor koji postaje detektabilan nakon aktivacije. Primeri uključuju fluorogene konstrukte tetrazin-fluorofor (npr., tetrazin-BODIPY FL, tetrazin-Oregon zelena 488, ili tetrazin-BODIPY TMR-X) ili fluorogene agense koji mogu da se aktiviraju pomoću enzima (npr., PROSENSE (VisEn Medical)).

[0401] Kada su jedinjenja enzimski obeležena, na primer, peroksidazom rena, alkalnom fosfatazom, ili luciferazom, enzimska oznaka se detektuje određivanjem konverzije odgovarajućeg supstrata u proizvod.

[0402] In vitro testovi u kojima ove kompozicije mogu da se upotrebe uključuju enzimski vezane imunosorbentne testove (ELISA), imunoprecipitacije, imunofluorescenciju, enzimski imunoesej (EIA), radioimunoesej (RIA), i analizu Western blot.

[0403] Oznake koje nisu ovde opisane su obuhvaćene ovim prikazom, uključujući druge optičkidetektabilne oznake. Oznake mogu da budu vezane za modifikovani nukleotid predmetnog prikaza na bilo kojoj poziciji upotrebom standardnih hemijskih reakcija tako da oznaka može da se ukloni sa ugrađene baze nakon otcepljivanja linkera koji može da se otcepi.

Opterećenje lekom: Opterećenja lekom koja prodiru u ćelije

[0404] U nekim slučajevima, modifikovani nukleotidi i modifikovane nukleinske kiseline mogu da uključuju i opterećenje lekom koje može da predstavlja fragment koji prodire u ćeliju ili agens koji poboljšava isporuku kompozicija u ćelije. Na primer, kompozicije mogu da uključuju peptidnu sekvencu koja prodire u ćelije koja olakšava isporuku u unutarćelijski prostor, npr., TAT peptid poreklom iz HIV, penetratini, transportani, ili peptidi koji prodiru u ćelije poreklom od hCT, videti, npr., Caron et al., (2001) Mol Ther. 3(3):310-8; Langel, Cell-Penetrating Peptides: Processes and Applications (CRC Press, Boca Raton FL 2002); El-Andaloussi et al., (2005) Curr Pharm Des. 11(28):3597-611; i Deshayes et al., (2005) Cell Mol Life Sci. 62(16):1839-49. Kompozicije mogu takođe da budu formulisane tako da uključuju agens koji prodire u ćelije, npr., lipozome, koji olakšava isporuku kompozicija u unutarćelijski prostor.

Opterećenje lekom: Biološki ciljevi

4

[0405] Ovde opisani modifikovani nukleotidi i modifikovane nukleinske kiseline mogu da se upotrebe za isporuku opterećenja lekom do bilo kog biološkog cilja za koji postoji ili može da se generiše specifični ligand. Ligand može da se veže za biološki cilj ili kovalentno ili nekovalentno.

[0406] Ilustrativni biološki ciljevi uključuju biopolimere, npr., antitela, nukleinske kiseline kao RNK i DNK, proteine, enzime; primeri proteina uključuju enzime, receptore, i jonske kanale. U nekim slučajevima cilj je marker specifičan za tkivo ili ćelijski tip, npr., protein koji se eksprimira specifično na odabranom tkivu ili ćelijskom tipu. U nekim slučajevima, cilj je receptor, kao što su, ali bez ograničenja, receptori plazma membrane i receptori jedra; specifičniji primeri uključuju receptore kuplovane sa G-proteinom, proteine ćelijskih pora, transportne proteine, antitela eksprimirana na površini ćelije, HLA proteine, MHC proteine i receptore faktora rasta.

Sinteza modifikovanih nukleotida

[0407] Ovde opisani modifikovani nukleozidi i nukleotidi mogu da se pripreme od lako dostupnih polaznih materijala upotrebom sledećih opštih postupaka i procedura. Podrazumeva se da kada su dati uobičajeni ili poželjni procesni uslovi (tj., reakcione temperature, vremena, molski odnosi reaktanata, rastvarači, pritisci, itd.); mogu da se koriste i drugi procesni uslovi, osim ako nije drugačije naznačeno. Optimalni reakcioni uslovi mogu da variraju sa konkretnim upotrebljenim reaktantima ili rastvaračem, ali takve uslove stručnjak u ovoj oblasti može da odredi rutinskim procedurama optimizacije.

[0408] Ovde opisani postupci mogu da se prate bilo kojom pogodnom metodom poznatom u stanju tehnike. Na primer, formiranje proizvoda može da se prati spektroskopski, na primer nuklearnom magnetnom rezonantnom spektroskopijom (npr.,<1>H ili<13>C), infracrvenom spektroskopijom, spektrofotometrijom (npr., u UV-vidljivom spektru), ili masenom spektrometrijom, ili hromatografijom, kao što je tečna hromatografija visokih performansi (HPLC) ili tankoslojna hromatografija.

[0409] Priprema modifikovanih nukleozida i nukleotida može da uključuje dodavanje i uklanjanje zaštitnih grupa na različite hemijske grupe. Stručnjak u ovoj oblasti može lako da utvrdi postojanje potrebe za dodavanjem i uklanjanjem zaštitnih grupa, i izbor odgovarajućih zaštitnih grupa. Hemija zaštitnih grupa može da se nađe, na primer, u Greene, et al., Protective Groups in Organic Synthesis, 2d. Ed., Wiley & Sons, 1991.

[0410] Reakcije ovde opisanih postupaka mogu da se izvedu u pogodnim rastvaračima, koje stručnjak u oblasti organske sinteze može lako da odabere. Pogodni rastvarači mogu da budu suštinski nereaktivni sa polaznim materijalima (reaktantima), intermedijerima, ili proizvodima na

4

temperaturama na kojima se izvode reakcije, tj., temperaturama koje mogu da variraju od temperature zamrzavanja rastvarača do temperature ključanja rastvarača. Data reakcija može da bude izvedena u rastvaraču ili smeši više od jednog rastvarača. U zavisnosti od konkretnog koraka reakcije, mogu da budu odabrani pogodni rastvarači za taj konkretan korak reakcije.

[0411] Razdvajanje racemskih smeša modifikovanih nukleozida i nukleotida može da se izvede bilo kojom od brojnih metoda poznatih u stanju tehnike. Primer metode uključuje frakcionu rekristalizaciju upotrebom "kiseline za hiralno razdvajanje" koja je optički aktivna, organska kiselina koja formira so. Pogodni agensi za razdvajanje za metode frakcione rekristalizacije su, na primer, optički aktivne kiseline, kao što su D i L oblici vinske kiseline, diacetil vinske kiseline, dibenzoil vinske kiseline, bademove kiseline, jabučne kiseline, mlečne kiseline ili različitih optički aktivnih kamforsulfonskih kiselina. Razdvajanje racemskih smeša takođe može da se izvede eluiranjem sa kolone pakovane sa optički aktivnim agensom za razdvajanje (npr., dinitrobenzoilfenilglicin). Stručnjak u ovoj oblasti može da odredi pogodan sastav rastvarača za eluiranje.

Dužina

[0412] Uopšteno, dužina modifikovane mRNA predmetnog prikaza je veća od 30 nukleotida. U drugom slučaju, molekul RNK je duži od 35 nukleotida. U drugom slučaju, dužina je najmanje 40 nukleotida. U drugom slučaju, dužina je najmanje 45 nukleotida. U drugom slučaju, dužina je najmanje 55 nukleotida. U drugom slučaju, dužina je najmanje 60 nukleotida. U drugom slučaju, dužina je najmanje 60 nukleotida. U drugom slučaju, dužina je najmanje 80 nukleotida. U drugom slučaju, dužina je najmanje 90 nukleotida. U drugom slučaju, dužina je najmanje 100 nukleotida. U drugom slučaju, dužina je najmanje 120 nukleotida. U drugom slučaju, dužina je najmanje 140 nukleotida. U drugom slučaju, dužina je najmanje 160 nukleotida. U drugom slučaju, dužina je najmanje 180 nukleotida. U drugom slučaju, dužina je najmanje 200 nukleotida. U drugom slučaju, dužina je najmanje 250 nukleotida. U drugom slučaju, dužina je najmanje 300 nukleotida. U drugom slučaju, dužina je najmanje 350 nukleotida. U drugom slučaju, dužina je najmanje 400 nukleotida. U drugom slučaju, dužina je najmanje 450 nukleotida. U drugom slučaju, dužina je najmanje 500 nukleotida. U drugom slučaju, dužina je najmanje 600 nukleotida. U drugom slučaju, dužina je najmanje 700 nukleotida. U drugom slučaju, dužina je najmanje 800 nukleotida. U drugom slučaju, dužina je najmanje 900 nukleotida. U drugom slučaju, dužina je najmanje 1000 nukleotida. U drugom slučaju, dužina je najmanje 1100 nukleotida. U drugom slučaju, dužina je najmanje 1200 nukleotida. U drugom slučaju, dužina je najmanje 1300 nukleotida. U drugom

41

slučaju, dužina je najmanje 1400 nukleotida. U drugom slučaju, dužina je najmanje 1500 nukleotida. U drugom slučaju, dužina je najmanje 1600 nukleotida. U drugom slučaju, dužina je najmanje 1800 nukleotida. U drugom slučaju, dužina je najmanje 2000 nukleotida. U drugom slučaju, dužina je najmanje 2500 nukleotida. U drugom slučaju, dužina je najmanje 3000 nukleotida. U drugom slučaju, dužina je najmanje 4000 nukleotida. U drugom slučaju, dužina je najmanje 5000 nukleotida, ili veća od 5000 nukleotida. U drugom slučaju, dužina je najmanje 5000 nukleotida, ili veća od 6000 nukleotida. U drugom slučaju, dužina je najmanje 7000 nukleotida, ili veća od 7000 nukleotida. U drugom slučaju, dužina je najmanje 8000 nukleotida, ili veća od 8000 nukleotida. U drugom slučaju, dužina je najmanje 9000 nukleotida, ili veća od 9000 nukleotida. U drugom slučaju, dužina je najmanje 10000 nukleotida, ili veća od 10000 nukleotida.

Upotreba modifikovanih RNK

Prevencija ili smanjenje aktivacije urođenog ćelijskog imunskog odgovora

[0413] Termin "urođeni imunski odgovor" uključuje ćelijski odgovor na egzogene jednolančane nukleinske kiseline, uglavnom virusnog ili bakterijskog porekla, koji uključuje indukciju ekspresije i oslobađanja citokina, posebno interferona, i ćelijsku smrt. Sinteza proteina je takođe redukovana tokom urođenog ćelijskog imunskog odgovora. Iako eliminacija urođenog imunskog odgovora u ćeliji predstavlja prednost, prikaz obezbeđuje modifikovane mRNA koje suštinski redukuju imunski odgovor, uključujući interferonsku signalizaciju, bez potpune eliminacije takvog odgovora. U nekim slučajevima, imunski odgovor je redukovan za 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 99.9%, ili više od 99.9% u poređenju sa imunskim odgovorom indukovanim odgovarajućom nemodifikovanom nukleinskom kiselinom. Takva redukcija može da se meri nivoom ekspresije ili aktivnosti interferona tipa 1 ili ekspresijom gena koje regulišu interferoni, kao što su toll-u slični receptori (npr., TLR7 i TLR8). Redukcija urođenog imunskog odgovora takođe može da se meri sniženom ćelijskom smrti nakon jedne ili više primena modifikovane RNK na populaciju ćelija; npr., ćelijska smrt je 10%, 25%, 50%, 75%, 85%, 90%, 95%, ili više od 95% manja od učestalosti ćelijske smrti zapažene sa odgovarajućom nemodifikovanom nukleinskom kiselinom. Osim toga, ćelijska smrt može da pogodi manje od 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1%, 0.1%, 0.01% ili manje od 0.01% ćelija dovedenih u kontakt sa modifikovanim nukleinskim kiselinama.

[0414] Prikaz obezbeđuje ponovljeno uvođenje (npr., transfekciju) modifikovanih nukleinskih kiselina u ciljnu ćelijsku populaciju, npr., in vitro, ex vivo, ili in vivo. Korak dovođenja u kontakt ćelijske populacije može da se ponavlja jednom ili više puta (kao dva, tri, četiri, pet ili više od pet puta). U nekim slučajevima, korak dovođenja u kontakt ćelijske populacije sa modifikovanim nukleinskim kiselinama se ponavlja onoliki broj puta koliko je dovoljno da se dostigne unapred određena efikasnost translacije proteina u ćelijskoj populaciji. S obzirom na smanjenu citotoksičnost ciljne populacije ćelija koju obezbeđuju modifikacije nukleinske kiseline, takve ponovljene transfekcije se mogu postići u različitim vrstama ćelija.

Partneri u interakciji sa glavnim žlebom

[0415] Kao što je ovde opisano, izraz "partner u interakciji sa glavnim žlebom" se odnosi na receptore za prepoznavanje RNK koji detektuju i odgovaraju na ligande RNK kroz interakcije, npr. vezivanje, sa površinom glavnog žleba nukleotida ili nukleinske kiseline. Kao takvi, ligandi RNK koji sadrže modifikovane nukleotide ili nukleinske kiseline, kao što su ovde opisane modifikovane RNK smanjuju interakcije sa vezujućim partnerima glavnog žleba, i tako snižavaju urođeni imunski odgovor.

[0416] Primeri partnera u interakciji, npr. vezivanju, sa glavnim žlebom uključuju, ali nisu ograničeni na sledeće nukleaze i helikaze. U membranama, TLR (engl. Toll-like Receptors – Tollu slični receptori) 3, 7, i 8 mogu da odgovore na jednolančane i dvolančane RNK. U citoplazmi, članovi superfamilije 2 klase DEX(D/H) helikaza i ATPaza mogu da detektuju RNK kako bi inicirali antivirusne odgovore. Ove helikaze uključuju RIG-I (engl. retinoic acid-inducible gene I – gen I koji indukuje retinoinska kiselina) i MDA5 (engl. melanoma differentiation-associated gene 5 – gen 5 povezan sa diferencijacijom melanoma). Ostali primeri uključuju protein laboratorija za genetiku i fiziologiju 2 (engl. laboratory of genetics i physiology 2, LGP2), proteine koji sadrže domen HIN-200, ili proteine koji sadrže helikazni domen.

Proteini koji vezuju RNK

[0417] U nekim slučajevima predmetnog prikaza, dati su proteini koji vezuju RNK. Proteini koji vezuju RNK mogu da budu obezbeđeni kao proteini i/ili kao nukleinske kiseline koje kodiraju takve proteine. Proteini koji vezuju RNK imaju višestruke uloge u regulisanju stabilnosti RNK i translacije proteina. Elementi bogati A/U u 3' UTR mRNA dovode do formiranja sekundarnih struktura koje vezuju proteini koji vezuju regione bogate A/U (AREBP) što rezultuje povećanom ili smanjenom stabilnošću mRNA (Fan, X.C. et al., Overexpression of HuR, a nuclear-cytoplasmic shuttling protein, increases the in vivo stability of ARE-containing mRNAs. EMBO J.1998 Jun 15; 17(12):3448-60). HuR je stabilizujući AREBP. Kako bi se povećala stabilnost mRNA od interesa, mRNA koja kodira HuR može da bude ko-transfektovana ili ko-injektovana zajedno sa mRNA od interesa u ćelije ili u tkivo. Ovi proteini mogu i da se povežu sa mRNA od interesa in vitro i da se zatim zajedno primene na ćelije. Protein koji vezuje poli A rep, PABP, interaguje sa eukariotskim faktorom inicijacije translacije eIF4G za stimulaciju inicijacije translacije. Istovremena primena mRNA koje kodiraju ove RBP zajedno sa mRNA lekom i/ili vezivanje ovih proteina za mRNA lek in vitro i primena mRNA vezane za protein na ćelije može da poveća efikasnost translacije mRNA. Isti koncept može da se proširi na istovremenu primenu mRNA zajedno sa mRNA koje kodiraju različite translacione faktore i faktore koji olakšavaju translaciju, kao i sa samim proteinima kako bi se uticalo na stabilnost RNK i/ili efikasnost translacije.

Varijante polipeptida

[0418] Obezbeđene su nukleinske kiseline koje kodiraju varijantne polipeptide, koji imaju izvesnu identičnost sa referentnom polipeptidnom sekvencom. Termin "identičnost", kao što je poznato u stanju tehnike, odnosi se na odnos između sekvenci dva ili više peptida, određen poređenjem sekvenci. U tehnici, "identičnost" takođe označava stepen srodnosti sekvenci između peptida, određeno brojem podudaranja između nizova dva ili više aminokiselinskih ostataka.

[0419] "Identičnost" meri procenat identičnih podudaranja između manje od dve ili više sekvenci sa poravnanjima praznina (ako ih ima) kojima se bavi određeni matematički model ili računarski program (tj., "algoritmi"). Identičnost srodnih peptida može lako da se izračuna poznatim postupcima. Takvi postupci uključuju, ali nisu ograničeni na, one opisane u Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991; i Carillo et al., SIAM J. Applied Math.48, 1073 (1988).

[0420] U nekim slučajevima, polipeptidna varijanta ima istu ili sličnu aktivnost kao referentni polipeptid. Alternativno, varijanta ima izmenjenu aktivnost (npr., povećanu ili smanjenu) u odnosu na referentni polipeptid. Uopšteno, varijante određenog polinukleotida ili polipeptida prema prikazu imaće najmanje oko 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identičnosti sekvence sa tim konkretnim referentnim polinukleotidom ili polipeptidom, određeno pomoću programa za poravnanje sekvenci i parametara koji su ovde opisani i poznati stručnjacima u ovoj oblasti.

41

[0421] Kao što će stručnjacima u ovoj oblasti biti poznato, proteinski fragmenti, funkcionalni proteinski domeni i homologi proteini se takođe smatraju opisanim u ovom dokumentu. Na primer, ovde je dat bilo koji proteinski fragment referentnog proteina (označava polipeptidnu sekvencu koja je za najmanje jedan aminokiselinski ostatak kraća od referentne polipeptidne sekvence, sa kojom je inače identična) dužine 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ili više od 100 aminokiselina. U drugom primeru, bilo koji protein koji uključuje niz od oko 20, oko 30, oko 40, oko 50, ili oko 100 aminokiselina koje su oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 70%, oko 80%, oko 90%, oko 95%, ili oko 100% identične bilo kojoj od ovde opisanih sekvenci mogu da se upotrebe u skladu sa prikazom. U određenim slučajevima, proteinska sekvenca za upotrebu prema prikazu uključuje 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ili više mutacija kao što je prikazano u bilo kojoj od ovde datih ili navedenih sekvenci.

Biblioteke polipeptida

[0422] Ovde su date i biblioteke polinukleotida koje sadrže modifikacije nukleozida, pri čemu polinukleotidi pojedinačno sadrže prvu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira polipeptid, kao što je antitelo, vezujući partner proteina, protein skele, i drugi polipeptidi poznati u stanju tehnike. Poželjno, polinukleotidi su mRNA u obliku pogodnom za direktno uvođenje u ciljnu ćelijudomaćina, koja zauzvrat sintetizuje kodirani polipeptid.

[0423] U određenim slučajevima, proizvode se višestruke varijante proteina, svaka sa jednom ili više drugačijih aminokiselinskih modifikacija, i ispituju da bi se odredila najbolja varijanta u smislu farmakokinetike, stabilnosti, biokompatibilnosti, i/ili biološke aktivnosti, ili biofizičkog svojstva kao što je nivo ekspresije. Takva biblioteka može da sadrži 10, 10<2>, 10<3>, 10<4>, 10<5>, 10<6>, 10<7>, 10<8>, 10<9>, ili preko 10<9>mogućih varijanti (uključujući supstitucije, delecije jednog ili više ostataka, i insercije jednog ili više ostataka).

Kompleksi polipeptid-nukleinska kiselina

[0424] Ispravna translacija proteina uključuje fizičku agregaciju brojnih polipeptida i nukleinskih kiselina povezanih sa mRNA. Prikaz obezbeđuje komplekse koji sadrže konjugate proteina i nukleinskih kiselina, koji uključuju mRNA koja može da se translatira, koja ima jednu ili više nukleozidnih modifikacija (npr., najmanje dve različite nukleozidne modifikacije) i jedan ili više polipeptida vezanih za mRNA. Uopšteno, proteini su obezbeđeni u količini koja je efikasna u sprečavanju ili redukciji urođenog imunskog odgovora ćelije u koju se kompleks uvodi.

Fragmenti za ciljno delovanje

[0425] U slučajevima prema prikazu, date su modifikovane nukleinske kiseline da eksprimiraju vezujući partner proteina ili receptor na površini ćelije, koji funkcioniše tako da usmeri ćeliju na specifični prostor tkiva ili da interaguje sa specifičnim ostatkom, bilo in vivo ili in vitro. Pogodni vezujući partneri proteina uključuju antitela i njihove funkcionalne fragmente, proteine skele, ili peptide. Dodatno, modifikovane nukleinske kiseline mogu da se koriste za usmeravanje sinteze i vanćelijske lokalizacije lipida, ugljenih hidrata, ili drugih bioloških fragmenata.

[0426] Kao što je ovde opisano, korisno svojstvo modifikovanih nukleinskih kiselina prema prikazu je njihova sposobnost da redukuju urođeni imunski odgovor ćelije na egzogenu nukleinsku kiselinu. Obezbeđeni su postupci za izvođenje titracije, redukcije ili otklanjanja imunskog odgovora u ćeliji ili populaciji ćelija. U nekim slučajevima, ćelija se dovodi u kontakt sa prvom kompozicijom koja sadrži prvu dozu prve egzogene nukleinske kiseline koja uključuje region koji može da se translatira i najmanje jednu nukleozidnu modifikaciju, i određuje se nivo urođenog imunskog odgovora ćelije na prvu egzogenu nukleinsku kiselinu. Zatim, ćelija se dovodi u kontakt sa drugom kompozicijom, koja uključuje drugu dozu prve egzogene nukleinske kiseline, gde druga doza sadrži manju količinu prve egzogene nukleinske kiseline u poređenju sa prvom dozom.

[0427] Alternativno, ćelija se dovodi u kontakt sa prvom dozom druge egzogene nukleinske kiseline. Druga egzogena nukleinska kiselina može da sadrži jedan ili više modifikovanih nukleozida, koji mogu da budu isti ili različiti u odnosu na prvu egzogenu nukleinsku kiselinu ili, alternativno, druga egzogena nukleinska kiselina može da ne sadrži modifikovane nukleozide. Koraci dovođenja u kontakt ćelije sa prvom kompozicijom i/ili drugom kompozicijom mogu da se ponavljaju jednom ili više puta.

[0428] Dodatno, efikasnost proizvodnje proteina (npr., translacije proteina) u ćeliji se opciono određuje, i ćelija može da se podvrgne ponovljenoj transfekciji prvom i/ili drugom kompozicijom dok se ne postigne ciljna efikasnost proizvodnje proteina.

[0429] U jednom slučaju, 3' kraj ovde opisanih modifikovanih nukleinskih kiselina može da uključuje sekvencu za usmeravanje modifikovane nukleinske kiseline na željenu lokaciju u ćeliji kao što su, ali bez ograničenja, mikrovezikule u ćeliji. Sekvenca za usmeravanje može da bude "nalik zip kodu" po svojoj funkciji budući da može da je prepozna ćelijska mašinerija koja može da prenosi molekule na različita mesta u ćeliji. Neograničavajući primeri sekvenci za usmeravanje nukleinskih kiselina opisani su u međunarodnoj patentnoj objavi br. WO2013109713. Bolukbasi et al. su pokazali da sekvence nalik zip kodu i miR-1289 obogaćuju sadržaj mRNA u mikrovezikulama (Mol. Ther. Nuc. Acid 20121, e10) budući da i zip kodovi i microRNA imaju ulogu u post-transkripcionoj regulaciji mRNA.

41

[0430] U jednom slučaju, sekvenca za usmeravanje modifikovane nukleinske kiseline je SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 38 ili konkatemer od najmanje jedne SEQ ID NO: 22 i najmanje jedne SEQ ID NO: 38 kako je opisano u međunarodnoj patentnoj objavi br. WO2013109713.

Vakcine

[0431] Kao što je ovde opisano, obezbeđene su mRNA koje imaju sekvence koje suštinski ne mogu da se translatiraju. Takva mRNA je efikasna kao vakcina kada se primeni kod subjekta sisara.

[0432] Obezbeđene su i modifikovane nukleinske kiseline koje sadrže jedan ili više nekodirajućih regiona. Takve modifikovane nukleinske kiseline se generalno ne translatiraju, ali mogu da vežu i sekvestriraju jednu ili više komponenti translacione mašinerije kao što je ribozomski protein ili transfer RNK (tRNA), čime se efikasno redukuje ekspresija proteina u ćeliji. Modifikovana nukleinska kiselina može da sadrži malu jedarnu RNK (sno-RNA), mikro RNK (miRNA), malu interferirajuću RNK (siRNA) ili Piwi-interagujuću RNK (piRNA).

[0433] Dodatno, određeni modifikovani nukleozidi, ili njihove kombinacije, kada se uvedu u modifikovane nukleinske kiseline aktiviraju urođeni imunski odgovor. Takve aktivirajuće modifikovane nukleinske kiseline, npr., modifikovane RNK, su korisne kao adjuvansi, kada se kombinuju sa polipeptidnim ili drugim vakcinama. U određenim slučajevima, aktivirane modifikovane mRNA sadrže region koji može da se translatira, koji kodira polipeptidnu sekvencu korisnu kao vakcina, čime se postiže mogućnost da one predstavljaju sopstveni adjuvans.

Terapeutski agensi

[0434] Modifikovane nukleinske kiseline (modifikovane RNK) i proteini translatirani sa ovde opisanih modifikovanih nukleinskih kiselina mogu da se upotrebe kao terapeutski agensi. Na primer, ovde opisane modifikovane nukleinske kiseline mogu da se primene na subjekta, pri čemu se modifikovana nukleinska kiselina translatira in vivo da bi se proizveo terapeutski peptid u subjektu. Obezbeđene su kompozicije, postupci, kompleti i reagensi za lečenje ili prevenciju bolesti ili stanja kod ljudi i drugih sisara. Aktivni terapeutski agensi prema prikazu uključuju modifikovane nukleinske kiseline, ćelije koje sadrže modifikovane nukleinske kiseline ili polipeptide translatirane sa modifikovanih nukleinskih kiselina, polipeptide translatirane sa modifikovanih nukleinskih kiselina, i ćelije dovedene u kontakt sa ćelijama koje sadrže modifikovane nukleinske kiseline ili polipeptide translatirane sa modifikovanih nukleinskih kiselina.

41

[0435] U određenim slučajevima, obezbeđene su kombinacije terapeutika koje sadrže jednu ili više modifikovanih nukleinskih kiselina koje uključuju regione koji mogu da se translatiraju, koji kodiraju protein ili proteine koji pojačavaju imunitet subjekta sisara, zajedno sa proteinom koji indukuje ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela. Na primer, obezbeđeni su terapeutici koji sadrže jednu ili više nukleinskih kiselina koje kodiraju trastuzumab i faktor koji stimuliše kolonije granulocita (G-CSF). Posebno, takvi kombinovani terapeutici su korisni kod pacijenata sa kancerom dojke Her2+ koji su razvili indukovanu rezistenciju na trastuzumab. (videti, npr., Albrecht, Immunotherapy. 2(6):795-8 (2010)).

[0436] Obezbeđeni su postupci za indukovanje translacije rekombinantnog polipeptida u populaciji ćelija upotrebom ovde opisanih modifikovanih nukleinskih kiselina. Takva translacija može da se odvija in vivo, ex vivo, in culture, ili in vitro. Populacija ćelija se dovodi u kontakt sa efikasnom količinom kompozicije koja sadrži nukleinsku kiselinu koja ima najmanje jednu nukleozidnu modifikaciju, i region koji može da se translatira, koji kodira rekombinantni polipeptid. Populacija se dovodi u kontakt pod takvim uslovima da je nukleinska kiselina lokalizovana u jednoj ili više ćelija populacije ćelija, a rekombinantni polipeptid se translatira u ćeliji sa nukleinske kiseline.

[0437] Obezbeđena je efikasna količina kompozicije na osnovu, bar delom, tipa ciljnog tkiva, tipa ciljne ćelije, načina primene, fizičkih karakteristika nukleinske kiseline (npr., veličine, i stepena modifikovanih nukleozida), i drugih odrednica. Uopšteno, efikasna količina kompozicije obezbeđuje efikasnu proizvodnju proteina u ćeliji, poželjno efikasniju od kompozicije koja sadrži odgovarajuću nemodifikovanu nukleinsku kiselinu. Povećana efikasnost može da se pokaže putem povećane transfekcije ćelija (tj., procenta ćelija koje su transfektovane nukleinskom kiselinom), povećane translacije proteina sa nukleinske kiseline, smanjene razgradnje nukleinske kiseline (pokazano, npr., putem povećanog trajanja translacije proteina sa modifikovane nukleinske kiseline), ili redukovanog urođenog imunskog odgovora ćelije-domaćina.

[0438] Aspekti prema prikazu su usmereni na postupke za indukovanje in vivo translacije rekombinantnog polipeptida kod subjekta sisara, kome je to potrebno. Ovde, efikasna količina kompozicije koja sadrži nukleinsku kiselinu koja ima najmanje jednu nukleozidnu modifikaciju i region koji može da se translatira koji kodira rekombinantni polipeptid se primenjuje kod subjekta upotrebom ovde opisanih postupaka za isporuku. Nukleinska kiselina je obezbeđena u količini i pod ostalim uslovima tako da je nukleinska kiselina lokalizovan u ćeliji subjekta i rekombinantni polipeptid se translatira u ćeliji sa nukleinske kiseline. Na ćeliju u kojoj je lokalizovana nukleinska kiselina, ili tkivo u kome je ćelija prisutna, može ciljno da se deluje jednim ili većim brojem ciklusa primene nukleinske kiseline.

41

[0439] Drugi aspekti prikaza odnose se na transplantaciju ćelija koje sadrže modifikovane nukleinske kiseline u telo subjekta sisara. Primena ćelija kod subjekata koji su sisari poznata je stručnjacima u ovoj oblasti, kao što je lokalna implantacija (npr., topikalna ili subkutana primena), isporuka u organ ili sistemska injekcija (npr., intravenska injekcija ili inhalacija), na primer u formulaciji ćelija u farmaceutski prihvatljivom nosaču. Kompozicije koje sadrže modifikovane nukleinske kiseline su formulisane za intramuskularnu, transarterijalnu, intraokularnu, vaginalnu, rektalnu, intraperitonealnu, intravensku, intranazalnu, subkutanu, endoskopsku, transdermalnu, ili intratekalnu primenu. U nekim slučajevima, kompozicija je formulisana za produženo oslobađanje.

[0440] Subjekat kod koga se terapeutski agens primenjuje pati od, ili je u riziku od razvoja bolesti, poremećaj, ili štetnog stanja. Obezbeđeni su postupci za identifikovanje, dijagnostikovanje i klasifikovanje subjekata na ovim osnovama, koji mogu da uključuju kliničku dijagnozu, nivoe biomarkera, izučavanje asocijacija na nivou celog genoma (GWAS), i druge postupke poznate u stanju tehnike.

[0441] U određenim slučajevima, primenjena modifikovana nukleinska kiselina usmerava proizvodnju jednog ili više rekombinantnih polipeptida koji obezbeđuju funkcionalnu aktivnost koje suštinski nema u ćeliji u kojoj se rekombinantni polipeptid translatira. Na primer, nedostajuća funkcionalna aktivnost može da bude po prirodi enzimska, strukturna, ili da reguliše gene. U povezanim slučajevima, primenjena modifikovana nukleinska kiselina usmerava proizvodnju jednog ili više rekombinantnih polipeptida koji povećavaju (npr., sinergistički) funkcionalnu aktivnost koja je prisutna, ali suštinski nedovoljna u ćeliji u kojoj se rekombinantni polipeptid translatira.

[0442] U drugim slučajevima, primenjena modifikovana nukleinska kiselina usmerava proizvodnju jednog ili više rekombinantnih polipeptida koji zamenjuju polipeptid (ili više polipeptida) koga suštinski nema u ćeliji u kojoj se rekombinantni polipeptid translatira. Takvo odsustvo može da nastane zbog genetske mutacije kodirajućeg gena ili njegovog regulatornog puta. U nekim slučajevima, rekombinantni polipeptid povećava nivo endogenog proteina u ćeliji do željenog nivoa; takvo povećanje može da dovede nivo endogenog proteina od nivoa koji je ispod normalnog do normalnog nivoa, ili od normalnog nivoa do nivoa iznad normalnog.

[0443] Alternativno, rekombinantni polipeptid funkcioniše tako što antagonizuje aktivnost endogenog proteina prisutnog u ćeliji, na površini ćelije, ili izlučenog iz ćelije. Obično, aktivnost endogenog proteina je štetna za subjekta, na primer, zbog mutacije endogenog proteina koja dovodi do izmenjene aktivnosti ili lokalizacije. Dodatno, rekombinantni polipeptid antagonizuje, direktno ili indirektno, aktivnost biološkog fragmenta prisutnog u ćeliji, na površini ćelije, ili

41

izlučenog iz ćelije. Primeri antagonizovanih bioloških fragmenata uključuju lipide (npr., holesterol), lipoprotein (npr., lipoprotein niske gustine), nukleinsku kiselinu, ugljeni hidrat, proteinski toksin, kao što je šiga toksin i toksin tetanusa, ili toksin sa malim molekulom, kao što su botulinski toksin, toksini kolere i difterije. Dodatno, antagonizovani biološki molekul može da bude endogeni protein koji ispoljava nepoželjnu aktivnost, kao što je citotoksična ili citostatska aktivnost. Rekombinantni proteini koji su ovde opisani konstruisani su za lokalizaciju u ćeliji, potencijalno unutar određenih odeljaka kao što je jedro, ili su konstruisani za izlučivanje iz ćelije ili translokaciju do plazma membrane ćelije.

Terapeutici

[0444] Obezbeđeni su postupci za lečenje ili prevenciju simptoma bolesti koje se odlikuju nedostatkom ili nepravilnom aktivnošću proteina, zamenom nedostajuće aktivnosti proteina ili prevazilaženjem nepravilne aktivnosti proteina. Zbog brzog započinjanja proizvodnje proteina nakon introdukcije modifikovanih mRNA u poređenju sa virusnim DNK vektorima, jedinjenja predmetnog prikaza su posebno pogodna u lečenju akutnih bolesti kao što su sepsa, moždani udar, i infarkt miokarda. Osim toga, nedostatak regulacije transkripcije modifikovanih mRNA prema prikazu predstavlja prednost zbog toga što omogućava postizanje precizne titracije proizvodnje proteina.

[0445] U nekim slučajevima, modifikovane mRNA i njima kodirani polipeptidi u skladu sa predmetnim prikazom mogu da se koriste u terapeutske svrhe. U nekim slučajevima, modifikovane mRNA i njima kodirani polipeptidi u skladu sa predmetnim prikazom mogu da se koriste za lečenje bilo koje od raznih bolesti, poremećaja, i/ili stanja, uključujući, ali bez ograničenja jedno ili više od sledećeg: autoimunske poremećaje (npr. dijabetes, lupus, multipla skleroza, psorijaza, reumatoidni artritis); inflamatorne poremećaje (npr. artritis, pelvična inflamatorna bolest); infektivne bolesti (npr. virusne infekcije (npr., HIV, HCV, RSV), bakterijske infekcije, gljivične infekcije, sepsa); neurološke poremećaje (npr. Alchajmerova bolest, Hantingtonova bolest; autizam; Dišenova mišićna distrofija); kardiovaskularne poremećaje (npr. ateroskleroza, hiperholesterolemija, tromboza, poremećaji zgrušavanja, angiogeni poremećaji kao što je degeneracija makule); proliferativne poremećaje (npr. kancer, benigne neoplazme); respiratorne poremećaje (npr. hronična opstruktivna bolest pluća); digestivne poremećaje (npr. inflamatorna bolest creva, ulkusi); mišićno-skeletne poremećaje (npr. fibromijalgija, artritis); endokrine, metaboličke i nutritivne poremećaje (npr. dijabetes, osteoporoza); urološke poremećaje (npr.

41

bubrežna bolest); psihološke poremećaje (npr. depresija, šizofrenija); kožne poremećaje (npr. rane, ekcem); poremećaje krvi i limfe (npr. anemija, hemofilija); itd.

[0446] Bolesti koje se odlikuju disfunkcionalnom ili nepravilnom aktivnošću proteina uključuju cističnu fibrozu, anemiju sprastih ćelija, buloznu epidermolizu, amiotrofnu lateralnu sklerozu i deficijenciju glucoza-6-fosfat dehidrogenaze. Predmetni prikaz obezbeđuje postupak za lečenje takvih stanja ili bolesti kod subjekta uvođenjem nukleinske kiseline ili terapeutika na bazi ćelije koji sadrže ovde obezbeđene modifikovane nukleinske kiseline, pri čemu modifikovane nukleinske kiseline kodiraju protein koji antagonizuje ili drugačije prevazilazi nepravilnu aktivnost proteina prisutnu u ćeliji subjekta. Specifični primeri disfunkcionalnog proteina su varijante sa misens mutacijom gena za regulator transmembranske provodljivosti kod cistične fibroze (CFTR), koje proizvode disfunkcionalnu varijantu proteina CFTR, koja dovodi do cistične fibroze.

[0447] Bolesti koje se odlikuju nedostatkom (ili značajnim smanjenjem, tako da ne dolazi do pravilne funkcije proteina) aktivnosti proteina uključuju cističnu fibrozu, Niemann-Pickova bolest tip C, β talasemiju major, Dišenovu mišićnu distrofiju, Harlerov sindrom, Hanterov sindrom i hemofiliju A. Takvi proteini mogu da budu odsutni, ili suštinski nefunkcionalni. Predmetni prikaz obezbeđuje postupak za lečenje takvih stanja ili bolesti kod subjekta uvođenjem nukleinske kiseline ili terapeutika na bazi ćelije koji sadrže ovde obezbeđene modifikovane nukleinske kiseline, pri čemu modifikovane nukleinske kiseline kodiraju protein koji zamenjuje proteinsku aktivnost koja nedostaje u ciljnim ćelijama subjekta. Specifični primeri disfunkcionalnog proteina su varijante sa nonsens mutacijom gena za regulator transmembranske provodljivosti kod cistične fibroze (CFTR), koje proizvode nefunkcionalnu varijantu proteina CFTR, koja dovodi do cistične fibroze.

[0448] Prema tome, obezbeđeni su postupci za lečenje cistične fibroze kod subjekta sisara dovođenjem u kontakt ćelije subjekta sa modifikovanom nukleinskom kiselinom koja ima region koji može da se translatira koji kodira funkcionalni polipeptid CFTR, pod uslovima takvim da je efikasna količina polipeptida CTFR prisutna u ćeliji. Poželjne ciljne ćelije su epitelne, endotelne i mezotelijalne ćelije, na primer u plućima, a postupci za primenu se određuju imajući u vidu ciljno tkivo; tj., za isporuku u pluća, molekuli RNK se formulišu za primenu putem inhalacije.

[0449] U drugom slučaju, predmetni prikaz obezbeđuje postupak za lečenje hiperlipidemije kod subjekta, uvođenjem u populaciju ćelija subjekta modifikovanog molekula mRNA koji kodira Sortilin, protein koji je nedavno okarakterisan u studijama genoma, čime se ublažava hiperlipidemija kod subjekta. Gen SORT1 kodira transmembranski protein trans-Goldžijeve mreže (TGN) nazvan Sortilin. Genetske studije su pokazale da jedna od pet osoba ima polimorfizam

42

jednog nukleotida, rs12740374, u lokusu 1p13 gena SORT1 koji joj daje predispoziciju za niske nivoe lipoproteina niske gustine (LDL) i lipoproteina veoma niske gustine (VLDL). Svaka kopija manje zastupljenog alela, prisutna kod oko 30% ljudi, menja LDL holesterol za 8 mg/dL, dok dve kopije manje zastupljenog alela, prisutne kod oko 5% populacije, snižavaju LDL holesterol za 16 mg/dL. Pokazano je takođe da nosioci manje zastupljenog alela imaju za 40% snižen rizik od infarkta miokarda. Funkcionalne in vivo studije na miševima opisuju da prekomerna ekspresija SORT1 u tkivu jetre miša dovodi do značajno nižih nivoa LDL-holesterola, čak i 80% nižih, i da je utišavanje SORT1 povećalo LDL holesterol za približno 200% (Musunuru K et al. From noncoding variant to phenotype via SORT1 at the 1p13 cholesterol locus. Nature 2010; 466: 714-721).

Modulacija ćelijske sudbine

[0450] Obezbeđeni su postupci za izazivanje promene ćelijske sudbine u ciljnoj ćeliji sisara. Ciljna ćelija sisara može da bude prekursorska ćelija i promena može da uključuje pokretanje diferencijacije u lozu ili blokiranje takve diferencijacije. Alternativno, ciljna ćelija sisara može da bude diferencirana ćelija, a promena ćelijske sudbine uključuje pokretanje dediferencijacije u pluripotentnu prekursorsku ćeliju, ili blokiranje takve dediferencijacije, kao što je dediferencijacija ćelija kancera u matične ćelije kancera. U situacijama kada je poželjna promena ćelijske sudbine, efikasne količine mRNA koje kodiraju induktivni polipeptid ćelijske sudbine se uvode u ciljnu ćeliju pod uslovima takvim da se indukuje promena u ćelijskoj sudbini. U nekim slučajevima, modifikovane mRNA su korisne za reprogramiranje subpopulacije ćelija iz prvog fenotipa u drugi fenotip. Takvo reprogramiranje može da bude privremeno ili trajno.

[0451] Opciono, reprogramiranje indukuje ciljnu ćeliju da usvoji intermedijarni fenotip.

[0452] Pored toga, postupci predmetnog prikaza su posebno korisni za generisanje indukovanih pluripotentnih matičnih ćelija (iPS ćelije) zbog visoke efikasnosti transfekcije, sposobnosti ponovne transfekcije ćelija i održivosti količine rekombinantnih polipeptida proizvedenih u ciljnim ćelijama. Dalje, očekuje se da će upotreba iPS ćelija generisanih korišćenjem ovde opisanih postupaka pokazati smanjenu incidencu formiranja teratoma.

[0453] Takođe su obezbeđeni postupci za smanjenje ćelijske diferencijacije u ciljnoj ćelijskoj populaciji. Na primer, ciljna ćelijska populacija koja sadrži jedan ili više tipova prekursorskih ćelija dovodi se u kontakt sa kompozicijom koja ima efikasnu količinu modifikovane mRNA koja kodira polipeptid, pod takvim uslovima da se polipeptid translira i smanjuje diferencijaciju prekursorske ćelije. U neograničavajućim slučajevima, ciljna ćelijska populacija obuhvata povređeno tkivo kod subjekta sisara, ili tkivo zahvaćeno hirurškom procedurom. Prekursorska ćelija je, na primer, stromalna prekursorska ćelija, nervna prekursorska ćelija ili mezenhimska prekursorska ćelija.

[0454] U specifičnom slučaju, obezbeđene su modifikovane nukleinske kiseline koje kodiraju jedan ili više faktora diferencijacije Gata4, Mef2c i Tbx4. Ovi faktori generisani pomoću mRNA se uvode u fibroblaste i pokreću reprogramiranje u kardiomiocite. Takvo reprogramiranje može da se obavi in vivo, dovođenjem u kontakt flastera koji sadrži mRNA ili drugog materijala sa oštećenim srčanim tkivom da bi se olakšala regeneracija srca. Takav proces podstiče genezu kardiomiocita za razliku od fibroze.

Ciljno delovanje na patogene organizme: prečišćavanje bioloških materijala

[0455] Ovde su obezbeđeni postupci za ciljno delovanje na patogene mikroorganizme, kao što su bakterije, kvasac, protozoe, helminte i slično, upotrebom modifikovanih mRNA koje kodiraju citostatske ili citotoksične polipeptide. Poželjno, mRNA uvedena u ciljni patogeni organizam sadrži modifikovane nukleozide ili druge modifikacije sekvence nukleinske kiseline, tako da se mRNA translatira isključivo, ili prvenstveno, u ciljnom patogenom organizmu, kako bi se smanjili mogući efekti terapeutika van ciljnog mesta. Takvi postupci su korisni za uklanjanje patogenih organizama iz biološkog materijala, uključujući krv, spermu, jaja, i materijale za transplantaciju, uključujući embrione, tkiva i organe.

Ciljno delovanje na obolele ćelije

[0456] Ovde su obezbeđeni postupci za ciljno delovanje na patogene ili obolele ćelije, posebno kancerske ćelije, upotrebom modifikovanih mRNA koje kodiraju citostatske ili citotoksične polipeptide. Poželjno, mRNA uvedena u ciljnu patogenu ćeliju sadrži modifikovane nukleozide ili druge modifikacije sekvence nukleinske kiseline, tako da se mRNA translatira isključivo, ili prvenstveno, u ciljnoj patogenoj ćeliji, kako bi se smanjili mogući efekti terapeutika van ciljnog mesta. Alternativno, prikaz obezbeđuje usmeravajuće fragmente koji mogu da usmere modifikovane mRNA da se prvenstveno vežu za, i uđu u ciljnu patogenu ćeliju.

Proizvodnja proteina

[0457] Ovde obezbeđeni postupci su korisni za poboljšanje prinosa proteinskog proizvoda u postupku kultivacije ćelija. U ćelijskoj kulturi koja sadrži mnoštvo ćelija-domaćina, uvođenje ovde opisanih modifikovanih mRNA dovodi do povećane efikasnosti proizvodnje proteina u odnosu na odgovarajuću nemodifikovanu nukleinsku kiselinu. Takva povećana efikasnost proizvodnje proteina može da se demonstrira, npr., pokazujući povećanu transfekciju ćelija, povećanu translaciju proteina sa nukleinske kiseline, smanjenu razgradnju nukleinske kiseline, i/ili smanjen urođeni imunski odgovor ćelije-domaćina. Proizvodnja proteina može da se meri ELISA testom, a aktivnost proteina može da se meri različitim funkcionalnim testovima poznatim u stanju tehnike. Proizvodnja proteina može da bude generisana u kontinuiranom ili šaržnom postupku na sisarskim ćelijama.

[0458] Dodatno, korisno je optimizovati ekspresiju specifičnog polipeptida u ćelijskoj liniji ili kolekciji ćelijskih linija od potencijalnog interesa, posebno konstruisanog proteina kao što je proteinska varijanta referentnog proteina koji ima poznatu aktivnost. U jednom slučaju, obezbeđen je postupak za optimizaciju ekspresije konstruisanog proteina u ciljnoj ćeliji, obezbeđivanjem mnoštva tipova ciljnih ćelija, i nezavisnim dovođenjem u kontakt modifikovane mRNA koja kodira konstruisani polipeptid sa svakim od mnoštva tipova ciljnih ćelija. Dodatno, uslovi kultivacije mogu da se menjaju kako bi se povećala efikasnost proizvodnje proteina. Zatim, prisustvo i/ili nivo konstruisanog polipeptida u mnoštvu tipova ciljnih ćelija se detektuje i/ili kvantifikuje, što omogućava optimizaciju ekspresije konstruisanog polipeptida selekcijom efikasne ciljne ćelije i uslova kultivacije ćelija povezanih sa njom. Takvi postupci su posebno korisni kada konstruisani polipeptid sadrži jednu ili više posttranslacionih modifikacija ili ima suštinski tercijarnu strukturu, što su situacije koje često komplikuju efikasnu proizvodnju proteina.

Utišavanje gena

[0459] Ovde opisane modifikovane mRNA su korisne u utišavanju (tj., sprečavanju ili suštinskom smanjenju) ekspresije jednog ili više ciljnih gena u populaciji ćelija. Modifikovana mRNA koja kodira polipeptid koji može da usmeri metilaciju histona H3 koja je specifična za sekvencu se uvodi u ćelije u populaciji pod uslovima takvim, da se polipeptid translatira i snižava transkripciju ciljnog gena putem metilacije histona H3 i posledičnog formiranja heterohromatina. U nekim slučajevima, mehanizam utišavanja se sprovodi na populaciji ćelija koja je prisutna u subjektu sisaru. U smislu neograničavajućeg primera, koristan ciljni gen je mutirani član familije kinaze Janus tipa 2, gde subjekat sisar koji eksprimira mutantni ciljni gen pati od mijeloproliferativne bolesti koja nastaje zbog nepravilne aktivnosti kinaze.

[0460] U ovom dokumentu obezbeđena je i istovremena primena modifikovanih mRNA i siRNA. Kao što je pokazano kod kvasca, utišavanje u trans-konfiguraciji specifično za sekvencu predstavlja efikasan mehanizam za promenu ćelijske funkcije. Fisionom kvascu su potrebna dva kompleksa RNAi za sklapanje heterohromatina posredovano siRNA: RNK-indukovani kompleks

42

za utišavanje transkripcije (RITS) i kompleks RNK-usmerene RNK polimeraze (RDRC) (Motamedi et al. Cell 2004, 119, 789-802). U fisionom kvascu, kompleks RITS sadrži protein Ago1 familije Argonaut koji vezuje siRNA, hromodomenski protein Chp1 i Tas3. Kompleks RDRC fisionog kvasca je sačinjen od RNK-zavisne RNK polimeraze Rdp1, pretpostavljene RNK helikaze Hrr1 i proteina Cidi12 iz familije poliA polimeraze. Ova dva kompleksa za aktivnost zahtevaju ribonukleazu Dicer i metiltransferazu histona H3 Clr4. Zajedno, Ago1 vezuje molekule siRNA nastale Dicer-posredovanim cepanjem ko-transkripciono generisanih transkripata dsRNA Rdp1 i omogućava direktno udruživanje specifično za sekvencu Chp1, Tas3, Hrr1 i Clr4 sa regionima DNK predviđenim za metilaciju i modifikaciju histona i naknadno zbijanje u transkripciono utišani heterohromatin. Dok ovaj mehanizam funkcioniše u cis-konfiguraciji sa centromernim regionima DNK, utišavanje u trans-konfiguraciji specifično za sekvencu je moguće kroz ko-transfekciju sa dvolančanim siRNA za specifične regione DNK i istovremeno RNAiusmereno utišavanje siRNA ribonukleaze Eri1 (Buhler et al. Cell 2006, 125, 873-886).

Modulacija bioloških puteva

[0461] Brza translacija modifikovanih mRNA uvedenih u ćelije obezbeđuje poželjan mehanizam modulacije ciljnih bioloških puteva. Takva modulacija uključuje antagonizam ili agonizam datog puta. U jednom slučaju, obezbeđen je postupak za antagonizovanje biološkog puta u ćeliji tako što se ćelija dovodi u kontakt sa efikasnom količinom kompozicije koja sadrži modifikovanu nukleinsku kiselinu koja kodira rekombinantni polipeptid, pod uslovima takvim da je nukleinska kiselina lokalizovana u ćeliji i rekombinantni polipeptid može da se translatira u ćeliji sa nukleinske kiseline, pri čemu rekombinantni polipeptid inhibira aktivnost polipeptida koji funkcioniše na biološkom putu. Primeri bioloških puteva su oni koji su defektni kod autoimunskog ili inflamatornog poremećaja, kao što je multipla skleroza, reumatoidni artritis, psorijaza, eritematozni lupus, ankilozantni spondilitis kolitis ili Kronova bolest; posebno, od naročite koristi je antagonizam signalnih puteva IL-12 i IL-23. (Videti Kikly K, Liu L, Na S, Sedgwick JD (2006) Curr. Opin. Immunol. 18 (6): 670-5).

[0462] Dalje, obezbeđene su modifikovane nukleinske kiseline koje kodiraju antagonist za receptore hemokina; receptori hemokina CXCR-4 i CCR-5 su potrebni za, npr., ulazak HIV u ćelije-domaćine (Arenzana-Seisdedos F et al, (1996) Nature. Oct 3;383(6599):400).

[0463] Alternativno, obezbeđeni su postupci za agonizovanje biološkog puta u ćeliji tako što se ćelija dovodi u kontakt sa efikasnom količinom modifikovane nukleinske kiseline koja kodira rekombinantni polipeptid pod uslovima u kojima je nukleinska kiselina lokalizovana u ćeliji i rekombinantni polipeptid može da bude translatiran u ćeliji sa nukleinske kiseline, a rekombinantni polipeptid indukuje aktivnost polipeptida koji funkcioniše na biološkom putu. Primeri agonizovanih bioloških puteva uključuju puteve koji moduliraju određivanje ćelijske sudbine. Takvo agonizovanje je reverzibilno ili, alternativno, ireverzibilno.

Isporuka nukleinske kiseline u ćeliju

[0464] Postupci predmetnog prikaza poboljšavaju isporuku nukleinske kiseline u populaciju ćelija, in vivo, ex vivo, ili u kulturi. Na primer, ćelijska kultura koja sadrži mnoštvo ćelijadomaćina (npr., eukariotske ćelije kao što su ćelije kvasca ili sisara) se dovodi u kontakt sa kompozicijom koja sadrži poboljšanu nukleinsku kiselinu koja ima najmanje jednu nukleozidnu modifikaciju i, opciono, region koji može da se translatira. Kompozicija takođe uglavnom sadrži reagens za transfekciju ili drugo jedinjenje koje povećava efikasnost preuzimanja poboljšane nukleinske kiseline u ćelije-domaćine. Poboljšana nukleinska kiselina se poboljšano zadržava u populaciji ćelija, u odnosu na odgovarajuću nemodifikovanu nukleinsku kiselinu. Zadržavanje poboljšane nukleinske kiseline je veće od zadržavanja nemodifikovane nukleinske kiseline. U nekim slučajevima, ono je najmanje oko 50%, 75%, 90%, 95%, 100%, 150%, 200% ili više od 200% veće od zadržavanja nemodifikovane nukleinske kiseline. Takva prednost zadržavanja može da se postigne jednim ciklusom transfekcije poboljšanom nukleinskom kiselinom, ili može da se postigne nakon ponovljenih ciklusa transfekcije.

[0465] U nekim slučajevima, poboljšana nukleinska kiselina se isporučuje u ciljnu populaciju ćelija sa jednom ili više dodatnih nukleinskih kiselina. Takva isporuka može da bude istovremena, ili se poboljšana nukleinska kiselina isporučuje pre isporuke jedne ili više dodatnih nukleinskih kiselina. Dodatna jedna ili više nukleinskih kiselina mogu da budu modifikovane nukleinske kiseline ili nemodifikovane nukleinske kiseline. Podrazumeva se da inicijalno prisustvo poboljšanih nukleinskih kiselina suštinski ne indukuje urođeni imunski odgovor populacije ćelija i, osim toga, da urođeni imunski odgovor neće biti aktiviran kasnijim prisustvom nemodifikovanih nukleinskih kiselina. U tom pogledu, poboljšana nukleinska kiselina ne mora sama po sebi da sadrži region koji može da se translatira, ako se protein za koji je poželjno da bude prisutan u ciljnoj populaciji ćelija translatira sa nemodifikovanih nukleinskih kiselina.

IV. Farmaceutske kompozicije

Formulacija, primena, isporuka i doziranje

42

[0466] Predmetni prikaz obezbeđuje polinukleotide, modifikovanu nukleinsku kiselinu, poboljšanu modifikovanu RNK i kompozicije i komplekse ribonukleinske kiseline u kombinaciji sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa. Farmaceutske kompozicije mogu opciono da sadrže jednu ili više dodatnih aktivnih supstanci, npr. terapeutski i/ili profilaktički aktivne supstance. Opšta razmatranja u vezi sa formulacijom i/ili proizvodnjom farmaceutskih agenasa mogu se naći, na primer, u Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21. ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005.

[0467] U jednom slučaju, date su formulacije koje sadrže efikasnu količinu ribonukleinske kiseline (npr. mRNA ili nukleinske kiseline koja sadrži mRNA) konstruisane tako da izbegnu urođeni imuni odgovor ćelije u koju ribonukleinska kiselina ulazi. Ribonukleinska kiselina uglavnom uključuje nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid od interesa.

[0468] U nekim slučajevima, kompozicije se daju ljudima, humanim pacijentima ili subjektima. Za potrebe ovog prikaza, izraz "aktivni sastojak" se generalno odnosi na modifikovanu nukleinsku kiselinu, poboljšanu nukleinsku kiselinu ili ribonukleinsku kiselinu koja se isporučuje kao što je ovde opisano.

[0469] Iako su opisi farmaceutskih kompozicija dati ovde uglavnom usmereni na farmaceutske kompozicije koje su pogodne za davanje ljudima, kvalifikovani stručnjak će razumeti da su takve kompozicije generalno pogodne za davanje bilo kojoj drugoj životinji, npr. životinjama koje nisu ljudi, npr. sisarima izuzev ljudi. Modifikovanje farmaceutskih kompozicija pogodnih za davanje ljudima tako da te kompozicije budu pogodne za davanje različitim životinjama je dobro shvaćeno, i veterinarski farmakolog sa uobičajenim kvalifikacijama može da dizajnira i/ili izvrši takvu modifikaciju na osnovu uobičajenog, ako ikakvog, eksperimentisanja. Subjekti kod kojih se razmatra primena farmaceutskih kompozicija uključuju, ali nisu ograničeni na, ljude i/ili druge primate; sisare, uključujući komercijalno relevantne sisare kao što su goveda, svinje, konji, ovce, mačke, psi, miševi i/ili pacovi; i/ili ptice, uključujući komercijalno relevantne ptice kao što je živina, kokoške, patke, guske i/ili ćurke.

[0470] Formulacije ovde opisanih farmaceutskih kompozicija mogu da budu pripremljene bilo kojim postupkom koji je poznat ili naknadno razvijen u farmakologiji. Uopšteno, takvi preparativni postupci obuhvataju korak dovođenja aktivnog sastojka u vezu sa ekscipijensom i/ili jednim ili više drugih pomoćnih sastojaka, a zatim, ako je potrebno i/ili poželjno, podele, oblikovanja i/ili pakovanja proizvoda u željenu jednodoznu ili višedoznu jedinicu.

[0471] Farmaceutska kompozicija u skladu sa prikazom može da bude pripremljena, upakovana i/ili prodata u balku, kao pojedinačna jedinična doza, i/ili kao više jediničnih doza. Kako se ovde koristi, "jedinična doza" je diskretna količina farmaceutske kompozicije koja sadrži unapred

42

određenu količinu aktivnog sastojka. Količina aktivnog sastojka je uopšteno jednaka dozi aktivnog sastojka koja bi se dala subjektu i/ili pogodnom delu takve doze kao što je, na primer, polovina ili trećina takve doze.

[0472] Relativne količine aktivnog sastojka, farmaceutski prihvatljivog ekscipijensa i/ili bilo kojih dodatnih sastojaka u farmaceutskoj kompoziciji u skladu sa prikazom će varirati, u zavisnosti od identiteta, veličine i/ili stanja subjekta koji se leči i dalje u zavisnosti od načina na koji se kompozicija primenjuje. Kao primer, kompozicija može sadržati između 0.1% i 100%, na primer, između 0.5 i 50%, između 1-30%, između 5-80%, najmanje 80% (tež./tež.) aktivnog sastojka.

Formulacije

[0473] Polinukleotidi, modifikovana nukleinska kiselina, poboljšana modifikovana RNK i ribonukleinska kiselina prema prikazu mogu da se formulišu korišćenjem jednog ili više ekscipijenasa za: (1) povećanje stabilnosti; (2) povećanje transfekcije ćelija; (3) omogućavanje produženog ili odloženog oslobađanja (npr. iz depo formulacije modifikovanih nukleinskih kiselina, poboljšane modifikovane RNK ili ribonukleinskih kiselina); (4) menjanje biološke raspodele (npr. usmeravanje modifikovanih nukleinskih kiselina, poboljšane modifikovane RNK ili ribonukleinskih kiselina na specifična tkiva ili tipove ćelija); (5) povećanje translacije kodiranog proteina in vivo; i/ili (6) promenu profila oslobađanja kodiranog proteina in vivo. Pored tradicionalnih ekscipijenasa, kao što su bilo koji i svi rastvarači, disperzioni medijumi, razblaživači ili drugi tečni nosači, pomoćna sredstva za dispergovanje ili suspendovanje, površinski aktivni agensi, izotonični agensi, sredstva za zgušnjavanje ili emulgovanje, konzervansi, ekscipijensi prema predmetnom prikazu mogu da uključuju, bez ograničenja, lipidoide, lipozome, lipidne nanočestice, polimere, lipoplekse, nanočestice jezgra-omotači, peptide, proteine, ćelije transfektovane polinukleotidima, modifikovanu nukleinsku kiselinu, poboljšanu modifikovanu RNK i ribonukleinsku kiselinu (npr., za transplantaciju u subjekata), hijaluronidazu, mimike nanočestica i njihove kombinacije.

[0474] Prema tome, formulacije prikaza mogu da uključuju jedan ili više ekscipijenasa, svaki u količini koja zajedno povećava stabilnost polinukleotida, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšane modifikovane RNK ili ribonukleinske kiseline, povećava ćelijsku transfekciju polinukleotidima, modifikovanom nukleinskom kiselinom, poboljšanom modifikovanom RNK ili ribonukleinskom kiselinom, povećava ekspresiju proteina kodiranog polinukleotidima, modifikovanom nukleinskom kiselinom, poboljšanom modifikovanom RNK ili ribonukleinskom kiselinom, i/ili menja profil oslobađanja proteina kodiranih polinukleotidima, modifikovanom nukleinskom kiselinom, poboljšanom modifikovanom RNK ili ribonukleinskom kiselinom. Dalje,

42

polinukleotidi, modifikovana nukleinska kiselina, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinska kiselina predmetnog prikaza mogu da budu formulisani korišćenjem nanočestica nukleinske kiseline koje se same sklapaju.

[0475] Formulacije ovde opisanih farmaceutskih kompozicija mogu da budu pripremljene bilo kojim postupkom koji je poznat ili naknadno razvijen u oblasti farmakologije. Uopšteno, takvi preparativni postupci uključuju korak povezivanja aktivnog sastojka sa ekscipijensom i/ili jednim ili više drugih pomoćnih sastojaka.

[0476] Polinukleotidi, modifikovana nukleinska kiselina, poboljšana modifikovana RNK i ribonukleinska kiselina prema prikazu mogu da budu formulisani za isporuku u tkiva i/ili organe subjekta. Organi mogu da uključuju, ali nisu ograničeni na, srce, pluća, mozak, jetru, bazalne ganglije, medulu moždanog stabla, srednji mozak, pons, mali mozak, cerebralni korteks, hipotalamus, oko, hipofizu, štitnu žlezdu, paratiroidnu žlezdu, jednjak, timus, nadbubrežne žlezde, slepo crevo, bešiku, žučnu kesu, creva (npr. debelo i tanko crevo), bubrege, pankreas, slezinu, stomak, kožu, prostatu, testise, jajnike, matericu, nadbubrežne žlezde, anus, bronhije, uši, jednjak, genitalije, larinks (grkljan), limfne čvorove, moždane ovojnice, usta, nos, paratiroidne žlezde, hipofizu, rektum, pljuvačne žlezde, kičmenu moždinu, timusnu žlezdu, jezik, dušnik, uretere, uretru, debelo crevo. Tkiva mogu da uključuju, ali nisu ograničena na, srčane zaliske, kost, venu, srednje uvo, mišiće (srčane, glatke ili skeletne), hrskavicu, tetivu ili ligamente. Kao neograničavajući primer, polinukleotidi, modifikovana nukleinska kiselina, poboljšana modifikovana RNK i ribonukleinska kiselina mogu da budu formulisani u lipidnoj nanočestici i isporučeni u organ kao što je, ali bez ograničenja, u jetru, slezinu, bubreg ili pluća. U drugom neograničavajućem primeru, polinukleotidi, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK i ribonukleinska kiselina mogu da se formulišu u lipidnoj nanočestici koja sadrži katjonski lipid DLin-KC2-DMA i isporuče u organ kao što je, ali bez ograničenja, jetra, slezina, bubreg ili pluća.

[0477] Farmaceutska kompozicija u skladu sa ovim prikazom može da bude pripremljena, upakovana i/ili prodata u balku, kao pojedinačna jedinična doza, i/ili kao više jediničnih doza. Kako se ovde koristi, "jedinična doza" se odnosi na diskretnu količinu farmaceutske kompozicije koja sadrži unapred određenu količinu aktivnog sastojka. Količina aktivnog sastojka uopšteno može da bude jednaka dozi aktivnog sastojka koja bi bila primenjena kod subjekta i/ili pogodnom delu takve doze uključujući, ali ne ograničavajući se na, polovinu ili trećinu takve doze.

[0478] Relativne količine aktivnog sastojka, farmaceutski prihvatljivog ekscipijensa i/ili bilo kojih dodatnih sastojaka u farmaceutskoj kompoziciji u skladu sa ovim prikazom mogu da variraju, u zavisnosti od identiteta, veličine i/ili stanja subjekta koji se leči, i dalje u zavisnosti od puta kojim

42

se kompozicija primenjuje. Na primer, kompozicija može da sadrži između 0.1% i 99% (tež./tež.) aktivnog sastojka.

[0479] U nekim slučajevima, ovde opisane formulacije modifikovane mRNA mogu da sadrže najmanje jednu modifikovanu mRNA. Formulacije mogu da sadrže 1, 2, 3, 4 ili 5 modifikovanih mRNA. U jednom slučaju formulacija može da sadrži modifikovanu mRNA koja kodira proteine odabrane iz kategorija kao što su, ali bez ograničenja, humani proteini, veterinarski proteini, bakterijski proteini, biološki proteini, antitela, imunogeni proteini, terapeutski peptidi i proteini, izlučeni proteini, proteini plazma membrane , citoplazmatski i citoskeletni proteini, intracelularni proteini vezani za membranu, proteini jedra, proteini povezani sa humanim bolestima i/ili proteini povezani sa bolestima koje nisu humane. U jednom slučaju, formulacija sadrži najmanje tri modifikovane mRNA koje kodiraju proteine. U jednom slučaju, formulacija sadrži najmanje pet modifikovanih mRNA koje kodiraju proteine.

[0480] Farmaceutske formulacije mogu dodatno da sadrže farmaceutski prihvatljiv ekscipijens, koji, kako se ovde koristi, uključuje, ali nije ograničen na, bilo koji i sve rastvarače, disperzione medijume, razblaživače ili druge tečne nosače, pomoćne supstance za dispergovanje ili suspendovanje, površinski aktivne agense, izotonične agense, agense za zgušnjavanje ili emulgatore, konzervanse i slično, kako je pogodno za određeni željeni oblik doze. Različiti ekscipijensi za formulisanje farmaceutskih kompozicija i tehnike za pripremu kompozicije su poznati u tehnici (videti Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21. izdanje, A. R. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006). Upotreba konvencionalnog ekscipijensnog medijuma može da se razmatra, osim u onoj meri u kojoj bilo koji konvencionalni ekscipijensni medijum može da bude nekompatibilan sa supstancom ili njenim derivatima, kao što je stvaranje bilo kakvog neželjenog biološkog efekta ili drugačija interakcija na štetan način sa bilo kojom drugom komponentom/komponentama farmaceutske kompozicije.

[0481] U nekim slučajevima, veličina čestica lipidnih nanočestica može da bude povećana i/ili smanjena. Promena veličine čestica može da pomogne u suzbijanju bioloških reakcija kao što je, ali bez ograničenja, zapaljenje, ili može da poveća biološki efekat modifikovane mRNA isporučene u telo sisara.

[0482] Farmaceutski prihvatljivi ekscipijensi koji se koriste u proizvodnji farmaceutskih kompozicija uključuju, ali nisu ograničeni na, inertne razblaživače, površinski aktivne agense i/ili emulgatore, konzervanse, puferske agense, agense za podmazivanje i/ili ulja. Takvi ekscipijensi mogu opciono da budu uključeni u farmaceutske formulacije prikaza.

Lipidoid

42

[0483] Sinteza lipidoida je opširno opisana i formulacije koje sadrže ova jedinjenja su posebno pogodne za isporuku polinukleotida, modifikovanih nukleinskih kiselina, poboljšane modifikovane RNK i ribonukleinskih kiselina (videti Mahon et al., Bioconjug Chem. 2010 21:1448-1454; Schroeder et al., J Intern Med.2010 267:9-21; Akinc et al., Nat Biotechnol. 2008 26:561-569; Love et al., Proc Natl Acad Sci U S A.2010 107:1864-1869; Siegwart et al. al., Proc Natl Acad Sci U S A.2011 108:12996-3001).

[0484] Dok su ovi lipidoidi korišćeni za efikasnu isporuku molekula dvolančanih malih interferirajućih RNK kod glodara i primata izuzev čoveka (videti Akinc et al., Nat Biotechnol.

2008 26:561-569; Frank-Kamenetsky et al., Proc. Natl Acad Sci U S A.2008 105:11915-11920; Akinc et al., Mol Ther. 2009 17:872-879; Love et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 107:1864-1864-1869; Leuschner et al., Nat Biotechnol. 2011 29:1005-1010), predmetni prikaz opisuje njihovu formulaciju i upotrebu u isporuci jednolančanog polinukleotida, modifikovanih nukleinskih kiselina, poboljšane modifikovane RNK i ribonukleinskih kiselina. Mogu da se pripreme kompleksi, micele, lipozomi ili čestice koji sadrže ove lipidoide i stoga mogu da dovedu do efikasne isporuke polinukleotida, modifikovanih nukleinskih kiselina, poboljšane modifikovane RNK i ribonukleinskih kiselina, po proceni na osnovu proizvodnje kodiranog proteina, nakon ubrizgavanja lipidoidne formulacije putem lokalizovanih i/ili sistemskih puteva primene. Lipidoidni kompleksi polinukleotida, modifikovanih nukleinskih kiselina, poboljšane modifikovane RNK i ribonukleinskih kiselina mogu da se primene na različite načine uključujući, ali ne ograničavajući se na intravenske, intramuskularne ili subkutane puteve.

[0485] Na isporuku nukleinskih kiselina in vivo mogu da utiču mnogi parametri, uključujući, ali bez ograničenja, sastav formulacije, prirodu PEGilacije čestica, stepen punjenja, odnos oligonukleotida i lipida i biofizičke parametre kao što je veličina čestica (Akinc et al., Mol Ther.

2009 17:872-879). Na primer, male promene u dužini sidrenog lanca lipida poli(etilen glikola) (PEG) mogu da rezultuju značajnim efektima na efikasnost in vivo. In vivo aktivnost formulacija sa različitim lipidoidima, uključujući, ali ne ograničavajući se na penta[3-(1-laurilaminopropionil)]-trietilentetramin hidrohlorid (TETA-5LAP; aka 98N12-5, videti Murugaiah et al., Analytical Biochemistry, 401:61 (2010)) ), C12-200 (uključujući derivate i varijante) i MD1, može da se ispita.

[0486] Lipidoid koji se ovde pominje kao "98N12-5" su otkrili Akinc et al., Mol Ther. 2009 17:872-879.

[0487] Lipidoid koji se ovde pominje kao "C12-200" su otkrili Love et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2010 107:1864-1869 i Liu and Huang, Molecular Therapy. 2010 669-670. Lipidoidne formulacije mogu da uključuju čestice koje sadrže 3 ili 4, ili više komponenti pored polinukleotida,

4

modifikovanih nukleinskih kiselina, poboljšane modifikovane RNK i ribonukleinskih kiselina. Kao primer, formulacije sa određenim lipidoidima uključuju, ali nisu ograničene na, 98N12-5 i mogu da sadrže 42% lipidoida, 48% holesterola i 10% PEG (alkil lanac dužine C14). Kao drugi primer, formulacije sa određenim lipidoidima uključuju, ali nisu ograničene na, C12-200 i mogu da sadrže 50% lipidoida, 10% disteroilfosfatidil holina, 38.5% holesterola i 1.5% PEG-DMG.

[0488] U jednom slučaju, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline formulisane sa lipidoidom za sistemsku intravensku primenu mogu da budu usmerene na jetru. Na primer, finalna optimizovana intravenska formulacija koja koristi modifikovane nukleinske kiseline, poboljšanu modifikovanu RNK ili ribonukleinske kiseline i koja sadrži molarni sastav lipida od 42% 98N12-5, 48% holesterola i 10% PEG-lipida sa finalnim težinskim odnosom od oko 7.5 prema 1 ukupnog lipida prema polinukleotidu, modifikovanim nukleinskim kiselinama, poboljšanoj modifikovanoj RNK ili ribonukleinskim kiselinama i dužinom alkilnog lanca od C14 na PEG lipidu, sa srednjom veličinom čestica od otprilike 50-60 nm, mogu da dovedu do toga da raspodela formulacije bude veća od 90% u jetri (videti, Akinc et al., Mol Ther.200917:872-879). U drugom primeru, intravenska formulacija u kojoj je upotrebljen lipidoid C12-200 (videti WO2010129709) može da ima molarni odnos od 50/10/38.5/1.5 C12-200/disteroilfosfatidil holin/holesterol/PEG-DMG, sa težinskim odnosom od 7 prema 1 ukupnog lipida prema polinukleotidu, modifikovanim nukleinskim kiselinama, poboljšanoj modifikovanoj RNK ili ribonukleinskim kiselinama, i srednja veličina čestica od 80 nm, može da bude efikasna za isporuku polinukleotida, modifikovanih nukleinskih kiselina, poboljšane modifikovane RNK ili ribonukleinskih kiselina u hepatocite (videti Love et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 107:1864-1869). U drugom slučaju, formulacija koja sadrži lipidoid MD1može da se koristi za efikasnu isporuku polinukleotida, modifikovanih nukleinskih kiselina, poboljšane modifikovane RNK ili ribonukleinskih kiselina u hepatocite in vivo. Karakteristike optimizovanih lipidoidnih formulacija za intramuskularne ili subkutane puteve mogu značajno da variraju u zavisnosti od tipa ciljne ćelije i sposobnosti formulacija da difunduju kroz ekstracelularnu matricu u krvotok. Dok veličina čestica manja od 150 nm može da bude poželjna za efektivnu isporuku u hepatocite zbog veličine endotelnih fenestara (videti, Akinc et al., Mol Ther. 2009 17:872-879), upotreba lipidoidno formulisanih polinukleotida, modifikovanih nukleinskih kiselina, poboljšane modifikovane RNK ili ribonukleinskih kiselina za isporuku formulacije u druge tipove ćelija uključujući, ali ne ograničavajući se na, endotelne ćelije, mijeloidne ćelije i mišićne ćelije možda neće biti na sličan način ograničena veličinom. Prikazana je upotreba lipidoidnih formulacija za isporuku siRNA in vivo u druge ćelije koje nisu hepatociti, kao što su mijeloidne ćelije i endotel (videti Akinc et al., Nat Biotechnol.26:561 - 569; Leuschner et al., Nat Biotechnol.2011. 29:1005-

4 1

1010; Cho et al. Adv. Funct. Mater. 200919:3112-3118; 8th International Judah Folkman Conference, Cambridge, MA, 8-9. oktobar 2010.). Lipidoidne formulacije sa efikasnom isporukom u mijeloidne ćelije, kao što su monociti, mogu da imaju sličan molarni odnos komponenti. Različiti odnosi lipidoida i drugih komponenti uključujući, ali ne ograničavajući se na, disteroilfosfatidil holin, holesterol i PEG-DMG, mogu da se koriste za optimizaciju formulacije polinukleotida, modifikovanih nukleinskih kiselina, poboljšane modifikovane RNK ili ribonukleinskih kiselina za isporuku u različite tipove ćelija uključujući, ali ne ograničavajući se na, hepatocite, mijeloidne ćelije, mišićne ćelije, itd. Na primer, molarni odnos komponenti može da uključuje, ali nije ograničen na, 50% C12-200, 10% disteroilfosfatidil holina, 38.5% holesterola i 1.5% PEG-DMG (videti Leuschner et al., Nat Biotechnol 2011 29:1005-1010). Upotreba lipidoidnih formulacija za lokalizovanu isporuku nukleinskih kiselina u ćelije (kao što su, ali bez ograničenja, masne ćelije i mišićne ćelije) putem subkutane ili intramuskularne isporuke, možda neće zahtevati sve komponente formulacije koje su poželjne za sistemsku isporuku, i kao takve mogu da sadrže samo lipidoid i polinukleotide, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšanu modifikovanu RNK ili ribonukleinske kiseline.

[0489] Kombinacije različitih lipidoida mogu da se koriste za poboljšanje efikasnosti proizvodnje proteina usmerene polinukleotidima, modifikovanim nukleinskim kiselinama, poboljšanom modifikovanom RNK ili ribonukleinskim kiselinama, jer lipidoidi mogu da povećaju transfekciju ćelije polinukleotidima, modifikovanom nukleinskom kiselinom ili modifikovanom nukleinskim kiselinama, poboljšanom modifikovanom RNK ili ribonukleinskim kiselinama; i/ili da povećaju translaciju kodiranog proteina (videti Whitehead et al., Mol. Ther.2011, 19:1688-1694).

Lipozomi, lipopleksi i lipidne nanočestice

[0490] Polinukleotidi, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline prikaza mogu da budu formulisani korišćenjem jednog ili više lipozoma, lipopleksa ili lipidnih nanočestica. U jednom slučaju, farmaceutske kompozicije polinukleotida, modifikovanih nukleinskih kiselina, poboljšane modifikovane RNK ili ribonukleinskih kiselina uključuju lipozome. Lipozomi su veštački pripremljene vezikule koje prvenstveno mogu da budu sačinjene od lipidnog dvosloja i mogu da se koriste kao vehikulum za isporuku hranljivih materija i farmaceutskih formulacija. Lipozomi mogu da budu različitih veličina kao što je, ali bez ograničenja, multilamelarna vezikula ( MLV) koja može da ima stotine nanometara u prečniku i može da sadrži niz koncentričnih dvosloja odvojenih uskim vodenim odeljcima, mala jednoćelijska vezikula (SUV) koja može da bude manja od 50 nm u prečniku i velika jednolamelarna vezikula (LUV) koja može da ima prečnik od između 50 i 500 nm. Dizajn

4 2

lipozoma može da uključuje, ali nije ograničen na, opsonine ili ligande za poboljšanje vezivanja lipozoma za nezdravo tkivo ili za aktiviranje događaja kao što je, ali bez ograničenja, endocitoza. Lipozomi mogu da sadrže nizak ili visok pH kako bi se poboljšala isporuka farmaceutskih formulacija.

[0491] Formiranje lipozoma može da zavisi od fizikohemijskih karakteristika kao što su, ali bez ograničenja, sadržana farmaceutska formulacija i lipozomalni sastojci, priroda medijuma u kome su lipidne vezikule dispergovane, efektivna koncentracija sadržane supstance i njena potencijalna toksičnost, bilo koji dodatne postupci uključeni tokom primene i/ili isporuke vezikula, optimizovana veličina, polidisperznost i vek trajanja vezikula za predviđenu primenu, kao i ponovljivost među serijama i mogućnost proizvodnje industrijskih razmera bezbednih i efikasnih lipozomalnih proizvoda.

[0492] U jednom slučaju, ovde opisane farmaceutske kompozicije mogu da uključuju, bez ograničenja, lipozome kao što su oni formirani od 1,2-dioleiloksi-N,N-dimetilaminopropan (DODMA) lipozoma, DiLa2 lipozoma kompanije Marina Biotech (Bothell, WA), 1,2 -dilinoleiloksi-3-dimetilaminopropan (DLin-DMA), 2,2-dilinoleil-4-(2-dimetilaminoetil)-[1,3]-dioksolan (DLin-KC2-DMA), i MC3 (US20100324120) i lipozome koji mogu isporučuju lekove sa malim molekulima kao što je, ali ne ograničavajući se na, DOXIL<®>kompanije Janssen Biotech, Inc. (Horsham, PA). U jednom slučaju, ovde opisane farmaceutske kompozicije mogu da uključuju, bez ograničenja, lipozome kao što su oni formirani sintezom stabilizovanih plazmidnolipidnih čestica (SPLP) ili stabilizovanih lipidnih čestica nukleinske kiseline (SNALP) koje su prethodno opisane i za koje je pokazano da su pogodne za isporuku oligonukleotida in vitro i in vivo (videti Wheeler et al. Gene Therapy. 1999 6:271-281; Zhang et al. Gene Therapy 1999 6:1438-144/; Jeffs et al. Pharm Res. 2005 22:362-372; Morrissey et al., Nat Biotechnol. 2005 2:1002-100/; Zimmermann et al., Nature. 2006 441: 111-114; Heyes et al. J Contr Rel.

2005107:276-287; Semple i dr. Nature Biotech. 2010 28:1/2-1/6; Judge i dr. J Clin Invest.2009 119:661-673; de-Fougerolles Hum Gene Ther. 2008 19:125-132.) Originalni postupak za proizvodnju autora Wheeler et al. bila je metoda dijalize deterdžentom, koju su kasnije poboljšali Jeffs et al. i naziva se metodom spontanog formiranja vezikula. Formulacije lipozoma su sačinjene od 3 do 4 lipidne komponente pored polinukleotida, modifikovanih nukleinskih kiselina, poboljšane modifikovane RNK ili ribonukleinskih kiselina. Kao primer, lipozom može da sadrži, ali nije ograničen na, 55% holesterola, 20% disteroilfosfatidil holina (DSPC), 10% PEG-S-DSG i 15% 1,2-dioleiloksi-N,N-dimetilaminopropana (DODMA ), kako su opisali Jeffs et al. Kao drugi primer, određene formulacije lipozoma mogu da sadrže, ali nisu ograničene na, 48% holesterola, 20% DSPC, 2% PEG-c-DMA i 30% katjonskog lipida, pri čemu katjonski lipid može da bude 1,2-

4

disteadoksi- N,N-dimetilaminopropan (DSDMA), DODMA, DLin-DMA ili 1,2-dilinoleniloksi-3-dimetilaminopropan (DLenDMA), kako su opisali Heyes et al.

[0493] U jednom slučaju, farmaceutske kompozicije mogu da uključuju lipozome koji mogu da se formiraju za isporuku polinukleotida, modifikovanih nukleinskih kiselina, poboljšane modifikovane RNK i ribonukleinskih kiselina koje mogu da kodiraju najmanje jedan imunogen. Polinukleotidi, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK i ribonukleinske kiseline mogu da budu inkapsulirani u lipozom i/ili mogu da budu sadržani u vodenom jezgru koje zatim može da bude inkapsulirano u lipozom (videti međunarodne objave br. WO2012031046, WO2012031043, WO2012030901 i WO2012006378). U drugom slučaju polinukleotidi, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK i ribonukleinske kiseline koji mogu da kodiraju imunogen mogu da budu formulisani u katjonskoj emulziji ulje u vodi, gde čestica emulzije sadrži uljano jezgro i katjonski lipid koji može da interaguje sa polinukleotidima, modifikovanim nukleinskim kiselinama, poboljšanom modifikovanom RNK i ribonukleinskim kiselinama koji pričvršćuje molekul za česticu emulzije (videti međunarodnu objavu br. WO2012006380). U još jednom slučaju, lipidna formulacija može da uključuje najmanje katjonski lipid, lipid koji može da poboljša transfekciju i najmanje jedan lipid koji sadrži hidrofilnu glavnu grupu povezanu sa lipidnim fragmentom (međunarodna objava br. WO2011076807 i SAD objava br. 20110200582). U drugom slučaju, polinukleotidi, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline koji kodiraju imunogen mogu da budu formulisani u lipidnoj vezikuli koja može da ima poprečne veze između funkcionalizovanih lipidnih dvosloja (videti SAD objava br.20120177724).

[0494] U jednom slučaju, polinukleotidi, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline mogu da se formulišu u lipidnoj vezikuli koja može da ima poprečne veze između funkcionalizovanih lipidnih dvosloja.

[0495] U jednom slučaju, polinukleotidi, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline mogu da budu formulisani u kompleksu lipidpolikatjon. Formiranje kompleksa lipid-polikatjon može da se ostvari postupcima poznatim u tehnici i/ili kako je opisano u SAD objavi br. 20120178702. Kao neograničavajući primer, polikatjon može da uključuje katjonski peptid ili polipeptid kao što su, ali bez ograničenja, polilizin, poliomitin i/ili poliarginin. U drugom slučaju, polinukleotid, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline mogu da budu formulisani u kompleksu lipid-polikatjon koji može dalje da uključuje neutralni lipid kao što je, ali bez ograničenja, holesterol ili dioleoil fosfatidiletanolamin (DOPE).

4 4

[0496] Na formulaciju lipozoma mogu da utiču, ali bez ograničenja, izbor katjonske lipidne komponente, stepen zasićenosti katjonskih lipida, priroda PEGilacije, odnos svih komponenti i biofizički parametri, kao što je veličina. U jednom primeru autora Semple et al. (Semple et al. Nature Biotech. 201028:172-176), formulacija lipozoma je bila sačinjena od 57.1% katjonskog lipida, 7.1% dipalmitoilfosfatidilholina, 34.3% holesterola i 1.4% PEG-c-DMA. Kao drugi primer, promena sastava katjonskog lipida mogla je efikasnije da isporuči siRNA u različite antigenprezentujuće ćelije (Basha et al. Mol Ther.2011 19:2186-2200).

[0497] U nekim slučajevima, udeo PEG u formulacijama LNP može da bude povećan ili smanjen i/ili dužina ugljeničnog lanca PEG lipida može da bude modifikovana sa C14 na C18 da bi se promenila farmakokinetika i/ili biološka raspodela formulacija LNP. Kao neograničavajući primer, formulacije LNP mogu da sadrže 1-5% molarnog odnosa lipida PEG-c-DOMG u poređenju sa katjonskim lipidom, DSPC i holesterolom. U drugom slučaju, PEG-c-DOMG može biti zamenjen PEG lipidom kao što je, ali bez ograničenja, PEG-DSG (1,2-distearoil-sn-glicerol, metoksipolietilen glikol) ili PEG-DPG (1,2-dipalmitoil-sn-glicerol, metoksipolietilen glikol). Katjonski lipid može da bude izabran od bilo kog lipida poznatog u tehnici, kao što je, ali bez ograničenja, DLin-MC3-DMA, DLin-DMA, C12-200 i DLin-KC2-DMA.

[0498] U jednom slučaju, katjonski lipid može da bude odabran od, ali bez ograničenja, katjonskog lipida opisanog u međunarodnim objavama br. WO2012040184, WO2011153120, WO2011149733, WO2011090965, WO2011043913, WO2011022460, WO2012061259, WO2012054365, WO2012044638, WO2010080724, WO201021865 i WO2008103276, SAD patentima br. 7,893,302 i 7,404,969 i SAD patentnim objavama br. US20100036115. U drugom slučaju, katjonski lipid može da bude odabran od, ali bez ograničenja, formule A opisane u međunarodnim objavama br. WO2012040184, WO2011153120, WO2011149733, WO2011090965, WO2011043913, WO2011022460, WO2012061259, WO2012054365 i WO2012044638. U još jednom slučaju, katjonski lipid može da bude odabran od, ali bez ograničenja, formula CLI-CLXXIX iz međunarodne objave br. WO2008103276, formula CLI-CLXXIX iz SAD patenta br.7,893,302, formula CLI-CLXXXXII iz SAD patenta br.7,404,969 i formula I-VI iz SAD patentne objave br. US20100036115. Kao neograničavajući primer, katjonski lipid može da bude odabran od (20Z,23Z)-N,N-dimetilnonakoza-20,23-dien-10-amina, (17Z,20Z)-N,N-dimemilheksakoza-17,20-dien-9-amina, (1Z,19Z)-N5N~dimetilpentakoza~I6, 19-dien-8-amina, (13Z,16Z)-N,N-dimetildokoza-13J16-dien-5-amina, (12Z,15Z)-NJN-dimetilhenikoza-12,15-dien-4-amina, (14Z,17Z)-N,N-dimetiltrikoza-14,17-dien-6-amina, (15Z,18Z)-N,N-dimetiltetrakoza-15,18-dien-7-amina, (18Z,21Z)-N,N-dimetilheptakoza-18,21-dien-10-amina, (15Z,18Z)-N,N-dimetiltetrakoza-15,18-dien-5-amina, (14Z,17Z)-N,N-

4

dimetiltrikoza-14,17-dien-4-amina, (19Z,22Z)-N,N-dimeihiloktakoza-19,22-dien-9-amina, (18Z,21Z)-N,N-dimetilheptakoza-18,21-dien-8-amina, (17Z,20Z)-N,N-dimetilheksakoza-17,20-dien-7-amina, (16Z;19Z)-N,N-dimetilpentakoza-16,19-dien-6-amina, (22Z,25Z)-N,N-dimetilhentriakonta-22,25-dien-10-amina, (21Z,24Z)-N,N-dimetiltriakonta-21,24-dien-9-amina, (18Z)-N,N-dimetilheptakos-18-en-10-amina, (17Z)-N,N-dimetilheksakos-17-en-9-amina, (19Z,22Z)-NJN-dimetiloktakoza-19,22-dien-7-amina, N,N-dimetilheptakozan-10-amina, (20Z,23Z)-N-etil-N-metilnonakoza-20J23-dien-l0-amina, 1-[(1IZ,14Z)-I-nonilikoza-I1,14-dien-I-il] pirolidina, (20Z)-N,N-dimetilheptakos-20-en-I0-amina, (15Z)-N,N-dimetil eptakos-15-en-I0-amina, (14Z)-N,N-dimetilnonakos-14-en-I0-amina, (17Z)-N,N-dimetilnonakos-17-en-I0-amina, (24Z)-N,N-dimetiltritriakont-24-en-I0-amina, (20Z)-N,N-dimetilnonakos-20-en-I0-amina, (22Z)-N,N-dimetilhentriakont-22-en-I0-amina, (16Z)-N,N-dimetilpentakos-16-en-8-amina, (12Z,15Z)-N,N-dimetil-2-nonilhenikoza-12,15-dien-1-amina, (13Z,16Z)-N,N-dimetil-3-nonildokoza-I3,16-dien-I-amina, N,N-dimetil-I-[(IS,2R)-2-oktilciklopropil] eptadekan-8-amina, 1-[(1S,2R)-2-heksilciklopropil]-N,N-dimetilnonadekan-10-amina, N,N-dimetil-1-[(1S,2R)-2-oktilciklopropil]nonadekan-10-amina, N,N-dimetil-21~[(IS,2R)-2-oktilciklopropiljhenikozan-I0-amina, N,N-dimetil-1-[(1S,2S)-2-{[(IR,2R)-2-pentilciklopropil]metil} ciklopropil]nonadekan-10-amina, N,N-dimetil-1-[(1S,2R)-2-oktilciklopropil]heksadekan-8-amina, N,N-dimetil-I-[(IR,2S)-2-undecilciklopropil]tetradekan-5-amina, N,N-dimetil-3-{7-[(1S,2R)-2-oktilciklopropil]heptil} dodekan-1-amina, 1-[(1R,2S)-2-heptilciklopropi 1] -N,N-dimetiloktadekan-9-amina, 1-[(1S,2R)-2-decilciklopropil]-N,N-dimetilpentadekan-6-amina, N,N-dimetil-I-[(IS,2R)-2-oktilciklopropil]pentadekan-8-amina, R-N,N-dimetil-1-[(9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-iloksi]-3-(oktiloksi)propan-2-amina, S-N,N-dimetil-1-[(9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-iloksi]-3-(oktiloksi)propan-2-amina, 1-{2-[(9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-iloksil-1-[(oktiloksi) metil]etil}pirolidina, (2S)-N,N-dimetil-1-[(9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-iloksi]-3-[(5Z)-okt-5-en-1-iloksi]propan-2-amina, 1-{2-[(9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-iloksi]-1-[(oktiloksi) metil]etil}azetidina, (2S)-1-(heksiloksi)-N,N-dimetil-3-[(9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-iloksilpropan-2-amina, (2S)-1-(heptiloksi)-N,N-dimetil-3-[(9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-iloksilpropan-2-amina, N,N-dimetil-1-(noniloksi)-3-[(9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-iloksilpropan-2-amina, N,N-dimetil-1-[(9Z)-oktadec-9-en-1-iloksi]-3-(oktiloksi)propan-2-amina (jedinjenje 9); (2S)-N,N-dimetil-1-[(6Z,9Z,12Z)-oktadeka-6,9,12-trien-1-iloksi]-3-(oktiloksi)propan-2-amina, (2S)-1-[(11Z,14Z)-ikoza-11,14-dien-1-iloksi]-N,N-dimetil-3-(pentiloksi)propan-2-amina, (2S)-1-(heksiloksi)-3-[(11Z,14Z)-ikoza-11,14-dien-1-iloksi]-N,N-dimetilpropan-2-amina, 1-[(11Z,14Z)-ikoza-11,14-dien-1-iloksi]-N,N-dimeti1-3-(oktiloksi)propan-2-amina, 1-[(13Z,16Z)-dokoza-I3,16-dien-I-iloksi-N,N-dimetil-3-

4

(oktiloksi)propan-2-amina, (2S)-1-[(13Z,16Z)-dokoza-13,16-dien-1-iloksi]-3-(heksiloksi)-N,N-dimetilpropan-2-amina, (2S)-1-[(13Z)-dokos-13-en-1-iloksi]-3-(heksiloksi)-N,N-dimetilpropan-2-amina, 1-[(13Z)-dokos-13-en-1-iloksi]-N,N-dimetil-3-(oktiloksi)propan-2-amina, 1-[(9Z)-heksadec-9-en-1-iloksi]-N,N-dimetil-3-(oktiloksi)propan-2-amina, (2R)-N,N-dimetil-H(1-metoiloktil)oksi]-3-[(9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-iloksi]propan-2-amina, (2R)-1-[(3,7-dimetiloktil)oksi]-N,N-dimetil-3-[(9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-iloksi]propan-2-amina, N,N-dimetil-1-(oktiloksi)-3-({8-[(1S,2S)-2-{[(1R,2R)-2-pentilciklopropil]metil}ciklopropil]oktil] oksi)propan-2-amina, N,N-dimetil-1-{[8-(2-oktilciklopropil)oktil]oksi}-3-(oktiloksi)propan-2-amina i (1IE,20Z,23Z)-N;N-dimetilnonakoza-I1,20,2-trien-10-amina ili njihove farmaceutski prihvatljive soli ili stereoizomera.

[0499] U jednom slučaju, katjonski lipid može da bude sintetisan postupcima poznatim u stanju tehnike i/ili kao što je opisano u međunarodnim objavama br. WO2012040184, WO2011153120, WO2011149733, WO2011090965, WO2011043913, WO2011022460, WO2012061259, WO2012054365, WO2012044638, WO2010080724 i WO201021865.

[0500] U jednom slučaju, formulacija LNP može da sadrži 3% lipidnog molarnog udela PEG-c-DOMG. U drugom slučaju, formulacija LNP može da sadrži 1.5% lipidnog molarnog udela PEG-c-DOMG.

[0501] U jednom slučaju, formulacija LNP može da sadrži PEG-DMG 2000 (1,2-dimiristoil-snglicero-3-fosfoetanolamin-N-[metoksi(polietilen glikol)-2000). U jednom slučaju, formulacija LNP može da sadrži PEG-DMG 2000, katjonski lipid poznat u stanju tehnike i najmanje još jednu komponentu. U drugom slučaju, formulacija LNP može da sadrži PEG-DMG 2000, katjonski lipid poznat u stanju tehnike, DSPC i holesterol. Kao neograničavajući primer, formulacija LNP može da sadrži PEG-DMG 2000, DLin-DMA, DSPC i holesterol. Kao još jedan neograničavajući primer, formulacija LNP može da sadrži PEG-DMG 2000, DLin-DMA, DSPC i holesterol u molarnom odnosu od 2:40:10:48 (videti Geall et al., Nonviral delivery of self-amplifying RNA vaccines, PNAS 2012; PMID: 22908294).

[0502] U jednom slučaju, formulacija LNP može da bude formulisana postupcima opisanim u međunarodnim objavama br. WO2011127255 ili WO2008103276. Kao neograničavajući primer, ovde opisana modifikovana RNK može da bude inkapsulirana u formulacijama LNP kao što je opisano u WO2011127255 i/ili WO2008103276.

[0503] U jednom slučaju, ovde opisane formulacije LNP mogu sa sadrže polikatjonsku kompoziciju. Kao neograničavajući primer, polikatjonska kompozicija može da bude odabrana od formula 1-60 iz SAD patentne objave br. US20050222064. U drugom slučaju, formulacije LNP

4

koje sadrže polikatjonsku kompoziciju mogu da se koriste za isporuku ovde opisane modifikovane RNK in vivo i/ili in vitro.

[0504] U jednom slučaju, ovde opisane formulacije LNP mogu dodatno da sadrže molekul koji poboljšava permeabilnost. Neograničavajući primeri molekula koji poboljšavaju permeabilnost opisani su u SAD patentnoj objavi br. US20050222064.

[0505] U jednom slučaju, farmaceutske kompozicije mogu da budu formulisane u lipozomima, kao što su, ali bez ograničenja, lipozomi DiLa2 (Marina Biotech, Bothell, WA), SMARTICLES<®>(Marina Biotech, Bothell, WA), lipozomi na bazi neutralnog DOPC (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoholin) (npr., isporuka siRNA kod kancera jajnika (Landen et al. Cancer Biology & Therapy 2006 5(12)1708-1713)) i lipozomi obloženi hijaluronanom (Quiet Therapeutics, Israel).

[0506] Formulacije lipidnih nanočestica mogu da se poboljšaju zamenom katjonskog lipida biorazgradivim katjonskim lipidom koji je poznat kao lipidna nanočestica koja se brzo eliminiše (reLNP). Pokazalo se da se katjonski lipidi koji mogu da se jonizuju, kao što su, ali bez ograničenja, DLinDMA, DLin-KC2-DMA i DLin-MC3-DMA, akumuliraju u tkivima plazme tokom vremena i mogu da budu potencijalni izvor toksičnosti. Brzi metabolizam lipida koji se brzo eliminišu može da poboljša podnošljivost i terapeutski indeks lipidnih nanočestica za red veličine od doze od 1 mg/kg do doze od 10 mg/kg kod pacova. Uključivanje estarske veze koja može enzimski da se razgradi može da poboljša profil degradacije i metabolizma katjonske komponente, uz istovremeno održavanje aktivnosti formulacije reLNP. Estarska veza može da bude interno locirana unutar lipidnog lanca ili može da bude terminalno locirana na samom kraju lipidnog lanca. Unutrašnja estarska veza može da zameni bilo koji ugljenik u lancu lipida.

[0507] U jednom slučaju, unutrašnja estarska veza može da se nalazi sa bilo koje strane zasićenog ugljenika. Neograničavajući primeri reLNP uključuju,

[0508] U jednom slučaju, imunski odgovor može da bude izazvan isporukom lipidne nanočestice koja može da uključuje nanovrstu, polimer i imunogen. (SAD objava br. 20120189700 i

4

međunarodna objava br. WO2012099805). Polimer može da inkapsulira nanovrste ili da delimično inkapsulira nanovrste. Imunogen može da bude rekombinantni protein, ovde opisana modifikovana RNK. U jednom slučaju, lipidna nanočestica može da bude formulisana za upotrebu u vakcini na primer, ali bez ograničenja, protiv patogena.

[0509] Lipidne nanočestice mogu da budu konstruisane da menjaju svojstva površine čestica tako da lipidne nanočestice mogu da prodru kroz mukoznu barijeru. Sluz se nalazi na mukoznom tkivu kao što je, ali bez ograničenja, oralno (npr. bukalne i ezofagusne membrane i tkivo krajnika), oftalmološko, gastrointestinalno (npr. želudac, tanko crevo, debelo crevo, kolon, rektum), nazalno, respiratorno (npr. nazalne, faringealne, trahealne i bronhijalne membrane), genitalno (npr. vaginalne, cervikalne i uretralne membrane). Smatra se da su nanočestice veće od 10-200 nm koje su poželjne zbog veće efikasnosti inkapsulacije leka i sposobnosti da obezbede kontinuiranu isporuku širokog spektra lekova prevelike da bi brzo difundovale kroz mukozne barijere. Sluz se kontinuirano sekretuje, izlučuje, odbacuje ili digestira i reciklira, tako da većina zarobljenih čestica može da se ukloni iz tkiva sluzokože u roku od nekoliko sekundi ili u roku od nekoliko sati. Velike polimerne nanočestice (200 nm – 500 nm u prečniku) koje su gusto obložene polietilen glikolom male molekulske težine (PEG) difunduju kroz sluz samo 4 do 6 puta sporije od istih čestica koje difunduju u vodi (Lai et al. PNAS 20071 (5): 1482-487; Lai et al. Adv Drug Deliv Rev. 2009 61 (2): 158-171). Transport nanočestica može da se odredi korišćenjem brzina permeacije i/ili tehnika fluorescentne mikroskopije, uključujući, ali ne ograničavajući se na, oporavak fluorescencije nakon fotoizbeljivanja (FRAP) i praćenje više čestica visoke rezolucije (MPT).

[0510] Lipidna nanočestica konstruisana da prodre kroz sluz može da sadrži polimerni materijal (tj. polimerno jezgro) i/ili konjugat polimer-vitamin i/ili tri-blok kopolimer. Polimerni materijal može da uključuje, ali nije ograničen na, poliamine, polietre, poliamide, poliestere, polikarbamate, poliuree, polikarbonate, poli(stirene), poliimide, polisulfone, poliuretane, poliacetilene, polietilene, polietilenimine, poliizocijanate, poliakrilate, polimetakrilate, poliakrilonitrile i poliarilate. Polimerni materijal može da bude biorazgradiv i/ili biokompatibilan. Neograničavajući primeri specifičnih polimera uključuju poli(kaprolakton)

[0511] (PCL), polimer etilen vinil acetata (EVA), poli(mlečnu kiselinu) (PLA), poli(L-mlečnu kiselinu) (PLLA), poli(glikolnu kiselinu) (PGA), poli(mlečnu kiselinu-ko-glikolnu kiselinu) (PLGA), poli(L-mlečnu kiselinu-ko-glikolnu kiselinu) (PLLGA), poli(D,L-laktid) (PDLA), poli(L-laktid) (PLLA), poli(D,L-laktid-ko-kaprolakton), poli(D,L-laktid-ko-kaprolakton-koglikolid), poli(D,L-laktid-ko-PEO-ko-D,L-laktid), poli(D,L-laktid-ko-PPO-ko-D,L-laktid), polialkil cijanoakralat, poliuretan, poli-L-lizin (PLL), hidroksipropil metakrilat (HPMA), polietilenglikol, poli-L-glutaminsku kiselinu, poli(hidroksi kiseline), polianhidride, poliortoestre,

4

poli(estarske amide), poliamide, poli(estarske etre), polikarbonate, polialkilene, kao što su polietilen i polipropilen, polialkilen glikole, kao što je poli(etilen glikol) (PEG), polialkilen okside (PEO), polialkilen tereftalate, kao što je poli(etilen tereftalat), polivinil alkohole (PVA), polivinil etre, polivinil estre, kao što je poli(vinil acetat), polivinil halogenidi kao što je poli(vinil hlorid) (PVC), polivinilpirolidon, polisiloksane, polistiren (PS), poliuretane, derivatizovane celuloze kao što su alkil celuloze, hidroksialkil celuloze, etri celuloze, estri celuloze, nitro celuloze, hidroksipropilceluloza, karboksimetilceluloza, polimere akrilnih kiselina, kao što su poli(metil(met)akrilat) (PMMA), polifetil(met)akrilat), poli(butil(met)akrilat), poli(izobutil(met)akrilat), poli(heksil(met)akrilat), poli(izodecil(met)akrilat), poli(lauril(met)akrilat), poli(fenil(met)akrilat) poli(metil akrilat), poli(izopropil akrilat), polifizobutil akrilat), poli(oktadecil akrilat) i kopolimeri i njihove smeše, polidioksanon i njegove kopolimere, polihidroksialkanoate, polipropilen fumarat, polioksimetilen, poloksamere, poli(orto)estre, poli(buternu kiselinu), poli(valerinsku kiselinu), poli(laktid-ko-kaprolakton) i trimetilen karbonat, polivinilpirolidon. Lipidna nanočestica može da bude obložena ili povezana sa kopolimerom kao što je, ali bez ograničenja, blok kopolimer, i (poli(etilen glikol))-(poli(propilen oksid))-(poli(etilen glikol)) triblok kopolimer (videti SAD objavu 20120121718 i SAD objavu 20100003337). Kopolimer može da bude polimer koji se generalno smatra bezbednim (GRAS) i formiranje lipidne nanočestice može da bude takvo da se ne stvaraju novi hemijski entiteti. Na primer, lipidna nanočestica može da sadrži poloksamere koji oblažu PLGA nanočestice bez formiranja novih hemijskih entiteta koji su i dalje sposobni da brzo prodru kroz ljudsku sluz (Yang et al. Angew. Chem. Int. Ed.201150:2597-2600).

[0512] Vitamin konjugata polimer-vitamin može da bude vitamin E. Vitaminski deo konjugata može da bude zamenjen drugim pogodnim komponentama kao što su, ali bez ograničenja, vitamin A, vitamin E, drugi vitamini, holesterol, hidrofobni deo, ili hidrofobna komponenta drugih surfaktanata (npr. lanci sterola, masne kiseline, ugljovodonični lanci i lanci alkilen oksida).

[0513] Lipidne nanočestice konstruisane da prodiru kroz sluz mogu da uključuju agense za menjanje površine kao što su, ali bez ograničenja, polinukleotidi, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK, ribonukleinske kiseline, anjonski protein (npr., albumin goveđeg seruma), surfaktanti (npr. katjonski surfaktanti kao što su na primer dimetildioktadecilamonijum bromid), šećeri ili derivati šećera (npr. ciklodekstrin), nukleinske kiseline, polimeri (npr. heparin, polietilen glikol i poloksamer), mukolitički agensi (npr. N-acetilcistein, mugvort, bromelain, papain, klerodendrum, acetilcistein, bromheksin, karbocistein, eprazinon, mesna, ambroksol, sobrerol, domiodol, letostein, stepronin, tiopronin, gelsolin, timozin β4 dornaza alfa, nelteneksin, erdostein) i različite DNaze uključujući rhDNazu. Agens za menjanje površine može

44

da bude ugrađen ili upleten u površinu čestice ili raspoređen (npr. oblaganjem, adsorpcijom, kovalentnim povezivanjem ili drugim postupkom) na površini lipidne nanočestice, (videti SAD objavu 20100215580 i SAD objavu 20080166414).

[0514] Lipidne nanočestice koje prodiru kroz sluz mogu da sadrže najmanje jedan polinukleotid, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšanu modifikovanu RNK ili ribonukleinske kiseline opisane ovde. Modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline mogu da budu inkapsulirane u lipidnu nanočesticu i/ili raspoređene na površini čestice. Polinukleotid, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline mogu da budu kovalentno vezani za lipidne nanočestice. Formulacije lipidnih nanočestica koje prodiru kroz sluz mogu da sadrže više nanočestica. Dalje, formulacije mogu da sadrže čestice koje mogu da stupaju u interakciju sa sluzi i da promene strukturna i/ili adhezivna svojstva okolne sluzi kako bi se smanjila mukoadhezija što može da poveća isporuku lipidnih nanočestica koje prodiru kroz sluz u mukozno tkivo.

[0515] U jednom slučaju, polinukleotid, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline su formulisani kao lipopleks, kao što je, bez ograničenja, sistem ATUPLEX<™>, sistem DACC, sistem DBTC i druge tehnologije siRNA-lipopleks kompanije Silence Therapeutics (London, Ujedinjeno kraljevstvo), STEMFECT<™>kompanije STEMGENT<®>(Cambridge, MA), i polietilenimin (PEI) ili usmerena i neusmerena isporuka nukleinskih kiselina na bazi protamina (Aleku et al. Cancer Res. 2008 68:9788-9798; Strumberg et al. Int J Clin Pharmacol Ther 201250:76-78; Santel et al., Gene Ther 2006 13:1222-1234; Santel et al., Gene Ther 200613: 1360-1370; Gutbier et al., Pulm Pharmacol. Ther. 2010 23:334-344; Kaufmann et al. Microvasc Res 2010 80:286-293Weide et al. J Immunother. 2009 32:498-507; Weide et al. J Immunother. 2008 31:180-188; Pascolo Expert Opin. Biol. Ther. 4:1285-1294; Fotin-Mleczek et al., 2011 J. Immunother. 34:1-15; Song et al., Nature Biotechnol. 2005, 23:709-717; Peer et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 6;104:4095-4100; deFougerolles Hum Gene Ther.2008 19:125-132).

[0516] U jednom slučaju takve formulacije mogu takođe da budu konstruisane ili kompozicije izmenjene tako da se pasivno ili aktivno usmeravaju na različite tipove ćelija in vivo, uključujući, ali bez ograničenja hepatocite, imunske ćelije, tumorske ćelije, endotelne ćelije, antigenprezentujuće ćelije i leukocite (Akinc et al. Mol Ther. 2010 18:1357-1364; Song et al., Nat Biotechnol. 2005 23:709-717, Judge et al., J Clin Invest. 2009 119:661-673; Kaufmann et al., Microvasc Res 201080:286-293; Santel et al., Gene Ther200613:1222-1234; Santel et al., Gene Ther 200613:1360-1370; Gutbier et al., Pulm Pharmacol. Ther. 2010 23:334-344; Basha et al., Mol. Ther. 201119:2186-2200; Fenske and Cullis, Expert Opin Drug Deliv. 20085:25-44; Peer et al., Science. 2008 319:627-630; Peer and Lieberman, Gene Ther. 201118:1127-1133). Jedan primer pasivnog usmeravanja formulacija na ćelije jetre uključuje formulacije lipidnih nanočestica na bazi DLin-DMA, DLin-KC2-DMA i MC3 za koje se pokazalo da se vezuju za apolipoprotein E i podstiču vezivanje i preuzimanje ovih formulacija u hepatocite in vivo (Akinc et al. Mol Ther.

2010 18:1357-1364). Formulacije mogu takođe da budu selektivno usmerene putem ekspresije različitih liganda na svojoj površini, kao što je na primer, ali bez ograničenja, folat, transferin, N-acetilgalaktozamin (GalNAc), i pristupi usmeravanja antitelom (Kolhatkar et al., Curr Drug Discov Technol.2011 8:197-206; Musacchio and Torchilin, Front Biosci.2011 16:1388-1412; Yu et al., Mol Membr Biol.2010 27:286-298; Patil et al., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.200825:1-61; Benoit et al., Biomacromolecules. 201112:2708-2714Zhao et al., Expert Opin Drug Deliv.

2008 5:309-319; Akinc et al., Mol Ther.2010 18:1357-1364; Srinivasan et al., Methods Mol Biol.

2012 820:105-116; Ben-Arie et al., Methods Mol Biol. 2012 757:497-507; Peer 2010 J Control Release. 20:63-68; Peer et al., Proc Natl Acad Sci USA.2007104:4095-4100; Kim et al., Methods Mol Biol.2011 721:339-353; Subramanya et al., Mol Ther.2010 18:2028-2037; Song et al., Nat Biotechnol. 2005 23:709-717; Peer et al., Science.2008 319:627-630; Peer and Lieberman, Gene Ther. 201118:1127-1133).

[0517] U jednom slučaju, polinukleotid, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline su formulisani kao čvrsta lipidna nanočestica. Čvrsta lipidna nanočestica (SLN) može da bude sferna sa prosečnim prečnikom između 10 i 1000 nm. SLN poseduje čvrstu matricu lipidnog jezgra koja može da rastvori lipofilne molekule i može da se stabilizuje surfaktantima i/ili emulgatorima. U daljem slučaju, lipidna nanočestica može da bude samosklapajuća nanočestica lipida-polimera (videti Zhang et al., ACS Nano, 2008, 2 (8), str.

1696-1702).

[0518] Lipozomi, lipopleksi ili lipidne nanočestice mogu da se upotrebe za poboljšanje efikasnosti proizvodnje proteina usmerene polinukleotidom, modifikovanim nukleinskim kiselinama, poboljšanom modifikovanom RNK ili ribonukleinskim kiselinama, jer ove formulacije mogu da povećaju transfekciju ćelije pomoću polinukleotida, modifikovanih nukleinskih kiselina, poboljšane modifikovane RNK ili ribonukleinskih kiselina; i/ili da povećaju translaciju kodiranog proteina. Jedan takav primer uključuje upotrebu inkapsulacije lipida da bi se omogućila efikasna sistemska isporuka polipleksa plazmidne DNK (Heyes et al., Mol Ther. 2007 15:713-720). Lipozomi, lipopleksi ili lipidne nanočestice takođe mogu da se upotrebe za povećanje stabilnosti polinukleotida, modifikovanih nukleinskih kiselina, poboljšane modifikovane RNK ili ribonukleinskih kiselina.

[0519] U jednom slučaju, polinukleotid, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline ovog prikaza mogu da budu formulisani za kontrolisano oslobađanje i/ili usmerenu isporuku. Kako se ovde koristi, "kontrolisano oslobađanje" se odnosi na profil oslobađanja farmaceutske kompozicije ili jedinjenja koji je u skladu sa određenim obrascem oslobađanja da bi se postigao terapeutski ishod. U jednom slučaju, polinukleotid, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline mogu da budu inkapsulirani u sredstvo za isporuku koje je ovde opisano i/ili poznato u tehnici za kontrolisano oslobađanje i/ili usmerenu isporuku. Kako se ovde koristi, izraz "inkapsulirati" znači zatvoriti, okružiti ili obložiti. Kako se odnosi na formulaciju jedinjenja prikaza, inkapsulacija može biti suštinska, potpuna ili delimična. Termin "suštinski inkapsuliran" znači da najmanje više od 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.9, 99.9 ili više od 99.999% farmaceutske kompozicije ili jedinjenja prikaza može da bude zatvoreno, okruženo ili obloženo agensom za isporuku. "Delimična inkapsulacija" znači da manje od 10, 10, 20, 30, 40, 50 ili manje farmaceutske kompozicije ili jedinjenja ovog prikaza može da bude zatvoreno, okruženo ili obloženo agensom za isporuku. Povoljno, inkapsulacija može da se odredi merenjem ispuštanja ili aktivnosti farmaceutske kompozicije ili jedinjenja prema prikazu korišćenjem fluorescencije i/ili elektronske mikrografije. Na primer, najmanje 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.9, 99.99 ili više od 99.99% farmaceutske kompozicije ili jedinjenje prema prikazu su inkapsulirani u agensu za isporuku.

[0520] U drugom slučaju, polinukleotidi, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline mogu da budu inkapsulirani u lipidnu nanočesticu ili lipidnu nanočesticu koja se brzo eliminiše, a lipidne nanočestice ili lipidna nanočestica koja se brzo eliminiše mogu zatim da budu inkapsulirane u polimer, hidrogel i/ili hirurški zaptivač koji je ovde opisan i/ili poznat u tehnici. Kao neograničavajući primer, polimer, hidrogel ili hirurški zaptivač može da bude PLGA, etilen vinil acetat (EVAc), poloksamer, GELSITE<®>(Nanotherapeutics, Inc. Alachua, FL), HYLENEX<®>(Halozyme Therapeutics, San Dijego CA), hirurški zaptivači kao što su polimeri fibrinogena (Ethicon Inc. Cornelia, GA), TISSELL<®>(Baxter International, Inc Deerfield, IL), zaptivači na bazi PEG i COSEAL<®>(Baxter International, Inc Deerfield, IL).

[0521] U jednom slučaju, lipidna nanočestica može da bude inkapsulirana u bilo koji polimer ili hidrogel poznat u tehnici koji može da formira gel kada se ubrizga u subjekta. Kao još jedan neograničavajući primer, lipidna nanočestica može da bude inkapsulirana u polimernu matricu koja može da bude biorazgradiva.

44

[0522] U jednom slučaju, formulacija polinukleotida, modifikovanih nukleinskih kiselina, poboljšane modifikovane RNK ili ribonukleinskih kiselina za kontrolisano oslobađanje i/ili usmerenu isporuku može takođe da sadrži najmanje jednu oblogu za kontrolisano oslobađanje. Obloge za kontrolisano oslobađanje uključuju, ali nisu ograničene na, OPADRY<®>, kopolimer polivinilpirolidon/vinil acetat, polivinilpirolidon, hidroksipropil metilcelulozu, hidroksipropil celulozu, hidroksietil celulozu, EUDRAGIT RL<®>, EUDRAGIT RS<®>i derivate celuloze kao što su vodene disperzije etilceluloze AQUACOAT<®>i SURELEASE<®>).

[0523] U jednom slučaju, formulacija za kontrolisano oslobađanje i/ili usmerenu isporuku može da sadrži najmanje jedan razgradivi poliestar koji može da sadrži polikatjonske bočne lance. Razgradivi poliestri uključuju, ali nisu ograničeni na, poli(serinski estar), poli(L-laktid-ko-L-lizin), poli(4-hidroksi-L-prolin estar) i njihove kombinacije. U drugom slučaju, razgradivi poliesteri mogu da uključuju PEG konjugaciju da bi se formirao PEGilovani polimer.

[0524] U jednom slučaju, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline predmetnog prikaza mogu da budu inkapsulirani u terapeutsku nanočesticu. Terapeutske nanočestice mogu da budu formulisane postupcima koji su ovde opisani i poznati u stanju tehnike kao što su, ali bez ograničenja, međunarodne objave br. WO2010005740, WO2010030763, WO2010005721, WO2010005723, WO2012054923, SAD objave br. US20110262491, US20100104645, US20100087337, US20100068285, US20110274759, US20100068286, i SAD pat. br.8,206,747. U drugom slučaju, terapeutske polimerne nanočestice mogu da se identifikuju postupcima opisanim u SAD objavi br. US20120140790.

[0525] U jednom slučaju, terapeutska nanočestica može da bude formulisana za produženo oslobađanje. Kako se ovde koristi, "produženo oslobađanje" se odnosi na profil oslobađanja farmaceutske kompozicije ili jedinjenja koji odgovara brzini oslobađanja tokom određenog vremenskog perioda. Vremenski period može da uključuje, ali nije ograničen na, sate, dane, nedelje, mesece i godine. Kao neograničavajući primer, nanočestica sa produženim oslobađanjem može da sadrži polimer i terapeutski agens kao što su, ali bez ograničenja, polinukleotidi, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline predmetnog prikaza (videti međunarodnu objavu br. 2010075072 i SAD objave br. US20100216804 i US20110217377).

[0526] U jednom slučaju, terapeutske nanočestice mogu da budu formulisane tako da budu specifične za ciljni molekul. Kao neograničavajući primer, terapeutske nanočestice mogu da uključuju kortikosteroid (videti međunarodnu objavu br. WO2011084518). U jednom slučaju, terapeutske nanočestice mogu da budu formulisane tako da budu specifične za kancer. Kao neograničavajući primer, terapeutske nanočestice mogu da budu formulisane u nanočesticama opisanim u međunarodnoj objavi br. WO2008121949, WO2010005726, WO2010005725, WO2011084521 i SAD objavi br. US20100069426, US20120004293 i US20100104655.

[0527] U jednom slučaju, nanočestice ovog pronalaska mogu da sadrže polimernu matricu. Kao neograničavajući primer, nanočestica može da sadrži dva ili više polimera kao što su, ali bez ograničenja, polietileni, polikarbonati, polianhidridi, polihidroksikiseline, polipropilfumerati, polikaprolaktoni, poliamidi, poliacetali, polieteri, poliestari, poli(ortoestri), policijanoakrilati, polivinil alkoholi, poliuretani, polifosfazeni, poliakrilati, polimetakrilati, policijanoakrilati, poliuree, polistireni, poliamini, polilizin, poli(etilen imin), poli(serinski estar), poli(L-laktid-ko-L-lizin), poli(4-hidroksi-L-prolin estar) ili njihove kombinacije.

[0528] U jednom slučaju, diblok kopolimer može da uključuje PEG u kombinaciji sa polimerom kao što su, ali bez ograničenja, polietileni, polikarbonati, polianhidridi, polihidroksikiseline, polipropilfumerati, polikaprolaktoni, poliamidi, poliacetali, polieteri, poliestari, poli(ortoestri), policijanoakrilati, polivinil alkoholi, poliuretani, polifosfazeni, poliakrilati, polimetakrilati, policijanoakrilati, poliuree, polistireni, poliamini, polilizin, poli(etilen imin), poli(serinski estar), poli(L-laktid-ko-L-lizin), poli(4-hidroksi-L-prolin estar) ili njihove kombinacije.

[0529] U jednom slučaju, terapeutska nanočestica sadrži diblok kopolimer. Kao neograničavajući primer, terapeutska nanočestica sadrži blok kopolimer PLGA-PEG (videti SAD objavu br. US20120004293 i SAD patent br.8,236,330). U drugom neograničavajućem primeru, terapeutska nanočestica je stelt nanočestica koja sadrži diblok kopolimer PEG i PLA ili PEG i PLGA (videti SAD patent br.8,246,968).

[0530] U jednom slučaju, terapeutska nanočestica može da sadrži najmanje jedan akrilni polimer. Akrilni polimeri uključuju, ali nisu ograničeni na, akrilnu kiselinu, metakrilnu kiselinu, kopolimere akrilne kiseline i metakrilne kiseline, kopolimere metil metakrilata, etoksietil metakrilate, cijanoetil metakrilat, kopolimer amino alkil metakrilata, poli(akrilnu kiselinu), (poli(metakrilnu kiselinu), policijanoakrilate i njihove kombinacije.

[0531] U jednom slučaju, terapeutske nanočestice mogu da sadrže najmanje jedan katjonski polimer koji je ovde opisan i/ili poznat u tehnici.

[0532] U jednom slučaju, terapeutske nanočestice mogu da sadrže najmanje jedan polimer koji sadrži amin kao što su, ali bez ograničenja na polilizin, polietilen imin, poli(amidoamin) dendrimeri i njihove kombinacije.

[0533] U jednom slučaju, terapeutske nanočestice mogu da sadrže najmanje jedan razgradivi poliestar koji može da sadrži polikatjonske bočne lance. Razgradivi poliestri uključuju, ali nisu ograničeni na, poli(serinski estar), poli(L-laktid-ko-L-lizin), poli(4-hidroksi-L-prolin estar) i

44

njihove kombinacije. U drugom slučaju, razgradivi poliesteri mogu da uključuju PEG konjugaciju da bi se formirao PEGilovani polimer.

[0534] U drugom slučaju, terapeutska nanočestica može da uključuje konjugaciju najmanje jednog ciljno delujućeg liganda.

[0535] U jednom slučaju, terapeutska nanočestica može da bude formulisana u vodenom rastvoru koji se može koristiti za ciljno delovanje na kancer (videti međunarodnu objavu br. WO2011084513 i SAD objavu br. US20110294717).

[0536] U jednom slučaju, polinukleotidi, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline mogu da budu inkapsulirani u, vezani za i/ili povezani sa sintetičkim nanonosačima. Sintetički nanonosači mogu da budu formulisani postupcima koji su poznati u stanju tehnike i/ili su ovde opisani. Kao neograničavajući primer, sintetički nanonosači mogu da budu formulisani postupcima opisanim u međunarodnim objavama br. WO2010005740, WO2010030763 i SAD objavama br. US20110262491, US20100104645 i US20100087337. U drugom slučaju, formulacije sintetičkih nanonosača mogu da budu liofilizovane postupcima opisanim u međunarodnoj objavi br. WO2011072218 i SAD patentu br.

8,211,473.

[0537] U jednom slučaju, sintetički nanonosači mogu da sadrže reaktivne grupe za oslobađanje modifikovanih nukleinskih kiselina, poboljšane modifikovane RNK ili ribonukleinskih kiselina koje su ovde opisane (videti međunarodnu objavu br. WO20120952552 i SAD objavu br. US20120171229).

[0538] U jednom slučaju, sintetički nanonosači mogu da sadrže imunostimulatorni agens za poboljšanje imunskog odgovora na isporuku sintetičkog nanonosača. Kao neograničavajući primer, sintetički nanonosač može da sadrži Th1 imunostimulatorni agens koji može da poboljša odgovor imunskog sistema zasnovan na Th1 (videti međunarodnu objavu br. WO2010123569 i SAD objavu br. US20110223201).

[0539] U jednom slučaju, sintetički nanonosači mogu da budu formulisani za ciljno oslobađanje. U jednom slučaju, sintetički nanonosač je formulisan da oslobađa polinukleotide, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšanu modifikovanu RNK ili ribonukleinske kiseline na specifičnom pH i/ili nakon željenog vremenskog intervala. Kao neograničavajući primer, sintetička nanočestica može da bude formulisana da oslobađa modifikovane nukleinske kiseline, poboljšanu modifikovanu RNK ili ribonukleinske kiseline posle 24 sata i/ili na pH od 4.5 (videti međunarodne objave br. WO2010138193 i WO2010138194 i SAD objave br. US20110020388 i US20110027217).

44

[0540] U jednom slučaju, sintetički nanonosači mogu da budu formulisani za kontrolisano i/ili produženo oslobađanje ovde opisanih polinukleotida, modifikovanih nukleinskih kiselina, poboljšane modifikovane RNK ili ribonukleinskih kiselina. Kao neograničavajući primer, sintetički nanonosači za produženo oslobađanje mogu da budu formulisani postupcima koji su poznati u stanju tehnike, opisani u ovom dokumentu i/ili opisani u međunarodnoj objavi br. WO2010138192 i SAD objavi br.20100303850.

[0541] U jednom slučaju, sintetički nanonosač može da bude formulisan za upotrebu kao vakcina. U jednom slučaju, sintetički nanonosač može da inkapsulira najmanje jednu modifikovanu nukleinsku kiselinu, poboljšanu modifikovanu RNK ili ribonukleinsku kiselinu koja kodira najmanje jedan antigen. Kao neograničavajući primer, sintetički nanonosač može da uključuje najmanje jedan antigen i ekscipijens za dozni oblik vakcine (videti međunarodnu objavu br. WO2011150264 i SAD objavu br. US20110293723). Kao još jedan neograničavajući primer, dozni oblik vakcine može da uključuje najmanje dva sintetička nanonosača sa istim ili različitim antigenima i ekscipijens (videti međunarodnu objavu br. WO2011150249 i SAD objavu br. US20110293701). Dozni oblik vakcine može da bude odabran postupcima koji su ovde opisani, poznati u stanju tehnike i/ili opisani u međunarodnoj objavi br. WO2011150258 i SAD objavi br. US20120027806).

[0542] U jednom slučaju, sintetički nanonosač može da sadrži najmanje jedan polinukleotid, modifikovanu nukleinsku kiselinu, poboljšanu modifikovanu RNK ili ribonukleinsku kiselinu koja kodira najmanje jedan adjuvans. U drugom slučaju, sintetički nanonosač može da sadrži najmanje jednu modifikovanu nukleinsku kiselinu, poboljšanu modifikovanu RNK ili ribonukleinsku kiselinu i adjuvans. Kao neograničavajući primer, sintetički nanonosač koji sadrži adjuvans može da bude formulisan postupcima opisanim u međunarodnoj objavi br. WO2011150240 i SAD objavi br. US20110293700.

[0543] U jednom slučaju, sintetički nanonosač može da inkapsulira najmanje jedan polinukleotid, modifikovanu nukleinsku kiselinu, poboljšanu modifikovanu RNK ili ribonukleinsku kiselinu koja kodira peptid, fragment ili region virusa. Kao neograničavajući primer, sintetički nanonosač može da uključuje, ali nije ograničen na, nanonosače opisane u međunarodnoj objavi br. WO2012024621, WO201202629, WO2012024632 i SAD objavama br. US20120064110, US20120058153 i US20120058154.

Polimeri, biorazgradive nanočestice i nanočestice jezgro-omotač

44

[0544] Polinukleotidi, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline prema prikazu mogu da budu formulisani upotrebom prirodnog i/ili sintetičkog polimera. Neograničavajući primeri polimera koji se mogu upotrebljavati za isporuku uključuju, ali nisu ograničeni na, formulacije Dynamic POLYCONJUGATE™ kompanije MIRUS<®>Bio (Madison, WI) i Roche Madison (Madison, WI), polimerne formulacije PHASERX™, kao što su, bez ograničavanja, SMARTT POLYMER TECHNOLOGY™ (Seattle, WA), DMRI/DOPE, poloksamer, adjuvans VAXFECTIN<®>kompanije Vical (San Diego, CA), hitozan, ciklodekstrin kompanije Calando Pharmaceuticals (Pasadena, CA), dendrimere i polimere poli(laktična-ko-glikolna kiselina) (PLGA), polimere RONDEL™ (isporuka nanočestica RNAi/oligonukleotid) (Arrowhead Research Corporation, Pasadena, CA) i ko-blok polimere koji odgovaraju na pH, kao što je, ali bez ograničenja, PHASERX™ (Seattle, WA).

[0545] Neograničavajući primeri PLGA formulacija uključuju, ali nisu ograničeni na, PLGA injektabilne depoe (npr. ELIGARD<®>koji se formira rastvaranjem PLGA u 66% N-metil-2-pirolidonu (NMP), a ostatak je vodeni rastvarač i leuprolid. Nakon injektiranja, PLGA i leuprolidni peptid talože se u subkutanom prostoru).

[0546] Mnogi od ovih polimernih pristupa pokazali su efikasnost u isporuci oligonukleotida in vivo u ćelijsku citoplazmu (pregledno prikazano u deFougerolles Hum Gene Ther.2008 19:125-132). Dva polimerna pristupa koja su dala robusnu in vivo isporuku nukleinskih kiselina, u ovom slučaju sa malom interferirajućom RNK (siRNA), su dinamički polikonjugati i nanočestice na bazi ciklodekstrina. Prvi od ovih pristupa isporuke upotrebljava dinamičke polikonjugate i pokazano je in vivo kod miševa da efikasno isporučuje siRNA i utišava endogenu ciljnu mRNA u hepatocitima (Rozema et al., Proc Natl Acad Sci USA 2007 104:12982-12887). Ovaj poseban pristup je višekomponentni polimerni sistem čije ključne osobine uključuju membranski aktivan polimer za koji je nukleinska kiselina, u ovom slučaju siRNA, kovalentno kuplovana putem disulfidne veze i gde su i PEG (za maskiranje naelektrisanja) i grupe N-acetilgalaktozamina (za ciljno delovanje na hepatocit) povezane putem veza osetljivih na pH (Rozema et al., Proc Natl Acad Sci USA 2007 104:12982-12887). Po vezivanju za hepatocit i ulasku u endozom, polimerni kompleks se rasklapa u okruženju sa niskim pH, pri čemu pozitivno naelektrisanje polimera postaje izloženo, što dovodi do otpuštanja iz endozoma i oslobađanja u citoplazmu siRNA iz polimera. Zamenom grupe N-acetilgalaktozamina manoznom grupom, pokazano je da ciljno delovanje može da se preusmeri sa hepatocita koji eksprimiraju asijaloglikoproteinske receptore na sinusoidni endotel i Kupferove ćelije. Sledeći polimerni pristup uključuje upotrebu polikatjonskih nanočestica koje sadrže ciklodekstrin i koje su usmerene na transferin. Ove nanočestice su demonstrirale ciljano utišavanje proizvoda gena EWS-FLI1 gena u tumorskim ćelijama Juingovog sarkoma koje eksprimiraju

44

transferinski receptor (Hu-Lieskovan et al., Cancer Res.200565: 8984-8982) i siRNA formulisana u ovim nanočesticama je ispoljila dobru podnošljivost kod primata izuzev ljudi (Heidel et al., Proc Natl Acad Sci USA 2007104:5715-21). Obe ove strategije isporuke uključuju racionalne pristupe upotrebom oba mehanizama, ciljane isporuke, kao i otpuštanja iz endozoma.

[0547] Polimerna formulacija može da obezbedi produženo ili odloženo oslobađanje polinukleotida, modifikovanih nukleinskih kiselina, poboljšane modifikovane RNK ili ribonukleinskih kiselina (npr., nakon intramuskularne ili subkutane injekcije). Izmenjeni profil oslobađanja polinukleotida, modifikovanih nukleinskih kiselina, poboljšane modifikovane RNK ili ribonukleinskih kiselina može da rezultuje, na primer, translacijom kodiranog proteina tokom produženog vremenskog perioda. Polimerna formulacija takođe može da se upotrebi za povećanje stabilnosti polinukleotida, modifikovanih nukleinskih kiselina, poboljšane modifikovane RNK ili ribonukleinskih kiselina. Biorazgradivi polimeri su prethodno upotrebljavani za zaštitu nukleinskih kiselina različitih od modifikovanih nukleinskih kiselina, poboljšane modifikovane RNK ili ribonukleinskih kiselina od degradacije i pokazano je da rezultuju produženim oslobađanjem opterećenja lekom in vivo (Rozema et al., Proc Natl Acad Sci USA.2007104:12982-12887; Sullivan et al., Expert Opin Drug Deliv. 2010 7:1433-1446; Convertine et al., Biomacromolecules. 2010 Oct 1; Chu et al., Acc Chem Res. 2012 Jan 13; Manganiello et al., Biomaterials. 2012 33:2301-2309; Benoit et al., Biomacromolecules.2011 12:2708-2714; Singha et al., Nucleic Acid Ther. 2011 2:133-147; deFougerolles Hum Gene Ther. 2008 19:125-132; Schaffert and Wagner, Gene Ther. 2008 16:1131-1138; Chaturvedi et al., Expert Opin Drug Deliv. 2011 8:1455-1468; Davis, Mol Pharm. 2009 6:659-668; Davis, Nature 2010 464:1067-1070).

[0548] U jednom slučaju, farmaceutske kompozicije mogu da budu formulacije sa produženim oslobađanjem. U drugom slučaju, formulacije sa produženim oslobađanjem mogu da budu namenjene za subkutanu isporuku. Formulacije sa produženim oslobađanjem mogu da uključuju, ali nisu ograničene na, PLGA mikrosfere, etilen vinil acetat (EVAc), poloksamer, GELSITE<®>(Nanotherapeutics, Inc. Alachua, FL), HYLENEX<®>(Halozyme Therapeutics, San Diego CA), hirurške zaptivače kao što su polimeri fibrinogena (Ethicon Inc. Cornelia, GA), TISSELL<®>(Baxter International, Inc Deerfield, IL), zaptivače na bazi PEG, i COSEAL<®>(Baxter International, Inc Deerfield, IL).

[0549] Kao neograničavajući primer, modifikovana mRNA može da bude formulisana u PLGA mikrosfere pripremanjem PLGA mikrosfera sa podesivim stopama oslobađanja (npr. dani i nedelje) i inkapsuliranjem modifikovane mRNA u PLGA mikrosfere uz održavanje integriteta modifikovane mRNA tokom postupka inkapsulacije. EVAc su biokompatibilni polimeri koji nisu

44

biorazgradivi, koji se uveliko upotrebljavaju u pretkliničkim primenama implantata sa produženim oslobađanjem (npr. proizvodi sa produženim oslobađanjem Ocusert, pilokarpinski oftalmološki umetak za glaukom ili progestasert, intrauterusni uređaj sa produženim oslobađanjem progesterona; sistemi za transdermalnu isporuku Testoderm, Duragesic i Selegiline; kateteri). Poloksamer F-407 NF je hidrofilni, nejonski surfaktantski triblok kopolimer polioksietilenpolioksipropilen-polioksietilena koji ima nisku viskoznost na temperaturama manjim od 5 °C i formira čvrsti gel na temperaturama većim od 15 °C. Hirurški zaptivači na bazi PEG sadrže dve sintetičke PEG komponente pomešane u uređaju za isporuku koji može da se pripremi za jedan minut, zaptiva za 3 minuta i reapsorbuje se unutar 30 dana. GELSITE<®>i prirodni polimeri sposobni su da želiraju in situ na mestu primene. Pokazano je da interaguju sa proteinskim i peptidnim terapeutskim kandidatima preko jonske interakcije kako bi se obezbedio stabilizujući efekat.

[0550] Polimerne formulacije takođe mogu selektivno da se usmere preko ekspresije različitih liganada, kao što su, na primer, ali bez ograničenja, folat, transferin i N-acetilgalaktozamin (GalNAc) (Benoit et al., Biomacromolecules. 2011 12:2708-2714; Rozema et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2007 104:12982-12887; Davis, Mol Pharm. 2009 6:659-668; Davis, Nature 2010 464:1067-1070).

[0551] Polinukleotidi, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline prema prikazu mogu da budu formulisani sa, ili u polimernom jedinjenju. Polimer može da uključuje najmanje jedan polimer kao što su, ali bez ograničenja, polieteni, polietilen glikol (PEG), poli(l-lizin) (PLL), PEG graftovan na PLL, katjonski lipopolimer, biorazgradivi katjonski lipopolimer, polietilenimin (PEI), umreženi razgranati poli(alkilen imini), derivat poliamina, modifikovani poloksamer, biorazgradivi polimer, biorazgradivi blok kopolimer, biorazgradivi nasumični kopolimer, biorazgradivi poliestarski kopolimer, biorazgradivi poliestarski blok kopolimer, biorazgradivi poliestarski blok nasumični kopolimer, linearni biorazgradivi kopolimer, poli[α-(4-aminobutil)-L-glikolna kiselina) (PAGA), biorazgradivi umreženi katjonski multi-blok kopolimeri, polikarbonati, polianhidridi, polihidroksikiseline, polipropilfumerati, polikaprolaktoni, poliamidi, poliacetali, polietri, poliestri, poli(ortoestri), policijanoakrilati, polivinil alkoholi, poliuretani, polifosfazeni, poliakrilati, polimetakrilati, policijanoakrilati, poliuree, polistireni, poliamini, polizin, poli(etilen imin), poli(serin estar), poli(L-laktid-ko-L-lizin), poli(4- hidroksi-L-prolin estar), akrilni polimeri, polimeri koji sadrže amin ili njihove kombinacije.

[0552] Kao neograničavajući primer, polinukleotidi, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline prema prikazu mogu da budu formulisani sa polimernim jedinjenjem PEG graftovanim sa PLL kao što je opisano u SAD patentu

4

br. 6,177,274. Formulacija se može upotrebljavati za transfekciju ćelija in vitro ili za in vivo isporuku polinukleotida, modifikovanih nukleinskih kiselina, poboljšane modifikovane RNK ili ribonukleinskih kiselina. U sledećem primeru, polinukleotidi, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline mogu da budu suspendovani u rastvoru ili medijumu sa katjonskim polimerom, u suvoj farmaceutskoj kompoziciji ili u rastvoru koji može da se osuši, kao što je opisano u SAD objavama br.20090042829 i 20090042825.

[0553] Kao sledeći neograničavajući primer polinukleotidi, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline prema prikazu mogu da budu formulisani sa blok kopolimerom PLGA-PEG (videti SAD objavu br. US20120004293 i SAD patent br. 8,236,330). Kao neograničavajući primer, polinukleotidi, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline prema prikazu mogu da budu formulisani sa diblok kopolimerom PEG i PLA ili PEG i PLGA (videti SAD patent br 8,246,968).

[0554] Derivat poliamina može da se upotrebi za isporuku nukleinskih kiselina ili za lečenje i/ili preveniranje bolesti ili da se uključi u implantabilni ili injektabilni uređaj (SAD objava br.

20100260817). Kao neograničavajući primer, farmaceutska kompozicija može da uključuje modifikovane nukleinske kiseline, poboljšanu modifikovanu RNK ili ribonukleinske kiseline i derivat poliamina opisan u SAD objavi br.20100260817.

[0555] Polinukleotidi, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline prema prikazu mogu da budu formulisani sa najmanje jednim akrilnim polimerom. Akrilni polimeri uključuju, ali nisu ograničeni na, akrilnu kiselinu, metakrilnu kiselinu, kopolimere akrilne kiseline i metakrilne kiseline, kopolimere metil metakrilata, etoksietil metakrilate, cijanoetil metakrilat, kopolimer amino alkil metakrilata, poli(akrilnu kiselinu), poli(metakrilnu kiselinu), policijanoakrilate i njihove kombinacije.

[0556] U jednom slučaju, polinukleotidi, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline predmetnog prikaza mogu da budu formulisani sa najmanje jednim polimerom opisanim u međunarodnim objavama br. WO2011115862, WO2012082574 i WO2012068187. U drugom slučaju, polinukleotidi, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline predmetnog prikaza mogu da budu formulisani sa polimerom formule Z kao što je opisano u WO2011115862. U još jednom slučaju, polinukleotidi, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline mogu da budu formulisani sa polimerom formule Z, Z' ili Z" kao što je opisano u WO2012082574 ili WO2012068187. Polimeri formulisani sa modifikovanom RNK predmetnog prikaza mogu se sintetisati postupcima opisanim u WO2012082574 ili WO2012068187.

4 1

[0557] Formulacije polinukleotida, modifikovanih nukleinskih kiselina, poboljšane modifikovane RNK ili ribonukleinskih kiselina prema prikazu mogu da uključuju najmanje jedan polimer koji sadrži amin, kao što su, ali bez ograničenja, polizin, polietilen imin, poli(amidoamin) dendrimeri ili njihove kombinacije.

[0558] Na primer, polinukleotidi, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline prema prikazu mogu da budu formulisani u farmaceutskom jedinjenju koje uključuje poli(alkilen imin), biorazgradivi katjonski lipopolimer, biorazgradivi blok kopolimer, biorazgradivi polimer, ili biorazgradivi nasumični kopolimer, biorazgradivi poliestarski blok kopolimer, biorazgradivi poliestarski polimer, biorazgradivi poliestarski nasumični kopolimer, linearni biorazgradivi kopolimer, PAGA, biorazgradivi umreženi katjonski multi-blok kopolimer ili njihove kombinacije. Biorazgradivi katjonski lipopolimer može da se napravi pomoću postupaka poznatih u struci i/ili kao što je opisano u SAD patentu br.6,696,038, SAD objavama br.20030073619 i 20040142474. Poli(alkilen imin) može da se napravi upotrebom postupaka poznatih u struci i/ili kao što je opisano u SAD objavi br.20100004315. Biorazgradivi polimer, biorazgradivi blok kopolimer, biorazgradivi nasumični kopolimer, biorazgradivi poliestarski blok kopolimer, biorazgradivi poliestarski polimer, ili biorazgradivi poliestarski nasumični kopolimer mogu se napraviti upotrebom postupaka poznatih u struci i/ili kao što je opisano u SAD patentima br.6,517,869 i 6,267,987. Linearni biorazgradivi kopolimer može da se napravi upotrebom postupaka poznatih u struci i/ili kao što je opisano u SAD patentu br.6,652,886. Polimer PAGA može da se napravi upotrebom postupaka poznatih u struci i/ili kao što je opisano u SAD patentu br.6,217,912. Polimer PAGA može da bude kopolimerizovan da formira kopolimer ili blok kopolimer sa polimerima kao što su, ali bez ograničenja, poli-L-lizin, poliarginin, poliornitin, histoni, avidin, protamini, polilaktidi i poli(laktid-ko-glikolidi). Biorazgradivi umreženi katjonski multi-blok kopolimeri mogu da se naprave pomoću postupaka poznatih u struci i/ili kao što je opisano u SAD patentu br. 8,057,821 ili SAD objavi br.2012009145. Na primer, multi-blok kopolimeri mogu da budu sintetisani upotrebom blokova linearnog polietilenimina (LPEI) koji imaju različite obrasce u poređenju sa razgranatim polietileniminima. Dodatno, kompozicija ili farmaceutska kompozicija mogu da se naprave pomoću postupaka poznatih u struci, opisanih ovde, ili kao što je opisano u SAD objavi br.20100004315 ili SAD patentima br.

6,267,987 i 6,217,912.

[0559] Polinukleotidi, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline prema prikazu mogu da budu formulisani sa najmanje jednim razgradivim poliestrom koji može da sadrži polikatjonske bočne lance. Razgradivi poliestri uključuju, ali nisu ograničeni na, poli(serin estar), poli(L-laktid-ko-L-lizin), poli(4-hidroksi-L-prolin estar), i njihove

4 2

kombinacije. U sledećem slučaju, razgradivi poliestri mogu da uključuju konjugaciju sa PEG da formiraju PEGilovani polimer.

[0560] U jednom slučaju, ovde opisani polimeri mogu da budu konjugovani sa PEG koji se završava lipidom. Kao neograničavajući primer, PLGA može da bude konjugovan sa PEG koji se završava lipidom koji formira PLGA-DSPE-PEG. Kao sledeći neograničavajući primer, PEG konjugati za upotrebu sa ovde otkrivenim predmetom opisani su u međunarodnoj objavi br. WO2008103276.

[0561] U jednom slučaju, ovde opisani polinukleotidi, modifikovana RNK, mogu da budu konjugovani sa drugim jedinjenjem. Neograničavajući primeri konjugata opisani su u SAD patentima br. 7,964,578 i 7,833,992. U drugom slučaju, modifikovana RNK predmetnog prikaza može da bude konjugovana sa konjugatima formule 1-122 kao što je opisano u SAD patentima br.

7,964,578 i 7,833,992.

[0562] Kao što je opisano u SAD objavi br.20100004313, kompozicija za isporuku gena može da uključuje nukleotidnu sekvencu i poloksamer. Na primer, polinukleotid, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline predmetnog pronalaska mogu se upotrebljavati u kompoziciji za isporuku gena sa poloksamerom opisanoj u SAD objavi br.

20100004313.

[0563] U jednom slučaju, polimerna formulacija predmetnog prikaza može da bude stabilizovana dovođenjem u kontakt polimerne formulacije, koja može uključivati katjonski nosač, sa katjonskim lipopolimerom koji može da bude kovalentno vezan za holesterol i grupe polietilen glikola. Polimerna formulacija može da bude dovedena u kontakt sa katjonskim lipopolimerom upotrebom postupaka opisanih u SAD objavi br. 20090042829. Katjonski nosač može da uključuje, ali nije ograničen na polietilenimin, poli(trimetilenimin), poli(tetrametilenimin), polipropilenimin, aminoglikozid-poliamin, didezoksi-diamino-b-ciklodekstrin, spermin, spermidin, poli(2-dimetilamino)etil metakrilat, poli(lizin), poli(histidin), poli(arginin), katjonizovani želatin, dendrimere, hitozan, 1,2-dioleoil-3-trimetilamonijum-propan (DOTAP), N-[1-(2,3-dioleoiloksi)propil]-N,N,N-trimetilamonijum hlorid (DOTMA), 1-[2-(oleoiloksi)etil]-2-oleil-3-(2-hidroksietil)imidazolinijum hlorid (DOTIM), 2,3-dioleiloksi-N-[2(sperminkarboksamido) etil]-N,N-dimetil-1-propanaminiumtrifluoroacetat (DOSPA), 3B-[N-(N',N'-dimetilaminoetan)-karbamoil]holesterol hidrohlorid (DC-holesterol HCl) diheptadecilamidoglicil spermidin (DOGS), N,N-distearil-N,N-dimetilamonijum bromid (DDAB), N-(1,2-dimiristiloksiprop-3-il)-N,N-dimetil-N-hidroksietil amonijum bromid (DMRIE), N,N-dioleil-N,N-dimetilamonijum hlorid DODAC) i njihove kombinacije.

4

[0564] Polinukleotidi, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline prema prikazu mogu takođe da budu formulisani kao nanočestice upotrebom kombinacije polimera, lipida, i/ili drugih biorazgradivih agenasa, kao što je, ali bez ograničenja, kalcijum fosfat. Komponente mogu da budu kombinovane u arhitekturi jezgroomotač, hibrid, i/ili sloj-po-sloj, kako bi se omogućilo fino podešavanje nanočestice tako da isporuka modifikovanih nukleinskih kiselina, poboljšane modifikovane RNK ili ribonukleinskih kiselina može da bude poboljšana (Wang et al, Nat Mater. 2006 5:791-796; Fuller et al, Biomaterials. 2008 29:1526-1532, DeKoker et al, Adv Drug Deliv Rev.2011 63:748-761; Endres et al., Biomaterials.201132:7721-7731; Su et al., Mol Pharm.2011 Jun 6;8(3):774-87).

[0565] Pokazano je da biorazgradive nanočestice kalcijum fosfata u kombinaciji sa lipidima i/ili polimerima isporučuju polinukleotide, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšanu modifikovanu RNK ili ribonukleinske kiseline in vivo. U jednom slučaju, nanočestica kalcijum fosfata obložena lipidom, koja takođe može da sadrži ciljno delujući ligand kao što je anisamid, može se upotrebljavati za isporuku polinukleotida, modifikovanih nukleinskih kiselina, poboljšane modifikovane RNK ili ribonukleinskih kiselina predmetnog prikaza. Na primer, za efikasnu isporuku siRNA u metastatskom modelu pluća miša, upotrebljena je nanočestica kalcijum fosfata obložena lipidom (Li et al., J Contr Rel.2010 142:416-421; Li et al., J Contr Rel.2012 158:108-114; Yang et al., Mol Ther. 201220:609-615). Ovaj sistem za isporuku kombinuje i usmerenu nanočesticu i komponentu za poboljšanje ispuštanja iz endozoma, kalcijum fosfat, kako bi se poboljšala isporuka siRNA.

[0566] U jednom slučaju, kalcijum fosfat sa blok kopolimerom PEG-polianjon može da se upotrebi za isporuku polinukleotida, modifikovanih nukleinskih kiselina, poboljšane modifikovane RNK ili ribonukleinskih kiselina (Kazikawa et al., J Contr Rel. 2004 97:345-356; Kazikawa et al., J Contr Rel.2006 111:368-370).

[0567] U jednom slučaju, polimer konverzije naelektrisanja PEG (Pitella et al., Biomaterials.2011 32:3106-3114) može da se upotrebi za formiranje nanočestice za isporuku polinukleotida, modifikovanih nukleinskih kiselina, poboljšane modifikovane RNK ili ribonukleinskih kiselina predmetnog prikaza. Polimer konverzije naelektrisanja PEG može da bude poboljšan u odnosu na blok kopolimere PEG-polianjon isecanjem u polikatjon pri kiselom pH, čime se poboljšava otpuštanje iz endozoma.

[0568] Upotreba nanočestica jezgro-omotač dodatno je fokusirana na pristup visoke propusnosti za sintezu katjonskih umreženih nanogel jezgara i različitih omotača (Siegwart et al., Proc Natl Acad Sci USA 2011 108:12996-13001). Kompleksovanje, isporuka, i internalizacija polimernih nanočestica mogu se precizno kontrolisati izmenom hemijske kompozicije i u komponenti jezgra

4 4

i u komponenti omotača nanočestice. Na primer, nanočestice jezgro-omotač mogu efikasno da isporuče siRNA u hepatocite miša nakon što kovalentno vežu holesterol za nanočesticu.

[0569] U jednom slučaju, šuplje lipidno jezgro koje sadrži srednji sloj PLGA i spoljni neutralni lipidni sloj koji sadrži PEG može da se upotrebi za isporuku polinukleotida, modifikovanih nukleinskih kiselina, poboljšane modifikovane RNK ili ribonukleinskih kiselina predmetnog prikaza. Kao neograničavajući primer, kod miševa koji imaju tumor koji eksprimira luciferazu, utvrđeno je da hibridna nanočestica lipid-polimer-lipid značajno suprimira ekspresiju luciferaze, u poređenju sa konvencionalnim lipopleksom (Shi et al, Angew Chem Int Ed.201150:7027-7031).

Peptidi i proteini

[0570] Polinukleotidi, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline prema prikazu mogu da budu formulisani sa peptidima i/ili proteinima kako bi se povećala transfekcija ćelija modifikovanim nukleinskim kiselinama, poboljšanom modifikovanom RNK ili ribonukleinskim kiselinama. U jednom slučaju, peptidi kao što su, ali bez ograničenja, peptidi i proteini koji penetriraju u ćeliju i peptidi koji omogućavaju unutarćelijsku isporuku mogu se upotrebljavati za isporuku farmaceutskih formulacija. Neograničavajući primer peptida koji penetrira u ćeliju i koji se može upotrebljavati sa farmaceutskim formulacijama predmetnog prikaza uključuje peptidnu sekvencu koja penetrira u ćeliju vezanu za polikatjone što olakšava isporuku u unutarćelijski prostor, npr. TAT peptid poreklom iz HIV, penetranti, transportani, ili peptidi koji prodiru u ćeliju poreklom iz hCT (videti, npr. Caron et al., Mol. Ther.

3(3):310-8 (2001); Langel, Cell-Penetrating Peptides: Processes and Applications (CRC Press, Boca Raton FL, 2002); El-Andaloussi et al., Curr. Pharm. Des. 11(28):3597-611 (2003); i Deshayes et al., Cell. Mol. Life Sci.62(16):1839-49 (2005)). Kompozicije takođe mogu da budu formulisane tako da uključuju agens za penetriranje u ćeliju, npr. lipozome, koji poboljšavaju isporuku kompozicija u unutarćelijski prostor. Modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline prema prikazu mogu da budu kompleksovani za peptide i/ili proteine, kao što su, ali bez ograničenja, peptidi i/ili proteini kompanije Aileron Therapeutics (Cambridge, MA) i Permeon Biologics (Cambridge, MA) kako bi se omogućila unutarćelijska isporuka (Cronican et al., ACS Chem. Biol. 20105:747-752; McNaughton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2009 106:6111-6116; Sawyer, Chem Biol Drug Des. 2009 73:3-6; Verdine and Hilinski, Methods Enzymol.2012;503:3-33).

[0571] U jednom slučaju, polipeptid koji penetrira u ćeliju može da sadrži prvi domen i drugi domen. Prvi domen može da sadrži supernaelektrisani polipeptid. Drugi domen može da sadrži

4

protein-vezujućeg partnera. Kao što se ovde upotrebljava, "protein-vezujući partner" uključuje, ali nije ograničen na, antitela i njihove funkcionalne fragmente, proteine skele, ili peptide. Polipeptid koji penetrira u ćeliju može dodatno da sadrži unutarćelijskog vezujućeg partnera za proteinvezujućeg partnera. Polipeptid koji penetrira u ćeliju može da bude sposoban da bude izlučen iz ćelije u koju modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline mogu da budu introdukovani.

[0572] Formulacije uključenih peptida ili proteina mogu da se upotrebe za povećanje transfekcije ćelija polinukleotidima, modifikovanim nukleinskim kiselinama, poboljšanom modifikovanom RNK ili ribonukleinskim kiselinama, izmenu biodistribucije polinukleotida, modifikovanih nukleinskih kiselina, poboljšane modifikovane RNK ili ribonukleinskih kiselina (npr., ciljnim delovanjem na specifična tkiva ili tipove ćelija), i/ili povećanje translacije kodiranog proteina.

Ćelije

[0573] Polinukleotidi, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline prema prikazu mogu da budu transfektovani ex vivo u ćelije, koje se zatim transplantiraju u subjekta. Kao neograničavajući primeri, farmaceutske kompozicije mogu da uključuju crvena krvna zrnca za isporuku modifikovane RNK u jetru i mijeloidne ćelije, virozome za isporuku modifikovane RNK u čestice slične virusu (VLP), i elektroporisane ćelije, na primer, ali bez ograničenja, kompanije MAXCYTE<®>(Gaithersburg, MD) i ERYTECH<®>(Lyon, Francuska) za isporuku modifikovane RNK. Dokumentovani su primeri upotrebe crvenih krvnih zrnaca, virusnih čestica i elektroporisanih ćelija za isporuku opterećenja lekom različitog od polinukleotida, modifikovanih nukleinskih kiselina, poboljšane modifikovane RNK ili ribonukleinskih kiselina (Godfrin et al., Expert Opin Biol Ther. 2012 12:127-133; Fang et al., Expert Opin Biol Ther. 201212:385-389; Hu et al., Proc Natl Acad Sci USA 2011108:10980-10985; Lund et al., Pharm Res.2010 27:400-420; Huckriede et al., J Liposome Res.2007;17:39-47; Cusi, Hum Vaccin.2006 2:1-7; de Jonge et al., Gene Ther. 2006 13:400-411). Modifikovana RNK može da bude isporučena u sintetičkim VLP koje su sintetisane postupcima opisanim u međunarodnoj objavi br. WO2011085231 i SAD objavi br.20110171248.

[0574] Formulacije polinukleotida, modifikovanih nukleinskih kiselina, poboljšane modifikovane RNK ili ribonukleinskih kiselina prema prikazu na bazi ćelija mogu da se upotrebe za obezbeđivanje transfekcije ćelija (npr. u ćelijskom nosaču), izmenu biodistribucije modifikovanih nukleinskih kiselina, poboljšane modifikovane RNK ili ribonukleinskih kiselina (npr. ciljnim

4

delovanjem ćelijskog nosača na specifična tkiva ili tipove ćelija), i/ili povećanje translacije kodiranog proteina.

Introdukcija u ćelije

[0575] Različiti postupci su poznati u stanju tehnike i pogodni za introdukciju nukleinske kiseline u ćeliju, uključujući virusno posredovane tehnike i tehnike koje nisu posredovane virusima. Primeri tipičnih tehnika koje nisu posredovane virusima uključuju, ali nisu ograničeni na, elektroporaciju, transfer posredovan kalcijum fosfatom, nukleofekciju, sonoporaciju, toplotni šok, magnetofekciju, transfer posredovan lipozomima, mikroinjekciju, transfer posredovan mikroprojektilima (nanočestice), transfer posredovan katjonskim polimerom (DEAE-dekstran, polietilenimin, polietilen glikol (PEG) i slično) ili ćelijsku fuziju.

[0576] Tehnika sonoporacije, ili ćelijske sonikacije je upotreba zvuka (npr. ultrazvučnih frekvencija) za modifikovanje permeabilnosti ćelijske plazma membrane. Postupci sonoporacije su poznati stručnjacima u ovoj oblasti i o njima se podučava, na primer, kada se odnose na bakterije, u SAD patentnoj objavi 20100196983, a kada se odnose na druge tipove ćelija, na primer, u SAD patentnoj objavi 20100009424.

[0577] Tehnike elektroporacije su takođe dobro poznate u struci. U jednom slučaju, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline mogu da budu isporučene pomoću elektroporacije kao što je opisano u primeru 11.

Hijaluronidaza

[0578] Intramuskularno ili subkutano lokalizovana injekcija polinukleotida, modifikovanih nukleinskih kiselina, poboljšane modifikovane RNK ili ribonukleinskih kiselina prema prikazu može da uključuje hijaluronidazu, koja katalizuje hidrolizu hijaluronana. Katalizujući hidrolizu hijaluronana, konstituenta intersticijske barijere, hijaluronidaza smanjuje viskoznost hijaluronana, time povećavajući premeabilnost tkiva (Frost, Expert Opin. Drug Deliv. (2007) 4:427-440). Korisno je ubrzati disperziju i sistemsku distribuciju kodiranih proteina koje proizvode transfektovane ćelije. Alternativno, hijaluronidaza može da se upotrebi za povećanje broja ćelija izloženih modifikovanim nukleinskim kiselinama, poboljšanoj modifikovanoj RNK ili ribonukleinskim kiselinama prema prikazu primenjenim intramuskularno ili subkutano.

Mimici nanočestica

4

[0579] Polinukleotidi, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline prema prikazu mogu da budu inkapsulirani unutar i/ili apsorbovani na mimik nanočestice. Mimik nanočestica može da oponaša funkciju isporuke koju imaju organizmi ili čestice, kao što su, ali bez ograničenja, patogeni, virusi, bakterije, gljivice, paraziti, prioni i ćelije. Kao neograničavajući primer, polinukleotidi, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline prema prikazu mogu da budu inkapsulirani u nevirusnu česticu koja može da oponaša funkciju isporuke koju ima virus (videti međunarodnu objavu br. WO2012006376).

Nanocevi

[0580] Polinukleotidi, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline prema prikazu mogu da budu spojeni ili na drugi način vezani za najmanje jednu nanocev, kao što su, ali bez ograničenja, rozeta nanocevi, rozeta nanocevi koje imaju dvostruke baze sa linkerom, ugljenične nanocevi i/ili ugljenične nanocevi sa jednim zidom. Polinukleotidi, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline mogu da budu vezani za nanocevi silama kao što su, ali bez ograničenja, steričke, jonske, kovalentne i/ili druge sile.

[0581] U jednom slučaju, nanocev može da otpušta jedan ili više polinukleotida, modifikovanih nukleinskih kiselina, poboljšane modifikovane RNK ili ribonukleinskih kiselina u ćelije. Veličina i/ili površinska struktura najmanje jedne nanocevi može da bude izmenjena tako da upravlja interakcijom nanocevi unutar tela i/ili da se spoji ili veže za ovde opisane polinukleotide, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšanu modifikovanu RNK ili ribonukleinske kiseline. U jednom slučaju, gradivni blok i/ili funkcionalne grupe spojene sa gradivnim blokom najmanje jedne nanocevi mogu da budu izmenjene kako bi se prilagodile dimenzije i/ili svojstva nanocevi. Kao neograničavajući primer, dužina nanocevi može da bude izmenjena da spreči nanocevi da prođu kroz otvore u zidovima normalnih krvnih sudova, ali da još uvek budu dovoljno male da prođu kroz veće otvore u krvnim sudovima tumorskog tkiva.

[0582] U jednom slučaju, najmanje jedna nanocev takođe može da bude obložena jedinjenjima koja poboljšavaju isporuku, uključujući polimere, kao što je, ali bez ograničenja, polietilen glikol. U sledećem slučaju, najmanje jedna nanocev i/ili modifikovana mRNA mogu da se pomešaju sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensima i/ili vehikulumima za isporuku.

[0583] U jednom slučaju, polinukleotidi ili modifikovana mRNA su spojeni i/ili na drugi način vezani za najmanje jednu rozetu nanocevi. Rozete nanocevi mogu da budu formirane postupkom

4

poznatim u stuci i/ili postupkom opisanim u međunarodnoj objavi br. WO2012094304. Najmanje jedna modifikovana mRNA može da bude spojena i/ili na drugi način vezana za najmanje jednu rozetu nanocevi postupkom kao što je opisano u međunarodnoj objavi br. WO2012094304, gde se rozeta nanocevi ili moduli koji formiraju rozetu nanocevi mešaju u vodenom medijumu sa najmanje jednom modifikovanom mRNA pod uslovima koji mogu uzrokovati da se najmanje jedna modifikovana mRNA spoji ili na drugi način veže za rozetu nanocevi.

Konjugati

[0584] Polinukleotidi, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline prema prikazu uključuju konjugate, kao što su modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline kovalentno vezane za nosač ili ciljno delujuću grupu, ili koji uključuju dva kodirajuća regiona koji zajedno proizvode fuzioni protein (npr. koji nosi ciljno delujuću grupu i terapeutski protein ili peptid).

[0585] Konjugati prema prikazu uključuju supstance koje se prirodno javljaju, kao što je protein (npr. humani serumski albumin (HSA), lipoprotein male gustine (LDL), lipoprotein visoke gustine (HDL), ili globulin); ugljeni hidrat (npr. dekstran, pululan, hitin, hitozan, inulin, ciklodekstrin ili hijaluronska kiselina); ili lipid. Ligand može takođe da bude rekombinantni ili sintetički molekul, kao što je sintetički polimer, npr. sintetička poliamino kiselina, oligonukleotid (npr. aptamer). Primeri poliamino kiselina koji uključuju poliamino kiselinu su polilizin (PLL), poli L-asparaginska kiselina, poli L-glutaminska kiselina, kopolimer stiren- anhidrid maleinske kiseline, poli(L-laktid-ko-glikolid) kopolimer, kopolimer divinil etar- anhidrid maleinske kiseline, N-(2-hidroksipropil)metakrilamid kopolimer (HMPA), polietilen glikol (PEG), polivinil alkohol (PVA), poliuretan, poli(2-etilakrilna kiselina), N-izopropilakrilamidni polimeri, ili polifosfazin. Primeri poliamina uključuju: polietilenimin, polilizin (PLL), spermin, spermidin, poliamin, pseudopeptidpoliamin, peptidomimetički poliamin, dendrimer poliamin, arginin, amidin, protamin, katjonski lipid, katjonski porfirin, kvaternarnu so poliamina, ili alfa helijačni peptid.

[0586] Reprezentativni SAD patenti koji podučavaju o pripremi polinukleotidnih konjugata, posebno za RNK, uključuju, ali nisu ograničeni na, SAD patente br. 4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,578,717, 5,580,731; 5,591,584; 5,109,124; 5,118,802; 5,138,045; 5,414,077; 5,486,603; 5,512,439; 5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4,605,735; 4,667,025; 4,762,779; 4,789,737; 4,824,941; 4,835,263; 4,876,335; 4,904,582; 4,958,013; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,245,022; 5,254,469; 5,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241,

4

5,391,723; 5,416,203, 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599,928 i 5,688,941; 6,294,664; 6,320,017; 6,576,752; 6,783,931; 6,900,297; 7,037,646.

[0587] U jednom slučaju, konjugat predmetnog prikaza može da funkcioniše kao nosač za polinukleotid, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšanu modifikovanu RNK ili ribonukleinske kiseline predmetnog prikaza. Konjugat može da sadrži katjonski polimer kao što su, ali bez ograničenja, poliamin, polilizin, polialkilenimin, i polietilenimin koji može da bude graftovan sa poli(etilen glikolom). Kao neograničavajući primer, konjugat može da bude sličan polimernom konjugatu i postupku sinteze polimernog konjugata opisanom u SAD patentu br.

6,586,524.

[0588] Konjugati takođe mogu da uključuju ciljno delujuće grupe, npr. agens za ciljno delovanje na ćeliju ili tkivo, npr. lektin, glikoprotein, lipid ili protein, npr. antitelo, koje se vezuje za specifični tip ćelije, kao što je ćelija bubrega. Ciljno delujuća grupa može da bude tirotropin, melanotropin, lektin, glikoprotein, surfaktant protein A, mucin ugljeni hidrat, multivalentna laktoza, multivalentna galaktoza, N-acetil-galaktozamin, N-acetil-glukozamin multivalentna manoza, multivalentna fukoza, glikozilovane poliamino kiseline, multivalentna galaktoza, transferin, bisfosfonat, poliglutamat, poliaspartat, lipid, holesterol, steroid, žučna kiselina, folat, vitamin B12, biotin, RGD peptid, mimetik RGD peptida ili aptamer.

[0589] Ciljno delujuće grupe mogu da budu proteini, npr. glikoproteini, ili peptidi, npr. molekuli koji imaju specifičan afinitet za ko-ligand, ili antitela, npr. antitelo, koje se vezuje za specifičan tip ćelije, kao što su kancerska ćelija, endotelna ćelija, ili koštana ćelija. Ciljno delujuće grupe mogu takođe da uključuju hormone i receptore za hormone. One takođe mogu da uključuju nepeptidne vrste, kao što su lipidi, lektini, ugljeni hidrati, vitamini, kofaktori, multivalentna laktoza, multivalentna galaktoza, N-acetil-galaktozamin, N-acetil-glukozamin multivalentna manoza, multivalentna fukoza, ili aptameri. Ligand može da bude, na primer, lipopolisaharid, ili aktivator kinaze p38 MAP.

[0590] Ciljno delujuća grupa može da bude bilo koji ligand koji može da ciljno deluje na specifični receptor. Primeri uključuju, bez ograničavanja, folat, GalNAc, galaktozu, manozu, manozu-6P, aptamere, ligande receptora integrina, ligande receptora hemokina, transferin, biotin, ligande receptora serotonina, PSMA, endotelin, GCPII, somatostatin, LDL, i HDL ligande. U određenim slučajevima, ciljno delujuća grupa je aptamer. Aptamer može da bude nemodifikovan ili da ima bilo koju kombinaciju modifikacija koje su ovde objavljene.

4

[0591] U jednom slučaju, farmaceutske kompozicije predmetnog prikaza mogu da uključuju hemijske modifikacije kao što su, ali bez ograničenja, modifikacije slične zaključanim nukleinskim kiselinama.

[0592] Reprezentativni SAD patenti koji podučavaju o pripremi zaključane nukleinske kiseline (LNA), kao što su one kompanije Santaris, uključuju, ali nisu ograničene na, sledeće: SAD patente br. 6,268,490; 6,670,461; 6,794,499; 6,998,484; 7,053,207; 7,084,125; i 7,399,845.

[0593] Reprezentativni SAD patenti koji podučavaju o pripremi PNA jedinjenja uključuju, ali nisu ograničeni na, SAD patente br. 5,539,082; 5,714,331; i 5,719,262. Dodatno podučavanje o PNA jedinjenjima može se pronaći, na primer, u Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500.

[0594] Neki slučajevi navedeni u prikazu uključuju modifikovane nukleinske kiseline, poboljšanu modifikovanu RNK ili ribonukleinske kiseline sa fosforotioatnim osnovnim lancima i oligonukleozide sa drugim modifikovanim osnovnim lancima, i posebno --CH2--NH--CH2--, --CH2--N(CH3)--O--CH2--[poznat kao metilen (metilimino) ili MMI osnovni lanac], --CH2-O--N(CH3)--CH2--, --CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2-- i --N(CH3)--CH2--CH2--[gde je nativni fosfodiestarski osnovni lanac predstavljen kao --O-P(O)2--O--CH2--] iz gore navedenog SAD patenta br. 5,489,677, i amidni osnovni lanci iz gore navedenog SAD patenta br. 5,602,240. U nekim slučajevima, ovde prikazani polinukleotidi imaju strukture morfolino osnovnog lanca iz gore navedenog SAD patenta br.5,034,506.

[0595] Modifikacije na 2' poziciji takođe mogu da pomognu u isporuci. Poželjno, modifikacije na 2' poziciji nisu locirane u sekvenci koja kodira polipeptid, tj. nisu u regionu koji može da se translatira. Modifikacije na 2' poziciji mogu da budu locirane u 5'UTR, 3'UTR i/ili u regionu repa. Modifikacije na 2' poziciji mogu da uključuju jedno od sledećeg na 2' poziciji: H (tj.2'-dezoksi); F; O-, S-, ili N-alkil; O-, S-, ili N-alkenil; O-, S-, ili N-alkinil; ili O-alkil-O-alkil, pri čemu alkil, alkenil i alkinil mogu da budu supstituisani ili nesupstituisani C1do C10alkil ili C2do C10alkenil i alkinil. Primeri pogodnih modifikacija uključuju O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, i O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2, gde su n i m od 1 do oko 10. U drugim slučajevima, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline uključuju na 2' poziciji jedno od sledećeg: C1do C10niži alkil, supstituisani niži alkil, alkaril, aralkil, O-alkaril ili O-aralkil, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocikloalkil, heterocikloalkaril, aminoalkilamino, polialkilamino, supstituisani silil, grupa koja iseca RNK, reporterska grupa, interkalator, grupa za poboljšanje farmakokinetičkih svojstava, ili grupa za poboljšanje farmakodinamičkih svojstava, i drugi supstituenti koji imaju slična svojstva. U nekim slučajevima, modifikacija uključuje 2'-metoksietoksi (2'-O-CH2CH2OCH3, takođe poznat kao 2'-O-(2-metoksietil) ili 2'-MOE) (Martin et

4 1

al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504) tj. alkoksi-alkoksi grupu. Sledeći primer modifikacije je 2'-dimetilaminooksietoksi, tj. O(CH2)2ON(CH3)2grupa, takođe poznata kao 2'-DMAOE, kao što je opisano u navedenim primerima u nastavku, i 2'-dimetilaminoetoksietoksi (takođe poznata u struci kao 2'-O-dimetilaminoetoksietil ili 2'-DMAEOE), tj.2'-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2, takođe opisana u navedenim primerima u nastavku. Druge modifikacije uključuju 2'-metoksi (2'-OCH3), 2'-aminopropoksi (2'-OCH2CH2CH2NH2) i 2'-fluoro (2'-F). Slične modifikacije mogu da se uvedu i na drugim pozicijama, posebno na 3' poziciji šećera na 3' terminalnom nukleotidu ili u 2'-5' povezanoj dsRNA i na 5' poziciji 5' terminalnog nukleotida. Polinukleotidi prikaza mogu takođe da imaju mimetike šećera kao što su fragmenti ciklobutila umesto pentofuranozil šećera. Reprezentativni SAD patenti koji podučavaju o pripremi takvih modifikovanih struktura šećera uključuju, ali nisu ograničeni na, SAD patente br. 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; i 5,700,920.

[0596] U još nekim slučajevima, polinukleotidi, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline kovalentno su konjugovani za polipeptid koji penetrira u ćeliju.

[0597] Peptid koji penetrira u ćeliju može takođe da uključuje signalnu sekvencu. Konjugati pronalaska mogu da budu dizajnirani tako da imaju povećanu stabilnost; povećanu transfekciju ćelije; i/ili izmenjenu biodistribuciju (npr. usmerenu na specifična tkiva ili tipove ćelija).

Samo-sklapajuće nanočestice nukleinske kiseline

[0598] Samo-sklapajuće nanočestice imaju dobro definisanu veličinu koja može precizno da se kontroliše jer lanci nukleinske kiseline mogu lako da se reprogramiraju. Na primer, optimalna veličina čestica za nosač za nanoisporuku koji ciljno deluje na kancer je 20-100 nm jer se prečnikom većim od 20 nm izbegava bubrežni klirens i poboljšava isporuka do određenih tumora preko povećane permeabilnosti i efekta zadržavanja. Za poboljšanu isporuku upotrebljavaju se samo-sklapajuće nanočestice nukleinske kiseline jedne uniformne populacije po veličini i obliku koja ima precizno kontrolisanu prostornu orijentaciju i gustinu liganada koji ciljno deluju na kancer. Kao neograničavajući primer, nanočestice oligonukleotida su pripremljene upotrebom programabilnog samo-sklapanja kratkih fragmenata DNK i terapeutskih siRNA. Ove nanočestice su molekulski identične sa veličinom čestica koja može da se kontroliše i lokacijom i gustinom ciljnog liganda. Fragmenti DNK i siRNA se samo-sklapaju u jednofaznoj reakciji čime se generišu

4 2

tetraedarske nanočestice DNK/siRNA za ciljnu in vivo isporuku. (Lee et al., Nature Nanotechnology 2012 7:389-393).

Ekscipijensi

[0599] Farmaceutske formulacije mogu dodatno da sadrže farmaceutski prihvatljiv ekscipijens, koji, kao što se ovde upotrebljava, uključuje, ali nije ograničen na bilo koje i sve rastvarače, disperzione medijume, razblaživače, ili druge tečne vehikulume, pomoćna sredstva za dispergovanje ili suspendovanje, površinski aktivne agense, izotonične agense, agense za zgušnjavanje ili emulgatore, konzervanse, čvrsta veziva, lubrikante i slično, kao što je pogodno za konkretni željeni dozni oblik. Različiti ekscipijensi za formulisanje farmaceutskih kompozicija i tehnike za pripremu kompozicije su poznate u stanju tehnike (videti Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006). Upotreba konvencionalnog ekscipijensnog medijuma može da bude predviđena, osim ukoliko bilo koji konvencionalni ekscipijensni medijum može da bude nekompatibilan sa supstancom ili njenim derivatima, tako što na primer proizvodi bilo kakav neželjeni biološki efekat ili interaguje na drugi štetan način sa bilo kojom drugom komponentom/komponentama farmaceutske kompozicije.

[0600] U nekim slučajevima, farmaceutski prihvatljiv ekscipijens može da bude najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili 100% čist. U nekim slučajevima, ekscipijens može da bude odobren za upotrebu kod ljudi i za veterinarsku upotrebu. U nekim slučajevima, ekscipijens može da bude odobren od strane Uprave za hranu i lekove Sjedinjenih Država. U nekim slučajevima, ekscipijens može da bude farmaceutskog kvaliteta. U nekim slučajevima, ekscipijens može da zadovoljava standarde Farmakopeje Sjedinjenih Država (USP), Evropske farmakopeje (EP), Britanske farmakopeje, i/ili Međunarodne farmakopeje.

[0601] Farmaceutski prihvatljivi ekscipijensi koji se upotrebljavaju u proizvodnji farmaceutskih kompozicija uključuju, ali nisu ograničeni na, inertne razblaživače, agense za dispergovanje i/ili granulaciju, površinski aktivne agense i/ili emulgatore, agense za dezintegraciju, vezujuće agense, konzervanse, agense za puferisanje, agense za lubrikaciju, i/ili ulja. Takvi ekscipijensi mogu opciono biti uključeni u farmaceutske formulacije. Kompozicija može da uključuje i ekscipijense kao što su kakao buter i voskovi za supozitorije, agensi za bojenje, agensi za oblaganje, zaslađivači, arome i/ili agensi za davanje mirisa.

[0602] Primeri razblaživača uključuju, ali nisu ograničeni na, kalcijum karbonat, natrijum karbonat, kalcijum fosfat, dikalcijum fosfat, kalcijum sulfat, kalcijum hidrogen fosfat, natrijum

4

fosfat laktozu, saharozu, celulozu, mikrokristalnu celulozu, kaolin, manitol, sorbitol, inozitol, natrijum hlorid, suvi skrob, kukuruzni skrob, šećer u prahu, itd. i/ili njihove kombinacije.

[0603] Primeri agenasa za dispergovanje i/ili granulaciju uključuju, ali nisu ograničeni na, krompirov skrob, kukuruzni skrob, tapioka skrob, natrijum skrob glikolat, gline, alginsku kiselinu, guar gumu, pulpu citrusa, agar, bentonit, celulozu i proizvode od drveta, prirodni sunđer, katjonsko-izmenjivačke smole, kalcijum karbonat, silikate, natrijum karbonat, umreženi poli(vinilpirolidon) (krospovidon), natrijum karboksimetil skrob (natrijum skrob glikolat), karboksimetil celulozu, umreženu natrijum karboksimetil celulozu (kroskarmeloza), metilcelulozu, preželatinizovani skrob (skrob 1500), mikrokristalni skrob, skrob koji je nerastvorljiv u vodi, kalcijum karboksimetil celulozu, magnezijum aluminijum silikat (Veegum), natrijum lauril sulfat, kvaternarna amonijum jedinjenja, itd. i/ili njihove kombinacije.

[0604] Primeri površinski aktivnih agenasa i/ili emulgatora uključuju, ali nisu ograničeni na, prirodne emulgatore (npr. akacija, agar, alginska kiselina, natrijum alginat, tragakant, hondruks, holesterol, ksantan, pektin, želatin, žumance, kazein, mast vune, holesterol, vosak, i lecitin), koloidne gline (npr. bentonit [aluminijum silikat] i VEEGUM<®>[magnezijum aluminijum silikat]), derivate aminokiselina dugog lanca, alkohole velike molekulske mase (npr. stearil alkohol, cetil alkohol, oleil alkohol, triacetin monostearat, etilen glikol distearat, gliceril monostearat, i propilen glikol monostearat, polivinil alkohol), karbomere (npr. karboksi polimetilen, poliakrilna kiselina, polimer akrilne kiseline, i karboksivinil polimer), karagenan, derivate celuloze (npr. natrijum karboksimetilceluloza, celuloza u prahu, hidroksimetil celuloza, hidroksipropil celuloza, hidroksipropil metilceluloza, metilceluloza), estre masnih kiselina sorbitana (npr. polioksietilen sorbitan monolaurat [TWEEN<®>20], polioksietilen sorbitan [TWEEN<®>60], polioksietilen sorbitan monooleat [TWEEN<®>80], sorbitan monopalmitat [SPAN<®>40], sorbitan monostearat [SPAN<®>60], sorbitan tristearat [SPAN<®>65], gliceril monooleat, sorbitan monooleat [SPAN<®>80]), polioksietilen estre (npr. polioksietilen monostearat [MYRJ<®>45], polioksietilen hidrogenisano ricinusovo ulje, polietoksilovano ricinusovo ulje, polioksimetilen stearat, i SOLUTOL<®>), estre masnih kiselina saharoze, estre polietilen glikol masnih kiselina (npr. CREMOPHOR<®>), polioksietilen etre (npr. polioksietilen etar [BRIJ<®>30]), poli(vinilpirolidon), dietilen glikol monolaurat, trietanolamin oleat, natrijum oleat, kalijum oleat, etil oleat, oleinsku kiselinu, etil laurat, natrijum lauril sulfat, PLUORINC<®>F 68, POLOXAMER<®>188, cetrimonijum bromid, cetilpiridinijum hlorid, benzalkonijum hlorid, dokusat natrijum, itd. i/ili njihove kombinacije.

[0605] Primeri vezujućih agenasa uključuju, ali nisu ograničeni na, skrob (npr. kukuruzni skrob i skrobna pasta); želatin; šećere (npr. saharoza, glukoza, dekstroza, dekstrin, melasa, laktoza, laktitol, manitol); prirodne i sintetičke gume (npr. akacija, natrijum alginat, ekstrakt irske

4 4

mahovine, guma panwar, guma ghatti, sluz ljuspica biljke izapol, karboksimetilceluloza, metilceluloza, etilceluloza, hidroksietilceluloza, hidroksipropil celuloza, hidroksipropil metilceluloza, mikrokristalna celuloza, celuloza acetat, poli(vinil-pirolidon), magnezijum aluminijum silikat (VEEGUM<®>), i arabogalaktan ariša); alginate; polietilen oksid; polietilen glikol; neorganske soli kalcijuma; silicijumovu kiselinu; polimetakrilate; voskove; vodu; alkohol; itd.; i njihove kombinacije.

[0606] Primeri konzervansa mogu uključivati, ali nisu ograničeni na, antioksidanse, helatne agense, antimikrobne konzervanse, antigljivične konzervanse, alkoholne konzervanse, kisele konzervanse, i/ili druge konzervanse. Primeri antioksidanasa uključuju, ali nisu ograničeni na, alfa tokoferol, askorbinsku kiselinu, akorbil palmitat, butilovani hidroksianizol, butilovani hidroksitoluen, monotioglicerol, kalijum metabisulfit, propansku kiselinu, propil galat, natrijum askorbat, natrijum bisulfit, natrijum metabisulfit, i/ili natrijum sulfit. Primeri helatnih agenasa uključuju etilendiamintetrasirćetnu kiselinu (EDTA), monohidrat limunske kiseline, dinatrijum edetat, dikalijum edetat, edetičnu kiselinu, fumarnu kiselinu, jabučnu kiselinu, fosfornu kiselinu, natrijum edetat, vinsku kiselinu, i/ili trinatrijum edetat. Primeri antimikrobnih konzervanasa uključuju, ali nisu ograničeni na, benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid, benzil alkohol, bronopol, cetrimid, cetilpiridinijum hlorid, hlorheksidin, hlorobutanol, hlorokrezol, hloroksilenol, krezol, etil alkohol, glicerin, heksetidin, imidureu, fenol, fenoksetanol, feniletil alkohol, fenil živa nitrat, propilen glikol, i/ili timerosal. Primeri antigljivičnih konzervanasa uključuju, ali nisu ograničeni na, butil paraben, metil paraben, etil paraben, propil paraben, benzoevu kiselinu, hidroksibenzoevu kiselinu, kalijum benzoat, kalijum sorbat, natrijum benzoat, natrijum propionat, i/ili sorbinsku kiselinu. Primeri alkoholnih konzervanasa uključuju, ali nisu ograničeni na, etanol, polietilen glikol, fenol, fenolna jedinjenja, bisfenol, hlorobutanol, hidroksibenzoat, i/ili feniletil alkohol. Primeri kiselih konzervanasa uključuju, ali nisu ograničeni na, vitamin A, vitamin C, vitamin E, beta-karoten, limunsku kiselinu, sirćetnu kiselinu, dehidrosirćetnu kiselinu, askorbinsku kiselinu, sorbinsku kiselinu, i/ili fitinsku kiselinu. Drugi konzervansi uključuju, ali nisu ograničeni na, tokoferol, tokoferol acetat, deteroksim mezilat, cetrimid, butilovani hidroksianizol (BHA), butilovani hidroksitoluen (BHT), etilendiamin, natrijum lauril sulfat (SLS), natrijum lauril etar sulfat (SLES), natrijum bisulfit, natrijum metabisulfit, kalijum sulfit, kalijum metabisulfit, GLYDANT PLUS<®>, PHENONIP<®>, metilparaben, GERMALL<®>115, GERMABEN<®>II, NEOLONE<™>, KATHON<™>, i/ili EUXYL<®>

[0607] Primeri agenasa za puferisanje uključuju, ali nisu ograničeni na, rastvore citratnog pufera, rastvore acetatnog pufera, rastvore fosfatnog pufera, amonijum hlorid, kalcijum karbonat, kalcijum hlorid, kalcijum citrat, kalcijum glubionat, kalcijum gluceptat, kalcijum glukonat, d-glukonsku

4

kiselinu, kalcijum glicerofosfat, kalcijum laktat, propansku kiselinu, kalcijum levulinat, pentansku kiselinu, dvobazni kalcijum fosfat, fosfornu kiselinu, trobazni kalcijum fosfat, kalcijum hidroksid fosfat, kalijum acetat, kalijum hlorid, kalijum glukonat, smeše kalijuma, dvobazni kalijum fosfat, jednobazni kalijum fosfat, smeše kalijum fosfata, natrijum acetat, natrijum bikarbonat, natrijum hlorid, natrijum citrat, natrijum laktat, dvobazni natrijum fosfat, monobazni natrijum fosfat, smeše natrijum fosfata, trometamin, magnezijum hidroksid, aluminijum hidroksid, alginsku kiselinu, vodu bez pirogena, izotonični fiziološki rastvor, Ringerov rastvor, etil alkohol, itd. i/ili njihove kombinacije.

[0608] Primeri agenasa za lubrikaciju uključuju, ali nisu ograničeni na, magnezijum stearat, kalcijum stearat, stearinsku kiselinu, silicijum dioksid, talk, slad, gliceril behanat, hidrogenizovana biljna ulja, polietilen glikol, natrijum benzoat, natrijum acetat, natrijum hlorid, leucin, magnezijum lauril sulfat, natrijum lauril sulfat, itd. i njihove kombinacije.

[0609] Primeri ulja uključuju, ali nisu ograničeni na ulja badema, jezgra koštice kajsije, avokada, babase, bergamota, semenke crne ribizle, boražine, kleke, kamilice, kanole, kima, karnaube, ricinusa, cimeta, kakao butera, kokosa, jetre bakalara, kafe, kukuruza, semena pamuka, emua, eukaliptusa, noćurka, ribe, lanenog semena, geraniola, tikve, semenke grožđa, lešnika, miloduha, izopropil miristat, jojobe, kukui oraha, lavandina, lavande, limuna, Litsea cubeba, makadamije, sleza, semena manga, semena livadske pene, minka, muskatnog oraščića, masline, pomorandže, atlantske sluzoglavke, palme, jezgra semena palme, jezgra koštice breskve, kikirikija, maka, semena bundeve, uljane repice, pirinčanih mekinja, ruzmarina, šafranike, sandalovine, kamelije saskuana, čubra, pasjeg trna, susama, ši-butera, silikon, soje, suncokreta, čajevca, čička, japanske kamelije, vetivera, oraha, i pšeničnih klica. Primeri ulja uključuju, ali nisu ograničeni na, butil stearat, kaprilni triglicerid, kaprinski triglicerid, ciklometikon, dietil sebakat, dimetikon 360, izopropil miristat, mineralno ulje, oktildodekanol, oleil alkohol, silikon ulje, i/ili njihove kombinacije.

[0610] Ekscipijensi kao što su kakao buter i voskovi za supozitorije, agensi za bojenje, agensi za oblaganje, zaslađivači, arome i/ili agensi za davanje mirisa mogu da budu prisutni u kompoziciji, u skladu sa procenom osobe koja obavlja formulaciju.

Isporuka

[0611] Predmetni prikaz obuhvata isporuku polinukleotida, modifikovanih nukleinskih kiselina, poboljšane modifikovane RNK ili ribonukleinskih kiselina za bilo koju terapeutsku, farmaceutsku, dijagnostičku isporuku ili za isporuku za snimanje bilo kojim odgovarajućim putem uzimajući u

4

obzir verovatni napredak u nauci o isporuci leka. Isporuka može da bude u vidu "golih" molekula ili formulisana.

Isporuka "golih" molekula

[0612] Polinukleotidi, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline predmetnog prikaza mogu da budu isporučeni u ćeliju u vidu "golih" molekula. Kao što se ovde upotrebljava, "goli" označava isporuku polinukleotida, modifikovanih nukleinskih kiselina, poboljšane modifikovane RNK ili ribonukleinskih kiselina bez agenasa koji podstiču transfekciju. Na primer, polinukleotidi, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline isporučeni u ćeliju ne moraju da sadrže nikakve modifikacije. Goli polinukleotidi, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline mogu da budu isporučeni u ćeliju upotrebom puteva primene poznatih u struci i opisanih ovde.

Formulisana isporuka

[0613] Polinukleotidi, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline predmetnog prikaza mogu da budu formulisani, upotrebom ovde opisanih postupaka. Formulacije mogu da sadrže polinukleotide, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšanu modifikovanu RNK ili ribonukleinske kiseline koji mogu da budu modifikovani i/ili nemodifikovani. Formulacije mogu dalje da uključuju, ali nisu ograničene na, agense za penetraciju u ćeliju, farmaceutski prihvatljiv nosač, agens za isporuku, biorazgradivi ili biokompatibilni polimer, rastvarač, i depo za isporuku sa produženim oslobađanjem. Formulisani polinukleotidi, modifikovane nukleinske kiseline ili poboljšane modifikovane nukleinske kiseline mogu da budu isporučeni u ćeliju upotrebom puteva primene koji su poznati u struci i ovde opisani.

[0614] Kompozicije takođe mogu da budu formulisane za direktnu isporuku u organ ili tkivo na bilo koji od nekoliko načina poznatih u struci uključujući, ali bez ograničenja, direktno natapanje ili kupanje, putem katetera, gelovima, praškom, mastima, kremama, gelovima, losionima, i/ili kapima, upotrebom supstrata kao što su tkanina ili biorazgradivi materijali obloženi ili impregnirani sa kompozicijama, i slično.

[0615] U određenim slučajevima, formulacije uključuju jedan ili više agenasa za penetraciju u ćeliju, npr., transfekcionih agenasa. U jednom specifičnom slučaju, ribonukleinska kiselina se meša sa, ili dodaje agensu za transfekciju (ili njihovoj smeši) i dobijena smeša se koristi za transfekciju ćelija. Poželjni agensi za transfekciju su katjonske lipidne kompozicije, posebno

4

monovalentne i polivalentne katjonske lipidne kompozicije, konkretnije "LIPOFECTIN", "LIPOFECTACE", "LIPOFECTAMINE", "CELLFECTIN", DMRIE-C, DMRIE, DOTAP, DOSPA i DOSPER, i kompozicije dendrimera, posebno dendrimera G5-G10, uključujući guste zvezdaste dendrimere, dendrimere PAMAM, graftovane dendrimere, i dendrimere poznate kao dendrigraftovi i "SUPERFECT". U drugom specifičnom postupku transfekcije, ribonukleinska kiselina se konjuguje sa grupom koja vezuje nukleinsku kiselinu, na primer poliaminom i konkretnije sperminom, i zatim se introdukuje u ćeliju ili se dodaje agensu za transfekciju (ili njihovoj smeši) i dobijena smeša se koristi za transfekciju ćelija. U trećem specifičnom slučaju, smeša jednog ili više peptida, proteina, ili proteinskih fragmenata koji podstiču transfekciju, uključujući fuzogene peptide ili proteine, peptide ili proteine za transport ili promet molekula, peptide ili proteine receptor-ligand, ili peptide ili proteine za lokalizaciju u jedru i/ili njihove modifikovane analoge (npr., peptide ili proteine modifikovane sperminom) ili njihove kombinacije se mešaju sa i kompleksiraju sa ribonukleinskom kiselinom koja treba da se introdukuje u ćeliju, opciono pomešani sa agensom za transfekciju i dobijena smeša se koristi za transfekciju ćelija. Dalje, komponenta agensa za transfekciju (npr., lipidi, katjonski lipidi ili dendrimeri) se kovalentno konjuguje sa odabranim peptidima, proteinima, ili proteinskim fragmentima direktno ili preko povezujuće ili spejserske grupe. Od posebnog interesa u ovom slučaju su peptidi ili proteini koji su fuzogeni, proteini za permeabilizaciju membrane, za transport ili promet molekula, ili za ciljno delovanje na ćeliju. Kompleks peptida ili proteina sa agensom za transfekciju se kombinuje sa ribonukleinskom kiselinom i koristi za transfekciju.

[0616] U određenim slučajevima, formulacije uključuju farmaceutski prihvatljiv nosač koji dovodi do toga da se efikasna količina polinukleotida, modifikovane nukleinske kiseline ili ribonukleinske kiseline suštinski zadrži u ciljnom tkivu koje sadrži ćeliju.

Primena

[0617] Polinukleotidi, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline predmetnog prikaza mogu da budu primenjeni bilo kojim putem koji rezultuje terapeutski efikasnim ishodom. Ovi putevi uključuju, ali nisu ograničeni na enteralnu, gastroenteralnu, epiduralnu, oralnu, transdermalnu, epiduralnu (periduralnu), intracerebralnu (u veliki mozak), intracerebroventrikularnu (u moždane komore), epikutanu (nanošenje na kožu), intradermalnu, (u samu kožu), subkutanu (ispod kože), nazalnu primenu (kroz nos), intravensku (u venu), intraarterijsku (u arteriju), intramuskularnu (u mišić), intrakardijalnu (u srce), intraosealnu infuziju (u kostnu srž), intratekalnu (u kičmeni kanal), intraperitonealnu (infuzija ili

4

injekcija u peritoneum), intravezikalnu infuziju, intravitrealnu (kroz oko), intrakavernoznu injekciju (u bazu penisa), intravaginalnu primenu, intrauterinu, ekstraamnionsku primenu, transdermalnu (difuzija kroz intaktnu kožu radi sistemske distribucije), transmukoznu primenu (difuzija kroz mukuznu membranu), primenu insuflacijom (ušmrkivanjem), sublingvalno, sublabijalno, klistir, primenu putem kapi za oči (na konjunktivu), ili kapi za uši.

[0618] U jednom slučaju, obezbeđene su kompozicije za stvaranje in vivo depoa koje sadrže polinukleotid, modifikovanu nukleinsku kiselinu ili konstruisani ribonukleotid. Na primer, kompozicija sadrži biorazgradivi, biokompatibilni polimer, rastvarač prisutan u količini koja postiže plastifikaciju polimera i formira gel sa njim, i polinukleotid, modifikovanu nukleinsku kiselinu ili konstruisanu ribonukleinsku kiselinu. U određenim slučajevima kompozicija takođe uključuje agens za penetraciju u ćeliju kao što je ovde opisano. U drugim slučajevima, kompozicija takođe sadrži tiksotropnu količinu tiksotropnog agensa koji može da se meša sa polimerom tako da može da formira tiksotropnu kompoziciju. Sledeće kompozicije uključuju agens za stabilizovanje, agens za punjenje, helirajući agens, ili agens za puferisanje.

[0619] U drugim slučajevima, obezbeđeni su depoi sa produženim oslobađanjem, na primer, za primenu polinukleotida, modifikovane nukleinske kiseline, ili konstruisane ribonukleinske kiseline u okruženju (u smislu organa ili tkiva) u telu pacijenta. Takvi depoi uglavnom sadrže konstruisanu ribonukleinsku kiselinu i fleksibilni lanac polimera, pri čemu su i konstruisana ribonukleinska kiselina i fleksibilni lanac polimera obuhvaćeni poroznom matricom umreženog matriksnog proteina. Obično, veličina pora je manja od 1 mm, na primer, 900 nm,800 nm, 700 nm, 600 nm, 500 nm, 400 nm, 300 nm, 200 nm, 100 nm, ili manje od 100 nm. Obično je fleksibilni lanac polimera hidrofilan. Obično fleksibilni lanac polimera ima molekulsku težinu od najmanje 50 kDa, na primer, 75 kDa, 100 kDa, 150 kDa, 200 kDa, 250 kDa, 300 kDa, 400 kDa, 500 kDa, ili više od 500 kDa. Obično fleksibilni lanac polimera ima perzistentnu dužinu manju od 10%, na primer, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2,1 ili manju od 1% perzistentne dužine matriksnog proteina. Obično fleksibilni lanac polimera ima naelektrisanje slično onom kod matriksnog proteina. U nekim slučajevima, fleksibilni lanac polimera menja efektivnu veličinu pora matrice umreženog matriksnog proteina do veličine sposobne da održi difuziju konstruisane ribonukleinske kiseline iz matriksa u okolno tkivo koje sadrži ćeliju u koju su polinukleotid, modifikovana nukleinska kiselina, konstruisana ribonukleinska sposobni da uđu.

[0620] U specifičnim slučajevima, kompozicije mogu da se primenjuju na način koji im omogućava da prođu krvno-moždanu barijeru, vaskularnu barijeru, ili drugu epitelnu barijeru. Neograničavajući putevi primene za polinukleotide, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšanu modifikovanu RNK ili ribonukleinske kiseline predmetnog prikaza su opisani u nastavku.

4

[0621] Ovaj prikaz obezbeđuje postupke koji obuhvataju davanje polinukleotida, modifikovanih mRNA i njihovih kodiranih proteina ili kompleksa u skladu sa prikazom subjektu kome je to potrebno. Nukleinske kiseline, proteini ili kompleksi, ili njihove farmaceutske kompozicije, kompozicije za snimanje, dijagnostičke ili profilaktičke kompozicije, mogu da se primene kod subjekta upotrebom bilo koje količine i bilo kog načina davanja efikasnog za prevenciju, lečenje, dijagnostikovanje ili snimanje bolesti, poremećaja i/ili stanja (npr. bolest, poremećaj i/ili stanje koje se odnosi na deficite radne memorije). Tačna potrebna količina će varirati od subjekta do subjekta, u zavisnosti od vrste, starosti i opšteg stanja subjekta, težine bolesti, konkretne kompozicije, načina njene primene, načina delovanja i slično. Kompozicije u skladu sa prikazom su tipično formulisane u obliku jedinične doze zbog lakše primene i uniformnosti doziranja. Podrazumeva se, međutim, da će o ukupnoj dnevnoj upotrebi kompozicija predmetnog prikaza odlučiti nadležni lekar u okvirima razumnog medicinskog rasuđivanja. Specifičan terapeutski efikasan, profilaktički efikasan ili odgovarajući nivo doze za snimanje za svakog određenog pacijenta zavisiće od niza faktora uključujući poremećaj koji se leči i ozbiljnost poremećaja; aktivnost specifičnog upotrebljenog jedinjenja; specifične kompozicije koja se koristi; starosti, telesne težine, opšteg zdravstvenog stanja, pola i ishrane pacijenta; vremena primene, puta primene i brzine izlučivanja specifičnog upotrebljenog jedinjenja; trajanja lečenja; lekova koji se koriste u kombinaciji ili istovremeno sa specifičnim upotrebljenim jedinjenjem; i sličnih faktora koji su dobro poznati u medicinskoj struci.

Parenteralna i injektabilna primena

[0622] Tečni dozni oblici za oralnu i parenteralnu primenu uključuju, ali nisu ograničeni na, farmaceutski prihvatljive emulzije, mikroemulzije, rastvore, suspenzije, sirupe, i/ili eliksire. Pored aktivnih sastojaka, tečni dozni oblici mogu da sadrže inertne razblaživače koji se uobičajeno upotrebljavaju u struci, kao što su, na primer, voda ili drugi rastvarači, agensi za solubilizaciju i emulgatori kao što su etil alkohol, izopropil alkohol, etil karbonat, etil acetat, benzil alkohol, benzil benzoat, propilen glikol, 1,3-butilen glikol, dimetilformamid, ulja (posebno, ulje semena pamuka, kikirikija, kukuruza, klica, masline, ricinusa, i susama), glicerol, tetrahidrofurfuril alkohol, polietilen glikoli i estri masnih kiselina sorbitana, i njihove smeše. Osim inertnih razblaživača, oralne kompozicije mogu da uključuju adjuvanse kao što su agensi za vlaženje, agensi za emulgovanje i suspendovanje, zaslađivači, arome, i/ili agensi za davanje mirisa. U određenim slučajevima za parenteralnu primenu, kompozicije se mešaju sa agensima za solubilizaciju kao što

4

su CREMOPHOR<®>, alkoholi, ulja, modifikovana ulja, glikoli, polisorbati, ciklodekstrini, polimeri, i/ili njihove kombinacije.

[0623] Injektabilni preparati, na primer, sterilne injektabilne vodene ili uljne suspenzije mogu da budu formulisane u skladu sa poznatom strukom upotrebom pogodnih agenasa za dispergovanje, agenasa za vlaženje, i/ili agenasa za suspendovanje. Sterilni injektabilni preparati mogu da budu sterilni injektabilni rastvori, suspenzije, i/ili emulzije u netoksičnim parenteralno prihvatljivim razblaživačima i/ili rastvaračima, na primer, kao rastvor u 1,3-butandiolu. Među prihvatljivim vehikulumima i rastvaračima koji se mogu koristiti su voda, Ringerov rastvor, USP, i izotonični rastvor natrijum hlorida. Sterilna, fiksna ulja se konvencionalno koriste kao rastvarač ili medijum za suspendovanje. U tu svrhu može se koristiti bilo koje blago fiksno ulje, uključujući sintetičke mono- ili digliceride. Masne kiseline, kao što je oleinska kiselina, mogu da se upotrebe u pripremi injekcija.

[0624] Injektabilne formulacije mogu da budu sterilisane, na primer, filtracijom kroz filter koji zadržava bakterije, i/ili inkorporisanjem agenasa za sterilizaciju u obliku sterilnih čvrstih kompozicija koje se mogu rastvoriti ili dispergovati u sterilnoj vodi ili drugom sterilnom injektabilnom medijumu pre upotrebe.

[0625] Kako bi se produžio efekat aktivnog sastojka, često je poželjno usporiti apsorpciju aktivnog sastojka iz subkutane ili intramuskularne injekcije. Ovo se može postići upotrebom tečne suspenzije kristalnog ili amorfnog materijala sa slabom solubilnošću u vodi. Stopa apsorpcije leka tada zavisi od njegove stope rastvaranja koja, pak, može zavisiti od veličine kristala i kristalnog oblika. Alternativno, odložena apsorpcija parenteralno primenjenog oblika leka se postiže rastvaranjem ili suspendovanjem leka u uljanom vehikulumu. Injektabilni depo oblici se prave formiranjem mikroinkapsuliranih matriksa leka u biorazgradivim polimerima kao što je polilaktidpoliglikolid. U zavisnosti od odnosa leka prema polimeru i prirode određenog polimera koji se koristi, može se kontrolisati stopa oslobađanja leka. Primeri drugih biorazgradivih polimera uključuju poli(ortoestre) i poli(anhidride). Injektabilne depo formulacije se pripremaju zarobljavanjem leka u lipozome ili mikroemulzije koje su kompatibilne sa tkivima u telu.

Rektalna i vaginalna primena

[0626] Kompozicije za rektalnu ili vaginalnu primenu su tipično supozitorije koje se mogu pripremiti mešanjem kompozicija sa pogodnim neiritirajućim ekscipijensima kao što su kakao buter, polietilen glikol ili vosak za supozitorije koji su čvrsti na temperaturi okoline, ali tečni na

4 1

telesnoj temperaturi i prema tome se tope u rektumu ili vaginalnoj šupljini i oslobađaju aktivni sastojak.

Oralna primena

[0627] Čvrsti dozni oblici za oralnu primenu uključuju kapsule, tablete, pilule, praškove, i granule. U takvim čvrstim doznim oblicima, aktivni sastojak je pomešan sa najmanje jednim inertnim, farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom, kao što su natrijum citrat ili dikalcijum fosfat i/ili fileri ili ekstenderi (npr. skrobovi, laktoza, saharoza, glukoza, manitol, i silicijumova kiselina), veziva (npr. karboksimetilceluloza, alginati, želatin, polivinilpirolidinon, saharoza, i akacija), ovlaživači (npr. glicerol), agensi za dezintegraciju (npr. agar, kalcijum karbonat, krompirov ili tapioka skrob, alginska kiselina, određeni silikati, i natrijum karbonat), agensi za usporavanje rastvora (npr. parafin), ubrzivači apsorpcije (npr. kvaternarna amonijum jedinjenja), agensi za vlaženje (npr. cetil alkohol i glicerol monostearat), apsorbanti (npr. kaolin i bentonit glina), i lubrikanti (npr. talk, kalcijum stearat, magnezijum stearat, čvrsti polietilen glikoli, natrijum lauril sulfat), i njihove smeše. U slučaju kapsula, tableta i pilula, dozni oblik može sadržati agense za puferisanje.

Topikalna ili transdermalna primena

[0628] Kao što je ovde opisano, kompozicije koje sadrže polinukleotide, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšanu modifikovanu RNK ili ribonukleinske kiseline prema prikazu, mogu da budu formulisane za topikalnu primenu. Koža može da bude idealno ciljno mesto za isporuku pošto je lako dostupna. Ekspresija gena može da bude ograničena ne samo na kožu, čime se potencijalno izbegava nespecifična toksičnost, već i na specifične slojeve i tipove ćelija unutar kože.

[0629] Mesto kutane ekspresije isporučenih kompozicija zavisiće od puta isporuke nukleinske kiseline. Tri puta se uobičajeno razmatraju za isporuku polinukleotida, modifikovanih nukleinskih kiselina, poboljšane modifikovane RNK ili ribonukleinskih kiselina u kožu: (i) topikalna aplikacija (npr. za lokalno/regionalno lečenje); (ii) intradermalna injekcija (npr. za lokalno/regionalno lečenje); i (iii) sistemska isporuka (npr. za lečenje dermatoloških bolesti koje utiču i na kutane i na ekstrakutane regione). Polinukleotidi, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline mogu da budu isporučeni u kožu pomoću nekoliko različitih pristupa poznatih u struci. Pokazano je da većina pristupa topikalne isporuke funkcioniše za isporuku DNK, kao što su, ali bez ograničenja, topikalna aplikacija kompleksa nekatjonski lipozom-DNK, kompleksa katjonski lipozom-DNK, transfekcija gena posredovana česticama (genski pištolj), transfekcija gena posredovana punkcijom, i pristupi virusne isporuke. Posle

4 2

isporuke nukleinske kiseline, genski proizvodi su detektovani u brojnim različitim tipovima ćelija kože, uključujući, ali bez ograničenja, bazalne keratinocite, ćelije lojnih žlezda, dermalne fibroblaste i dermalne makrofage.

[0630] U jednom slučaju, prikaz obezbeđuje različite obloge (npr. obloge za rane) ili zavoje (npr. lepljive zavoje) za pogodno i/ili efikasno izvođenje postupaka predmetnog prikaza. Tipično obloge ili zavoji mogu da sadrže dovoljne količine farmaceutskih kompozicija i/ili polinukleotida, modifikovanih nukleinskih kiselina, poboljšane modifikovane RNK ili ribonukleinskih kiselina koji su ovde opisani kako bi se korisniku omogućilo da izvede više tretmana subjekta/subjekata.

[0631] U jednom slučaju, prikaz obezbeđuje da se kompozicije polinukleotida, modifikovanih nukleinskih kiselina, poboljšane modifikovane RNK ili ribonukleinskih kiselina isporučuju u više od jedne injekcije.

[0632] U jednom slučaju, pre topikalne i/ili transdermalne primene najmanje jedno područje tkiva, kao što je koža, može da bude podvrgnuto uređaju i/ili rastvoru koji mogu da povećaju permeabilnost. U jednom slučaju, tkivo može da bude podvrgnuto abrazivnom uređaju kako bi se povećala permeabilnost kože (videti SAD patentnu objavu br.20080275468). U sledećem slučaju, tkivo može da bude podvrgnuto ultrazvučnom uređaju za poboljšanje permeabilnosti. Ultrazvučni uređaj za poboljšanje permeabilnosti može da uključuje, ali nije ograničen na, uređaje opisane u SAD objavi br.20040236268 i SAD patentima br.6,491,657 i 6,234,990. Postupci za poboljšanje permeabilnosti tkiva opisani su u SAD objavama br.20040171980 i 20040236268 i SAD pat. br.

6,190,315.

[0633] U jednom slučaju, uređaj može da se upotrebljava kako bi se povećala permeabilnost tkiva pre isporuke formulacija ovde opisane modifikovane mRNA. Permeabilnost kože može da se izmeri postupcima poznatim u struci i/ili opisanim u SAD patentu br. 6,190,315. Kao neograničavajući primer, formulacija modifikovane mRNA može da bude isporučena postupcima za isporuku leka koji su opisani u SAD patentu br.6,190,315.

[0634] U sledećem neograničavajućem primeru, tkivo može da bude tretirano eutektičkom smešom kreme lokalnih anestetika (EMLA) pre, tokom i/ili pošto tkivo može da bude podvrgnuto uređaju koji može da poveća permeabilnost. Katz et al. (Anesth Analg (2004); 98:371-76) su pokazali da se pri upotrebi EMLA kreme u kombinaciji sa niskom energijom, pojava površinske kutane analgezije zapaža već 5 minuta posle pretretmana ultrazvukom niske energije.

[0635] U jednom slučaju, poboljšivači mogu da budu naneti na tkivo pre, tokom i/ili pošto je tkivo tretirano kako bi se povećala permeabilnost. Poboljšivači uključuju, ali nisu ograničeni na, poboljšivače transporta, fizičke poboljšivače, i poboljšivače kavitacije. Neograničavajući primeri poboljšivača opisani su u SAD patentu br.6,190,315.

4

[0636] U jednom slučaju, uređaj može da bude upotrebljen za povećanje permeabilnosti tkiva pre isporuke formulacija ovde opisane modifikovane mRNA, koja može dodatno da sadrži supstancu koja izaziva imunski odgovor. U sledećem neograničavajućem primeru, formulacija koja sadrži supstancu koja izaziva imunski odgovor može da bude isporučena postupcima opisanim u SAD objavama br.20040171980 i 20040236268.

[0637] Dozni oblici za topikalnu i/ili transdermalnu primenu kompozicije mogu uključivati masti, paste, kreme, losione, gelove, praškove, rastvore, sprejeve, inhalante i/ili flastere. Generalno, aktivni sastojak se meša u sterilnim uslovima sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom i/ili bilo kojim potrebnim konzervansima i/ili puferima kao što može da bude potrebno. Dodatno, predmetni prikaz razmatra upotrebu transdermalnih flastera, koji često imaju dodatnu prednost u obezbeđivanju kontrolisane isporuke jedinjenja u telo. Takvi dozni oblici mogu da budu pripremljeni, na primer, rastvaranjem i/ili disperzijom jedinjenja u odgovarajućem medijumu. Alternativno ili dopunski, stopa se može kontrolisati bilo obezbeđivanjem membrane za kontrolu stope i/ili dispergovanjem jedinjenja u polimernoj matrici i/ili gelu.

[0638] Formulacije pogodne za topikalnu primenu uključuju, ali nisu ograničene na, tečne i/ili polutečne preparate kao što su linimenti, losioni, emulzije ulje u vodi i/ili voda u ulju kao što su kreme, masti i/ili paste, i/ili rastvori i/ili suspenzije.

[0639] Formulacije za topikalnu primenu mogu, na primer, da sadrže od oko 0.1% do oko 10% (tež./tež.) aktivnog sastojka, mada koncentracija aktivnog sastojka može da bude toliko visoka kolika je granica solubilnosti aktivnog sastojka u rastvaraču. Formulacije za topikalnu primenu mogu dodatno sadržati jedan ili više od dopunskih sastojaka koji su ovde opisani.

Depo primena

[0640] Kao što je ovde opisano, u nekim slučajevima, kompozicija je formulisana u depoima za produženo oslobađanje. Uopšteno, specifični organ ili tkivo ("ciljno tkivo") je ciljano za primenu.

[0641] U nekim aspektima prikaza, nukleinske kiseline (posebno ribonukleinske kiseline koje kodiraju polipeptide) prostorno se zadržavaju unutar ili u blizini ciljnog tkiva. Obezbeđeni su postupci obezbeđivanja kompozicije ciljnom tkivu subjekta sisara dovođenjem u kontakt ciljnog tkiva (koje sadrži jednu ili više ciljnih ćelija) sa kompozicijom pod takvim uslovima da se kompozicija, posebno komponenta/komponente nukleinske kiseline kompozicije, suštinski zadržava u ciljnom tkivu, što znači da se najmanje 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.9, 99.99 ili više od 99.99% kompozicije zadržava u ciljnom tkivu. Povoljno, zadržavanje se određuje merenjem količine nukleinske kiseline prisutne u kompoziciji koja ulazi

4 4

u jednu ili više ciljnih ćelija. Na primer, najmanje 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99.9, 99.99 ili više od 99.99% nukleinskih kiselina koje su primenjene kod subjekta je prisutno unutar ćelije u vremenskom periodu nakon primene. Na primer, intramuskularna injekcija subjektu sisaru izvodi se upotrebom vodene kompozicije koja sadrži ribonukleinsku kiselinu i reagens za transfekciju, i zadržavanje kompozicije se određuje merenjem količine ribonukleinske kiseline prisutne u mišićnim ćelijama.

[0642] Aspekti prikaza su usmereni na postupke obezbeđivanja kompozicije ciljnom tkivu subjekta sisara, dovođenjem u kontakt ciljnog tkiva (koje sadrži jednu ili više ciljnih ćelija) sa kompozicijom pod takvim uslovima da se kompozicija suštinski zadrži u ciljnom tkivu. U drugom slučaju, polinukleotid, ribonukleinska kiselina konstruisana da izbegne urođeni imunski odgovor ćelije u koju ulazi ribonukleinska kiselina, pri čemu ribonukleinska kiselina sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid od interesa, pod uslovima takvim da se polipeptid od interesa proizvodi u najmanje jednoj ciljnoj ćeliji. Kompozicije generalno sadrže agens za penetraciju u ćeliju, mada se takođe razmatra "gola" nukleinska kiselina (kao što su nukleinske kiseline bez agensa za penetraciju u ćeliju ili drugog agensa), i farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0643] U nekim okolnostima, količina proteina koju proizvode ćelije u tkivu je poželjno povećana. Poželjno, ovo povećanje proizvodnje proteina je prostorno ograničeno na ćelije unutar ciljnog tkiva. Stoga, obezbeđeni su postupci povećanja proizvodnje proteina od interesa u tkivu subjekta sisara. Obezbeđena je kompozicija koja sadrži ribonukleinsku kiselinu konstruisanu da izbegne urođeni imunski odgovor ćelije u koju ulazi ribonukleinska kiselina i kodira polipeptid od interesa i kompozicija se odlikuje time što je jedinična količina kompozicije određena tako da proizvede polipeptid od interesa u značajnom procentu ćelija sadržanih unutar unapred određene zapremine ciljnog tkiva.

[0644] U nekim slučajevima, kompozicija uključuje mnoštvo različitih ribonukleinskih kiselina, gde je jedna ili više od jedne ribonukleinske kiseline konstruisana da izbegne urođeni imunski odgovor ćelije u koju ulazi ribonukleinska kiselina, i pri čemu jedna ili više od jedne ribonukleinske kiseline kodira polipeptid od interesa. Opciono, kompozicija takođe sadrži agens za penetraciju u ćeliju koji pomaže u unutarćelijskoj isporuci ribonukleinske kiseline. Određuje se doza kompozicije potrebna za proizvodnju polipeptida od interesa u značajnom procentu ćelija sadržanih unutar unapred određene zapremine ciljnog tkiva (generalno, bez indukovanja značajne proizvodnje polipeptida od interesa u susednom tkivu do unapred određenog volumena, ili distalno od ciljnog tkiva). Nakon ovog određivanja, određena doza se introdukuje direktno u tkivo subjekta sisara.

4

[0645] U jednom slučaju, prikaz obezbeđuje da polinukleotidi, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline budu isporučeni u više od jedne injekcije ili injekcijama podeljene doze.

[0646] U jednom slučaju, polinukleotid može da bude zadržan u blizini ciljnog tkiva upotrebom malog rezervoara za lek za jednokratnu upotrebu ili pumpe u vidu flastera. Neograničavajući primeri pumpi u vidu flastera uključuju one koje proizvode i/ili prodaju kompanije BD<®>, (Franklin Lakes, NJ), Insulet Corporation (Bedford, MA), SteadyMed Therapeutics (San Francisco, CA), Medtronic (Minneapolis, MN) , UniLife (York, PA), Valeritas (Bridgewater, NJ), i SpringLeaf Therapeutics (Boston, MA).

Primena preko pluća

[0647] Farmaceutska kompozicija može da bude pripremljena, upakovana, i/ili prodata u formulaciji pogodnoj za pulmonalnu primenu putem bukalne šupljine. Takva formulacija može da sadrži suve čestice koje sadrže aktivni sastojak i koje imaju prečnik u opsegu od oko 0.5 nm do oko 7 nm ili od oko 1 nm do oko 6 nm. Takve kompozicije su pogodno u obliku suvih praškova za primenu upotrebom uređaja koji sadrži rezervoar suvog praška u koji se može usmeriti mlaz propelanta za dispergovanje praška i/ili upotrebom samopropelantnog rastvarača/kontejnera za dispergovanje praška, kao što je uređaj koji sadrži aktivni sastojak rastvoren i/ili suspendovan u propelantu sa niskom tačkom ključanja u zapečaćenom kontejneru. Takvi praškovi sadrže čestice u kojima najmanje 98% čestica po težini ima prečnik veći od 0.5 nm, i najmanje 95% čestica po broju ima prečnik manji od 7 nm. Alternativno, najmanje 95% čestica po težini ima prečnik veći od 1 nm, i najmanje 90% čestica po broju ima prečnik manji od 6 nm. Kompozicije suvog praška mogu uključivati čvrsti razblaživač u prašku kao što je šećer i pogodno se obezbeđuju u jediničnom doznom obliku.

[0648] Propelanti sa niskom tačkom ključanja generalno uključuju tečne propelante koji imaju tačku ključanja ispod 65 °F pri atmosferskom pritisku. Generalno, propelant može činiti 50% do 99.9% (tež./tež.) kompozicije, i aktivni sastojak može činiti 0.1% do 20% (tež./tež.) kompozicije. Propelant može dodatno sadržati dopunske sastojke kao što su tečni nejonski i/ili čvrsti anjonski surfaktant i/ili čvrsti razblaživač (koji mogu imati veličinu čestica istog reda veličine kao i čestice koje sadrže aktivni sastojak).

[0649] Farmaceutske kompozicije formulisane za pulmonalnu isporuku mogu obezbediti aktivni sastojak u obliku kapljica rastvora i/ili suspenzije. Takve formulacije mogu da budu pripremljene, upakovane, i/ili prodate kao vodeni i/ili razblaženi alkoholni rastvori i/ili suspenzije, opciono

4

sterilne, koje sadrže aktivni sastojak, i mogu se pogodno primenjivati upotrebom bilo kog uređaja za nebulizaciju i/ili atomizaciju. Takve formulacije mogu dodatno sadržati jedan ili više dopunskih sastojaka uključujući, ali bez ograničenja na, agens za aromu kao što je natrijum saharin, isparljivo ulje, agens za puferisanje, površinski aktivni agens, i/ili konzervans kao što je metilhidroksibenzoat. Kapljice koje se obezbeđuju ovim putem primene mogu imati prosečan prečnik u opsegu od oko 0.1 nm do oko 200 nm.

Intranazalna, nazalna i bukalna primena

[0650] Formulacije koje su ovde opisane kao korisne za pulmonalnu isporuku su korisne za intranazalnu isporuku farmaceutske kompozicije. Sledeća formulacija pogodna za intranazalnu primenu je grubi prašak koji sadrži aktivni sastojak i ima prosečne čestice od oko 0.2 µm do 500 µm. Takva formulacija se primenjuje na način na koji se uzima burmut, tj. brzim udisanjem kroz nazalni prolaz iz kontejnera sa praškom koji se drži blizu nosa.

[0651] Formulacije pogodne za nazalnu primenu mogu, na primer, sadržati od oko samo 0.1% (tež./tež.) i čak 100% (tež./tež.) aktivnog sastojka, i mogu sadržati jedan ili više dopunskih sastojaka koji su ovde opisani. Farmaceutska kompozicija može da bude pripremljena, upakovana, i/ili prodata u formulaciji pogodnoj za bukalnu primenu. Takve formulacije mogu, na primer, biti u obliku tableta i/ili lozengi napravljenih upotrebom konvencionalnih postupaka, i mogu, na primer, sadržati 0.1% do 20% (tež./tež.) aktivnog sastojka, gde ostatak sadrži oralno rastvorljivu i/ili razgradivu kompoziciju i, opciono, jedan ili više od dopunskih sastojaka koji su ovde opisani. Alternativno, formulacije pogodne za bukalnu primenu mogu sadržati prašak i/ili aerosolizovan i/ili atomizovan rastvor i/ili suspenziju koja sadrži aktivni sastojak. Takve praškaste, aerosolizovane, i/ili aerosolizovane formulacije, kada se disperguju, mogu imati prosečnu veličinu čestica i/ili kapljica u opsegu od oko 0.1 nm do oko 200 nm, i mogu dodatno sadržati jedan ili više od bilo kojih dopunskih sastojaka koji su ovde opisani.

Oftalmološka primena

[0652] Farmaceutska kompozicija može da bude pripremljena, upakovana, i/ili prodata u formulaciji pogodnoj za oftalmološku primenu. Takve formulacije mogu, na primer, biti u obliku kapi za oči uključujući, na primer, 0.1/1.0% (tež./tež.) rastvor i/ili suspenziju aktivnog sastojka u vodenom ili uljanom tečnom ekscipijensu. Takve kapi mogu dodatno sadržati agense za puferisanje, soli, i/ili jedan ili više drugih od bilo kojih dopunskih sastojaka koji su ovde opisani. Druge oftalmološki primenljive formulacije koje su korisne uključuju one koje sadrže aktivni

4

sastojak u mikrokristalnom obliku i/ili u lipozomskom preparatu. Razmatraju se kapi za uši i/ili kapi za oči.

Primena opterećenja lekom: Detektabilni agensi i terapeutski agensi

[0653] Ovde opisani polinukleotidi, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline mogu se upotrebljavati u brojnim različitim scenarijima u kojima je poželjna isporuka supstance ("opterećenje lekom") biološkom cilju, na primer isporuka detektabilnih supstanci radi detektovanja cilja, ili isporuka terapeutskog agensa. Postupci detekcije mogu da uključuju, ali nisu ograničeni na, postupke i in vitro i in vivo snimanja, npr. imunohistohemiju, snimanje bioluminescencijom (BLI), snimanje magnetnom rezonancom (MRI), pozitronsku emisionu tomografiju (PET), elektronsku mikroskopiju, rendgensku kompjuterizovanu tomografiju, Raman snimanje, optičku koherentnu tomografiju, apsorpciono snimanje, termičko snimanje, fluorescentno refleksiono snimanje, fluorescentnu mikroskopiju, snimanje fluorescentnom molekulskom tomografijom, snimanje nuklearnom magnetnom rezonancom, rendgensko snimanje, ultrazvučno snimanje, fotoakustičko snimanje, laboratorijske testove, ili u bilo kojoj situaciji u kojoj je potrebno označavanje/bojenje/snimanje.

[0654] Polinukleotidi, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline mogu da budu dizajnirani tako da uključuju i linker i opterećenje lekom u bilo kojoj korisnoj orijentaciji. Na primer, linker koji ima dva kraja se upotrebljava kako bi se jedan kraj vezao za opterećenje lekom, a drugi kraj za nukleobazu, na primer, na C-7 ili C-8 pozicijama deaza-adenozina ili deaza-guanozina ili za N-3 ili C-5 pozicije citozina ili uracila. Polinukleotid prikaza može da uključuje više od jednog opterećenja lekom (npr. oznaka i inhibitor transkripcije), kao i linker koji može da se otcepi.

[0655] U jednom slučaju, modifikovani nukleotid je modifikovani 7-deaza-adenozin trifosfat, gde je jedan kraj linkera koji može da se otcepi vezan za C7 poziciju 7-deaza-adenina, a drugi kraj linkera je vezan za inhibitor (npr. za C5 poziciju nukleobaze na citidinu), i oznaka (npr. Cy5) je vezan za centar linkera (videti, npr. jedinjenje 1 od A<∗>pCp C5 Parg Capless na Sl.5 i u kolonama 9 i 10 SAD pat. br.7,994,304). Nakon inkorporacije modifikovanog 7-deaza-adenozin trifosfata u kodirajući region, rezultujući polinukleotid ima linker koji može da se otcepi vezan za oznaku i inhibitor (npr. inhibitor polimeraze). Nakon isecanja linkera (npr. sa reduktivnim uslovima za redukciju linkera koji ima disulfidni fragment koji može da se otcepi), oznaka i inhibitor se oslobađaju. U ovom dokumentu opisani su dodatni linkeri i opterećenja lekom (npr. terapeutski agensi, detektabilne oznake, i opterećenja lekom koja penetriraju u ćeliju).

4

[0656] Na primer, ovde opisani polinukleotidi, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline mogu da se upotrebe u reprogramiranju indukovanih pluripotentnih matičnih ćelija (iPS ćelije), koji mogu direktno da prate ćelije koje su transfektovane u poređenju sa ukupnim ćelijama u klasteru. U sledećem primeru, lek koji može da bude vezan za modifikovane nukleinske kiseline, poboljšanu modifikovanu RNK ili ribonukleinske kiseline preko linkera i može da bude fluorescentno obeležen može se upotrebljavati za praćenje leka in vivo, npr. unutarćelijski. Drugi primeri uključuju, ali nisu ograničeni na, upotrebu polinukleotida, modifikovanih nukleinskih kiselina, poboljšane modifikovane RNK ili ribonukleinskih kiselina u reverzibilnoj isporuci leka u ćelije.

[0657] Ovde opisani polinukleotidi, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline mogu da se upotrebe u unutarćelijskom ciljnom delovanju opterećenja lekom, npr. detektabilnog ili terapeutskog agensa, na specifičnu organelu. Primeri unutarćelijskih ciljeva mogu da uključuju, ali nisu ograničeni na, nukleusnu lokalizaciju za naprednu obradu mRNA, ili nukleusnu lokalizacionu sekvencu (NLS) vezanu za mRNA koja sadrži inhibitor.

[0658] Pored toga, ovde opisani polinukleotidi, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline mogu se upotrebljavati za isporuku terapeutskih agenasa u ćelije ili tkiva, npr. kod živih životinja. Na primer, ovde opisani polinukleotidi, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline mogu se upotrebljavati za isporuku veoma polarnih hemoterapeutskih agenasa za ubijanje kancerskih ćelija. Polinukleotidi, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline vezani za terapeutski agens preko linkera mogu da olakšaju permeaciju membrane, omogućavajući terapeutskom agensu koji ulazi u ćeliju da dođe do unutarćelijskog cilja.

[0659] U drugom primeru, polinukleotidi, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline mogu da budu vezani za polinukleotide, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšanu modifikovanu RNK ili ribonukleinske kiseline virusni inhibitorni peptid (VIP) preko linkera koji može da se otcepi. Linker koji može da se otcepi može da oslobodi VIP i boju u ćeliju. U drugom primeru, polinukleotidi, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline mogu da budu vezani preko linkera za ADP-ribozilat, koji je odgovoran za delovanje nekih bakterijskih toksina, kao što su toksin kolere, toksin difterije, i toksin pertusisa. Ovi proteini toksina su ADP-riboziltransferaze koje modifikuju ciljne proteine u humanim ćelijama. Na primer, toksin kolere ADP-ribozilacijom

4

G proteina modifikuje humane ćelije izazivajući masivno izlučivanje tečnosti iz sluznice tankog creva, što rezultuje dijarejom koja ugrožava život.

[0660] U nekim slučajevima, opterećenje lekom može da bude terapeutski agens kao što je citotoksin, radioaktivni jon, hemioterapeutik, ili drugi terapeutski agens. Citotoksin ili citotoksični agens uključuje bilo koji agens koji može da bude štetan za ćelije. Primeri uključuju, ali nisu ograničeni na, taksol, citohalazin B, gramicidin D, etidijum bromid, emetin, mitomicin, etopozid, tenipozid, vinkristin, vinblastin, kolhicin, doksorubicin, daunorubicin, dihidroksiantracindion, mitoksantron, mitramicin, aktinomicin D,1-dehidrotestosteron, glukokortikoide, prokain, tetrakain, lidokain, propranolol, puromicin, majtanzinoide, npr. majtanzinol (videti SAD pat. br.

5,208,020), rahelmicin (CC-1065, videti SAD patente br. 5,475,092, 5,585,499, i 5,846,545), i njihove analoge ili homologe. Radioaktivni joni uključuju, ali nisu ograničeni na jod (npr. jod 125 ili jod 131), stroncijum 89, fosfor, paladijum, cezijum, iridijum, fosfat, kobalt, itrijum 90, samarijum 153, i praseodimijum. Drugi terapeutski agensi uključuju, ali nisu ograničeni na, antimetabolite (npr. metotreksat, 6-merkaptopurin, 6-tioguanin, citarabin, 5-fluorouracil dekarbazin), alkilujuće agense (npr. mehloretamin, tiotepa hlorambucil, rahelmicin (CC-1065), melfalan, karmustin (BSNU), lomustin (CCNU), ciklofosfamid, busulfan, dibromomanitol, streptozotocin, mitomicin C i cis-dihlorodiamin platina (II) (DDP) cisplatin), antracikline (npr. daunorubicin (ranije daunomicin) i doksorubicin), antibiotike (npr. daktinomicin (ranije aktinomicin), bleomicin, mitramicin, i antramicin (AMC)), i antimitotičke agense (npr. vinkristin, vinblastin, taksol i majtanzinoidi).

[0661] U nekim slučajevima, opterećenje lekom može da bude detektabilni agens, kao što su različiti mali organski molekuli, neorganska jedinjenja, nanočestice, enzimi ili supstrati enzima, fluorescentni materijali, luminescentni materijali (npr. luminol), bioluminescentni materijali (npr. luciferaza, luciferin, i ekuorin), hemiluminescentni materijali, radioaktivni materijali (npr.<18>F,<67>Ga,<81m>Kr,<82>Rb,<111>In,<123>I,<133>Xe,<201>Tl,<125>I,<35>S,<14>C,<3>H ili<99m>Tc (npr. kao pertehnetat (tehnetat (VII), TcO4-)), i kontrastni agensi (npr. zlato (npr. nanočestice zlata), gadolinijum (npr. helirani Gd), oksidi gvožđa (npr. superparamagnetni oksid gvožđa (SPIO), monokristalne nanočestice oksida gvožđa (MION), i ultramali superparamagnetni oksid gvožđa (USPIO)), helati mangana (npr. Mn-DPDP), barijum sulfat, jodirani kontrastni medijumi (joheksol), mikromehurići, ili perfluorougljenici). Takve optički detektabilne oznake uključuju, na primer, bez ograničenja, 4-acetamido-4'-izotiocijanatostilben-2,2'disulfonsku kiselinu; akridin i derivate (npr. akridin i akridin izotiocijanat); 5-(2'-aminoetil)aminonaftalen-1-sulfonsku kiselinu (EDANS); 4-amino-N-[3-vinilsulfonil)fenil]naftalimid-3,5 disulfonat; N-(4-anilino-1-naftil)maleimid; antranilamid; BODIPY; briljantno žutu; kumarin i derivate (npr. kumarin, 7-amino-4-metilkumarin (AMC,

4

kumarin 120), i 7-amino-4-trifluorometilkumarin (kumarin 151)); cijanin boje; cijanozin; 4',6-diaminidino-2-fenilindol (DAPI); 5'5"-dibromopirogalol-sulfonaftalein (bromopirogalol crvenu); 7-dietilamino-3-(4'-izotiocijanatofenil)-4-metilkumarin; dietilentiamin pentaacetat; 4,4'-diizotiocijanatodihidro-stilben-2,2'-disulfonsku kiselinu; 4,4'-diizotiocijanatostilben-2,2'-disulfonsku kiselinu; 5-[dimetilamino]-naftalen-1-sulfonil hlorid (DNS, dansilhlorid); 4-dimetilaminofenilazofenil-4'-izotiocijanat (DABITC); eozin i derivate (npr. eozin i eozin izotiocijanat); eritrozin i derivate (npr. eritrozin B i eritrozin izotiocijanat); etidijum; fluorescein i derivate (npr.5-karboksifluorescein (FAM), 5-(4,6-dihlorotriazin-2-il) aminofluorescein (DTAF), 2',7'-dimetoksi-4'5'-dihloro-6-karboksifluorescein, fluorescein, fluorescein izotiocijanat, X-rodamin-5-(i-6)-izotiocijanat (QFITC ili XRITC), i fluoreskamin); 2-[2-[3-[[1,3-dihidro-1,1-dimetil-3-(3-sulfopropil)-2H-benz[e]indol-2-iliden]etiliden]-2-[4-(etoksikarbonil)-1-piperazinil]-1-ciklopenten-1-il]etenil]-1,1-dimetil-3-(3-sulforpropil)-1H-benz[e]indolijum hidroksid, unutrašnju so, jedinjenje sa n,n-dietiletanaminom (1:1) (IR144); 5-hloro-2-[2-[3-[(5-hloro-3-etil-2(3H)-benzotiazol-iliden)etiliden]-2-(difenilamino)-1-ciklopenten-1-il]etenil]-3-etil benzotiazolijum perhlorat (IR140); malahit zeleno izotiocijanat; 4-metilumbeliferon ortokrezolftalein; nitrotirozin; pararozanilin; fenol crvenu; B-fikoeritrin; o-ftaldialdehid; piren i derivate (npr. piren, piren butirat, i sukcinimidil 1-piren); butiratne kvantne tačke; reaktivnu crvenu 4 (CibacronTM brilijantno crvena 3B-A); rodamin i derivate (npr.6-karboksi-X-rodamin (ROX), 6-karboksirodamin (R6G), lizamin rodamin B sulfonil hlorid rodamin (Rhod), rodamin B, rodamin 123, rodamin X izotiocijanat, sulforodamin B, sulforodamin 101, sulfonil hlorid derivat sulforodamina 101 (Teksas crveno), N,N,N',N'tetrametil-6-karboksirodamin (TAMRA) tetrametil rodamin i tetrametil rodamin, izotiocijanat (TRITC)); riboflavin; rozolnu kiselinu; derivate terbijum helata; cijanin-3 (Cy3); cijanin-5 (Cy5); cijanin-5.5 (Cy5.5), cijanin-7 (Cy7); IRD 700; IRD 800; Aleksa 647; La Jolta Blue; ftalo cijanin; i naftalo cijanin.

[0662] U nekim slučajevima, detektabilni agens može da bude nedetektabilni prekursor koji postaje detektabilan nakon aktivacije (npr. fluorogeni konstrukti tetrazin-fluorofor (npr. tetrazin-BODIPY FL, tetrazin-Oregon zelena 488, ili tetrazin-BODIPY TMR-X) ili fluorogeni agensi koji se mogu aktivirati enzimom (npr. PROSENSE<®>(VisEn Medical))). In vitro testovi u kojima se mogu upotrebljavati enzimski obeležene kompozicije uključuju, ali nisu ograničeni na, enzimske imunosorbentne testove (ELISA), testove imunoprecipitacije, imunofluorescenciju, enzimske imunotestove (EIA), radioimunotestove (RIA), i Westarn blot analizu. Kombinacija

[0663] Modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline mogu da se upotrebljavaju u kombinaciji sa jednim ili više drugih terapeutskih, profilaktičkih, dijagnostičkih, ili agenasa za snimanje. Pod "u kombinaciji sa", se ne implicira da

4 1

agensi moraju da se primenjuju u isto vreme i/ili da budu formulisani za isporuku zajedno, iako su ovi postupci isporuke obuhvaćeni prikazom. Kompozicije mogu da se primenjuju istovremeno sa, pre, ili posle, jednog ili više drugih željenih terapeutika ili medicinskih procedura. Uopšteno, svaki agens će se primenjivati u dozi i/ili u vremenskom rasporedu koji je određen za taj agens. U nekim slučajevima, predmetni prikaz obuhvata isporuku farmaceutskih, profilaktičkih, dijagnostičkih, ili kompozicija za snimanje u kombinaciji sa agensima koji mogu da poboljšaju njihovu bioraspoloživost, redukuju i/ili modifikuju njihov metabolizam, inhibiraju njihovu ekskreciju, i/ili modifikuju njihovu distribuciju unutar tela. Kao neograničavajući primer, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline mogu da se upotrebljavaju u kombinaciji sa farmaceutskim agensom za lečenje kancera ili za kontrolu hiperproliferativnih ćelija. U SAD patentu br. 7,964,571 opisana je kombinovana terapija za lečenje čvrstog primarnog ili metastaziranog tumora upotrebom farmaceutske kompozicije koja uključuje DNK plazmid koji kodira za interleukin-12 sa lipopolimerom i takođe primenom najmanje jednog antikancerskog agensa ili hemioterapeutika. Dodatno, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline predmetnog prikaza koje kodiraju antiproliferativne molekule mogu da budu u farmaceutskoj kompoziciji sa lipopolimerom (videti npr. SAD objavu br. 20110218231, koja patentno štiti farmaceutsku kompoziciju koja sadrži DNK plazmid koji kodira antiproliferativni molekul i lipopolimer) koji može da se primeni sa najmanje jednim hemioterapeutikom ili antikancerskim agensom.

Primena opterećenja lekom: Opterećenje lekom koje prodire u ćeliju

[0664] U nekim slučajevima, polinukleotidi, modifikovani nukleotidi i molekuli modifikovane nukleinske kiseline, koji su ugrađeni u nukleinsku kiselinu, npr., RNK ili mRNA, mogu da uključuju i opterećenje lekom koje može da bude fragment koji prodire u ćeliju ili agens koji poboljšava unutarćelijsku isporuku kompozicija. Na primer, kompozicije mogu da uključuju, ali nisu ograničene na, peptidnu sekvencu koji prodire u ćeliju koja olakšava isporuku u unutarćelijski prostor, npr., TAT peptid poreklom iz HIV, penetratine, transportane, ili peptide koji prodiru u ćelije poreklom od hCT, videti, npr., Caron et al, (2001) Mol Ther. 3(3):310-8; Langel, Cell-Penetrating Peptides: Processes and Applications (CRC Press, Boca Raton FL 2002); El-Andaloussi et al., (2005) Curr Pharm Des. 11(28):3597-611; i Deshayes et al., (2005) Cell Mol Life Sci.62(16):1839-49. Kompozicije mogu takođe da budu formulisane tako da uključuju agens koji prodire u ćeliju, npr., lipozome, koji poboljšava isporuku kompozicija u unutarćelijski prostor.

Primena opterećenja lekom: Biološki cilj

4 2

[0665] Ovde opisani modifikovani nukleotidi i molekuli modifikovane nukleinske kiseline, koji su ugrađeni u nukleinsku kiselinu, npr., RNK ili mRNA, mogu da se upotrebe za isporuku opterećenja lekom na bilo koji biološki cilj za koji specifični ligand postoji ili može da se generiše. Ligand može da se veže za biološki cilj bilo kovalentno ili nekovalentno.

[0666] Primeri bioloških ciljeva uključuju, ali nisu ograničeni na biopolimere, npr., antitela, nukleinske kiseline kao RNK i DNK, proteine, enzime; gde primeri proteina uključuju, ali nisu ograničeni na enzime, receptore i jonske kanale. U nekim slučajevima cilj može da bude marker specifičan za tkivo ili ćeliju, npr., protein koji se specifično eksprimira na odabranom tipu tkiva ili ćelije. U nekim slučajevima, cilj može da bude receptor, kao što su, ali bez ograničenja, receptori plazma membrane i receptori jedra; specifičniji primeri uključuju, ali nisu ograničeni na receptore kuplovane sa G-proteinom, proteine ćelijskih pora, proteine-transportere, antitela eksprimirana na površini ćelije, HLA proteine, MHC proteine i receptore faktora rasta.

Doziranje

[0667] Predmetni prikaz obezbeđuje postupke koji sadrže primenu modifikovanih mRNA i njihovih kodiranih proteina ili kompleksa u skladu sa prikazom kod subjekta kome je to potrebno. Nukleinske kiseline, proteini ili kompleksi, ili njihove farmaceutske kompozicije, kompozicije za snimanje, dijagnostičke, ili profilaktičke kompozicije, mogu da budu primenjene kod subjekta upotrebom bilo koje količine i bilo kojim putem primene koji je efikasan za preveniranje, lečenje, dijagnostikovanje, ili snimanje bolesti, poremećaja, i/ili stanja (npr. bolesti, poremećaja, i/ili stanja povezanih sa deficitima radne memorije). Tačna potrebna količina variraće od subjekta do subjekta, u zavisnosti od vrste, starosti, i opšteg stanja subjekta, težine bolesti, konkretne kompozicije, njenog načina primene, njenog načina aktivnosti, i slično. Kompozicije u skladu sa prikazom se tipično formulišu u jediničnom doznom obliku zbog lakše primene i uniformnosti doze. Podrazumeva se, međutim, da nadležni lekar može da odluči o ukupnoj dnevnoj upotrebi kompozicija iz predmetnog prikaza u okviru razumnog medicinskog rasuđivanja. Specifični terapeutski efikasan, profilaktički efikasan, ili odgovarajući nivo doze za snimanje za svakog određenog pacijenta zavisiće od različitih faktora, uključujući poremećaj koji se leči i težinu poremećaja; aktivnost specifičnog jedinjenja koje se koristi; specifičnu kompoziciju koja se koristi; starost, telesnu težinu, opšte zdravlje, pol i ishranu pacijenta; vreme primene, put primene, i stopu ekskrecije specifičnog jedinjenja koje se koristi; trajanje lečenja; lekove koji se upotrebljavaju u kombinaciji ili istovremeno sa specifičnim jedinjenjem koje se koristi; i slične faktore dobro poznate u medicinskoj struci.

4

[0668] U određenim slučajevima, kompozicije u skladu sa predmetnim prikazom mogu da budu primenjene pri nivoima doza dovoljnim da se isporuči od oko 0.0001 mg/kg do oko 100 mg/kg, od oko 0.001 mg/kg do oko 0.05 mg/kg, od oko 0.005 mg/kg do oko 0.05 mg/kg, od oko 0.001 mg/kg do oko 0.005 mg/kg, od oko 0.05 mg/kg do oko 0.5 mg/kg, od oko 0.01 mg/kg do oko 50 mg/kg, od oko 0.1 mg/kg do oko 40 mg/kg, od oko 0.5 mg/kg do oko 30 mg/kg, od oko 0.01 mg/kg do oko 10 mg/kg, od oko 0.1 mg/kg do oko 10 mg/kg, ili od oko 1 mg/kg do oko 25 mg/kg, telesne težine subjekta dnevno, jednom ili više puta dnevno, kako bi se postigao željeni terapeutski, dijagnostički, profilaktički, ili efekat za snimanje. Željena doza može da bude isporučena tri puta dnevno, dva puta dnevno, jednom dnevno, svaki drugi dan, svaki treći dan, svake nedelje, svake dve nedelje, svake tri nedelje, ili svake četiri nedelje. U nekim slučajevima, željena doza može da bude isporučena upotrebom više primena (npr. dve, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, jedanaest, dvanaest, trinaest, četrnaest, ili više primena).

[0669] U skladu sa predmetnim prikazom, otkriveno je da primena modifikovanih nukleinskih kiselina, poboljšane modifikovane RNK ili ribonukleinskih kiselina u režimima podeljenih doza proizvodi više nivoe proteina kod subjekata sisara. Kao što se ovde upotrebljava, "podeljena doza" je podela pojedinačne jedinične doze ili ukupne dnevne doze na dve ili više doza, npr. dve ili više primena pojedinačne jedinične doze. Kao što se ovde upotrebljava, "pojedinačna jedinična doza" je doza bilo kog terapeutika koji se primenjuje u jednoj dozi/u jednom trenutku/jednim putem/na jednoj tački kontakta, tj. događaj pojedinačne primene. Kao što se ovde upotrebljava, "ukupna dnevna doza" je količina koja se daje ili propisuje u periodu od 24 sata. Može se primeniti kao pojedinačna jedinična doza. U jednom slučaju, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline predmetnog prikaza se primenjuju kod subjekta u podeljenim dozama. Modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline mogu da budu formulisane samo u puferu, ili u formulaciji koja je ovde opisana.

Dozni oblici

[0670] Ovde opisana farmaceutska kompozicija može da bude formulisana u ovde opisanom doznom obliku, kao što je topikalni, intranazalni, intratrahealni, ili injektabilni (npr. intravenski, intraokularni, intravitrealni, intramuskularni, intrakardijalni, intraperitonealni, subkutani).

Tečni dozni oblici

4 4

[0671] Tečni dozni oblici za parenteralnu primenu uključuju, ali nisu ograničeni na, farmaceutski prihvatljive emulzije, mikroemulzije, rastvore, suspenzije, sirupe, i/ili eliksire. Pored aktivnih sastojaka, tečni dozni oblici mogu sadržati inertne razblaživače koji se uobičajeno upotrebljavaju u struci uključujući, ali bez ograničenja, vodu ili druge rastvarače, agense za solubilizaciju i emulgatore kao što su etil alkohol, izopropil alkohol, etil karbonat, etil acetat, benzil alkohol, benzil benzoat, propilen glikol, 1,3-butilen glikol, dimetilformamid, ulja (posebno, ulje semena pamuka, kikirikija, kukuruza, klica, masline, ricinusa, i susama), glicerol, tetrahidrofurfuril alkohol, polietilen glikole i estre masnih kiselina sorbitana, i njihove smeše. U nekim slučajevima za parenteralnu primenu, kompozicije se mogu mešati sa agensima za solubilizaciju kao što su CREMOPHOR<®>, alkoholi, ulja, modifikovana ulja, glikoli, polisorbati, ciklodekstrini, polimeri, i/ili njihove kombinacije.

Injektabilni oblici

[0672] Injektabilni preparati, na primer, sterilne injektabilne vodene ili uljne suspenzije mogu da budu formulisane u skladu sa poznatom strukom i mogu uključivati pogodne agense za dispergovanje, agense za vlaženje, i/ili agense za suspendovanje. Sterilni injektabilni preparati mogu da budu sterilni injektabilni rastvori, suspenzije, i/ili emulzije u netoksičnim parenteralno prihvatljivim razblaživačima i/ili rastvaračima, na primer, rastvor u 1,3-butandiolu. Među prihvatljivim vehikulumima i rastvaračima koji se mogu koristiti uključujući, ali bez ograničenja, su voda, Ringerov rastvor, USP, i izotonični rastvor natrijum hlorida. Sterilna, fiksna ulja se konvencionalno koriste kao rastvarač ili medijum za suspendovanje. U tu svrhu može se koristiti bilo koje blago fiksno ulje uključujući sintetičke mono- ili digliceride. Masne kiseline, kao što je oleinska kiselina, mogu se upotrebljavati u pripremi injekcija.

[0673] Injektabilne formulacije mogu da budu sterilisane, na primer, filtracijom kroz filter koji zadržava bakterije, i/ili inkorporisanjem agenasa za sterilizaciju u obliku sterilnih čvrstih kompozicija koje se mogu rastvoriti ili dispergovati u sterilnoj vodi ili drugom sterilnom injektabilnom medijumu pre upotrebe.

[0674] Kako bi se produžio efekat aktivnog sastojka, može da bude poželjno usporiti apsorpciju aktivnog sastojka iz subkutane ili intramuskularne injekcije. Ovo se može postići upotrebom tečne suspenzije kristalnog ili amorfnog materijala sa slabom solubilnošću u vodi. Stopa apsorpcije modifikovane mRNA tada zavisi od njegove stope rastvaranja koja, pak, može zavisiti od veličine kristala i kristalnog oblika. Alternativno, odložena apsorpcija parenteralno primenjene modifikovane mRNA može da bude postignuta rastvaranjem ili suspendovanjem modifikovane

4

mRNA u uljanom vehikulumu. Injektabilni depo oblici se prave formiranjem mikroinkapsuliranih matrica modifikovane mRNA u biorazgradivim polimerima kao što je polilaktid-poliglikolid. U zavisnosti od odnosa modifikovane mRNA prema polimeru i prirode određenog polimera koji se koristi, može se kontrolisati stopa oslobađanja modifikovane mRNA. Primeri drugih biorazgradivih polimera uključuju, ali nisu ograničeni na, poli(ortoestre) i poli(anhidride). Injektabilne depo formulacije mogu da budu pripremljene zarobljavanjem modifikovane mRNA u lipozome ili mikroemulzije koje su kompatibilne sa tkivima u telu.

Pulmonalni oblici

[0675] Formulacije koje su ovde opisane kao korisne za pulmonalnu isporuku mogu se takođe upotrebljavati za intranazalnu isporuku farmaceutske kompozicije. Sledeća formulacija pogodna za intranazalnu primenu može da bude grubi prašak koji sadrži aktivni sastojak i ima prosečne čestice od oko 0.2 µm do 500 µm. Takva formulacija se može primeniti na način na koji se uzima burmut, tj. brzim udisanjem kroz nazalni prolaz iz kontejnera sa praškom koji se drži blizu nosa.

[0676] Formulacije pogodne za nazalnu primenu mogu, na primer, sadržati od oko samo 0.1% (tež./tež.) i čak 100% (tež./tež.) aktivnog sastojka, i mogu sadržati jedan ili više od dopunskih sastojaka koji su ovde opisani. Farmaceutska kompozicija može da bude pripremljena, upakovana, i/ili prodata u formulaciji pogodnoj za bukalnu primenu. Takve formulacije mogu, na primer, biti u obliku tableta i/ili lozengi napravljenih upotrebom konvencionalnih postupaka, i mogu, na primer, sadržati oko 0.1% do 20% (tež./tež.) aktivnog sastojka, gde ostatak može sadržati oralno rastvorljivu i/ili razgradivu kompoziciju i, opciono, jedan ili više od dopunskih sastojaka koji su ovde opisani. Alternativno, formulacije pogodne za bukalnu primenu mogu sadržati prašak i/ili aerosolizovan i/ili atomizovan rastvor i/ili suspenziju koja sadrži aktivni sastojak. Takve praškaste, aerosolizovane, i/ili aerosolizovane formulacije, kada se disperguju, mogu imati prosečnu veličinu čestica i/ili kapljica u opsegu od oko 0.1 nm do oko 200 nm, i mogu dodatno sadržati jedan ili više od bilo kojih dopunskih sastojaka koji su ovde opisani.

[0677] Opšta razmatranja o formulaciji i/ili proizvodnji farmaceutskih agenasa mogu se pronaći, na primer, u Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21st ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005.

Obloge ili omotači

[0678] Čvrsti dozni oblici tableta, dražeja, kapsula, pilula, i granula mogu da budu pripremljeni sa oblogama i omotačima, kao što su enteričke obloge i druge obloge dobro poznate u struci

4

farmaceutske formulacije. Oni mogu opciono sadržati agense za zamućivanje i mogu da budu od kompozicije koje oslobađaju samo aktivni sastojak/sastojke, ili poželjno, u određenom delu intestinalnog trakta, opciono, na odložen način. Primeri kompozicija za ugradnju koje se mogu upotrebljavati uključuju polimerne supstance i voskove. Čvrste kompozicije sličnog tipa mogu se koristiti kao fileri u mekim i tvrdim želatinskim kapsulama upotrebom takvih ekscipijenasa kao što su laktoza ili mlečni šećer kao i polietilen glikoli velike molekulske mase i slično.

Kompleti

[0679] Prikaz obezbeđuje niz kompleta za pogodno i/ili efikasno izvođenje postupaka predmetnog prikaza. Tipično, kompleti će sadržati dovoljne količine i/ili broj komponenti da omoguće korisniku da izvede više tretmana subjekta/subjekata i/ili da izvede više eksperimenata.

[0680] U jednom aspektu, predmetni prikaz obezbeđuje komplete za proizvodnju proteina, koji sadrže prvo modifikovane nukleinske kiseline, poboljšanu modifikovanu RNK ili ribonukleinske kiseline koje sadrže region koji može da se translatira. Komplet može dodatno da sadrži pakovanje i uputstva i/ili agens za isporuku kako bi se formirala formulacija kompozicije. Agens za isporuku može da sadrži slani rastvor, puferisani rastvor, lipidoid ili bilo koji agens za isporuku koji je ovde opisan.

[0681] U jednom slučaju, puferski rastvor može da uključuje natrijum hlorid, kalcijum hlorid, fosfat i/ili EDTA. U drugom slučaju, puferski rastvor može da uključuje, ali nije ograničen na slani rastvor, slani rastvor sa 2mM kalcijuma, 5% saharoze, 5% saharoze sa 2mM kalcijuma, 5% manitola, 5% manitola sa 2mM kalcijuma, Ringerov laktat, natrijum hlorid, natrijum hlorid sa 2mM kalcijuma. U sledećem slučaju, puferski rastvori mogu da budu precipitirani ili mogu da budu liofilizovani. Količina svake komponente može da se varira kako bi se omogućila konzistentna, ponovljiva veća koncentracija slanog rastvora ili jednostavne formulacije pufera. Komponente takođe mogu da se variraju kako bi se povećala stabilnost modifikovane RNK u puferskom rastvoru tokom određenog vremenskog perioda i/ili pod različitim uslovima.

[0682] U jednom aspektu, predmetni prikaz obezbeđuje komplete za proizvodnju proteina, koji sadrže: modifikovane nukleinske kiseline, poboljšanu modifikovanu RNK ili ribonukleinske kiseline koje sadrže region koji može da se translatira, obezbeđene u količini koja je efikasna za proizvodnju željene količine proteina kodiranog regionom koji može da se translatira kada se uvedu u ciljnu ćeliju; drugo, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšanu modifikovanu RNK ili ribonukleinske kiseline koje sadrže inhibitornu nukleinsku kiselinu, obezbeđene u količini efikasnoj da suštinski inhibira urođeni imunski odgovor ćelije; i pakovanje i uputstva.

4

[0683] U jednom aspektu, predmetni prikaz obezbeđuje komplete za proizvodnju proteina, koji sadrže modifikovane nukleinske kiseline, poboljšanu modifikovanu RNK ili ribonukleinske kiseline koje sadrže region koji može da se translatira, pri čemu nukleinska kiselina ispoljava smanjenu razgradnju ćelijskom nukleazom, i pakovanje i uputstva.

[0684] U jednom aspektu, predmetni prikaz obezbeđuje komplete za proizvodnju proteina, koji sadrže modifikovane nukleinske kiseline, poboljšanu modifikovanu RNK ili ribonukleinske kiseline koje sadrže region koji može da se translatira, pri čemu nukleinska kiselina ispoljava smanjenu razgradnju ćelijskom nukleazom, i sisarsku ćeliju pogodnu za translaciju regiona koji može da se translatira prve nukleinske kiseline.

Uređaji

[0685] Predmetni prikaz obezbeđuje uređaje koji mogu da uključuju modifikovane nukleinske kiseline, poboljšanu modifikovanu RNK ili ribonukleinske kiseline koje kodiraju polipeptide od interesa. Ovi uređaji sadrže u stabilnoj formulaciji reagense za sintezu nukleinske kiseline u formulaciji koja je dostupna da se odmah isporuči subjektu kome je to potrebno, kao što je humani pacijent. Neograničavajući primeri takvog polipeptida od interesa uključuju faktor rasta i/ili stimulator angiogeneze za zarastanje rana, peptidni antibiotik koji olakšava kontrolu infekcije i antigen za brzo stimulisanje imunskog odgovora na novoidentifikovani virus.

[0686] U nekim slučajevima uređaj je samostalan, i opciono je sposoban za bežični daljinski pristup za dobijanje instrukcija za sintezu i/ili analizu generisanih modifikovanih nukleinskih kiselina, poboljšane modifikovane RNK ili ribonukleinskih kiselina. Uređaj je sposoban za mobilnu sintezu najmanje jedne modifikovane nukleinske kiseline, poboljšane modifikovane RNK ili ribonukleinske kiseline i poželjno neograničenog broja različitih modifikovanih nukleinskih kiselina, poboljšane modifikovane RNK ili ribonukleinskih kiselina. U određenim slučajevima, uređaj može da transportuje jedna ili mali broj osoba. U drugim slučajevima, uređaj se prilagođava tako da stane na radni pult ili sto. U drugim slučajevima, uređaj se prilagođava tako da stane u kofer, ranac ili predmet slične veličine. U drugom slučaju, uređaj može da bude uređaj koji se upotrebljava na mestu pružanja nege ili ručni uređaj. U daljim slučajevima, uređaj se prilagođava tako da stane u vozilo, kao što je automobil, kamion ili ambulantna kola, ili vojno vozilo kao što je tenk ili transporter. Informacije neophodne za generisanje ribonukleinske kiseline koja kodira polipeptid od interesa su prisutne u kompjuterski čitljivom medijumu prisutnom u uređaju.

4

[0687] U jednom slučaju, uređaj može da se koristi za procenu nivoa proteina koji je primenjen u obliku modifikovanih nukleinskih kiselina, poboljšane modifikovane RNK ili ribonukleinskih kiselina. Uređaj može da sadrži test za krv, urin ili drugi biološki fluid.

[0688] U nekim slučajevima, uređaj ima mogućnost komunikacije (npr. bežične komunikacije) sa bazom podataka sekvenci nukleinskih kiselina i polipeptida. Uređaj sadrži najmanje jedan blok za uzorak za umetanje jedne ili više posuda za uzorke. Takve posude za uzorke mogu da prihvate u tečnom ili drugom obliku bilo koji broj materijala kao što su matrična DNK, nukleotidi, enzimi, puferi i drugi reagensi. Posude za uzorke takođe mogu da se zagrevaju i hlade kontaktom sa blokom za uzorak. Blok za uzorak je uopšteno u komunikaciji sa bazom uređaja sa jednom ili više elektronskih kontrolnih jedinica za najmanje jedan blok uzorka. Blok uzorka poželjno sadrži grejni modul, takav molekul za zagrevanje sposoban da zagreje i/ili ohladi sudove za uzorke i njihov sadržaj na temperature između oko -20°C i iznad 100°C. Baza uređaja je u komunikaciji sa izvorom napona, kao što je baterija ili eksterno napajanje. Uređaj takođe sadrži sredstva za skladištenje i distribuciju materijala za sintezu RNK.

[0689] Opciono, blok za uzorke sadrži modul za odvajanje sintetizovanih nukleinskih kiselina. Alternativno, uređaj sadrži modul za razdvajanje koji je funkcionalno povezan sa blokom za uzorke. Poželjno, uređaj sadrži sredstvo za analizu sintetizovane nukleinske kiseline. Takva analiza uključuje identitet sekvence (pokazan, na primer, hibridizacijom), odsustvo nepoželjnih sekvenci, merenje integriteta sintetizovane mRNA (na primer, mikrofluidnom viskometrijom kombinovanom sa spektrofotometrijom), i koncentraciju i/ili potenciju modifikovanih nukleinskih kiselina, poboljšane modifikovane RNK ili ribonukleinskih kiselina (na primer, spektrofotometrijom).

[0690] U određenim slučajevima, uređaj se kombinuje sa sredstvom za detekciju patogena prisutnih u biološkom materijalu dobijenom od subjekta, na primer, IBIS PLEX-ID sistem (Abbott, Abbott Park, IL) za identifikaciju mikroba.

[0691] Pogodni uređaji za upotrebu u isporuci ovde opisanih intradermalnih farmaceutskih kompozicija uključuju uređaje sa kratkim iglama kao što su oni opisani u SAD patentima 4,886,499; 5,190,521; 5,328,483; 5,527,288; 4,270,537; 5,015,235; 5,141,496; i 5,417,662. Intradermalne kompozicije mogu da se primene pomoću uređaja koji ograničavaju efektivnu dužinu prodiranja igle u kožu, kao što su oni opisani u PCT objavi WO 99/34850 i njenim funkcionalnim ekvivalentima. Pogodni su uređaji za mlazno ubrizgavanje koji isporučuju tečne kompozicije u dermis preko mlaznog injektora tečnosti i/ili preko igle koja probija stratum corneum i proizvodi mlaz koji dopire do dermisa. Uređaji za mlazno ubrizgavanje opisani su, na primer, u SAD patentima 5,480,381; 5,599,302; 5,334,144; 5,993,412; 5,649,912; 5,569,189;

4

5,704,911; 5,383,851; 5,893,397; 5,466,220; 5,339,163; 5,312,335; 5,503,627; 5,064,413; 5,520,639; 4,596,556; 4,790,824; 4,941,880; 4,940,460; i PCT objavama WO 97/37705 i WO 97/13537. Pogodni su uređaji za balističku isporuku praha/čestica koji koriste komprimovani gas da ubrzaju vakcinu u obliku praha kroz spoljašnje slojeve kože do dermisa.

[0692] Alternativno ili dodatno, konvencionalni špricevi mogu da se koriste u klasičnom "mantoux postupku" za intradermalnu primenu.

[0693] U nekim slučajevima, uređaj može da bude pumpa ili da sadrži kateter za primenu jedinjenja ili kompozicija prikaza preko krvno-moždane barijere. Takvi uređaji uključuju, ali nisu ograničeni na uređaj za olfaktornu isporuku pod pritiskom, uređaje za jontoforezu, uređaje sa višeslojnim mikrofluidima, i slično. Takvi uređaji mogu da budu prenosivi ili stacionarni. Mogu da se implantiraju ili da budu spolja vezani za telo, ili kombinacije navedenog.

[0694] Uređaji za primenu mogu da se koriste za isporuku modifikovanih nukleinskih kiselina, poboljšane modifikovane RNK ili ribonukleinskih kiselina predmetnog prikaza u skladu sa pojedinačnim, višestrukim ili podeljenim režimima doziranja koji su ovde navedeni. Takvi uređaji su opisani u nastavku.

[0695] Postupak i uređaji poznati u tehnici za višestruku primenu na ćelije, organe i tkiva su predviđeni za upotrebu zajedno sa postupcima i kompozicijama koje su ovde opisane kao slučajevi predmetnog prikaza. Ovo uključuje, na primer, one postupke i uređaje koji imaju više igala, hibridne uređaje koji koriste, na primer, lumene ili katetere, kao i uređaje koji koriste mehanizme pokretane toplotom, električnom strujom ili zračenjem.

[0696] Prema ovom prikazu, ovi uređaji za višestruku primenu mogu da se koriste za isporuku pojedinačnih, višestrukih ili podeljenih doza koje su ovde razmatrane.

[0697] Postupak za isporuku terapeutskih agenasa u čvrsto tkivo opisali su Bahrami i saradnici i prikazan je na primer u SAD patentnoj objavi 20110230839. Prema Bahramiu, niz igala je ugrađen u uređaj koji isporučuje suštinski jednaku količinu tečnosti na bilo koju lokaciju u pomenutom čvrstom tkivu dužinom svake igle.

[0698] Uređaj za isporuku biološkog materijala kroz biološko tkivo opisali su Kodgule i saradnici i prikazan je na primer u SAD patentnoj objavi 20110172610. Prema Kodguleu, višestruke šuplje mikro igle napravljene od jednog ili više metala i koje imaju spoljni prečnik od oko 200 mikrona do oko 350 mikrona i dužine od najmanje 100 mikrona su ugrađene u uređaj koji isporučuje peptide, proteine, ugljene hidrate, molekule nukleinske kiseline, lipide i druge farmaceutski aktivne sastojke ili njihove kombinacije.

[0699] Sondu za isporuku za isporučivanje terapeutskog agensa u tkivo opisali su Gunday i saradnici i prikazan je na primer u SAD patentnoj objavi 20110270184. Kako navodi Gunday, više

4

igala je ugrađeno u uređaj koji pomera pričvršćene kapsule između aktiviranog položaja i neaktiviranog položaja kako bi se agens izbacio iz kapsula kroz igle.

[0700] Medicinski aparat za višestruko ubrizgavanje opisao je Assaf i on je prikazan, na primer, u SAD patentnoj objavi 20110218497. Prema Assafu, više igala je ugrađeno u uređaj koji ima komoru povezanu sa jednom ili više navedenih igala i sredstvo za kontinuirano punjenje komore medicinskom tečnošću nakon svake injekcije.

[0701] U jednom slučaju, modifikovane nukleinske kiseline, poboljšana modifikovana RNK ili ribonukleinske kiseline daju se subkutano ili intramuskularno preko najmanje 3 igle na tri različite, opciono susedne, lokacije istovremeno, ili u periodu od 60 minuta (npr. davanje na 4 ,5, 6, 7, 8, 9 ili 10 lokacija istovremeno ili u periodu od 60 minuta). Podeljene doze mogu da se daju istovremeno u susedno tkivo korišćenjem uređaja opisanih u SAD patentnim objavama br.

20110230839 i 20110218497.

[0702] Forsell je opisao barem delimično implantabilni sistem za ubrizgavanje supstance u telo pacijenta, posebno sistem za stimulaciju erekcije penisa, koji je opisan na primer u SAD patentnoj objavi 20110196198. Prema Forsellu, više igala je ugrađeno u uređaj koji se implantira zajedno sa jednim ili više kućišta pored pacijentovog levog i desnog kavernoznog tela. Za snabdevanje lekovima kroz igle implantiraju se i rezervoar i pumpa.

[0703] Berenson je opisao postupak za transdermalnu isporuku terapeutski efikasne količine gvožđa i on je, na primer, opisan u SAD patentnoj objavi 20100130910. Prema Berensonu, više igala može da se koristi za stvaranje više mikro kanala u sloju stratum corneum za poboljšanje transdermalne isporuke jonskog gvožđa na jonoforetskom flasteru.

[0704] Postupak za isporuku biološkog materijala kroz biološko tkivo opisali su Kodgule i saradnici i opisan je, na primer, u SAD patentnoj objavi 20110196308. Prema Kodguleu, višestruke biorazgradive mikroigle koje sadrže terapeutski aktivni sastojak su ugrađene u uređaj koji isporučuje proteine, ugljene hidrate, molekule nukleinske kiseline, lipide i druge farmaceutski aktivne sastojke ili njihove kombinacije.

[0705] Transdermalni flaster koji sadrži kompoziciju botulinskog toksina je opisao Donovan i prikazan je na primer u SAD patentnoj objavi 20080220020. Prema Donovanu, više igala je ugrađeno u flaster koji isporučuje botulinski toksin ispod sloja stratum corneum kroz pomenute igle koje prolaze kroz stratum corneum kože ne dovodeći do pucanja krvnog suda.

[0706] Mali rezervoar za lek za jednokratnu upotrebu, ili pumpa u vidu flastera, koja može da sadrži približno 0.2 do 15 mL tečnih formulacija, može da se postavi na kožu i da kontinuirano isporučuje formulaciju subkutano koristeći mali otvor koji je potreban (npr.26 do 34 gejdža) . Kao neograničavajući primeri, pumpa u vidu flastera može da ima dimenzije 50 mm x 76 mm x 20 mm

4 1

sa oprugom i iglom promera 30 do 34 gejdža (BD™ Microinfuser, Franklin Lakes NJ), 41 mm x 62 mm x 17 mm sa rezervoarom od 2 mL koji se koristi za isporuku lekova kao što je insulin (OMNIPOD<®>, Insulet Corporation Bedford, MA), ili prečnika 43-60 mm, debljine 10 mm sa rezervoarom od 0.5 do 10 mL (PATCHPUMP<®>, SteadyMed Therapeutics, San Francisco, CA). Dalje, pumpa u vidu flastera može da se napaja baterijama i/ili da bude punjiva.

[0707] Toubia je opisao kriosondu za davanje aktivnog agensa na mesto kriogenog tretmana i ona je prikazana, na primer, u SAD patentnoj objavi 20080140061. Kako navodi Toubia, više igala je ugrađeno u sondu koja prima aktivni agens u komoru i isporučuje agens u tkivo.

[0708] Postupak za lečenje ili prevenciju zapaljenja ili poboljšanje zdravstvenog stanja zglobova opisali su Stock i saradnici i on je prikazan, na primer, u SAD patentnoj objavi 20090155186. Prema Stocku, više igala je ugrađeno u uređaj koji isporučuje kompozicije koje sadrže jedinjenja za modulaciju transdukcije signala.

[0709] Sistem ubrizgavanja na više mesta opisali su Kimmell i saradnici i prikazan je, na primer, u SAD patentnoj objavi 20100256594. Prema Kimmellu, više igala je ugrađeno u uređaj koji isporučuje lek u stratum corneum kroz igle.

[0710] Postupak za isporuku interferona u intradermalni odeljak opisali su Dekker i saradnici i prikazan je na primer u SAD patentnoj objavi 20050181033. Prema Dekkeru, više igala čiji izlaz izviruje u visini između 0 i 1 mm ugrađeno je u uređaj koji poboljšava farmakokinetiku i biodostupnost isporukom supstance na dubini između 0.3 mm i 2 mm.

[0711] Desai je opisao postupak za isporuku gena, enzima i bioloških agenasa u ćelije tkiva i on je prikazan, na primer, u SAD patentnoj objavi 20030073908. Prema Desaiu, više igala je ugrađeno u uređaj koji se ubacuje u telo i isporučuje tečnost leka kroz navedene igle.

[0712] Postupak za lečenje srčanih aritmija fibroblastima opisali su Lee i saradnici i prikazan je, na primer, u SAD patentnoj objavi 20040005295. Kako navodi Lee, više igala je ugrađeno u uređaj koji isporučuje fibroblaste u lokalnu oblast tkiva.

[0713] Postupak koji koristi magnetno kontrolisanu pumpu za lečenje tumora na mozgu opisali su Shachar i saradnici i prikazan je, na primer, u SAD patentu 7,799,012 (postupak) i 7,799,016 (uređaj). Prema Shacharu, više igala je ugrađeno u pumpu koja gura lek kroz igle kontrolisanom brzinom.

[0714] Postupke za lečenje funkcionalnih poremećaja bešike kod ženki sisara opisali su Versi i saradnici i prikazani su, na primer, u SAD patentu 8,029,496. Kako navodi Versi, niz mikro-igala je ugrađen u uređaj koji isporučuje terapeutsko sredstvo kroz igle direktno u trigonum bešike.

[0715] Transdermalni transportni uređaj sa mikro-iglama opisali su Angel i saradnici i on je prikazan, na primer u SAD patentu 7,364,568. Prema Angelu, više igala je ugrađeno u uređaj koji

4 2

transportuje supstancu u površinu tela kroz igle koje se ubacuju u površinu iz različitih pravaca. Transdermalni transportni uređaj sa mikro-iglama može da bude sistem sa ispunjenim mikroiglama ili sistem sa šupljim mikro-iglama. Kao neograničavajući primer, sa ispunjenim mikroiglama može da ima kapacitet do 0.5 mg, sa 300-1500 ispunjenih mikro-igala po cm<2>, visine oko 150-700 µm, obloženih lekom. Mikro-igle prodiru u stratum corneum i ostaju u koži kratko (npr.

20 sekundi do 15 minuta). U drugom primeru, sistem sa šupljim mikro-iglama ima kapacitet do 3 mL za isporuku tečnih formulacija koristeći 15-20 mikro-igala po cm<2>, visine približno 950 µm. Mikro-igle prodiru u kožu kako bi omogućile tečnim formulacijama da isteku iz uređaja u kožu. Sistem sa šupljim mikro-iglama može da se nosi od 1 do 30 minuta u zavisnosti od zapremine i viskoziteta formulacije.

[0716] Uređaj za subkutanu infuziju opisali su Dalton i saradnici i prikazan je, na primer, u SAD patentu 7,150,726. Prema Daltonu, više igala je ugrađeno u uređaj koji isporučuje tečnost kroz igle u potkožno tkivo.

[0717] Uređaj i postupak za intradermalnu isporuku vakcina i agenasa za gensku terapiju kroz mikrokanile opisali su Mikszta i saradnici i oni su prikazani, na primer u SAD patentu 7,473,247. Prema opisu koji daje Mikszta, najmanje jedna šuplja mikro-igla je ugrađena u uređaj koji isporučuje vakcine u kožu subjekta do dubine između 0.025 mm i 2 mm.

[0718] Postupak za isporuku insulina opisali su Pettis i saradnici i on je prikazan, na primer, u SAD patentu 7,722,595. Prema Pettisu, dve igle su ugrađene u uređaj pri čemu se obe igle suštinski istovremeno zabadaju u kožu, pri čemu se prva ubacuje na dubinu manju od 2.5 mm da bi isporučila insulin u intradermalni odeljak, a druga na dubinu veću od 2.5 mm i manju od 5.0 mm za isporuku insulina u potkožni odeljak.

[0719] Kožno davanje injekcije pod sukcijom opisali su Kochamba i saradnici i prikazano je, na primer, u SAD patentu 6,896,666. Prema opisu koji daje Kochamba, više igala koje su međusobno relativno blisko postavljene ugrađeno je u uređaj koji ubrizgava tečnost ispod sloja kože.

[0720] Uređaj za povlačenje ili isporuku supstance kroz kožu opisali su Down i saradnici i prikazan je, na primer, u SAD patentu 6,607,513. Kako navodi Down, višestruki elementi koji prodiru u kožu koji su ugrađeni u uređaj imaju dužinu od oko 100 mikrona do oko 2000 mikrona i oko 30 do 50 gejdža.

[0721] Uređaj za isporuku supstance na kožu opisali su Palmer i saradnici i opisan je na primer u SAD patentu 6,537,242. Prema Palmeru, niz mikro-igala je ugrađen u uređaj koji koristi sklop za istezanje da bi se poboljšao kontakt igala sa kožom i obezbedila ravnomernija isporuka supstance.

[0722] Perfuzioni uređaj za lokalizovanu isporuku leka je opisao Zamoyski i prikazan je, na primer, u SAD patentu 6,468,247. Prema opisu koji daje Zamoyski, više hipodermičkih igala je

4

ugrađeno u uređaj koji ubrizgava sadržaj hipodermičkih igala u tkivo dok se navedene hipodermičke igle uvlače.

[0723] Postupak za pojačani transport lekova i bioloških molekula kroz tkivo poboljšanjem interakcije mikro-igala i ljudske kože opisali su Prausnitz i saradnici i prikazan je, na primer, u SAD patentu 6,743,211. Prema Prausnitzu, višestruke mikro-igle su ugrađene u uređaj koji je u stanju da predstavi čvršću i manje deformabilnu površinu na koju se nanose mikro-igle.

[0724] Uređaj za intraorgansku primenu medicinskih agenasa opisali su Ting i saradnici i prikazan je, na primer, u SAD patentu 6,077,251. Prema Tingu, više igala koje imaju bočne otvore za poboljšanu primenu su ugrađene u uređaj koji izvlačenjem i uvlačenjem navedenih igala iz i u komoru za igle potiskuje lek iz rezervoara u navedene igle i ubrizgava pomenuti lek u ciljni organ.

[0725] Držač višestrukih igala i potkožni višekanalni infuzioni port je opisao Brown i prikazani su, na primer, u SAD patentu 4,695,273. Kako navodi Brown, višestruke igle na držaču igala se ubacuju kroz septum infuzionog porta i one su u kontaktu sa izolovanim komorama u navedenom infuzionom portu.

[0726] Dvostruki hipodermički špric je opisao Horn i on je prikazan, na primer, u SAD patentu 3,552,394. Prema Hornu, dve igle ugrađene u uređaj su međusobno udaljene manje od 68 mm i mogu da budu različitih stilova i dužina, što omogućava ubrizgavanje na različitim dubinama.

[0727] Špric sa višestrukim iglama i više odeljaka za tečnost je opisao Hershberg i prikazan je, na primer, u SAD patentu 3,572,336. Prema Hershbergu, više igala je ugrađeno u špric koji ima više odeljaka za tečnost i može istovremeno da isporučuje nekompatibilne lekove koji inače ne mogu da se mešaju u jednoj injekciji.

[0728] Hirurški instrument za intradermalnu injekciju tečnosti opisali su Eliscu i saradnici i prikazan je, na primer, u SAD patentu 2,588,623. Kako navodi Eliscu, više igala je ugrađeno u instrument koji ubrizgava tečnosti intradermalno sa većom disperzijom.

[0729] Aparat za istovremenu isporuku supstance u više mlečnih kanala dojke je opisao Hung i prikazan je na primer u EP 1818017. Prema Hungu, više lumena je ugrađeno u uređaj koji se ubacuje kroz otvore mreža kanala i isporučuje tečnost u mreže kanala.

[0730] Tkebuchava je opisao kateter za uvođenje lekova u tkivo srca ili drugih organa i on je prikazan, na primer, u WO2006138109. Prema opisu koji daje Tkebuchava, ugrađene su dve zakrivljene igle koje ulaze u zid organa po putanji paralelnoj zidu organa.

[0731] Uređaje za isporuku medicinskih agenasa opisali su Mckay i saradnici i prikazani su, na primer, u WO2006118804. Prema opisu koji daje Mckay, više igala sa više otvora na svakoj igli su ugrađene u uređaje kako bi se olakšala regionalna isporuka u tkivo, kao što je unutrašnji prostor diska kičmenog diska.

4 4

[0732] Pettis je opisao postupak za direktnu isporuku imunomodulatorne supstance u intradermalni prostor unutar kože sisara i on je prikazan, na primer, u WO2004020014. Prema Pettisu, više igala je ugrađeno u uređaj koji isporučuje supstancu kroz igle do dubine između 0.3 mm i 2 mm.

[0733] Postupke i uređaje za isporuku supstanci u bar dva odeljka u koži za sistemsku apsorpciju i poboljšanu farmakokinetiku opisali su Pettis i saradnici i oni su prikazani, na primer, u WO2003094995 Prema Pettisu, više igala koje imaju dužinu između oko 300 µm i oko 5 mm su ugrađene u uređaj koji istovremeno obavlja isporuku u intradermalno i potkožno tkivo.

[0734] Uređaj za davanje leka sa iglama i valjkom opisali su Zimmerman i saradnici i prikazan je, na primer, u WO2012006259. Prema Zimmermanu, više šupljih igala postavljenih u valjak je ugrađeno u uređaj koji isporučuje sadržaj u rezervoar kroz igle dok se valjak rotira.

Postupci i uređaji koji koriste katetere i/ili lumene

[0735] Postupci i uređaji koji koriste katetere i lumene mogu da se koriste za davanje modifikovanih nukleinskih kiselina, poboljšane modifikovane RNK ili ribonukleinskih kiselina prema ovom prikazu prema jednokratnom, višekratnom ili režimu doziranja sa podeljenim dozama. Takvi postupci i uređaji su opisani u nastavku teksta.

[0736] Isporuku skeletnih mioblasta u miokard oštećenih srca na bazi katetera opisali su Jacoby i saradnici i ona je prikazana, na primer, u SAD patentnoj objavi 20060263338. Prema opisu koji daje Jacoby, više igala je ugrađeno u uređaj, čiji je bar deo ubačen u krvni sud i isporučuje ćelijsku kompoziciju kroz igle u lokalizovanu oblast srca subjekta.

[0737] Aparat za lečenje astme korišćenjem neurotoksina opisali su Deem i saradnici i on je prikazan, na primer, u SAD patentnoj objavi 20060225742. Prema Deemu, više igala je ugrađeno u uređaj koji isporučuje neurotoksin kroz igle u bronhijalno tkivo.

[0738] Postupak za primenu višekomponentnih terapija je opisao Nayak i prikazan je, na primer, u SAD patentu 7,699,803. Prema Nayaku, višestruke injekcione kanile mogu da budu ugrađene u uređaj u koji mogu da budu uključeni dubinski prorezi za kontrolu dubine na kojoj se terapeutska supstanca isporučuje unutar tkiva.

[0739] Hirurški uređaj za ablaciju kanala i isporuku najmanje jednog terapeutskog agensa u željeni region tkiva opisali su McIntyre i saradnici i on je prikazan, na primer, u SAD patentu 8,012,096. Kako navodi McIntyre, više igala je ugrađeno u uređaj koji dozira terapeutsko sredstvo u region tkiva koji okružuje kanal i posebno je pogodan za operacije transmiokardijalne revaskularizacije.

[0740] Postupke lečenja funkcionalnih poremećaja mokraćne bešike kod ženki sisara opisali su Versi i saradnici i oni su prikazani, na primer, u SAD patentu 8,029,496. Prema opisu koji daje

4

Versi, niz mikro-igala je ugrađen u uređaj koji isporučuje terapeutsko sredstvo kroz igle direktno u trigonum bešike.

[0741] Uređaj i postupak za isporuku tečnosti u fleksibilnu biološku barijeru opisali su Yeshurun i saradnici i oni su prikazani, na primer, u patentu SAD 7,998,119 (uređaj) i 8,007,466 (postupak). Prema Yeshurunu, mikro-igle na uređaju prodiru i protežu se u fleksibilnu biološku barijeru i tečnost se ubrizgava kroz otvor šupljih mikro-igala.

[0742] Postupak za epikardijalno ubrizgavanje supstance u oblast tkiva srca koja ima epikardijalnu površinu i koja se nalazi unutar torza opisali su Bonner i saradnici i prikazan je, na primer, u SAD patentu 7,628,780. Prema Bonneru, uređaji imaju izdužene osovine i distalne injekcione glave za uvođenje igala u tkivo i ubrizgavanje medicinskih agenasa u tkivo kroz igle.

[0743] Uređaj za zaptivanje punkcija opisali su Nielsen i saradnici i on je prikazan, na primer, u SAD patentu 7,972,358. Prema Nielsenu, više igala je ugrađeno u uređaj koji isporučuje sredstvo za zaptivanje punkcija u tkivo koje okružuje putanju punkcije.

[0744] Postupak za miogenezu i angiogenezu opisali su Chiu i saradnici i prikazan je, na primer, u SAD patentu 6,551,338. Kako navodi Chiu, 5 do 15 igala maksimalnog prečnika od najmanje 1.25 mm i dužine efektivne da obezbedi dubinu punkcije od 6 do 20 mm ugrađeno je u uređaj koji se ubacuje u blizinu miokarda i snabdeva ga egzogenim angiogenim ili miogenim faktorom kroz provodnike koji se nalaze u bar nekim od navedenih igala.

[0745] Postupak za lečenje tkiva prostate opisali su Bolmsj i saradnici i prikazan je, na primer, u SAD patentu 6,524,270. Kako navodi Bolmsj, uređaj koji sadrži kateter koji se ubacuje kroz uretru ima najmanje jedan šuplji vrh koji može da se pruži u okolno tkivo prostate. Adstringentni i analgetički lek se primenjuje preko pomenutog vrha u navedeno tkivo prostate.

[0746] Postupak za infuziju tečnosti u intrakoštano mesto opisali su Findlay i saradnici i prikazan je, na primer, u SAD patentu 6,761,726. Kako navodi Findlay, više igala je ugrađeno u uređaj koji može da prodre u čvrsti omotač materijala prekriven slojem mekog materijala i isporuči tečnost na unapred određenoj udaljenosti ispod navedenog čvrstog omotača materijala.

[0747] Uređaj za ubrizgavanje lekova u zid sudova opisali su Vigil i saradnici i prikazan je, na primer, u SAD patentu 5,713,863. Prema Vigilu, višestruki injektori su postavljeni na svaku od fleksibilnih cevi u uređaju koji uvodi tečnost leka kroz kateter sa više lumena, u navedene fleksibilne cevi i iz navedenih injektora za infuziju u zid suda.

[0748] Kateter za isporuku terapeutskih i/ili dijagnostičkih sredstava u tkivo koje okružuje telesni prolaz opisali su Faxon i saradnici i on je prikazan, na primer, u SAD patentu 5,464,395. Prema Faxonu, najmanje jedna kanila sa iglom je ugrađena u kateter i ona isporučuje željene agense u tkivo kroz navedene igle koje se pružaju van katetera.

4

[0749] Orr je opisao balon katetere za isporuku terapeutskih sredstava i oni su prikazani, na primer, u WO2010024871. Prema Orru, više igala je ugrađeno u uređaje koji isporučuju terapeutske agense na različite dubine unutar tkiva.

Postupci i uređaji koji koriste električnu struju

[0750] Postupci i uređaji koji koriste električnu struju mogu da se koriste za isporuku modifikovanih nukleinskih kiselina, poboljšane modifikovane RNK ili ribonukleinskih kiselina prema ovom prikazu prema jednokratnom, višekratnom ili režimu doziranja sa podeljenim dozama koji su ovde opisani. Takvi postupci i uređaji su opisani u nastavku teksta.

[0751] Uređaj za terapiju elektro-indukcijom kolagena je opisao Marquez i on je prikazan, na primer, u SAD patentnoj objavi 20090137945. Kako navodi Marquez, u uređaj je ugrađeno više igala koje više puta probijaju kožu i povlače u kožu deo supstance koja je prvo naneta na kožu.

[0752] Elektrokinetički sistem su opisali Etheredge i saradnici i on je prikazan, na primer, u SAD patentnoj objavi 20070185432. Kako navodi Etheredge, mikro-igle su ugrađene u uređaj koji električnom strujom pokreće lek kroz igle do ciljanog mesta lečenja.

[0753] Uređaj za jontoforezu opisali su Matsumura i saradnici i prikazan je, na primer, u SAD patentu 7,437,189. Kako navodi Matsumura, više igala je ugrađeno u uređaj koji je sposoban da isporuči jonizabilni lek u živo telo većom brzinom ili većom efikasnošću.

[0754] Intradermalnu isporuku biološki aktivnih agenasa injekcijom bez igle i elektroporacijom opisali su Hoffmann i saradnici i ona je prikazana, na primer, u SAD patentu 7,171,264. Prema Hoffmannu, jedan ili više injektora bez igle su ugrađeni u uređaj za elektroporaciju i kombinacija ubrizgavanja bez igle i elektroporacije je dovoljna da se agens uvede u ćelije kože, mišića ili sluzokože.

[0755] Postupak za intracelularnu isporuku posredovanu elektropermeabilizacijom opisali su Lundkvist i saradnici i on je prikazan, na primer, u SAD patentu 6,625,486. Prema Lundkvistu, par igličastih elektroda je ugrađen u kateter. Navedeni kateter se postavlja u lumen tela, a zatim se pomenute igličaste elektrode pružaju tako da prodru u tkivo koje okružuje navedeni lumen. Zatim uređaj uvodi agens kroz najmanje jednu od navedenih igličastih elektroda i primenjuje električno polje pomoću pomenutog para igličastih elektroda kako bi se omogućilo da pomenuti agens prođe kroz ćelijske membrane u ćelije na mestu lečenja.

[0756] Sistem isporuke za transdermalnu imunizaciju opisali su Levin i saradnici i prikazan je, na primer, u WO2006003659. Prema Levinu, više elektroda je ugrađeno u uređaj koji primenjuje električnu energiju između elektroda za generisanje mikro-kanala u koži kako bi se olakšala transdermalna isporuka.

4

[0757] Postupak za isporuku RF energije u kožu je opisao Schomacker i on je prikazan, na primer u WO2011163264. Prema Schomackeru, više igala je ugrađeno u uređaj koji primenjuje vakuum da bi kožu doveo u kontakt sa pločom, tako da se igle ubacuju u kožu kroz rupe na ploči i isporučuju RF energiju.

Definicije

[0758] Na različitim mestima u predmetnoj specifikaciji, supstituenti jedinjenja iz predmetnog prikaza su opisani u grupama ili u opsezima. Specifično je predviđeno da predmetni prikaz uključi svaku i sve pojedinačne podkombinacije članova takvih grupa i opsega. Na primer, termin "C1-6alkil" je specifično namenjen da pojedinačno opiše metil, etil, C3alkil, C4alkil, C5alkil, i C6alkil.

[0759] Oko: Kao što se ovde upotrebljava, termin "oko" znači /- 10% navedene vrednosti.

[0760] Životinja: Kao što se ovde upotrebljava, termin "životinja" označava bilo kog člana životinjskog carstva. U nekim slučajevima, "životinja" označava ljude u bilo kojoj fazi razvića. U nekim slučajevima, "životinja" označava životinje izuzev ljudi u bilo kojoj fazi razvića. U određenim slučajevima, životinja izuzev ljudi je sisar (npr. glodar, miš, pacov, zec, majmun, pas, mačka, ovca, govedo, primat, ili svinja). U nekim slučajevima, životinje uključuju, ali nisu ograničene na, sisare, ptice, gmizavce, vodozemce, ribe, i crve. U nekim slučajevima, životinja je transgena životinja, genetički konstruisana životinja, ili klon.

[0761] Približno: Kao što se ovde upotrebljava, termin "približno" ili "oko", primenjen na jednu ili više vrednosti od interesa, označava vrednost koja je slična navedenoj referentnoj vrednosti. U određenim slučajevima, termin "približno" ili "oko" označava opseg vrednosti koje se nalaze unutar 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, ili manje u oba smera (više od ili manje od) navedene referentne vrednosti, osim ukoliko nije drugačije navedeno ili nije drugačije evidentno iz konteksta (osim gde bi takav broj premašio 100% moguće vrednosti).

[0762] Udruženo sa: Kao što se ovde upotrebljava, termini "udruženo sa", "konjugovano", "povezano", "prikačeno", i "privezano", kada se upotrebljavaju u odnosu na dva ili više fragmenata, znače da su fragmenti fizički asocirani ili povezani jedan sa drugim, bilo direktno ili putem jednog ili više dopunskih fragmenata koji služe kao povezujući agens, kako bi formirali strukturu koja je dovoljno stabilna tako da fragmenti ostaju fizički asocirani pod uslovima u kojima se struktura upotrebljava, npr. fiziološkim uslovima. "Udruženost" ne mora da bude striktno preko direktnog kovalentnog hemijskog vezivanja. Takođe može sugerisati jonsko ili vodonično

4

vezivanje ili povezivanje zasnovano na hibridizaciji dovoljno stabilno tako da "udruženi" entiteti ostaju fizički udruženi.

[0763] Auksotrofno: Kao što se ovde upotrebljava, termin "auksotrofno" se odnosi na mRNA koja sadrži najmanje jedno svojstvo koje pokreće ili indukuje degradaciju ili inaktivaciju mRNA tako da je ekspresija proteina suštinski sprečena ili redukovana u odabranom tkivu ili organu.

[0764] Bifunkcionalno: Kao što se ovde upotrebljava, termin "bifunkcionalno" označava bilo koju supstancu, molekul ili fragment koji je sposoban za, ili održava, najmanje dve funkcije. Funkcije mogu da ostvare isti ishod ili različit ishod. Struktura koja proizvodi funkciju može da bude ista ili različita. Na primer, bifunkcionalne modifikovane RNK predmetnog prikaza mogu da kodiraju citotoksični peptid (prva funkcija), dok su oni nukleozidi koji sadrže kodirajuću RNK sami po sebi citotoksični (druga funkcija). U ovom primeru, isporuka bifunkcionalne modifikovane RNK u kancersku ćeliju ne samo da bi proizvela molekul peptida ili proteina koji bi mogao da ublaži ili leči kancer, već bi takođe isporučila citotoksično opterećenje lekom u vidu nukleozida u ćeliju, ukoliko dođe do degradacije, umesto translacije modifikovane RNK.

[0765] Biokompatibilno: Kao što se ovde upotrebljava, termin "biokompatibilno" znači kompatibilno sa živim ćelijama, tkivima, organima ili sistemima što predstavlja mali ili nikakav rizik od povrede, toksičnosti ili odbacivanja od strane imunskog sistema.

[0766] Biorazgradivo: Kao što se ovde upotrebljava, termin "biorazgradivo" znači da se može razgraditi na bezopasne proizvode dejstvom živih bića.

[0767] Biološki aktivno: Kao što se ovde upotrebljava, fraza "biološki aktivno" označava karakteristiku bilo koje supstance koja ima aktivnost u biološkom sistemu i/ili organizmu. Na primer, supstanca koja, kada je primenjena organizmu, ima biološki efekat na taj organizam, smatra se biološki aktivnom. U posebnim slučajevima, molekul nukleinske kiseline predmetnog prikaza može da se smatra biološki aktivnim ukoliko je samo deo molekul nukleinske kiseline biološki aktivan ili oponaša aktivnost koja se smatra biološki relevantnom.

[0768] Hemijski izrazi: U nastavku su definisani različiti hemijski izrazi od "acil" do "tiol".

[0769] Izraz "acil", kako se koristi u ovom tekstu, predstavlja vodonik ili alkil grupu (npr., haloalkil grupu), kako je definisano u ovom tekstu, koja je prikačena za parentalnu molekulsku grupu preko karbonil grupe, kako je definisano u ovom tekstu, i za primer prikazano sa formil (tj., karboksialdehidna grupa), acetil, propionil, butanoil i slično. Primeri nesupstituisanih acil grupa uključuju od 1 do 7, od 1 do 11, ili od 1 do 21 ugljenika. U nekim slučajevima, alkil grupa je dodatno supstituisana sa 1, 2, 3, ili 4 supstituenta, kako je opisano u ovom tekstu.

[0770] Izraz "acilamino", kako se koristi u ovom tekstu, predstavlja acil grupu, kako je ovde definisano, prikačenu za parentalnu molekulsku grupu preko amino grupe, kako je definisano u

4

ovom tekstu (tj., -N(R<N1>)-C(O)-R, pri čemu je R H ili opciono supstituisana C1-6, C1-10, ili C1-20alkil grupa i R<N1>je kako je definisano u ovom tekstu). Primeri nesupstituisanih acilamino grupa uključuju od 1 do 41 ugljenika (npr., od 1 do 7, od 1 do 13, od 1 do 21, od 2 do 7, od 2 do 13, od 2 do 21, ili od 2 do 41 ugljenika). U nekim slučajevima, alkil grupa je dodatno supstituisana sa 1, 2, 3, ili 4 supstituenta kako je opisano u ovom tekstu, i/ili amino grupa je -NH2ili -NHR<N1>, pri čemu je R<N1>nezavisno, OH, NO2, NH2, NR<N2>2, SO2OR<N2>, SO2R<N2>, SOR<N2>, alkil, ili aril, i svaki R<N2>može biti H, alkil, ili aril.

[0771] Izraz "aciloksi" kako se koristi u ovom tekstu, predstavlja acil grupu, kako je ovde definisano, prikačenu za parentalnu molekulsku grupu preko atoma kiseonika (tj., -O-C(O)-R, pri čemu je R H ili opciono supstituisana C1-6, C1-10, ili C1-20alkil grupa). Primeri nesupstituisanih aciloksi grupa uključuju od 1 do 21 ugljenika (npr., od 1 do 7 ili od 1 do 11 ugljenika). U nekim slučajevima, alkil grupa je dodatno supstituisana sa 1, 2, 3, ili 4 supstituenta kako je opisano u ovom tekstu, i/ili je amino grupa -NH2ili -NHR<N1>, pri čemu je R<N1>, nezavisno, OH, NO2, NH2, NR<N2>2, SO2OR<N2>, SO2R<N2>, SOR<N2>, alkil, ili aril, i svaki R<N2>može biti H, alkil, ili aril.

[0772] Izraz "alkaril", kako se koristi u ovom tekstu, predstavlja aril grupu, kako je ovde definisano, prikačenu za parentalnu molekulsku grupu preko alkilen grupe, kako je definisano u ovom tekstu. Primeri nesupstituisanih alkaril grupa imaju od 7 do 30 ugljenika (npr., od 7 do 16 ili od 7 do 20 ugljenika, na primer C1-6alk-C6-10aril, C1-10alk-C6-10aril, ili C1-20alk-C6-10aril). U nekim slučajevima, alkilen i aril, svaki, može biti dodatno supstituisan sa 1, 2, 3, ili 4 supstituentne grupe kako je definisano u ovom tekstu za respektivne grupe. Druge grupe kojima prethodi prefiks "alk-" definisane su na isti način, gde "alk" označava C1-6alkilen, ukoliko nije drugačije napomenuto, i prikačena hemijska struktura je kako je definisano u ovom tekstu.

[0773] Izraz "alkcikloalkil" predstavlja cikloalkil grupu, kako je ovde definisano, prikačenu za parentalnu molekulsku grupu preko alkilen grupe, kako je definisano u ovom tekstu (npr., alkilen grupa sa od 1 do 4, od 1 do 6, od 1 do 10, ili od 1 do 20 ugljenika). U nekim slučajevima, alkilen i cikloalkil, svaki, može biti dodatno supstituisan sa 1, 2, 3, ili 4 supstituentne grupe kako je definisano u ovom tekstu za respektivnu grupu.

[0774] Izraz "alkenil", kako se koristi u ovom tekstu, predstavlja monovalentne grupe linearnog ili granatog lanca od, ukoliko nije drugačije specifikovano, 2 do 20 ugljenika (npr., od 2 do 6 ili od 2 do 10 ugljenika), koje sadrže jednu ili više ugljenik-ugljenik dvostrukih veza i njihovi primeri su etenil, 1-propenil, 2-propenil, 2-metil-1-propenil, 1-butenil, 2-butenil, i slično. Alkenili uključuju i cis i trans izomere. Alkenil grupe mogu biti opciono supstituisane sa 1, 2, 3, ili 4 supstituentne grupe koje se biraju, nezavisno, od amino, aril, cikloalkil, ili heterociklil (npr., heteroaril), kako je definisano u ovom tekstu, ili bilo koji od primera alkil supstituentnih grupa opisanih u ovom tekstu.

[0775] Izraz "alkeniloksi" predstavlja hemijski supstituent formule -OR, pri čemu je R C2-20alkenil grupa (npr., C2-6ili C2-10alkenil), ukoliko nije drugačije specifikovano. Primeri alkeniloksi grupa uključuju eteniloksi, propeniloksi, i slično. U nekim slučajevima, alkenil grupa može biti dodatno supstituisana sa 1, 2, 3, ili 4 supstituentne grupe kako je ovde definisano (npr., hidroksi grupa).

[0776] Izraz "alkheteroaril" označava heteroaril grupu, kako je ovde definisano, prikačenu za parentalnu molekulsku grupu preko alkilen grupe, kako je definisano u ovom tekstu. Primeri nesupstituisanih alkheteroaril grupa imaju od 2 do 32 ugljenika (npr., od 2 do 22, od 2 do 18, od 2 do 17, od 2 do 16, od 3 do 15, od 2 do 14, od 2 do 13, ili od 2 do 12 ugljenika, na primer C1-6alk-C1-12heteroaril, C1-10alk-C1-12heteroaril, ili C1-20alk-C1-12heteroaril). U nekim slučajevima, alkilen i heteroaril, svaki, može biti dodatno supstituisan sa 1, 2, 3, ili 4 supstituentne grupe kako je ovde definisano za respektivne grupe. Alkheteroaril grupe su podgrupa alkheterociklil grupa.

[0777] Izraz "alkheterociklil" predstavlja heterociklil grupu, kako je ovde definisano, prikačenu za parentalnu molekulsku grupu preko alkilen grupe, kako je definisano u ovom tekstu. Primeri nesupstituisanih alkheterociklil grupa imaju od 2 do 32 ugljenika (npr., od 2 do 22, od 2 do 18, od 2 do 17, od 2 do 16, od 3 do 15, od 2 do 14, od 2 do 13, ili od 2 do 12 ugljenika, na primer C1-6alk-C1-12heterociklil, C1-10alk-C1-12heterociklil, ili C1-20alk-C1-12heterociklil). U nekim slučajevima, alkilen i heterociklil, svaki, može biti dodatno supstituisan sa 1, 2, 3, ili 4 supstituentne grupe kako je definisano u ovom tekstu za respektivne grupe.

[0778] Izraz "alkoksi" predstavlja hemijski supstituent formule -OR, pri čemu je R C1-20alkil grupa (npr., C1-6ili C1-10alkil), ukoliko nije drugačije specifikovano. Primeri alkoksi grupa uključuju metoksi, etoksi, propoksi (npr., n-propoksi i izopropoksi), t-butoksi, i slično. U nekim slučajevima, alkil grupa može biti dodatno supstituisana sa 1, 2, 3, ili 4 supstituentne grupe, kako je definisano u ovom tekstu (npr., hidroksi ili alkoksi).

[0779] Izraz "alkoksialkoksi" predstavlja alkoksi grupu koja je supstituisana alkoksi grupom. Primeri nesupstituisanih alkoksialkoksi grupa uključuju između 2 i 40 ugljenika (npr., od 2 do 12 ili od 2 do 20 ugljenika, na primer C1-6alkoksi-C1-6alkoksi, C1-10alkoksi-C1-10alkoksi, ili C1-20alkoksi-C1-20alkoksi). U nekim slučajevima, svaka alkoksi grupa može biti dodatno supstituisana sa 1, 2, 3, ili 4 supstituentne grupe kako je definisano u ovom tekstu.

[0780] Izraz "alkoksialkil" predstavlja alkil grupu koja je supstituisana alkoksi grupom. Primeri nesupstituisanih alkoksialkil grupa uključuju između 2 i 40 ugljenika (npr., od 2 do 12 ili od 2 do 20 ugljenika, na primer C1-6alkoksi-C1-6alkil, C1-10alkoksi-C1-10alkil, ili C1-20alkoksi-C1-20alkil).

1

U nekim slučajevima, alkil i alkoksi, svaki, može biti dodatno supstituisan sa 1, 2, 3, ili 4 supstituentne grupe kako je definisano u ovom tekstu za respektivnu grupu.

[0781] Izraz "alkoksikarbonil", kako se koristi u ovom tekstu, predstavlja alkoksi, kako je ovde definisano, prikačen za parentalnu molekulsku grupu preko karbonil atoma (npr., -C(O)-OR, gde je R H ili opciono supstituisana C1-6, C1-10, ili C1-20alkil grupa). Primeri nesupstituisanih alkoksikarbonila uključuju od 1 do 21 ugljenika (npr., od 1 do 11 ili od 1 do 7 ugljenika). U nekim slučajevima, alkoksi grupa je dodatno supstituisana sa 1, 2, 3, ili 4 supstituenta kako je opisano u ovom tekstu.

[0782] Izraz "alkoksikarbonilalkoksi", kako se koristi u ovom tekstu, predstavlja alkoksi grupu, kako je ovde definisano, koja je supstituisana alkoksikarbonil grupom, kako je ovde definisano (npr., -O-alkil-C(O)-OR, pri čemu je R opciono supstituisana C1-6, C1-10, ili C1-20alkil grupa). Primeri nesupstituisanih alkoksikarbonilalkoksi uključuju od 3 do 41 ugljenika (npr., od 3 do 10, od 3 do 13, od 3 do 17, od 3 do 21, ili od 3 do 31 ugljenika, na primer C1-6alkoksikarbonil-C1-6alkoksi, C1-10alkoksikarbonil-C1-10alkoksi, ili C1-20alkoksikarbonil-C1-20alkoksi). U nekim slučajevima, svaka alkoksi grupa dodatno je nezavisno supstituisana sa 1, 2, 3, ili 4 supstituenta, kako je opisano u ovom tekstu (npr., hidroksi grupa).

[0783] Izraz "alkoksikarbonilalkil" kako se koristi u ovom tekstu, predstavlja alkil grupu, kako je ovde definisano, koja je supstituisana alkoksikarbonil grupom, kako je definisano u ovom tekstu (npr., -alkil-C(O)-OR, pri čemu je R opciono supstituisana C1-20, C1-10, ili C1-6alkil grupa). Primeri nesupstituisanih alkoksikarbonilalkil uključuju od 3 do 41 ugljenika (npr., od 3 do 10, od 3 do 13, od 3 do 17, od 3 do 21, ili od 3 do 31 ugljenika, na primer C1-6alkoksikarbonil-C1-6alkil, C1-10alkoksikarbonil-C1-10alkil, ili C1-20alkoksikarbonil-C1-20alkil). U nekim slučajevima, svaka alkil i alkoksi grupa dodatno je nezavisno supstituisana sa 1, 2, 3, ili 4 supstituenta kako je opisano u ovom tekstu (npr., hidroksi grupa).

[0784] Izraz "alkil", kako se koristi u ovom tekstu, uključuje zasićene grupe linearnog i granatog lanca od 1 do 20 ugljenika (npr., od 1 do 10 ili od 1 do 6), ukoliko nije drugačije specifikovano. Primeri alkil grupa su metil, etil, n- i izo-propil, n-, sek-, izo- i terc-butil, neopentil, i slično, i one mogu da budu opciono supstituisane jednim, dva, tri ili u slučaju alkil grupa od dva ugljenika ili više, četiri supstituenta nezavisno odabrana iz grupe koju čine: (1) C1-6alkoksi; (2) C1-6alkilsulfinil; (3) amino, kako je definisano u ovom tekstu (npr., nesupstituisana amino (tj., -NH2) ili supstituisana amino (tj., -N(R<N1>)2, pri čemu je R<N1>kako je definisano za amino); (4) C6-10aril-C1-6alkoksi; (5) azido; (6) halo; (7) (C2-9heterociklil)oksi; (8) hidroksi; (9) nitro; (10) okso (npr., karboksialdehid ili acil); (11) C1-7spirociklil; (12) tioalkoksi; (13) tiol; (14) -CO2R<A'>, gde je R<A'>odabran iz grupe koju čine (a) C1-20alkil (npr., C1-6alkil), (b) C2-20alkenil (npr., C2-6alkenil), (c)

2

C6-10aril, (d) vodonik, (e) C1-6alk-C6-10aril, (f) amino-C1-20alkil, (g) polietilen glikol -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR', gde je s1 ceo broj od 1 do 10 (npr., od 1 do 6 ili od 1 do 4), svaki od s2 i s3, nezavisno, je ceo broj od 0 do 10 (npr., od 0 do 4, od 0 do 6, od 1 do 4, od 1 do 6, ili od 1 do 10), i R' je H ili C1-20alkil, i (h) amino-polietilen glikol -NR<N1>(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NR<N1>, pri čemu je s1 ceo broj od 1 do 10 (npr., od 1 do 6 ili od 1 do 4), svaki od s2 i s3, nezavisno, je ceo broj od 0 do 10 (npr., od 0 do 4, od 0 do 6, od 1 do 4, od 1 do 6, ili od 1 do 10), i svaki R<N1>je, nezavisno, vodonik ili opciono supstituisani C1-6alkil; (15) -C(O)NR<B'>R<C'>, pri čemu je svaki od R<B'>i R<C'>, nezavisno, odabran iz grupe koju čine (a) vodonik, (b) C1-6alkil, (c) C6-10aril, i (d) C1-6alk-C6-10aril; (16) -SO2R<D'>, pri čemu je R<D'>odabran iz grupe koju čine (a) C1-6alkil, (b) C6-10aril, (c) C1-6alk-C6-10aril, i (d) hidroksi; (17) -SO2NR<E'>R<F'>, pri čemu je svaki od R<E'>i R<F'>, nezavisno, odabran iz grupe koju čine (a) vodonik, (b) C1-6alkil, (c) C6-10aril i (d) C1-6alk-C6-10aril; (18) -C(O)R<G'>, pri čemu je R<G'>odabran iz grupe koju čine (a) C1-

20alkil (npr., C1-6alkil), (b) C2-20alkenil (npr., C2-6alkenil), (c) C6-10aril, (d) vodonik, (e) C1-6alk-C6-10aril, (f) amino-C1-20alkil, (g) polietilen glikol - (CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR', pri čemu je s1 ceo broj od 1 do 10 (npr., od 1 do 6 ili od 1 do 4), svaki od s2 i s3, nezavisno, je ceo broj od 0 do 10 (npr., od 0 do 4, od 0 do 6, od 1 do 4, od 1 do 6, ili od 1 do 10), i R' je H ili C1-20alkil, i (h) amino-polietilen glikol - NR<N1>(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NR<N1>, pri čemu je s1 ceo broj od 1 do 10 (npr., od 1 do 6 ili od 1 do 4), svaki od s2 i s3, nezavisno, je ceo broj od 0 do 10 (npr., od 0 do 4, od 0 do 6, od 1 do 4, od 1 do 6, ili od 1 do 10), i svaki R<N1>je, nezavisno, vodonik ili opciono supstituisani C1-6alkil; (19) -NR<H'>C(O)R<I'>, pri čemu je R<H'>odabran iz grupe koju čine (a1) vodonik i (b1) C1-6alkil, i R<I'>je odabran iz grupe koju čine (a2) C1-20alkil (npr., C1-6alkil), (b2) C2-20alkenil (npr., C2-6alkenil), (c2) C6-10aril, (d2) vodonik, (e2) C1-6alk-C6-10aril, (f2) amino-C1-20alkil, (g2) polietilen glikol -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR', pri čemu je s1 ceo broj od 1 do 10 (npr., od 1 do 6 ili od 1 do 4), svaki od s2 i s3, nezavisno, je ceo broj od 0 do 10 (npr., od 0 do 4, od 0 do 6, od 1 do 4, od 1 do 6, ili od 1 do 10), i R' je H ili C1-20alkil, i (h2) amino-polietilen glikol -NR<N1>(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NR<N1>, pri čemu je s1 ceo broj od 1 do 10 (npr., od 1 do 6 ili od 1 do 4), svaki od s2 i s3, nezavisno, je ceo broj od 0 do 10 (npr., od 0 do 4, od 0 do 6, od 1 do 4, od 1 do 6, ili od 1 do 10), i svaki R<N1>je, nezavisno, vodonik ili opciono supstituisani C1-6alkil; (20) - NR<J'>C(O)OR<K'>, pri čemu je R<J'>odabran iz grupe koju čine (a1) vodonik i (b1) C1-6alkil, i R<K'>je odabran iz grupe koju čine (a2) C1-20alkil (npr., C1-6alkil), (b2) C2-20alkenil (npr., C2-6alkenil), (c2) C6-10aril, (d2) vodonik, (e2) C1-6alk-C6-10aril, (f2) amino-C1-20alkil, (g2) polietilen glikol -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR', pri čemu je s1 ceo broj od 1 do 10 (npr., od 1 do 6 ili od 1 do 4), svaki od s2 i s3, nezavisno, je ceo broj od 0 do 10 (npr., od 0 do 4, od 0 do 6, od 1 do 4, od 1 do 6, ili od 1 do 10), i R' je H ili C1-20alkil, i (h2) amino-polietilen glikol NR<N1>(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NR<N1>, pri čemu je s1 ceo broj od 1 do 10 (npr., od 1 do 6 ili od 1 do 4), svaki od s2 i s3, nezavisno, je ceo broj od 0 do 10 (npr., od 0 do 4, od 0 do 6, od 1 do 4, od 1 do 6, ili od 1 do 10), i svaki R<N1>je, nezavisno, vodonik ili opciono supstituisani C1-6alkil; i (21) amidin. U nekim slučajevima, svaka od ovih grupa može biti dodatno supstituisana kako je opisano u ovom tekstu. Na primer, alkilen grupa C1-alkaril može biti dodatno supstituisana okso grupom da se dobije odgovarajući ariloil supstituent.

[0785] Izraz "alkilen" i prefiks "alk-", kako se koriste u ovom tekstu, predstavljaju zasićenu dvovalentnu ugljovodoničnu grupu izvedenu iz zasićenog ugljovodonika linearnog ili granatog lanca, uklanjanjem dva atoma vodonika, i primeri su metilen, etilen, izopropilen, i slično. Izraz "Cx-yalkilen" i prefiks "Cx-yalk-" predstavljaju alkilen grupe koje imaju između x i y ugljenika. Primeri vrednosti za x su 1, 2, 3, 4, 5, i 6, i primeri vrednosti za y su 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, ili 20 (npr., C1-6, C1-10, C2-20, C2-6, C2-10, ili C2-20alkilen). U nekim slučajevima, alkilen može biti dodatno supstituisan sa 1, 2, 3, ili 4 supstituentne grupe kako je definisano u ovom tekstu za alkil grupu.

[0786] Izraz "alkilsulfinil", kako se koristi u ovom tekstu, predstavlja alkil grupu prikačenu za parentalnu molekulsku grupu preko -S(O)- grupe. Primeri nesupstituisanih alkilsulfinil grupa imaju od 1 do 6, od 1 do 10, ili od 1 do 20 ugljenika. U nekim slučajevima, alkil grupa može biti dodatno supstituisana sa 1, 2, 3, ili 4 supstituentne grupe kako je definisano u ovom tekstu.

[0787] Izraz "alkilsulfinilalkil", kako se koristi u ovom tekstu, predstavlja alkil grupu, kako je ovde definisano, supstituisanu alkilsulfinil grupom. Primeri nesupstituisanih alkilsulfinilalkil grupa imaju od 2 do 12, od 2 do 20, ili od 2 do 40 ugljenika. U nekim slučajevima, svaka alkil grupa može biti dodatno supstituisana sa 1, 2, 3, ili 4 supstituentne grupe kako je definisano u ovom tekstu.

[0788] Izraz "alkinil", kako se koristi u ovom tekstu, predstavlja monovalentne grupe linearnog ili granatog lanca od 2 do 20 ugljenikovih atoma (npr., od 2 do 4, od 2 do 6, ili od 2 do 10 ugljenika) koje sadrže trostruke ugljenik-ugljenik veze i primeri su etinil, 1-propinil, i slično. Alkinil grupe mogu biti dodatno supstituisane sa 1, 2, 3, ili 4 supstituentne grupe koje su odabrane, nezavisno, između aril, cikloalkil, ili heterociklil (npr., heteroaril), kako je ovde definisano, ili bilo kojom od primera alkil-supstituentnih grupa opisanih u ovom tekstu.

[0789] Izraz "alkiniloksi" predstavlja hemijski supstituent formule -OR, pri čemu je R C2-20alkinil grupa (npr., C2-6ili C2-10alkinil), ukoliko nije drugačije specifikovano. Primeri alkiniloksi grupa uključuju etiniloksi, propiniloksi, i slično. U nekim slučajevima, alkinil grupa može biti dodatno supstituisana sa 1, 2, 3, ili 4 supstituentne grupe kako je definisano u ovom tekstu (npr., hidroksi grupa).

4

[0790] Izraz "amidin", kako se koristi u ovom tekstu, predstavlja -C(=NH)NH2grupu.

[0791] Izraz "amino", kako se koristi u ovom tekstu, predstavlja -N(R<N1>)2, pri čemu je svaki R<N1>, nezavisno, H, OH, NO2, N(R<N2>)2, SO2OR<N2>, SO2R<N2>, SOR<N2>, N-protektivna grupa, alkil, alkenil, alkinil, alkoksi, aril, alkaril, cikloalkil, alkcikloalkil, karboksialkil, sulfoalkil, heterociklil (npr., heteroaril), ili alkheterociklil (npr., alkheteroaril), pri čemu svaka od ovih navedenih R<N1>grupa može biti opciono supstituisana, kako je definisano u ovom tekstu za svaku grupu; ili dva R<N1>se kombinuju da formiraju heterociklil ili N-protektivnu grupu, i pri čemu je svaki R<N2>, nezavisno, H, alkil, ili aril. Amino grupe objave mogu biti nesupstituisane amino (tj., -NH2) ili supstituisane amino (tj., -N(R<N1>)2). U poželjnom slučaju, amino je -NH2ili -NHR<N1>, pri čemu je R<N1>, nezavisno, OH, NO2, NH2, NRN22, SO2OR<N2>, SO2R<N2>, SOR<N2>, alkil, karboksialkil, sulfoalkil, ili aril, i svaki R<N2>može biti H, C1-20alkil (npr., C1-6alkil), ili C6-10aril.

[0792] Izraz "aminokiselina", kako je opisano u ovom tekstu, odnosi se na molekul koji ima bočni lanac, amino-grupu, i kiselinsku grupu (npr., karboksi grupu -CO2H ili sulfo grupu -SO3H), pri čemu je aminokiselina prikačena za parentalnu molekulsku grupu bočnim lancem, amino-grupom, ili kiselinskom grupom (npr., bočnim lancem). U nekim slučajevima, aminokiselina je prikačena za parentalnu molekulsku grupu karbonil grupom, pri čemu su bočni lanac ili amino grupa prikačeni za karbonil grupu. Primeri bočnih lanaca uključuju opciono supstituisani alkil, aril, heterociklil, alkaril, alkheterociklil, aminoalkil, karbamoilalkil, i karboksialkil. Primeri aminokiselina uključuju alanin, arginin, asparagin, asparaginsku kiselinu, cistein, glutaminsku kiselinu, glutamin, glicin, histidin, hidroksinorvalin, izoleucin, leucin, lizin, metionin, norvalin, ornitin, fenilalanin, prolin, pirolizin, selenocistein, serin, taurin, treonin, triptofan, tirozin, i valin. Aminokiselinske grupe mogu biti opciono supstituisane sa jednim, dva, tri, ili, u slučaju aminokiselinskih grupa od dva ugljenika ili više, četiri supstituenta nezavisno odabrana iz grupe koju čine: (1) C1-6alkoksi; (2) C1-6alkilsulfinil; (3) amino, kako je definisano u ovom tekstu (npr., nesupstituisani amino (tj., -NH2) ili supstituisani amino (tj., -N(R<N1>)2, pri čemu je R<N1>kako je definisano za amino); (4) C6-10aril-C1-6alkoksi; (5) azido; (6) halo; (7) (C2-9heterociklil)oksi; (8) hidroksi; (9) nitro; (10) okso (npr., karboksialdehid ili acil); (11) C1-7spirociklil; (12) tioalkoksi; (13) tiol; (14) -CO2R<A'>, pri čemu je R<A'>odabrano iz grupe koju čine (a) C1-20alkil (npr., C1-6alkil), (b) C2-20alkenil (npr., C2-6alkenil), (c) C6-10aril, (d) vodonik, (e) C1-6alk-C6-10aril, (f) amino-C1-

20alkil, (g) polietilen glikol -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR', pri čemu je s1 ceo broj od 1 do 10 (npr., od 1 do 6 ili od 1 do 4), svaki od s2 i s3, nezavisno, je ceo broj od 0 do 10 (npr., od 0 do 4, od 0 do 6, od 1 do 4, od 1 do 6, ili od 1 do 10), i R' je H ili C1-20alkil, i (h) amino-polietilen glikol -NR<N1>(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NR<N1>, pri čemu je s1 ceo broj od 1 do 10 (npr., od 1 do 6 ili od 1 do 4), svaki od s2 i s3, nezavisno, je ceo broj od 0 do 10 (npr., od 0 do 4, od 0 do 6, od 1 do 4, od 1 do 6, ili od 1 do 10), i svaki R<N1>je, nezavisno, vodonik ili opciono supstituisani C1-6alkil; (15) -C(O)NR<B'>R<C'>, pri čemu je svaki od R<B'>i R<C'>, nezavisno, odabran iz grupe koju čine (a) vodonik, (b) C1-6alkil, (c) C6-10aril, i (d) C1-6alk-C6-10aril; (16) -SO2R<D'>, pri čemu je R<D'>odabran iz grupe koju čine (a) C1-6alkil, (b) C6-10aril, (c) C1-6alk-C6-10aril, i (d) hidroksi; (17) -SO2NR<E'>R<F'>, pri čemu je svaki od R<E'>i R<F'>, nezavisno, odabran iz grupe koju čine (a) vodonik, (b) C1-6alkil, (c) C6-10aril i (d) C1-6alk-C6-10aril; (18) -C(O)R<G'>, pri čemu je R<G'>odabran iz grupe koju čine (a) C1-

20alkil (npr., C1-6alkil), (b) C2-20alkenil (npr., C2-6alkenil), (c) C6-10aril, (d) vodonik, (e) C1-6alk-C6-10aril, (f) amino-C1-20alkil, (g) polietilen glikol - (CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR', pri čemu je s1 ceo broj od 1 do 10 (npr., od 1 do 6 ili od 1 do 4), svaki od s2 i s3, nezavisno, je ceo broj od 0 do 10 (npr., od 0 do 4, od 0 do 6, od 1 do 4, od 1 do 6, ili od 1 do 10), i R' je H ili C1-20alkil, i (h) amino-polietilen glikol - NR<N1>(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NR<N1>, pri čemu je s1 ceo broj od 1 do 10 (npr., od 1 do 6 ili od 1 do 4), svaki od s2 i s3, nezavisno, je ceo broj od 0 do 10 (npr., od 0 do 4, od 0 do 6, od 1 do 4, od 1 do 6, ili od 1 do 10), i svaki R<N1>je, nezavisno, vodonik ili opciono supstituisani C1-6alkil; (19) -NR<H'>C(O)R<I'>, pri čemu je R<H'>odabran iz grupe koju čine (a1) vodonik i (b1) C1-6alkil, i R<I'>je odabran iz grupe koju čine (a2) C1-20alkil (npr., C1-6alkil), (b2) C2-20alkenil (npr., C2-6alkenil), (c2) C6-10aril, (d2) vodonik, (e2) C1-6alk-C6-10aril, (f2) amino-C1-20alkil, (g2) polietilen glikol -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR', pri čemu je s1 ceo broj od 1 do 10 (npr., od 1 do 6 ili od 1 do 4), svaki od s2 i s3, nezavisno, je ceo broj od 0 do 10 (npr., od 0 do 4, od 0 do 6, od 1 do 4, od 1 do 6, ili od 1 do 10), i R' je H ili C1-20alkil, i (h2) amino-polietilen glikol -NR<N1>(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NR<N1>, pri čemu je s1 ceo broj od 1 do 10 (npr., od 1 do 6 ili od 1 do 4), svaki od s2 i s3, nezavisno, je ceo broj od 0 do 10 (npr., od 0 do 4, od 0 do 6, od 1 do 4, od 1 do 6, ili od 1 do 10), i svaki R<N1>je, nezavisno, vodonik ili opciono supstituisani C1-6alkil; (20) - NR<J'>C(O)OR<K'>, pri čemu je R<J'>odabran iz grupe koju čine (a1) vodonik i (b1) C1-6alkil, i R<K'>je odabran iz grupe koju čine (a2) C1-20alkil (npr., C1-6alkil), (b2) C2-20alkenil (npr., C2-6alkenil), (c2) C6-10aril, (d2) vodonik, (e2) C1-6alk-C6-10aril, (f2) amino-C1-20alkil, (g2) polietilen glikol -(CH2)s2(OCH2CH2)s1(CH2)s3OR', pri čemu je s1 ceo broj od 1 do 10 (npr., od 1 do 6 ili od 1 do 4), svaki od s2 i s3, nezavisno, je ceo broj od 0 do 10 (npr., od 0 do 4, od 0 do 6, od 1 do 4, od 1 do 6, ili od 1 do 10), i R' je H ili C1-20alkil, i (h2) amino-polietilen glikol -NR<N1>(CH2)s2(CH2CH2O)s1(CH2)s3NR<N1>, pri čemu je s1 ceo broj od 1 do 10 (npr., od 1 do 6 ili od 1 do 4), svaki od s2 i s3, nezavisno, je ceo broj od 0 do 10 (npr., od 0 do 4, od 0 do 6, od 1 do 4, od 1 do 6, ili od 1 do 10), i svaki R<N1>je, nezavisno, vodonik ili opciono supstituisani C1-6alkil; i (21) amidin. U nekim slučajevima, svaka od ovih grupa može biti dodatno supstituisana kako je opisano u ovom tekstu.

[0793] Izraz "aminoalkoksi", kako se koristi u ovom tekstu, predstavlja alkoksi grupu, kako je ovde definisano, supstituisanu amino grupom, kako je definisano u ovom tekstu. Alkil i amino, svaki, može biti dodatno supstituisan sa 1, 2, 3, ili 4 supstituentne grupe kako je opisano u ovom tekstu za odgovarajuću grupu (npr., CO2R<A'>, gde je R<A'>odabran iz grupe koju čine (a) C1-6alkil, (b) C6-10aril, (c) vodonik, i (d) C1-6alk-C6-10aril, npr., karboksi).

[0794] Izraz "aminoalkil", kako se koristi u ovom tekstu, predstavlja alkil grupu, kako je definisano u ovom tekstu, supstituisanu amino grupom, kako je definisano u ovom tekstu. Alkil i amino, svaki, može biti dodatno supstituisan sa 1, 2, 3, ili 4 supstituentne grupe kako je opisano u ovom tekstu za odgovarajuću grupu (npr., CO2R<A'>, gde je R<A'>odabran iz grupe koju čine (a) C1-6alkil, (b) C6-10aril, (c) vodonik, i (d) C1-6alk-C6-10aril, npr., karboksi).

[0795] Izraz "aril", kako se koristi u ovom tekstu, predstavlja mono-, biciklični, ili multiciklični karbociklični prstenasti sistem koji ima jedan ili dva aromatična prstena i čiji primeri su fenil, naftil, 1,2-dihidronaftil, 1,2,3,4-tetrahidronaftil, antracenil, fenantrenil, fluorenil, indanil, indenil, i slično, i može biti opciono supstituisan sa 1, 2, 3, 4, ili 5 supstituenata nezavisno odabranih iz grupe koju čine: (1) C1-7acil (npr., karboksialdehid); (2) C1-20alkil (npr., C1-6alkil, C1-6alkoksi-C1-6alkil, C1-6alkilsulfinil-C1-6alkil, amino-C1-6alkil, azido-C1-6alkil, (karboksialdehid)-C1-6alkil, halo-C1-6alkil (npr., perfluoroalkil), hidroksi-C1-6alkil, nitro-C1-6alkil, ili C1-6tioalkoksi-C1-

6alkil); (3) C1-20alkoksi (npr., C1-6alkoksi, na primer perfluoroalkoksi); (4) C1-6alkilsulfinil; (5) C6-10aril; (6) amino; (7) C1-6alk-C6-10aril; (8) azido; (9) C3-8cikloalkil; (10) C1-6alk-C3-8cikloalkil; (11) halo; (12) C1-12heterociklil (npr., C1-12heteroaril); (13) (C1-12heterociklil)oksi; (14) hidroksi; (15) nitro; (16) C1-20tioalkoksi (npr., C1-6tioalkoksi); (17) -(CH2)qCO2R<A'>, gde je q ceo broj od nula do četiri, i R<A'>je odabran iz grupe koju čine (a) C1-6alkil, (b) C6-10aril, (c) vodonik, i (d) C1-6alk-C6-10aril; (18) - (CH2)qCONR<B'>R<C'>, gde je q ceo broj od nula do četiri i gde su R<B'>i R<C'>nezavisno odabrani iz grupe koju čine (a) vodonik, (b) C1-6alkil, (c) C6-10aril, i (d) C1-6alk-C6-10aril; (19) -(CH2)qSO2R<D'>, gde je q ceo broj od nula do četiri i gde je R<D'>odabran iz grupe koju čine (a) alkil, (b) C6-10aril, i (c) alk-C6-10aril; (20) -(CH2)qSO2NR<E'>R<F'>, gde je q ceo broj od nula do četiri i gde je svaki od R<E'>i R<F'>, nezavisno, odabran iz grupe koju čine (a) vodonik, (b) C1-6alkil, (c) C6-10aril, i (d) C1-6alk-C6-10aril; (21) tiol; (22) C6-10ariloksi; (23) C3-8cikloalkoksi; (24) C6-10aril-C1-6alkoksi; (25) C1-6alk-C1-12heterociklil (npr., C1-6alk-C1-12heteroaril); (26) C2-20alkenil; i (27) C2-20alkinil. U nekim slučajevima, svaka od ovih grupa može biti dodatno supstituisana kako je opisano u ovom tekstu. Na primer, alkilen grupa C1-alkaril ili C1-alkheterociklil može biti dodatno supstituisana okso grupom da se dobije odgovarajuća ariloil i (heterociklil)oil supstituentna grupa.

[0796] Izraz "arilalkoksi" kako se koristi u ovom tekstu, predstavlja alkaril grupu, kako je ovde definisano, prikačenu za parentalnu molekulsku grupu preko atoma kiseonika. Primeri nesupstituisanih alkoksialkil grupa uključuju 7 do 30 ugljenika (npr., od 7 do 16 ili od 7 do 20 ugljenika, na primer C6-10aril-C1-6alkoksi, C6-10aril-C1-10alkoksi, ili C6-10aril-C1-20alkoksi). U nekim slučajevima, arilalkoksi grupa može biti supstituisana sa 1, 2, 3, ili 4 supstituenta kako je definisano u ovom tekstu

[0797] Izraz "ariloksi" predstavlja hemijski supstituent formule -OR', pri čemu je R' aril grupa od 6 do 18 ugljenika, ukoliko nije drugačije specifikovano. U nekim slučajevima, aril grupa može biti supstituisana sa 1, 2, 3, ili 4 supstituenta kako je definisano u ovom tekstu.

[0798] Izraz "ariloil", kako se koristi u ovom tekstu, predstavlja aril grupu, kako je definisano ovde, koja je prikačena za parentalnu molekulsku grupu preko karbonil grupe. Primeri nesupstituisanih ariloil grupa imaju od 7 do 11 ugljenika. U nekim slučajevima, aril grupa može biti supstituisana sa 1, 2, 3, ili 4 supstituenta kako je definisano u ovom tekstu.

[0799] Izraz "azido" predstavlja -N3grupu, koja može biti prikazana i kao -N=N=N.

[0800] Izraz "bicikličan", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na strukturu koja ima dva prstena, koji mogu biti aromatični ili nearomatični. Biciklične strukture uključuju spirociklil grupe, kako je definisano u ovom tekstu, i dva prstena koja dele jedan ili više mostova, pri čemu svaki most može uključiti jedan atom ili lanac koji sadrži dva, tri ili više atoma. Primeri bicikličnih grupa uključuju bicikličnu karbociklil grupu, gde su prvi i drugi prsten karbociklil grupe, kako je definisano u ovom tekstu; biciklične aril grupe, gde su prvi i drugi prsten aril grupe, kako je definisano u ovom tekstu; biciklične heterociklil grupe, gde je prvi prsten heterociklil grupa i drugi prsten je karbociklil (npr., aril) ili heterociklil (npr., heteroaril) grupa; i biciklične heteroaril grupe, gde je prvi prsten heteroaril grupa i drugi prsten je karbociklil (npr., aril) ili heterociklil (npr., heteroaril) grupa. U nekim slučajevima, biciklična grupa može biti supstituisana sa 1, 2, 3, ili 4 supstituenta, kako je definisano u ovom tekstu za cikloalkil, heterociklil, i aril grupe.

[0801] Izrazi "karbocikličan" i "karbociklil", kako se koristi u ovom tekstu, odnose se na opciono supstituisanu C3-12monocikličnu, bicikličnu, ili tricikličnu strukturu u kojoj se prstenovi koji mogu biti aromatični ili nearomatični, formiraju ugljenikovim atomima. Karbociklične strukture uključuju cikloalkil, cikloalkenil, i aril grupe.

[0802] Izraz "karbamoil", kako se koristi u ovom tekstu, predstavlja -C(O)-N(R<N1>)2, pri čemu se značenje svakog R<N1>nalazi u definiciji "amino" datoj u ovom tekstu.

[0803] Izraz "karbamoilalkil", kako se koristi u ovom tekstu, predstavlja alkil grupu, kako je ovde definisano, supstituisanu karbamoil grupom, kako je definisano u ovom tekstu. Alkil grupa može biti dodatno supstituisana sa 1, 2, 3, ili 4 supstituenta kako je definisano u ovom tekstu.

[0804] Izraz "karbamil", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na karbamatnu grupu koja ima strukturu -NR<N1>C(=O)OR ili -OC(=O)N(R<N1>)2, pri čemu se značenje svakog R<N1>nalazi u definiciji "amino" datoj u ovom tekstu, i R je alkil, cikloalkil, alkcikloalkil, aril, alkaril, heterociklil (npr., heteroaril), ili alkheterociklil (npr., alkheteroaril), kako je definisano u ovom tekstu.

[0805] Izraz "karbonil", kako se koristi u ovom tekstu, predstavlja C(O) grupu, koja takođe može biti predstavljena kao C=O.

[0806] Izraz "karboksialdehid" predstavlja acil grupu koja ima strukturu -CHO.

[0807] Izraz "karboksi", kako se koristi u ovom tekstu, znači -CO2H.

[0808] Izraz "karboksialkoksi", kako se koristi u ovom tekstu, predstavlja alkoksi grupu, kako je definisano ovde, supstituisanu karboksi grupom, kako je definisano u ovom tekstu. Alkoksi grupa može biti dodatno supstituisana sa 1, 2, 3, ili 4 supstituentne grupe kako je opisano u ovom tekstu za alkil grupu.

[0809] Izraz "karboksialkil", kako se koristi u ovom tekstu, predstavlja alkil grupu, kako je ovde definisano, supstituisanu karboksi grupom, kako je definisano u ovom tekstu. Alkil grupa može biti dodatno supstituisana sa 1, 2, 3, ili 4 supstituentne grupe kako je opisano u ovom tekstu.

[0810] Izraz "cijano", kako se koristi u ovom tekstu, predstavlja -CN grupu.

[0811] Izraz "cikloalkoksi" predstavlja hemijski supstituent formule -OR, pri čemu je R C3-8cikloalkil grupa, kako je definisano u ovom tekstu, ukoliko nije drugačije specifikovano. Cikloalkil grupa može biti dodatno supstituisana sa 1, 2, 3, ili 4 supstituentne grupe kako je opisano ovde. Primeri nesupstituisanih cikloalkoksi grupa imaju od 3 do 8 ugljenika. U nekim slučajevima, cikloalkil grupa može biti dodatno supstituisana sa 1, 2, 3, ili 4 supstituentne grupe kako je opisano u ovom tekstu.

[0812] Izraz "cikloalkil", kako se koristi u ovom tekstu, predstavlja monovalentnu zasićenu ili nezasićenu nearomatičnu cikličnu ugljovodoničnu grupu od tri do osam ugljenika, ukoliko nije drugačije specifikovano, a primeri su ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil, cikloheksil, cikloheptil, biciklo[2.2.1.]heptil, i slično. Kada cikloalkil grupa sadrži jednu ugljenik-ugljenik dvostruku vezu, cikloalkil grupa može da se označi kao "cikloalkenil" grupa. Primeri cikloalkenil grupa uključuju ciklopentenil, cikloheksenil, i slično. Cikloalkil grupe ove objave mogu biti opciono supstituisane sa: (1) C1-7acil (npr., karboksialdehid); (2) C1-20alkil (npr., C1-6alkil, C1-6alkoksi-C1-6alkil, C1-6alkilsulfinil-C1-6alkil, amino-C1-6alkil, azido-C1-6alkil, (karboksialdehid)-C1-6alkil, halo-C1-6alkil (npr., perfluoroalkil), hidroksi-C1-6alkil, nitro-C1-6alkil, ili C1-6tioalkoksi-C1-6alkil); (3) C1-

20alkoksi (npr., C1-6alkoksi, na primer perfluoroalkoksi); (4) C1-6alkilsulfinil; (5) C6-10aril; (6) amino; (7) C1-6alk-C6-10aril; (8) azido; (9) C3-8cikloalkil; (10) C1-6alk-C3-8cikloalkil; (11) halo; (12) C1-12heterociklil (npr., C1-12heteroaril); (13) (C1-12heterociklil)oksi; (14) hidroksi; (15) nitro; (16) C1-20tioalkoksi (npr., C1-6tioalkoksi); (17) -(CH2)qCO2R<A'>, gde je q ceo broj od nula do četiri, i R<A'>je odabran iz grupe koju čine (a) C1-6alkil, (b) C6-10aril, (c) vodonik, i (d) C1-6alk-C6-10aril; (18) -(CH2)qCONR<B'>R<C'>, gde je q ceo broj od nula do četiri i gde su R<B'>i R<C'>nezavisno odabrani iz grupe koju čine (a) vodonik, (b) C6-10alkil, (c) C6-10aril, i (d) C1-6alk-C6-10aril; (19) -(CH2)qSO2R<D'>, gde je q ceo broj od nula do četiri i gde je R<D'>odabran iz grupe koju čine (a) C6-10alkil, (b) C6-10aril, i (c) C1-6alk-C6-10aril; (20) -(CH2)qSO2NR<E'>R<F'>, gde je q ceo broj od nula do četiri i gde je svaki od R<E'>i R<F'>, nezavisno, odabran iz grupe koju čine (a) vodonik, (b) C6-10alkil, (c) C6-10aril, i (d) C1-6alk-C6-10aril; (21) tiol; (22) C6-10ariloksi; (23) C3-8cikloalkoksi; (24) C6-10aril-C1-6alkoksi; (25) C1-6alk-C1-12heterociklil (npr., C1-6alk-C1-12heteroaril); (26) okso; (27) C2-

20alkenil; i (28) C2-20alkinil. U nekim slučajevima, svaka od ovih grupa može biti dodatno supstituisana kako je opisano u ovom tekstu. Na primer, alkilen grupa C1-alkaril ili C1-alkheterociklil može biti dodatno supstituisana okso grupom da se dobije odgovarajuća ariloil i (heterociklil)oil supstituentna grupa.

[0813] Izraz "dijastereomer", kako se koristi u ovom tekstu, označava stereoizomere koji nisu jedan drugome slika u ogledalu i ne preklapaju se jedan sa drugim.

[0814] Izraz "efikasna količina" agensa, kako se koristi u ovom tekstu, je količina dovoljna za postizanje korisnih ili željenih rezultata, na primer, kliničkih rezultata, i, kao takva, "efikasna količina" zavisi od konteksta u kojem se primenjuje. Na primer, u kontekstu primene agensa kojim se leči kancer, efikasna količina agensa je, na primer, količina dovoljna za ostvarivanje lečenja, kako je definisano u ovom tekstu, kancera, u poređenju sa odgovorom koji se dobija bez primene agensa.

[0815] Izraz "enantiomer", kako se koristi u ovom tekstu, označava svaku pojedinačnu optički aktivnu formu jedinjenja objave, koja ima optičku čistoću ili enantiomerski višak (što se određuje postupcima koji su standardni u struci) od najmanje 80% (tj., najmanje 90% jednog enantiomera i najviše 10% drugog enantiomera), poželjno najmanje 90% i poželjnije najmanje 98%.

[0816] Izraz "halo", kako se koristi u ovom tekstu, predstavlja halogen odabran između broma, hlora, joda, ili fluora.

[0817] Izraz "haloalkoksi", kako se koristi u ovom tekstu, predstavlja alkoksi grupu, kako je definisano ovde, supstituisanu halogenom grupom (tj., F, Cl, Br, ili I). Haloalkoksi može biti supstituisan sa jednim, dva, tri, ili, u slučaju alkil grupa od dva ugljenika ili više, četiri halogena. Haloalkoksi grupe uključuju perfluoroalkoksi (npr., -OCF3), -OCHF2, -OCH2F, -OCCl3, -OCH2CH2Br, - OCH2CH(CH2CH2Br)CH3, i -OCHICH3. U nekim slučajevima, haloalkoksi grupa može biti dodatno supstituisana sa 1, 2, 3, ili 4 supstituentne grupe kako je opisano u ovom tekstu za alkil grupe.

1

[0818] Izraz "haloalkil", kako se koristi u ovom tekstu, predstavlja alkil grupu, kako je definisano ovde, supstituisanu halogenom grupom (tj., F, Cl, Br, ili I). Haloalkil može biti supstituisan sa jednim, dva, tri, ili, u slučaju alkil grupa od dva ugljenika ili više, četiri halogena. Haloalkil grupe uključuju perfluoroalkile (npr., -CF3), -CHF2, -CH2F, -CCl3, -CH2CH2Br, -CH2CH(CH2CH2Br)CH3, i -CHICH3. U nekim slučajevima, haloalkil grupa može biti dodatno supstituisana sa 1, 2, 3, ili 4 supstituentne grupe, kako je opisano u ovom tekstu za alkil grupe.

[0819] Izraz "heteroalkilen", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na alkilen grupu, kako je definisano u ovom tekstu, u kojoj su jedan ili dva konstituentna ugljenikova atoma, zamenjena azotom, kiseonikom ili sumporom. U nekim slučajevima, heteroalkilen grupa može biti dodatno supstituisana sa 1, 2, 3, ili 4 supstituentne grupe kako je opisano u ovom tekstu za alkilen grupe.

[0820] Izraz "heteroaril", kako se koristi u ovom tekstu, predstavlja podgrupu heterociklila, kako je ovde definisano, koji su aromatični: tj., sadrže 4n+2 pi elektrona unutar mono- ili multicikličnog prstenastog sistema. Primeri nesupstituisanih heteroaril grupa imaju od 1 do 12 (npr., 1 do 11, 1 do 10, 1 do 9, 2 do 12, 2 do 11, 2 do 10, ili 2 do 9) ugljenika. U nekim slučajevima, heteroaril je supstituisan sa 1, 2, 3, ili 4 supstituentne grupe kako je definisano za heterociklil grupu.

[0821] Izraz "heterociklil", kako se koristi u ovom tekstu predstavlja 5-, 6- ili 7-člani prsten, ukoliko nije drugačije specifikovano, koji sadrži jedan, dva, tri ili četiri heteroatoma nezavisno odabrana iz grupe koju čine azot, kiseonik, i sumpor. Petočlani prsten ima nula do dve dvostruke veze, i 6- i 7-člani prstenovi imaju nula do tri dvostruke veze. Primeri nesupstituisanih heterociklil grupa imaju od 1 do 12 (npr., 1 do 11, 1 do 10, 1 do 9, 2 do 12, 2 do 11, 2 do 10, ili 2 do 9) ugljenika. Izraz "heterociklil" takođe predstavlja heterociklično jedinjenje koje ima premošćenu multicikličnu strukturu u kojoj jedan ili više ugljenika i/ili heteroatoma premošćuju dva nesusedna člana monocikličnog prstena, npr., hinuklidinil grupa. Izraz "heterociklil" uključuje biciklične, triciklične, i tetraciklične grupe u kojima je bilo koji od gornjih heterocikličnih prstenova fuzionisan sa jednim, dva ili tri karbociklična prstena, npr., aril prsten, cikloheksanski prsten, cikloheksenski prsten, ciklopentanski prsten, ciklopentenski prsten, ili drugi monociklični heterociklični prsten, na primer indolil, hinolil, izohinolil, tetrahidrohinolil, benzofuril, benzotienil i slično. Primeri fuzionisanih heterociklila uključuju tropane i 1,2,3,5,8,8a-heksahidroindolizin. Heterociklici uključuju pirolil, pirolinil, pirolidinil, pirazolil, pirazolinil, pirazolidinil, imidazolil, imidazolinil, imidazolidinil, piridil, piperidinil, homopiperidinil, pirazinil, piperazinil, pirimidinil, piridazinil, oksazolil, oksazolidinil, izoksazolil, izoksazolidinil, morfolinil, tiomorfolinil, tiazolil, tiazolidinil, izotiazolil, izotiazolidinil, indolil, indazolil, hinolil, izohinolil, hinoksalinil, dihidrohinoksalinil, hinazolinil, cinolinil, ftalazinil, benzimidazolil, benzotiazolil, benzoksazolil, benzotiadiazolil, furil, tienil, tiazolidinil, izotiazolil, triazolil, tetrazolil, oksadiazolil (npr., 1,2,3-

11

oksadiazolil), purinil, tiadiazolil (npr., 1,2,3-tiadiazolil), tetrahidrofuranil, dihidrofuranil, tetrahidrotienil, dihidrotienil, dihidroindolil, dihidrohinolil, tetrahidrohinolil, tetrahidroizohinolil, dihidroizohinolil, piranil, dihidropiranil, ditiazolil, benzofuranil, izobenzofuranil, benzotienil, i slično, uključujući njihove dihidro i tetrahidro forme, pri čemu su jedna ili više dvostrukih veza redukovane i zamenjene vodonicima. Još neki primeri heterociklila uključuju: 2,3,4,5-tetrahidro-2-okso-oksazolil; 2,3-dihidro-2-okso-1H-imidazolil; 2,3,4,5-tetrahidro-5-okso-1H-pirazolil (npr., 2,3,4,5-tetrahidro-2-fenil-5-okso-1H-pirazolil); 2,3,4,5-tetrahidro-2,4-diokso-1H-imidazolil (npr., 2,3,4,5-tetrahidro-2,4-diokso-5-metil-5-fenil-1H-imidazolil); 2,3-dihidro-2-tiokso-1,3,4-oksadiazolil (npr., 2,3-dibidro-2-tiokso-5-fenil-1,3,4-oksadiazolil); 4,5-dihidro-5-okso-1H-triazolil (npr., 4,5-dihidro-3-metil-4-amino 5-okso-1H-triazolil); 1,2,3,4-tetrahidro-2,4-dioksopiridinil (npr., 1,2,3,4-tetrahidro-2,4-diokso-3,3-dietilpiridinil); 2,6-diokso-piperidinil (npr., 2,6-diokso-3-etil-3-fenilpiperidinil); 1,6-dihidro-6-oksopiridiminil; 1,6-dihidro-4-oksopirimidinil (npr., 2-(metiltio)-1,6-dihidro-4-okso-5-metilpirimidin-1-il); 1,2,3,4-tetrahidro-2,4-dioksopirimidinil (npr., 1,2,3,4-tetrahidro-2,4-diokso-3-etilpirimidinil); 1,6-dihidro-6-oksopiridazinil (npr., 1,6-dihidro-6-okso-3-etilpiridazinil); 1,6-dihidro-6-okso-1,2,4-triazinil (npr., 1,6-dihidro-5-izopropil-6-okso-1,2,4-triazinil); 2,3-dihidro-2-okso-1H-indolil (npr., 3,3-dimetil-2,3-dihidro-2-okso-1H-indolil i 2,3-dihidro-2-okso-3,3'-spiropropan-1H-indol-1-il); 1,3-dihidro-1-okso-2H-izo-indolil; 1,3-dihidro-1,3-diokso-2H-izo-indolil; 1H-benzopirazolil (npr., 1-(etoksikarbonil)-1H-benzopirazolil); 2,3-dihidro-2-okso-1H-benzimidazolil (npr., 3-etil-2,3-dihidro-2-okso-1H-benzimidazolil); 2,3-dihidro-2-okso-benzoksazolil (npr., 5-hloro-2,3-dihidro-2-okso-benzoksazolil); 2,3-dihidro-2-okso-benzoksazolil; 2-okso-2H-benzopiranil; 1,4-benzodioksanil; 1,3-benzodioksanil; 2,3-dihidro-3-okso,4H-1,3-benzotiazinil; 3,4-dihidro-4-okso-3H-hinazolinil (npr., 2-metil-3,4-dihidro-4-okso-3H-hinazolinil); 1,2,3,4-tetrahidro-2,4-diokso-3H-hinazolil (npr., 1-etil-1,2,3,4-tetrahidro-2,4-diokso-3H-hinazolil); 1,2,3,6-tetrahidro-2,6-diokso-7H-purinil (npr., 1,2,3,6-tetrahidro-1,3-dimetil-2,6-diokso-7 H -purinil); 1,2,3,6-tetrahidro-2,6-diokso-1 H-purinil (npr., 1,2,3,6-tetrahidro-3,7-dimetil-2,6-diokso-1 H-purinil); 2-oksobenz[c,d]indolil; 1,1-diokso-2H-naft[1,8-c,d]izotiazolil; i 1,8-naftilendikarboksamido. Dodatni heterociklici uključuju 3,3a,4,5,6,6a-heksahidro-pirolo[3,4-b]pirol-(2H)-il, i 2,5-diazabiciklo[2.2.1]heptan-2-il, homopiperazinil (ili diazepanil), tetrahidropiranil, ditiazolil, benzofuranil, benzotienil, oksepanil, tiepanil, azokanil, oksekanil, i tiokanil. Heterociklične grupe uključuju i grupe formule

12

pri čemu

[0822] E' je odabran iz grupe koju čine -N- i -CH-; F' je odabran iz grupe koju čine -N=CH-, -NH-CH2-, -NH-C(O)-, -NH-, -CH=N-, -CH2-NH-, -C(O)-NH-, -CH=CH-, - CH2-, -CH2CH2-, -CH2O-, -OCH2-, -O-, i -S-; i G' je odabran iz grupe koju čine - CH- i -N-. Svaka od heterociklil grupa pomenutih u ovom tekstu može biti opciono supstituisana sa jednim, dva, tri, četiri ili pet supstituenata nezavisno odabranih iz grupe koju čine: (1) C1-7acil (npr., karboksialdehid ); (2) C1-

20alkil (npr., C1-6alkil, C1-6alkoksi-C1-6alkil, C1-6alkilsulfinil-C1-6alkil, amino-C1-6alkil, azido-C1-6alkil, (karboksialdehid)-C1-6alkil, halo-C1-6alkil (npr., perfluoroalkil), hidroksi-C1-6alkil, nitro-C1-6alkil, ili C1-6tioalkoksi-C1-6alkil); (3) C1-20alkoksi (npr., C1-6alkoksi, na primer perfluoroalkoksi); (4) C1-6alkilsulfinil; (5) C6-10aril; (6) amino; (7) C1-6alk-C6-10aril; (8) azido; (9) C3-8cikloalkil; (10) C1-6alk-C3-8cikloalkil; (11) halo; (12) C1-12heterociklil (npr., C2-12heteroaril); (13) (C1-12heterociklil)oksi; (14) hidroksi; (15) nitro; (16) C1-20tioalkoksi (npr., C1-6tioalkoksi); (17) -(CH2)qCO2R<A'>, pri čemu je q ceo broj od nula do četiri, i R<A'>je odabran iz grupe koju čine (a) C1-6alkil, (b) C6-10aril, (c) vodonik, i (d) C1-6alk-C6-10aril; (18) -(CH2)qCONR<B'>R<C'>, pri čemu je q ceo broj od nula do četiri i gde su R<B'>i R<C'>nezavisno odabrani iz grupe koju čine (a) vodonik, (b) C1-6alkil, (c) C6-10aril, i (d) C1-6alk-C6-10aril; (19) -(CH2)qSO2R<D'>, pri čemu je q ceo broj od nula do četiri i gde je R<D'>odabran iz grupe koju čine (a) C1-6alkil, (b) C6-10aril, i (c) C1-6alk-C6-10aril; (20) -(CH2)qSO2NR<E'>R<F'>, pri čemu je q ceo broj od nula do četiri i gde je svaki od R<E'>i R<F'>, nezavisno, odabran iz grupe koju čine (a) vodonik, (b) C1-6alkil, (c) C6-10aril, i (d) C1-6alk-C6-10aril; (21) tiol; (22) C6-10ariloksi; (23) C3-8cikloalkoksi; (24) arilalkoksi; (25) C1-6alk-C1-12heterociklil (npr., C1-6alk-C1-12heteroaril); (26) okso; (27) (C1-12heterociklil)imino; (28) C2-20alkenil; i (29) C2-20alkinil. U nekim slučajevima, svaka od ovih grupa može biti dodatno supstituisana kako je opisano u ovom tekstu. Na primer, alkilen grupa C1-alkarila ili C1-alkheterociklila može biti dodatno supstituisana okso grupom da se dobije odgovarajuća ariloil i (heterociklil)oil supstituentna grupa.

[0823] Izraz "(heterociklil)imino", kako se koristi u ovom tekstu, predstavlja heterociklil grupu, kako je definisano u ovom tekstu, prikačenu za parentalnu molekulsku grupu preko imino grupe. U nekim slučajevima, heterociklil grupa može biti supstituisana sa 1, 2, 3, ili 4 supstituentne grupe kako je definisano u ovom tekstu.

1

[0824] Izraz "(heterociklil)oksi", kako se koristi u ovom tekstu, predstavlja heterociklil grupu, kao što je ovde definisano, prikačenu za parentalnu molekulsku grupu preko atoma kiseonika. U nekim slučajevima, heterociklil grupa može biti supstituisana sa 1, 2, 3, ili 4 supstituentne grupe kako je definisano u ovom tekstu.

[0825] Izraz "(heterociklil)oil", kako se koristi u ovom tekstu, predstavlja heterociklil grupu, kako je definisano u ovom tekstu, prikačenu za parentalnu molekulsku grupu preko karbonil grupe. U nekim slučajevima, heterociklil grupa može biti supstituisana sa 1, 2, 3, ili 4 supstituentne grupe kako je definisano u ovom tekstu.

[0826] Izraz "ugljovodonik", kako se koristi ovde, predstavlja grupu koja se sastoji samo od atoma ugljenika i vodonika.

[0827] Izraz "hidroksi", kako se koristi u ovom tekstu, predstavlja -OH grupu.

[0828] Izraz "hidroksialkenil", kako se koristi u ovom tekstu, predstavlja alkenil grupu, kako je ovde definisano, supstituisanu jednom do tri hidroksi grupe, uz uslov da ne više od jedne hidroksi grupe može biti prikačeno za jedan ugljenikov atom alkil grupe, i primer je dihidroksipropenil, hidroksiizopentenil, i slično.

[0829] Izraz "hidroksialkil", kako se koristi u ovom tekstu, predstavlja alkil grupu, kako je definisano ovde, supstituisanu jednom do tri hidroksi grupe, uz uslov da ne više od jedne hidroksi grupe može biti prikačeno za jedan ugljenikov atom alkil grupe, i primer je hidroksimetil, dihidroksipropil, i slično.

[0830] Izraz "izomer", kako se koristi u ovom tekstu, označava svaki tautomer, stereoizomer, enantiomer, ili dijastereomer bilo kojeg jedinjenja objave. Prepoznaje se da jedinjenja objave mogu imati jedan ili više hiralnih centara i/ili dvostrukih veza i, dakle, postojati u vidu stereoizomera, kao izomeri sa dvostrukom vezom (tj., geometrijski E/Z izomeri) ili dijastereomeri (npr., enantiomeri (tj., (+) ili (-)) ili cis/trans izomeri). U skladu sa objavom, hemijske strukture prikazane u ovom tekstu, i prema tome, jedinjenja objave, obuhvataju sve odgovarajuće stereoizomere, to jest, i stereomerno čistu formu (npr., geometrijski čistu, enantiomerski čistu, ili dijastereomerno čistu) i enantiomerne i stereoizomerne smeše, npr., racemate. Enantiomerne i stereoizomerne smeše jedinjenja objave mogu tipično da se razdvoje u svoje sastavne enantiomere ili stereoizomere dobro poznatim postupcima, kao što su hiralno-fazna gasna hromatografija, hiralno-fazna tečna hromatografija visokih performansi, kristalizacija jedinjenja kao hiralnih slanih kompleksa, ili kristalizacija jedinjenja u hiralnom rastvaraču. Enantiomeri i stereoizomeri mogu da se dobiju i iz stereomerno ili enantiomerno čistih intermedijara, reagenasa, i katalizatora dobro poznatim metodima asimetrične sinteze.

14

[0831] Izraz "N-protektovani amino", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na amino grupu, kako je definisano ovde, za koju su prikačene jedna ili dve N-protektivne grupe, kako je definisano u ovom tekstu.

[0832] Izraz "N-protektivna grupa", kako se koristi u ovom tekstu, predstavlja one grupe koje su namenjene zaštiti amino grupe od neželjenih reakcija tokom sintetskih procedura. Često korišćene N-protektivne grupe objavljene su u Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis", 3. izdanje (John Wiley & Sons, New York, 1999). N-protektivne grupe uključuju acil, ariloil, ili karbamil grupe kao što su formil, acetil, propionil, pivaloil, t-butilacetil, 2-hloroacetil, 2-bromoacetil, trifluoroacetil, trihloroacetil, ftalil, o-nitrofenoksiacetil, α-hlorobutiril, benzoil, 4-hlorobenzoil, 4-bromobenzoil, 4-nitrobenzoil, i hiralne pomoćna sredstva kao što su protektovane ili neprotektovane D, L ili D, L-aminokiseline, na primer alanin, leucin, fenilalanin, i slično; sulfonilsadržavajuće grupe kao što su benzensulfonil, p-toluensulfonil, i slično; karbamat-formirajuće grupe kao što su benziloksikarbonil, p-hlorobenziloksikarbonil, p-metoksibenziloksikarbonil, pnitrobenziloksikarbonil, 2-nitrobenziloksikarbonil, p-bromobenziloksikarbonil, 3,4-dimetoksibenziloksikarbonil, 3,5-dimetoksibenziloksikarbonil, 2,4-dimetoksibenziloksikarbonil, 4-metoksibenziloksikarbonil, 2-nitro-4,5-dimetoksibenziloksikarbonil, 3,4,5-trimetoksibenziloksikarbonil, 1-(p-bifenilil)-1-metiletoksikarbonil, α,α-dimetil-3,5-dimetoksibenziloksikarbonil, benzhidriloksi karbonil, t-butiloksikarbonil, diizopropilmetoksikarbonil, izopropiloksikarbonil, etoksikarbonil, metoksikarbonil, aliloksikarbonil, 2,2,2,-trihloroetoksikarbonil, fenoksikarbonil, 4-nitrofenoksi karbonil, fluorenil-9-metoksikarbonil, ciklopentiloksikarbonil, adamantiloksikarbonil, cikloheksiloksikarbonil, feniltiokarbonil, i slično, alkaril grupe kao što su benzil, trifenilmetil, benziloksimetil, i slično i silil grupe kao što su trimetilsilil, i slično. Poželjne N-protektivne grupe su formil, acetil, benzoil, pivaloil, t-butilacetil, alanil, fenilsulfonil, benzil, t-butiloksikarbonil (Boc), i benziloksikarbonil (Cbz).

[0833] Izraz "nitro", kako se koristi u ovom tekstu, predstavlja -NO2grupu.

[0834] Izraz "okso" kako se koristi u ovom tekstu, predstavlja =O.

[0835] Izraz "perfluoroalkil", kako se koristi u ovom tekstu, predstavlja alkil grupu, kako je definisano u ovom tekstu, gde je svaki vodonični radikal vezan za alkil grupu zamenjen fluoridnim radikalom. Primeri perfluoroalkil grupa su trifluorometil, pentafluoroetil, i slično.

[0836] Izraz "perfluoroalkoksi", kako se koristi u ovom tekstu, predstavlja alkoksi grupu, kako je definisano u ovom tekstu, gde je svaki vodonični radikal vezan za alkoksi grupu zamenjen fluoridnim radikalom. Primeri perfluoroalkoksi grupa su trifluorometoksi, pentafluoroetoksi, i slično.

1

[0837] Izraz "spirociklil", kako se koristi u ovom tekstu, predstavlja C2-7alkilen diradikal, čija su oba kraja vezana za isti ugljenikov atom parentalne grupe da se formira spirociklična grupa, i takođe C1-6heteroalkilen diradikal, čija su oba kraja vezana za isti atom. Heteroalkilen radikal koji formira spirociklil grupu može sadržati jedan, dva, tri ili četiri heteroatoma nezavisno odabrana iz grupe koja se sastoji od azota, kiseonika i sumpora. U nekim slučajevima, spirociklil grupa uključuje jedan do sedam ugljenika, isključujući ugljenikov atom za koji je prikačen diradikal. Spirociklil grupe prikaza mogu da budu opciono supstituisane sa 1, 2, 3, ili 4 supstituenta koja su ovde obezbeđena kao opcioni supstituenti za cikloalkil i/ili heterociklil grupe.

[0838] Izraz "stereoizomer", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na sve moguće različite izomerne kao i konformacione forme koje jedinjenje može da ima (npr., jedinjenje bilo koje formule opisane ovde), tačnije sve moguće stereohemijske i konformacione izomerne forme, sve dijastereomere, enantiomere i/ili konformere osnovne molekulske strukture. Neka jedinjenja predmetnog prikaza mogu postojati u različitim tautomernim formama.

[0839] Izraz "sulfoalkil", kako se koristi u ovom tekstu, predstavlja alkil grupu, kako je definisano u ovom tekstu, supstituisanu sulfo grupom -SO3H. U nekim slučajevima, alkil grupa može biti dodatno supstituisana sa 1, 2, 3, ili 4 supstituentne grupe kako je opisano ovde.

[0840] Izraz "sulfonil", kako se koristi u ovom tekstu, predstavlja -S(O)2- grupu.

[0841] Izraz "tioalkaril", kako se koristi u ovom tekstu, predstavlja hemijski supstituent formule -SR, gde je R alkaril grupa. U nekim slučajevima, alkaril grupa može biti dodatno supstituisana sa 1, 2, 3, ili 4 supstituentne grupe kako je opisano u ovom tekstu.

[0842] Izraz "tioalkheterociklil", kako se koristi u ovom tekstu, predstavlja hemijski supstituent formule -SR, gde je R alkheterociklil grupa. U nekim slučajevima, alkheterociklil grupa može biti dodatno supstituisana sa 1, 2, 3, ili 4 supstituentne grupe kako je opisano u ovom tekstu.

[0843] Izraz "tioalkoksi", kako se koristi u ovom tekstu, predstavlja hemijski supstituent formule -SR, gde je R alkil grupa, kako je ovde definisano. U nekim slučajevima, alkil grupa može biti dodatno supstituisana sa 1, 2, 3, ili 4 supstituentne grupe kako je opisano u ovom tekstu.

[0844] Izraz "tiol" predstavlja -SH grupu.

[0845] Jedinjenje: Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "jedinjenje", kako se ovde koristi, treba da uključi sve stereoizomere, geometrijske izomere, tautomere, i izotope prikazanih struktura.

[0846] Jedinjenja opisana u ovom tekstu mogu biti asimetrična (npr., imati jedan ili više stereocentara). U vidu se imaju svi stereoizomeri, na primer enantiomeri i dijastereomeri, ako nije drugačije naznačeno. Jedinjenja predmetnog prikaza koja sadrže asimetrično supstituisane ugljenikove atome mogu se izolovati u optički aktivnoj ili racemskoj formi. Postupci pripremanja optički aktivne forme od optički aktivnih polaznih materijala poznati su u struci, na primer

1

razdvajanje racemskih smeša ili stereoselektivna sinteza. Mnogi geometrijski izomeri olefina, C=N dvostrukih veza, i slično takođe mogu biti prisutni u jedinjenjima opisanim u ovom tekstu, i u predmetnoj objavi se razmatraju svi takvi stabilni izomeri. Cis i trans geometrijski izomeri jedinjenja predmetnog prikaza opisani su i mogu se izolovati kao smeše izomera ili zasebne izomerne forme.

[0847] Jedinjenja predmetnog prikaza uključuju i tautomerne forme. Tautomerne forme su rezultat zamene jednostruke veze susednom dvostrukom vezom zajedno sa istovremenom migracijom protona. Tautomerne forme uključuju prototropske tautomere koji su izomerna protonisana stanja koja imaju istu empirijsku formulu i ukupno naelektrisanje. Primeri prototropnih tautomera uključuju parove keton - enol, parove amid - imidna kiselina, parove laktam - laktim, parove amid - imidna kiselina, parove enamin - imin, i prstenaste forme gde proton može zauzeti dve ili više pozicija heterocikličnog sistema, na primer, 1H- i 3H-imidazol, 1H-, 2H- i 4H- 1,2,4-triazol, 1H-i 2H- izoindol, i 1H- i 2H-pirazol. Tautomerne forme mogu biti u ravnoteži ili sterički zaključane u jednoj formi odgovarajućom supstitucijom.

[0848] Jedinjenja predmetnog prikaza uključuju i sve izotope atoma koji se sreću u intermedijaru ili finalnom jedinjenju. "Izotopi" odnosi se na atome koji imaju isti atomski broj, ali različite masene brojeve, što je rezultat različitog broja neutrona u nukleusu. Na primer, izotopi vodonika uključuju tricijum i deuterijum.

[0849] Jedinjenja i soli predmetnog prikaza mogu se pripremiti u kombinaciji sa molekulima rastvarača ili vode da bi se rutinskim postupcima formirali solvate i hidrate.

[0850] Konzervirani: Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "konzervirani" odnosi se na nukleotide ili aminokiselinske rezidue polinukleotidne sekvence, odnosno polipeptidne sekvence, koji se sreću neizmenjeni na istoj poziciji u dve ili više upoređenih sekvenci. Nukleotidi ili aminokiseline koji su relativno konzervirani su oni koji su konzervirani među srodnijim sekvencama nego nukleotidi ili aminokiseline koji se nalaze na drugim mestima u sekvencama.

[0851] U nekim slučajevima, kaže se da su dve ili više sekvenci "potpuno konzervirane" ako su 100% identične jedna sa drugom. U nekim slučajevima, kaže se da su dve ili više sekvenci "visoko konzervirane" ako su najmanje 70% identične, najmanje 80% identične, najmanje 90% identične, ili najmanje 95% identične jedna sa drugom. U nekim slučajevima, kaže se da su dve ili više sekvenci "visoko konzervirane" ako su oko 70% identične, oko 80% identične, oko 90% identične, oko 95%, oko 98%, ili oko 99% identične jedna sa drugom. U nekim slučajevima, kaže se da su dve ili više sekvenci "konzervirane" ako su najmanje 30% identične, najmanje 40% identične, najmanje 50% identične, najmanje 60% identične, najmanje 70% identične, najmanje 80% identične, najmanje 90% identične, ili najmanje 95% identične jedna sa drugom. U nekim

1

slučajevima, kaže se da su dve ili više sekvenci "konzervirane" ako su oko 30% identične, oko 40% identične, oko 50% identične, oko 60% identične, oko 70% identične, oko 80% identične, oko 90% identične, oko 95% identične, oko 98% identične, ili oko 99% identične jedna sa drugom. Konzerviranje sekvenci može da važi za čitavu dužinu oligonukleotida ili polipeptida ili može da važi za njihov deo, region ili karakteristiku. Konzerviranje sekvenci može da važi za čitavu dužinu oligonukleotida ili polipeptida ili može da važi za njihov deo, region ili karakteristiku.

[0852] Isporuka: Kako se koristi u ovom tekstu, "isporuka" se odnosi na čin ili način isporuke jedinjenja, supstance, entiteta, komponente, tereta ili opterećenja lekom.

[0853] Agens za isporuku: Kako se koristi u ovom tekstu, "agens za isporuku" odnosi se na svaku supstancu koja olakšava, bar delimično, in vivo isporuku modifikovane nukleinske kiseline u ciljne ćelije.

[0854] Detektabilna oznaka: Kao što se ovde upotrebljava, "detektabilna oznaka" označava jedan ili više markera, signala, ili delova koji su prikačeni, inkorporisani ili asocirani sa drugim entitetom koji se lako detektuje pomoću postupaka poznatih u struci uključujući radiografiju, fluorescenciju, hemiluminescenciju, enzimsku aktivnost, apsorbancu i slično. Detektabilne oznake uključuju radioizotope, fluorofore, hromofore, enzime, boje, jone metala, ligande kao što su biotin, avidin, streptavidin i hapteni, kvantne tačke, i slično. Detektabilne oznake mogu da budu locirane na bilo kojoj poziciji u peptidima ili proteinima koji su ovde opisani. One mogu da budu unutar aminokiselina, peptida, ili proteina, ili locirane na N- ili C-krajevima.

[0855] Uređaj: Kao što se ovde upotrebljava, izraz "uređaj" komad opreme konstruisan da služi posebnoj nameni. Uređaj može da sadrži mnoge karakteristike kao što su, ali bez ograničenja, električne komponente (npr., ožičenje i kola), moduli za skladištenje i moduli za analizu.

[0856] Bolest: Kao što se ovde upotrebljava, termin "bolest" označava abnormalno stanje koje utiče na telo organizma koji često pokazuje specifične telesne simptome.

[0857] Poremećaj: Kao što se ovde upotrebljava, termin "poremećaj" označava poremećaj ili ometanje normalnih funkcija ili uspostavljenih sistema tela.

[0858] Digestirati: Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "digestirati" znači razdvojiti u manje delove ili komponente. Kada se odnosi na polipeptide ili proteine, digestija rezultuje proizvodnjom peptida.

[0859] Kodirani signal isecanja proteina: Kao što se ovde upotrebljava, "kodirani signal isecanja proteina" označava nukleotidnu sekvencu koja kodira signal isecanja proteina.

[0860] Konstruisano: Kao što se ovde upotrebljava, primeri izvođenja pronalaska su "konstruisani" kada su dizajnirani da imaju osobinu ili svojstvo, bilo strukturno ili hemijsko, koje se razlikuje od početne tačke, molekula divljeg tipa ili nativnog molekula.

1

[0861] Egzozom: Kao što se ovde upotrebljava, "egzozom" je vezikula koju sekretuju ćelije sisara ili kompleks uključen u degradaciju RNK.

[0862] Ekspresija: Kao što se ovde upotrebljava, "ekspresija" sekvence nukleinske kiseline označava jedan ili više od sledećih događaja: (1) proizvodnja matrice RNK iz sekvence DNK (npr. transkripcijom); (2) obrada RNK transkripta (npr. splajsovanjem, editovanjem, formiranjem 5' kape, i/ili obradom 3' kraja); (3) translacija RNK u polipeptid ili protein; i (4) posttranslaciona modifikacija polipeptida ili proteina.

[0863] Osobina: Kao što se ovde upotrebljava, "osobina" označava karakteristiku, svojstvo, ili prepoznatljiv element.

[0864] Formulacija: Kao što se ovde upotrebljava, "formulacija" uključuje najmanje modifikovanu nukleinsku kiselinu i agens za isporuku.

[0865] Fragment: "Fragment", kao što se ovde upotrebljava, označava deo. Na primer, fragmenti proteina mogu sadržati polipeptide dobijene digestijom proteina pune dužine izolovanog iz kultivisanih ćelija.

[0866] Funkcionalno: Kao što se ovde upotrebljava, "funkcionalni" biološki molekul je biološki molekul u obliku u kojem pokazuje svojstvo i/ili aktivnost po kojoj se karakteriše.

[0867] Heterologo: Kao što se ovde upotrebljava, termin "heterologo" kada se odnosi na netranslatirani region kao što je 5'UTR ili 3'UTR označava region nukleinske kiseline, posebno netranslatiranu nukleinsku kiselinu koja se u prirodi ne nalazi zajedno sa kodirajućim regionom kodiranim na istom ili predmetnom polinukleotidu, primarnom konstruktu ili mmRNA. Homologi UTR bi na primer na primer predstavljali one UTR koji su prirodno povezani sa kodirajućim regionom mRNA, kao što je UTR divljeg tipa.

[0868] Homologija: Kao što se ovde upotrebljava, termin "homologija" označava ukupnu srodnost između polimernih molekula, npr. između molekula nukleinskih kiselina (npr. DNK molekula i/ili RNK molekula) i/ili između molekula polipeptida. U nekim slučajevima, polimerni molekuli smatraju se "homolognim" jedni drugima ukoliko su njihove sekvence najmanje 25%, najmanje 30%, najmanje 35%, najmanje 40%, najmanje 45%, najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 99% identične. U nekim slučajevima, smatra se da su polimerni molekuli međusobno "homologi" ako su njihove sekvence najmanje 25%, najmanje 30%, najmanje 35%, najmanje 40%, najmanje 45%, najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 99% slične. Termin "homologi" se neophodno odnosi na poređenje najmanje dve sekvence (polinukleotidne ili polipeptidne sekvence).

1

[0869] U skladu sa pronalaskom, smatra se da su dve polinukleotidne sekvence homologe ako su polipeptidi koje one kodiraju najmanje oko 50% identični, najmanje oko 60% identični, najmanje oko 70% identični, najmanje oko 80% identični, ili najmanje oko 90% identični u najmanje jednom nizu od najmanje oko 20 aminokiselina.

[0870] U nekim slučajevima, homologe polinukleotidne sekvence se odlikuju sposobnošću da kodiraju niz od najmanje 4-5 jedinstveno određenih aminokiselina. Za polinukleotidne sekvence dužine manje od 60 nukleotida, homologija se određuje mogućnošću da kodiraju niz od najmanje 4-5 jedinstveno određenih aminokiselina. U skladu sa pronalaskom, smatra se da su dve proteinske sekvence homologe ako su proteini najmanje oko 50% identični, najmanje oko 60% identični, najmanje oko 70% identični, najmanje oko 80% identični, ili najmanje oko 90% identični za najmanje jedan niz od najmanje oko 20 aminokiselina.

[0871] Identičnost: Kao što se ovde upotrebljava, termin "identičnost" označava ukupnu srodnost između polimernih molekula, npr. između molekula oligonukleotida (npr. DNK molekula i/ili RNK molekula) i/ili između molekula polipeptida. Izračunavanje procenta identičnosti dve polinukleotidne sekvence, na primer, može se izvesti poravnanjem dve sekvence radi optimalnih poređenja (npr. praznine se mogu introdukovati u jednu ili obe prve i druge sekvence nukleinske kiseline radi optimalnog poravnanja i neidentične sekvence se mogu zanemariti radi poređenja). U određenim slučajevima, dužina sekvence poravnate radi poređenja je najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili 100% dužine referentne sekvence. Zatim se upoređuju nukleotidi na odgovarajućim pozicijama nukleotida. Kada poziciju u prvoj sekvenci zauzima isti nukleotid kao na odgovarajućoj poziciji u drugoj sekvenci, tada su molekuli identični na toj poziciji. Procenat identičnosti između dve sekvence je funkcija broja identičnih pozicija koje su zajedničke za sekvence, uzimajući u obzir broj praznina, i dužinu svake praznine, koju je potrebno introdukovati za optimalno poravnanje dve sekvence. Upoređivanje sekvenci i određivanje procenta identičnosti između dve sekvence može da bude postignuto upotrebom matematičkog algoritma. Na primer, procenat identičnosti između dve nukleotidne sekvence može da bude određen upotrebom postupaka kao što su oni opisani u Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., i Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; i Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. i Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991. Na primer, procenat identičnosti između dve nukleotidne sekvence može da bude određen upotrebom Majersovog (Meyers) i Milerovog (Miller) algoritma

2

(CABIOS, 1989, 4:11-17), koji je inkorporisan u ALIGN program (verzija 2.0) upotrebom tabele mase ostataka PAM120, kazne za dužine praznine 12 i kazne za prazninu 4. Procenat identičnosti između dve nukleotidne sekvence alternativno može da bude određen upotrebom GAP programa u GCG softverskom paketu upotrebom matriksa NWSgapdna.CMP. Postupci koji se uobičajeno koriste za određivanje procenta identičnosti između sekvenci uključuju, ali nisu ograničeni na one objavljene u Carillo, H. i Lipman, D., SIAM J Applied Math., 48:1073 (1988). Tehnike za određivanje identičnosti kodirane su u javno dostupnim računarskim programima. Primeri računarskog softvera za određivanje homologije između dve sekvence uključuju, ali nisu ograničeni na, GCG programski paket, Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1), 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, i FASTA Altschul, S. F., et al., J. Molec. Biol, 215, 403 (1990)).

[0872] Inhibira ekspresiju gena: Kao što se ovde upotrebljava, fraza "inhibira ekspresiju gena" znači da uzrokuje redukovanje količine proizvoda ekspresije gena. Proizvod ekspresije može da bude RNK transkribovana iz gena (npr. mRNA) ili polipeptid translatiran iz mRNA transkribovane iz gena. Tipično redukovanje nivoa mRNA rezultuje redukovanjem nivoa polipeptida koji se iz nje translatira. Nivo ekspresije može da bude određen upotrebom standardnih tehnika za merenje mRNA ili proteina.

[0873] In vitro: Kao što se ovde upotrebljava, termin "in vitro" označava događaje koji se događaju u veštačkom okruženju, npr. u epruveti ili reakcionoj posudi, u ćelijskoj kulturi, u Petri šolji, itd. pre nego unutar organizma (npr. životinje, biljke, ili mikroba).

[0874] In vivo: Kao što se ovde upotrebljava, termin "in vivo" označava događaje koji se događaju unutar organizma (npr. životinje, biljke ili mikroba ili njihove ćelije ili tkiva).

[0875] Izolovano: Kao što se ovde upotrebljava, termin "izolovano" označava supstancu ili entitet koji je odvojen od najmanje nekih komponenti sa kojima je bio asociran (bilo u prirodi ili u eksperimentalnoj postavci). Izolovane supstance mogu imati različite nivoe čistoće u odnosu na supstance sa kojima su bile asocirane. Izolovane supstance i/ili entiteti mogu da budu odvojeni od najmanje oko 10%, oko 20%, oko 30%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 70%, oko 80%, oko 90%, ili više drugih komponenti sa kojima su bili inicijalno asocirani. U nekim slučajevima, izolovani agensi su više od oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 91%, oko 92%, oko 93%, oko 94%, oko 95%, oko 96%, oko 97%, oko 98%, oko 99%, ili više od oko 99% čisti. Kao što se ovde upotrebljava, supstanca je "čista" ukoliko je suštinski bez drugih komponenti. Suštinski izolovano: Pod "suštinski izolovano" podrazumeva se da je jedinjenje suštinski odvojeno od okruženja u kome je bilo formirano ili detektovano. Delimično odvajanje može uključivati, na primer, kompoziciju obogaćenu jedinjenjem predmetnog prikaza. Znatno odvajanje može uključivati kompozicije koje sadrže najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80%, najmanje

21

oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 97%, ili najmanje oko 99% po težini jedinjenja predmetnog prikaza, ili njegove soli. Postupci za izolovanje jedinjenja i njihovih soli su rutinski u struci.

[0876] Linker: Kao što se ovde upotrebljava, linker označava grupu atoma, npr.10-1.000 atoma, i može se sastojati od atoma ili grupa kao što su, ali bez ograničenja, ugljenik, amino, alkilamino, kiseonik, sumpor, sulfoksid, sulfonil, karbonil, i imin. Linker može da bude prikačen za modifikovani nukleozid ili nukleotid na nukleobazi ili šećernom delu na prvom kraju, i za opterećenje lekom, npr. detektibilni ili terapeutski agens, na drugom kraju. Linker može da bude dovoljne dužine da ne ometa inkorporaciju u sekvencu nukleinske kiseline. Linker se može upotrebljavati u bilo koju korisnu svrhu, kao što je formiranje modifikovanih multimera mRNA (npr. preko povezivanja dve ili više modifikovanih nukleinskih kiselina), ili modifikovanih konjugata mRNA, kao i za primenu opterećenja lekom, kao što je ovde opisano. Primeri hemijskih grupa koje mogu da budu inkorporisane u linker uključuju, ali nisu ograničene na, alkil, alkenil, alkinil, amido, amino, etar, tioetar, estar, alkilen, heteroalkilen, aril, ili heterociklil, od kojih svaka može da bude opciono supstituisana, kao što je ovde opisano. Primeri linkera uključuju, ali nisu ograničeni na, nezasićene alkane, polietilen glikole (npr. monomerne jedinice etilen ili propilen glikola, npr. dietilen glikol, dipropilen glikol, metilen glikol, tripropilen glikol, tetraetilen glikol, ili tetraetilen glikol), i dekstran polimere. Drugi primeri uključuju, ali nisu ograničeni na, delove unutar linkera koji može da se otcepi, kao što su, na primer, disulfidna veza (-S-S-) ili azo veza (-N=N-), koje se mogu iseći upotrebom redukcionog agensa ili fotolize. Neograničavajući primeri selektivno isecive veze koji može da se otcepi uključuju amido vezu koja se može iseći na primer pomoću upotrebe tris(2-karboksietil)fosfina (TCEP), ili drugih redukcionih agenasa, i/ili fotolize, kao i estarsku vezu koja se može iseći na primer pomoću kisele ili bazne hidrolize.

[0877] Modifikovani: Kao što se ovde upotrebljava, "modifikovano" označava promenjeno stanje ili strukturu molekula iz pronalaska. Molekuli mogu da budu modifikovani na mnogo načina, uključujući hemijski, strukturno, i funkcionalno. U jednom slučaju, molekuli mRNA predmetnog prikaza su modifikovani introdukovanjem neprirodnih nukleozida i/ili nukleotida.

[0878] Koji se javlja prirodno: Kao što se ovde upotrebljava, "koji se javlja prirodno" znači da postoji u prirodi bez veštačke pomoći.

[0879] Otvoreni okvir čitanja: Kao što se ovde upotrebljava, "otvoreni okvir čitanja" ili "ORF" označava sekvencu koja ne sadrži stop kodon u datom okviru čitanja.

[0880] Operativno povezano: Kao što se ovde upotrebljava, fraza "operativno povezano" označava funkcionalnu vezu između dva ili više molekula, konstrukata, transkripata, entiteta, delova ili slično.

22

[0881] Pacijent: Kao što se ovde upotrebljava, "pacijent" označava subjekta koji može tražiti ili mu je potrebno lečenje, zahteva lečenje, prima lečenje, primaće lečenje, ili subjekt koji je pod nadzorom obučenog stručnjaka za određenu bolest ili stanje.

[0882] Opciono supstituisano: Ovde je fraza oblika "opciono supstituisan X" (npr. opciono supstituisani alkil) namenjena da bude ekvivalentna sa "X, pri čemu je X opciono supstituisan" (npr. "alkil, pri čemu je navedeni alkil opciono supstituisan"). Nije namenjeno da znači da je osobina "X" (npr. alkil) sama po sebi opciona. Peptid: Kao što se ovde upotrebljava, "peptid" je dugačak manje od, ili je jednak, 50 aminokiselina, npr. dugačak je oko 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, ili 50 aminokiselina.

[0883] Peptid: Kao što se ovde upotrebljava, "peptid" je dugačak manje od, ili je jednak, 50 aminokiselina, npr. dugačak je oko 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, ili 50 aminokiselina.

[0884] Farmaceutska kompozicija: Izraz "farmaceutski kompozicija" se odnosi na kompoziciju koja menja etiologiju bolesti, poremećaja i/ili stanja.

[0885] Farmaceutski prihvatljiv: Fraza "farmaceutski prihvatljiv" ovde se koristi da označi ona jedinjenja, materijale, kompozicije, i/ili dozne oblike koji su, u okviru zdrave medicinske procene, pogodni za upotrebu u dodiru sa tkivima ljudskih bića i životinja bez prekomerne toksičnosti, iritacije, alergijskog odgovora, ili drugih problema ili komplikacija, srazmerno razumnom korist/rizik odnosu.

[0886] Farmaceutski prihvatljivi ekscipijensi: Fraza "farmaceutski prihvatljiv ekscipijens", kao što se ovde upotrebljava, označava bilo koji sastojak osim ovde opisanih jedinjenja (na primer, vehikulum sposoban da suspenduje ili rastvara aktivno jedinjenje) i koji ima svojstva da bude suštinski netoksičan i neinflamatoran za pacijenata. Ekscipijensi mogu uključivati, na primer: antiadherente, antioksidanse, veziva, obloge, agense za komprimovanje, dezintegrante, boje (kolorante), emolijense, emulgatore, filere (razblaživače), agense za formiranje filma ili obloge, arome, mirise, glidante (pojačivače protoka), lubrikante, konzervanse, štamparske boje, sorbente, agense za suspendovanje ili dispergovanje, zaslađivače, i vode za hidrataciju. Primeri ekscipijenasa uključuju, ali nisu ograničeni na: butilisani hidroksitoluen (BHT), kalcijum karbonat, kalcijum fosfat (dvobazni), kalcijum stearat, kroskarmelozu, umreženi polivinilpirolidon, limunsku kiselinu, krospovidon, cistein, etilcelulozu, želatin, hidroksipropil celulozu, hidroksipropil metilcelulozu, laktozu, magnezijum stearat, maltitol, manitol, metionin, metilcelulozu, metil paraben, mikrokristalnu celulozu, polietilen glikol, polivinilpirolidon, povidon, preželatinizovani skrob, propil paraben, retinil palmitat, šelak, silicijum dioksid, natrijum karboksimetil celulozu, natrijum citrat, natrijum skrob glikolat, sorbitol, skrob (kukuruzni), stearinsku kiselinu, saharozu, talk, titanijum dioksid, vitamin A, vitamin E, vitamin C, i ksilitol.

2

[0887] Farmaceutski prihvatljive soli: Predmetna objava takođe uključuje farmaceutski prihvatljive soli ovde opisanih jedinjenja. Kao što se ovde upotrebljava, "farmaceutski prihvatljive soli" označavaju derivate objavljenih jedinjenja pri čemu je parentalno jedinjenje modifikovano konvertovanjem postojećeg kiselog ili baznog dela u njegov oblik soli (npr. reagovanjem slobodne bazne grupe sa pogodnom organskom kiselinom). Primeri farmaceutski prihvatljivih soli uključuju, ali nisu ograničeni na, soli mineralnih ili organskih kiselina baznih ostataka kao što su amini; alkalne ili organske soli kiselih ostataka kao što su karboksilne kiseline; i slično. Reprezentativne kisele adicione soli uključuju soli acetata, adipata, alginata, askorbata, aspartata, benzensulfonata, benzoata, bisulfata, borata, butirata, kamforata, kamforsulfonata, citrata, ciklopentanpropionata, diglukonata, dodecilsulfata, etansulfonata, fumarata, glukoheptonata, glicerofosfata, hemisulfata, heptonata, heksanoata, hidrobromida, hidrohlorida, hidrojodida, 2-hidroksi-etansulfonata, laktobionata, laktata, laurata, lauril sulfata, malata, maleata, malonata, metansulfonata, 2-naftalensulfonata, nikotinata, nitrata, oleata, oksalata, palmitata, pamolata, pektinata, persulfata, 3-fenilpropionata, fosfata, pikrata, pivalata, propionata, stearata, sukcinata, sulfata, tartarata, tiocijanata, toluensulfonata, undekanoata, valerata, i slično. Reprezentativne soli alkalnih ili zemnoalkalnih metala uključuju natrijum, litijum, kalijum, kalcijum, magnezijum, i slično, kao i netoksični amonijum, kvaternarni amonijum, i aminske katjone, uključujući, ali bez ograničenja, amonijum, tetrametilamonijum, tetraetilamonijum, metilamin, dimetilamin, trimetilamin, trietilamin, etilamin, i slično. Farmaceutski prihvatljive soli predmetnog prikaza uključuju konvencionalne netoksične soli parentalnog jedinjenja formirane, na primer, od netoksičnih neorganskih ili organskih kiselina. Farmaceutski prihvatljive soli predmetnog prikaza mogu da budu sintetisane iz parentalnog jedinjenja koje sadrži bazni ili kiseli deo pomoću konvencionalnih hemijskih postupaka. Generalno, takve soli se mogu pripremiti reagovanjem slobodnih kiselih ili baznih oblika ovih jedinjenja sa stehiometrijskom količinom odgovarajuće baze ili kiseline u vodi ili u organskom rastvaraču, ili u smeši ova dva; generalno, poželjni su nevodeni medijumi kao što su etar, etil acetat, etanol, izopropanol, ili acetonitril. Liste pogodnih soli nalaze se u Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985, p.1418, i Journal of Pharmaceutical Science, 66, 2 (1977).

[0888] Farmakokinetika: Kao što se ovde upotrebljava, "farmakokinetika" označava bilo koje jedno ili više svojstava molekula ili jedinjenja pošto se odnosi na određivanje sudbine supstanci primenjenih živom organizmu. Farmakokinetika je podeljena u nekoliko oblasti uključujući opseg i stopu apsorpcije, distribuciju, metabolizam i ekserciju. Ovo se uobičajeno označava kao ADME gde: (A) Apsorpcija je proces ulaska supstance u krvnu cirkulaciju; (D) Distribucija je disperzija ili širenje supstanci po fluidima i tkivima tela; (M) Metabolizam (ili biotransformacija) je

24

ireverzibilna transformacija parentalnih jedinjenja u ćerke metabolite; i (E) Eksercija (ili eliminacija) označava uklanjanje supstanci iz tela. U retkim slučajevima, neki lekovi se ireverzibilno akumuliraju u tkivu tela.

[0889] Farmaceutski prihvatljiv solvat: Termin "farmaceutski prihvatljiv solvat", kao što se ovde upotrebljava, znači jedinjenje prema pronalasku pri čemu su molekuli pogodnog rastvarača inkorporisani u kristalnu rešetku. Pogodan rastvarač je fiziološki podnošljiv u primenjenoj dozi. Na primer, solvati mogu da budu pripremljeni kristalizacijom, rekristalizacijom, ili taloženjem iz rastvora koji uključuje organske rastvarače, vodu, ili njihovu smešu. Primeri pogodnih rastvarača su etanol, voda (na primer, mono-, di- i tri-hidrati), N-metilpirolidinon (NMP), dimetil sulfoksid (DMSO), N,N'-dimetilformamid (DMF), N,N'-dimetilacetamid (DMAC), 1,3-dimetil-2-imidazolidinon (DMEU), 1,3-dimetil-3,4,5,6-tetrahidro-2-(1H)-pirimidinon (DMPU), acetonitril (ACN), propilen glikol, etil acetat, benzil alkohol, 2-pirolidon, benzil benzoat, i slično. Kada je voda rastvarač, solvat se označava kao "hidrat".

[0890] Fizičko-hemijsko: Kao što se ovde upotrebljava, "fizičko-hemijski" znači za ili koja se odnosi na fizička i/ili hemijska svojstva.

[0891] Preveniranje: Kao što se ovde upotrebljava, termin "preveniranje" označava delimično ili potpuno odlaganje početka infekcije, bolesti, poremećaja i/ili stanja; delimično ili potpuno odlaganje početka jednog ili više simptoma, osobina, ili kliničkih manifestacija određene infekcije, bolesti, poremećaja, i/ili stanja; delimično ili potpuno odlaganje početka jednog ili više simptoma, osobina, ili manifestacija određene infekcije, bolesti, poremećaja, i/ili stanja; delimično ili potpuno odlaganje progresije infekcije, određene bolesti, poremećaja, i/ili stanja; i/ili smanjenje rizika od razvoja patologije povezane sa infekcijom, bolešću, poremećajem, i/ili stanjem.

[0892] Prolek: Predmetna objava takođe uključuje prolekove jedinjenja koja su ovde opisana. Kao što se ovde upotrebljava, "prolekovi" označavaju bilo koju supstancu, molekul ili entitet koji je u obliku predikta za tu supstancu, molekul ili entitet da deluje kao terapeutik nakon hemijske ili fizičke promene. Prolekovi mogu da budu kovalentno vezani ili sekvestrirani na neki način i koji oslobađaju ili se konvertuju u aktivni deo leka pre, nakon ili posle primene subjektu sisaru. Prolekovi se mogu pripremiti modifikovanjem funkcionalnih grupa prisutnih u jedinjenjima na takav način da se modifikacije isecaju, bilo rutinskom manipulacijom ili in vivo, do parentalnih jedinjenja. Prolekovi uključuju jedinjenja u kojima su hidroksilne, amino, sulfhidrilne, ili karboksilne grupe vezane za bilo koju grupu koja se, kada se primeni subjektu sisaru, iseca tako da formira slobodnu hidroksilnu, amino, sulfhidrilnu, ili karboksilnu grupu, respektivno. Priprema i upotreba prolekova se razmatra u T. Higuchi i V. Stella, "Pro-drugs as Novel Delivery Systems,"

2

Vol. 14 of the A.C.S. Symposium Series, i u Bioreversible Carriers in Drug Design, ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987.

[0893] Mesto isecanja proteina: Kao što se ovde upotrebljava, "mesto isecanja proteina" označava mesto gde se može postići kontrolisano isecanje lanca aminokiselina hemijskim, enzimskim ili fotohemijskim sredstvima.

[0894] Signal isecanja proteina: Kao što se ovde upotrebljava, "signal isecanja proteina" označava najmanje jednu aminokiselinu koja obeležava ili markira polipeptid za isecanje.

[0895] Protein od interesa: Kao što se ovde upotrebljava, termini "proteini od interesa" ili "željeni proteini" uključuju one koji su ovde obezbeđeni i njihove fragmente, mutante, varijante, i alternacije.

[0896] Proksimalno: Kao što se ovde upotrebljava, termin "proksimalno" znači da se nalazi bliže centru ili tački ili regionu od interesa.

[0897] Pseudouridin: Kao što se ovde upotrebljava, pseudouridin se odnosi na C-glikozidni izomer nukleozida uridina. "Analog pseudouridina" je bilo koja modifikacija, varijanta, izoforma ili derivat pseudouridina. Na primer, analozi pseudouridina uključuju, ali nisu ograničeni na 1-karboksimetil-pseudouridin, 1-propinil-pseudouridin, 1-taurinometil-pseudouridin, 1-taurinometil-4-tio-pseudouridin, 1-metil-pseudouridin (m<1>ψ), 1-metil-4-tio-pseudouridin (m<1>s<4>ψ), 4-tio-1-metil-pseudouridin, 3-metil-pseudouridin (m<3>ψ), 2-tio-1-metil-pseudouridin, 1-metil-1-deaza-pseudouridin, 2-tio-1-metil-1-deaza-pseudouridin, dihidropseudouridin, 2-tiodihidropseudouridin, 2-metoksiuridin, 2-metoksi-4-tio-undin, 4-metoksi-pseudouridin, 4-metoksi-2-tio-pseudouridin, N1-metil-pseudouridin, 1-metil-3-(3-amino-3-karboksipropil)pseudouridin (acp<3>ψ), i 2'-O-metil-pseudouridin (ψm).

[0898] Prečišćeno: Kao što se ovde upotrebljava, "prečistiti", "prečišćeno", "prečišćavanje" znači učiniti suštinski čistim ili očišćenim od neželjenih komponenti, prljavštine od materijala, primesa ili nesavršenosti.

[0899] Smanjenje efekta: Kao što se ovde upotrebljava, izraz "smanjenje efekta" kada se odnosi na simptome, znači smanjenje, otklanjanje ili ublažavanje simptoma kod subjekta. To ne znači nužno da će simptom biti, zapravo, potpuno otklonjen, smanjen ili ublažen.

[0900] Uzorak: Kao što se ovde upotrebljava, termin "uzorak" ili "biološki uzorak" označava podskup njegovih tkiva, ćelija ili sastavnih delova (npr. telesne tečnosti, uključujući, ali bez ograničenja krv, mukus, limfnu tečnost, sinovijalnu tečnost, cerebrospinalnu tečnost, pljuvačku, amnionsku tečnost, krv amnionske vrpce, urin, vaginalnu tečnost i spermu). Uzorak dodatno može uključivati homogenat, lizat ili ekstrakt pripremljen iz celog organizma ili podskupa njegovih tkiva, ćelija ili sastavnih delova, ili njegove frakcije ili dela, uključujući, ali bez ograničenja, na

2

primer, plazmu, serum, spinalnu tečnost, limfnu tečnost, spoljne delove kože, respiratornog, crevnog i genitourinarnog trakta, suze, pljuvačku, mleko, krvne ćelije, tumore, organe. Uzorak dodatno označava medijum, kao što je hranljivi bujon ili gel, koji može sadržati ćelijske komponente, kao što su proteini ili molekul nukleinske kiseline.

[0901] Uzorak: Kao što se ovde upotrebljava, termin "uzorak" ili "biološki uzorak" označava podskup njegovih tkiva, ćelija ili sastavnih delova (npr. telesne tečnosti, uključujući, ali bez ograničenja krv, mukus, limfnu tečnost, sinovijalnu tečnost, cerebrospinalnu tečnost, pljuvačku, amnionsku tečnost, krv amnionske vrpce, urin, vaginalnu tečnost i spermu). Uzorak dodatno može uključivati homogenat, lizat ili ekstrakt pripremljen iz celog organizma ili podskupa njegovih tkiva, ćelija ili sastavnih delova, ili njegove frakcije ili dela, uključujući, ali bez ograničenja, na primer, plazmu, serum, spinalnu tečnost, limfnu tečnost, spoljne delove kože, respiratornog, crevnog i genitourinarnog trakta, suze, pljuvačku, mleko, krvne ćelije, tumore, organe. Uzorak dodatno označava medijum, kao što je hranljivi bujon ili gel, koji može sadržati ćelijske komponente, kao što su proteini ili molekul nukleinske kiseline.

[0902] Seme sekvenca: Kao što se ovde upotrebljava u odnosu na mikro RNK (miRNA), miRNA "seme sekvenca" je sekvenca sa identičnim nukleotidima na pozicijama 2-8 kao u zreloj miRNA. U jednom slučaju, seme sekvenca miRNA sadrži pozicije 2-7 zrele miRNA.

[0903] Sporedni efekat: Kao što se ovde upotrebljava, izraz "sporedni efekat" odnosi se na sekundarni efekat lečenja.

[0904] Signalna peptidna sekvenca: Kao što se ovde upotrebljava, fraza "signalna peptidna sekvenca" označava sekvencu koja može usmeriti transport ili lokalizaciju proteina.

[0905] Sličnost: Kao što se ovde upotrebljava, termin "sličnost" označava ukupnu srodnost između polimernih molekula, npr. između molekula polinukleotida (npr. DNK molekula i/ili RNK molekula) i/ili između molekula polipeptida. Proračun procenta sličnosti polimernih molekula jednog sa drugim može se izvesti na isti način kao i izračunavanje procenta identičnosti, s tim što proračun procenta sličnosti uzima u obzir konzervativne supstitucije kao što je poznato u struci.

[0906] Podeljena doza: Kao što se ovde upotrebljava, "podeljena doza" je podela pojedinačne jedinične doze ili ukupne dnevne doze na dve ili više doza.

[0907] Stabilno: Kao što se ovde upotrebljava, "stabilno" označava jedinjenje koje je dovoljno robusno da pretrpi izolaciju do korisnog stepena čistoće iz reakcione smeše, i poželjno može da se formuliše u efikasni terapeutski agens.

[0908] Stabilizovano: Kao što se ovde upotrebljava, termin "stabilizovati", "stabilizovano", "stabilizovan region" znači učiniti stabilnim ili postati stabilno.

2

[0909] Subjekt: Kao što se ovde upotrebljava, termin "subjekt" ili "pacijent" označava bilo koji organizam na koji se kompozicija u skladu sa pronalaskom može primeniti, npr. u eksperimentalne, dijagnostičke, profilaktičke, i/ili terapeutske svrhe. Tipični subjekti uključuju životinje (npr. sisare kao što su miševi, pacovi, zečevi, ne-humani primati, i ljudi) i/ili biljke.

[0910] Suštinski: Kao što se ovde upotrebljava, termin "suštinski" označava kvalitativni uslov za iskazivanje ukupnog ili skoro ukupnog obima ili stepena karakteristike ili svojstva od interesa. Osoba sa prosečnim iskustvom u biološkoj struci će podrazumevati da biološki i hemijski fenomeni retko, ako ikad, dođu do završetka i/ili do potpunog završavanja ili postignu ili izbegnu apsolutni rezultat. Termin "suštinski" se prema tome ovde upotrebljava za hvatanje potencijalnog nedostatka potpunog završetka svojstvenog mnogim biološkim i hemijskim fenomenima.

[0911] Suštinski jednako: Kao što se ovde upotrebljava kada se odnosi na vremenske razlike između doza, termin znači plus/minus 2%.

[0912] Suštinski istovremeno: Kao što se ovde upotrebljava kada se odnosi na mnoštvo doza, termin znači unutar 15 sekundi.

[0913] Pati od: Pojedincu koji "pati od" od bolesti, poremećaja, i/ili stanja dijagnostikovan je ili pokazuje jedan ili više simptoma bolesti, poremećaja, i/ili stanja.

[0914] Podložan: Pojedinac koji je "podložan" bolesti, poremećaju, i/ili stanju nema dijagnozu, i/ili možda ne pokazuje simptome bolesti, poremećaja, i/ili stanja, ali ima sklonost ka razvoju bolesti ili njenih simptoma. U nekim slučajevima, pojedinac koji je podložan bolesti, poremećaju, i/ili stanju (na primer, kanceru) može da bude okarakterisan jednim ili više od sledećeg: (1) genetička mutacija povezana sa razvojem bolesti, poremećaja, i/ili stanja; (2) genetički polimorfizam povezan sa razvojem bolesti, poremećaja, i/ili stanja; (3) povećana i/ili smanjena ekspresija i/ili aktivnost proteina i/ili nukleinske kiseline povezane sa bolešću, poremećajem, i/ili stanjem; (4) navike i/ili stilovi života povezani sa razvojem bolesti, poremećaja, i/ili stanja; (5) porodična istorija bolesti, poremećaja, i/ili stanja; i (6) izloženost i/ili infekcija mikroorganizmom povezanim sa razvojem bolesti, poremećaja, i/ili stanja. U nekim slučajevima, pojedinac koji je podložan bolesti, poremećaju, i/ili stanju razviće bolest, poremećaj, i/ili stanje. U nekim slučajevima, pojedinac koji je podložan bolesti, poremećaju, i/ili stanju neće razviti bolest, poremećaj, i/ili stanje.

[0915] Simptom: Kao što se ovde upotrebljava, termin "simptom" je signal bolesti, poremećaja i/ili stanja. Na primer, subjekt koji ih ima može da oseti ili primeti simptome, ali možda neće biti lako primećeni posmatranjem spoljašnjeg izgleda ili ponašanja subjekta. Primeri simptoma uključuju, ali nisu ograničeni na, slabost, probadanja i bolove, groznicu, umor, gubitak težine, krvne ugruške, povećan nivo kalcijuma u krvi, nizak broj belih krvnih zrnaca, kratak dah, vrtoglavicu, glavobolje,

2

hiperpigmentaciju, žuticu, ertem, pruritis, prekomerni rast dlaka, promena u navikama creva, promena u funkciji bešike, dugotrajne rane, bele fleke u ustima, bele mrlje na jeziku, neobično krvarenje ili iscedak, zadebljanje ili kvržica na delovima tela, loše varenje, problemi sa gutanjem, promene na bradavicama ili mladežima, promena nove kože i mučan kašalj ili promuklost.

[0916] Sintetički: Termin "sintetički" znači proizveden, pripremljen, i/ili napravljen čovekovom rukom. Sinteza polinukleotida ili polipeptida ili drugih molekula predmetnog prikaza može da bude hemijska ili enzimska.

[0917] Ciljane ćelije: Kao što se ovde upotrebljava, "ciljane ćelije" označavaju bilo koju jednu ili više ćelija od interesa. Ćelije se mogu naći in vitro, in vivo, in situ ili u tkivu ili organu organizma. Organizam može da bude životinja, poželjno sisar, poželjnije čovek i najpoželjnije pacijent.

[0918] Terminalni region: Kao što se ovde upotrebljava, termin "terminalni region" se odnosi na region na 5' ili 3' kraju regiona vezanih nukleozida koji kodira polipeptid od interesa ili kodirajućeg regiona.

[0919] Terminalno optimizovan: Termin "terminalno optimizovan" kada se odnosi na nukleinske kiseline znači da su terminalni regioni nukleinska kiselina poboljšani u odnosu na nativne terminalne regione.

[0920] Terapeutski agens: Termin "terapeutski agens" označava bilo koji agens koji, kada se primenjuje subjektu, ima terapeutski, dijagnostički, i/ili profilaktički efekat i/ili izaziva željeni biološki i/ili farmakološki efekat.

[0921] Terapeutski efikasna količina: Kao što se ovde upotrebljava, termin "terapeutski efikasna količina" označava količinu agensa koji treba da se isporuči (npr. nukleinska kiselina, lek, terapeutski agens, dijagnostički agens, profilaktički agens itd.) koja je dovoljna, kada se primeni kod subjekta koji pati od, ili je podložan bolesti, poremećaju i/ili stanju, da leči, poboljša simptome, dijagnostikuje, prevenira, i/ili odloži početak bolesti, poremećaja, i/ili stanja.

[0922] Terapeutski efikasan ishod: Kao što se ovde upotrebljava, "terapeutski efikasna količina" označava količinu agensa koji treba da se isporuči (npr., nukleinska kiselina, lek, terapeutski agens, dijagnostički agens, profilaktički agens, itd.) koja je dovoljna, kada se primeni kod subjekta koji pati od, ili je podložan bolesti, poremećaju, i/ili stanju, da leči, poboljša simptome, dijagnostikuje, prevenira, i/ili odloži početak bolesti, poremećaja, i/ili stanja.

[0923] Ukupna dnevna doza: Kao što se ovde upotrebljava, "ukupna dnevna doza" je količina koja se daje ili propisuje u periodu od 24 sata. Može se primeniti kao pojedinačna jedinična doza.

[0924] Transkripcioni faktor: Kao što se ovde upotrebljava, termin "transkripcioni faktor" označava DNK-vezujući protein koji reguliše transkripciju DNK u RNK, na primer, pomoću aktivacije ili suzbijanja transkripcije. Neki transkripcioni faktori utiču sami na regulaciju

2

transkripcije, dok drugi deluju zajedno sa drugim proteinima. Neki transkripcioni faktor može i da aktivira i da suzbija transkripciju pod određenim uslovima. Uopšteno, transkripcioni faktori vezuju specifičnu ciljnu sekvencu ili sekvence veoma slične specifičnoj konsenzus sekvenci u regulatornom regionu ciljnog gena. Transkripcioni faktori mogu regulisati transkripciju ciljnog gena sami ili u kompleksu sa drugim molekulima.

[0925] Lečiti: Kao što se ovde upotrebljava, termin "lečiti" označava delimično ili potpuno ublažavanje, oporavljanje, poboljšanje, olakšanje, odlaganje početka, sprečavanje progresije, redukovanje težine, i/ili redukovanje incidence jednog ili više simptoma ili osobina određene bolesti, poremećaja, i/ili stanja. Na primer, "lečiti" kancer može označavati inhibiciju preživljavanja, rasta, i/ili širenja tumora. Lečenje se može primeniti na subjekta koji ne pokazuje znake bolesti, poremećaja, i/ili stanja i/ili na subjekta koji pokazuje samo rane znake bolesti, poremećaja, i/ili stanja u svrhu smanjenja rizika razvoja patologije povezane sa bolešću, poremećajem, i/ili stanjem.

[0926] Nemodifikovano: Kao što se ovde upotrebljava, "nemodifikovano" označava bilo koju supstancu, jedinjenje ili molekul pre nego što se na bilo koji način promeni. Nemodifikovan može, ali ne uvek, označavati divlji tip ili nativni oblik biomolekula. Molekuli mogu da budu podvrgnuti nizu modifikacija pri čemu svaki modifikovani molekul može poslužiti kao "nemodifikovani" početni molekul za naknadnu modifikaciju.

[0927] U patentnim zahtevima, neodređeni i određeni članovi mogu značiti jedan ili više od jednog, osim ukoliko nije naznačeno suprotno ili na drugi način očigledno iz konteksta. Patentni zahtevi ili opisi koji uključuju "ili" između jednog ili više članova grupe smatraju se zadovoljenim ukoliko je jedan, više od jednog, ili su svi članovi grupe prisutni u, korišćeni u, ili na neki drugi način relevantni za dati proizvod ili postupak osim ukoliko nije naznačeno suprotno ili na drugi način očigledno iz konteksta. Pronalazak uključuje primere izvođenja u kojima je tačno jedan član grupe prisutan u, korišćen u, ili na neki drugi način relevantan za dati proizvod ili postupak. Pronalazak uključuje primere izvođenja u kojima je više od jednog, ili su svi članovi grupe prisutni u, korišćeni u, ili na neki drugi način relevantni za dati proizvod ili postupak.

[0928] Takođe se napominje da je termin "koji sadrži" namenjen da bude otvoren i dozvoljava inkluziju dopunskih elemenata ili koraka.

[0929] Tamo gde su dati opsezi, krajnje tačke su uključene. Pored toga, treba razumeti da, osim ukoliko nije drugačije naznačeno ili drugačije očigledno iz konteksta i razumevanja onih sa prosečnim iskustvom u struci, vrednosti izražene kao opsezi mogu pretpostaviti bilo koju specifičnu vrednost ili podopseg unutar navedenih opsega u različitim primerima izvođenja pronalaska, do desetine jedinice donje granice opsega, osim ukoliko kontekst jasno ne nalaže drugačije.

PRIMERI

Primer 1. Proizvodnja modifikovane mRNA

[0930] Modifikovane mRNA prema prikazu se prave upotrebom standardnih laboratorijskih postupaka i materijala.

[0931] Otvoreni okvir čitanja sa različitim ushodnim ili nishodnim regionima (β-globin, oznake, itd.) poručen je od DNA2.0 (Menlo Park, CA) i tipično sadrži višestruka mesta kloniranja koja prepoznaje XbaI. Posle dobijanja konstrukta, on se rekonstituiše i transformiše u hemijski kompetentnu E. coli. Za ovaj primer, koriste se NEB DH5-alfa kompetentne E. coli. Tipična mapa klona prikazana je na slici 3. Transformacije su izvedene u skladu sa uputstvima NEB upotrebom 100 ng plazmida. Protokol je sledeći:

1. Odmrznuti tubu NEB 5-alfa kompetentnih E. coli ćelija na ledu tokom 10 minuta.

2. Dodati 1-5 µl koji sadrže 1 pg-100 ng plazmidne DNK u ćelijsku smešu. Pažljivo protresti epruvetu 4-5 puta kao bi se izmešale ćelije i DNK. Ne mešati na vorteksu.

3. Staviti smešu na led tokom 30 minuta. Ne mešati.

4. Toplotni udar na 42 °C tokom tačno 30 sekundi. Ne mešati.

5. Staviti na led 5 minuta. Ne mešati.

6. Pipetirati 950 µl SOC na sobnoj temperaturi u smešu.

7. Staviti na 37 °C tokom 60 minuta. Snažno mućkati (250 o/min) ili rotirati.

8. Zagrejati selekcione ploče na 37 °C.

9. Temeljno promešati ćelije protresanjem epruvete i okretanjem.

10. Razmazati 50-100 µl svakog razblaženja na selekcionu ploču i inkubirati preko noći na 37°C. Alternativno, inkubirati na 30°C tokom 24-36 sati ili 25°C tokom 48 sati.

[0932] Jedna kolonija se zatim upotrebljava za inokulaciju 5 ml LB medijuma za rast upotrebom odgovarajućeg antibiotika i zatim se omogući da raste (250 o/min, 37 °C) tokom 5 sati. Ovo se zatim upotrebljava za inokulaciju 200 ml medijuma za kulturu i omogućava se da raste preko noći pod istim uslovima.

[0933] Kako bi se izolovao plazmid (do 850 µg), izvodi se maksi prep procedura upotrebom Invitrogen PureLink<™>HiPure Maxiprep kompleta (Carlsbad, CA), prateći uputstva proizvođača.

1

[0934] Kako bi se generisala cDNA za in vitro transkripciju (IVT), plazmid se prvo linearizuje upotrebom restrikcionog enzima kao što je XbaI. Tipična restrikciona digestija sa XbaI će sadržati sledeće: plazmid 1.0 µg; 10x pufer 1.0 µl; XbaI 1.5 µl; dH2O do 10 µl; inkubirano na 37 °C tokom 1 sata. Ukoliko se izvodi u laboratorijskoj razmeri (< 5pg), reakcija se prečisti upotrebom Invitrogen PureLink<™>PCR Micro kompleta (Carlsbad, CA) prema uputstvima proizvođača. Prečišćavanja većih razmera će možda morati da se urade sa proizvodom koji ima veći kapacitet punjenja, kao što je Invitrogen standardni PureLink PCR komplet (Carlsbad, CA). Nakon prečišćavanja, linearizovani vektor je kvantifikovan upotrebom NanoDrop i analiziran kako bi se potvrdila linearizacija upotrebom elektroforeze na agaroznom gelu.

[0935] Kao neograničavajući primer, G-CSF može da predstavlja polipeptid od interesa. Sekvence upotrebljene u koracima prikazanim u primerima 1-5 prikazane su u tabeli 16. Treba napomenuti da je start kodon (ATG) podvučen u svakoj sekvenci u tabeli 16.

Tabela 16. Sekvence G-CSF

2

SEQ ID NO Opis

Primer 2. PCR za proizvodnju cDNA

[0936] PCR procedure za pripremanje cDNA izvode se korišćenjem 2x KAPA HiFi<™>HotStart ReadyMix, Kapa Biosystems (Woburn, MA). Ovaj sistem uključuje 2x KAPA ReadyMix 12.5 µl; direktni prajmer (10 uM) 0.75 µl; reverzni prajmer (10 uM) 0.75 µl; matričnu cDNA 100 ng; i dH20 dodatu do 25.0 µl. Reakcioni uslovi su na 95° C u trajanju od 5 min i 25 ciklusa od 98° C u trajanju od 20 s, zatim 58° C u trajanju od 15 s, zatim 72° C u trajanju od 45 s, zatim 72° C u trajanju od 5 min, zatim 4° C do završetka.

[0937] Reverzni prajmer ovog prikaza inkorporiše poli-T120za poli-A120u mRNA. Drugi reverzni prajmeri sa dužim ili kraćim poli(T) nizovima mogu da se upotrebe za podešavanje dužine poli(A) repa u mRNA.

[0938] Reakcija se prečisti korišćenjem Invitrogen PureLink<™>PCR Micro kompleta (Carlsbad, CA) prema uputstvima proizvođača (do 5 µg). Reakcije većeg obima zahtevaju prečišćavanje korišćenjem proizvoda sa većim kapacitetom. Posle prečišćavanja, cDNA se kvantifikuje korišćenjem NanoDrop i analizira elektroforezom na agaroznom gelu da se potvrdi da cDNA ima očekivanu veličinu. cDNA se zatim podvrgava analizi sekvence pre nego što se pređe na reakciju transkripcije in vitro.

Primer 3. In vitro transkripcija

[0939] Reakcija transkripcije in vitro daje mRNA sa modifikovanim nukleotidima ili modifikovanu RNK. Ulazna mešavina nukleotid trifosfata (NTP) pravi se u ustanovi podnosilaca prijave korišćenjem prirodnih ili neprirodnih NTP.

[0940] Tipična reakcija transkripcije in vitro uključuje sledeće:

1. Matrična cDNA 1.0 µg

2. 10x transkripcioni pufer (400 mM Tris-HCl pH 8.0,190 mM MgCl2, 50 mM DTT, 10 mM spermidin) 2.0 µl

3. Prilagođeni NTP (25mM svaki) 7.2 µl

4. Inhibitor RNaze 20 U

5. T7 RNK polimeraza 3000 U

6. dH20 do 20.0 µl. i

7. Inkubacija na 37° C tokom 3 sata - 5 sati.

[0941] Sirova smeša za IVT može da se čuva na 4° C preko noći da bi se prečistila sledećeg dana. Zatim se za digestiju originalne matrice koristi 1 U DNaze koja ne sadrži RNazu. Posle 15 minuta inkubacije na 37° C, mRNA se prečisti korišćenjem kompleta Ambion MEGAclear<™>(Austin, TX) prema uputstvima proizvođača. Ovaj komplet može da prečisti do 500 µg RNK. Posle prečišćavanja, RNK se kvantifikuje korišćenjem NanoDrop i analizira elektroforezom na agaroznom gelu da se potvrdi da je RNK ispravne veličine i da se ne dolazi do degradacije RNK.

Primer 4. Enzimsko stavljanje kape na mRNA

[0942] Stavljanje kape na mRNA vrši se kako sledi, pri čemu smeša uključuje: IVT RNK 60 µg-180 µg i dH20 do 72 µl. Smeša se inkubira na 65° C 5 minuta da se denaturiše RNK, zatim se odmah prenosi na led.

[0943] Protokol zatim uključuje mešanje 10x pufera za stavljanje kape (0.5 M Tris-HCl (pH 8.0), 60 mM KCl, 12.5 mM MgCl2) (10.0 µl); 20 mM GTP (5.0 µl); 20 mM S-adenozil metionina (2.5 µl); inhibitora RNaze (100 U); 2'-O-metiltransferaze (400 U); enzima za stavljanje kape vakcinije

4

(guanilil transferaza) (40 U); dH2O (do 28 µl); i inkubaciju na 37° C u trajanju od 30 minuta za 60 µg RNK ili do 2 sata za 180 µg RNK.

[0944] mRNA se zatim prečisti korišćenjem kompleta Ambion MEGAclear<™>(Austin, TX) prema uputstvima proizvođača. Posle prečišćavanja, RNK se kvantifikuje korišćenjem NanoDrop (ThermoFisher, Waltham, MA) i analizira elektroforezom na agaroznom gelu da se potvrdi da je RNK ispravne veličine i da se ne zapaža degradacija RNK. RNK proizvod može i da se sekvencira primenom metode PCR sa reverznom transkripcijom da se dobije cDNA za sekvenciranje.

Primer 5. Reakcija dodavanja poliA repa

[0945] Bez poli-T u cDNK, reakcija dodavanja poli-A repa mora da se izvede pre prečišćavanja finalnog proizvoda. Ovo se obavlja mešanjem IVT RNK sa kapom (100 µl) inhibitora RNaze (20 U); 10x pufera za dodavanje repa (0.5 M Tris-HCl (pH 8.0), 2.5 M NaCl, 100 mM MgCl2)(12.0 µl); 20 mM ATP (6.0 µl); poli-A polimeraze (20 U); dH2O do 123.5 µl i inkubacijom na 37° C u trajanju od 30 min. Ako je poli-A rep već u transkriptu, onda reakcija dodavanja repa može da se preskoči i da se pređe direktno na prečišćavanje korišćenjem kompleta Ambion MEGAclear<™>(do 500 µg). Poli-A polimeraza je poželjno rekombinantni enzim eksprimiran u kvascu.

[0946] Za studije izvedene i opisane u ovom tekstu, poli-A rep je kodiran u IVT matrici tako da bude dug 160 nukleotida. Međutim, treba razumeti da kao rezultat odvijanja ili integriteta reakcije dodavanja poliA repa ne mora uvek da nastane niz od tačno 160 nukleotida. Prema tome, opisani su poliA repovi od približno 160 nukleotida, npr., oko 150-165, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164 ili 165.

Primer 6. Prirodne 5' kape i analozi 5' kape

[0947] Dodavanje 5' kape modifikovanoj RNK može da bude obavljeno istovremeno tokom reakcije in vitro-transkripcije upotrebom sledećih hemijskih analoga RNK kape za generisanje strukture 5'-guanozin kape u skladu sa protokolima proizvođača: 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G; G(5')ppp(5')A; G(5')ppp(5')G; m7G(5')ppp(5')A; m7G(5')ppp(5')G (New England BioLabs, Ipswich, MA). Dodavanje 5' kape modifikovanoj RNK može da bude obavljeno posttranskripciono upotrebom enzima za dodavanje kape vakcinija virusa kako bi se generisala struktura "Cap 0": m7G(5')ppp(5')G (New England BioLabs, Ipswich, MA). Struktura Cap 1 može da bude generisana upotrebom enzima za dodavanje kape vakcinija virusa, kao i 2'-O metiltransferaze kako bi se generisao: m7G(5')ppp(5')G-2'-O-metil. Struktura Cap 2 može da bude generisana iz strukture Cap 1 nakon 2'-O-metilacije 5'-drugog pre krajnjeg nukleotida upotrebom 2'-O metil-transferaze. Struktura Cap 3 može da bude generisana iz strukture Cap 2, nakon 2'-O-metilacije 5'-trećeg pre krajnjeg nukleotida upotrebom 2'-O metil-transferaze. Enzimi su poželjno poreklom iz rekombinantnog izvora.

[0948] Kada se transfektuju u sisarske ćelije, modifikovane mRNA mogu da budu stabilne između 12-18 sati ili više od 18 sati, npr., 24, 36, 48, 60, 72 ili više od 72 sata.

Primer 7. Analiza ekspresije proteina - kapa hemijskog porekla naspram kape enzimskog porekla

[0949] Sintetičke mRNA koje kodiraju humani G-CSF koje sadrže analog kape ARCA ili strukturu Cap1 mogu da budu transfektovane u humane primarne keratinocite u jednakim koncentracijama. Količina G-CSF izlučenog u medijum kulture može da se ispita ELISA testom 6, 12, 24 i 36 sati nakon transfekcije. Sintetičke mRNA koje izlučuju visoke nivoe G-CSF u medijum bi odgovarale sintetičkoj mRNA sa strukturom kape koja ima veću translacionu kompetenciju.

Primer 8. Analiza čistoće - kapa hemijskog porekla naspram kape enzimskog porekla

[0950] Čistoća sirovih proizvoda sinteze sintetičkih mRNA koje kodiraju humani G-CSF koje sadrže analog kape ARCA ili strukturu Cap1 može da bude upoređena upotrebom denaturišućeg gela agaroza-urea za elektroforeza ili HPLC analize. Sintetičke mRNA sa jedinstvenom, konsolidovanom elektroforetskom trakom odgovaraju čistijem proizvodu u poređenju sa sintetičkom mRNA sa više traka ili isprekidanim trakama. Sintetičke mRNA sa jednim pikom HPLC bi takođe mogle da odgovaraju čistijem proizvodu. Reakcija dodavanja kape koja je efikasnija obezbedila bi čistiju populaciju mRNA.

Primer 9. Analiza citokina - kapa hemijskog porekla naspram kape enzimskog porekla

[0951] Sintetičke mRNA koje kodiraju humani G-CSF koje sadrže analog kape ARCA ili strukturu Cap1 mogu da budu transfektovane u humane primarne keratinocite u različitim koncentracijama. Količina proinflamatornih citokina kao što su TNF-alfa i IFN-beta izlučenih u medijum kulture može da se ispita ELISA testom 6, 12, 24 i 36 sati nakon transfekcije. Sintetičke mRNA koje izlučuju više nivoe proinflamatornih citokina u medijum bi odgovarale sintetičkoj mRNA koja sadrži imuno-aktivirajuću strukturu kape.

Primer 10. Efikasnost reakcije dodavanja kape - kapa hemijskog porekla naspram kape enzimskog porekla

[0952] Kod sintetičkih mRNA koje kodiraju humani G-CSF koje sadrže analog kape ARCA ili strukturu Cap1 može da se ispita efikasnost reakcije dodavanja kape pomoću LC-MS nakon tretmana nukleazom mRNA sa kapom. Tretman mRNA nukleazom bi dao mešavinu slobodnih nukleotida i strukturu sa kapom u vidu 5'-5-trifosfatne kape koja može da se detektuje pomoću LC-MS. Količina proizvoda sa kapom na LC-MS spektrima može da se izrazi kao procenat ukupne mRNA iz reakcije i ona bi odgovarala efikasnosti reakcije dodavanja kape. Struktura kape sa većom efikasnošću reakcije dodavanja kape dala bi veću količinu proizvoda sa kapom pri analizi pomoću LC-MS.

Primer 11. Elektroforeza na agaroznom gelu modifikovane RNK ili proizvoda RT PCR

[0953] Pojedinačne modifikovane RNK (200-400 ng u zapremini od 20 µl) ili reverzno transkribovani PCR proizvodi (200-400 ng) se nanose u bunarčić sa nedenaturišućim 1.2% agaroznim E-gelom (Invitrogen, Carlsbad, CA) i elektroforeza se odvija 12-15 minuta prema protokolu proizvođača.

Primer 12. Nanodrop kvantifikacija modifikovane RNK i UV spektralni podaci:

[0954] Modifikovane RNK u TE puferu (1 µl) se upotrebljavaju za očitavanja Nanodrop UV apsorbance za kvantifikaciju prinosa svake modifikovane RNK iz reakcije in vitro transkripcije.

Primer 13. In vitro transkripcija modifikovane RNK koja sadrži različite dužine poli-A repa

[0955] Modifikovane mRNA su napravljene upotrebom standardnih laboratorijskih postupaka i materijala za in vitro transkripciju osim što mešavina nukleotida sadrži modifikovane nukleotide. Modifikovane mRNA ovog primera uključuju 5-metilcitozin i pseudouridin. Otvoreni okvir čitanja (ORF) gena od interesa ograničen je 5' netranslatiranim regionom (UTR) koji sadrži jak Kozak signal za inicijaciju translacije i 3' UTR alfa-globina koji se završava oligo(dT) sekvencom za matrično dodavanje poliA repa za modifikovane RNK koje ne uključuju analoge adenozina. Modifikovane RNK koje sadrže adenozin sintetišu se bez oligo (dT) sekvence kako bi se omogućilo post-transkripciono dodavanje poli-(A) repa pomoću poli (A) polimeraze. Za humani G-CSF generisane su dužine poli-a repa od 0 nukleotida, 80 nukleotida, 120 nukleotida, 160 nukleotida. G-CSF sekvence uključuju sekvencu cDNA (SEQ ID NO: 4257), sekvencu mRNA (SEQ ID NO: 4258) i proteinsku sekvencu (SEQ ID NO: 4259). Detekcija G-CSF može da se izvede pomoću kompleta prajmer-proba za cDNA koji uključuju direktni prajmer TTG GAC CCT CGT ACA GAA GCT AAT ACG (SEQ ID NO: 4260), reverzni prajmer za matrično dodavanje poli(A) repa T(120)CT TCC TAC TCA GGC TTT ATT CAA AGA CCA (SEQ ID NO: 4261) i reverzni prajmer za post-transkripciono dodavanje repa pomoću poli(A) polimeraze CTT CCT ACT CAG GCT TTA TTC AAA GAC CA (SED ID NO: 4262). Detekcija može da se izvede i pomoću direktnog prajmera TGG CCG GTC CCG CGA CCC AA (SEQ ID NO: 4263) i reverznog prajmera GCT TCA CGG CTG CGC AAG AT (SEQ ID NO: 4264) za reverzno-transkriptaznu lančanu reakciju polimeraze (RT-PCR) modifikovanog molekula nukleinske kiseline G-CSF.

[0956] Sintetisani reverzni prajmeri su konstruisani i naručeni od IDT. Reverzni prajmeri uključuju poli-T40, poli-T80, poli-T120, poli-T160 za poli-A40, poli-A80, poli-A120, i poli-A160 redom. Ćelije humanog embrionalnog bubrega (HEK) 293 su uzgajane u Eaglesovom minimalnom esencijalnom medijumu (EMEM) i 10% fetalnom goveđem serumu (FBS) do dostizanja konfluentnosti od 80-90%. Približno 80 000 ćelija je transfektovano sa 100 ng i 500 ng modifikovane RNK kompleksovane sa RNAiMax kompanije Invitrogen (Carlsbad, CA) u ploči sa 24 bunarčića. Kompleks RNK:RNAiMax je formiran prvo inkubiranjem RNAiMax sa EMEM u 5X volumetrijskom razblaženju 10 minuta na sobnoj temperaturi.

[0957] Sadržaj bočice sa RNK je zatim pomešan sa sadržajem bočice sa RNAiMAX i inkubiran 20-30 na sobnoj temperaturi pre nego što je dodat ćelijama u kapima. Rekombinantni humani G-CSF je dodat u količini od 2ng/mL u kontrolne bunarčiće ćelijske kulture. Koncentracija izlučenog humanog G-CSF merena je na 12 sati posle transfekcije.

[0958] Slika 4 prikazuje histogram za enzimski imunosorbentni test (ELISA) za humani G-CSF iz HEK293 ćelija transfektovanih modifikovanom RNK za humani G-CSF koja ima različite dužine poli-A repa: 0 nukleotida, 80 nukleotida, 120 nukleotida, 160 nukleotida. Zapažena je povećana ekspresija proteina sa poli-A repom od 160 nukleotida.

[0959] Iz podataka se može utvrditi da duži poli-A repovi proizvode više proteina i da ova aktivnost zavisi od doze.

Primer 14. Ekspresija modifikovane nukleinske kiseline sa mestom vezivanja microRNA

[0960] Epitelne ćelije humanog embrionskog bubrega (HEK293A) i primarni humani hepatociti (hepatociti) zasejani su pri gustini od 200 000 ćelija po bunarčiću u 500 ul medijuma za kulturu ćelija (InVitro GRO medijum kompanije Celsis, Chicago, IL). G-CSF mRNA koja ima 3'UTR alfa-globina (G-CSF alfa) (sekvenca cDNA je prikazana u SEQ ID NO: 4265; sekvenca mRNA je prikazana u SEQ ID NO: 4266; poliA rep od približno 160 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5' kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i pseudouridinom), G-CSF mRNA koja ima 3'UTR alfa-globina i mesto vezivanja miR-122 (G-CSF miR-122) (sekvenca cDNA je prikazana u SEQ ID NO: 4267; sekvenca mRNA je prikazana u SEQ ID NO: 4268; poliA rep od približno 160 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5' kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i pseudouridinom) ili G-CSF mRNA koja ima 3'UTR alfa-globina sa četiri mesta vezivanja miR-122 sa deletiranim regionom seme sekvence (G-CSF bez seme sekvence) (sekvenca cDNA je prikazana u SEQ ID NO: 4269; sekvenca mRNA je prikazana u SEQ ID NO: 4270; poliA rep od približno 160 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5' kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i pseudouridinom) ispitivane su u koncentraciji od 250 ng po bunarčiću u pločama sa 24 bunarčića. Ekspresija G-CSF je merena ELISA testom i rezultati su prikazani u tabeli 17.

Tabela 17. Mesta vezivanja miR-122

[0961] Budući da HEK293 ćelije ne eksprimiraju miR-122 nije bilo nishodne regulacije proteina G-CSF sekvencom koja sadrži miR-122. Istovremeno, humani hepatociti eksprimiraju visoke nivoe miR-122 i javila se drastična nishodna regulacija proteina G-CSF zapažena kada sekvenca G-CSF sadrži ciljnu sekvencu miR-122. Posledično, mRNA funkcioniše kao auksotrofna mRNA.

Primer 15. Usmerena SAR pseudouridina i N1-metil pseudouridina

[0962] Sa nedavnim fokusom na pirimidinski nukleozid pseudouridin, osmišljena je serija studija odnosa strukture i aktivnosti (SAR) da se istraži mRNA koja sadrži modifikacije pseudouridina ili N1-metil-pseuduridina.

[0963] Studija je dizajnirana da istraži efekat dužine lanca, povećanu lipofilnost, prisustvo prstenastih struktura i promenu hidrofobnih ili hidrofilnih interakcija kada su modifikacije napravljene na poziciji N1, poziciji C6, poziciji 2, poziciji 4 i na fosfatnom osnovnom lancu. Ispitivana je i stabilnost.

[0964] U tom cilju, ispitivane su modifikacije koje uključuju alkilaciju, cikloalkilaciju, alkilcikloalkilaciju, arilaciju, alkil-arilaciju, alkilacione fragmente sa amino grupama, alkilacione fragmente sa grupama karboksilne kiseline, i alkilacione fragmente koji sadrže aminokiselinske fragmente. Stepen alkilacije je generalno C1-C6. Primeri hemijskih modifikacija uključuju one navedene u tabeli 18 i 19.

Tabela 18. SAR pseudouridina i N1-metil pseudouridina

Hemijska modifikacija Jedinjenje br. Javlja se u prirodi

4

Tabela 19. SAR pseudouridina i N1-metil pseudouridina

41

42

4

44

Primer 16. Ugradnja prirodnih i neprirodnih nukleozida

[0965] Prirodni i neprirodni nukleozidi su ugrađeni u mRNA koja kodira polipeptid od interesa. Njihovi primeri dati su u tabelama 20 i 21. Određeni komercijalno dostupni nukleozid trifosfati (NTP) su ispitivani u polinukleotidma prema prikazu. Njihov izbor dat je u tabeli 20. Zatim je ispitana sposobnost rezultujućih mRNA da proizvode proteine, indukuju citokine, i/ili proizvedu terapeutski ishod.

Tabela 20. Prirodni i neprirodni nukleozidi

4

Tabela 21. Neprirodni nukleozid trifosfati

4

Primer 17. Uključivanje modifikacija u nukleobazu i ugljeni hidrat (šećer)

[0966] Prirodni i neprirodni nukleozidi su ugrađeni u mRNA koja kodira polipeptid od interesa. Ispitivana je sposobnost komercijalno dostupnih nukleozida i NTP koji imaju modifikacije oba, i nukleobaze i ugljenog hidrata (šećera) da budu ugrađeni u mRNA i da proizvedu protein, indukuju citokine, i/ili proizvedu terapeutski ishod. Primeri ovih nukleozida dati su u tabelama 22 i 23.

Tabela 22. Modifikacije kombinacija

4

Tabela 23. Prirodne kombinacije

4 Naziv Jedinjenje br. Javlja se u prirodi

[0967] U tabelama "UTP" označava uridin trifosfat, "GTP" označava guanozin trifosfat, "ATP" označava adenozin trifosfat, "CTP" označava citozin trifosfat, "TP" označava trifosfat i "Bz" označava benzil.

Primer 18. Studija promene signalne sekvence

[0968] Nekoliko varijanti mmRNA koja kodira humani faktor stimulacije kolonija granulocita (G-CSF) (sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 4258; poliA rep od približno 160 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5' kapa, Cap1) su sintetisane upotrebom modifikovanih nukleotida pseudouridina i 5-metilcitidina (pseudo-U/5mC). Ove varijante su uključivale konstrukte G-CSF koji kodiraju ili N terminalnu sekretornu signalnu peptidnu sekvencu divljeg tipa (MAGPATQSPMKLMALQLLLWHSALWTVQEA; SEQ ID NO: 4271), sekvencu bez sekretorne signalne peptidne sekvence, ili sekretornu signalnu peptidnu sekvencu preuzetu iz druge mRNA. Ovo je uključivalo sekvence u kojima je signalna peptidna sekvenca GCSF divljeg tipa zamenjena signalnom peptidnom sekvencom bilo: humanog α-1-antitripsina (AAT) (MMPSSVSWGILLLAGLCCLVPVSLA; SEQ ID NO: 4272), humanog faktora IX (FIX) (MQRVNMIMAESPSLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKR; SEQ ID NO: 4273), humanog prolaktina (Prolac) (MKGSLLLLLVSNLLLCQSVAP; SEQ ID NO: 4274), ili humanog albumina (Alb) (MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRR; SEQ ID NO: 4275).

[0969] 250 ng modifikovane mRNA koja kodira svaku varijantu G-CSF transfektovano je u ćelijske linije HEK293A (293A u tabeli), mioblaste miša (MM u tabeli) (C2C12, CRL-1772, ATCC) i mioblaste pacova (RM u tabeli) (linija L6, CRL-1458, ATCC) u ploče sa 24 bunarčića upotrebom 1 ul lipofektamina 2000 (Life Technologies), gde svaki bunarčić sadrži 300000 ćelija. Supernatanti su sakupljeni posle 24 sata i sekretovani protein G-CSF je analiziran ELISA testom

4

upotrebom kompleta za ELISA test za humani G-CSF (Life Technologies). Podaci prikazani u tabeli 24 otkrili su da ćelije transfektovane sa G-CSF mmRNA koja kodira signalni peptid albumina izlučuju najmanje 12 puta više proteina G-CSF nego njihov ekvivalent divljeg tipa.

Tabela 24. Promena signalnog peptida

Primer 19. 3' Netranslatirani regioni

[0970] 3' UTR može da bude obezbeđen u oivičavajućem regionu. Više 3' UTR može da bude uključeno u oivičavajući region i oni mogu da imaju iste ili različite sekvence. Bilo koji deo oivičavajućih regiona, uključujući nijedan, može da ima optimizovane kodone i bilo koji može nezavisno da sadrži jednu ili više različitih strukturnih ili hemijskih modifikacija, pre i/ili posle optimizacije kodona.

[0971] U tabeli 7 prikazana je lista 3'-netranslatiranih regiona prema prikazu. Varijante 3' UTR mogu da se koriste kada se jedan ili više nukleotida dodaju ili uklanjaju sa krajeva, uključujući A, T, C ili G.

Primer 20. Promena prenosa polinukleotida: NLS i NES

[0972] Dva signala za transport iz jedra (NES) koja mogu da budu ugrađena u polinukleotide ovog prikaza uključuju one prikazane kod Muller, et al (Traffic, 2009, 10: 514-527) i povezani su sa signalizacijom preko gena COMMD1. To su NES1, PVAIIELEL (SEQ ID NO 4276) i NES2, VNQILKTLSE (SEQ ID NO 4277).

[0973] Mogu se koristiti i signali za lokalizaciju u jedru. Jedna takva sekvenca je PKKKRKV (SEQ ID NO: 4278).

[0974] Ćelijskim linijama ili miševima se daje jedan ili više polinukleotida koji imaju u sebi kodiran NLS ili NES. Nakon primene, polinukleotid se transportuje na drugu lokaciju, na primer, u jedro pomoću NLS. Polipeptid koji ima NLS bi bio transportovan u jedro gde bi isporučio ili signal preživljavanja ili smrti jedarnom mikrookruženju. Polipeptidi koji mogu da budu lokalizovani u jedru uključuju one sa izmenjenim svojstvima vezivanja za DNK, koji će funkcionisati tako da promene profil ekspresije ćelije na terapeutski koristan način za ćeliju, tkivo ili organizam.

[0975] U jednom eksperimentu, polinukleotid kodira COMMD1 mut1/mut2 NLS (npr., oba NES signala su poremećena i dodat je NLS) prema postupcima Muller et al, (Traffic 2009; 10: 514-527) i van de Sluis et al, (J Clin Invest. 2010; 120 (6): 2119-2130). Signalna sekvenca može da kodira polipeptid ili šifrovanu sekvencu koja ne može da se translatira. Kodirana signalna sekvenca bi interagovala sa HIF1-alfa da bi promenila transkriptom ćelija kancera.

[0976] Eksperiment se ponavlja u normalnim i hipoksičnim uslovima.

[0977] Kada se jednom identifikuje HIF1-alfa-zavisni polinukleotid, testira se klonsko preživljavanje ćelijskih linija kancera ili se meri marker apoptoze i upoređuje sa kontrolnim ili lažno tretiranim ćelijama.

Primer 21. Mesta vezivanja miRNA (BS) korisna kao senzorske sekvence u polinukleotidima

[0978] Mesta vezivanja miRNA se koriste u 3'UTR terapeutika na bazi mRNA za usmeravanje citotoksičnih ili citoprotektivnih mRNA terapeutika na specifične ćelije (normalne i/ili kancerozne).

[0979] Snažan apoptotski signal (tj. AIFsh - kratka izoforma faktora koji indukuje apoptozu) je kodiran kao polipeptid ili "signal" i kodiran je zajedno sa nizom 3'UTR mesta vezivanja miR, kao što je ono za mir-122a, što bi učinilo polinukleotid relativno mnogo stabilnijim u kancerskim ćelijama nego u normalnim ćelijama.

[0980] Eksperimenti koji upoređuju kancerske sa normalnim ćelijskim linijama jetre u kojima kancerske ćelijske linije imaju specifičan otisak miR izvode se in vitro. Koriste se SNU449 ili HEP3B (HCC ćelijske linije humanog porekla) jer se pokazalo da obe imaju "nedetektibilni miR-122a", dok bi normalni hepatociti trebalo da imaju veoma visoke nivoe miR-122a. Prvo se bira kancerska ćelija koja je osetljiva na polinukleotid AIFsh (tj. on dovodi do apoptoze).

[0981] Tri mesta vezivanja miR-122a su kodirana u 3'UTR sekvence mRNA za AIFsh i grane istraživanja uključuju 2 ćelijske linije (normalni hepatocit, SNU449 ili HEP3B) x 5 tretmana (samo vehikulum, polinukleotid koji ne može da se translatira, polinukleotid AIFsh (bez miR BS u 3'UTR), 3'UTR[miR122a BS x3]-polinukleotid koji ne može da se translatira, 3'UTR[miR122a BS x3]-polinukleotid AIFsh).

1

[0982] Očekivani rezultat bi bila značajna apoptoza u prisustvu polinukleotida AIFsh i u normalnim i u kancerskim ćelijskim linijama (HEP3B ili SNU449) u odsustvu bilo kog 3'UTR-miR122a BS. Međutim, značajna razlika u relativnoj apoptozi normalnih naspram kancerskih ćelijskih linija primećena je u prisustvu 3'UTR [miR122a BS x3]-polinukleotida AIFsh.

[0983] Reverzibilnost efekta je prikazana istovremenom primenom miR122a na kancersku ćelijsku liniju (npr. kroz izvesnu transdukciju aktivnosti miR122a nazad u kancersku ćelijsku liniju).

[0984] In vivo studije na životinjama se zatim izvode korišćenjem bilo kog od modela koji su ovde opisani ili komercijalno dostupnog ortotopskog modela HCC.

Primer 22. Ćelijske linije za ispitivanje polinukleotida

[0985] Polinukleotidi predmetnog prikaza i formulacije koje sadrže polinukleotide predmetnog prikaza ili su opisane u međunarodnoj prijavi br. PCT/US2012/69610 mogu da budu ispitane u brojnim kancerskim ili normalnim ćelijskim linijama. Ćelijske linije koje su korisne u ovom prikazu uključuju linije iz ATCC (Manassas, VA) i navedene su u tabeli 25.

Tabela 25. Ćelijske linije

2

4

ATCC broj Opis hibridoma ili ćelijske linije Naziv

ATCC bro O is hibridoma ili ćeliske linie Naziv

ATCC bro O is hibridoma ili ćeliske linie Naziv

ATCC bro O is hibridoma ili ćeliske linie Naziv

1

ATCC bro O is hibridoma ili ćeliske linie Naziv

2

ATCC bro O is hibridoma ili ćeliske linie Naziv

ATCC bro O is hibridoma ili ćeliske linie Naziv

4

ATCC bro O is hibridoma ili ćeliske linie Naziv

ATCC bro O is hibridoma ili ćeliske linie Naziv

ATCC bro O is hibridoma ili ćeliske linie Naziv

ATCC bro O is hibridoma ili ćeliske linie Naziv

ATCC bro O is hibridoma ili ćeliske linie Naziv

ATCC bro O is hibridoma ili ćeliske linie Naziv

1

Primer 23. RNK-vezujući proteini

[0986] RNK-vezujući proteini mogu da budu obezbeđeni kao proteini i/ili kao nukleinske kiseline koje kodiraju takve proteine. RNK-vezujući proteini imaju mnoštvo uloga u regulisanju stabilnosti RNK i translaciji proteina. U nekim slučajevima, RNK-vezujući proteini su obezbeđeni u obliku proteina i/ili nukleinske kiseline sa elementima predmetnog prikaza. Takvi RNK-vezujući proteini uključuju, ali nisu ograničeni na one navedene (zajedno sa ENSG brojem, koji identifikuje odgovarajući gen, kao i jednim ili više ENST brojeva, koji identifikuju transkripcione varijante svakog) u tabeli 26.

Tabela 26. RNK-vezujući proteini

2

4

P

O

1

2

4

1

2

[0987] HuR je stabilizujući AREBP. Da bi se povećala stabilnost mRNA od interesa, mRNA koja kodira HuR može da se ko-transfektuje ili ko-injektira zajedno sa mRNA od interesa u ćelije ili u tkivo. Ovi proteini takođe mogu da se vežu za mRNA od interesa in vitro i da se zatim zajedno primene na ćelije. Protein koji vezuje poli A rep, PABP stupa u interakciju sa eukariotskim faktorom inicijacije translacije eIF4G da bi stimulisao inicijaciju translacije. Zajednička primena mRNA koje kodiraju ove RBP zajedno sa mRNA koja predstavlja lek i/ili vezivanje ovih proteina za mRNA koja predstavlja lek in vitro i primena mRNA vezane za protein na ćelije može da poveća translacionu efikasnost mRNA. Isti koncept se može proširiti na ko-administriranje mRNA zajedno sa mRNA koje kodiraju različite faktore translacije i faktore koji olakšavaju translaciju, kao i na same proteine da utiču na stabilnost RNK i/ili efikasnost translacije.

Primer 24. Ekspresija modifikovane nukleinske kiseline sa mestom vezivanja microRNA

[0988] Epitelne ćelije humanog embrionskog bubrega (HEK293A), antigen-prezentujuće ćelije ili ćelijske linije sa visoko eksprimiranim mir-142/146, kao što su dendritske ćelije poreklom od monocita (MDDC) ili PBMC, zasejane su pri gustini od 200000 ćelija po bunarčiću u 500 ul medijuma za kulturu ćelija (InVitro GRO medijum kompanije Celsis, Chicago, IL). G-CSF mRNA (sekvenca mRNA je prikazana u SEQ ID NO: 4258; poliA rep od najmanje 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5' kapa, Cap1) G-CSF mRNA koja ima mesto vezivanja miR-142-5p (G-CSF miR-142-5p) (sekvenca cDNA je prikazana u SEQ ID NO: 4985; sekvenca mRNA je prikazana u SEQ ID NO: 4986, poliA rep od najmanje 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1), G-CSF mRNA koja ima seme sekvencu mesta vezivanja miR-142-5p (G-CSF miR-142-5p-seme sekvenca) (sekvenca cDNA je prikazana u SEQ ID NO: 4987; sekvenca mRNA je prikazana u SEQ ID NO: 4988; poliA rep od najmanje 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1) G-CSF mRNA koja ima mesto vezivanja miR-142-5p bez seme sekvence (G-CSF miR-142-5pbez seme sekvence) (sekvenca cDNA je prikazana u SEQ ID NO: 4989, sekvenca mRNA je prikazana u SEQ ID NO: 4990; poliA rep od najmanje 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1) G-CSF mRNA koja ima mesto vezivanja miR-142-3p (G-CSF miR-142-3p) (sekvenca cDNA je prikazana u SEQ ID NO: 4991; sekvenca mRNA je prikazana u SEQ ID NO: 4992; poliA rep od najmanje 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1) G-CSF mRNA koja ima seme sekvencu mesta vezivanja miR-142-3p (G-CSF miR-142-3p-seme sekvenca) (sekvenca cDNA je prikazana u SEQ ID NO: 4993; sekvenca mRNA je prikazana u SEQ ID NO: 4994; poliA rep od najmanje 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1) G-CSF mRNA koja ima mesto vezivanja miR-142-3p bez seme sekvence (G-CSF miR-142-3pbez seme sekvence) (sekvenca DNK je prikazana u SEQ ID NO: 4995; sekvenca mRNA je prikazana u SEQ ID NO: 4996; poliA rep od najmanje 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1) G-CSF mRNA koja ima mesto vezivanja miR-146a (G-CSF miR-146a) (sekvenca cDNA je prikazana u SEQ ID NO: 4997; sekvenca mRNA je prikazana u SEQ ID NO: 4998; poliA

4

rep od najmanje 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1) G-CSF mRNA koja ima seme sekvencu mesta vezivanja miR-146a (G-CSF miR-146a-seme sekvenca) (sekvenca cDNA je prikazana u SEQ ID NO:4999 sekvenca mRNA je prikazana u SEQ ID NO: 5000; poliA rep od najmanje 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5'Cap,Cap1) ili G-CSF mRNA koja ima mesto vezivanja miR-146a bez seme sekvence (G-CSF miR-146a-bez seme sekvence) (sekvenca cDNA je prikazana u SEQ ID NO: 5001; sekvenca mRNA je prikazana u SEQ ID NO: 5002; poliA rep od najmanje nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1) su ispitane pri koncentraciji od 250 ng po bunarčiću u pločama sa 24 bunarčića. Procenjene su sekvence mRNA sa različitim modifikacijama koje su ovde opisane i/ili poznate u stanju tehnike uključujući, potpuno modifikovane 5-metilcitidinom i pseudouridinom, potpuno modifikovane 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom, potpuno modifikovane pseudouridinom, potpuno modifikovane 1-metilpseudouridinom i one kod kojih je 25% uridinskih ostataka modifikovano 2-tiouridinom i 25% citozinskih ostataka modifikovano 5-metilcitidinom. Ekspresija G-CSF u svakom uzorku merena je ELISA testom.

[0989] U tabeli 27 prikazane su sekvence DNK i mRNA G-CSF sa gore opisanim mestima vezivanja miR. U tabeli je podvučen start kodon svake sekvence.

Tabela 27. Konstrukti G-CSF sa mestima vezivanja miR

SEQ Opis SEQ

SEQ Opis SEQ

[0990] Ako je "seme" sekvenca vezujućeg mesta dovoljna da dovede do vezivanja mircoRNA, ekspresija G-CSF bi trebalo da bude nishodno regulisana u ćelijama koje su transfektovane sa miR-142-3p, miR-142-3p-seme sekvenca, miR-142-5p, miR-142-5p-seme sekvenca, miR-146a ili miR-146a-seme sekvenca. Nasuprot tome, miR-142-3p-bez seme sekvence, miR-142-5p-bez seme sekvence, miR-146a-bez seme sekvence ne bi trebalo da menjaju ekspresiju G-CSF, u poređenju sa ćelijama koje su transfektovane sa G-CSF mRNA bez mesta vezivanja microRNA.

Primer 25. Mesta vezivanja mikroRNA specifična za APC za suzbijanje imunske stimulacije posredovane modifikovanom nukleinskom kiselinom

[0991] Mesta vezivanja microRNA se koriste u 3'UTR mRNA terapeutika za selektivnu degradaciju mRNA terapeutika u imunskim ćelijama da bi se suzbile neželjene imunogene reakcije izazvane isporukom mRNA terapeutika.

[0992] Polinukleotid koji sadrži seriju mesta vezivanja miR u 3'UTR koja čine nukleinske kiseline ili mRNA ovog prikaza nestabilnijima u antigen-prezentujućim ćelijama (APC), kao što su, ali bez ograničenja, mir-142-5p, mir-142-3p, mir-146a-5p i mir-146a-3p, kodira onkološki značajan polipeptid prema predmetnom prikazu. Dodavanje mesta vezivanja miR u 3'UTR, što polinukleotid senzora signala čini nestabilnim, umanjilo bi imunološku stimulaciju posredovanu modifikovanom mRNA.

[0993] Eksperimenti koji upoređuju ekspresiju citokina (npr. TNF-alfa) indukovanu polipeptidom sa APC-specifičnim microRNA otiskom u poređenju sa odsustvom takvog otiska izvode se in vitro postupcima koji su ovde opisani i/ili poznati u tehnici.

Primer 26. In vitro ekspresija mRNA sa mestima vezivanja miR

[0994] Epitelne ćelije humanog embrionalnog bubrega (HEK293A), antigen-prezentujuće ćelije ili ćelijske linije sa visoko eksprimiranim mir-142/146, kao što su dendritske ćelije poreklom od monocita (MDDC) ili PBMC, zasejane su pri gustini od 200000 ćelija po bunarčiću u 500 ul medijuma za ćelijsku kulturu (InVitro GRO medijum kompanije Celsis, Chicago, IL). Kultivisane ćelije su transfektovane sa G-CSF mRNA sa, ili bez microRNA otiska, kao što je opisano u primeru 24. Ćelije su transfektovane pet uzastopnih dana. Kompleksi transfekcije su uklanjani četiri sata nakon svakog ciklusa transfekcije.

[0995] U supernatantu kulture ispitivan je sadržaj izlučenog G-CSF (R&D Systems, kataloški br. DCS50), faktora nekroze tumora-alfa (TNF-alfa) i interferona alfa (IFN-alfa) pomoću ELISA testa svakog dana nakon transfekcije prema protokolima proizvođača. Ispitivana je vijabilnost ćelija korišćenjem CELL TITER GLO<®>(Promega, kataloški br. G7570) 6 sati i 18 sati nakon prvog ciklusa transfekcije i svakog drugog dana nakon toga. U isto vreme, iz sakupljenih ćelija je izolovana ukupna RNK i tretirana pomoću DNASE<®>korišćenjem mikro kompleta RNAEASY (kataloški br. 74004) u skladu sa protokolom proizvođača. 100 ng ukupne RNK se koristi za sintezu cDNA korišćenjem kompleta za reverznu transkripciju cDNA visokog kapaciteta (Applied Biosystems, kat. br. 4368814) u skladu sa protokolom proizvođača. Zatim se na cDNA ispituje ekspresija gena urođenog imunskog odgovora kvantitativnom PCR metodom u realnom vremenu upotrebom SybrGreen u instrumentu Biorad CFX 384 prema protokolu proizvođača.

Primer 27. In vivo detekcija studije urođenog imunskog odgovora

[0996] Da bi se ispitala ekspresija proteina sa nukleinskih kiselina ili mRNA i in vivo imunski odgovor, ženkama BALB/C miševa (n=5) je intramuskularno injektirana G-CSF mRNA sa ili bez microRNA otiska, kao što je opisano u primeru 24. Krv je prikupljena 8 sati nakon doziranja. Nivoi proteina G-CSF, TNF-alfa i IFN-alfa se određuju ELISA testom.

[0997] Razlika u proizvodnji citokina se vidi na osnovu merenja nivoa TNF-alfa i IFN-alfa u serumu miša. Injekcija modifikovane G-CSF mRNA koja ima mesto vezivanja ili seme sekvencu mesta vezivanja miR-142 i miR-146a pokazuje niži nivo odgovora citokina in vivo.

Primer 28. Ekspresija miR-122 u primarnim hepatocitima

[0998] Izmeren je nivo miR-122 specifične za hepatocite u primarnim hepatocitima pacova i čoveka. Hela ćelije i primarni hepatociti pacova i čoveka su kultivisani i RNK su ekstrahovane iz ćelijskih lizata. Nivo miR-122 u primarnim hepatocitima pacova i čoveka upoređen je sa onim u ćelijama Hela. Nivo miR-122 je oko 6 puta povećan u primarnim humanim hepatocitima i oko 12 puta povećan u primarnim hepatocitima pacova, redom, u poređenju sa onim u Hela ćelijama.

1

Primer 29. Ekspresija modifikovane nukleinske kiseline sa mestom vezivanja mir-122 u hepatocitima

[0999] Primarni hepatociti pacova i čoveka i Hela ćelije su zasejane pri gustini od 200000 ćelija po bunarčiću u 500 ul medijuma za ćelijsku kulturu (InVitro GRO medijum kompanije Celsis, Chicago, IL). G-CSF mRNA koja ima mesta vezivanja miR-122 u 3'UTR (G-CSF miR-122-1X) (sekvenca mRNA je prikazana u SEQ ID NO: 4268; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5 ' kapa, Cap1) potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i pseudouridinom (5mC/pU), ili potpuno modifikovana pseudouridinom (pU) ili G-CSF mRNA sa četiri mesta vezivanja miR-122 sa deletiranim regionom seme sekvence (G-CSF bez seme sekvence) (sekvenca mRNA je prikazana u SEQ ID NO: 4270; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5' kapa, Cap1) potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i pseudouridinom (5mC/pU) ili potpuno modifikovana pseudouridinom (pU) je ispitana u koncentraciji od 250 ng po bunarčiću na pločama sa 24 bunarčića. Ekspresija G-CSF je merena ELISA testom 24 sata nakon transfekcije, a rezultati su prikazani u tabeli 28.

Tabela 28. Ekspresija G-CSF mir122

Primer 30. Ekspresija modifikovanih nukleinskih kiselina sa mestima vezivanja mir-122 u hepatocitima

[1000] MicroRNA kontroliše ekspresiju gena putem translacione supresije i/ili degradacije ciljne informacione RNK. Mesto vezivanja mir-122 koje sadrži G-CSF mRNA je translaciono regulisano u hepatocitima.

2

[1001] Primarni hepatociti pacova i čoveka i Hela ćelije su zasejane pri gustini od 200000 ćelija po bunarčiću u 500 ul medijuma za ćelijsku kulturu (InVitro GRO medijum kompanije Celsis, Chicago, IL). G-CSF mRNA (G-CSF alfa) (sekvenca mRNA je prikazana u SEQ ID NO: 4266; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5' kapa, Cap1) potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i pseudouridinom (5mC/pU), G-CSF mRNA koja ima mesto vezivanja miR-122 u 3'UTR (G-CSF miR-122-1X) (sekvenca mRNA je prikazana u SEQ ID NO: 4268; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenca; 5’ kapa, Cap1) potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i pseudouridinom (5mc/pU) ili G-CSF mRNA sa četiri mesta vezivanja miR-122 sa deletiranim regionom seme sekvence (G-CSF bez seme sekvence) (prikazana je sekvenca mRNA u SEQ ID NO: 4270; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1) potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i pseudouridinom (5mC/pU) ispitane su u koncentraciji od 250 ng po bunarčiću u ploči sa 24 bunarčića. Ekspresija G-CSF je merena ELISA testom 24 sata nakon transfekcije. Nivoi G-CSF leka (mRNA) i nivoi proteina prikazani su u tabeli 29.

Tabela 29. Nivoi leka G-CSF i proteina

Primer 31. Modifikovane sekvence mRNA sa ili bez sekvenci Kozak i/ili IRES

[1002] Modifikovana mRNA koja kodira G-CSF sa ili bez sekvence Kozak i/ili IRES, i njihove odgovarajuće sekvence cDNA, prikazane su u tabeli 30. U tabeli 30, start kodon svake sekvence je podvučen.

Tabela 30. Sekvence G-CSF

4

1

[1003] Ove modifikovane sekvence mRNA mogu da uključuju najmanje jednu ovde opisanu hemijsku modifikaciju. Modifikovana sekvenca G-CSF mRNA može da bude formulisana, korišćenjem postupaka koji su ovde opisani i/ili poznati u tehnici, pre transfekcije i/ili primene.

[1004] Modifikovana sekvenca mRNA koja kodira G-CSF može da bude transfektovana in vitro u različite tipove ćelija kao što su HEK293, HeLa, PBMC i BJ fibroblast i one opisane u tabeli 25 korišćenjem postupaka koji su ovde opisani i/ili poznati u tehnici. Ćelije se zatim analiziraju korišćenjem postupaka koji su ovde opisani i/ili poznati u tehnici da bi se odredila koncentracija G-CSF i/ili vijabilnost ćelija.

[1005] Modifikovana sekvenca mRNA koja kodira G-CSF takođe može da se primeni kod sisara uključujući miševe, pacove, primate koji nisu ljudi i ljude. Serum i okolno tkivo mogu da se sakupljaju u unapred određenim intervalima i analiziraju korišćenjem postupaka koji su ovde opisani i/ili poznati u tehnici za određivanje koncentracije G-CSF i drugih farmakokinetičkih svojstava koja su ovde pomenuta.

Primer 32. Modifikovane miR-122 sekvence mRNA sekvenci u UTR alfa-globina

[1006] Modifikovana mRNA koja kodira G-CSF ili faktor IX sa sekvencom mir-122 u 3'UTR humanog ili mišjeg alfa-globina, i njihove odgovarajuće cDNK sekvence, prikazane su ispod u tabeli 31. U tabeli 31, početni kodon svakog niza je podvučen.

Tabela 31. Sekvence G-CSF i FIX

11

12

1

14

1

1

1

1

1

2 O is Sekvenca SE

21

22

2

24

[1007] Ove modifikovane sekvence mRNA mogu da uključuju najmanje jednu ovde opisanu hemijsku modifikaciju. Modifikovana mRNA sekvenca G-CSF i/ili faktora IX može da bude formulisana, upotrebom postupaka koji su ovde opisani i/ili poznati u tehnici, pre transfekcije i/ili primene.

[1008] Modifikovana sekvenca mRNA koja kodira G-CSF ili faktor IX može da se transfektuje in vitro u različite tipove ćelija kao što su HEK293, HeLa, PBMC i BJ fibroblast i one opisane u tabeli 25 upotrebom postupaka koji su ovde opisani i/ili poznati u tehnici. Ćelije se zatim analiziraju upotrebom postupaka koji su ovde opisani i/ili poznati u tehnici da bi se odredila koncentracija G-CSF ili faktora IX i/ili vijabilnost ćelija.

[1009] Modifikovana sekvenca mRNA koja kodira G-CSF ili faktor IX takođe može da se primeni kod sisara uključujući miševe, pacove, primate koji nisu ljudi i ljude. Serum, okolno tkivo i organi mogu da se sakupljaju u unapred određenim intervalima i analiziraju upotrebom postupaka koji su

2

ovde opisani i/ili poznati u tehnici za određivanje koncentracije G-CSF ili faktora IX i drugih ovde pomenutih farmakokinetičkih svojstava.

Primer 33. Mikrofiziološki sistemi

[1010] Polinukleotidi, primarni konstrukti i/ili mmRNA koji su ovde opisani formulišu se korišćenjem jednog od ovde opisanih postupaka, na primer, u puferu, lipidnim nanočesticama i PLGA. Ove formulacije se zatim daju ili stupaju u kontakt sa mikrofiziološkim sistemima napravljenim od čipova organa kako je opisano u međunarodnim objavama br. WO2013086502, WO2013086486 i WO2013086505.

Primer 34. Enhenserski elementi translacije (TEE) u netranslatiranim regionima

[1011] 5' i/ili 3' netranslatirani regioni (UTR) u ovde opisanim polinukleotidima, primarnim konstruktima i/ili mmRNA mogu da uključuju najmanje jedan enhenserski element translacije (TEE). Takvi TEE koji mogu da budu uključeni u 5'UTR i/ili 3'UTR obuhvataju, ali nisu ograničeni na, one navedene u tabeli 32, uključujući njihov deo i/ili fragmente. Sekvenca TEE može da uključuje najmanje 5%, najmanje 10%, najmanje 15%, najmanje 20%, najmanje 25%, najmanje 30%, najmanje 35%, najmanje 40%, najmanje 45%, najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 99% ili više od 99% sekvence TEE opisane u tabeli 28 i/ili sekvenca TEE može da uključuje fragment od 5-30 nukleotida, fragment od 5-25 nukleotida, fragment od 5-20 nukleotida, fragment od 5-15 nukleotida, fragment od 5-10 nukleotida iz sekvence TEE opisane u tabeli 32.

Tabela 32. Sekvence TEE

2

2

2

2 Oznaka Sekvenca SEQ ID NO

Oznaka Sekvenca SEQ ID NO

1

Oznaka Sekvenca SEQ ID NO

2

Oznaka Sekvenca SEQ ID NO

Oznaka Sekvenca SEQ ID NO

4

Oznaka Sekvenca SEQ ID NO

Oznaka Sekvenca SEQ ID NO

Oznaka Sekvenca SEQ ID NO

Oznaka Sekvenca SEQ ID NO

Oznaka Sekvenca SEQ ID NO

Oznaka Sekvenca SEQ ID NO

4

Oznaka Sekvenca SEQ ID NO

41

Oznaka Sekvenca SEQ ID NO

42

Oznaka Sekvenca SEQ ID NO

4

Oznaka Sekvenca SEQ ID NO

44

Oznaka Sekvenca SEQ ID NO

4

Oznaka Sekvenca SEQ ID NO

4

Oznaka Sekvenca SEQ ID NO

4

Oznaka Sekvenca SEQ ID NO

4

Oznaka Sekvenca SEQ ID NO

4

Oznaka Sekvenca SEQ ID NO

Oznaka Sekvenca SEQ ID NO

1

Oznaka Sekvenca SEQ ID NO

2

Oznaka Sekvenca SEQ ID NO

Oznaka Sekvenca SEQ ID NO

4

Oznaka Sekvenca SEQ ID NO

Oznaka Sekvenca SEQ ID NO

Oznaka Sekvenca SEQ ID NO

Oznaka Sekvenca SEQ ID NO

1 Oznaka Sekvenca SEQ ID NO

2

4 Oznaka Sekvenca SEQ ID NO

Oznaka Sekvenca SEQ ID NO

Primer 35. In vitro ekspresija modifikovanih nukleinskih kiselina sa miR-122

[1012] MicroRNA kontroliše ekspresiju gena putem supresije translacije i/ili degradacije ciljne informacione RNK. Ekspresija G-CSF mRNA i mRNA faktora IX sa 3' netranslatiranim regionima (UTR) alfa-globina čoveka ili miša bila je nishodno regulisana u primarnim humanim hepatocitima upotrebom miR-122 sekvence u 3'UTR.

[1013] Primarni humani hepatociti su zasejani pri gustini od 350000 ćelija po bunarčiću u 500 ul medijuma za ćelijsku kulturu (InVitro GRO medijum kompanije Celsis, Chicago, IL).

[1014] G-CSF mRNA koja ima 3’UTR humanog alfa-globina (G-CSF Hs3'UTR; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5716; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1) ili 3’UTR alfa-globina miša (G-CSF Mm3'UTR; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5717; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1) bila je potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom. G-CSF mRNA koja sadrži humani 3'UTR koja ima miR-122 sekvencu u 3'UTR (G-CSF Hs3'UTR miR-122; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5018; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1), ili seme sekvencu miR-122 u 3'UTR (G-CSF Hs3'UTR miR-122 seme sekvenca; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5020; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1) ili sekvencu miR-122 bez seme sekvence u 3'UTR (G-CSF Hs3'UTR miR-122 bez seme sekvence; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5022; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1) bila je potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom. G-CSF mRNA koja sadrži 3'UTR miša koja ima miR-122 sekvencu u 3'UTR (G-CSF Mm3'UTR miR-122; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5024; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1), ili seme sekvencu miR-122 u 3'UTR (G-CSF Mm3'UTR miR-122 seme sekvenca; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5026; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1) ili sekvencu miR-122 bez seme sekvence u 3'UTR (G-CSF Mm3'UTR miR-122 bez seme sekvence; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5028; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1) bila je potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom.

[1015] mRNA faktora IX koja ima 3’UTR humanog alfa-globina (faktor IX Hs3'UTR; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5718; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1) ili 3’UTR alfa-globina miša (faktor IX Mm3'UTR; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5719; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1) bila je potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom. mRNA faktora IX koja sadrži humani 3'UTR koji ima miR-122 sekvencu u 3'UTR (faktor IX Hs3'UTR miR-122; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5030; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1), ili seme sekvencu miR-122 u 3'UTR (faktor IX Hs3'UTR miR-122 seme sekvenca; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5032; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1) ili sekvencu miR-122 bez seme sekvence u 3'UTR (faktor IX Hs3'UTR miR-122 bez seme sekvence; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5034; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1) bila je potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom. mRNA faktora IX koja sadrži 3'UTR miša koji ima miR-122 sekvencu u 3'UTR (faktor IX Mm3'UTR miR-122; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5036; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1), ili seme sekvencu miR-122 u 3'UTR (faktor IX Mm3'UTR miR-122 seme sekvenca; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5038; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1) ili sekvencu miR-122 bez seme sekvence u 3'UTR (faktor IX Mm3'UTR miR-122 bez seme sekvence; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5040; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1) bila je potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom.

[1016] Svaka mRNA sekvenca, za G-CSF ili faktor IX, ispitana je u koncentraciji od 500 ng po bunarčiću u pločama sa 24 bunarčića. Ekspresija proteina merena je ELISA testom 24, 48 i 72 sata nakon transfekcije. Nivoi proteina za G-CSF prikazani su u tabeli 33, a nivoi proteina za faktor IX prikazani su u tabeli 34.

Tabela 33. Ekspresija proteina G-CSF

Tabela 34. Ekspresija proteina faktora IX

Primer 36. In vitro ekspresija modifikovane nukleinske kiseline sa mestima vezivanja mir-142 ili miR-146

[1017] HeLa i RAW264 ćelije su zasejane pri gustini od 17 000, odnosno 80 000 ćelija po bunarčiću, u 100 ul medijuma za ćelijsku kulturu (DMEM+10%FBS).

[1018] G-CSF mRNA (G-CSF; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 4258; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1) bila je potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom.

[1019] G-CSF mRNA koja ima miR-142-3p sekvencu u 3'UTR (G-CSF miR-142-3p; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 4992; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1), ili miR-142-3p seme sekvencu u 3'UTR (G-CSF miR-142-3p seme sekvenca; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 4994; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1) ili miR-142-3p sekvencu bez seme sekvence u 3'UTR (G-CSF miR-142-3p bez seme sekvence; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 4996; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1) bila je potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom.

[1020] G-CSF mRNA koja ima miR-142-5p sekvencu u 3'UTR (G-CSF miR-142-5p; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 4986; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1), ili miR-142-5p seme sekvencu u 3'UTR (G-CSF miR-142-5p seme sekvenca; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 4988; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1) ili miR-142-5p sekvencu bez seme sekvence u 3'UTR (G-CSF miR-142-5p bez seme sekvence; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 4990; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1) bila je potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom.

[1021] G-CSF mRNA koja ima miR-146a sekvencu u 3'UTR (G-CSF miR-146a; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 4998; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1), ili miR-146a seme sekvencu u 3'UTR (G-CSF miR-146a seme sekvenca; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5000; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1) ili miR-146a sekvencu bez seme sekvence u 3'UTR (G-CSF miR-146a bez seme sekvence; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5002; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1) bila je potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom.

[1022] Svaka G-CSF mRNA sekvenca je ispitana u koncentraciji od 500 ng po bunarčiću u pločama sa 24 bunarčića za svaki tip ćelija. Ekspresija proteina merena je ELISA testom 24 sata nakon transfekcije, i nivoi proteina prikazani su u tabeli 35. G-CSF sekvence sa miR-142-3p sekvencom u 3'UTR su nishodno regulisale ekspresiju G-CSF u ćelijama RAW264, dok G-CSF sekvence sa miR-142-5p ili miR-146a sekvencom u 3'UTR nisu nishodno regulisale ekspresiju G-CSF.

1

Tabela 35. Ekspresija G-CSF

Primer 37. Efekat Kozak sekvence na ekspresiju modifikovanih nukleinskih kiselina

[1023] HeLa ćelije su zasejane pri gustini od 17 000 ćelija po bunarčiću u 100 ul medijuma za ćelijsku kulturu (DMEM 10%FBS). G-CSF mRNA koja ima IRES sekvencu i Kozak sekvencu (G-CSF IRES Kozak; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5004; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1), G-CSF mRNA koja ima IRES sekvencu, ali nema Kozak sekvencu (G-CSF IRES; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5006; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1), G-CSF mRNA bez IRES ili Kozak sekvence (GCSF no Kozak; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5008; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1) ili G-CSF sekvenca koja ima

2

Kozak sekvencu (G-CSF Kozak; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5720; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1) bile su potpuno modifikovane 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom i ispitane u koncentraciji od 75 ng po bunarčiću u pločama sa 24 bunarčića. Ekspresija G-CSF merena je ELISA testom 24 sata nakon transfekcije, i rezultati su prikazani u tabeli 36.

Tabela 36. Ekspresija G-CSF

Primer 38. Konstrukti MALAT1

[1024] Modifikovana mRNA koja kodira G-CSF ili mCherry sa sekvencom MALAT1 čoveka ili miša i njihove odgovarajuće cDNA sekvence prikazane su ispod u tabeli 37. U tabeli 37, start kodon svake sekvence je podvučen, a sekvence MALAT1 su podebljane.

Tabela 37. Konstrukti MALAT1

4

[1025] Ove modifikovane mRNA sekvence mogu da uključuju najmanje jednu ovde opisanu hemijsku modifikaciju. Modifikovana mRNA sekvenca za G-CSF ili mCherry može da bude formulisana, upotrebom postupaka koji su ovde opisani i/ili poznati u stanju tehnike, pre transfekcije i/ili primene.

[1026] Modifikovana mRNA sekvenca koja kodira G-CSF ili mCherry može da bude transfektovana in vitro u različite tipove ćelija kao što su HEK293, HeLa, PBMC i BJ fibroblast i one opisane u tabeli 25 upotrebom postupaka koji su ovde opisani i/ili poznati u stanju tehnike.

Ćelije se zatim analiziraju upotrebom postupaka koji su ovde opisani i/ili poznati u stanju tehnike kako bi se odredila koncentracija G-CSF ili mCherry i/ili ćelijska vijabilnost.

Primer 39. Upotreba heterologih 5'UTR

[1027] 5' UTR može da bude dat kao oivičavajući region nukleinskih kiselina, modifikovanih nukleinskih kiselina ili mmRNA prema prikazu. 5'UTR može da bude homolog ili heterolog u odnosu na kodirajući region koji se nalazi u nukleinskim kiselinama, modifikovanim nukleinskim kiselinama ili mmRNA prema prikazu. Višestruki 5' UTR mogu da budu uključeni u oivičavajući region i mogu da imaju istu ili različite sekvence. Bilo koji deo oivičavajućih regiona, uključujući nijedan, može da ima optimizovane kodone i svaki može nezavisno da sadrži jednu ili više različitih strukturnih ili hemijskih modifikacija, pre i/ili posle optimizacije kodona.

[1028] U produženoj tabeli 21 u SAD privremenoj prijavi br 61/7/5,509, podnetoj 9. marta 2013, pod nazivom Heterologous Untranslated Regions for mRNA i u produženoj tabeli 21 u SAD privremenoj prijavi br 61/829,372, podnetoj 31. maja 2013, pod nazivom Heterologous Untranslated Regions for mRNA nalazi se lista mesta početka i završetka u polinukleotidima, primarnim konstruktima ili mmRNA prema prikazu. Svaki 5'UTR (5'UTR-005 do 5'UTR 68511) se identifikuje preko mesta početka i završetka u odnosu na svoj nativni ili (homologi) transkript divljeg tipa (ENST; oznaka upotrebljena u bazi podataka ENSEMBL).

[1029] Da bi se promenilo jedno ili više svojstava nukleinskih kiselina, modifikovanih nukleinskih kiselina ili mmRNA prema prikazu, 5'UTR koji su heterologi kodirajućem regionu nukleinskih kiselina, modifikovanih nukleinskih kiselina ili mmRNA prema prikazu su konstruisani u jedinjenja prikaza. Nukleinske kiseline, modifikovane nukleinske kiseline ili mmRNA su zatim primenjene na ćelije, tkiva ili organizme, a ishodi, kao što su nivo proteina, lokalizacija i/ili poluživot, su mereni da bi se procenili korisni efekti koje heterologi 5'UTR može da ima na nukleinske kiseline, modifikovane nukleinske kiseline ili mmRNA prema prikazu. Mogu da se koriste varijante 5' UTR u kojima se jedan ili više nukleotida dodaje ili uklanja na krajevima, uključujući A, T, C ili G. 5'UTR takođe mogu da imaju optimizovane kodone ili da budu modifikovani na bilo koji ovde opisan način.

Primer 40. Dodatna upotreba 5' netranslatiranih regiona

[1030] 5' UTR može da bude dat kao oivičavajući region nukleinskih kiselina, modifikovanih nukleinskih kiselina ili mmRNA prema prikazu. 5'UTR može da bude homolog ili heterolog u odnosu na kodirajući region koji se nalazi u nukleinskim kiselinama, modifikovanim nukleinskim kiselinama ili mmRNA prema prikazu. Višestruki 5' UTR mogu da budu uključeni u oivičavajući region i mogu da imaju istu ili različite sekvence. Bilo koji deo oivičavajućih regiona, uključujući nijedan, može da ima optimizovane kodone i svaki može nezavisno da sadrži jednu ili više različitih strukturnih ili hemijskih modifikacija, pre i/ili posle optimizacije kodona.

[1031] U tabeli 38 navedeni su 5'-netranslatirani regioni koji mogu da se upotrebe sa nukleinskim kiselinama, modifikovanim nukleinskim kiselinama ili mmRNA predmetnog prikaza.

[1032] Da bi se promenilo jedno ili više svojstava nukleinskih kiselina, modifikovanih nukleinskih kiselina ili mmRNA prema prikazu, 5'UTR koji su heterologi kodirajućem regionu nukleinskih kiselina, modifikovanih nukleinskih kiselina ili mmRNA prema prikazu su konstruisani u jedinjenja prikaza. Nukleinske kiseline, modifikovane nukleinske kiseline ili mmRNA su zatim primenjene na ćelije, tkiva ili organizme, a ishodi, kao što su nivo proteina, lokalizacija i/ili poluživot, su mereni da bi se procenili korisni efekti koje heterologi 5'UTR može da ima na nukleinske kiseline, modifikovane nukleinske kiseline ili mmRNA prema prikazu. Mogu da se koriste varijante 5' UTR u kojima se jedan ili više nukleotida dodaje ili uklanja na krajevima, uključujući A, T, C ili G. 5'UTR takođe mogu da imaju optimizovane kodone ili da budu modifikovani na bilo koji ovde opisan način.

Tabela 38. 5'-Netranslatirani regioni

Primer 41. Proizvodnja proteina upotrebom heterologih 5'UTR

[1033] Dan pre transfekcije, 20000 HeLa ćelija (ATCC br. CCL-2; Manassas, VA) su sakupljene tretmanom rastvorom tripsin-EDTA (LifeTechnologies, Grand Island, NY) i zasejane u ukupnoj zapremini od 100ul medijuma EMEM (obogaćenog sa 10%FCS i 1x Glutamax) po bunarčiću u ploči za kulturu ćelija 96 bunarčića (Corning, Manassas, VA). Ćelije su gajene u 37°C u 5% atmosfere CO2preko noći. Sledećeg dana, 37.5 ng, 75 ng ili 150 modifikovane G-CSF RNK koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline za 5UTR-001 (sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom), modifikovane G-CSF RNK koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline za 5UTR-68515 (sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5732; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom), modifikovane G-CSF RNK koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline za 5UTR-68516 (sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5733; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom), modifikovane G-CSF RNK koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline za 5UTR-68521 (sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5738; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom) ili modifikovane G-CSF RNK koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline za 5UTR-68522 (sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5739; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom) razblaženo je u finalnoj zapremini od 10ul OPTI-MEM (LifeTechnologies, Grand Island, NY). Kao reagens za transfekciju upotrebljen je lipofektamin 2000 (LifeTechnologies, Grand Island, NY) i 0.2 ul je razblaženo u 10 ul finalne zapremine OPTI-MEM. Posle 5 minuta inkubacije na sobnoj temperaturi, dva rastvora su kombinovana i inkubirana dodatnih 15 minuta na sobnoj temperaturi. Zatim je 20ul kombinovanog rastvora dodato u 100ul medijuma za ćelijsku kulturu koji sadrži HeLa ćelije i inkubirano na sobnoj temperaturi.

[1034] Nakon inkubacije od 24 sata ćelije koje eksprimiraju G-CSF su lizirane sa 100 ul pufera za pasivnu lizu (Promega, Madison, WI) prema uputstvu proizvođača. Proizvodnja proteina G-CSF određena je ELISA testom.

[1035] Ovi rezultati, prikazani u tabeli 39, pokazuju da G-CSF mRNA koja sadrži 5UTR-68515 ili 5UTR-68521 proizvodi najviše proteina, dok G-CSF mRNA koja sadrži 5UTR-68522 proizvodi najmanju količinu proteina.

Tabela 39. Proizvodnja proteina G-CSF sa heterologih 5'UTR

Primer 42. Efekat Kozak sekvence u modifikovanim nukleinskim kiselinama

[1036] HeLa ćelije su zasejane pri gustini od 15 000 ćelija po bunarčiću u 100 ul medijuma za ćelijsku kulturu DMEM+FBS 10%. G-CSF mRNA koja ima Kozak sekvencu (G-CSF Kozak; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5004; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom) ili G-CSF mRNA koja nema Kozak sekvencu (G-CSF bez Kozak sekvence; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5008; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom) su transfektovane u triplikatu pri koncentraciji od 75 ng po bunarčiću u pločama sa 96 bunarčića. Supernatant je sakupljen 24 sata, 48 sata i 72 sata nakon transfekcije i ekspresija G-CSF je merena ELISA testom, i rezultati su prikazani u tabeli 40.

Tabela 40. Ekspresija G-CSF

Primer 43. Efekat promene 5'UTR u modifikovanim nukleinskim kiselinama

[1037] mRNA koja kodira polipeptid od interesa i ima poliA sekvencu i kapu, potpuno je modifikovana najmanje jednom hemijskom reakcijom koja je opisana ovde i/ili u nerešenoj međunarodnoj objavi br. WO2013052523 istog podnosioca i mRNA sadrži 5'UTR iz tabele 41. HeLa ćelije su zasejane u medijumu za ćelijsku kulturu i transfektovane sa mRNA u unapred određenoj koncentraciji (ng po bunarčiću) u svim bunarčićima. U unapred određenim intervalima (npr., 2 sata, 4 sata, 6 sati, 8 sati, 10 sati, 12 sati, 14 sati, 16 sati, 18 sati, 20 sati, 22 sata, 24 sata, 36 sati, 48 sati, 60 sati i/ili 72 sata) nakon transfekcije, supernatant je sakupljen i ekspresija proteina je merena ELISA testom.

Tabela 41. 5' UTR

1

Oznaka Naziv/Opis Sekvenca SEQ

Primer 44. Efekat dužine poliA repa u modifikovanim nukleinskim kiselinama

A. Uređaj za biološku analizu

[1038] Modifikovana G-CSF mRNA (sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5745; 5’ kapa, Cap1 potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom (5mc/1mpU) ili potpuno modifikovana 1-metilpseudouridinom (1mpU)), modifikovana mRNA faktora IX (FIX) (sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5746; 5’ kapa, Cap1 potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom (5mc/1mpU) ili potpuno modifikovana 1-metilpseudouridinom (1mpU)), modifikovana mRNA eritropoietina (EPO) (sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5747; 5’ kapa, Cap1 potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom (5mc/1mpU) ili potpuno modifikovana 1-metilpseudouridinom (1mpU)) ili modifikovana mRNA mCherry (sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5748; 5’ kapa, Cap1 potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom (5mc/1mpU) ili potpuno modifikovana 1-metilpseudouridinom (1mpU)) koje imaju poliA rep dužine 20, 40, 80, 100, 120, 140 ili 160 nukleotida ili nemaju poliA rep, analizirane su uređajem za biološku analizu (Agilent 2100 bioanalyzer). Svi uzorci su, prema uređaju za biološku analizu, sačuvali integritet mRNA.

B. BJ Fibroblasti

[1039] Humani primarni fibroblasti prepucijuma (BJ fibroblasti) su nabavljeni iz Američke kolekcije tipova kultura (ATCC) (kataloški br. CRL-2522) i uzgajani u Eagleovom minimalnom esencijalnom medijumu (ATCC, kat. br. 11095-114) obogaćenom sa 10% fetalnog goveđeg seruma na 37°C, pod 5% CO2. BJ fibroblasti su zasejani na ploču sa 24 bunarčića pri gustini od 100 000 ćelija po bunarčiću u 0.5 ml medijuma za kulturu.250 ng modifikovane G-CSF mRNA

2

(sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5745; 5’ kapa, Cap1 potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom (5mc/1mpU) ili potpuno modifikovana 1-metilpseudouridinom (1mpU)), modifikovana mRNA faktora IX (FIX) (sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5746; 5’ kapa, Cap1 potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom (5mc/1mpU) ili potpuno modifikovana 1-metilpseudouridinom (1mpU)), modifikovana mRNA eritropoietina (EPO) (sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5747; 5' kapa,

[1040] Cap1 potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom (5mc/1mpU) ili potpuno modifikovana 1-metilpseudouridinom (1mpU)) ili modifikovana mRNA mCherry (sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5748; 5’ kapa, Cap1 potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom (5mc/1mpU) ili potpuno modifikovana 1-metilpseudouridinom (1mpU)) koje imaju poliA rep dužine 20, 40, 80, 100, 120, 140 ili 160 nukleotida ili nemaju poliA rep su transfektovane upotrebom lipofektamina 2000, prema protokolu proizvođača. FIX, G-CSF i EPO su transfektovani u triplikatu.

[1041] Supernatant je sakupljan na 24 sata, 48 sati i 72 sata za FIX, G-CSF i EPO i na 24 sata za mCherry. Ekspresija proteina je ispitana ELISA testom za FIX, G-CSF i EPO i fluorescentnoaktiviranim sortiranjem ćelija (FACS) za mCherry. Rezultati za G-CSF su prikazani u tabeli 42, rezultati za EPO su prikazani u tabeli 43, rezultati za FIX su prikazani u tabeli 44 i rezultati za mCherry su prikazani u tabeli 45.

Tabela 42. Ekspresija proteina G-CSF

Opis Dužina poliA repa Vremenska tačka Protein (ng/ml)

(ng/ml)

4

O is Dužina oliA re a Vremenska tačka Protein n/ml

Tabela 43. Ekspresija proteina EPO

Opis Dužina poliA repa Vremenska tačka Protein (ng/ml)

(ng/ml)

Tabela 44. Ekspresija proteina FIX

O is Dužina oliA re a Vremenska tačka Protein n/ml

Tabela 45. Ekspresija mCherry

Primer 45. Modifikovane nukleinske kiseline sa sekvencom miR-122

A. Ćelije HeLa

[1042] HeLa ćelije su zasejane pri gustini od 15 000 ćelija po bunarčiću u 100 ul medijuma za ćelijsku kulturu (DMEM 10%FBS). G-CSF mRNA koja ima miR-122 sekvencu u 3'UTR (G-CSF miR122; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5024; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5' kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom) ili G-CSF mRNA koja ima sekvencu miR-122 bez seme sekvence u 3'UTR (G-CSF bez seme sekvence; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5028; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudoundinom) su transfektovane upotrebom 0.3ul po bunarčiću lipofektamina 2000 u koncentraciji od 75 ng mRNA po bunarčiću u pločama sa 96 bunarčića. Supernatant je sakupljen između 16-18 sati nakon transfekcije i ekspresija G-CSF je merena ELISA testom, i rezultati su prikazani u tabeli 46.

Tabela 46. Ekspresija G-CSF u HeLa

B. Primarni hepatociti čoveka i pacova

[1043] Primarni hepatociti čoveka i pacova su zasejani pri gustini od 350000 ćelija po bunarčiću u 500 ul medijuma za ćelijsku kulturu (InvitroGRO CP i InVitroGRO HI medijum 2.2% Torpedo mešavina antibiotika). G-CSF mRNA koja ima miR-122 sekvencu u 3'UTR (G-CSF miR122; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5024; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom) ili G-CSF mRNA koja ima sekvencu miR-122 bez seme sekvence u 3'UTR (G-CSF bez seme sekvence; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5028; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudoundinom) su transfektovane upotrebom 1 ul po bunarčiću lipofektamina 2000 u koncentraciji od 500 ng mRNA po bunarčiću u pločama sa 24 bunarčića u slučaju primarnih hepatocita čoveka i primarnih hepatocita pacova. Supernatant je sakupljen između 16-18 sati nakon transfekcije i ekspresija G-CSF je merena ELISA testom, i rezultati su prikazani u tabeli 47. Sekvenca mesta vezivanja mir-122 u mRNA prigušila je ekspresiju G-CSF proteina u primarnim hepatocitima.

1

Tabela 47. Ekspresija G-CSF u hepatocitima

Primer 46. Vremenski tok kod modifikovanih nukleinskih kiselina sa sekvencom miR-122

A. Ćelije HeLa

[1044] HeLa ćelije su zasejane pri gustini od 17000 ćelija po bunarčiću u 100 ul medijuma za ćelijsku kulturu (DMEM 10%FBS). G-CSF mRNA bez miR-122 sekvence u 3'UTR (G-CSF; mouse 3' UTR sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5717; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom; humana 3'UTR sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5716; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom), G-CSF mRNA koja ima miR-122 sekvencu u 3'UTR (G-CSF miR122; mišja 3' UTR sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5024; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom; human 3'UTR sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5018; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-methyipseudouridinom), G-CSF mRNA koja ima seme sekvence miR-122 u 3'UTR (G-CSF seme sekvenca; mišja 3' UTR sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5026; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom, humana 3'UTR sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5020; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom), G-CSF mRNA koja ima sekvencu miR-122 bez seme sekvence u 3'UTR (G-CSF bez seme sekvence; mišja 3' UTR sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5028; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom; human 3'UTR sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5022; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom), mRNA faktora IX bez sekvence miR-122 u 3'UTR (FIX;

2

mišja 3' UTR sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5719; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom; humana 3'UTR sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5718; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom), mRNA faktora IX koja ima miR-122 sekvencu u 3'UTR (FIX miR122; mišja 3' UTR sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5036; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom, humana 3'UTR sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5030; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom), mRNA faktora IX koja ima seme sekvence miR-122 u 3'UTR (FIX seme sekvenca; mišja 3' UTR sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5038; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom, human 3'UTR sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5032; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudoundinom) ili mRNA faktora IX koja ima sekvencu miR-122 bez seme sekvence u 3'UTR (FIX bez seme sekvence; mišja 3' UTR sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5040; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom, humana 3'UTR sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5034; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudoundinom) su transfektovane upotrebom 0.3 ul po bunarčiću lipofektamina 2000 u koncentraciji od 75 ng mRNA po bunarčiću u pločama sa 96 bunarčića. Supernatant je sakupljen između 16-18 sata nakon transfekcije, ekspresija G-CSF ili faktora IX je merena ELISA testom, i rezultati su prikazani u tabeli 48.

Tabela 48. Ekspresija u HeLa

Opis Ekspresija proteina Mm Ekspresija proteina Hs

B. Primarni hepatociti čoveka i pacova

[1045] Primarni hepatociti čoveka ili pacova su zasejani pri gustini od 350000 ćelija po bunarčiću u 500 ul medijuma za ćelijsku kulturu (InvitroGRO CP i InVitroGRO HI medijum 2.2% Torpedo antibiotika). G-CSF mRNA bez miR-122 sekvence u 3'UTR (G-CSF; mišja 3' UTR sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5717; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom; humana 3'UTR sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5716; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom), G-CSF mRNA koja ima miR-122 sekvencu u 3'UTR (G-CSF miR122; mišja 3' UTR sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5024; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom; humana 3'UTR sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5018; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom), G-CSF mRNA koja ima seme sekvence miR-122 u 3'UTR (G-CSF seme sekvenca; mišja 3' UTR sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5026; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom; humana 3'UTR sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5020; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom), G-CSF mRNA koja ima sekvencu miR-122 bez seme sekvence u 3'UTR (G-CSF bez seme sekvence; mišja 3' UTR sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5028; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom; humana 3'UTR sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5022; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom), mRNA faktora IX bez miR-122 sekvence u 3'UTR (FIX;

4

mišja 3' UTR sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5719; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom; humana 3'UTR sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5718; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom), mRNA faktora IX koja ima miR-122 sekvencu u 3'UTR (FIX miR122; mišja 3' UTR sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5036; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom; humana 3'UTR sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5030; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom), mRNA faktora IX koja ima seme sekvence miR-122 u 3'UTR (FIX seme sekvenca; mišja 3' UTR sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5038; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom: humana 3'UTR sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5032; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom) ili mRNA faktora IX koja ima sekvencu miR-122 bez seme sekvence u 3'UTR (FIX bez seme sekvence; mišja 3' UTR sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5040; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom: humana 3'UTR sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5034; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom) su transfektovane pomoću 1 ul po bunarčiću lipofektamina 2000 u koncentraciji od 500 ng po bunarčiću u pločama sa 24 bunarčića u slučaju primarnih hepatocita čoveka i primarnih hepatocita pacova. Supernatant je sakupljan na 24 sata, 48 sati i 72 sata nakon transfekcije, ekspresija G-CSF i faktora IX je merena ELISA testom, i rezultati su prikazani u tabeli 49. Sekvenca mesta vezivanja mir-122 u mRNA prigušila je ekspresiju proteina G-CSF i faktora IX u primarnim hepatocitima.

Tabela 49. Ekspresija G-CSF u hepatocitima

Vremenska Primarni hepatociti Primarni hepatociti tačka čoveka čoveka

Primer 47. Vremenski tok kod modifikovanih nukleinskih kiselina sa sekvencom miR-122 u ćelijama kancera

A. Osnovni nivo miR-122

[1046] Osnovni nivo mir-122 u hepatocitima čoveka, hepatocitima pacova, ćelijama humanog hepatocelularnog karcinoma (Hep3B) i ćelijama HeLa određen je analizom TAQMAN<®>upotrebom protokola proizvođača. Nivoi su normalizovani u odnosu na U6 i rezultati su prikazani u tabeli 50.

Tabela 50. Nivoi miR-122 u različitim tipovima ćelija

B. Primarni hepatociti čoveka i ćelije Hep3B

[1047] Primarni humani hepatociti su zasejani pri gustini od 50000 ćelija po bunarčiću u 100 ul medijuma za ćelijsku kulturu (InvitroGRO CP i InVitroGRO HI medijum 2.2% Torpedo mešavine antibiotika), a Hep3B ćelije su zasejane pri gustini od 20000 ćelija po bunarčiću u 100 ul medijuma za ćelijsku kulturu MEM 10%FBS. G-CSF mRNA bez miR-122 sekvence u 3'UTR (G-CSF; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5745; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom), G-CSF mRNA koja ima miR-122 sekvencu u 3'UTR (G-CSF miR122; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5018; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1metilpseudouridinom), G-CSF mRNA koja ima seme sekvence miR-122 u 3'UTR (G-CSF seme sekvenca; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5020; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom) ili G-CSF mRNA koja ima sekvencu miR-122 bez seme sekvence u 3'UTR (G-CSF bez seme sekvence; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5022; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom) su transfektovane pomoću 0.3 ul po bunarčiću lipofektamina 2000 u koncentraciji od 75 ng mRNA po bunarčiću u pločama sa 96 bunarčića kada su u pitanju humani hepatociti i ćelije Hep3B. Supernatant je sakupljan na 24 sati, 48 sati i 72 sata nakon transfekcije, ekspresija G-CSF je merena ELISA testom, i rezultati su prikazani u tabeli 51. Sekvenca mesta vezivanja mir-122 u mRNA prigušila je ekspresiju proteina G-CSF u primarnim hepatocitima čoveka, ali ne i u ćelijama Hep3B.

Tabela 51. Ekspresija G-CSF

Primer 48. Vremenski tok modifikovanih nukleinskih kiselina sa sekvencom miR-142 3p

A. Osnovni nivo miR-1433p

[1048] Osnovni nivo miR-1423p u ćelijama RAW264.7 i ćelijama HeLa određen je analizom TAQMAN<®>upotrebom protokola proizvođača. Nivoi su normalizovani u odnosu na U6 i rezultati su prikazani u tabeli 52.

Tabela 52. Nivoi miR-142 3p u različitim tipovima ćelija

B. Ćelije HeLa i RAW264.7

[1049] HeLa ćelije su zasejane pri gustini od 17 000 ćelija po bunarčiću u 100 ul medijuma za ćelijsku kulturu DMEM 10%FBS, a ćelije RAW264.7 su zasejane pri gustini od 200000 ćelija po bunarčiću u 100 ul medijuma za ćelijsku kulturu DMEM 10%FBS. G-CSF mRNA bez miR-142 3p sekvence u 3'UTR (G-CSF; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5749; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom), G-CSF mRNA koja ima miR-1423p sekvencu u 3'UTR (G-CSF miR1423p; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5750; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom), G-CSF mRNA koja ima miR-142 3p seme sekvencu u 3'UTR (G-CSF seme sekvenca; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5751; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudoundinom) ili G-CSF mRNA koja ima miR-142 3p sekvencu bez seme sekvence u 3'UTR (G-CSF bez seme sekvence; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5752; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom) su transfektovane pomoću 0.3ul po bunarčiću lipofektamina 2000 u koncentraciji od 75 ng mRNA po bunarčiću u pločama sa 96 bunarčića u slučaju HeLa ili pomoću 1 ul po bunarčiću lipofektamina 2000 u koncentraciji od 250 ng mRNA po bunarčiću u pločama sa 24 bunarčića u slučaju RAW264.7 ćelija. Supernatant je sakupljen 16-18 sati nakon transfekcije, ekspresija G-CSF je merena ELISA testom, i rezultati su prikazani u tabeli 53. Pokazano je da miR-142 3p mesta u G-CSF nishodno regulišu ekspresiju G-CSF u ćelijama RAW264.7.

Tabela 53. Ekspresija

C. Vremenski tok u ćelijama RAW264.7

[1050] Ćelije RAW264.7 su zasejane pri gustini od 60000 ćelija po bunarčiću u 100 ul medijuma za ćelijsku kulturu (DMEM 10%FBS). G-CSF mRNA bez miR-1423p sekvence u 3'UTR (G-CSF; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5749; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom), G-CSF mRNA koja ima miR-142 3p sekvencu u 3'UTR (G-CSF miR142 3p; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5750; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom), G-CSF mRNA koja ima miR-142 3p seme sekvencu u 3'UTR (G-CSF seme sekvenca; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5751; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudoundinom) ili G-CSF mRNA koja ima miR-142 3p sekvencu bez seme sekvence u 3'UTR (G-CSF bez seme sekvence; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5752; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudoundinom) su transfektovane pomoću 0.3 ul po bunarčiću lipofektamina 2000 u koncentraciji od 75 ng mRNA po bunarčiću u pločama sa 96 bunarčića. Supernatant je sakupljan na 24 sati, 48 sati i 72 sata nakon transfekcije, ekspresija G-CSF je merena ELISA testom, i rezultati su prikazani u tabeli 54. Sekvenca mesta vezivanja mir-142 3p u mRNA je pokazala snažnu supresiju ekspresije G-CSF u ćelijama RAW264.7 tokom vremena.

Tabela 54. Ekspresija G-CSF

D. miR-1423p u PBMC

[1051] Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMCs) su zasejane pri gustini od 150000 ćelija po bunarčiću u 100 ul medijuma za ćelijsku kulturu (Opti-MEM i nakon transfekcije dodato je 10%FBS). G-CSF mRNA koja ima miR-142 3p sekvencu u 3'UTR (G-CSF miR1423p; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5750; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom), G-CSF mRNA koja ima miR-1423p seme sekvencu u 3'UTR (G-CSF seme sekvenca; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5751; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom) ili G-CSF mRNA koja ima miR-142 3p sekvencu bez seme sekvence u 3'UTR (G-CSF bez seme sekvence; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5752; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudoundinom) su transfektovane u triplikatu pomoću 0.4 ul po bunarčiću lipofektamina

1

2000 u koncentraciji od 500 ng mRNA po bunarčiću u pločama sa 96 bunarčića od 2 ili 3 davaoca. Supernatant je sakupljan 24 sata nakon transfekcije i ekspresija G-CSF je merena ELISA testom. Rezultati za 2 davaoca su prikazani u tabeli 55, a rezultati za 3 davaoca su prikazani u tabeli 56. Sekvenca mesta vezivanja mir-1423p u mRNA pokazala je nishodnu regulaciju ekspresije G-CSF u PBMC čoveka.

Tabela 55. Ekspresija PBMC (2 davaoca)

Tabela 56. Ekspresija PBMC (3 davaoca)

Primer 49. In vivo ekspresija modifikovane mRNA

A. BALB/C goli miševi

[1052] BALB/c golim miševima je intravenski ubrizgano 0.1 mg/kg modifikovane mRNA luciferaze bez mesta vezivanja miR-122 ("mRNA koja nije ciljna"; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5753; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5' kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom) formulisane u lipidnoj nanočestici opisanoj u tabeli 57 ili modifikovane mRNA luciferaze sa mestom vezivanja miR-122 u 3'UTR ("mRNA na koju ciljno deluje miR-122"; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5754; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5' kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom) formulisane u lipidnoj nanočestici opisanoj u tabeli 58.

2

Tabela 57. Lipidna nanočestica za mRNA koja nije ciljna

Tabela 58. Lipidna nanočestica za ciljnu mRNA

[1053] Životinje su anestezirane 24 sata nakon tretmana i ubrizgan im je supstrat luciferaze D-luciferin i bioluminiscencijska slika (BLI) živih životinja je procenjena pomoću uređaja za snimanje IVIS 15 minuta kasnije. Signali su dobijeni od životinja kojima je ubrizgana mRNA koja nije ciljna i mRNA na koju ciljno deluje miR-122 i predstavljeni u tabeli 59. Ukupni svetlosni signal proizveden iz jetre životinja tretiranih sa mRNA na koju ciljno deluje miR-122 je 29 puta niži od onog kod mRNA koja nije ciljna, što pokazuje da konstruisani element u 3'UTR može da inhibira ekspresiju proteina u normalnom tkivu.

Tabela 59. In vivo ekspresija modifikovane mRNA modulisane konstruisanim mestom vezivanja miR122

B. BALB/c goli miševi sa ćelijama Hep3B hepatocelularnog karcinoma

[1054] BALB/c golim miševima je intrahepatički implantirano 2 × 10<6>ćelija Hep3B hepatocelularnog karcinoma i rezultirajućim ortotopski tumori su ostavljeni da rastu 24 dana.

Miševima sa tumorima je zatim intravenozno ubrizgano 0.1 mg/kg modifikovane mRNA luciferaze bez mesta vezivanja miR-122 ("mRNA koja nije ciljna"; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5753; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5' kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom) ili modifikovane mRNA luciferaze sa mestom vezivanja miR-122 u 3'UTR ("mRNA na koju ciljno deluje miR-122"; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5754; poliA rep od približno 140 nukleotida koji nije prikazan u sekvenci; 5' kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom) formulisanom u lipidnoj nanočestici opisanoj u tabelama 57 i 58 (gore). Životinje su anestezirane 24 sata nakon tretmana i ubrizgan im je supstrat luciferaze D-luciferin i bioluminiscencijska slika (BLI) živih životinja je procenjena pomoću uređaja za snimanje IVIS 20 minuta kasnije. Signal sa ortotopskih tumora u poređenju sa susednom normalnom jetrom je kvantifikovan, a mRNA na koju ciljno deluje miR-122 koja je sistemski isporučena preko lipidnih nanočestica je dostigla više od dvostrukog povećanja prisustva u tumoru, u poređenju sa normalnom jetrom.

Primer 50. Efekat Kozak sekvence u modifikovanim nukleinskim kiselinama

[1055] HeLa ćelije su zasejane pri gustini od 15000 ćelija po bunarčiću u 100 ul medijuma za ćelijsku kulturu DMEM+FBS 10%. G-CSF mRNA koja ima Kozak sekvencu (G-CSF Kozak; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5716; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom), G-CSF mRNA koja nema Kozak sekvencu (G-CSF bez Kozak sekvence; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5008; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom), G-CSF mRNA u kojoj je A na poziciji -3, ushodno od start kodona, pretvoren u T, (G-CSF 3t5'; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5755 (tabela 60); poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom), G-CSF mRNA u kojoj je A na poziciji -9, ushodno od start kodona, pretvoren u T, (G-CSF 9t5'; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5756 (tabela 60); poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudoundinom) ili G-CSF mRNA u kojoj je 9 nukleotida ushodno od start kodona (AGAGCCACC) deletirano (G-CSF 9del5'; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5757 (tabela 60); poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudoundinom) su

4

transfektovane u triplikatu u koncentraciji od 37.5 ng po bunarčiću u pločama sa 96 bunarčića. Supernatant je sakupljen 24 sata, 48 sati i 72 sata nakon transfekcije i ekspresija G-CSF je merena ELISA testom, i rezultati su prikazani u tabeli 61. U tabeli 60, start kodon u svakoj sekvenci je podvučen. U tabeli 60, u G-CSF 3t5' A na poziciji -3, ushodno od start kodona je podebljano i podvučeno i u G-CSF 9t5' A na poziciji -9 ushodno od start kodona je podebljano i podvučeno.

Tabela 60. Sekvence G-CSF

Tabela 61. Ekspresija G-CSF

Primer 51. Efekat modifikacije 5'UTR u modifikovanim nukleinskim kiselinama

[1056] BJ fibroblasti su zasejani pri gustini od 100000 ćelija po bunarčiću u 500 ul medijuma za ćelijsku kulturu EMEM+FBS 10%. G-CSF mRNA koja ima sintetički 5'UTR (G-CSF; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5716; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom) ili G-CSF mRNA koja sadrži 5'UTR sa pet tandemskih ponovaka sekvence od 18 nukleotida u IRES gena GTX (GTX G-CSF; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5758 (tabela 62); poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom) su transfektovane u triplikatu u koncentraciji od 250 ng po bunarčiću u pločama sa 24 bunarčića. Supernatant je sakupljen 24 sata, 48 sati i 72 sata nakon transfekcije i ekspresija G-CSF je merena ELISA testom, i rezultati su prikazani u tabeli 63. U tabeli 62, start kodon je podvučen i pet tandemskih ponovaka sekvence od 18 nukleotida u IRES gena GTX je podebljano, a prvi, treći i peti tandemski ponovak sekvence od 18 nukleotida je takođe podvučen.

Tabela 62. Sekvenca GTX G-CSF

Tabela 63. 5' UTR

Primer 53. Efekat modifikacije 5'UTR u modifikovanim nukleinskim kiselinama

[1057] BJ fibroblasti su zasejani pri gustini od 100000 ćelija po bunarčiću u 500 ul medijuma za ćelijsku kulturu EMEM+FBS 10%. G-CSF mRNA koja ima sintetički 5'UTR (G-CSF; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5716; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 1-metilpseudouridinom) ili G-CSF mRNA koja sadrži 5'UTR sa pet tandemskih ponovaka sekvence od 18 nukleotida u IRES gena Gtx (Gtx G-CSF; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5758 (tabela 62); poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 1-metilpseudouridinom) su transfektovane u triplikatu u koncentraciji od 250 ng po bunarčiću u pločama sa 24 bunarčića. Supernatant je sakupljen 24 sata, 48 sati i 72 sata nakon transfekcije i ekspresija G-CSF je merena ELISA testom, i rezultati su prikazani u tabeli 64.

Tabela 64. 5' UTR

Primer 54. In vivo efekat modifikacije 5'UTR u nukleinskim kiselinama modifikovanim 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom

[1058] Da bi se proučavao efekat modifikacije 5'UTR u modifikovanim nukleinskim kiselinama, ženke Balb/c miševa (n=3; stare 12 nedelja; Harlan Laboratories (South Easton, MA)) tretirane su pomoću mRNA sa lipopleksom.

[1059] 8 ug G-CSF mRNA koja ima sintetički 5'UTR (G-CSF; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5716; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom) ili G-CSF mRNA u kojoj je 9 nukleotida ushodno od start kodona deletirano (G-CSF 9del5'; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5757 (tabela 60); poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5’ kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom) za tretman 3 miša se razblaži sterilnim DMEM-om bez seruma (Life Technologies) kako bi se dobila ukupna zapremina od 200ul. Ukupno 8 ul lipofektamina 2000 (LifeTechnologies, 11668019) za tretman 3 miša je razblaženo sterilnim DMEM-om bez seruma (LifeTechnologies, Grand Island, NY; 11965-118) da bi se dobila ukupna zapremina od 200 ul. Posle 5 minuta inkubacije, dva rastvora su kombinovana i pažljivo pomešana pipetom. Posle 20 minuta formiranje lipopleksa mRNA-lipofektamin 2000 je završeno. Rastvor lipopleksa je prebačen u sterilni špric od 1 ml (BD Falcon) sa iglom za injekciju od 27 gejdža (BD SafetyGlide insulinski špric od 0.3 mL sa BD trajno pričvršćenom iglom od 29 G × 1⁄2 inča (kataloški br. 305935)). Balb/C miševi su stavljeni pod toplotnu lampu 5 minuta pre intravenske injekcije u repnu venu od 100 ul koja sadrži 2 ug lipopleksirane mRNA. Miševi su anestezirani 6 sati nakon injekcije i uzeta im je krv za sakupljanje seruma srčanom punkcijom. Uzorci seruma su zatim obrađeni na G-CSF ELISA (R&D systems kataloški br. SCS50) i rezultati su prikazani u tabeli 65. G-CSF mRNA kod koje je 9 nukleotida ushodno od start kodona deletirano imala je viši nivo ekspresije G-CSF na 6 sati u poređenju sa G-CSF koja ima sintetički UTR.

Tabela 65. Ekspresija G-CSF Kozak in vivo

Primer 55. In vivo efekat GTX modifikacija 5'UTR u nukleinskim kiselinama G-CSF modifikovanim 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom

[1060] Da bi se proučavao efekat modifikacije 5'UTR u modifikovanim nukleinskim kiselinama, ženke Balb/c miševa (n=3; stare 12 nedelja; Harlan Laboratories (South Easton, MA)) tretirane su pomoću mRNA sa lipopleksom.

[1061] 8 ug G-CSF mRNA koja ima sintetički 5'UTR (G-CSF; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5716; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5' kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudundinom) ili G-CSF mRNA koja sadrži 5'UTR sa pet tandem ponavljanja sekvence od 18 nukleotida iz IRES gena GTX (GTX G-CSF; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5758 ( tabela 62); poliA rep od približno 140 nukleotida koji nije prikazan u sekvenci; 5' kapa, Cap1; potpuno modifikovana 5-metilcitidinom i 1-metilpseudouridinom) za tretman 3 miša je razblažena sterilnim DMEM-om bez seruma (Life Technologies) da se dobije ukupna zapremina od 200ul. Ukupno 8 ul lipofektamina 2000 (LifeTechnologies, 11668019) za tretman 3 miša je razblaženo sterilnim DMEM-om bez seruma (LifeTechnologies, Grand Island, NI; 11965-118) da bi se dobila ukupna zapremina od 200 ul. Posle 5 minuta inkubacije, dva rastvora su kombinovana i pažljivo pomešana pipetom. Posle 20 minuta formiranje lipopleksa mRNA-lipofektamin 2000 je završeno. Rastvor lipopleksa je prebačen u sterilni špric od 1 ml (BD Falcon) sa iglom za injekciju od 27 gejdža (BD SafetyGlide insulinski špric od 0.3 mL sa BD trajno pričvršćenom iglom od 29 G × 1⁄2 inča (kataloški br.

305935)). Balb/C miševi su stavljeni pod toplotnu lampu na 5 minuta pre intravenske injekcije od 100 ul u repnu venu koja je sadržala 2 ug lipopleksirane mRNA. Miševi su anestezirani 6 sati nakon injekcije i uzeta im je krv za sakupljanje seruma srčanom punkcijom. Uzorci seruma su zatim ispitani na G-CSF ELISA (R&D systems kataloški br. SCS50) i rezultati su prikazani u tabeli 66. G-CSF mRNA koja ima pet tandem ponavljanja sekvence od 18 nukleotida iz IRES gena GTX imala je viši nivo ekspresije G-CSF na 6 sati u poređenju sa G-CSF koji ima sintetički UTR.

Tabela 66. Ekspresija GTX G-CSF in vivo

Primer 56. In vivo efekat GTX modifikacije 5'UTR u nukleinskim kiselinama G-CSF modifikovanim 1-metilpseudouridinom

[1062] Da bi se proučavao efekat modifikacije 5'UTR u modifikovanim nukleinskim kiselinama, ženke Balb/c miševa (n=3; stare 12 nedelja; Harlan Laboratories (South Easton, MA)) tretirane su pomoću mRNA sa lipopleksom.

[1063] 8 ug G-CSF mRNA koja ima sintetički 5'UTR (G-CSF; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5716; poliA rep od približno 140 nukleotida nije prikazan u sekvenci; 5' kapa, Cap1; potpuno modifikovana 1-metilpseudaundinom) ili G-CSF mRNA koja sadrži 5'UTR sa pet tandem ponavljanja sekvence od 18 nukleotida iz IRES gena GTX (GTX G-CSF; sekvenca mRNA prikazana u SEQ ID NO: 5758 (tabela 62); poliA rep od približno 140 nukleotida koji nije prikazan u sekvenci; 5' kapa, Cap1; potpuno modifikovan sa 1-metilpseudaundinom) za tretman 3 miša je razblažen sterilnim DMEM-om bez seruma (Life Technologies) da bi se dobila ukupna zapremina od 200ul. Ukupno 8 ul lipofektamina 2000 (LifeTechnologies, 11668019) za tretman 3 miša je razblaženo sterilnim DMEM-om bez seruma (LifeTechnologies, Grand Island, NI; 11965-118) da bi se dobila ukupna zapremina od 200 ul. Posle 5 minuta inkubacije, dva rastvora su kombinovana i pažljivo pomešana pipetom. Posle 20 minuta formiranje lipopleksa mRNA-lipofektamin 2000 je završeno. Rastvor lipopleksa je prebačen u sterilni špric od 1 ml (BD Falcon) sa iglom za injekciju od 27 gejdža (BD SafetyGlide insulinski špric od 0.3 mL sa BD trajno pričvršćenom iglom od 29 G × 1⁄2 inča (kataloški br.305935)). Balb/C miševi su stavljeni pod toplotnu lampu na 5 minuta pre intravenske injekcije od 100 ul u repnu venu koja je sadržala 2 ug lipopleksirane mRNA. Miševi su anestezirani 6 sati nakon injekcije i uzeta im je krv za sakupljanje seruma srčanom punkcijom. Uzorci seruma su zatim rađeni na G-CSF ELISA (katalog R&D sistema #SCS50) i rezultati su prikazani u tabeli 67. G-CSF mRNA koja ima pet tandem ponavljanja sekvence od 18 nukleotida iz IRES gena GTX imala je viši nivo ekspresije G-CSF na 6 sati u poređenju sa G-CSF koji ima sintetički UTR.

1

Tabela 67. Ekspresija GTX G-CSF in vivo

11

Claims (16)

Patentni zahtevi

1. Formulacija lipidnih nanočestica mRNA za ciljanu ekspresiju polipeptida od interesa u specifičnim tipovima ćelija, gde navedena mRNA sadrži

(a) 5' netranslatirani region

(b) region povezanih nukleozida koji kodira polipeptid od interesa;

(c) 3' netranslatirani region koji sadrži najmanje jedno mesto vezivanja microRNA, za microRNA eksprimiranu u specifičnom tipu ćelija, tako da ekspresija mRNA može da bude smanjena, pri čemu mRNA predstavlja ciljni molekul koji podleže degradaciji ili smanjenju translacije u prisustvu microRNA; i

(d) 3' repni region povezanih nukleozida,

pri čemu je uracil ili uridin u mRNA zamenjen do 100% modifikovanim uracilom, ili modifikovanim uridinom, redom.

2. Formulacija lipidnih nanočestica prema patentnom zahtevu 1, naznačena time, što bilo koji od regiona (a) - (d) u patentnom zahtevu 1 sadrži najmanje jedan analog pseudouridina,

pri čemu je opciono analog pseudouridina 1-metilpseudouridin, u kom slučaju mRNA opciono dodatno sadrži modifikovani nukleozid 5-metilcitidin.

3. Formulacija lipidnih nanočestica prema patentnom zahtevu 1, naznačena time, što najmanje jedan region mRNA ima optimizovane kodone, pri čemu opciono region povezanih nukleozida koji kodira navedeni polipeptid od interesa ima optimizovane kodone.

4. Formulacija lipidnih nanočestica prema patentnom zahtevu 1, naznačena time, što je 5' UTR nativni 5'UTR kodiranog polipeptida.

5. Formulacija lipidnih nanočestica prema patentnom zahtevu 1, naznačena time, što 5'UTR sadrži sekvencu za inicijaciju translacije odabranu iz grupe koja se sastoji od Kozak sekvence i unutrašnjeg mesta za ulazak u ribozom (IRES).

6. Formulacija lipidnih nanočestica prema patentnom zahtevu 1, naznačena time, što je 5'UTR strukturirana UTR.

7. Formulacija lipidnih nanočestica prema patentnom zahtevu 1, koja sadrži najmanje jednu strukturu 5' kape, pri čemu je opciono najmanje jedna struktura 5' kape odabrana iz grupe koja se sastoji od Cap0, Cap1, ARCA, inozina, N1-metil-guanozina, 2'fluoro-guanozina, 7-deazaguanozina, 8-okso-guanozina, 2-amino-guanozina, LNA-guanozina, 2-azido-guanozina, Cap2, Cap4, i CAP-003 - CAP-225.

8. Formulacija lipidnih nanočestica prema patentnom zahtevu 1, naznačena time, što je najmanje jedno mesto vezivanja microRNA za microRNA koja je specifična za imunske ćelije,

pri čemu je opciono microRNA koja je specifična za imunske ćelije odabrana iz grupe koja se sastoji od miR-122, miR-142-3p, miR-142-5p, miR-146a i miR-146b.

9. Formulacija lipidnih nanočestica prema patentnom zahtevu 1, naznačena time što 3' repni region povezanih nukleozida dodatno sadrži nukleozid za terminaciju lanca,

pri čemu je opciono nukleozid za terminaciju lanca odabran iz grupe koja se sastoji od 3'-dezoksiadenozina (kordicepina), 3'-dezoksiuridina, 3'-dezoksicitozina, 3'-dezoksiguanozina, 3'-dezoksitimina, 2',3'-didezoksinukleozida, 2',3'- didezoksiadenozina, 2',3'-didezoksiuridina, 2',3'-didezoksicitozina, 2',3'- didezoksiguanozina, 2',3'-didezoksitimina, 2'-dezoksinukleozida, i -O-metilnukleozida.

10. Formulacija lipidnih nanočestica prema patentnom zahtevu 1, naznačena time, što 3' repni region sadrži drška petlja sekvencu.

11. Formulacija lipidnih nanočestica prema patentnom zahtevu 1, naznačena time, što 5'UTR sadrži najmanje jednu sekvencu enhenserskog elementa translacije (TEE).

12. Formulacija lipidnih nanočestica prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačena time, što je najmanje jedno mesto vezivanja microRNA za miR-142-3p.

13. Formulacija lipidnih nanočestica prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačena time, što mRNA sadrži najmanje dva mesta vezivanja microRNA.

14. Formulacija lipidnih nanočestica prema patentnom zahtevu 13, naznačena time, što su mesta vezivanja microRNA ista.

15. Formulacija lipidnih nanočestica prema patentnom zahtevu 13, naznačena time, što su mesta vezivanja microRNA različita.

16. Formulacija lipidnih nanočestica mRNA, kako je definisana u bilo kom od patentnih zahteva 1-15, za upotrebu u terapeutskom postupku, pri čemu se ekspresija mRNA usmerava u specifične tipove ćelija.

1