ES2427646T5

ES2427646T5 - Anticuerpos monoclonales humanos contra muerte programada 1 (PD1) y métodos para el tratamiento del cáncer mediante el uso de anticuerpos anti-PD-1 solos o combinados con otros agentes inmunoterapéuticos

Info

Publication number: ES2427646T5
Application number: ES09013687.0T
Authority: ES
Inventors: Alan J. Korman; Mohan Srinivasan; Changyu Wang; Mark J. Selby; Bing Chen; Josephine M. Cardarelli; Haichun Huang
Original assignee: Ono Pharmaceutical Co Ltd; Medarex LLC
Current assignee: Ono Pharmaceutical Co Ltd; ER Squibb and Sons LLC
Priority date: 2005-05-09
Filing date: 2006-05-02
Publication date: 2017-08-22
Anticipated expiration: 2026-05-02
Also published as: EP2418278A2; SI2161336T1; TW200716743A; DK2161336T5; KR101339628B1; HK1140793A1; RU2016133899A3; NO2018008I2; JP2006340714A; US20130133091A1; JP5872377B2; NO2018008I1; US8008449B2; BRPI0610235B8; EP2439272A2; IL208642A; FR15C0087I1; TWI379898B; US20140294852A1; EP1896582A4

Description

Anticuerpos monoclonales humanos contra muerte programada 1 (PD1) y métodos para el tratamiento delcáncer mediante el uso de anticuerpos anti-PD-1 solos o combinados con otros agentes inmunoterapéuticos

Campo técnico

La presente invención se refiere en general a la inmunoterapia en el tratamiento de enfermedades humanas y la reducción de los eventos adversos relacionados con las mismas. Más específicamente, la presente invención se refiere a anticuerpos anti-PD-1 y al uso de los anticuerpos y de inmunoterapia combinada, incluyendo la combinación de anticuerpos anti-CTLA-4 y anti-PD-1, para tratar el cáncer y/o para disminuir la incidencia o la magnitud de los eventos adversos relacionados con el tratamiento con dichos anticuerpos individualmente.

Antecedentes de la invención

La proteína Muerte Programada 1 (PD-1) es un miembro inhibidor de la familia de receptores CD28, que también incluye CD28, CTLA-4, ICOS y BTLA. La PD-1 se expresa en células B activadas, células T, y células mieloides (Agata et al, supra.; Okazaki et al. (2002) Curr. Opin. Immunol. 14: 391779-82; Bennett et al (2003) J Immunol 170:711-8). Los miembros iniciales de la familia, CD28 e ICOS, fueron descubiertos por los efectos funcionales en el aumento de la proliferación de células T después de la adición de anticuerpos monoclonales (Hutloff et al. (1999) Nature 397:263-266; Hansen et al. (1980) 10:247-260 Inmunogenics). La PD-1 fue descubierta a través del escrutinio de la expresión diferencial en células apoptóticas (Ishida et al. (1992) EMBO J. 11:3887-95). Los otros miembros de la familia, CTLA-4, y BTLA se descubrieron a través del escrutinio de la expresión diferencial en linfocitos T citotóxicos y células TH1, respectivamente. CD28, ICOS y CTLA-4 tienen un residuo de cisteína desapareado que permite la homodimerización. En contraste, se sugiere que PD-1 existe como un monómero, que carece del residuo de cisteína no apareado característico en otros miembros de la familia CD28.

El gen de PD-1 es una proteína transmembrana de tipo I de 55 kDa que es parte de la superfamilia de genes de Ig (Agata et al. (1996) Int. Immunol 8:765-72). La PD-1 contiene un inmunoreceptor con motivo inhibidor basado en tirosina proximal a la membrana (ITIM) y un motivo de activación "switch" basado en tirosina distal a la membrana (ITSM) (Thomas, M.L. (1995) J. Exp. Med. 181:1953-6; Vivier, E y Daeron, M (1997) Immunol Today 18:286-91). Aunque estructuralmente similar a CTLA-4, PD-1 carece del motivo MYPPPY que es crítico para la unión de B7-1 y B7-2. Se han identificado dos ligandos para PD-1, PD-L1 y PD-L2, que se ha demostrado que regulan a la baja la activación de células T tras la unión a PD-1 (Freeman et al. (2000) J. Exp. Med. 192:1027-34; Latchman et al. (2001) Nat. Immunol 2:261-8; Carter et al. (2002) Eur J Immunol 32:63443). Tanto PD-L1 como PD-L2 son homólogos de B7 que se unen a PD-1, pero no se unen a otros miembros de la familia CD28. Un ligando de PD-1, PD-L1 es abundante en una variedad de cánceres humanos (Dong et al. (2002) Nat. Med 8:787-9). La interacción entre PD-1 y PD-L1 da como resultado una disminución de los linfocitos infiltrantes de tumores, una disminución en la proliferación mediada por el receptor de células T, y la evasión inmunitaria de las células cancerosas (Dong et al. (2003) J. Mol. Med. 81:281-7; Blank et al. (2005) Cancer Immunol. Immunother. 54:307-314; Konishi et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10:5094-100). La inmunosupresión puede ser revertida mediante la inhibición de la interacción local de PD-1 con PD-L1, y el efecto es aditivo cuando la interacción de PD-1 con PD-L2 está también bloqueada (Iwai et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:12293-7; Brown et al. (2003) J. Immunol. 170:1257-66).

La PD-1 es un miembro de inhibidor de la familia CD28 expresado en células B activadas, células T, y células mieloides (Agata et al, supra.; Okazaki et al. (2002) Curr Opin Immunol 14: 391779-82; Bennett et al. (2003) J Immunol 170:711-8). Los animales carentes de PD-1 desarrollan diversos fenotipos autoinmunes, incluyendo miocardiopatía autoinmune y un síndrome de tipo lupus con artritis y nefritis (Nishimura et al. (1999) Inmmunity 11:141-51; Nshimura et al. (2001) Science 291:319-22). Además, se ha encontrado que PD-1 desempeña un papel en la encefalomielitis autoinmune, el lupus eritematoso generalizado, la enfermedad de injerto contra anfitrión (EICA), la diabetes de tipo I, y la artritis reumatoide (Salama et al. (2003) J. Exp. Med. 198:71-78; Prokunina y Alarcón-Riquelme (2004) Hum Mol Genet 13:R143 ; Nielsen et al. (2004) Lupus 13:510). En una línea de tumor de células B murina, se ha demostrado que el ITSM de PD-1 es esencial para bloquear el flujo de Ca2+ mediado por BCR y la fosforilación de tirosina de las moléculas efectoras aguas abajo (Okazaki et al. (2001) PNAS 98:13866-71).

En consecuencia, se desean agentes que reconozcan PD-1, y métodos de uso de tales agentes.

Descripción de la invención

La presente invención proporciona anticuerpos monoclonales aislados, en particular anticuerpos monoclonales humanos, que se unen a PD-1 y que exhiben numerosas propiedades deseables. Estas propiedades incluyen, por ejemplo, unión de alta afinidad a PD-1 humana, pero con carencia de reactividad cruzada sustancial con cualquiera de CD28, CTLA-4 o ICOS humanas. Aún más, se ha demostrado que los anticuerpos de la invención modulan la respuesta inmune. Los anticuerpos se utilizan para inhibir el crecimiento de las células tumorales in vivo.

Por lo tanto, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, que comprende: a) una región variable de la cadena pesada que comprende los aminoácidos que tienen la secuencia mostrada en el SEC ID NO: 4; y b) una región variable de la cadena ligera que comprende los aminoácidos que tienen la secuencia mostrada en el SEC ID NO: 11;

en donde el anticuerpo se une específicamente a la proteína Muerte Programada 1 (PD-1) humana.

El anticuerpo es un anticuerpo humano.

Preferiblemente, el anticuerpo inhibe la supresión de las células CD25-T CD4+ por las células T reguladoras. El anticuerpo puede mejorar la respuesta de memoria específica de antígeno a un tumor o un patógeno o puede conferir una inmunidad persistente a la recaída del tumor. El anticuerpo puede tener un isotipo IgG4, que opcionalmente no tiene ni actividad ADCC ni actividad CDC.

Los anticuerpos de la invención son, por ejemplo, anticuerpos completos, por ejemplo de un isotipo IgG1 o IgG4.

La invención también proporciona un producto inmunoconjugado que comprende un anticuerpo de la invención, ligado a un agente terapéutico, tal como una citotoxina o un isótopo radiactivo. La invención también proporciona una molécula biespecífica que comprende un anticuerpo, de la invención, unida a un segundo radical funcional que tiene una especificidad de unión diferente que dicho anticuerpo.

También se proporcionan composiciones que comprenden un anticuerpo, o producto inmunoconjugado o molécula biespecífica de la invención, y un portador farmacéuticamente aceptable.

Se pueden proporcionar un anticuerpo de la invención para su uso en un método para modular una respuesta inmunitaria en un sujeto. Típicamente, el método comprende administrar al sujeto el anticuerpo, de la invención de tal manera que se module la respuesta inmunitaria en el sujeto. Preferiblemente, el anticuerpo de la invención potencia, estimula o aumenta la respuesta inmunitaria en el sujeto.

Un anticuerpo de la invención también se puede proporcionar para su uso en un método para inhibir el crecimiento de células tumorales en un sujeto. Típicamente, el método comprende administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo. Se pueden utilizar otros anticuerpos anti-PD-1 combinados con un anticuerpo anti-PD-1 de la invención. Por ejemplo, se puede utilizar un anticuerpo anti-PD-1 quimérico, humanizado

o completamente humano utilizar en el método para inhibir el crecimiento del tumor.

Se puede proporcionar adicionalmente un anticuerpo de la invención para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad infecciosa en un sujeto. Típicamente, el método comprende administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo. Se pueden usar otros anticuerpos anti-PD-1 combinados con un anticuerpo anti-PD-1 de la invención. Por ejemplo, se puede utilizar un anticuerpo anti-PD-1 quimérico, humanizado o completamente humano en el método de tratamiento de una enfermedad infecciosa.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1A muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 57) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 1) de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 17D8. Se delinean las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 15), CDR2 (SEQ ID NO: 22) y CDR3 (SEC ID NO: 29) y se indican las derivaciones de la línea germinal V, D y J. La Figura 1B muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 64) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 8) de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 17D8. Se delinean las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 36), CDR2 (SEQ ID NO: 43) y CDR3 (SEC ID NO: 50) y se indican las derivaciones de la línea germinal V y J. La Figura 2A muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 58) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 2D3. Se delinean las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 16), CDR2 (SEQ ID NO: 23) y CDR3 (SEC ID NO: 30) y se indican las derivaciones de la línea germinal V y J. La Figura 2B muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 65) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 9) de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 2D3. Se delinean las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 37), CDR2 (SEQ ID NO: 44) y CDR3 (SEC ID NO: 51) y se indican las derivaciones de la línea germinal V y J. La Figura 3A muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 59) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 3) de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 4H1. Se delinean las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 17), CDR2 (SEQ ID NO: 24) y CDR3 (SEC ID NO: 31) y se indican las derivaciones de la línea germinal V y J.

La Figura 3B muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 66) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 10) de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 4H1. Se delinean las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 38), CDR2 (SEQ ID NO: 45) CDR3 (SEC ID NO: 52) y se indican las derivaciones de la línea germinal V yJ. La Figura 4A muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 60) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 4) de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 5C4. Se delinean las regiones CDR1 (SEC ID NO: 18), CDR2 (SEQ ID NO: 25) y CDR3 (SEC ID NO: 32) y se indican las derivaciones de la línea germinal V y J. La Figura 4B muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 67) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 11) de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 5C4. Se delinean las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 39), CDR2 (SEQ ID NO: 46) y CDR3 (SEC ID NO: 53) y se indican las derivaciones de la línea germinal V y J. La Figura 5A muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 61) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 5) de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 4A11. Se delinean las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 19), CDR2 (SEQ ID NO: 26) CDR3 (SEC ID NO: 33) y se indican las derivaciones de la línea germinal V yJ. La Figura 5B muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 68) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 12) de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 4A11. Se delinean las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 40), CDR2 (SEQ ID NO: 47) y CDR3 (SEC ID NO: 54) y se indican las derivaciones de la línea germinal V y J. La Figura 6A muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 62) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 6) de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 7D3. Se delinean las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 20), CDR2 (SEQ ID NO: 27) y CDR3 (SEC ID NO: 34) y se indican las derivaciones de la línea germinal V y J. La Figura 6B muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 69) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 13) de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 7D3. Se delinean las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 41), CDR2 (SEQ ID NO: 48) y CDR3 (SEC ID NO: 55) y se indican las derivaciones de la línea germinal V y J. La Figura 7A muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 63) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 7) de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 5F4. Se delinean las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 21), CDR2 (SEQ ID NO: 28) y CDR3 (SEC ID NO: 35) y se indican las derivaciones de la línea germinal V y J. La Figura 7B muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 70) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 14) de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 5F4. Se delinean las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 42), CDR2 (SEQ ID NO: 49) y CDR3 (SEC ID NO: 56) y se indican las derivaciones de la línea germinal V y J. La Figura 8 muestra el alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de 17D8, 2D3, 4H1, 5C4 y 7D3 con la secuencia de aminoácidos 3-33 de VH de la línea germinal humana (SEQ ID NO: 71). La Figura 9 muestra el alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de 17D8, 2D3 y 7D3 con la secuencia de aminoácidos L6 de Vk de la línea germinal humana (SEQ ID NO: 73). La Figura 10 muestra el alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de 4H1 y 5C4 con la secuencia de aminoácidos L6 de Vk de la línea germinal humana (SEQ ID NO: 73). La Figura 11 muestra el alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de 4A11 y 5F4 con la secuencia de aminoácidos 4-39 de VH de la línea germinal humana (SEQ ID NO: 72). La Figura 12 muestra el alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de 4A11 y 5F4 con la secuencia de aminoácidos L15 de Vk de la línea germinal humana (SEQ ID NO: 74). Las Figuras 13A-13B muestran los resultados de los experimentos de citometría de flujo que demuestran que los anticuerpos monoclonales humanos 5C4 y 4H1, dirigidos contra PD-1 humana, se unen la superficie celular de las células CHO transfectadas con PD-1 completa humana. La Figura 13A muestra el gráfico de citometría de flujo para 5C4. La Figura 13B muestra el gráfico de citometría de flujo para 4H1. Línea fina representa la unión a las células CHO y la línea gruesa representa la unión a las células CHO hPD-1. La Figura 14 muestra un gráfico que demuestra que los anticuerpos monoclonales humanos 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, y 4A11, dirigidos contra PD-1 humana, se unen específicamente a PD-1, y no a otros miembros de la familia CD28. Las Figuras 15A-15C muestran los resultados de los experimentos de citometría de flujo que demuestran que los anticuerpos monoclonales humanos 4H1 y 5C4, dirigidos contra PD-1 humana, se unen a PD-1 en la superficie celular. La Figura 15A muestra la unión a las células T humanas activadas. La Figura 15B muestra la unión a células T de mono cynomolgus. La Figura 15C muestra la unión a células CHO transfectadas que expresan PD-1. Las Figuras 16A-16C muestran los resultados de experimentos que demuestran que los anticuerpos monoclonales humanos contra PD-1 humana promueven la proliferación de células T, la secreción de IFN-gamma y la secreción de IL-2 en un análisis mixto de reacción de linfocitos. La Figura 16A es un diagrama de barras que muestra la proliferación de células T dependiente de la concentración; la Figura 16B es un diagrama de barras que muestra la secreción de IFN-gamma dependiente de la concentración; la Figura 16C es un diagrama de barras que muestra la secreción de IL-2 dependiente de la concentración.

Las Figuras 17A-17B muestran los resultados de los experimentos de citometría de flujo que demuestran que los anticuerpos monoclonales humanos contra PD-1 humana bloquean la unión de PD-L1 y PD-L2 a las células transfectadas CHO que expresan PD-1. La Figura 17A es un gráfico que muestra la inhibición de la unión de PD-L1; La Figura 17B es un gráfico que muestra la inhibición de la unión de PD-L2. La Figura 18 muestra los resultados de los experimentos de citometría de flujo que demuestran que los anticuerpos monoclonales humanos contra PD-1 humana no promueven la apoptosis de células T. La Figura 19 muestra los resultados de experimentos que demuestran que los HuMAbs anti-PD-1 tienen un efecto dependiente de la concentración en la secreción de IFN gamma por PBMC de donantes positivos a CMV cuando las PBMC se estimularon con un producto lisado de CMV y anti-PD-1. La Figura 20 muestra los resultados de experimentos de crecimiento de tumores en un sistema modelo de ratón que demuestran que el tratamiento in vivo de tumores de ratón con anticuerpos anti-PD-1 inhibe el crecimiento de tumores. Las Figuras 21A a 21D muestran el volumen del tumor a lo largo del tiempo en ratones individuales a los que se implantaron células de tumor de colon MC38 (PD-L1-) y el mismo día se trataron con una de las siguientes terapias:

(A) IgG de ratón (control), (B) anticuerpo anti-CTLA-4, (C) anticuerpo anti-PD-1, y (D) anticuerpos anti-CTLA-4 y anticuerpos anti-PD-1. Los ratones recibieron posteriores tratamientos con anticuerpos los días 3, 6 y 10, como se describe en el Ejemplo 13 y el volumen tumoral se controló durante 60 días. La Figura 22 muestra el volumen medio del tumor de los ratones mostrados en la Figura 21. La Figura 23 muestra el volumen medio del tumor de los ratones mostrados en la Figura 21. Las Figuras 24A a 24D muestran el volumen del tumor a lo largo del tiempo en ratones individuales a los que se implantaron células de tumor de colon MC38 (PD-L1-) y una semana después se trataron con una de las siguientes terapias: (A) IgG de ratón (control), (B) anticuerpo anti-CTLA-4, (C) anticuerpo anti-PD-1, y (D) anticuerpo anti-CTLA4 y anticuerpo anti-PD-1. El volumen del tumor en el primer día del tratamiento fue de aproximadamente 315 mm3. Los ratones recibieron posteriores tratamientos con anticuerpos los días 3, 6 y 10, como se describe en el Ejemplo

14. La Figura 25 muestra el volumen medio del tumor de los ratones mostrados en la Figura 24. La Figura 26 muestra el volumen medio del tumor de los ratones mostrados en la Figura 24. La Figura 27 muestra el volumen medio del tumor a lo largo del tiempo en ratones individuales a los que se implantaron células de tumor de colon MC38 (PD-L1-) (Día -7) y a continuación se trataron los días 0, 3, 6 y 10 después de la implantación (como se describe en el Ejemplo 15) con una de las siguientes terapias: (A) IgG de ratón como control (20 mg/kg, X20) (B) anticuerpo anti-PD-1 (10 mg/kg) e IgG de ratón (10 mg/kg) (P10X10), (C) anticuerpo anti-CTLA-4 (10 mg/kg) e IgG de ratón (10 mg/kg) (C10X10), (D) anticuerpo anti-CTLA-4 y anticuerpo anti-PD-1 (10 mg/kg cada uno) (C10P10), (E) anticuerpo anti-CTLA-4 y anticuerpo anti-PD-1 (3 mg/kg cada uno) (C3P3), y (F) anticuerpo anti-CTLA-4 y anticuerpo anti-PD-1 (1 mg/kg cada uno) (C1P1). Dos grupos de ratones se trataron con cada anticuerpo sucesivamente de la siguiente manera: (G) anticuerpo anti-CTLA-4 (10 mg/kg, día 0), anticuerpo anti-CTLA-4 (10 mg/kg, día 3), anticuerpo anti-PD-1 (10 mg/kg, días 6), y anticuerpo anti-PD-1 (10 mg/kg, día 10) (C10C10P10P10); y (H) anticuerpo anti-PD-1 (10 mg/kg, día 0), anticuerpo anti-PD-1 (10 mg/kg, día 3), anticuerpo antiCTLA-4 (10 mg/kg, día 6), y anticuerpo anti-CTLA-4 (10 mg/kg, día 10) (10 mg/kg, día 10) (P10P10C10C10). La Figura 28 muestra el volumen medio del tumor de los ratones mostrados en la Figura 27. La Figura 29 muestra el volumen medio del tumor de los ratones mostrados en la Figura 27. Las Figuras 30A a 30F muestran el volumen del tumor a lo largo del tiempo en ratones individuales a los que se implantaron células de fibrosarcoma SA1/N (PD-L1-) y un día después se trataron con una de las siguientes terapias:

(A) PBS (portador de control), (B) IgG de ratón (anticuerpo de control, 10 mg/kg), (C) anticuerpo anti-PD-1 (10 mg/kg), (D) anticuerpo anti-CTLA-4 (10 mg/kg), (E) anticuerpo anti-CTLA-4 (0,2 mg/kg), y (F) anticuerpo anti-PD-1 (10 mg/kg) y anticuerpo anti-CTLA-4 (0,2 mg/kg). Los ratones recibieron tratamientos con anticuerpos posteriores los días 4, 7 y 11, como se describe en el Ejemplo 16 y el volumen tumoral se controló durante 41 días. La Figura 31 muestra el volumen medio del tumor de los ratones mostrados en la Figura 29. La Figura 32 muestra el volumen medio del tumor de los ratones mostrados en la Figura 29. Las Figuras 33A a 33J muestran el volumen del tumor a lo largo del tiempo en ratones individuales a los que se implantaron células de fibrosarcoma SAl/N (PD-L1-) y a continuación se trataron los días 7, 10, 13 y 17 después de la implantación (como se describe en el Ejemplo 17) con uno de las siguientes terapias: (A) PBS (portador de control), (B) IgG de ratón (anticuerpo de control, 10 mg/kg), (C) anticuerpo anti-CTLA-4 (0,25 mg/kg), (D) anticuerpo anti-CTLA-4 (0,5 mg/kg), (E) anticuerpo anti-CTLA-4 (5 mg/kg ), (F) anticuerpo anti-PD-1 (3 mg/kg), (G) anticuerpo anti-PD-1 (10 mg/kg), (H) anticuerpo anti-PD-1 (10 mg/kg) y anticuerpo anti-CTLA-4 (0,25 mg/kg), (I) anticuerpo antiPD-1 (10 mg/kg) y anticuerpo anti-CTLA-4 (0,5 mg/kg), y (F) anticuerpo anti-PD-1 (3 mg/kg) y anticuerpo anti-CTLA4 (0,5 mg/kg). El volumen del tumor en el primer día del tratamiento fue de aproximadamente 110 mm3. La Figura 34 muestra el volumen medio del tumor de los ratones mostrados en la Figura 33. La Figura 35 muestra el volumen medio del tumor de los ratones mostrados en la Figura 33. Las Figuras 36A y 36B muestran el volumen del tumor a lo largo del tiempo en ratones individuales a los que se implantaron células de fibrosarcoma Sal/N (PD-L1-) y a continuación se trataron los días 10, 13, 16 y 19 después de la implantación (como se describe en el Ejemplo 17) con uno de los siguientes tratamientos: (A) IgG de ratón (anticuerpo de control, 10 mg/kg) o (B) anticuerpo anti-PD-1 (10 mg/kg) y anticuerpo anti-CTLA-4 (1 mg/kg). El volumen del tumor en el primer día de tratamiento fue de aproximadamente 250 mm3. La Figura 37 muestra el volumen medio del tumor de los ratones mostrados en la Figura 36.

La Figura 38 muestra el volumen medio del tumor de los ratones mostrados en la Figura 36. La Figura 39 muestra la media y la mediana del porcentaje de inhibición del tumor calculadas a partir de los volúmenes de los tumores que se muestran en las Figuras 33 y 36. Las Figuras 40A a 40D muestran el volumen tumoral en ratones BALB/c a los que se implantaron por vía subcutánea células de adenocarcinoma renal RENCA (PD-L1+) (Murphy y Hrushesky (1973) J. Natl. Cancer Res. 50:1013-1025) (día -12) y a continuación se trataron por vía intraperitoneal los días 0, 3, 6 y 9 después de la implantación con una de las siguientes terapias: (A) IgG de ratón (anticuerpo de control, 20 mg/kg), (B) anticuerpo anti-PD-1 (10 mg/kg), (C) anticuerpo anti-CTLA-4 (10 mg/kg), y (D) anticuerpo anti-PD-1 (10 mg/kg) combinado con anticuerpo anti-CTLA-4 (10 mg/kg). El volumen del tumor en el primer día del tratamiento fue de aproximadamente 115 mm3. La Figura 41 muestra que la unión de la proteína de fusión PD-L2-Fc de ratón a PD-1 (mPD-1) de ratón es bloqueada por anticuerpo 4H2 anti-mPD-1 de una manera dependiente de la dosis. La unión se detecta midiendo la fluorescencia de FITC marcado con anti-IgG de rata de burro mediante ELISA. Cuanto mayor sea la IMF (intensidad media de fluorescencia) mayor será la unión. La Figura 42 muestra las curvas de unión de anticuerpos anti-mPD-1 a la proteína de fusión mPD-1-Fc inmovilizada mediante ELISA. La Figura 43 muestra las curvas de unión de anticuerpo 4H2.B3 anti-mPD-1 de rata a células CHO que expresan mPD-1. La unión se detectó con anti-IgG de rata de burro, conjugado con FITC y se midió mediante FACS (IMF). La Figura 44 muestra la curva de unión de la proteína de fusión mPD-L1-hFc a células CHO que expresan mPD-1 en presencia de concentraciones crecientes de anticuerpo 4H2.B3 anti-mPD-1. La unión se detectó con anti-IgG humana de cabra, se conjugó con FITC y se midió mediante FACS (IMF). La Figura 45 muestra las curvas de unión de anticuerpo 4H2.B3 anti-mPD-1 de rata a células CHO que expresan mPD-1, en comparación con el anticuerpo 4H2 anti-mPD-1 de rata:ratón quimérico. La Figura 46 muestra las curvas de unión de la proteína de fusión mPD-L1-hFc a células CHO que expresan mPD-1 en presencia de concentraciones crecientes de anticuerpo 4H2.B3 anti-mPD-1 de rata o anticuerpo 4H2 anti-mPD-1 de rata:ratón quimérico. La Figura 47 muestra el volumen medio del tumor de ratones libres de tumores previamente tratados con anticuerpo anti-PD1 y sensibilizados de nuevo con células de fibrosarcoma Sal/N (PD-L1-). También se muestra el volumen medio del tumor de los ratones no sometidos a tratamiento previo (control, no sensibilizados o tratados previamente) a los que se habían implantado células de fibrosarcoma Sal/N. La Figura 48 muestra el volumen del tumor a lo largo del tiempo en ratones individuales, que sobrevivieron libres de tumor después de la implantación de células de tumor de colon MC3 8 (PD-L1-) y el tratamiento con anticuerpo antiPD1 o una combinación de anticuerpo anti-PD1 con anticuerpo anti-CTLA-4), sensibilizados de nuevo con 10x más células de tumor de colon MC38 que el tratamiento inicial. También se muestra el volumen medio del tumor de los ratones no sometidos a tratamiento previo (control, no sensibilizados o tratados previamente) a los que se habían implantado células de tumor de colon MC38. La Figura 49 muestra el volumen medio del tumor de los ratones mostrados en la Figura 48. La Figura 50 muestra el volumen medio del tumor a lo largo del tiempo en ratones individuales a los que se habían implantado células de tumor de colon CT26. Las Figuras 51A-B muestran los resultados de experimentos que demuestran que los anticuerpos monoclonales humanos contra PD-1 humana promueven la proliferación de células T y la secreción de IFN-gamma en cultivos que contienen células T reguladoras. La Figura 50A es un diagrama de barras que muestra la proliferación de células T dependiente de la concentración utilizando HuMAb 5C4; la Figura 50B es un diagrama de barras que muestra la concentración dependiente de la secreción de IFN-gamma a partir de HuMAb 5C4. Las Figuras 52A-B muestran los resultados de experimentos que demuestran que los anticuerpos monoclonales humanos contra PD-1 humana promueven la proliferación de células T y la secreción de IFN-gamma en cultivos que contienen células T activadas. La Figura 51A es un diagrama de barras que muestra la proliferación de células T dependiente de la concentración utilizando HuMAb 5C4; la Figura 51B es un diagrama de barras que muestra la concentración dependiente de la secreción de IFN-gamma a partir de HuMAb 5C4. La Figura 53 muestra los resultados de un análisis de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) que demuestran que los anticuerpos anti-PD-1 monoclonales humanos destruyen las células T activadas humanas de una manera dependiente de la concentración de ADCC en relación con la región Fc del anticuerpo anti-PD-1. La Figura 54 muestra los resultados de un análisis de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) que demuestra que los anticuerpos anti-PD-1 monoclonales humanos no destruyen las células T activadas humanas en una CDC dependiente de la concentración.

Mejor modo dellevar a cabo la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales aislados, que se unen específicamente a PD-1. Los anticuerpos que se describen en este documento exhiben una o más propiedades funcionales deseables, tales como alta afinidad de unión a PD-1, carencia de reactividad cruzada con otros miembros de la familia CD28, capacidad de estimular la proliferación de células T, la secreción IFN-γ y/o de IL-2 en reacciones mixtas de linfocitos, capacidad para inhibir la unión de uno o más ligandos de PD-1 (p. ej., PD-L1 y/o PD-L2), capacidad de reacción cruzada con PD-1 de mono cynomolgus, capacidad de estimular respuestas de memoria específicas de antígeno, capacidad de

estimular respuestas de anticuerpos y/o capacidad de inhibir el crecimiento de células tumorales in vivo. Los anticuerpos de la invención pueden derivar de secuencias concretas de la línea germinal de la cadena pesada y ligera. Los anticuerpos comprenden en particular regiones CDR que comprenden secuencias concretas de aminoácidos. Más específicamente, los anticuerpos comprenden:

a) una CDR1 de la región variable de la cadena pesada que comprende los aminoácidos que tienen la

secuencia mostrada en el SEC ID NO: 18;

b) una CDR2 de la región variable de la cadena pesada que comprende los aminoácidos que tienen la

secuencia mostrada en el SEC ID NO: 25;

c) una CDR3 de la región variable de la cadena pesada que comprende los aminoácidos que tienen la

secuencia mostrada en el SEC ID NO: 32;

d) una CDR1 de la región variable de la cadena ligera que comprende los aminoácidos que tienen la secuencia

mostrada en el SEC ID NO: 39;

e) una CDR2 de la región variable de la cadena ligera que comprende los aminoácidos que tienen la secuencia

mostrada en el SEC ID NO: 46; y

f) una región variable de la cadena ligera que comprende CDR3 de aminoácidos que tienen la secuencia

mostrada en el SEC ID NO: 53.

Con el fin de que la presente invención pueda entenderse más fácilmente, se definen primero ciertos términos. Las definiciones adicionales se exponen a lo largo de la descripción detallada.

Los términos "Muerte Programada 1", "Muerte Celular Programada 1", "proteína PD-1", "PD-1," PD1", "PDCD1", "hPD-1" y "hPD-I" se utilizan indistintamente, e incluyen variantes, isoformas, homólogos de especie de PD-1 humana, y análogos que tienen al menos un epítopo común con PD-1. La secuencia completa de PD-1 se puede encontrar bajo el número de acceso GenBank U64863.

Los términos "antígeno-4 asociado a linfocitos T citotóxicos", "CTLA-4", "CTLA4", "antígeno CTLA-4" y "CD152" (véase, p. ej., Murata, Am. J. Pathol. (1999) 155:453-460) se utilizan indistintamente, e incluyen variantes, isoformas, homólogos de especie de CTLA-4 humano, y análogos que tienen al menos un epítopo común con CTLA-4 (véase,

p. ej., Balzano (1992) Int. J. Cancer Suppl. 7:28-32). La secuencia de ácido nucleico completa de CTLA-4 se puede encontrar bajo el Número de Acceso de GenBank L15006.

El término "respuesta inmunitaria" se refiere a la acción de, p. ej., linfocitos, células presentadoras de antígenos, células fagocíticas, granulocitos, y macromoléculas solubles producidas por las células anteriores o el hígado (incluyendo anticuerpos, citoquinas, y complemento) que da como resultado daño selectivo a, destrucción de, o eliminación del cuerpo humano de patógenos invasores, células o tejidos infectados con patógenos, células cancerosas, o, en casos de autoinmunidad o inflamación patológica, células o tejidos humanos normales.

Un "ruta de transducción de señal" se refiere a la relación bioquímica entre una variedad de moléculas de transducción de señales que desempeñan un papel en la transmisión de una señal a partir de una porción de una célula a otra porción de una célula. Según se utiliza en este documento, la frase "receptor de superficie celular" incluye, p. ej., moléculas y complejos de moléculas capaces de recibir una señal y de la transmisión de tal señal a través de la membrana plasmática de una célula. Un ejemplo de un "receptor de superficie celular" de la presente invención es el receptor de PD-1.

El término "anticuerpo" referido en la presente memoria incluye anticuerpos completos. Un "anticuerpo" se refiere a una glicoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por medio de enlaces disulfuro, o una porción de unión a antígeno de la misma. Cada cadena pesada está compuesta de una región variable de la cadena pesada (abreviada en la presente memoria como VH) y una región constante de la cadena pesada. La región constante de la cadena pesada está compuesta de tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera está compuesta de una región variable de la cadena ligera (abreviada en la presente memoria como VL) y una región constante de la cadena ligera. La región constante de la cadena ligera está compuesta de un dominio, CL. Las regiones VH y VL pueden subdividirse en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada VH y VL se compone de tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino al extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interacciona con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar la unión de la inmunoglobulina a tejidos anfitriones o factores, incluyendo varias células del sistema inmunitario (p. ej., células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema del complemento clásico.

Se pretende que un "anticuerpo aislado", según se utiliza en la presente memoria, haga referencia a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (p. ej., Un anticuerpo aislado que se une específicamente a PD-1 está sustancialmente libre de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos distintos de PD-1). Un anticuerpo aislado que se une específicamente a PD-1 puede

tener, sin embargo, reactividad cruzada con otros antígenos, tales como moléculas de PD-1 de otras especies. Por otra parte, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o agentes químicos.

Los términos "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal" según se utiliza en la presente memoria, se refieren a una preparación de moléculas de anticuerpo de composición molecular única. Una composición de anticuerpo monoclonal presenta una sola especificidad y afinidad de unión para un epítopo concreto.

Se pretende que el término "anticuerpo humano", según se utiliza en la presente memoria, incluya anticuerpos que tienen regiones variables en las que las regiones tanto marco como CDR deriven de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. La región constante también deriva de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (p. ej., mutaciones introducidas mediante mutagénesis aleatoria o específica de sitio in vitro o mediante mutación somática in vivo). Sin embargo, no se pretende que el término "anticuerpo humano", según se utiliza en la presente memoria, incluya anticuerpos en los que se hayan injertado secuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como ratón, en secuencias estructurales humanas.

El término "anticuerpo monoclonal humano" se refiere a anticuerpos que muestran una sola especificidad de unión que tienen regiones variables en las que las regiones tanto en marco como CDR derivan de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. En una realización, los anticuerpos monoclonales humanos son producidos por un hibridoma que incluye una célula B obtenida de un animal no humano transgénico, p. ej., un ratón transgénico, que tiene un genoma que comprende un transgén de la cadena pesada humana y un transgén de la cadena ligera fusionados a una célula inmortalizada.

El término "anticuerpo humano recombinante", según se utiliza en la presente memoria, incluye todos los anticuerpos humanos que son preparados, expresados, creados o aislados por medios recombinantes, tales como

(a) anticuerpos aislados de un animal (p. ej., un ratón) que es transgénico o transcromosómico para genes de inmunoglobulina humana o un hibridoma preparado de allí (descrito adicionalmente más adelante), (b) anticuerpos aislados de una célula anfitriona transformada para expresar el anticuerpo humano, p. ej., de un transfectoma, (c) anticuerpos aislados de una biblioteca combinatoria de anticuerpos humanos recombinantes, y (d) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique corte y empalme de las secuencias de genes de inmunoglobulinas humanas a otras secuencias de ADN. Tales anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables en las que las regiones marco y CDR derivan de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. En ciertas realizaciones, sin embargo, tales anticuerpos humanos recombinantes pueden ser sometidos a mutagénesis in vitro (o, cuando se utilice un animal transgénico para secuencias de Ig humana, mutagénesis somática in vivo) y por lo tanto las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque derivadas de y relacionadas con las secuencias VH y VL de la línea germinal humana, no pueden existir de forma natural en el repertorio de la línea germinal de anticuerpos humanos in vivo.

Según se utiliza en la presente memoria, "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpo (p. ej., IgM o IgG) que es codificada por los genes de la región constante de la cadena pesada.

Las frases "un anticuerpo que reconoce un antígeno" y "un anticuerpo específico para un antígeno" se utilizan en la presente memoria indistintamente con el término "un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno."

El término "derivados de anticuerpos humanos" se refiere a cualquier forma modificada del anticuerpo humano, p. ej., un producto conjugado de anticuerpo y otro agente o anticuerpo.

Se pretende que el término "anticuerpo humanizado" haga referencia a anticuerpos en los que secuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, han sido injertadas en secuencias marco humanas. Se pueden realizar otras modificaciones de regiones marco dentro de las secuencias marco humanas.

Se pretende que el término "anticuerpo quimérico" haga referencia a anticuerpos en los que las secuencias de la región variable deriven de una especie y las secuencias de la región constante deriven de otra especie, tal como un anticuerpo en donde las secuencias de región variable derivan de un anticuerpo de ratón y las secuencias de la región constante derivan de un anticuerpo humano.

Según se utiliza en la presente memoria, se pretende que un anticuerpo que "se une específicamente a PD-1 humana" haga referencia a un anticuerpo que se une a PD-1 humana con una KD de 1 x 10-7 M o menos, más preferiblemente 5 x 10-8 M o menos, más preferiblemente 1 x 10-8 M o menos, más preferiblemente 5 x 10-9 M o menos.

Se pretende que el término "Kasoc" o " Ka", según se utiliza en la presente memoria, haga referencia a la velocidad de asociación de una interacción anticuerpo-antígeno concreta, mientras que se pretende que el término "Kdis" o " Kd", según se utiliza en la presente memoria, haga referencia a la velocidad de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno concreta. Se pretende que el término "KD", según se utiliza en la presente memoria, haga referencia a la constante de disociación, que se obtiene a partir de la razón de Ka a Ka (es decir,, Kd/Ka) y se expresa como una concentración molar (M). Los valores KD para los anticuerpos se pueden determinar utilizando métodos bien establecidos en la técnica. Un método preferido para determinar la KD de un anticuerpo es mediante resonancia de plasmón superficial, preferentemente utilizando un sistema biosensor tal como un sistema Biacore®. Según se utiliza en la presente memoria, el término "alta afinidad" para un anticuerpo IgG se refiere a un anticuerpo que tiene una KD de 10-8 M o menos, más preferiblemente 10-9 M o menos y aún más preferiblemente 10-10 M o menos para un antígeno diana. Sin embargo, la unión de "alta afinidad" puede variar para otros isotipos de anticuerpos. Por ejemplo, unión de "alta afinidad" para un isotipo IgM: se refiere a un anticuerpo que tiene una KD de 10-7 M o menos, más preferiblemente 10-8 M o menos, incluso más preferiblemente 10-9 M o menos.

El término "tratamiento" o "terapia" se refiere a la administración de un agente activo con el propósito de curar, sanar, aliviar, calmar, alterar, remediar, corregir, mejorar, o afectar a una afección (p. ej., una enfermedad), los síntomas de la afección, o para prevenir o retrasar la aparición de los síntomas, las complicaciones, los indicios bioquímicos de una enfermedad, o de otro modo detener o inhibir aún más el desarrollo de la enfermedad, afección,

o trastorno de una manera estadísticamente significativa.

Un "evento adverso" (EA), según se utiliza en la presente memoria es cualquier signo desfavorable y generalmente no deseado, incluso no deseable, (incluyendo un hallazgo anormal de laboratorio), síntoma o enfermedad asociados con el uso de un tratamiento médico. Por ejemplo, un acontecimiento adverso puede estar asociada con la activación del sistema inmunitario o la expansión de las células del sistema inmunitario (p. ej., células T) en respuesta a un tratamiento. Un tratamiento médico puede tener uno o más EA asociados y cada EA puede tener el mismo o diferente nivel de gravedad. La referencia a los métodos susceptibles de "eventos adversos que alteran" significa un régimen de tratamiento que disminuye la incidencia y/o severidad de uno o más EA asociados con el uso de un régimen de tratamiento diferente.

Según se utiliza en la presente memoria, "enfermedad hiperproliferativa" se refiere a condiciones en las que el crecimiento celular se incrementa sobre los niveles normales. Por ejemplo, las enfermedades o trastornos hiperproliferativos incluyen enfermedades malignas (p. ej., cáncer de esófago, cáncer de colon, cáncer biliar) y enfermedades no malignas (p. ej., aterosclerosis, hiperplasia benigna, hipertrofia prostática benigna).

Según se utiliza en la presente memoria, "dosis subterapéutica" significa una dosis de un compuesto terapéutico (p. ej., un anticuerpo) que es menor que la dosis normal o típica del compuesto terapéutico cuando se administra solo para el tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa (p. ej., cáncer). Por ejemplo, una dosis subterapéutica de anticuerpo CTLA 4 es una dosis única del anticuerpo a menos de aproximadamente 3 mg/kg, es decir, la dosis conocida de anticuerpo anti-CTLA-4.

Se debe entender que el uso de la alternativa (p. ej., "o") significa uno, ambos, o cualquiera de las combinaciones de las alternativas. En la presente memoria, se debe entender que los artículos indefinidos "un", "uno" o "una" hacen referencia a "uno o más" de cualquiera de los componentes recitados o enumerados.

Según se utiliza en la presente memoria, "aproximadamente" o "que comprende esencialmente" significa dentro de un intervalo de error aceptable para el valor concreto determinado por un experto normal en la técnica, que dependerá en parte de cómo se mida o determine el valor, es decir, las limitaciones del sistema de medición. Por ejemplo, "aproximadamente" o "que comprende esencialmente" puede significar una desviación típica dentro de 1 o más de 1 por la práctica de la técnica. Alternativamente, "aproximadamente" o "que comprende esencialmente" puede significar un intervalo de hasta 20%. Por otra parte, en particular con respecto a los sistemas o procesos biológicos, los términos pueden significar hasta un orden de magnitud o hasta 5 veces un valor. Cuando se proporcionan valores concretos en la solicitud y en las reivindicaciones, a menos que se indique lo contrario, se debe suponer que el significado de "aproximadamente" o "que comprende esencialmente" está dentro de un margen de error aceptable para ese valor concreto.

Según se describe en la presente memoria, se debe entender que cualquier intervalo de concentración, intervalo de porcentaje, intervalo de razón o intervalo de números enteros incluye el valor de cualquier número entero dentro del intervalo citado y, cuando sea apropiado, fracciones del mismo (tales como una décima y una centésima de un número entero) , a menos que se indique lo contrario.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "sujeto" incluye cualquier animal humano o no humano. El término "animal no humano" incluye todos los vertebrados, p. ej., mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, caballos, vacas, pollos, anfibios, reptiles, etc. Excepto cuando se indique, los términos "paciente" o "sujeto" se utilizan indistintamente.

Varios aspectos de la invención se describen con más detalle en las siguientes subsecciones.

Anticuerpos anti-PD-1

Los anticuerpos de la invención se caracterizan por características o propiedades funcionales particulares de los anticuerpos. Los anticuerpos se unen específicamente a PD-1 (p. ej., se unen a PD-1 humana y pueden reaccionar de forma cruzada con PD-1 de otras especies, tales como mono cynomolgus). Un anticuerpo de la invención se une a PD-1 con alta afinidad, con una KD de 1 x 10-7 M o menos. Los anticuerpos anti-PD-1 que se describen en este documento exhiben preferiblemente una o más de las siguientes características:

(a): se une a PD-1 humana con una KD de 1 x 10-7 M o menos;

(b): no se une sustancialmente a CD28, CTLA-4 o ICOS humanos;

(c): aumenta la proliferación de células T en un análisis de reacción mixta de linfocitos (MLR);

(d): aumenta la producción de interferón-gamma en un análisis MLR;

(e): aumenta la secreción de IL-2 en un análisis MLR;

(f): se une a PD-1 humana y a PD-1de mono cynomolgus;

(g): inhibe la unión de PD-L1 y/o PD-L2 a PD-1;

(h): estimula las respuestas de memoria de antígenos específicos;

(i): estimula respuestas de anticuerpos;

(j): inhibe el crecimiento de células tumorales in vivo.

Los análisis convencionales para evaluar la capacidad de unión de los anticuerpos a PD-1 son conocidos en la técnica, incluyendo p. ej., ELISA, transferencias Western y RIA. Las cinéticas de unión (p. ej., afinidad de unión) de los anticuerpos también se puede evaluar mediante análisis convencionales conocidos en la técnica, tales como mediante análisis Biacore. Los análisis adecuados para la evaluación de cualquiera de las características descritas anteriormente se describen en detalle en los Ejemplos.

Anticuerpos monoclonales 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 y 5F4

Un anticuerpo preferido de la invención es el anticuerpo monoclonal humano 5C4. Ese anticuerpo y los anticuerpos monoclonales humanos 17D8, 2D3, 4H1, 4A11, 7D3 y 5F4 que no forman parte de la presente invención se aislaron y se caracterizan estructuralmente como se describe en los Ejemplos 1 y 2.

Las secuencias de aminoácidos de VH de 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 y 5F4 se muestran en los SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de VL de 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 y 5F4 se muestran en los SEQ ID NO: 8, 9, 10, 11, 12, 13 y 14, respectivamente.

Por lo tanto, se describen anticuerpos que comprenden las CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada y la cadena ligera, de 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 y 5F4. Las secuencias de aminoácidos de las CDR1 de VH de 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 y 5F4 se muestran en los SEQ ID NO: 15, 16, 17, 18, 19, 20 y 21, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de las CDR2 de VH de 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 y 5F4 se muestran en los SEQ ID NO: 22, 23, 24, 25, 26, 27 y 28, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de las CDR3 de VH de 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 y 5F4 se muestran en los SEQ ID NO: 29, 30, 31, 32, 33, 34 y 35, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de las CDR1 de Vk de 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 y 5F4 se muestran en los SEQ ID NO: 36, 37, 38, 39, 40, 41 y 42, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de las CDR2 de Vk de 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 y 5F4 se muestran en los SEQ ID NO: 43, 44, 45, 46, 47, 48 y 49, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de las CDR3 de Vk de 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 y 5F4 se muestran en los SEQ ID NO: 50, 51, 52, 53, 54, 55 y 56, respectivamente. Las regiones CDR están delineadas mediante el sistema de Kabat (Kabat, EA, et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos, Publicación NIH Núm. 91-3242)

Además de los anticuerpos de acuerdo con la invención, por lo tanto, también se describen anticuerpos que se unen específicamente PD-1, preferiblemente PD-1 humana, y que comprenden:

(a): una CDR1 de la región variable de la cadena pesada que comprende el SEQ ID NO: 15;

(b): una CDR2 de la región variable de la cadena pesada que comprende el SEQ ID NO: 22;

(c): una CDR3 de la región variable de la cadena pesada que comprende el SEC ID NO: 29;

(d): una CDR1 de la región variable de la cadena ligera que comprende el SEQ ID NO: 36;

(e): una CDR2 de la región variable de la cadena ligera que comprende el SEQ ID NO: 43; y

(f): una CDR3 de la región variable de la cadena ligera que comprende el SEC ID NO: 50; o

(a): una CDR1 de la región variable de la cadena pesada que comprende el SEC ID NO: 16;

(b): una CDR2 de la región variable de la cadena pesada que comprende el SEQ ID NO: 23;

(c): una CDR3 de la región variable de la cadena pesada que comprende el SEC ID NO: 30;

(d): una CDR1 de la región variable de la cadena ligera que comprende el SEQ ID NO: 37;

(e): una CDR2 de la región variable de la cadena ligera que comprende el SEQ ID NO: 44; y

(f): una CDR3 de la región variable de la cadena ligera que comprende el SEC ID NO: 51; o

(a): una CDR1 de la región variable de la cadena pesada que comprende el SEQ ID NO: 17;

(b): una CDR2 de la región variable de la cadena pesada que comprende el SEQ ID NO: 24;

(c): una CDR3 de la región variable de la cadena pesada que comprende el SEC ID NO: 31; 5 (d) una CDR1 de la región variable de la cadena ligera que comprende el SEQ ID NO: 38;

(e): una CDR2 de la región variable de la cadena ligera que comprende el SEQ ID NO: 45; y

(f): una CDR3 de la región variable de la cadena ligera que comprende el SEC ID NO: 52; o

(a): una CDR1 de la región variable de la cadena pesada que comprende el SEQ ID NO: 19;

(b): una CDR2 de la región variable de la cadena pesada que comprende el SEQ ID NO: 26; 10 (c) una CDR3 de la región variable de la cadena pesada que comprende el SEC ID NO: 33;

(d): una CDR1 de la región variable de la cadena ligera que comprende el SEQ ID NO: 40;

(e): una CDR2 de la región variable de la cadena ligera que comprende el SEQ ID NO: 47; y

(f): una CDR3 de la región variable de la cadena ligera que comprende el SEC ID NO: 54.

15 Anticuerpos que tienen secuencias particulares de la línea germinal

Los anticuerpos que se describen en este documento comprenden una región variable de la cadena pesada de un gen de inmunoglobulina de la cadena pesada de la línea germinal particular y/o una región variable de la cadena ligera de un gen de inmunoglobulina de la cadena ligera de la línea germinal particular.

20 Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal aislado descrito en este documento, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de la cadena pesada que es el producto de o deriva de un gen 3-33 de VH humano, en donde el anticuerpo se une específicamente a PD-1, preferiblemente a PD-1 humana. También se describe en este documento un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que

25 comprende una región variable de la cadena ligera que es el producto de o deriva de un gen L6 de VK humano, en donde el anticuerpo se une específicamente a PD-1, preferiblemente a PD-1 humana.

También se describe un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de la cadena pesada que es el producto de o deriva de un gen 4-39 de VH humano,

30 en donde el anticuerpo se une específicamente a PD-1, preferiblemente a PD-1 humana. También se describe un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de la cadena ligera que es el producto de o deriva de un gen L15 de VK humano, en donde el anticuerpo se une específicamente a PD-1, preferiblemente a PD-1 humana.

35 Por lo tanto, un anticuerpo que se une específicamente a PD-1 puede comprender:

(a): una región variable de la cadena pesada que es el producto de o derivada de un gen VH 3-33 o 4-39 humano (gen que codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en los SEC ID NO: 71 o 73, respectivamente); y

(b): una región variable de la cadena ligera que es el producto de o deriva de un gen L6 o L15 de VK humano (gen que codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en los SEC ID NO: 72 o 74, respectivamente).

40 Los ejemplos de los anticuerpos que tienen VH y VK de 3-33 de VH y L6 de VK, respectivamente, son 17D8, 2D3, 4H1, 5C4 y 7D3. Los ejemplos de los anticuerpos que tienen VH y VK de 4-39 de VH y L15 de VK, respectivamente, son 4A11 y 5F4.

45 Según se utiliza en la presente memoria, un anticuerpo humano comprende regiones variables de la cadena pesada

o ligera que es "el producto de" o "deriva de" una secuencia de la línea germinal particular, si las regiones variables del anticuerpo se obtienen a partir de un sistema que utiliza genes de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Tales sistemas incluyen la inmunización de un ratón transgénico que porta genes de inmunoglobulina humana con el antígeno de interés o el escrutinio de una biblioteca de genes de inmunoglobulina humana presentados sobre el fago 50 con el antígeno de interés. Un anticuerpo humano que es "el producto de" o "deriva de" una secuencia de inmunoglobulina de la línea germinal humana puede ser identificado como tal comparando la secuencia de aminoácidos del anticuerpo humano con las secuencias de aminoácidos de las inmunoglobulinas de la línea germinal humana y seleccionando la secuencia de inmunoglobulina de la línea germinal humana que tiene la secuencia más próxima (es decir, el mayor % de identidad) con la secuencia del anticuerpo humano. Un anticuerpo 55 humano que es "el producto de" o "deriva de" una secuencia de inmunoglobulina de la línea germinal humana particular puede contener diferencias de aminoácidos en comparación con la secuencia de la línea germinal, debido a, p. ej., mutaciones somáticas de origen natural o la introducción intencionada de mutación dirigida al sitio. Sin embargo, un anticuerpo humano seleccionado es normalmente al menos 90% idéntico en la secuencia de aminoácidos a una secuencia de aminoácidos codificada por un gen de inmunoglobulina de la línea germinal

60 humana y contiene residuos de aminoácidos que identifican el anticuerpo humano como humano cuando se compara con las secuencias de aminoácido de inmunoglobulina de la línea germinal de otras especies (p. ej., secuencias de la línea germinal murina). En ciertos casos, un anticuerpo humano puede ser al menos 95%, o incluso al menos 96%, 97%, 98%, o 99% idéntico en la secuencia de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la línea germinal. Típicamente, un anticuerpo humano derivado de una secuencia

de la línea germinal humana particular mostrará no más de 10 diferencias de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la línea germinal humana. En ciertos casos, el anticuerpo humano puede mostrar no más de 5, o incluso no más de 4, 3, 2, o 1 diferencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la línea germinal.

Anticuerpos minipulados genéticamente y modificados

Los anticuerpos manipulados genéticamente incluyen aquellos en los que se han realizado modificaciones en los residuos estructurales dentro de VH y/o VK, p. ej., para mejorar las propiedades del anticuerpo. Típicamente, tales modificaciones del marco se realizan para disminuir la inmunogenicidad del anticuerpo. Por ejemplo, un enfoque consiste en "retromutar" uno o más residuos del marco a la secuencia de la línea germinal correspondiente. Más específicamente, un anticuerpo que ha sido objeto de mutación somática puede contener residuos del marco que difieren de la secuencia de la línea germinal de la que se deriva el anticuerpo. Tales residuos pueden ser identificados mediante la comparación de las secuencias marco de anticuerpos con las secuencias de la línea germinal de la que deriva el anticuerpo.

Por ejemplo, la Tabla 1 muestra una serie de cambios de aminoácidos en las regiones marco de los anticuerpos antiPD-1 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 y 5F4 que difieren de la secuencia de la línea germinal parental de la cadena pesada. Para devolver uno o más de los residuos de aminoácidos en las secuencias de las regiones marco a su configuración de la línea germinal, las mutaciones somáticas pueden ser "retromutadas" a la secuencia de la línea germinal, p. ej., mediante mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis mediada por PCR.

Se pueden producir cambios de aminoácidos en las regiones marco de anticuerpos anti-PD-1 que difieren de la secuencia de la línea germinal parental de la cadena ligera. Por ejemplo, para 17D8, residuo de aminoácido Núm. 47 (dentro de FR2) de VK es una isoleucina mientras que este residuo en la secuencia de la línea germinal L6 de VK correspondiente es una leucina. Para volver las secuencias de la región marco a su configuración de la línea germinal, las mutaciones somáticas pueden ser "retromutadas" a la secuencia de la línea germinal, p. ej., mediante mutagénesis dirigida a un sitio o mutagénesis mediada por PCR (p. ej., residuo Núm. 47 (residuo Núm. 13 de FR2) de VK de 17D8 puede "retromutada" de isoleucina a leucina).

Como otro ejemplo, para 4A11, el residuo de aminoácido Núm. 20 (dentro de FR1) de VK es una serina mientras que este residuo en la secuencia de la línea germinal L15 de VK correspondiente es una treonina. Para volver las secuencias de la región marco a su configuración de la línea germinal, p. ej., residuo Núm. 20 de VK de 4A11 puede ser "retromutado" de serina a treonina. También se pretende que tales anticuerpos "retromutados" estén abarcados por la invención.

El alineamiento de las regiones VH de 17D8, 2D3, 4H1, 5C4 y 7D3, contra la secuencia 3-33 de VH de la línea germinal parental se muestra en la Figura 8. El alineamiento de la regiones VH para 4A11 y 5F4 contra la secuencia 4-39 de VH de la línea germinal parental se muestra en la Figura 11.

Tabla 1. Modificaciones de los anticuerpos 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 y 5F4 de la configuración de la línea germinal de la cadena pesada.

Ab Anti-PD-1: Posición aminoácidos de Aminoácido del anticuerpo Aminoácido original de la configuración de la línea germinal

17D8: 10 D T

: 16 T R

: 27 V F

: 28 A T

: 78 M T

: 93 M V

2D3: 10 D T

: 27 L F

: 30 T S

: 85 N S

: 98 T R

4H1: 3 Y Q

: 84 T N

: 88 V A

: 98 s R

5C4: 21 D S

: 23 K A

: 27 I F

: 80 F Y

: 98 T R

4A11: 29 L I

: 79 Q H

: 98 V A

7D3: 23 T A

: 24 T A

: 27 I F

: 70 L I

: 74 D N

: 97 V A

: 98 T R

5F4: 23 S T

: 29 L I

: 51 A T

: 77 R K

Otro tipo de modificación del marco implica la mutación de uno o más residuos dentro de la región marco para eliminar epítopos de células T para reducir de ese modo la inmunogenicidad potencial del anticuerpo. Este enfoque también se conoce como "desinmunización" y se describe con más detalle en Publicación de la Patente de los

5 Estados Unidos 20030153043 de Carr et al.

Además o de manera alternativa a las modificaciones realizadas dentro de las regiones marco, los anticuerpos de la invención pueden ser manipulados genéticamente para incluir modificaciones dentro de la región Fc, típicamente para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo, tal como la vida media en suero, la fijación del

10 complemento, la unión al receptor de Fc, y/o la citotoxicidad celular dependiente de antígeno. Además, un anticuerpo de la invención puede ser modificado químicamente (p. ej., se pueden unir al anticuerpo uno o más radicales químicos) o ser modificado para alterar su glicosilación, de nuevo para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo. Cada una de estas realizaciones se describe con más detalle a continuación. La numeración de los residuos en la región Fc es la del índice EU de Kabat.

15 En una realización, la región bisagra de CH1 se modifica de tal manera que se altera el número de residuos de cisteína en la región bisagra, p. ej., aumenta o disminuye. Este enfoque se describe adicionalmente en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.677.425 de Bodmer et al. El número de residuos de cisteína en la región bisagra de CH1 se altera para, por ejemplo, facilitar el ensamblaje de las cadenas ligeras y pesadas o para aumentar o disminuir la

20 estabilidad del anticuerpo.

En otra realización, la región bisagra de Fc de un anticuerpo es mutada para disminuir la vida media biológica del anticuerpo. Más específicamente, se introducen una o más mutaciones de aminoácidos en la región de la interfaz de dominio CH2-CH3 del fragmento Fc-bisagra de tal manera que el anticuerpo ha deteriorado la unión de la proteína A

25 Estafilocócica (SpA) con respecto a la unión de SpA al dominio Fc-bisagra nativo. Este enfoque se describe con más detalle en la Patente de los Estados Unidos Núm. 6.165.745 de Ward et al.

En otra realización, el anticuerpo se modifica para aumentar su vida media biológica. Son posibles diversos enfoques. Por ejemplo, se pueden introducir una o más de las siguientes mutaciones: T252L, T254S, T256F, como se describe en la Patente de los Estados Unidos Núm. 6.277.375 de Ward. Alternativamente, para aumentar la vida media biológica, el anticuerpo puede ser alterado dentro de la región CH1 o CL para contener un epitopo de unión al receptor salvaje tomado a partir de dos bucles de un dominio CH2 de una región Fc de una IgG, como se describe en las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.869.046 y 6.121.022 de Presta et al.

En otras realizaciones más, la región Fc se altera remplazando al menos un residuo de aminoácido por un residuo de aminoácido diferente para alterar la función o las funciones efectoras del anticuerpo. Por ejemplo, uno o más aminoácidos seleccionados de los residuos de aminoácidos 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 y 322 pueden ser remplazados por un residuo de aminoácido diferente de tal manera que el anticuerpo tenga una afinidad alterada por un ligando efector pero conserve la capacidad de unión al antígeno del anticuerpo parental. El ligando efector en el que se altera la afinidad puede ser, p. ej., un receptor Fc o el componente C1 del complemento. Este enfoque se describe con más detalle en las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.624.821 y 5.648.260, ambas de Winter et al.

En otro ejemplo, uno o más aminoácidos seleccionados de los residuos de aminoácidos 329, 331 y 322 se pueden remplazar por un residuo de aminoácido diferente de tal manera que el anticuerpo tenga alterada la unión de C1q y/o reducida o abolida la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Este enfoque se describe con más detalle en la Patente de los Estados Unidos Núm. 6.194.551 de Idusogie et al.

En otro ejemplo, uno o más residuos de aminoácidos dentro de las posiciones de aminoácidos 231 y 239 son alterados para alterar de ese modo la capacidad del anticuerpo para fijar el complemento. Este enfoque se describe adicionalmente en la Publicación PCT WO 94/29351 de Bodmer et al.

En otro ejemplo, la región Fc se modifica para aumentar la capacidad del anticuerpo para mediar en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) y/o para aumentar la afinidad del anticuerpo por un receptor de Fcγ mediante la modificación de uno o más aminoácidos en las siguientes posiciones: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 o 439. Este enfoque se describe adicionalmente en la Publicación PCT WO 00/42072 de Presta. Por otra parte, se han mapeado los sitios de unión en la IgG1 humana para FcyR1, RII, RIII y FcRn y se han descrito variantes con unión mejorada (véase Shields, RL et al. (2001) J. Biol.. Chem.. 276:6591-6604). Se demostró que las mutaciones específicas en las posiciones 256, 290, 298, 333, 334 y 339 mejoran la unión a FcRIII. Además, se demostró que los siguientes mutantes de combinación mejoran la unión a FcRIII: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A y S298A/E333A/K334A.

En otra realización más, se modifica la glicosilación de un anticuerpo. Por ejemplo, se puede elaborar un anticuerpo aglicosilado (es decir, el anticuerpo carece de glicosilación). La glicosilación se puede alterar para, p. ej., aumentar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Tales modificaciones de carbohidratos se pueden lograr mediante, p. ej., la alteración de uno o más sitios de glicosilación dentro de la secuencia del anticuerpo. Por ejemplo, se pueden realizar una o más sustituciones de aminoácidos que dan como resultado la eliminación de uno o más sitios de glicosilación de la región marco variable para eliminar de ese modo la glicosilación en dicho sitio. Tal aglicosilación puede aumentar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Tal enfoque se describe con más detalle en las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.714.350 y 6.350.861 de Co et al.

Adicionalmente o alternativamente, se puede elaborar un anticuerpo que tiene un tipo de glicosilación alterado, tal como un anticuerpo hipofucosilado que tiene cantidades reducidas de residuos de fucosilo o un anticuerpo que tiene más estructuras de GlcNAc bisecantes. Se ha demostrado que patrones de glicosilación aumentan la capacidad de ADCC de los anticuerpos. Tales modificaciones de carbohidratos se pueden lograr, p. ej., expresando el anticuerpo en una célula anfitriona con la maquinaria de glicosilación alterada. Las células con maquinaria de glicosilación alterada se han descrito en la técnica y se pueden utilizar como células anfitrionas en la que expresar anticuerpos recombinantes de la invención para producir de este modo un anticuerpo con la glicosilación alterada. Por ejemplo, las líneas celulares Ms704, Ms705, y Ms709 carecen del gen de fucosiltransferasa, FUT8 (alfa (1,6) fucosiltransferasa), de manera que los anticuerpos expresados en las líneas celulares Ms704, Ms705, y Ms709 carecen de fucosa en sus hidratos de carbono. Las líneas celulares Ms704, Ms705, y Ms709 FUT8-/-fueron creadas por la alteración dirigida del gen FUT8 en las células CHO/DG44 utilizando dos vectores de reemplazo (ver Publicación de la Patente de los Estados Unidos Núm. 20040110704 de Yamane et al. y Yamane-Ohnuki et. al. (2004) Biotechnol Bioeng 87:614-22). Como otro ejemplo, en el documento EP 1.176.195 de Hanai et al. se describe una línea celular con un gen FUT8 alterado funcionalmente, que codifica una fucosiltransferasa, de manera que los anticuerpos expresados de tal línea celular exhiben hipofucosilación mediante la reducción o la eliminación de la enzima relacionada con el enlace alfa 1,6. Hanai et al. también describen líneas celulares que tienen una baja actividad de la enzima para la adición de fucosa a la N-acetilglucosamina que se une a la región Fc del anticuerpo o

no tiene la actividad de la enzima, por ejemplo la línea celular de mieloma de rata YB2/0 (ATCC CRL 1662). La Publicación PCT WO 03/035835 de Presta describe una variante de la línea de células CHO, células Lec13, con menor capacidad de anclar fucosa a carbohidratos unidos a Asn (297), dando también como resultado la hipofucosilación de los anticuerpos expresados en dicha célula anfitriona (véase también Shields, RL et al. (2002) J. Biol.. Chem. 277:26733-26740). La Publicación PCT WO 99/54342 de Umana et al. describe líneas celulares manipuladas genéticamente para expresar glicosil transferasas que modifican glicoproteínas (p. ej., beta(1,4)-Nacetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII)) de manera que los anticuerpos expresados en las líneas celulares manipuladas genéticamente presentan un aumento de las estructuras de GlcNAc bisecantes lo que da como resultado el aumento de la actividad ADCC de los anticuerpos (véase también Umana et al. (1999) Nat.. Biotech. 17:176-180). Alternativamente, los residuos de fucosa del anticuerpo pueden ser escindidos utilizando una enzima fucosidasa. Por ejemplo, la fucosidasa alfa-L-fucosidasa elimina los residuos fucosilo de los anticuerpos (Tarentino, AL et al. (1975) Biochem. 14:5516-23).

Otra modificación de los anticuerpos de la presente memoria que es contemplada por la invención es la pegilación. Un anticuerpo puede ser pegilado para, por ejemplo, aumentar la vida media biológica (p. ej., suero) del anticuerpo. Para pegilar un anticuerpo, el anticuerpo, o fragmento del mismo se hace reaccionar típicamente con polietilenglicol (PEG), tal como un éster reactivo o derivado aldehído de PEG, en condiciones en las que uno o más grupos PEG se unen al anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Preferiblemente, la pegilación se lleva a cabo a través de una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula de PEG reactiva (o un polímero soluble en agua reactivo análogo). Según se utiliza en la presente memoria, se pretende que el término "polietilenglicol" abarque cualquiera de las formas de PEG que han sido utilizadas para derivatizar otras proteínas, tales como mono alcoxi-o ariloxi-(C1-C10)-polietilenglicol o polietilenglicol-maleimida. En ciertas realizaciones, el anticuerpo que se va a pegilar es un anticuerpo aglicosilado. Los métodos para pegilar proteínas son conocidos en la técnica y se pueden aplicar a los anticuerpos de la invención. Véanse, p. ej., el documento EP 0 154 316 de Nishimura et al. y el documento EP 0 401 384 de Ishikawa et al.

Moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos de la invención

Las moléculas de ácido nucleico que codifican los anticuerpos de la invención pueden estar presentes en células enteras, en un producto lisado celular, o en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura. Un ácido nucleico es "aislado" o "vuelto sustancialmente puro" cuando se purifica aparte de otros componentes celulares u otros contaminantes, p. ej., otros ácidos nucleicos o proteínas celulares, mediante mecanismos convencionales, incluyendo tratamiento alcalino/SDS, formación de bandas en CsCl, cromatografía en columna, electroforesis en gel de agarosa y otras bien conocidos en la técnica. Véase, F. Ausubel, et al., Ed. (1987), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, Nueva York. Un ácido nucleico puede ser, p. ej., ADN o ARN y puede o no puede contener secuencias intrónicas. El ácido nucleico puede ser una molécula de ADNc.

Los ácidos nucleicos se pueden obtener utilizando técnicas convencionales de biología molecular. Para los anticuerpos expresados por los hibridomas (p. ej., hibridomas preparados a partir de ratones transgénicos que portan genes de inmunoglobulina humana como se describe adicionalmente más adelante), los ADNc que codifican las cadenas ligera y pesada del anticuerpo elaboradas por el hibridoma se pueden obtener mediante amplificación mediante PCR convencional o técnicas de clonación de ADNc. Para los anticuerpos obtenidos a partir de una biblioteca de genes de inmunoglobulina (p. ej., utilizando técnicas de presentación en fagos), el ácido nucleico que codifica el anticuerpo se puede recuperar de la biblioteca.

Las moléculas de ácidos nucleicos preferidas son aquellas que codifican las secuencias de VH y VL del anticuerpo monoclonal 5C4. Una secuencia de ADN que codifica la secuencia de VH de 5C4 se muestra en el SEQ ID NO: 60, una secuencia de ADN que codifica la secuencia de VL de 5C4 se muestra en el SEC ID NO: 67.

Una vez que se obtienen los fragmentos de ADN que codifican los segmentos VH y VL, estos fragmentos de ADN pueden manipularse adicionalmente mediante técnicas de ADN recombinante convencionales, por ejemplo para convertir los genes de región variable en genes de la cadena de anticuerpo completa, en genes de fragmentos Fab o en un gen de scFv. En estas manipulaciones, un fragmento de ADN que codifica VL o VH está conectado operablemente a otro fragmento de ADN que codifica otra proteína, tal como una región constante de anticuerpo o un conector flexible. Se pretende que el término "conectado operablemente", según se utiliza en este contexto, signifique que los dos fragmentos de ADN se unen de forma que las secuencias de aminoácidos codificadas por los dos fragmentos de ADN permanecen en marco.

El ADN aislado que codifica la región VH puede convertirse en un gen de la cadena pesada completo conectando operablemente el ADN que codifica VH con otra molécula de ADN que codifica las regiones constantes de la cadena pesada (CH1, CH2 y CH3). Las secuencias de genes de la región constante de la cadena pesada humana son conocidos en la técnica (véase p. ej., Kabat, EA, et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos, Publicación NIH Núm. 913242) y los fragmentos de ADN que incluyen estas regiones pueden obtenerse mediante amplificación por PCR

convencional. La región constante de la cadena pesada puede ser una región constante de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM o IgD, pero más preferiblemente es una región constante de IgG1 o IgG4. Para un gen de la cadena pesada de un fragmento Fab, el ADN que codifica VH puede conectarse operablemente a otra molécula de ADN que codifica únicamente la región constante CH1 de la cadena pesada.

El ADN aislado que codifica la región VL puede convertirse en un gen de cadena ligera completo (así como un gen de cadena ligera de Fab) conectando operablemente el ADN que codifica VL a otra molécula de ADN que codifica la región constante de cadena ligera, CL. Las secuencias de los genes de la región constante de la cadena ligera humanos son conocidas en la técnica (véase p. ej., Kabat, EA, et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos, Publicación NIH Núm. 91-3242) y los fragmentos de ADN que incluyen estas regiones pueden obtenerse mediante amplificación por PCR convencional. La región constante de la cadena ligera puede ser una región constante kappa o lambda, pero lo más preferiblemente es una región constante kappa.

Para crear un gen de scFv, los fragmentos de ADN que codifican VH y VL se conectan operablemente a otro fragmento que codifica un conector flexible, p. ej., que codifica la secuencia de aminoácidos (Gly4-Ser)3, de manera que la secuencias de VH y VL se puedan expresar como una proteína de cadena sencilla contigua, con las regiones VL y VH unidas por el conector flexible (véanse p. ej., Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554).

Producción de anticuerpos monoclonales de la invención

Los anticuerpos de la invención son anticuerpos monoclonales humanos. Tales anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra PD-1 se pueden generar utilizando ratones transgénicos o transcromosómicos que llevan partes del sistema inmunitario humano en lugar del sistema de ratón. Estos ratones transgénicos y transcromosómicos incluyen ratones referidos en la presente memoria como ratones HuMAb y ratones KM™, respectivamente, y son referidos colectivamente en la presente memoria como "ratones con Ig humana".

El ratón HuMAb® (Medarex, Inc.) contiene miniloci de genes de inmunoglobulina humana que codifican secuencias de inmunoglobulina de cadena pesada (μ y γ) y ligera κ humanas no reordenadas, junto con mutaciones dirigidas que inactivan los loci endógenos de las cadenas μ y κ (véase p. ej., Lonberg, et al. (1994) Nature 368 (6474): 856859). Por lo tanto, los ratones muestran una expresión reducida de IgM o κ de ratón, y en respuesta a la inmunización, los transgenes de la cadena pesada y ligera humanas introducidos experimentan cambio de clase y mutación somática para generar IgGκ monoclonal humana de alta afinidad (Lonberg, N. et al.(1994), supra; revisado en Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. y Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, y Harding, F. y Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad Sci. 764:536-546). La preparación y el uso de los ratones HuMab, y las modificaciones genómicas realizadas por tales ratones, son descritos con más detalle por Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591; y Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851, cuyo contenido se incorpora específicamente como referencia en su totalidad. Véanse adicionalmente, las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.789.650; 5.877.397; 5.661.016; 5.814.318; 5.874.299; y 5.770.429; todas de Lonberg y Kay, la Patente de los Estados Unidos Núm.

5.545.807 de Surani et al.; las Publicaciones PCT Núms. WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 y WO 99/45962, todas de Lonberg y Kay, y la Publicación PCT Núm. WO 01/14424 de Korman et al.

En otra realización, los anticuerpos humanos de la invención se pueden originar utilizando un ratón que porta secuencias de inmunoglobulina humana en los transgenes y transcromosomas, tal como un ratón que porta un transgén de la cadena pesada humana y un transcromosoma de la cadena ligera humana. Tales ratones, referidos en la presente memoria como "ratones KM™", se describen en detalle en la Publicación PCT WO 02/43478 de Ishida et al.

Adicionalmente, otros sistemas animales transgénicos alternativos que expresan genes de inmunoglobulina humana están disponibles en la técnica y se pueden utilizar para originar anticuerpos anti-PD-1 de la invención. Por ejemplo, se puede utilizar un sistema transgénico alternativo conocido como XenoMouse (Abgenix, Inc.); tales ratones se describen, p. ej., en las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.939.598; 6.075.181; 6.114.598; 6.150.584 y

6.162.963 de Kucherlapati et al.

Por otra parte, los sistemas animales transcromosómicos alternativos que expresan genes de inmunoglobulina humana están disponibles en la técnica y se pueden utilizar para originar anticuerpos anti-PD-1 de la invención. Por ejemplo, se pueden utilizar ratones que portan tanto un transcromosoma de cadena pesada humana y un transcromosoma de cadena ligera humana, denominados "ratones TC"; tales ratones son descritos por Tomizuka et

al. (2000) Proc. Natl. Acad. USA 97: 722-727. Además, las vacas que portan transcromosomas de las cadenas pesada y ligera humanas se han descrito en la técnica (Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894) y se pueden utilizar para originar anticuerpos anti-PD-1 de la invención.

Los anticuerpos monoclonales humanos de la invención también se pueden preparar utilizando métodos de presentación en fagos para la selección de bibliotecas de genes de inmunoglobulina humanos. Tales métodos de expresión en fagos para aislar anticuerpos humanos están establecidos en la técnica. Véanse, por ejemplo: las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.223.409; 5.403.484; y 5.571.698 de Ladner et al.; las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.427.908 y 5.580.717 de Dower et al.; las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.969.108 y 6.172.197 de McCafferty et al.; y las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.885.793; 6.521.404; 6.544.731; 6.555.313; 6.582.915 y 6.593.081 de Griffiths et al.

Los anticuerpos monoclonales humanos de la invención también se pueden preparar utilizando ratones SCID en los que las células inmunitarias humanas se han reconstituido de manera que se puede generar una respuesta de anticuerpo humano después de la inmunización. Tales ratones se describen, p. ej., en las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.476.996 y 5.698.767 de Wilson et al.

Inmunización de ratones con Ig humana

Cuando se utilizan ratones con Ig humana para producir los anticuerpos humanos de la invención, tales ratones pueden inmunizarse con una preparación purificada o enriquecida de antígeno PD-1 y/o PD-1 recombinante, o una proteína de fusión de PD-1, como describen Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368 (6474): 856-859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851; y las Publicaciones PCT WO 98/24884 y WO 01/14424. Preferiblemente, los ratones tendrán 6-16 semanas de edad tras la primera infusión. Por ejemplo, se puede utilizar una preparación purificada o recombinante (5-50 g) del antígeno PD-1 para inmunizar a los ratones con Ig humana por vía intraperitoneal.

Los procedimientos detallados para generar anticuerpos monoclonales totalmente humanos contra PD-1 se describen en el Ejemplo 1 de más abajo. La experiencia acumulada con diversos antígenos ha demostrado que los ratones transgénicos responden cuando se inmunizan inicialmente por vía intraperitoneal (IP) con antígeno en coadyuvante completo de Freund, seguido de inmunizaciones IP cada otros semanas (hasta un total de 6) con antígeno en coadyuvante incompleto de Freund. Sin embargo, también se encuentra que son eficaces otros coadyuvantes distintos del de Freund. Además, se encuentra que las células completas en ausencia de adyuvante son altamente inmunogénicas. La respuesta inmunitaria puede controlarse durante el transcurso del protocolo de inmunización con muestras de plasma que se obtienen por sangrados retroorbitales. El plasma puede escrutarse mediante ELISA (como se describe más abajo), y los ratones con títulos suficientes de inmunoglobulina humana anti-PD-1 se pueden utilizar para las fusiones. Los ratones se pueden reforzar intravenosamente con antígeno 3 días antes del sacrificio y la extirpación del bazo. Se espera que pueda se necesario realizar 2-3 fusiones para cada inmunización. Se inmunizan típicamente entre 6 y 24 ratones para cada antígeno. Por lo general, se utilizan ambas cepas HCo7 y HCo12. Además, se pueden generar juntos los transgenes HCo7 y HCo12 en un único ratón que tiene dos transgenes de la cadena pesada humana diferentes (HCo7/HCo12). Alternativamente o adicionalmente, se puede utilizar el ratón de la cepa KM™, tal como se describe en el Ejemplo 1.

Generación de hibridomas que producen anticuerpos monoclonales humanos de la invención

Para generar hibridomas que producen anticuerpos monoclonales humanos de la invención, esplenocitos y/o células de nódulos linfáticos de ratones inmunizados se puede aislar y fusionar a una línea celular inmortalizada apropiada, tal como una línea celular de mieloma de ratón. Los hibridomas resultantes se pueden escrutar para la producción de anticuerpos específicos de antígeno. Por ejemplo, suspensiones de células individuales de linfocitos esplénicos de ratones inmunizados se pueden fusionar a un sexto del número de células de mieloma de ratón no secretoras P3X63-Ag8.653 (ATCC, CRL 1580) con 50% de PEG. Alternativamente, las suspensiones de células individuales de linfocitos esplénicos de ratones inmunizados se pueden fusionar mediante un método de electrofusión basado campo eléctrico, utilizando un electroporador de fusión celular de cámara grande Cyto Pulse (Cyto Pulse Sciences, Inc., Glen Burnie, MD). Las células se cultivaron en placa a aproximadamente 2 x 105 en una placa de microtitulación de fondo plano, seguido de una incubación de dos semanas en medio selectivo que contenía suero FetalClone al 20%, medio acondicionado "653" al 18%, origen (IGEN) al 5%, L-glutamina 4 mM, piruvato sódico 1 mM, HEPES 5 mM, 2-mercaptoetanol al 0,055 mM, 50 unidades/ml de penicilina, 50 mg/ml de estreptomicina, 50 mg/ml de gentamicina y 1X HAT (Sigma; el medio HAT se añade 24 horas después de la fusión). Después de aproximadamente dos semanas, las células se pueden cultivar en un medio en donde el medio HAT se reemplaza por HT. Los pocillos individuales se pueden escrutar a continuación mediante ELISA para determinar los anticuerpos IgM e IgG monoclonales humanos. Una vez que se produce el crecimiento extensivo del hibridoma, el medio se puede observar por lo general después de 10-14 días. Los hibridomas secretores de anticuerpos se pueden volver a cultivar en placa, escrutar de nuevo, y si todavía son positivos para IgG humana, los anticuerpos monoclonales se pueden subclonar al menos dos veces mediante dilución limitante. Los subclones estables se pueden cultivar a

continuación in vitro para generar pequeñas cantidades de anticuerpo en medio de cultivo de tejido para su caracterización.

Para purificar anticuerpos monoclonales humanos, los hibridomas seleccionados se pueden cultivar en matraces de agitación dos litros para la purificación de anticuerpo monoclonal. Los sobrenadantes se pueden filtrar y concentrar antes de la cromatografía de afinidad con proteína A-sefarosa (Pharmacia, Piscataway, NJ). La IgG eluida se puede comprobar mediante electroforesis en gel y cromatografía líquida de alto rendimiento para garantizar la pureza. La solución tampón puede ser intercambiada en PBS, y la concentración se puede determinar mediante DO280 utilizando el coeficiente de extinción de 1:43. Los anticuerpos monoclonales se pueden dividir en alícuotas y almacenar a -80°C.

Generación de transfectomas que producen anticuerpos monoclonales de la invención

Los anticuerpos de la invención también se pueden producir en un transfectoma de célula anfitriona utilizando, p. ej., una combinación de técnicas de ADN recombinante y métodos de transfección de genes como es bien conocido en la técnica (p. ej., Morrison, S. (1985) Science 229:1202).

Por ejemplo, para expresar los anticuerpos, o los fragmentos de anticuerpos de los mismos, los ADN que codifican las cadenas pesada y ligera parciales o completas, se pueden obtener mediante técnicas de biología molecular convencionales (p. ej., amplificación mediante PCR o clonación de ADNc utilizando un hibridoma que expresa el anticuerpo de interés) y los ADN se pueden insertar en vectores de expresión de manera que los genes se unan operativamente a secuencias de control transcripcional y traduccional. En este contexto, se pretende que el término "ligado operablemente" signifique que un gen de anticuerpo se liga en un vector de manera que las secuencias de control transcripcional y traduccional dentro del vector sirven para su función pretendida de regular la transcripción y traducción del gen del anticuerpo. El vector de expresión y secuencias de control de expresión se eligen para que sean compatibles con la célula anfitriona de expresión utilizada. El gen de la cadena ligera del anticuerpo y el gen de la cadena pesada del anticuerpo pueden insertarse en vectores separados o, más típicamente, ambos genes se insertan en el mismo vector de expresión. Los genes de anticuerpo se insertan en el vector de expresión mediante métodos convencionales (p. ej., ligación de sitios de restricción complementarios en el fragmento génico del anticuerpo y el vector, o ligación de extremos romos si no hay sitios de restricción presentes). Las regiones variables de las cadenas ligera y pesada de los anticuerpos descritos en la presente memoria se pueden utilizar para crear genes de anticuerpos completos de cualquier isotipo de anticuerpo insertándolos en vectores de expresión que ya codifican las regiones constantes de cadena pesada y constantes de cadena ligera del isotipo deseado de manera que el segmento VH esté conectado operablemente al segmento o los segmentos CH dentro del vector y el segmento VK está conectado operablemente al segmento CL dentro del vector. Adicionalmente o alternativamente, el vector de expresión recombinante puede codificar un péptido señal que facilita la secreción de la cadena de anticuerpo a partir de una célula anfitriona. El gen de la cadena de anticuerpo puede clonarse en el vector de tal manera que el péptido señal se una en marco al extremo amino del gen de la cadena de anticuerpo. El péptido señal puede ser un péptido señal de inmunoglobulina o un péptido señal heterólogo (es decir, un péptido señal de una proteína no inmunoglobulina).

Además de los genes de la cadena de anticuerpo, los vectores de expresión recombinantes portan secuencias reguladoras que controlan la expresión de los genes de la cadena de anticuerpo en una célula anfitriona. Se pretende que el término "secuencia reguladora" incluya promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (p. ej., señales de poliadenilación) que controlen la transcripción o traducción de los genes de la cadena de anticuerpo. Tales secuencias reguladoras son descritas, p. ej., por Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)). Los expertos en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión, incluyendo la selección de secuencias reguladoras, puede depender de factores tales como la elección de la célula anfitriona que se vaya a transformar, el nivel de expresión de la proteína deseada, etc. Las secuencias reguladoras preferidas para la expresión en células anfitrionas de mamífero incluyen elementos virales que dirigen altos niveles de expresión de la proteína en células de mamífero, tales como promotores y/o potenciadores derivados de citomegalovirus (CMV), Virus de simio 40 (SV40), adenovirus, (p. ej., el promotor tardío principal de adenovirus (AdMLP) y polioma. Alternativamente, se pueden utilizar secuencias reguladoras no virales, tales como el promotor de ubicuitina o el promotor de β-globina. Adicionalmente, elementos reguladores compuestos de secuencias de diferentes fuentes, tales como el sistema promotor SRα, que contiene secuencias del promotor temprano de SV40 y la repetición terminal larga del virus de la leucemia de células T humana tipo 1 (Takebe, Y. et al (1988) Mol. Móvil. Biol.. 8:466-472).

Además de los genes de la cadena de anticuerpo y secuencias reguladoras, los vectores de expresión recombinantes pueden portar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la replicación del vector en células anfitrionas (p. ej., orígenes de replicación) y genes marcadores seleccionables. El gen marcador seleccionable facilita la selección de células anfitrionas en las que se ha introducido el vector (véanse, p. ej., las Patentes de los Estados Unidos Núms. todas de Axel et al.). Por ejemplo, típicamente el gen marcador seleccionable confiere resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina o metotrexato, en una célula anfitriona en la que se

ha introducido el vector. Los genes marcadores seleccionables preferidos incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) (para su uso en células anfitrionas dhfr-con selección/amplificación con metotrexato) y el gen neo (para selección con G418).

Para la expresión de las cadenas ligera y pesada, el vector o los vectores de expresión que codifican las cadenas pesada y ligera se transfectan a una célula anfitriona mediante técnicas convencionales. Se pretende que las diversas formas del término "transfección" abarquen una amplia variedad de técnicas comúnmente usadas para la introducción de ADN exógeno en una célula anfitriona procariota o eucariota, p. ej., electroporación, precipitación con fosfato de calcio, transfección con DEAE-dextrano y similares. Aunque es teóricamente posible expresar los anticuerpos de la invención en células anfitrionas procarióticas o eucarióticas, la expresión de los anticuerpos en células eucarióticas, y lo más preferiblemente en células anfitrionas de mamífero, es la más preferida debido a que es más probable que tales células eucarióticas, y, en particular, las células de mamífero, ensamblen y secreten un anticuerpo correctamente plegado e inmunológicamente activo que las células procarióticas. Se ha informado de que la expresión procariótica de genes de anticuerpos no es eficaz para la producción de altos rendimientos de anticuerpo activo (Boss, MA and Wood, C. R (1985) Immunology Today 6:12-13).

Las células anfitrionas de mamífero preferidas para expresar los anticuerpos recombinantes de la invención incluyen células de Ovario de Hámster Chino (células CHO) (incluyendo células CHO dhfr-, descritas por Urlaub y Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, utilizadas con un marcador seleccionable de DHFR, p. ej., como describen R. J. Kaufman y P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621), células de mieloma NSO, células COS y células SP2. En particular, para su uso con células de mieloma NSO, otro sistema de expresión preferido es el sistema de expresión del gen GS descrito en los documentos WO 87/04462, WO 89/01036 y EP 338.841. Cuando se introducen vectores de expresión recombinantes que codifican genes de anticuerpos en células anfitrionas de mamífero, los anticuerpos se producen cultivando las células anfitrionas durante un período de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células anfitrionas o, más preferiblemente, la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en donde se cultivan las células anfitrionas. Los anticuerpos pueden ser recuperados del medio de cultivo utilizando métodos de purificación de proteínas convencionales.

Caracterización de la unión del anticuerpo al antígeno

Los anticuerpos de la invención se pueden someter a ensayo para determinar la unión a PD-1, p. ej., ELISA convencional. En resumen, las placas de microtitulación se recubren con PD-1 purificada a 0,25 µg/ml en PBS, y a continuación se bloquean con albúmina de suero bovino al 5% en PBS. Las diluciones de anticuerpo (p. ej., diluciones de plasma de PD-1 de ratones inmunizados) se añaden a cada pocillo y se incuban durante 1-2 horas a 37°C. Las placas se lavan con PBS/Tween y se incuban a continuación con reactivo secundario (p. ej., para los anticuerpos humanos, un reactivo policlonal de cabra anti-IgG humana específico de Fc) conjugado con fosfatasa alcalina durante 1 hora a 37°C. Después del lavado, las placas se desarrollaron con sustrato pNPP (1 mg/ml), y se analizaron a una DO de 405 a 650. Preferiblemente, los ratones que desarrollan los títulos más altos se utilizarán para las fusiones.

También se puede utilizar un análisis ELISA como se ha descrito anteriormente para la detección de hibridomas que muestran reactividad positiva con el inmunógeno PD-1. Los hibridomas que se unen con alta avidez a PD-1 se subclonaron y se caracterizaron adicionalmente. Se puede elegir un clon de cada hibridoma, que retiene la reactividad de las células parentales (mediante ELISA), para elaborar un banco de células de 5-10 viales almacenado a -140°C, y para la purificación de los anticuerpos.

Para purificar anticuerpos anti-PD-1, los hibridomas seleccionados se pueden cultivar en matraces de agitación de dos litros para la purificación de anticuerpo monoclonal. Los sobrenadantes se pueden filtrar y concentrar antes de la cromatografía de afinidad con proteína A-sefarosa (Pharmacia, Piscataway, NJ). La IgG eluida se puede comprobar mediante electroforesis en gel y cromatografía líquida de alto rendimiento para garantizar la pureza. La solución tampón se puede intercambiar en PBS, y la concentración se puede determinar mediante DO280 utilizando un coeficiente de extinción de 1,43. Los anticuerpos monoclonales se pueden dividir en alícuotas y almacenar a -80°C.

Para determinar si los anticuerpos anti-PD-1 monoclonales seleccionados se unen a epítopos únicos, cada anticuerpo puede biotinilarse utilizando reactivos asequibles comercialmente (Pierce, Rockford, IL). Se pueden realizar estudios de competición utilizando anticuerpos monoclonales no marcados y anticuerpos monoclonales biotinilados utilizando placas de ELISA recubiertas de PD-1 como se ha descrito anteriormente. La unión del mAb biotinilado puede detectarse con una sonda de estreptavidina-fosfatasa alcalina.

Para determinar el isotipo de los anticuerpos purificados, se pueden realizar ELISA de isotipo utilizando reactivos específicos para los anticuerpos de un isotipo particular. Por ejemplo, para determinar el isotipo de un anticuerpo monoclonal humano, los pocillos de placas de microtitulación se pueden recubrir con 1 µg/ml de antiinmunoglobulina humana durante la noche a 4°C. Después de bloquear con BSA al 1%, las placas se hacen reaccionar con 1 µg/ml o menos de anticuerpos monoclonales de ensayo o controles de isotipo purificados, a

temperatura ambiente durante una a dos horas. Los pocillos se pueden hacer reaccionar a continuación con cualquiera de IgG1 humana o sondas conjugadas con fosfatasa alcalina específicas de IgM humana. Las placas se desarrollan y se analizan como se ha descrito anteriormente.

Las IgG humanas anti-PD-1 se pueden someter a ensayo adicionalmente para determinar la reactividad con el antígeno PD-1 mediante transferencia Western. En resumen, PD-1 se pueden preparar y someter a electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio. Después de la electroforesis, los antígenos separados se transfieren a membranas de nitrocelulosa, se bloquean con suero de ternera fetal al 10%, y se sondean con los anticuerpos monoclonales que se van a someter a ensayo. La unión de IgG humana puede detectarse utilizando fosfatasa alcalina anti-IgG humana y desarrollarse con comprimidos de sustrato de BCIP/NBT (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO).

Productos inmunoconjugados

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un anticuerpo anti-PD-1, conjugado con un resto terapéutico, tal como una citotoxina, un fármaco (p. ej., un inmunosupresor) o una radiotoxina. Tales productos conjugados se denominan en la presente memoria "productos inmunoconjugados". Los productos inmunoconjugados que incluyen una o más citotoxinas se conocen como "inmunotoxinas." Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que sea perjudicial (p. ej., destruye) para las células. Los ejemplos incluyen taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxiantracinodiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, y puromicina y análogos u homólogos de los mismos. Los agentes terapéuticos también incluyen, p. ej., antimetabolitos (p. ej., metotrexato, 6-mercaptopurina, 6tioguanina, citarabina, 5-fluorouracilo, dacarbazina), agentes alquilantes (p. ej., mecloretamina, tioepa, clorambucilo, melfalán, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, y cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino), antraciclinas (p. ej., daunorrubicina (antes daunomicina) y doxorrubicina), antibióticos (p. ej., dactinomicina (antes actinomicina), bleomicina, mitramicina, y antramicina (AMC)), y agentes anti-mitóticos (p. ej., vincristina y vinblastina).

Otros ejemplos preferidos de citotoxinas terapéuticas que pueden conjugarse con un anticuerpo de la invención incluyen duocarmicinas, calicheamicinas, maytansinas y auristatinas, y derivados de los mismos. Un ejemplo de un producto conjugado de anticuerpo de calicheamicina está disponible comercialmente (Mylotarg™; Wyeth-Ayerst).

Las citoxinas se pueden conjugar con los anticuerpos de la invención utilizando la tecnología conectora disponible en la técnica. Ejemplos de los tipos de conectores que han sido utilizados para conjugar una citotoxina a un anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, hidrazonas, ésteres, tioéteres, disulfuros y conectores que contienen péptidos. Se puede elegir un conector que es, p. ej., susceptible a la escisión por bajo pH dentro del compartimento lisosomal o es susceptible a la escisión por proteasas, tales como proteasas expresadas preferentemente en el tejido tumoral, tales como las catepsinas (p. ej., catepsinas B, C, D).

Para una discusión adicional de los tipos de citotoxinas, conectores y métodos para conjugar los agentes terapéuticos con los anticuerpos, véanse también Saito, G. et al., (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail,

P.A. et al. (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Allen, T.M. (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan, I. y Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. y Springer, C.J. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264.

Los anticuerpos de la presente invención también se pueden conjugar con un isótopo radioactivo para generar radiofármacos citotóxicos, también referidos como productos radioinmunoconjugados. Los ejemplos de los isótopos radiactivos que se pueden conjugar a los anticuerpos para uso diagnóstico o terapéutico incluyen, pero no se limitan a, yodo131, Indio111, Itrio90 y lutecio177. El método para la preparación de los productos radioimmunconjugados se establecen en la técnica. Los ejemplos de los productos radioinmunoconjugados están disponibles en el mercado, incluyendo Zevalin™ (IDEC Pharmaceuticals) y Bexxar™ (Corixa Pharmaceuticals), y se pueden utilizar métodos similares para preparar productos radioinmunoconjugados utilizando los anticuerpos de la invención.

Los productos conjugados de anticuerpos de la invención se pueden utilizar para modificar una respuesta biológica dada, y no se debe interpretar que el radical de fármaco está limitado a los agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, el radical de fármaco puede ser una proteína o polipéptido que posee una actividad biológica deseada. Tales proteínas pueden incluir, p. ej., una toxina enzimáticamente activa, o un fragmento activo de la misma, tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas, o toxina de la difteria; una proteína tal como el factor de necrosis tumoral o interferón-γ; o, modificadores de la respuesta biológica tales como, p. ej., linfocinas, interleuquina-1 ("IL1"), interleuquina-2 ("IL-2"), interleuquina-6 ("IL-6"), factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos ("GMCSF"), factor estimulador de colonias de granulocitos (" G-CSF "), u otros factores de crecimiento.

Las técnicas para conjugar tales radicales terapéuticos a anticuerpos son bien conocidas, ver, p. ej., Arnon et al., Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), págs. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2a Ed.), Robinson et al. (eds.), págs. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), págs. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), págs. 303-16 (Academic Press 1985), y Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982).

Moléculas biespecíficas

En otro aspecto, la presente invención se refiere a moléculas biespecíficas que comprenden un anticuerpo anti-PD1, de la invención. Un anticuerpo de la invención, se pueden derivatizar o conectar a otra molécula funcional, p. ej., otro péptido o proteína (p. ej., otro anticuerpo o ligando para un receptor) para generar una molécula biespecífica que se une a al menos dos sitios de unión diferentes o moléculas diana. El anticuerpo de la invención puede de hecho ser derivatizado o conectado a más de una molécula funcional distinta para generar moléculas multiespecíficas que se unen a más de dos sitios diferentes de unión y/o moléculas diana; también se pretende que tales moléculas multiespecíficas estén comprendidas en el término "molécula biespecífica" según se utiliza en la presente memoria. Para crear una molécula biespecífica de la invención, un anticuerpo de la invención se puede conectar funcionalmente (p. ej., mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otra manera) a una o más de otras moléculas de unión, tales como otro anticuerpo, fragmento de anticuerpo, péptido o mimético de unión, de manera que se produzca una molécula biespecífica.

Por lo tanto, la presente invención incluye moléculas biespecíficas que comprenden al menos una primera especificidad de unión para PD-1 y una segunda especificidad de unión para un segundo epítopo diana. En una realización particular de la invención, el segundo epítopo diana es un receptor de Fc, p. ej., FcγRI humano (CD64) o un receptor de Fcα humano (CD89). Por lo tanto, la invención incluye moléculas biespecíficas capaces de unirse tanto a células efectoras que expresan FcγR o FcαR (p. ej., monocitos, macrófagos o células polimorfonucleares (PMN)), como a células diana que expresan PD-1. Estas moléculas biespecíficas dirigen las células que expresan PD-1 a la célula efectora y desencadenan actividades de las células efectoras mediadas por el receptor de Fc, tales como la fagocitosis de células que expresan PD-1, la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), la liberación de citoquinas, o la generación de anión superóxido.

En una realización de la invención en la que la molécula biespecífica es multiespecífica, la molécula puede incluir adicionalmente una tercera especificidad de unión, además de una especificidad de unión anti-Fc y una especificidad de unión anti-PD-1. En una realización, la tercera especificidad de unión es una porción anti-factor de potenciación (EF), p. ej., una molécula que se une a una proteína de superficie que participa en la actividad citotóxica y de ese modo aumenta la respuesta inmunitaria contra la célula diana. La "porción anti-factor de potenciación" puede ser un anticuerpo, fragmento de anticuerpo funcional o un ligando que se une a una molécula dada, p. ej., un antígeno o un receptor, y por lo tanto da como resultado una mejora del efecto de los determinantes de unión para el receptor de FC o antígeno de célula diana. La "porción anti-factor de potenciación" se puede unir a un receptor de FC o un antígeno de célula diana. Alternativamente, la porción anti-factor de potenciación se puede unir a una entidad que es diferente de la entidad a la que se unen las primera y segunda especificidades de unión. Por ejemplo, la porción anti-factor de potenciación se puede unir una célula T citotóxica (p. ej., a través de CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 u otra célula inmune que de como resultado un aumento de la respuesta inmunitaria contra la célula diana).

En una realización, las moléculas biespecíficas de la invención comprenden como especificidad de unión al menos un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo del mismo, incluyendo, p. ej., un Fab, Fab', F(ab')2, Fv, o un Fv de cadena sencilla. El anticuerpo también puede ser un dímero de cadena ligera o cadena pesada, o cualquier fragmento mínimo del mismo tal como un Fv o un constructo de cadena sencilla como describe en la Patente de los Estados Unidos Núm. de Ladner et al. cuyo contenido se incorpora expresamente como referencia.

En una realización, la especificidad de unión para un receptor de Fcy es proporcionada por un anticuerpo monoclonal, cuya unión no es bloqueada por la inmunoglobulina G humana (IgG). Según se utiliza en la presente memoria, el término "receptor de IgG" se refiere a cualquiera de los ocho genes de cadena γ localizados en el cromosoma 1. Estos genes codifican un total de doce isoformas del receptor transmembrana o solubles que se agrupan en tres clases de receptores de Fcγ: FcγRI (CD64), FcγRII (CD32), y FcyRIII (CD16). En una realización preferida, el receptor de Fcγ es un FcγRI humano de alta afinidad. El FcγRI humano es una molécula de 72 kDa, que muestra alta afinidad por IgG monomérica (108-109 M-1).

La producción y caracterización de ciertos anticuerpos anti-Fcγ monoclonales preferidos son descritas por Fanger et al. en la Publicación PCT WO 88/00052 y en la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.954.617, cuyas enseñanzas

se incorporan completamente como referencia a la presente memoria. Estos anticuerpos se unen a un epítopo de FcγRI, FcγRII o FcγRIII en un sitio que es distinto del sitio de unión de Fcγ del receptor y, por lo tanto, su unión no se bloquea sustancialmente por niveles fisiológicos de IgG. Los anticuerpos anti-FcγRI específicos útiles en esta invención son mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 y mAb 197. El hibridoma que produce mAb 32 está disponible de la Colección de Cultivos Tipo Americana, ATCC Núm. de Acceso HB9469. En otras realizaciones, el anticuerpo antireceptor de Fcγ es una forma humanizada del anticuerpo monoclonal 22 (H22). La producción y caracterización del anticuerpo H22 es descrita por Graziano, RF et al. (1995) J. Immunol 155 (10): 4996 a 5002 y la Publicación PCT WO 94/10332. La línea de células productoras de anticuerpo H22 fue depositada en la Colección de Cultivos Tipo Americana bajo la denominación HA022CL1 y tiene el Núm. de acceso CRL 11177.

En otras realizaciones preferidas adicionales, la especificidad de unión para un receptor de Fc es proporcionada por un anticuerpo que se une a un receptor de IgA humano, p. ej., un receptor de Fc-alfa (FcαRI (CD89)), cuya unión preferiblemente no está bloqueada por inmunoglobulina A humana (IgA). Se pretende que el término "receptor de IgA" incluya el producto génico de un gen α (FcαRI) localizado en el cromosoma 19. Este gen es conocido por codificar varias isoformas transmembrana cortadas y empalmadas alternativamente de 55 a 110 kDa. El FcαRI (CD89) se expresa constitutivamente en monocitos/macrófagos, eosinófilos y granulocitos neutrófilos, pero no en poblaciones de células no efectoras. El FcαRI tiene una afinidad media (≈ 5 × 107 M-1) tanto para IgA1 como para IgA2, que aumenta tras la exposición a citoquinas tales como G-CSF o GM-CSF (Morton, H. C. et al. (1996) Critical Reviews in Immunology 16:423-440). Se han descrito cuatro anticuerpos monoclonales específicos de FcαRI, identificados como A3, A59, A62 y A77, que se unen FcαRI fuera del dominio de unión al ligando de IgA, (Monteiro, RC. et al. (1992) J. Immunol. 148: 1764).

FcαRI y FcγRI son receptores de activación preferidos para su uso en las moléculas biespecíficas de la invención, ya que son (1) expresados principalmente en las células efectoras inmunes, p. ej., monocitos, PMN, macrófagos y células dendríticas, (2) expresados a niveles altos (p. ej., 5.000-100.000 por célula); (3) mediadores de actividades citotóxicas (p. ej., ADCC, fagocitosis); (4) median la presentación de antígeno mejorada de antígenos, incluyendo autoantígenos, dirigidos a los mismos.

Si bien se prefieren los anticuerpos monoclonales humanos, otros anticuerpos que se pueden emplear en las moléculas biespecíficas de la invención son anticuerpos monoclonales murinos, quiméricos y humanizados.

Las moléculas biespecíficas de la presente invención se pueden preparar mediante la conjugación de las especificidades de unión constitutivas, p. ej., las especificidades de unión anti-FcR y anti-PD-1, utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, cada especificidad de unión de la molécula biespecífica puede generarse por separado y luego conjugarse entre sí. Cuando las especificidades de unión son proteínas o péptidos, se puede utilizar una variedad de agentes de acoplamiento o entrecruzamiento para la conjugación covalente. Los ejemplos de los agentes de entrecruzamiento incluyen proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA), 5,5'-ditiobis(ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB), o-fenilendimaleimida (OPDM), N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), y 4-(N-maleimidometil)ciclohaxano-1-carboxilato de sulfosuccinimidilo (sulfo-SMCC) (véase p. ej., Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. USA 82:8648). Otros métodos incluyen los descritos por Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. Núm. 78, 118-132; Brennan et al. (1985) Science 229:8183), y Glennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375). Los agentes de conjugación preferidos son SATA y sulfo-SMCC, ambos asequibles de Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).

Cuando las especificidades de unión son anticuerpos, que pueden estar conjugados a través de unión sulfhidrilo de las regiones bisagra del extremo C de las dos cadenas pesadas. En una realización particularmente preferida, la región bisagra se modifica para contener un número impar de residuos sulfhidrilo, preferiblemente uno, antes de la conjugación.

Alternativamente, ambas especificidades de unión pueden codificarse en el mismo vector y expresarse y ensamblarse en la misma célula anfitriona. Este método es particularmente útil cuando la molécula biespecífica es un mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 o ligando x proteína de fusión Fab. Una molécula biespecífica de la invención puede ser una molécula de cadena sencilla que comprende un anticuerpo de cadena sencilla y un determinante de unión, o una molécula biespecífica de cadena sencilla que comprende dos determinantes de unión. Las moléculas biespecíficas pueden comprender al menos dos moléculas de cadena sencilla. Los métodos para preparar moléculas biespecíficas se describen por ejemplo en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.260.203; la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.455.030; la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.881.175; la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.132.405; la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.091.513; la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.476.786; la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.013.653; la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.258.498; y la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.482.858.

La unión de las moléculas biespecíficas a sus dianas específicas puede confirmarse, p. ej., mediante análisis de inmunoabsorción ligado a enzima (ELISA), radioinmunoanálisis (RIA), análisis FACS, bioanálisis (p. ej., Inhibición del crecimiento), o ensayo de Transferencia Western. Cada uno de estos ensayos detecta generalmente la presencia de

complejos de proteína-anticuerpo de interés particular mediante el empleo de un reactivo marcado (p. ej., un anticuerpo) específico para el complejo de interés. Por ejemplo, los complejos de FcR-anticuerpo pueden ser detectados utilizando p. ej., un anticuerpo unido a enzima o fragmento de anticuerpo que reconoce y se une específicamente a los complejos de anticuerpo-FcR. Alternativamente, los complejos pueden ser detectados utilizando cualquiera de una variedad de otros inmunoanálisis. Por ejemplo, el anticuerpo se puede marcar radiactivamente y usarse en un radioinmunoanálisis (RIA) (véase, p. ej., Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986, que se incorpora como referencia en la presente memoria). El isótopo radiactivo puede detectarse por medios tales como el uso de un contador γ o un contador de centelleo o por autorradiografía.

Composiciones farmacéuticas

En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición, p. ej., una composición farmacéutica, que contiene un anticuerpo monoclonal de la presente invención, formulada junto con un portador farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones pueden incluir uno o una combinación de los (p. ej., dos o más) anticuerpos diferentes, o productos inmunoconjugados o moléculas biespecíficas de la invención.

Las composiciones farmacéuticas de la invención también se pueden administrar en una terapia combinada, es decir, combinadas con otros agentes. Por ejemplo, la terapia combinada puede incluir un anticuerpo anti-PD-1 de la presente invención combinado con al menos otro agente antiinflamatorio o inmunosupresor. Los ejemplos de los agentes terapéuticos que se pueden utilizar en la terapia combinada se describen con mayor detalle más adelante en la sección sobre los usos de los anticuerpos de la invención.

Según se utiliza en la presente memoria, "portador farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, y similares que sean fisiológicamente compatibles. Preferiblemente, el portador es adecuado para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (p. ej., mediante inyección o infusión). Dependiendo de la ruta de administración, el compuesto activo, es decir, el anticuerpo, producto inmunoconjugado, o molécula biespecífica, se pueden recubrir con un material para proteger al compuesto de la acción de ácidos y otras condiciones naturales que puedan inactivar el compuesto.

Los compuestos farmacéuticos de la invención pueden incluir una o más sales farmacéuticamente aceptables. Una "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sal que retiene la actividad biológica deseada del compuesto parental y no imparte efectos toxicológicos no deseados (véase p. ej., Berge, SM, et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:119). Los ejemplos de tales sales incluyen sales de adición de ácido y sales de adición de base. Las sales de adición de ácido incluyen las derivadas de ácidos inorgánicos no tóxicos, tales como clorhídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromhídrico, yodhídrico, fosforoso y similares, así como de los ácidos orgánicos no tóxicos tales como ácidos mono-y dicarboxílicos alifáticos, ácidos alcanoicos sustituidos con fenilo, ácidos hidroxialcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos y aromáticos y similares. Las sales de adición de base incluyen las derivadas de metales alcalinotérreos, tales como sodio, potasio, magnesio, calcio y similares, así como de aminas orgánicas no tóxicas, tales como N, N-dibenciletilendiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamina, procaína y similares.

Una composición farmacéutica de la invención también puede incluir un antioxidante farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de los antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) antioxidantes solubles en agua, tales como ácido ascórbico, hidrocloruro de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y similares;

(2) antioxidantes solubles en aceite, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol, y similares, y (3) agentes quelantes de metales, tales como ácido cítrico, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico, y similares.

Los ejemplos de los portadores acuosos y no acuosos adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. La fluidez apropiada puede mantenerse, p. ej., mediante el uso de materiales de recubrimiento, tales como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de las dispersiones y mediante el uso de tensioactivos.

Estas composiciones también pueden contener adyuvantes tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la presencia de microorganismos se puede asegurar tanto mediante procedimientos de esterilización, supra, como mediante la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, p. ej., parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro de sodio, y similares a las composiciones. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede ser provocada por la inclusión de agentes que retrasan la absorción tales como monoestearato de aluminio y gelatina.

Los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso del mismo en las composiciones farmacéuticas de la invención. También se pueden incorporar a las composiciones compuestos activos complementarios.

Las composiciones terapéuticas típicamente deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede formularse como una solución, microemulsión, liposoma, u otra estructura ordenada adecuada para una alta concentración de fármaco. El portador puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, p. ej., agua, etanol, poliol (p. ej., glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, o cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede provocarse incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, p. ej., sales de monoestearato y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de microfiltración de esterilización. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo a un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión alcalino y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado al vacío y secado por congelación (liofilización) que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución previamente filtrada en condiciones estériles del mismo.

La cantidad de ingrediente activo que se puede combinar con un material portador para producir una forma de dosificación única variará dependiendo del sujeto que esté siendo tratado, y el modo particular de administración. La cantidad de ingrediente activo que se puede combinar con un material portador para producir una sola forma de dosificación será generalmente la cantidad de la composición que produce un efecto terapéutico. Generalmente, aparte de cien por ciento, esta cantidad variará de aproximadamente 0,01 por ciento a aproximadamente noventa y nueve por ciento de ingrediente activo, preferiblemente de aproximadamente 0,1 por ciento a aproximadamente 70 por ciento, más preferiblemente de aproximadamente 1 por ciento a aproximadamente 30 por ciento de ingrediente activo en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Los regímenes de dosificación se ajustan para proporcionar la respuesta óptima deseada (p. ej., una respuesta terapéutica). Por ejemplo, se puede administrar un único bolo, se pueden administrar varias dosis divididas a lo largo del tiempo o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente según se indique por las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de unidad de dosificación para facilidad de administración y uniformidad de dosificación. La forma de dosificación unitaria según se utiliza en la presente memoria, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos que se vayan a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación para las formas unitarias de dosificación de la invención están dictadas por y dependen directamente de (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular que se vaya a conseguir, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de composición de tal compuesto activo para el tratamiento de sensibilidad en individuos.

Para la administración del anticuerpo, la dosificación oscila de aproximadamente 0,0001 a 100 mg/kg, y más habitualmente de 0,01 a 5 mg/kg, de peso corporal del anfitrión. Por ejemplo las dosificaciones pueden ser de 0,3 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg de peso corporal, 3 mg/kg de peso corporal, 5 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal o dentro del intervalo de 1-10 mg/kg . Un régimen de tratamiento ilustrativo implica la administración una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez al mes, una vez cada 3 meses o una vez cada tres a 6 meses. Los regímenes de dosificación preferidos para un anticuerpo anti-PD-1 de la invención incluyen 1 mg/kg de peso corporal o 3 mg/kg de peso corporal a través de la administración intravenosa, administrando el anticuerpo mediante la utilización de uno de los siguientes regímenes de dosificación: (i) cada cuatro semanas durante seis dosis, a continuación cada tres meses,

(ii) cada tres semanas, (iii) 3 mg/kg de peso corporal una vez seguido de 1 mg/kg de peso corporal cada tres semanas.

En algunos métodos, se administran simultáneamente dos o más anticuerpos monoclonales con diferentes especificidades de unión, en cuyo caso la dosificación de cada anticuerpo administrado está dentro de los intervalos

indicados. El anticuerpo se administra usualmente en múltiples ocasiones. Los intervalos entre las dosificaciones individuales pueden ser, p. ej., semanalmente, mensualmente, cada tres meses o cada año. Los intervalos también pueden ser irregulares como se indica mediante la medición de los niveles sanguíneos de anticuerpo con respecto al antígeno diana en el paciente. En algunos métodos, la dosificación se ajusta para lograr una concentración de anticuerpo en plasma de aproximadamente 1-1000 µg/ml y en algunos métodos acerca de 25-300 µg/ml.

Alternativamente, el anticuerpo puede administrarse como una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso se requiere una administración menos frecuente. La dosificación y la frecuencia varían dependiendo de la vida media del anticuerpo en el paciente. En general, los anticuerpos humanos muestran la vida media más larga, seguido de los anticuerpos humanizados, los anticuerpos quiméricos, y los anticuerpos no humanos. La dosificación y la frecuencia de administración pueden variar dependiendo de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En aplicaciones profilácticas, se administra una dosificación relativamente baja a intervalos relativamente infrecuentes durante un largo período de tiempo. Algunos pacientes continúan recibiendo tratamiento durante el resto de sus vidas. En las aplicaciones terapéuticas, a veces se requiere una dosis relativamente alta a intervalos relativamente cortos hasta que la progresión de la enfermedad se reduce o termina, y preferiblemente hasta que el paciente muestra mejora parcial o completa de los síntomas de la enfermedad. A partir de entonces, al paciente se le puede administrar un régimen profiláctico.

Los niveles de dosificación reales de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden variarse con el fin de obtener una cantidad del ingrediente activo que sea eficaz para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición, y modo de administración concretos, sin que sea tóxica para el paciente. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una variedad de factores farmacocinéticos que incluyen la actividad de las composiciones concretas de la presente invención empleadas, o el éster, sal o amida de las mismas, la ruta de administración, el tiempo de administración, la tasa de excreción de la compuesto concreto que se emplee, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales utilizados combinados con las composiciones concretas empleadas, la edad, sexo, peso, condición, salud general e historial médico previo del paciente que se esté tratando, y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas.

Una "dosis terapéuticamente eficaz" de un anticuerpo anti-PD-1 de la invención da como resultado preferiblemente una disminución de la severidad de síntomas de la enfermedad, un aumento en la frecuencia y duración de los períodos libres de síntomas de enfermedad, o una prevención de la deficiencia o discapacidad debidas a la aflicción por enfermedad. Por ejemplo, para el tratamiento de tumores, una "dosis terapéuticamente eficaz" preferiblemente inhibe el crecimiento celular o el crecimiento tumoral en al menos aproximadamente 20%, más preferiblemente en al menos aproximadamente 40%, aún más preferiblemente en al menos aproximadamente 60%, y todavía más preferiblemente en al menos aproximadamente 80% con respecto a los sujetos no tratados. La capacidad de un compuesto para inhibir el crecimiento del tumor puede ser evaluada en un sistema modelo animal predictivo de la eficacia en tumores humanos. Alternativamente, esta propiedad de una composición puede evaluarse examinando la capacidad del compuesto para inhibir tal inhibición in vitro mediante análisis conocidos por el experto en la técnica. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto terapéutico puede disminuir el tamaño del tumor, o de otra manera mejorar los síntomas en un sujeto. Un experto normal en la técnica sería capaz de determinar tales cantidades basándose en factores tales como el tamaño del sujeto, la gravedad de los síntomas del sujeto, y la composición o ruta de administración concretas seleccionadas.

En otro aspecto, la presente descripción proporciona un kit farmacéutico de partes que comprende un anticuerpo anti-PD-1 y un anticuerpo anti-CTLA-4, tal como se describe en la presente memoria. El kit también puede comprender adicionalmente instrucciones para su uso en el tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa (tal como el cáncer como se describe en la presente memoria). En otra realización, los anticuerpos anti-PD-1 y antiCTLA-4 se pueden empaquetar simultáneamente en una forma de dosificación unitaria.

En ciertas realizaciones, se administran simultáneamente dos o más anticuerpos monoclonales con diferentes especificidades de unión (p. ej., anti-PD-1 y anti-CTLA-4), en cuyo caso la dosificación de cada anticuerpo administrado está dentro de los intervalos indicados. Los anticuerpos se pueden administrar como una sola dosis o, más comúnmente se puede administrar en múltiples ocasiones. Los intervalos entre las dosificaciones individuales pueden ser, por ejemplo, semanalmente, mensualmente, cada tres meses o cada año. Los intervalos también pueden ser irregulares como se indica mediante la medición de los niveles sanguíneos de anticuerpo con respecto al antígeno diana en el paciente. En algunos métodos, la dosificación se ajusta para lograr una concentración de anticuerpo en plasma de aproximadamente 1-1000 µg/ml y en algunos métodos acerca de 25-300 µg/ml.

Una composición de la presente invención se puede administrar a través de una o más rutas de administración utilizando una o más de una variedad de métodos conocidos en la técnica. Como apreciará el experto en la técnica, la ruta y/o modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados. Las rutas preferidas de administración para los anticuerpos de la invención incluyen intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutánea, espinal u otras rutas de administración parenterales, por ejemplo mediante inyección o infusión. La

frase "administración parenteral" según se utiliza en la presente memoria significa modos de administración distintos de la administración enteral y tópica, normalmente mediante inyección, e incluye, sin limitación, inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal.

Alternativamente, un anticuerpo de la invención se puede administrar a través de una ruta no parenteral, tal como una ruta de administración tópica, epidérmica o mucosa, p. ej., intranasal, oral, vaginal, rectal, sublingual o tópica.

Los compuestos activos pueden prepararse con vehículos que protegerán el compuesto contra la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos, y sistemas de liberación microencapsulados. Se pueden utilizar polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como etileno acetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de tales formulaciones están patentados o son generalmente conocidos por los expertos en la técnica. Véase, p. ej., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

Las composiciones terapéuticas pueden administrarse con dispositivos médicos conocidos en la técnica. Por ejemplo, en una realización preferida, una composición terapéutica de la invención puede administrarse con un dispositivo de inyección hipodérmica sin aguja, tal como los dispositivos descritos en las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.399.163; 5.383.851; 5.312.335; 5.064.413; 4.941.880; 4.790.824; o 4.596.556. Los ejemplos de los implantes y módulos bien conocidos útiles en la presente invención incluyen: la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.487.603, que describe una bomba de micro-infusión implantable para dispensar medicación a una velocidad controlada; la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.486.194, que describe un dispositivo terapéutico para administrar medicamentos través de la piel; la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.447.233, que describe una bomba de infusión de medicación para la liberar medicación a una velocidad de infusión precisa; la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.447.224, que describe un aparato de infusión implantable de flujo variable para la liberación continua de fármaco; la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.439.196, que describe un sistema de administración de fármaco osmótico que tiene compartimientos de cámaras múltiples; y la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.475.196, que describe un sistema de administración de fármaco osmótico. Estas patentes se incorporan a la presente memoria como referencia. Muchos otros implantes, sistemas de liberación y módulos son conocidos por los expertos en la técnica.

En ciertas realizaciones, los anticuerpos monoclonales humanos de la invención pueden formularse para asegurar una distribución adecuada in vivo. Por ejemplo, la barrera hematoencefálica (BHE) excluye muchos compuestos altamente hidrófilos. Para garantizar que los compuestos terapéuticos de la invención cruzan la BHE (si se desea), pueden formularse, p. ej., en liposomas. Para los métodos de fabricación de liposomas, ver, p. ej., las Patentes de los Estados Unidos Núms. 4.522.811; 5.374.548; y 5.399.331. Los liposomas pueden comprender uno o más radicales que se transportan selectivamente a células u órganos específicos, mejorando de este modo la liberación de los fármacos (véase, p. ej., V. V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685). Los radicales de direccionamiento ejemplares incluyen folato o biotina (véase, p. ej., la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.416.016 de Low et al); manósidos (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); anticuerpos; (P. G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); surfactant protein A receptor (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134); p120 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); véanse también K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273.

Usos ymétodos de la invención

Los anticuerpos, y composiciones de anticuerpos de la presente invención tienen numerosas utilidades in vitro e in vivo que implican, p. ej., la detección de PD-1 o la mejora de la respuesta inmunitaria por el bloqueo de PD-1. Los anticuerpos de la presente invención son anticuerpos humanos. Por ejemplo, estas moléculas pueden administrarse a células en cultivo, in vitro o ex vivo, o a sujetos humanos, p. ej., in vivo, para mejorar la inmunidad en una variedad de situaciones. En consecuencia, se puede modificar la respuesta inmunitaria en un sujeto mediante la administración al sujeto del anticuerpo, de la invención de tal manera que se modifique la respuesta inmunitaria en el sujeto. Preferiblemente, la respuesta se potencia, estimula o regula al alza.

Según se utiliza en la presente memoria, se pretende que el término "sujeto" incluya animales humanos y no humanos. Los animales no humanos incluye todos los vertebrados, p. ej., mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, vacas, caballos, pollos, anfibios y reptiles, aunque se prefieren mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, vacas y caballos. Los sujetos preferidos incluyen pacientes humanos que necesiten mejora de una respuesta inmunitaria, particularmente pacientes humanos que tienen un trastorno que puede ser tratado mediante el aumento de la respuesta inmunitaria mediada por células T. Se pueden tratar células cancerosas in vivo. Para lograr la mejora específica antígeno de la

inmunidad, los anticuerpos anti-PD-1 se pueden administrar junto con un antígeno de interés. Cuando los anticuerpos contra PD-1 se administran junto con otro agente, los dos pueden administrarse en cualquier orden o simultáneamente.

Adicionalmente, se puede detectar la presencia de antígeno PD-1 humano en una muestra, o medir la cantidad de antígeno PD-1 humano, poniendo en contacto la muestra, y una muestra de control, con un anticuerpo monoclonal humano, o una porción de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a PD-1 humana, bajo condiciones que permitan la formación de un complejo entre el anticuerpo o porción del mismo y PD-1 humana. A continuación, se detecta la formación de un complejo, en donde una diferencia en la formación de complejos entre la muestra en comparación con la muestra de control es indicativa de la presencia de antígeno PD-1 humano en la muestra.

Teniendo en cuenta la unión específica de los anticuerpos de la invención para PD-1, en comparación con CD28, ICOS y CTLA-4, los anticuerpos de la invención se pueden utilizar para detectar específicamente la expresión de PD-1 en la superficie de las células y, por otra parte, se pueden utilizar para purificar PD-1 a través de la purificación mediante inmunoafinidad.

Cáncer

El bloqueo de PD-1 por los anticuerpos puede potenciar la respuesta inmunitaria contra células cancerosas en el paciente. El ligando de PD-1, PD-L1, no es expresado en las células humanas normales, pero es abundante en una variedad de cánceres humanos (Dong et al. (2002) Nat. Med. 8:787-9). La interacción entre PD-1 y PD-L1 da como resultado una disminución de los linfocitos infiltrantes de tumores, una disminución de la proliferación mediada por el receptor de células T, y la evasión inmunológica de las células cancerosas (Dong et al. (2003) J Mol Med 81:281-7; Blank et al. (2005) Cancer Immunol. Immunother. 54:307-314; Konishi et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10:5094-100). La inmunosupresión puede ser revertida mediante la inhibición de la interacción local de PD-1 con PD-L1 y el efecto es aditivo cuando la interacción de PD-1 con PD-L2 también está bloqueada (Iwai et al. (2002) PNAS 99:12293-7; Brown et al. (2003) J. Immunol. 170:1257-66). Si bien los estudios anteriores han demostrado que la proliferación de células T puede ser restaurada mediante la inhibición de la interacción de PD-1 con PD-L1, no ha habido informes de un efecto directo sobre el crecimiento tumoral del cáncer in vivo mediante el bloqueo de la interacción PD-1/PDL1. Sin embargo, un sujeto puede ser tratado ahora in vivo utilizando un anticuerpo anti-PD-1 de la invención de tal manera que se inhiba el crecimiento de tumores cancerosos. El anticuerpo anti-PD-1 puede ser utilizado solo para inhibir el crecimiento de tumores cancerosos. Alternativamente, el anticuerpo anti-PD-1 puede ser utilizado junto con otros agentes inmunogénicos, tratamientos convencionales contra el cáncer, u otros anticuerpos, como se describe a continuación.

Por lo tanto, el crecimiento de las células tumorales en un sujeto puede ser inhibida mediante la administración al sujeto de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-PD-1 de la invención.

Los cánceres preferidos cuyo crecimiento se puede inhibir utilizando los anticuerpos de la invención incluyen que responden típicamente a la inmunoterapia. Los ejemplos no limitantes de los cánceres preferidos para el tratamiento incluyen el melanoma (p. ej., melanoma maligno metastásico) el cáncer renal, (p. ej.,. el carcinoma de células claras), el cáncer de próstata (p. ej., adenocarcinoma de próstata refractario a hormonas), el cáncer de mama, el cáncer de colon y el cáncer de pulmón (p. ej., cáncer de pulmón de células no pequeñas). Además, se pueden tratar tumores malignos refractarios o recurrentes cuyo crecimiento se puede inhibir utilizando los anticuerpos de la invención.

Los ejemplos de otros tipos de cáncer que se pueden tratar utilizando los anticuerpos de la invención incluyen cáncer de huesos, cáncer de páncreas, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma maligno cutáneo o intraocular, cáncer de útero, cáncer de ovario, cáncer de recto, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer de útero, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma de endometrio, carcinoma del cuello uterino, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, enfermedad de Hodgkin, linfoma no-Hodgkin, cáncer del esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroides, cáncer de la glándula suprarrenal, sarcoma de tejidos blandos, cáncer de la uretra, cáncer del pene, leucemias crónicas o agudas, incluyendo leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crónica, tumores sólidos de la infancia, linfoma linfocítico, cáncer de la vejiga, cáncer del riñón o uréter, carcinoma de la pelvis renal, neoplasias del sistema nervioso central (SNC), linfoma primario del SNC, angiogénesis tumoral, tumor de eje espinal, glioma del tronco encefálico, adenoma de la pituitaria, sarcoma de Kaposi, cáncer epidermoide, cáncer de células escamosas, linfoma de células T, cánceres inducidos ambientalmente incluyendo los inducidos por el amianto, y combinaciones de dichos cánceres. También se pueden tratar cánceres metastásicos, especialmente cánceres metastásicos que expresan PD-L1 (Iwai et al. (2005) Int. Immunol. 17:133-144).

Opcionalmente, los anticuerpos contra PD-1 se pueden combinar con un agente inmunogénico, tal como células cancerosas, antígenos tumorales purificados (incluyendo proteínas, péptidos, y moléculas de hidratos de carbono recombinantes), células, y células transfectadas con genes que codifican citoquinas estimuladoras del sistema inmunitario (He et al (2004) J. Immunol. 173:4919-28). Los ejemplos no limitantes de las vacunas tumorales que se pueden utilizar incluyen péptidos de antígenos de melanoma, tales como péptidos de gp100, antígenos MAGE, Trp2, MART1 y/o tirosinasa, o células tumorales transfectadas para expresar la citoquina GM-CSF (discutido adicionalmente más abajo).

En seres humanos, se ha demostrado que algunos tumores son inmunogénicos, por ejemplo los melanomas. Se prevé que al elevar el umbral de activación de células T mediante el bloqueo de PD-1, se puede esperar que se activen las respuestas tumorales en el anfitrión.

Es probable que el bloqueo de PD-1 sea más eficaz cuando se combine con un protocolo de vacunación. Se han ideado muchas estrategias experimentales para la vacunación contra tumores (véase Rosenberg, S., 2000, Development of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring: 60-62; Logothetis, C., 2000, ASCO Educational Book Spring: 300-302; Khayat, D. 2000, ASCO Educational Book Spring: 414-428; Foon, K. 2000, ASCO Educational Book Spring: 730-738; véase también Restifo, N. and Sznol, M., Cancer Vaccines, Cap. 61, págs. 30233043 in DeVita, V. et al. (eds.), 1997, Cancer: Principles and Practice of Oncology. Fifth Edition). En una de estas estrategias, se prepara una vacuna utilizando células tumorales autólogas o alogénicas. Se ha demostrado que estas vacunas celulares son más eficaces cuando las células tumorales se transducen para expresar GM-CSF. Se ha demostrado que el GM-CSF es un potente activador de la presentación de antígenos para la vacunación tumoral (Dranoff et al. (1993) Proc. Natl. Acad Sci. EE.UU. 90: 3539-43).

El estudio de la expresión génica y los patrones de expresión génica a gran escala en varios tumores ha conducido a la definición de los denominados antígenos específicos de tumores (Rosenberg, SA (1999) Immunity 10: 281-7). En muchos casos, estos antígenos específicos de tumores son antígenos de diferenciación expresados en los tumores y en la célula de la que surgió el tumor, por ejemplo antígenos gp100 de melanocitos, antígenos MAGE, y Trp-2. Más importante aún, se puede demostrar que muchos de estos antígenos son el blanco de las células T específicas de tumores encontradas en el anfitrión. El bloqueo de PD-1 se puede utilizar junto con una colección de proteínas y/o péptidos recombinantes expresados en un tumor con el fin de generar una respuesta inmunitaria a estas proteínas. Estas proteínas son normalmente vistas por el sistema inmunitario como antígenos propios y por tanto son tolerantes a ellas. El antígeno tumoral también puede incluir la proteína telomerasa, que se requiere para la síntesis de telómeros de los cromosomas y que se expresa en más de 85% de los cánceres humanos y sólo en un número limitado de tejidos somáticos (Kim, N et al. (1994) Science 266: 2011-2013). (Estos tejidos somáticos pueden ser protegidos del ataque inmunitario mediante diversos medios). Los antígenos tumorales también pueden ser "neo-antígenos" expresados en células cancerosas a causa de mutaciones somáticas que alteran la secuencia de la proteína o crean proteínas de fusión entre dos secuencias no relacionadas (es decir bcr-abl en el cromosoma Philadelphia), o idiotipo de tumores de células B.

Otras vacunas tumorales pueden incluir las proteínas de los virus implicados en cánceres humanos tales como virus de papiloma humano (HPV), virus de la hepatitis (VHB y VHC) y el virus del herpes del sarcoma de Kaposi (KHSV). Otras formas de antígeno específico de tumor que se pueden utilizar junto con el bloqueo de PD-1 son las proteínas de choque térmico (HSP) aisladas del propio tejido tumoral Estas proteínas de choque térmico contienen fragmentos de proteínas de las células tumorales y estas HSP son altamente eficaces en la liberación a las células presentadoras de antígenos para provocar inmunidad tumoral (Suot, R & Srivastava, P (1995) Science 269:15851588; Tamura, Y. et al. (1997) Science 278:117-120).

Las células dendríticas (CD) son células presentadoras de antígenos potentes que se pueden utilizar para cebar respuestas específicas de antígeno. Las CD pueden ser producidas ex vivo y cargadas con diversos antígenos proteicos y peptídicos, así como extractos de células tumorales (Nestle, F. et al. (1998) Nature Medicine 4: 328-332). Las CD también pueden ser transducidas por medios genéticos para expresar también estos antígenos tumorales. Las CD también se han fusionado directamente con células tumorales para los fines de inmunización (Kugler, A. et al. (2000) Nature Medicine 6:332-336). Como un método de vacunación, la inmunización con CD puede combinarse eficazmente con el bloqueo de PD-1 para activar respuestas antitumorales más potentes.

El bloqueo de PD-1 también se puede combinar con tratamientos convencionales contra el cáncer. El bloqueo de PD-1 puede combinarse eficazmente con regímenes quimioterapéuticos. En estos casos, puede ser posible reducir la dosis de reactivo quimioterapéutico administrado (Mokyr, M. et al. (1998) Cancer Research 58: 5301 a 5304). Un ejemplo de tal combinación es un anticuerpo anti-PD-1 combinado con descarbazina para el tratamiento del melanoma. Otro ejemplo de tal combinación es un anticuerpo anti-PD-1 combinado con interleuquina-2 (IL-2) para el tratamiento del melanoma. El fundamento científico detrás del uso combinado del bloqueo de PD-1 y la quimioterapia es que la muerte celular, que es una consecuencia de la acción citotóxica de la mayoría de los compuestos quimioterapéuticos, debe dar como resultado el aumento de los niveles de antígeno tumoral en la ruta de presentación de antígeno. Otras terapias combinadas que pueden dar como resultado la sinergia con el bloqueo

de PD-1 por medio de la muerte celular son la radiación, la cirugía, y la privación de hormonas. Cada uno de estos protocolos crea una fuente de antígeno tumoral en el anfitrión. Los inhibidores de la angiogénesis también se pueden combinar con el bloqueo de PD-1. La inhibición de la angiogénesis conduce a la muerte de la célula tumoral que puede alimentar el antígeno tumoral a las rutas de presentación del antígeno al anfitrión.

Los anticuerpos de bloqueo de PD-1 también se puede utilizar combinados con anticuerpos biespecíficos, que dirigen las células efectoras que expresan los receptores Fc alfa o Fc gamma a las células tumorales (véanse, p. ej., las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.922.845 y 5.837.243). Los anticuerpos biespecíficos se pueden utilizar para elegir como diana dos antígenos separados. Por ejemplo se han utilizado anticuerpos biespecíficos antireceptor de Fc/anti-antígeno tumoral (p. ej., Her-2/neu) para dirigir los macrófagos a los sitios de tumor. Esta orientación puede activar más eficazmente las respuestas específicas al tumor. La rama de las células T de estas respuestas aumentaría por el uso del bloqueo de PD-1. Alternativamente, el antígeno puede ser liberado directamente a las CD mediante el uso de anticuerpos biespecíficos que se unen al antígeno tumoral y un marcador de superficie celular específico de células dendríticas.

Los tumores evaden la vigilancia inmunitaria del anfitrión mediante una gran variedad de mecanismos. Muchos de estos mecanismos pueden ser superados por la inactivación de proteínas que son expresadas por los tumores y que son inmunosupresoras. Estas incluyen, entre otras TGF-beta (Kehrl, J. et al. (1986) J. Exp.. Med. 163: 1037-1050), IL-10 (Howard, M. y O'Garra, A. (1992) Immunology Today 13: 198-200), y ligando de Fas (Hahne, M. et al. (1996) Science 274: 1363-1365). Los anticuerpos contra cada una de estas entidades se pueden usar combinados con antiPD-1 para contrarrestar los efectos del agente inmunosupresor y favorecer las respuestas inmunitarias contra tumores del anfitrión.

Otros anticuerpos que se pueden utilizar para activar la capacidad de respuesta inmunitaria del anfitrión se pueden utilizar combinados con anti-PD-1. Estos incluyen moléculas sobre la superficie de células dendríticas que activan la función de las CD y la presentación de antígenos. Los anticuerpos anti-CD40 son capaces de sustituir eficazmente la actividad de las células T coadyuvantes (Ridge, J. et al. (1998) Nature 393: 474-478) y se pueden utilizar junto con anticuerpos contra PD-1 (Ito, N. et al. (2000) Immunobiology 201 (5) 527-40). La activación de anticuerpos contra moléculas coestimuladoras de células T tales como CTLA-4 (p. ej., Patente de los Estados Unidos Núm. 5.811.097), OX-40 (Weinberg, A. et al. (2000) Immunol 164: 2160-2169), 4-1BB (Melero, I. et al. (1997) Nature Medicine 3: 682685 (1997), e ICOS (Hutloff, A. et al. (1999) Naturaleza 397: 262-266) también puede proporcionar un aumento de los niveles de activación de las células T.

El trasplante de médula ósea se está utilizando actualmente para tratar una variedad de tumores de origen hematopoyético. Si bien la enfermedad de injerto contra anfitrión es una consecuencia de este tratamiento, se puede obtener beneficio terapéutico a partir de respuestas de injerto frente a tumor. El bloqueo de PD-1 se puede utilizar para aumentar la eficacia de las células T específicas del tumor injertadas del donante.

También existen varios protocolos de tratamiento experimental que implican activación y expansión ex vivo de células T específicas de antígenos y la transferencia adoptiva de estas células a receptores con el fin de obtener células T específicas de antígenos contra tumores (Greenberg, R. y Riddell, S. (1999) Science 285: 546-51). Estos métodos también pueden usarse para activar respuestas de células T a agentes infecciosos tales como CMV. Se puede esperar que la activación ex vivo en presencia de anticuerpos anti-PD-1 aumente la frecuencia y actividad de las células T transferidas de manera adoptiva.

Enfermedades Infecciosas

Los anticuerpos de la invención se pueden utilizar para tratar a pacientes que han estado expuestos a toxinas o patógenos particulares. En consecuencia, una enfermedad infecciosa en un sujeto puede ser tratada mediante la administración al sujeto de un anticuerpo anti-PD-1 de la invención, de manera que el sujeto sea tratado para la enfermedad infecciosa.

Al igual que en su aplicación a los tumores comentados anteriormente, el bloqueo de PD-1 mediado por anticuerpos se puede utilizar solo, o como un adyuvante, combinado con vacunas, para estimular la respuesta inmunitaria a patógenos, toxinas y antígenos propios. Los ejemplos de patógenos para los cuales este enfoque terapéutico puede ser particularmente útil, incluyen patógenos para los cuales no existe actualmente ninguna vacuna eficaz, o patógenos para los cuales las vacunas convencionales son menos que completamente eficaces. Estos incluyen, pero no se limitan a VIH, hepatitis (A, B, y C), Gripe, Herpes, Giardia, Malaria, Leishmania, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa. El bloqueo de PD-1 es particularmente útil contra infecciones establecidas por agentes tales como VIH que presentan antígenos alterados a lo largo del curso de las infecciones. Estos epítopos novedosos se reconocen como extraños en el momento de la administración de anti-PD-1 humana, provocando así una respuesta de células T fuerte que no está amortiguada por señales negativas a través de PD-1.

Algunos ejemplos de virus patógenos que causan infecciones tratables por los anticuerpos de la invención incluyen el VIH, la hepatitis (A, B, o C), virus del herpes (p. ej., VZV, HSV-1, 6-HAV, HSV-II, y CMV, virus de Epstein Barr), adenovirus, virus de la influenza, flavivirus, echovirus, rinovirus, virus de coxsackie, cornovirus, virus sincitial respiratorio, virus de las paperas, rotavirus, virus del sarampión, virus de la rubéola, parvovirus, virus vaccinia, virus HTLV, virus del dengue, virus del papiloma, virus del molusco, poliovirus, virus de la rabia, virus JC y virus de la encefalitis por arbovirus.

Algunos ejemplos de bacterias patógenas que causan infecciones tratables por los anticuerpos de la invención incluyen clamidia, bacterias rickettsiales, micobacterias, estafilococos, estreptococos, pneumonococos, meningococos y gonococos, klebsiella, proteus, serratia, pseudomonas, legionella, difteria, salmonela, bacilos, cólera, tétanos, botulismo, ántrax, peste, leptospirosis y bacterias de la enfermedad de Lyme.

Algunos ejemplos de hongos patógenos que causan infecciones tratables por los anticuerpos de la invención incluyen Candida (albicans, krusei, glabrata, tropicalis, etc), Cryptococcus neoformans, Aspergillus (fumigatus, niger, etc), géneros de Mucorales (mucor, absidia, rhizophus), Sporothrix schenckii, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitis y Histoplasma capsulatum.

Algunos ejemplos de parásitos patógenos que causan infecciones tratables por los anticuerpos de la invención incluyen Entamoeba histolytica, Balantidium coli, Naegleriafowleri, Acanthamoeba sp., Giardia lamblia, Cryptosporidium sp., Pneumocystis carinii, Plasmodium vivax, Babesia microti, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Toxoplasma Gondi y Nippostrongylus brasiliensis.

En todos los métodos anteriores, el bloqueo de PD-1 puede ser combinado con otras formas de inmunoterapia tal como tratamiento con citoquinas (p. ej., interferones, GM-CSF, G-CSF, IL-2), o terapia con anticuerpos biespecíficos, que se proporciona para mejorar la presentación de los antígenos tumorales (véase, p. ej., Holliger (1993) Proc. Natl. Acad. USA 90:6444-6448; Poljak (1994) Structure 2:1121-1123).

Reacciones autoinmunes

Los anticuerpos anti-PD-1 de la invención pueden provocar y amplificar respuestas autoinmunes. De hecho, la inducción de respuestas antitumorales utilizando células tumorales y vacunas de péptidos revela que muchas de las respuestas antitumorales incluyen anti-autoreactividades (despigmentación observada en anti-CTLA-4 + melanoma B16 modificado con GM-CSF en van Elsas et al. supra; despigmentación en ratones vacunados con Trp-2 (Overwijk,

W. et al. (1999) Proc. Natl. Acad. EE.UU. 96: 2982-2987); prostatitis autoinmune provocada por vacuna de células tumorales TRAMP (Hurwitz, A. (2000) supra), vacunación con antígeno peptídico de melanoma y vitíligo observado en ensayos clínicos humanos (Rosenberg, SA y White, DE (1996) J. Immunother Emphasis Tumor Immunol 19 (1): 81-4).

Por lo tanto, es posible considerar el uso de bloqueo anti-PD-1 junto con diversas proteínas propias con el fin de diseñar protocolos de vacunación para generar eficazmente respuestas inmunológicas contra estas proteínas propias para el tratamiento de la enfermedad. Por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer implica acumulación inapropiada de péptido Aß en depósitos amiloides en el cerebro; las respuestas de anticuerpos contra amiloide son capaces de limpiar estos depósitos amiloides (Schenk et al, (1999) Nature 400: 173-177).

Otras proteínas propias también se pueden usar como dianas tales como IgE para el tratamiento de la alergia y el asma, y TNF para la artritis reumatoide. Por último, las respuestas de anticuerpos a varias hormonas pueden ser inducidas por el uso de anticuerpo anti-PD-1. Las respuestas de anticuerpos neutralizantes a las hormonas reproductivas se pueden usar para la anticoncepción. Las respuestas de anticuerpos neutralizantes a las hormonas y otros factores solubles que se requieren para el crecimiento de tumores particulares también pueden considerarse como posibles dianas de vacunación.

Se pueden utilizar métodos análogos a los descritos anteriormente para el uso de anticuerpo anti-PD-1 para la inducción de respuestas autoinmunitarias terapéuticas para tratar pacientes que tienen una acumulación inapropiada de otros antígenos propios, tales como depósitos amiloides, incluyendo Aß en la enfermedad de Alzheimer, citoquinas tales como TNFa, e IgE.

Vacunas

Los anticuerpos anti-PD-1 de la invención se pueden utilizar para estimular las respuestas inmunes específicas de antígeno mediante co-administración de tal anticuerpo anti-PD-1 con un antígeno de interés (p. ej., una vacuna). Por consiguiente, una respuesta inmunitaria a un antígeno en un sujeto se puede mejorar administrando al sujeto: (i) el antígeno; y (ii) un anticuerpo anti-PD-1 de la invención, o porción de unión a antígeno del mismo, de manera que se potencie una respuesta inmunitaria al antígeno en el sujeto. Preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo humano anti-PD-1 humana (tal como cualquiera de los anticuerpos anti-PD-1 humanos descritos en la presente memoria).

Adicionalmente o alternativamente, el anticuerpo puede ser un anticuerpo quimérico o humanizado. El antígeno puede ser, p. ej., un antígeno tumoral, un antígeno viral, un antígeno bacteriano o un antígeno de un patógeno. Los ejemplos no limitantes de tales antígenos incluyen los descritos en las secciones anteriores, tales como los antígenos tumorales (o vacunas contra tumores) descritos anteriormente, o antígenos de los virus, bacterias u otros patógenos descritos anteriormente.

Las rutas adecuadas de administración de las composiciones de anticuerpos (p. ej., anticuerpos monoclonales humanos, moléculas y productos inmunoconjugados multiespecíficos y biespecíficos) de la invención in vivo e in vitro son bien conocidas en la técnica y pueden ser seleccionadas por los expertos normales. Por ejemplo, las composiciones de anticuerpos se pueden administrar mediante inyección (p. ej., intravenosa o subcutánea). Las dosificaciones adecuadas de las moléculas utilizadas dependerán de la edad y el peso del sujeto y de la concentración y/o formulación de la composición de anticuerpo. Como se ha descrito anteriormente, los anticuerpos anti-PD-1 humana de la invención puede ser administrados simultáneamente con uno o más de otros agentes terapéuticos, p. ej., un agente citotóxico, un agente radiotóxico o un agente inmunosupresor. El anticuerpo se puede conectar al agente (en forma de un inmunocomplejo) o se puede administrar separado del agente. En este último caso (administración separada), el anticuerpo se puede administrar antes, después o conjuntamente con el agente o se puede administrar simultáneamente con otras terapias conocidas, p. ej., una terapia contra el cáncer, p. ej., radiación. Tales agentes terapéuticos incluyen, entre otros, agentes anti-neoplásicos tales como doxorrubicina (adriamicina), cisplatino, sulfato de bleomicina, carmustina, clorambucilo, dacarbazina y ciclofosfamida, hidroxiurea que, por sí mismos, solo son eficaces a niveles que son tóxicos o subtóxicos para un paciente. El cisplatino se administra por vía intravenosa en forma de 100 mg/dosis una vez cada cuatro semanas y la adriamicina se administra por vía intravenosa en una dosis de 60-75 mg/ml una vez cada 21 días. La administración simultánea de los humanos anti-PD-1, anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, de la presente invención con agentes quimioterapéuticos proporciona dos agentes anticáncer que funcionan a través de diferentes mecanismos que producen un efecto citotóxico para las células tumorales humanas. Tal administración simultánea puede resolver los problemas debidos al desarrollo de resistencia a los medicamentos o a cambios en la antigenicidad de las células tumorales que las vuelven no reactivas con el anticuerpo.

También se describen en la presente memoria kits que comprenden las composiciones de anticuerpos de la invención (p. ej., anticuerpos humanos, moléculas biespecíficas o multiespecíficas, o productos inmunoconjugados) e instrucciones de uso. El kit puede contener adicionalmente al un menos un reactivo adicional, o uno o más anticuerpos humanos adicionales de la invención (p. ej., un anticuerpo humano que tiene una actividad complementaria que se une a un epítopo en el antígeno PD-1 distinto del primer anticuerpo humano). Los kits incluyen típicamente una etiqueta que indica el uso pretendido del contenido del kit. El término etiqueta incluye cualquier escrito, o material impreso suministrado en o con el kit, o que acompañe de otra manera al kit.

Terapia combinada

La presente invención se basa, en parte, de los siguientes datos experimentales. Se utilizaron Modelos tumorales de ratón (MC38 cáncer de colon y SA1/N fibrosarcoma) para examinar el efecto in vivo del tratamiento de un tumor mediante la combinación de anticuerpos anti-CTLA-4 y anti-PD-1 terapéuticos inmunoestimuladores. La combinación inmunoterapéutica se proporcionó ya sea simultáneamente con el implante de las células tumorales (Ejemplos 14 y 17) o después de implantar las células tumorales durante un tiempo suficiente para convertirse en un tumor establecido (Ejemplos 15, 16 y 18). Independientemente del tiempo de tratamiento con el anticuerpo, se encontró que el tratamiento con anticuerpo anti-CTLA-4 solo y el tratamiento con anticuerpo anti-PD-1 (anticuerpo quimérico en el que se modificó un anti-PD-1 de ratón de rata con una región Fc de inmunoglobulina de ratón, véase el Ejemplo 1) solo tuvo un efecto modesto sobre la reducción del crecimiento tumoral en el modelo de tumor MC38 (véanse, p. ej., las figuras 21, 24 y 27). El anticuerpo anti-CTLA 4 solo fue bastante eficaz en el modelo de tumor SA1/N (véase la Figura 30D), lo que requirió una dosis de anticuerpo anti-CTLA 4 más baja para los estudios de combinación en este modelo. No obstante, el tratamiento combinado de anticuerpos anti-CTLA-4 y anticuerpo antiPD-1 mostró un inesperado efecto significativamente mayor en la reducción de crecimiento del tumor en comparación con el tratamiento con el anticuerpo solo (véanse, p. ej., las Figuras 21D, 24D, 30F y 33H-J). Además, los resultados de los Ejemplos 14, 16 y 18 muestran que el tratamiento combinado de anticuerpo anti-CTLA-4 y anticuerpo anti-PD-1 tuvo un efecto significativo (sinérgico) en el crecimiento del tumor incluso a dosis terapéuticas subóptimas en comparación para el tratamiento con cualquier anticuerpo solo (es decir, la terapia combinada fue sorprendentemente más eficaz a dosis subterapéuticas de cualquier monoterapia). Sin desear estar ligado a la teoría, es posible que al elevar el umbral de activación de células T por el bloqueo de PD-1 y CTLA-4, se puedan activar las respuestas anti-tumorales en un anfitrión.

En una realización, por lo tanto, una enfermedad hiperproliferativa se puede tratar mediante la administración de un anticuerpo contra PD-1 de la invención y un anticuerpo CTLA-4 a un sujeto. En otras realizaciones, el anticuerpo anti-PD-1 se administra a una dosis subterapéutica, el anticuerpo anti-CTLA-4 se administra a una dosis subterapéutica, o ambos se administran a una dosis subterapéutica. En otra realización, un evento adverso asociado

con el tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa con un agente inmunoestimulador puede ser alterado mediante la administración de un anticuerpo anti-PD-1 de la invención y una dosis subterapéutica de un anticuerpo anti-CTLA-4 a un sujeto. En ciertas realizaciones, el sujeto es humano. En ciertas realizaciones, el anticuerpo antiCTLA-4 es la secuencia del anticuerpo monoclonal humano 10D1 y el anticuerpo anti-PD-1 es un anticuerpo monoclonal de secuencia humana, tal como 5C4.

El anticuerpo anti-CTLA-4 y los anticuerpos monoclonales (mAb) anti-PD-1 y los anticuerpos de secuencia humana de la invención pueden ser producidos mediante una variedad de técnicas, incluyendo la metodología convencional de anticuerpo monoclonal, p. ej., la técnica convencional de hibridación de células somáticas de Kohler y Milstein (1975) Nature 256:495. Se puede emplear cualquier técnica para la producción del anticuerpo monoclonal, p. ej., transformación viral u oncogénica de linfocitos B. Un sistema animal para preparar hibridomas es el sistema murino. La producción de hibridomas en el ratón es un procedimiento muy bien establecido. Los protocolos de inmunización y las técnicas para el aislamiento de esplenocitos inmunizados para la fusión son conocidos en la técnica. Los compañeros de fusión (p. ej., células de mieloma murino) y los procedimientos de fusión también se conocen (véase,

p. ej., Harlow y Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor de Nueva York).

Los anticuerpos anti-CTLA-4 pueden unirse a un epítopo sobre CTLA-4 con el fin de inhibir CTLA-4 de la interacción con un contrarreceptor B7 humano. Debido a que la interacción de CTLA-4 con B7 humano transduce una señal que conduce a la inactivación de las células T que portan el receptor de CTLA-4 humano, el antagonismo de la interacción induce, aumenta o prolonga de manera eficaz la activación de las células T que portan el receptor de CTLA-4 humano, prolongando o aumentando de ese modo una respuesta inmunitaria. Los anticuerpos anti-CTLA-4 se describen en las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.811.097; 5.855.887; 6.051.227; en las Publicaciones de las Solicitudes PCT Núms. WO 01/14424 y WO 00/37504, y en Publicación de la Patente de los Estados Unidos 2002/0039581. Un anticuerpo anti-CTLA-4 clínico ilustrativo es el anticuerpo monoclonal humano 10D1 descrito en el documento WO 01/14424 y la Solicitud de Patente de los Estados Unidos Núm. 09/644.668. El anticuerpo 10D1 se ha administrado en dosis únicas y múltiples, solo o combinado con una vacuna, quimioterapia, o interleuquina-2 a más de 500 pacientes con diagnóstico de melanoma metastásico, cáncer de próstata, linfoma, cáncer de células renales, cáncer de mama, cáncer de ovario, y VIH. Otros anticuerpos anti-CTLA-4 abarcados por los métodos de la presente invención incluyen, p. ej., los descritos en: el documentos WO 98/42752; el documento WO 00/37504; la Patente de los Estados Unidos Núm. 6.207.156; Hurwitz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (17): 1006710071; Camacho et al. (2004) J. Clin. Oncology 22 (145): Resumen Núm. 2505 (anticuerpo CP-675206), y Mokyr et al. (1998) Cancer Res. 58:5301-5304. En ciertas realizaciones, se utiliza un anticuerpo anti-CTLA-4 que es un anticuerpo de secuencia humana, preferiblemente un anticuerpo monoclonal. En otra realización, se utiliza el anticuerpo monoclonal 10D1.

En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-CTLA-4 se une a CTLA-4 humano con una KD de 5 x 10-8 M o menos, se une a CTLA-4 humano con una KD de 1 x 10-8M o menos, se une a CTLA-4 humano con una KD de 5x10-9 M o menos, o se une a CTLA-4 humano con una KD de entre 1 x 10-8 M y 1 x 10-10 M o menos.

La combinación de anticuerpos es útil para la mejora de una respuesta inmunitaria contra una enfermedad hiperproliferativa mediante el bloqueo de PD-1 y CTLA-4. En una realización preferida, los anticuerpos de la presente invención son anticuerpos humanos. Por ejemplo, estas moléculas pueden administrarse a células en cultivo, in vitro o ex vivo, o a sujetos humanos, p. ej., in vivo, para potenciar la inmunidad en una variedad de situaciones. Por consiguiente, se puede modificar una respuesta inmunitaria en un sujeto mediante la administración al sujeto de una combinación de anticuerpos, o una combinación de porciones de unión a antígeno de los mismos, de la invención de manera que se modifique la respuesta inmunitaria en el sujeto. Preferiblemente, la respuesta es potenciada, estimulada o regulada al alza. En otra realización, los eventos adversos asociados con el tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa con un agente terapéutico inmunoestimulador pueden ser alterados mediante la administración de un anticuerpo anti-PD-1 de la invención y una dosis subterapéutica de anticuerpo anti-CTLA 4 a un sujeto.

El bloqueo de PD-1 y CTLA-4 mediante anticuerpos puede potenciar la respuesta inmunitaria a células cancerosas en el paciente. Los cánceres cuyo crecimiento puede ser inhibido mediante los anticuerpos de la presente descripción incluyen cánceres que normalmente responden a la inmunoterapia. Los ejemplos representativos de tipos de cáncer para el tratamiento con la terapia combinada de la presente descripción incluyen melanoma (p. ej., melanoma maligno metastásico), cáncer renal, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de colon y cáncer de pulmón. Ejemplos de otros tipos de cáncer que se pueden tratar utilizando los métodos de la presente descripción incluyen cáncer de hueso, cáncer de páncreas, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma maligno cutáneo o intraocular, cáncer de útero, cáncer de ovario, cáncer de recto, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer de útero, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma del cuello uterino, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, enfermedad de Hodgkin, linfoma no-Hodgkin, cáncer del esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroides, cáncer de la glándula suprarrenal, sarcoma de tejidos blandos, cáncer de

la uretra, cáncer del pene, leucemias crónicas o agudas incluyendo leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, la leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crónica, tumores sólidos de la infancia, linfoma linfocítico, cáncer de la vejiga, cáncer del riñón o uréter, carcinoma de la pelvis renal, neoplasias del sistema nervioso central (SNC), linfoma primario del SNC, angiogénesis tumoral, tumor de eje espinal, glioma del tronco encefálico, adenoma de la pituitaria, sarcoma de Kaposi, cáncer epidermoide, cáncer de células escamosas, linfoma de células T, cánceres inducidos ambientalmente incluyendo los inducidos por el amianto, y combinaciones de dichos cánceres. También se pueden tratar cánceres metastásicos.

En ciertas realizaciones, la combinación de anticuerpos terapéuticos comentados en la presente memoria pueden ser administrados simultáneamente como una composición única en un vehículo farmacéuticamente aceptable, o al mismo tiempo como composiciones separadas con cada anticuerpo en un portador farmacéuticamente aceptable. En otra realización, la combinación de anticuerpos terapéuticos puede administrarse secuencialmente. Por ejemplo, un anticuerpo anti-CTLA-4 y un anticuerpo anti-PD-1 se puede administrar de forma secuencial, por ejemplo administrando primero anti-CTLA-4 y anti-PD-1 segundo, o administrando primero anti-PD-1 y anti-CTLA-4 segundo. Además, si se administra de forma secuencial más de una dosis de la terapia combinada, el orden de la administración secuencial puede ser revertida o mantenida en el mismo orden en cada momento de administración, las administraciones secuenciales se pueden combinar con las administraciones simultáneas, o cualquier combinación de las mismas. Por ejemplo, la primera administración de una combinación de anticuerpo anti-CTLA-4 y anticuerpo anti-PD-1 puede ser concurrente, la segunda administración puede ser secuencial con anti-CTLA-4 primero y anti-PD-1 segundo, y la tercero administración puede ser secuencial con anti-PD-1 primero y anti-CTLA-4 segundo, etc. Otro esquema de dosificación representativo podrá implicar una primera administración que es secuencial con anti-PD-1 primero y anti-CTLA-4 segundo, y las administraciones posteriores pueden ser concurrentes.

Opcionalmente, la combinación de anticuerpos anti-PD-1 y anti-CTLA-4 se pueden combinar adicionalmente con un agente inmunogénico, tal como células cancerosas, antígenos tumorales purificados (incluyendo proteínas, péptidos, y moléculas de hidratos de carbono recombinantes), células, y células transfectadas con genes que codifican citoquinas estimulantes del sistema inmunitario (He et al. (2004) J. Immunol. 173:4919-28). Los ejemplos no limitantes de vacunas tumorales que se pueden utilizar incluyen péptidos de antígenos de melanoma, tales como péptidos de gp100, antígenos MAGE, Trp-2, MART1 y/o tirosinasa, o células tumorales transfectadas para expresar la citoquina GM-CSF (discutido adicionalmente a continuación).

Un combinado bloqueo de PD-1 y CTLA-4 combinado se puede combinar adicionalmente con un protocolo de vacunación. Se han ideado muchas estrategias experimentales para la vacunación contra tumores (véase Rosenberg, S. (2000) Development of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring: 60-62; Logothetis, C., 2000, ASCO Educational Book Spring: 300-302; Khayat, D. (2000) ASCO Educational Book Spring: 414-428; Foon,

K. (2000) ASCO Educational Book Spring: 730-738; véase también Restifo and Sznol, Cancer Vaccines, Ch. 61, págs. 3023-3043 in DeVita et al. (eds.), 1997, Cancer: Principles and Practice of Oncology. Fifth Edition). En una de estas estrategias, una vacuna se prepara utilizando células tumorales autólogas o alogénicas. Estas vacunas celulares han demostrado ser más eficaces cuando las células tumorales se transducen para expresar GM-CSF. Se ha demostrado que GM-CSF es un potente activador de la presentación de antígeno para vacunación tumoral (Dranoff et al. (1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA. 90: 3539-43).

El estudio de la expresión génica y los patrones de expresión génica a gran escala en varios tumores ha conducido a la definición de los denominados antígenos específicos de tumor (Rosenberg (1999) Immunity 10:281-7). En muchos casos, estos antígenos específicos de tumor son antígenos de diferenciación expresados en los tumores y en la célula de la que surgió el tumor, por ejemplo antígenos gp100 de melanocitos, antígenos MAGE, y Trp-2. Más importante aún, se puede demostrar que muchos de estos antígenos son el blanco de las células T específicas de tumor encontradas en el anfitrión. En ciertas realizaciones, un bloqueo combinado de PD-1 y CTLA-4 utilizando las composiciones de anticuerpos descritas en la presente memoria puede utilizarse junto con una colección de proteínas recombinantes y/o péptidos expresados en un tumor con el fin de generar una respuesta inmunitaria a estas proteínas. Estas proteínas son normalmente vistas por el sistema inmunitario como antígenos propios y son, por lo tanto, tolerantes a ellas. El antígeno tumoral también puede incluir la proteína telomerasa, que se requiere para la síntesis de telómeros de los cromosomas y que se expresa en más de 85% de los cánceres humanos y sólo en un número limitado de tejidos somáticos (Kim et al. (1994) Science 266: 2011-2013). (Estos tejidos somáticos pueden ser protegidos del ataque inmunitario mediante diversos medios). Los antígenos tumorales también pueden ser "neo-antígenos" expresados en células cancerosas debido a mutaciones somáticas que alteran la secuencia de proteínas o crean proteínas de fusión entre dos secuencias no relacionadas (es decir, bcr-abl en el cromosoma Philadelphia), o el idiotipo a partir de tumores de células B.

Otras vacunas tumorales pueden incluir las proteínas de los virus implicados en cánceres humanos tales como el Virus de Papiloma Humano (HPV), el Virus de la Hepatitis (VHB y VHC) y el Virus del Herpes del Sarcoma de Kaposi (KHSV). Otras formas de antígeno específico de tumor que pueden ser utilizadas junto con el bloqueo de PD-1 son las Proteínas de Choque Térmico (HSP) aisladas del propio tejido tumoral purificado. Estas proteínas de choque

térmico contienen fragmentos de proteínas de las células tumorales y estas HSP son altamente eficaces en la liberación a las células presentadoras de antígenos para provocar inmunidad tumoral (Suot y Srivastava (1995) Science 269:1585-1588; Tamura et al. (1997) Ciencia 278:117-120).

Las células dendríticas (CD) son células presentadoras de antígenos potentes que se pueden utilizar para cebar respuestas específicas de antígeno. Las CD pueden producirse ex vivo y cargarse con diversos antígenos de proteínas y péptidos, así como extractos de células tumorales (Nestle et al. (1998) Nature Medicine 4: 328-332). Las CD también pueden ser transducidas por medios genéticos para expresar también estos antígenos tumorales. Las CD también se han fusionado directamente con células tumorales con fines de inmunización (Kugler et al. (2000) Nature Medicine 6:332-336). Como método de vacunación, la inmunización con CD se puede combinar eficazmente de manera adicional con un bloqueo combinado de PD-1 y CTLA-4 para activar respuestas antitumorales más potentes. Un bloqueo combinado de PD-1 y CTLA-4 también se pueden combinar adicionalmente con tratamientos contra el cáncer convencionales. Por ejemplo, un bloqueo combinado de PD-1 y CTLA-4 puede combinarse eficazmente con regímenes quimioterapéuticos. En estos casos, como se observa con la combinación de anticuerpos anti-PD-1 y anti-CTLA-4, puede ser posible reducir la dosis del otro reactivo quimioterapéutico administrado con la combinación de la presente descripción (Mokyr et al. (1998) Cancer Research 58: 5301 a 5304). Un ejemplo de tal combinación es una combinación de anticuerpos anti-PD-1 y anti-CTLA-4 adicionalmente combinados con dacarbazina para el tratamiento del melanoma. Otro ejemplo es una combinación de anticuerpos anti-PD-1 y anti-CTLA-4 adicionalmente combinados con interleuquina-2 (IL-2) para el tratamiento del melanoma. El fundamento científico detrás del uso combinado del bloqueo de PD-1 y CTLA-4 con quimioterapia es que la muerte celular, que es una consecuencia de la acción citotóxica de la mayoría de los compuestos quimioterapéuticos, debe dar como resultado el aumento de los niveles de antígeno tumoral en la ruta de presentación de antígeno. Otras terapias combinadas que pueden dar como resultado sinergia con un bloqueo combinado de PD-1 y CTLA-4 a través de la muerte celular incluyen radiación, cirugía, o privación hormonal. Cada uno de estos protocolos crea una fuente de antígeno tumoral en el anfitrión. Los inhibidores de la angiogénesis también se pueden combinar con un bloqueo combinado de PD-1 y CTLA-4. La inhibición de la angiogénesis conduce a la muerte celular tumoral, que también puede ser una fuente de antígeno tumoral que se va a alimentar a vías de presentación de antígeno del anfitrión.

Una combinación de anticuerpos de bloqueo contra PD-1 y CTLA-4 también se puede utilizar en combinación con anticuerpos biespecíficos que se dirigen a células efectoras que expresan el receptor Fcα o Fcy a células tumorales (véanse, p. ej., las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5,922,845y 5,837,243). Los anticuerpos biespecíficos se pueden utilizar para dirigirse a dos antígenos separados. Por ejemplo anti-receptor de Fc/antígeno antitumoral (p. ej., anticuerpos Her-2/neu) biespecíficos se han utilizado para dirigir los macrófagos a los sitios de tumor. Este direccionamiento puede activar más eficazmente las respuestas tumorales específicas. El brazo de células T de estas respuestas sería aumentado por el uso de un bloqueo combinado de PD-1 y CTLA-4. Alternativamente, el antígeno puede ser liberado directamente a las CD mediante el uso de anticuerpos biespecíficos que se unen al antígeno tumoral y un marcador de superficie celular específico de células dendríticas.

En otro ejemplo, se puede utilizar una combinación de anticuerpos anti-PD-1 y anti-CTLA-4 junto con anticuerpos anti-neoplásicos, tales como Rituxan® (Rituximab), Herceptin® (Trastuzumab), Bexxar® (Tositumomab), Zevalin® (Ibritumomab), Campath® (Alemtuzumab), Lymphocide® (Eprtuzumab), Avastin® (Bevacizumab) y Tarceva® (Erlotinib), y similares. A modo de ejemplo y sin desear estar ligado a la teoría, el tratamiento con un anticuerpo anticáncer o un anticuerpo anti-cáncer conjugado con una toxina puede conducir a la muerte de células cancerosas (p. ej., células tumorales) que podrían potenciar una respuesta inmunitaria mediada por CTLA-4 o PD-1. En una realización ilustrativa, un tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa (p. ej., un tumor canceroso) puede incluir un anticuerpo anti-cáncer en combinación con anticuerpos anti-PD-1 y anti-CTLA-4, concurrentemente o secuencialmente o cualquier combinación de los mismos, lo que puede potenciar una respuesta inmunitaria antitumoral por el anfitrión.

Los tumores evaden la vigilancia inmunitaria del anfitrión por medio de una gran variedad de mecanismos. Muchos de estos mecanismos pueden superarse mediante la inactivación de las proteínas, que son expresadas por los tumores y que son inmunosupresoras. Estos incluyen, entre otros, TGF-β (Kehrl, J. et al. (1986) J. Exp.. Med. 163: 1037-1050), IL-10 (Howard, M. y O'Garra, A. (1992) Immunology Today 13: 198-200), y ligando Fas (Hahne, M. et al. (1996) Science 274: 1363-1365). En otro ejemplo, los anticuerpos para cada una de estas entidades se pueden combinar adicionalmente con una combinación de anti-PD-1 y anti-CTLA-4 para contrarrestar los efectos de los agentes inmunosupresores y favorecer las respuestas inmunológicas contra los tumores por el anfitrión.

Otros anticuerpos que se pueden utilizar para activar la capacidad de respuesta inmunitaria del anfitrión pueden utilizarse adicionalmente combinados con una combinación de anti-PD-1 y anti-CTLA-4. Estos incluyen moléculas sobre la superficie de las células dendríticas que activan la función de las CD y la presentación de antígenos. Los anticuerpos anti-CD40 son capaces de sustituir eficazmente la actividad de las células T coadyuvantes (Ridge, J. et al. (1998) Nature 393: 474-478) y se pueden utilizar junto con una combinación de anti-PD-1 y anti-CTLA-4 (Ito, N. et al. (2000) Inmunobiología 201 (5) 527-40). La activación de anticuerpos contra moléculas coestimuladoras de células

T, tales como OX-40 (Weinberg, A. et al. (2000) Immunol 164: 2160-2169), 4-1BB (Melero, I. et al. (1997) Nature Medicine 3: 682-685 (1997), e ICOS (Hutloff, A. et al. (1999) Nature 397: 262-266) también puede proporcionar niveles aumentados de activación de células T.

El trasplante de médula ósea se está utilizando actualmente para tratar una variedad de tumores de origen hematopoyético. Si bien la enfermedad de injerto contra anfitrión es una consecuencia de este tratamiento, se puede obtener beneficio terapéutico a partir de las respuestas del injerto frente al tumor. Se puede utilizar un bloqueo combinado de PD-1 y CTLA-4 para aumentar la eficacia de las células T específicas del tumor injertadas del donante.

También existen varios protocolos de tratamiento experimental que implican la activación y expansión ex vivo de células T específicas de antígenos y la transferencia adoptiva de estas células a receptores con el fin de obtener antígenos específicos de células T contra el tumor (Greenberg, R. & Riddell, S. (1999) Science 285: 546-51). Estos métodos también pueden usarse para activar las respuestas de células T contra agentes infecciosos tales como CMV. Se puede esperar que a activación ex vivo en presencia de anticuerpos anti-PD-1 y anti-CTLA-4 aumente la frecuencia y actividad de las células T transferidas de manera adoptiva.

Como se ha establecido en la presente memoria, los órganos pueden exhibir eventos adversos relacionados con la inmunidad posteriores a la terapia inmunoestimuladora con anticuerpo terapéutico, tal como el tracto GI (diarrea y colitis) y la piel (exantema y prurito) después del tratamiento con anticuerpo anti-CTLA-4. Por ejemplo, los eventos adversos gastrointestinales no colónicos relacionados con la inmunidad se han observado también en el esófago (esofagitis), duodeno (duodenitis), y el íleon (ileítis) después de tratamiento anticuerpo anti-CTLA-4.

En ciertas realizaciones, un evento adverso asociado con el tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa con un agente inmunoestimulador puede ser alterado mediante la administración de un anticuerpo anti-PD-1 de la invención y una dosis subterapéutica de anticuerpo anti-CTLA-4 a un sujeto. Por ejemplo, la incidencia de colitis o diarrea inducida por anticuerpos inmunoestimuladores terapéuticos puede ser reducida mediante la administración de un esteroide no absorbible al paciente. Debido a que cualquier paciente que va a recibir un anticuerpo terapéutico inmunoestimulador está en riesgo de desarrollo de colitis o diarrea inducidas por dicho anticuerpo, toda esta población de pacientes es adecuada para la terapia que utiliza anticuerpos de la presente invención. Aunque los esteroides se han administrado para tratar la enfermedad inflamatoria intestinal (EII) y prevenir las exacerbaciones de la EII, no han sido utilizados para prevenir (reducir la incidencia de) EII en pacientes que no han sido diagnosticados de EII. Los efectos secundarios significativos asociados con esteroides, incluso esteroides no absorbibles, han desalentado el uso profiláctico.

En realizaciones adicionales, una combinación de bloqueo de PD-1 y CTLA-4 (es decir, anticuerpos anti-PD-1 y antiCTLA-4 inmunoestimuladores terapéuticos) se pueden combinar adicionalmente con el uso de cualquier esteroide no absorbible. Según se utiliza en la presente memoria, un "esteroide no absorbible" es un glucocorticoide que exhibe un amplio metabolismo de primer paso de tal manera que, después del metabolismo en el hígado, la biodisponibilidad del esteroide es baja, es decir, menos de aproximadamente 20%. En una realización de la invención, el esteroide no absorbible es la budesonida. La budesonida es un glucocorticosteroide que actúa localmente, que se metaboliza extensivamente, principalmente en el hígado, tras la administración oral. ENTOCORT CE® (Astra-Zeneca) es una formulación oral de budesonida dependiente del pH y del tiempo desarrollada para optimizar la administración de fármacos en el íleon y en todo el colon. ENTOCORT CE® está aprobado en los Estados Unidos para el tratamiento de la enfermedad de Crohn leve a moderada que afecta al íleon y/o al colon ascendente. La dosis oral habitual de ENTOCORT CE® para el tratamiento de la enfermedad de Crohn es de 6 a 9 mg/día. ENTOCORT CE® se libera en los intestinos antes de ser absorbido y retenido en la mucosa del intestino. Una vez que pasa a través del tejido diana de la mucosa de intestino, ENTOCORT CE® es metabolizado extensamente por el sistema del citocromo P450 en el hígado a metabolitos con actividad glucocorticoide insignificante. Por lo tanto, la biodisponibilidad es baja (aproximadamente 10%). La baja biodisponibilidad de la budesonida da como resultado una relación terapéutica mejorada en comparación con otros glucocorticoides con metabolismo de primer paso menos extenso. La budesonida da como resultado menos efectos adversos, incluyendo menos supresión hipotalámico-hipofisaria que los corticoides de acción sistémica. Sin embargo, la administración crónica de ENTOCORT CE® puede dar como resultado efectos de glucocorticoides sistémicos tales como supresión de hipercortisolismo y suprarrenal. Véase PDR 58ª ed. 2004; 608-610.

En otras realizaciones adicionales, un bloqueo combinado de PD-1 y CTLA-4 (es decir, anticuerpos anti-PD-1 y antiCTLA-4 inmunoestimuladores terapéuticos) combinado con un esteroide no absorbible pueden combinarse adicionalmente con un salicilato. Los salicilatos incluyen agentes 5-ASA, tales como, por ejemplo: sulfasalazina (AZULFIDINE®, Pharmacia & Upjohn); olsalazina (DIPENTUM®, Pharmacia & Upjohn); balsalazida (COLAZAL®, Salix Pharmaceuticals, Inc.), y mesalamina (ASACOL®, Procter & Gamble Pharmaceuticals; PENTASA®, Shire US; CANASA®, Axcan Scandipharm, Inc.; ROWASA®, Solvay).

Se puede utilizar cualquier administración solapante o secuencial del salicilato y el esteroide no absorbible con el propósito de disminuir la incidencia de la colitis inducida por anticuerpos inmunoestimuladores. Así, p. ej., la incidencia de colitis inducida por los anticuerpos inmunoestimuladores de acuerdo con la presente invención se puede reducir mediante la administración de un salicilato y un esteroide no absorbible de al mismo tiempo o secuencialmente (p. ej., un salicilato se administra 6 horas después de un esteroide no absorbible), o cualquier combinación de los mismos. Además, un salicilato y un esteroide no absorbible pueden ser administrados por la misma ruta (p. ej., ambos se administran por vía oral) o por diferentes rutas (p. ej., un salicilato se administra por vía oral y un esteroide no absorbible se administra por vía rectal), que pueden diferir de la ruta o las rutas utilizadas para administrar los anticuerpos anti-PD-1 y anti-CTLA-4.

La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes Ejemplos que no deben considerarse una limitación adicional. El anticuerpo 5C4 es un anticuerpo de acuerdo con la presente invención.

Ejemplos

Ejemplo 1: Generación de anticuerpos monoclonales humanos contra PD-1

Antígeno

Protocolos de inmunización utilizados como antígeno (i) una proteína de fusión recombinante que comprende la porción extracelular de PD-1 y (ii) PD-1 completa unida a membrana. Ambos antígenos se generaron mediante métodos de transfección recombinante en una línea celular CHO.

Ratones transgénicos HuMab y KM™

Se prepararon anticuerpos monoclonales completamente humanos contra PD-1 utilizando la cepa HCo7 de ratones transgénicos HuMab y la cepa KM de ratones transcromósomicos transgénicos, que expresan cada uno genes de anticuerpos humanos. En cada una de estas cepas de ratón, el gen endógeno de la cadena ligera kappa de ratón ha sido alterado homocigóticamente como describen Chen et al. (1993) EMBO J. 12:811-820 y el gen endógeno de la cadena pesada de ratón ha sido alterado homocigóticamente como se describe en el Ejemplo 1 de la Publicación PCT WO 01/09187. Cada una de estas cepas de ratón porta un transgén de la cadena ligera kappa humana, KCo5, como describe Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851. La cepa HCo7 porta el transgén de la cadena pesada humana HCo7 como se describe en las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.545.806; 5.625.825; y

5.545.807. La cepa KM contiene el transcromosoma SC20 como se describe en la Publicación PCT WO 02/43478.

Inmunizaciones HuMab y KM:

Para generar anticuerpos monoclonales totalmente humanos contra PD-1, se inmunizaron ratones HuMab y KM™ con proteína de fusión PD-1 recombinante purificada y células CHO transfectadas con PD-1 como antígeno. Los esquemas de inmunización generales para los ratones HuMab son descritos por Lonberg, N. et al (1994) Nature 368 (6474): 856-859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851 y la Publicación PCT WO 98/24884. Los ratones tenían 6-16 semanas de edad tras la primera infusión de antígeno. Se utilizaron una preparación purificada recombinante (5-50 g) de antígeno de proteína de fusión de PD-1 y 5-10x106 células para inmunizar a los ratones HuMab y los ratones KM™ por vía intraperitoneal, por vía subcutánea (Sc) o por medio de inyección de almohadilla de la pata.

Los ratones transgénicos fueron inmunizados dos veces con antígeno en coadyuvante completo de Freund o coadyuvante de Ribi IP, seguido de 3-21 días IP (hasta un total de 11 vacunas) con el antígeno en coadyuvante de Freund incompleto o coadyuvante de Ribi. La respuesta inmunitaria se controló mediante sangrados retroorbitales. El plasma se escrutó mediante ELISA (como se describe a continuación), y los ratones con títulos suficientes de antiinmunogolobulina anti-PD-1 humana se utilizaron para las fusiones. Los ratones fueron reforzados intravenosamente con antígeno 3 días antes del sacrificio y la extirpación del bazo. Típicamente, se realizaron 10-35 fusiones para cada antígeno. Se inmunizaron varias decenas de ratones para cada antígeno.

Selección de Ratones HuMab o KM™ que producen anticuerpos anti-PD-1:

Para seleccionar los ratones HuMab o KM™ que producen anticuerpos que se unen a PD-1, los sueros de ratones inmunizados se sometieron a ensayo mediante ELISA como describen Fishwild, D. et al. (1996). En resumen, la placas de microtitulación se recubrieron con proteína de fusión de PD-1 recombinante purificada de células CHO transfectadas a 1-2 µg/ml en PBS, 100 µl/pocillos se incubaron a 4°C durante la noche luego se bloquearon con 200 µl/pocillo de suero bovino fetal 5% en PBS/Tween (0,05%). Se añadieron a cada pocillo las diluciones de los sueros de los ratones inmunizados con PD-1 y se incubaron durante 1-2 horas a temperatura ambiente. Las placas se lavaron con PBS/Tween y se incubaron a continuación con una anticuerpos policlonal de cabra anti-IgG humana conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado, las

placas se desarrollaron con sustrato ABTS (Sigma, A-1888, 0,22 mg/ml) y se analizaron mediante un espectrofotómetro a una DO de 415-495. Los ratones que desarrollaron los títulos más altos de anticuerpos anti-PD1 se utilizaron para las fusiones. Las fusiones se realizaron como se describe a continuación y los sobrenadantes de hibridoma se sometieron a ensayo para determinar la actividad anti-PD-1 mediante ELISA.

Generación de hibridomas que producen anticuerpos monoclonales humanos contra PD-1:

Los esplenocitos de ratón, aislados de los ratones HuMab o KM, se fusionaron con una línea celular de mieloma de ratón utilizando PEG o bien sobre la base de protocolos convencionales o electrofusión basada en campo eléctrico utilizando un electroporador de fusión celular de cámara grande Cyto Pulse (Cyto Pulse Sciences, Inc., Glen Burnie, MD). Los hibridomas resultantes se escrutaron a continuación para determinar la producción de anticuerpos específicos para el antígeno. Las suspensiones de células individuales de esplenocitos de ratones inmunizados se fusionaron a una cuarta parte del número de células de mieloma de ratón no secretoras SP2/0 (ATCC, CRL 1581) con 50% de PEG (Sigma). Las células se sembraron en placas a aproximadamente 1x105/pocillo en una placa de microtitulación de fondo plano, seguido de aproximadamente incubación de dos semanas en medio selectivo que contenía suero bovino fetal al 10%, P388D1 al 10% (ATCC, CRL TIB-63) medio acondicionado, origen al 3-5% (IGEN) en DMEM (Mediatech , CRL 10013, con alto contenido de glucosa, L-glutamina y piruvato de sodio) más HEPES 5 mM, 0,055 mM de 2-mercaptoetanol, 50 mg/ml de gentamicina y 1x HAT (Sigma, P CRL-7185). Después de 1-2 semanas, las células se cultivaron en medio en donde el HAT se reemplazó por HT. Los pocillos individuales se escrutaron a continuación mediante ELISA (descrito anteriormente) para anticuerpos IgG monoclonales anti-PD-1 humanas. Una vez que se produjo un amplio crecimiento del hibridoma, el medio se controló por lo general después de 10-14 días. Los hibridomas que secretan anticuerpos se volvieron a cultivar en placa, se escrutaron de nuevo y, si todavía eran positivos para IgG humana, los anticuerpos monoclonales anti-PD-1 se subclonaron al menos dos veces mediante dilución limitante. Los subclones estables se cultivaron a continuación in vitro para generar pequeñas cantidades de anticuerpo en medio de cultivo de tejido para una caracterización adicional.

Los clones de hibridoma 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 y 5F4 se seleccionaron para su posterior análisis.

Ejemplo 2: Caracterización Estructural de Anticuerpos Monoclonales Humanos 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 y 5F4

Las secuencias de ADNc que codifican las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos monoclonales 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 y 5F4 se obtuvieron a partir de los hibridomas 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 y 5F4, respectivamente, utilizando técnicas de PCR convencionales y se secuenciaron utilizando técnicas de secuenciación de ADN convencionales.

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de 17D8 se muestran en la Figura 1A y en los SEC ID NO: 57 y 1, respectivamente.

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de 17D8 se muestran en la Figura 1B y en los SEC ID NO: 64 y 8, respectivamente.

La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de la cadena pesada de 17D8 con las secuencias de la cadena pesada de inmunoglobulina de la línea germinal humana conocidas demostró que la cadena pesada de 17D8 utiliza un segmento VH de la línea germinal humana 3-33 de VH, un segmento indeterminado D, y un segmento de JH de la línea germinal humana 4b de JH. El alineamiento de la secuencia 17D8 de VH con la secuencia 3-33 de VH de la línea germinal se muestra en la Figura 8. Un análisis adicional de la secuencia 17D8 de VH utilizando el sistema de Kabat de determinación de la región CDR condujo a la delimitación de las regiones CDR1, CDR2 y CD3 de la cadena pesada como se muestra en las Figuras 1A y 8, y en los SEQ ID NO: 15, 22 y 29, respectivamente .

La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de la cadena ligera de 17D8 con las secuencias de la cadena ligera de inmunoglobulina de la línea germinal humana conocidas demostró que la cadena ligera de 17D8 utiliza un segmento VL de la línea germinal humana L6 de VK y un segmento JK de la línea germinal humana 4 de JK. El alineamiento de la secuencia de VL de 17D8 con la secuencia L6 de VK de línea germinal se muestra en la Figura 9. Un análisis adicional detallado de la secuencia de VL de 17D8 utilizando el sistema de Kabat de determinación de la región CDR condujo a la delimitación de las regiones CDR1, CDR2 y CD3 de la cadena ligera como se muestra en las Figuras 1B y 9, y en los SEQ ID NO: 36, 43 y 50, respectivamente .

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de 2D3 se muestran en la Figura 2A y en los SEQ ID NO: 58 y 2, respectivamente.

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de 2D3 se muestran en la Figura 2B y en los SEC ID NO: 65 y 9, respectivamente.

La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de la cadena pesada de 2D3 con las conocidas secuencias de la cadena pesada de inmunoglobulina de la línea germinal humanos demostró que la cadena pesada de 2D3 utiliza un segmento VH de la línea germinal humana 3-33 de VH, un segmento D de la línea germinal humana 7-27, y un segmento de JH de la línea germinal humana 4b de JH. El alineamiento de la secuencia 2D3 de VH con la secuencia de la línea germinal 3-33 de VH se muestra en la Figura 8. Un análisis adicional de la secuencia 2D3de VH utilizando el sistema de Kabat de determinación de la región CDR condujo a la delimitación de las regiones CDR1, CDR2 y CD3 de la cadena pesada como se muestra en las Figuras 2A y 8, y en los SEQ ID NO: 16, 23 y 30, respectivamente .

La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de la cadena ligera de 2D3 con las secuencias de la cadena ligera de inmunoglobulina de la línea germinal humana conocidas demostró que la cadena ligera de 2D3 utiliza un segmento VL de la línea germinal humana L6 de VK y un segmento JK de la línea germinal humana 4 de JK. El alineamiento de la secuencia de VL de 2D3 con la secuencia L6 de VK de la línea germinal se muestra en la Figura

9. Un análisis adicional de la secuencia de VL de 2D3 utilizando el sistema de Kabat de determinación de la región CDR condujo a la delimitación de las regiones CDR1, CDR2 y CD3 de la cadena ligera como se muestra en las Figuras 2B y 9, y en los SEQ ID NO: 37, 44 y 51, respectivamente .

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de 4H1 se muestran en la Figura 3A y en los SEQ ID NO: 59 y 3, respectivamente.

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de 4H1 se muestran en la Figura 3B y en los SEQ ID NO: 66 y 10, respectivamente.

La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de la cadena pesada de 4H1 con las secuencias de la cadena pesada de inmunoglobulina de la línea germinal humana conocidas demostró que la cadena pesada de 4H1 utiliza un segmento VH de la línea germinal humana 3-33 de VH, un segmento indeterminado D, y un segmento JH de la línea germinal humana 4b de JH. El alineamiento de la secuencia de VH de 4H1 con la secuencia de la línea germinal 3-33 de VH se muestra en la Figura 8. Un análisis adicional de la secuencia de VH de 4H1 utilizando el sistema de Kabat de determinación de la región CDR condujo a la delimitación de las regiones CDR1, CDR2 y CD3 de la cadena pesada como se muestra en las Figuras 3A y 8, y en los SEQ ID NO: 17, 24 y 31, respectivamente .

La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de la cadena ligera de 4H1 con las secuencias de la cadena ligera de inmunoglobulina de la línea germinal humana conocidas demostró que la cadena ligera de 4H1 utiliza un segmento VL de la línea germinal humana L6 de VK y un segmento JK de la línea germinal humana 1 de JK. El alineamiento de la secuencia de VL de 4H1 con la secuencia L6 de VK de la línea germinal se muestra en la Figura

10. Un análisis adicional de la secuencia de VL de 4H1 utilizando el sistema de Kabat de determinación de la región CDR condujo a la delimitación de las regiones CDR1, CDR2 y CD3 de la cadena ligera como se muestra en las Figuras 3B y 10, y en los SEQ ID NO: 38, 45 y 52, respectivamente .

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de 5C4 se muestran en la Figura 4A y en los SEC ID NO: 60 y 4, respectivamente.

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de 5C4 se muestran en la Figura 4B y en los SEQ ID NO: 67 y 11, respectivamente.

La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de la cadena pesada de 5C4 con las secuencias de inmunoglobulina de la cadena pesada de la línea germinal humana conocidas demostró que la cadena pesada de 5C4 utiliza un segmento VH de la línea germinal humana 3-33 de VH, un segmento indeterminado D, y un segmento JH de la línea germinal humana 4b de JH. El alineamiento de la secuencia de VH de 5C4 con la secuencia de la línea germinal 3-33 de VH se muestra en la Figura 8. Un análisis adicional de la secuencia de VH de 5C4 utilizando el sistema de Kabat de determinación de la región CDR condujo a la delimitación de las regiones CDR1, CDR2 y CD3 de la cadena pesada como se muestra en las Figuras 4A y 8, y en los SEQ ID NO: 18, 25 y 32, respectivamente .

La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de la cadena ligera de 5C4 con las secuencias de la cadena ligera de inmunoglobulina de la línea germinal humana conocidas demostró que la cadena ligera de 5C4 utiliza un segmento VL de la línea germinal humana L6 de VK y un segmento JK de la línea germinal humana 1 de JK. El alineamiento de la secuencia de VL de 5C4 con la secuencia L6 de VK de la línea germinal se muestra en la Figura

10. Un análisis adicional de la secuencia de VL de 5C4 utilizando el sistema de Kabat de determinación de la región CDR condujo a la delimitación de las regiones CDR1, CDR2 y CD3 de la cadena ligera como se muestra en las Figuras 4B y 10, y en los SEQ ID NO: 39, 46 y 53, respectivamente .

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de 4A11 se muestran en la Figura 5A y en los SEC ID NO: 61 y 5, respectivamente.

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de 4A11 se muestran en la Figura 5B y en los SEQ ID NO: 68 y 12, respectivamente.

La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de la cadena pesada de 4A11 con las secuencias de la cadena pesada de inmunoglobulina de la línea germinal humana conocidas demostró que la cadena pesada de 4A11 utiliza un segmento VH de la línea germinal humana 4-39 de VH, un segmento D de la línea germinal humana 3-9, y un segmento JH de la línea germinal humana 4b de JH. El alineamiento de la secuencia de VH de 4A11 con la secuencia de la línea germinal 4-39 de VH se muestra en la Figura 11. Un análisis adicional de la secuencia de VH de 4A11 utilizando el sistema de Kabat de determinación de la región CDR condujo a la delimitación de las regiones CDR1, CDR2 y CD3 de la cadena pesada como se muestra en las Figuras 5A y 11, y en los SEQ ID NO: 19, 26 y 33, respectivamente .

La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de la cadena ligera de 4A11 con las secuencias de la cadena ligera de inmunoglobulina de la línea germinal humana conocidas demostró que la cadena ligera de 4A11 utiliza un segmento VL de la línea germinal humana L15 de VK y un segmento JK de la línea germinal humana 1 de JK. El alineamiento de la secuencia de VL de 4A11 con la secuencia L6 de VK de la línea germinal se muestra en la Figura

12. Un análisis adicional de la secuencia de VL de 4A11 utilizando el sistema de Kabat de determinación de la región CDR condujo a la delimitación de las regiones CDR1, CDR2 y CD3 de la cadena ligera como se muestra en las Figuras 5B y 12, y en los SEQ ID NO: 40, 47 y 54, respectivamente .

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de 7D3 se muestran en la Figura 7A y en los SEC ID NO: 62 y 6, respectivamente.

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de 7D3 se muestran en la Figura 7B y en los SEQ ID NO: 69 y 13, respectivamente.

La comparación de la secuencia de la cadena pesada de inmunoglobulina 7D3 con las secuencias de la cadena pesada de inmunoglobulina de la línea germinal humana conocidas demostró que la cadena pesada de 7D3 utiliza un segmento VH de la línea germinal humana 3-33 de VH, un segmento 7-27 D de la línea germinal humana, y un segmento JH de la línea germinal humana 4b de JH. El alineamiento de la secuencia de VH de 7D3 con la secuencia de la línea germinal 3-33 de VH se muestra en la Figura 8. Un análisis adicional de la secuencia de VH de 7D3 utilizando el sistema de Kabat de determinación de la región CDR condujo a la delimitación de las regiones CDR1, CDR2 y CD3 de la cadena pesada como se muestra en las Figuras 6A y 8, y en los SEQ ID NO: 20, 27 y 34, respectivamente .

La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de la cadena ligera de 7D3 cono las secuencias de la cadena ligera de inmunoglobulina de la línea germinal humana conocidas demostró que la cadena ligera de 7D3 utiliza un segmento VL de la línea germinal humana L6 de VK y un segmento JK de la línea germinal humana 4 de JK. El alineamiento de la secuencia de VL de 7D3 con la secuencia L6 de VK de la línea germinal se muestra en la Figura

9. Un análisis adicional de la secuencia de VL de 7D3 utilizando el sistema de Kabat de determinación de la región CDR condujo a la delimitación de las regiones CDR1, CDR2 y CD3 de la cadena ligera como se muestra en las Figuras 6B y 9, y en los SEQ ID NO: 41, 48 y 55, respectivamente .

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de 5F4 se muestran en la Figura 7A y en los SEC ID NO: 63 y 7, respectivamente.

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de 5F4 se muestran en la Figura 7B y en los SEQ ID NO: 70 y 14, respectivamente.

La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de la cadena pesada de 5F4 con las secuencias de la cadena pesada de inmunoglobulina de la línea germinal humana conocidas demostraron que la cadena pesada de 5F4 utiliza un segmento VH de la línea germinal humana 4-39 de VH, un segmento D de la línea germinal humana 3-9, y un segmento JH de la línea germinal humana 4b de JH. El alineamiento de la secuencia de VH de 5F4 con la secuencia de la línea germinal 4-39 de VH se muestra en la Figura 11. Un análisis adicional de la secuencia de VH de 5F4 mediante el sistema de Kabat de determinación de la región CDR condujo a la delimitación de las regiones CDR1, CDR2 y CD3 de la cadena pesada como se muestra en las Figuras 7A y 11, y en los SEQ ID NO: 21, 28 y 35, respectivamente.

La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de la cadena ligera de 5F4 con las secuencias de la cadena ligera de inmunoglobulina de la línea germinal humana conocidas demostró que la cadena ligera de 5F4 utiliza un segmento VL de la línea germinal humana L15 de VK y un segmento JK de la línea germinal humana 1 de JK. El alineamiento de la secuencia de VL de 5F4 con la secuencia L6 de VK de la línea germinal se muestra en la Figura

12. Un análisis adicional de la secuencia de VL de 5F4 mediante el sistema de Kabat de determinación de la región

CDR condujo a la delimitación de las regiones CDR1, CDR2 y CD3 de la cadena ligera como se muestra en las Figuras 7B y 12, y en los SEQ ID NO: 42, 49 y 56, respectivamente.

Ejemplo 3: Caracterización de la especificidad de unión y la cinética de unión de anticuerpos anti-PD-1 monoclonales humanos

En este ejemplo, se examinaron la afinidad de unión y la cinética de unión de los anticuerpos anti-PD-1 por medio de un análisis de Biacore. La especificidad de unión, y la competición cruzada se analizaron mediante citometría de flujo.

Afinidad y cinética de unión

Se caracterizaron los anticuerpos anti-PD-1 para determinar sus afinidades y su cinética de unión por medio de un análisis Biacore (Biacore AB, Uppsala, Suecia). La proteína de fusión PD-1 humana recombinante purificada estaba ligada de forma covalente a un chip CM5 (chip recubierto con carboximetildextrano) a través de aminas primarias, utilizando la química de acoplamiento de aminas estándar y el kit proporcionado por Biacore. La unión se midió haciendo pasar los anticuerpos por tampón HBS EP (proporcionado por Biacore AB) a una concentración de 267 nM, a una velocidad de flujo de 50 µl/min. La cinética de la asociación antígeno-anticuerpo se siguió durante 3 minutos y la cinética de la disociación se siguió durante 7 minutos. Las curvas de asociación y disociación se ajustaron a un modelo de unión de Langmuir 1:1 utilizando el soporte lógico BIAevaluation (Biacore AB). Para reducir al mínimo los efectos de la avidez en la estimación de las constantes de unión, sólo se utilizó el segmento inicial de los datos correspondientes a las fases de asociación y disociación para el ajuste. Los valores de KD, Kon y koff que se determinaron se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2. Datos de unión mediante BIACORE de anticuerpos monoclonales humanos para PD-1.

Núm. Muestra: ID de la muestra Afinidad KD x 109(M) Velocidad de activación kon x 105 (1/ms) Velocidad de desactivación koff x 10-4 1/s

1: 17D8 0,16 2,56 0,45

2: 2D3 1,20 3,77 4,52

3: 4H1 5,46 3,15 1,72

4: 5C4 0,73 4,32 3,15

5: 4A11 0,13 0,76 0,099

6: 7D3 2,49 18,2 4,54

7: 5F4 2,91 8,74 2,54

Especificidad de unión por citometría de flujo

Se desarrollaron líneas de células de ovario de hámster chino (CHO) que expresan PD-1 recombinante humana en la superficie celular y se utilizaron para determinar la especificidad de los anticuerpos monoclonales humanos para PD-1 por medio de citometría de flujo. Las células CHO se transfectaron con plásmidos de expresión que contenían ADNc completo que codificaba las formas transmembrana de PD-1. La unión de los anticuerpos monoclonales humanos anti-PD1 5C4 y 4H1 se evaluó por medio de incubación de las células transfectadas con los anticuerpos monoclonales humanos anti-PD-1 a una concentración de 20 µg/ml. Las células se lavaron y se detectó la unión con un Ab anti-IgG humana marcado con FITC. Los análisis de citometría de flujo se realizaron utilizando una citometría de flujo FACScan (Becton Dickinson, San José, CA). Los resultados se representan en las Figuras 13A (5C4) y 13B (4H1). Los anticuerpos monoclonales humanos anti-PD-1 se unieron a las células CHO transfectadas con PD-1, pero no a las células CHO que no se transfectaron con PD-1 humana. Estos datos demuestran la especificidad de los anticuerpos monoclonales humanos anti-PD-1 para PD-1.

Especificidad de unión mediante ELISA frente a otros miembros de la familia CD28

Se realizó una comparación de la unión de los anticuerpos anti-PD-1 a miembros de la familia CD28 mediante ELISA estándar utilizando cuatro miembros diferentes de la familia CD28 para examinar la especificidad de la unión para PD-1.

Las proteínas de fusión de los miembros de la familia CD28, ICOS, CTLA-4 y CD28 (R&D Biosystems) se sometieron a ensayo para determinar la unión frente a los anticuerpos monoclonales humanos anti-PD-1 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, y 4A11. Se llevaron a cabo los procedimientos ELISA estándar. Los anticuerpos monoclonales humanos anti-PD-1 se añadieron a una concentración de 20 µg/ml. Se utilizó anticuerpo policlonal anti-IgG humana de cabra

(específico de la cadena kappa) conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) como anticuerpo secundario. Los resultados se muestran en la Figura 14. Cada uno de los anticuerpos monoclonales humanos anti-PD-1 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 y 5F4 se unió con una especificidad elevada a PD-1, pero no a los otros miembros de la familia CD28.

Ejemplo 4: Caracterización de la unión de anticuerpos anti-PD-1 PD-1 expresa sobre la superficie de células humanas y de mono

Se sometieron a ensayo anticuerpos anti-PD-1 para determinar la unión a las células que expresan PD-1 sobre su superficie celular por medio de citometría de flujo.

Se sometieron a ensayo células T humanas activadas, células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de mono, y células CHO transfectadas con PD-1 para determinar la unión del anticuerpo. Las células T humanas y las PBMC de cinomolgo fueron activadas por anticuerpo anti-CD3 para inducir la expresión de PD-1 en las células T antes de la unión con un anticuerpo monoclonal humano anti-PD-1. La unión de los anticuerpos monoclonales humanos anti-PD-1 5C4 y 4H1 se evaluó por medio de incubación de las células transfectadas con cualquiera de las formas IgG1 o IgG4 de los anticuerpos monoclonales humanos anti-PD-1 a diferentes concentraciones. Las células se lavaron y se detectó la unión con un Ab anti IgG-humana marcado con FITC. Se llevaron a cabo análisis de citometría de flujo utilizando una citometría de flujo FACScan (Becton Dickinson, San José, CA). Los resultados se muestran en las Figuras 15A (células T humanas activadas), 15B (PBMC de mono cinomolgo) y 15C (células CHO transfectadas con PD-1). Los anticuerpos monoclonales anti-PD-1 5C4 y 4H1 se unieron a células T humanas activadas, PBMC de mono activadas, y células CHO transfectadas con PD-1 humana, según lo medido por la intensidad media de fluorescencia (IMF) de la tinción. Estos datos demuestran que los HuMAbs anti-PD-1 se unen a PD-1 de la superficie de células tanto de ser humano como de mono cinomolgo. Ejemplo 5: Efecto de anticuerpos anti-PD-1 humanos sobre la proliferación celular y la producción de citoquinas en una reacción mixta de linfocitos

Se empleó una reacción mixta de linfocitos para demostrar el efecto del bloqueo de la ruta de PD-1 a células efectoras de linfocitos. Las células T del análisis ensayo se sometieron a ensayo para determinar la proliferación, la secreción de IFN-gamma y la secreción de IL-2 en presencia o ausencia de un anticuerpo HuMAb anti-PD-1.

Se purificaron células T humanas a partir de PBMC utilizando una columna de enriquecimiento de células T CD4+ humanas (R&D). Cada cultivo contenía 105 células T purificadas y 104 células dendríticas alogénicas en un volumen total de 200 µl. Se añadió 1 anticuerpo monoclonal anti-PD-1 5C4, 4H1, 17D8, 2D3 o una porción del fragmento Fab 5C4 a cada cultivo a diferentes concentraciones de anticuerpo. Se utilizó o bien ningún anticuerpo o bien un anticuerpo de control de isotipo como un control negativo. Las células se cultivaron durante 5 días a 37°C. Después del día 5, se tomaron 100 µl de medio de cada cultivo para la medición de las citoquinas. Se midieron los niveles de IFN-gamma y otras citoquinas utilizando kits de ELISA OptEIA (BD Biosciences). Las células se marcaron con 3Htimidina, se cultivaron durante otras 18 horas, y se analizaron para determinar la proliferación celular. Los resultados se muestran en las Figuras 16A (proliferación de células T), 16B (secreción de IFN-γ) y 16C (secreción de IL-2). Los anticuerpos monoclonales humanos anti-PD-1 promovieron la proliferación de células T, la secreción de IFN-gamma y la secreción de IL-2 de una manera dependiente de la concentración. El fragmento Fab de 5C4 también promovió la proliferación de células T, la secreción de IFN-gamma y la secreción de IL-2 de una manera dependiente de la concentración. En contraste, los cultivos que contenían el anticuerpo de control de isotipo no mostraron un aumento en la proliferación de células T, secreción de IFN-gamma o secreción de IL-2.

Ejemplo 6: Bloqueo de la unión del ligando a PD-1 por los anticuerpos humanos anti-PD-1

Se sometieron a ensayo HuMAb anti-PD-1 para determinar la capacidad de bloquear la unión de los ligandos PD-L1 y PD-L2 a PD-1 expresada en células CHO transfectadas mediante el uso de un análisis de citometría de flujo.

Se suspendieron células CHO que expresaban PD-1 en tampón FACS (PBS con suero de ternera fetal al 4%). Se añadieron diversas concentraciones del los HuMAbs anti-PD-1 5C4 y 4H1 a la suspensión de células y se incubaron a 4°C durante 30 minutos. El anticuerpo no unido se eliminó mediante lavado y se añadió o bien proteína de fusión de PD-L1 marcada con FITC o bien proteína de fusión de PD-L2 marcada con FITC en los tubos y se incubaron a 4°C durante 30 minutos. Se llevaron a cabo los análisis de citometría de flujo utilizando un citómetro de flujo FACScan (Becton Dickinson, San José, CA). Los resultados se representan en las Figuras 17A (bloqueo de PD-L1) y 17B (bloqueo de PD-L2). Los anticuerpos monoclonales anti-PD-1 5C4 y 4H1 bloquearon la unión de PD-L1 y PDL2 a las células CHO transfectadas con PD-1 humana, tal como se mide por la intensidad media de fluorescencia (IMF) de la tinción. Estos datos demuestran que los HuMAb anti-PD-1 bloquean la unión del ligando (tanto PD-L1 como PD-L2) a la PD-1 de la superficie de la célula.

Ejemplo 7: Efecto de anticuerpos anti-PD-1 humanos sobre la liberación de citoquinas en la sangre humana

Los HuMAb anti-PD-1 se mezclaron con sangre completa humana fresca con el fin de determinar si los HuMAb antiPD-1 solos estimulaban la liberación de ciertas citoquinas a partir de células de sangre humana.

Se añadieron 500 µl de sangre completa humana heparinizada fresca a cada pocillo. Se añadieron 10 µg o 100 µg

5 de un anticuerpo HuMAb anti-PD-1 (4H1 o SC4, este último como un isotipo IgG1 o IgG4) a cada pocillo. Algunos pocillos se incubaron con anticuerpo anti-CD3 como un control positivo, o un anticuerpo IgG1 humano o IgG4 humano como controles negativos de isotipo emparejado. Las células se incubaron a 37°C durante 6 ó 24 horas. Las células se centrifugaron y el plasma se recogió para la medición de las citoquinas, IFN-gamma, TNF-alfa, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10 e IL-12 utilizando un análisis en matriz de cuentas citométricas de citoquina (BD Biosciences). La

10 concentración de cada una de las citoquinas (pg/ml) se muestra a continuación en las Tablas 3a, con una incubación de 6 horas, y 3b, con una incubación de 24 horas. Los resultados muestran que el tratamiento con los anticuerpos humanos anti-PD-1 5C4 y 4H1 solo no estimuló las células de sangre humana para liberar cualquiera de las citoquinas IFN-gamma, TNF-alfa, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10 e IL-12.

15 Tabla 3a. Producción Citoquina después de 6 horas de incubación

Ab: IFN-gamma (pg/ml) TNF-alfa (pg/ml) IL-10 (pg/ml) IL-6 (pg/ml) IL-4 (pg/ml) IL-2 (pg/ml)

NOAB: 12,3 2 3 5 3,6 1,9

10 mg/ml de anti-CD3: 5000 530 82,6 510,4 37,2 467,9

100 mg/ml de anti-CD3: 5000 571 91,3 530 43,9 551,5

10 mg/ml de hIgG1: 7 1,8 2,8 4,4 2,6 1,5

100 mg/ml de hIgG1: 0 2,2 2,7 6 2,6 1,4

10 mg/ml de hIgG4: 5,4 1,4 2,5 4,5 2,1 1,3

100 mg/ml de hIgG4: 6,4 2,3 3 32,6 2,9 1,4

10 mg/ml de 4H1: 6,2 1,8 2,4 4,1 2,8 1,6

100 mg/ml de 4H1: 11,8 2 2,6 3,5 2,6 1,7

10 mg/ml de IgG1 5C4: 4,2 1,6 2,3 3,9 2,5 1,3

100 mg/ml de IgG1 5C4: 0 1,4 2,2 3,6 2,1 1,2

10 mg/ml de 5C4 IgG4: 8,3 2,5 1,9 4,8 1,6 1,5

100 mg/ml de 5C4 IgG4: 3,6 1,7 2,4 3,9 2,3 1,5

Tabla 3b. Producción de Citoquina después de 24 horas de incubación 10

Ab: IFN-gamma (pg/ml) TNF-alfa (pg/ml) IL-10 (pg/ml) I-6 (pg/ml) IL-4 (pg/ml) IL-2 (pg/ml)

No Ab: 11,2 2 6,1 5,9 2,6 1,7

10 mg/ml de anti-CD3: 5000 565,9 432 5000 64,5 1265,3

100 mg/ml de anti-CD3: 5000 535 461 5000 73,8 1334,9

10 mg/ml de MIG1: 0 0 0 0 0 0

100 mg/ml de hIgG1: 11,5 1,7 7,9 60,8 2,9 1,5

10 mg/ml de hIgG4: 24,6 3,1 8,3 63,4 3,1 2,3

100 mg/ml de hIgG4: 11,2 1,8 8 27,7 3,1 2,4

10 mg/ml de 4H1: 27,3 2,9 8 13,9 5,3 2,6

100 mg/ml de 4H1: 17,5 2,5 4,4 7 4 2,1

10 mg/ml de IgG1 5C4: 9,1 2 7,6 68,5 3,5 1,8

100 mg/ml de IgG1 5C4: 12,9 1,9 6,1 25,3 2,9 1,7

10 mg/ml de 5C4 TgG4: 14 1,9 4,4 3,3 2,6 1,9

100 mg/ml de 5C4 IgG4: 0 0 0 0 0 0

Ejemplo 8: Efecto de los anticuerpos anti-PD-1 sobre la apoptosis de las células T

Se midió el efecto de la anticuerpos anti-PD-1 en la inducción de la apoptosis de las células T utilizando un ensayo de tinción con anexina V.

Se cultivaron células T en una reacción mixta de linfocitos, tal como se describe anteriormente en el Ejemplo 5. El anticuerpo anti-PD-1 5C4 se añadió al tubo a una concentración de 25 µg/ml. Se utilizó un anticuerpo no específico como control. Se añadieron anexina V y yoduro de propidio de acuerdo con el protocolo estándar (BD Biosciences). La mezcla se incubó durante 15 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente y después se analizó utilizando un citómetro de flujo FACScan (Becton Dickinson, San José, CA). Los resultados se muestran en la Figura 18. El anticuerpo anti-PD-1 5C4 no tiene efecto sobre la apoptosis de células T.

Ejemplo 9: Efecto de anticuerpos anti-PD-1 sobre la secreción de citoquinas por células PBMC estimuladas con virus de un donante positivo para el virus

En este ejemplo, se aislaron las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de un donante positivo para CMV y se expusieron a un producto lisado de CMV en presencia o ausencia de anticuerpos anti-PD-1 para examinar el efecto de los anticuerpos sobre la secreción de citoquinas estimulada por el antígeno .

Se cultivaron 2 x 105 PMBC humanas de un donante positivo para CMV en un volumen total de 200 µl y se añadieron a cada pocillo junto con un producto lisado de células infectadas por CMV. Se añadió el HuMAb anti-PD15C4 a cada pocillo en diversas concentraciones durante 4 días. Después de 4 días, se tomaron 100 µl de medio de cada cultivo para la medición de citoquinas. El nivel de IFN-gamma se midió utilizando kits de ELISA OptEIA (BD Biosciences). Las células se marcaron con 3H-timidina, se cultivaron durante otras 18 horas, y se analizaron para determinar la proliferación celular. La proliferación celular se analizó utilizando el reactivo de Cell Titer-Glo (Promega). Los resultados se muestran en la Figura 19. El HuMab anti-PD-1 5C4 aumentó la secreción de IFN gamma en una forma dependiente de la concentración. Estos resultados muestran que los HuMAb anti-PD-1 pueden estimular la liberación de IFN-gamma en una respuesta de células T de memoria a partir de células PBMC estimuladas previamente contra un antígeno.

Ejemplo 10: Efecto de anticuerpos anti-PD-1 sobre la respuesta de anticuerpos secundarios a un antígeno

Se inmunizaron los ratones y se volvieron a sensibilizar con antígeno T1 (DNP-Ficoll) y también se trataron con un anticuerpo anti-PD-1 de ratón de rata, o un anticuerpo de control para examinar el efecto del anticuerpo anti-PD-1 sobre los títulos de anticuerpos.

Se dividieron en dos grupos ratones C57BL6 hembra, con 6 ratones/grupo. Un grupo se trató con una IgG de rata de control y el otro con un anticuerpo anti-PD-1 de ratón de rata. Los ratones fueron inmunizados con 5 μg de DNP-Ficoll (un antígeno T1) en 50 µl de CFA ip el día 0. Se administró el anticuerpo IgG de rata de control o el anticuerpo mPD-1 de rata (200 μg/ratón) ip en los días -1, 0 y 2. Cuatro semanas más tarde, los ratones fueron sensibilizados de nuevo con 5 μg de DNP-Ficoll en 50 µl de IFA ip en el día 0. El anticuerpo anti-mPD-1 de rata o el anticuerpo de control (200 μg/ratón) se administraron ip en los días 0 y 1. Se midieron los títulos de anticuerpos mediante un análisis ELISA estándar el día 7 después del refuerzo. Los resultados se muestran en la Tabla 4 a continuación. En los ratones tratados con el anticuerpo anti-mPD-1, los isotipos tanto IgM como IgG3 mostraron el mayor aumento en el título después de la sensibilización con el antígeno T1, en comparación con los ratones tratados con un anticuerpo de control. Estos resultados demuestran que el tratamiento con anti-PD-1 puede aumentar los títulos de anticuerpos en respuesta al antígeno T1.

Tabla 4 Respuesta secundaria murina después del tratamiento con anticuerpo anti-PD-1

Isotipo de Anticuerpo: Grupo de control Anticuerpo anti-PD-1 de ratón de rata Valor P

IgM: 606 1200 0,026

IgG: 9 15,55 0,18

IgG1: 1,2 1,1 0,83

IgG2b: 5,05 9,26 0,18

IgG3: 21,9 81,2 0,03

* Los resultados mostrados son la concentración media de isotipo de anticuerpo (µg/ml)

Ejemplo 11: Tratamiento de modelo tumoral in vivo utilizando anticuerpos anti-PD-1 43

Los ratones en los que se había implantado un tumor canceroso se trataron in vivo con anticuerpos anti-PD-1 para examinar el efecto in vivo de los anticuerpos sobre el crecimiento del tumor. Como control positivo, se utilizó un anticuerpo anti-CTLA-4, ya que se ha demostrado que tales anticuerpos inhiben el crecimiento del tumor in vivo.

En este experimento, el anticuerpo anti-PD-1 utilizado fue un anticuerpo anti-PD-1 de ratón de rata quimérico generado utilizando técnicas de laboratorio bien conocidas. Para generar el anticuerpo anti-PD-1 de ratón de rata, las ratas fueron inmunizadas con células de ratón transfectadas para expresar una proteína de fusión PD-1 de ratón recombinante (R&D Systems Núm. Catálogo 1021-PD) y se escrutaron los anticuerpos monoclonales para determinar la unión al antígeno PD-1 ratón por medio de un análisis ELISA. Las regiones V del anticuerpo anti-PD-1 de rata se conectaron recombinantemente a continuación a una región constante de IgG1 murina utilizando técnicas estándar de biología molecular y se volvieron a escrutar para determinar la unión a PD-1 de ratón mediante ELISA y FACS. El La anticuerpo anti-PD-1 de ratón de rata quimérico utilizado en la presente memoria se refiere como 4H2.

Para los estudios de tumores, se aleatorizaron ratones AJ hembra de entre 6-8 semanas de edad (Harlan Laboratories) por pesos en 6 grupos. Se implantaron subcutáneamente en los ratones en el flanco derecho 2 x 106 células de fibrosarcoma SA1/N disueltas en 200 µl de medio DMEM el día 0. Los ratones se trataron con vehículo de PBS, o anticuerpos a 10 mg/kg. Se administraron a los animales mediante inyección intraperitoneal aproximadamente 200 µl de PBS que contenía anticuerpo o vehículo en los días 1, 4, 8 y 11. Cada grupo contenía 10 animales y los grupos consistieron en: (i) un grupo con vehículo, (ii) IgG de ratón de control, (iii) IgG de hámster de control, (iv) anticuerpo anti-CTL-4 de ratón de hámster y (v) el anticuerpo anti-PD-1 quimérico 4H2. Los ratones se controlaron dos veces por semana para determinar el crecimiento tumoral durante aproximadamente 6 semanas. Utilizando un calibrador electrónico, se midieron los tumores en tres dimensiones (alto x ancho x largo) y se calculó el volumen del tumor. Los ratones fueron sacrificados cuando los tumores alcanzaron el punto final del tumor (1.500 mm3) o cuando mostraron una pérdida de peso de más del 15%. Los resultados se muestran en la Figura 20. El anticuerpo anti-PD-1 prolongó el tiempo medio hasta alcanzar el volumen del criterio de valoración tumoral (1500 mm3) desde -25 días en los grupos de control a ~40 días. Por lo tanto, el tratamiento con un anticuerpo anti-PD-1 tiene un efecto inhibidor directo in vivo sobre el crecimiento tumoral.

Ejemplo 12: Generación de anticuerpo anti-PD-1 quimérico (rata-ratón) 4H2

Se generaron anticuerpos monoclonales de rata contra anticuerpos para PD-1 de ratón (anti-mPD-1 de rata) a partir de ratas inmunizadas con proteína de fusión mPD-1-hFc utilizando métodos estándar de producción de hibridoma (véanse Kohler y Milstein (1975) Nature 256:495; y Harlow y Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor Nueva York). Se subclonaron ocho hibridomas, y se aislaron los anticuerpos y se escrutaron para determinar su capacidad para bloquear la unión de PD-L2 de ratón (MPD-L2) a mPD-1. Se identificaron varios anticuerpos anti-mPD-1capaces de bloquear la unión de mPD-L2 a mPD-1 (véase, p. ej., la actividad de 4H2, Figura 41) y se determinó la afinidad de unión de varios de estos anticuerpos a la proteína de fusión mPD-1-Fc mediante ELISA (Figura 42).

Se caracterizó adicionalmente el anticuerpo 4H2.B3, que se denomina indistintamente en la presente memoria "4H2." Se construyeron células CHO que expresaban PD-1 de ratón y se incubaron con anticuerpo anti-mPD-1 4H2 a una concentración que oscilaba de 200 µg/ml a 0,012 µg/ml para determinar la afinidad de unión de 4H2 a PD-1. Se detectó la unión del anticuerpo anti-mPD-1 a las células CHO que expresaban PD-1 mediante incubación con anti-IgG de rata de burro, conjugado con FITC y se midió por medio de FACS. El anticuerpo anti-mPD-1 tenía una CE50 (concentración eficaz del 50%) de aproximadamente 0,38 µg (Figura 43) y un KD de 4,7 x 10-9M. Para examinar la inhibición de la unión de PD-L1 a PD-1, se llevó a cabo el mismo análisis con la excepción de que las células también se incubaron con 0,16 µg de proteína de fusión mPD-L1-hFc, a continuación, se detectó la unión de PD-L1 a las células CHO que expresaban PD-1 mediante incubación con anti-IgG humana de cabra (específico de Fc), conjugado con FITC y midiendo la señal de unión por medio de FACS (IFM, intensidad de fluorescencia media). El anticuerpo anti-mPD-1 tenía una CE50 de aproximadamente 0,72 µg (Figura 44).

Para su uso en los modelos tumorales de ratón, el anti-mPD-1 de rata 4H2 tuvo que ser modificado para que el sistema inmunitario del ratón no neutralizara el anticuerpo inmunoterapéutico (es decir, de manera que el anticuerpo tuviera una mejor farmacocinética) y para evitar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) reduciendo las interacciones del receptor de Fc (es decir, de manera que el bloqueo por anti-PD-1 pudiera ser evaluado estando comprometido por los efectos de la ADCC). Se determinó que el anticuerpo anti-mPD de rata original, 4H2, era un isotipo IgG2a de rata. Por lo tanto, la porción Fc del anticuerpo 4H2 fue reemplazada por una porción Fc de un isotipo IgG1 de ratón. Usando el análisis descrito anteriormente, se encontró que la afinidad de unión de 4H2 quimérico de rata-ratón a mPD-1 era comparable a la del anticuerpo anti-mPD-1 4H2.B3 de rata (Figura 45). Del mismo modo, la inhibición de la unión de PD-L1 unión a PD-1 fue comparable para ambos anticuerpos (Figura 46). Por lo tanto, se utilizó el anticuerpo anti-mPD-1 4H2 de rata-ratón para examinar la eficacia terapéutica de anti-PD-1 combinado con anti-CTLA-4.

Ejemplo 13: Eficacia in vivo de la terapia combinada (anticuerpos anti-CTLA-4 y anti-PD-1) sobre el establecimiento y el crecimiento del tumor

Se implantaron células MC38 de cáncer colorrectal (PD-L1-) (asequibles del Dr. N. Restifo, National Cancer Institute, Bethesda, MD; o Jeffrey Schlom, National Institutes of Health, Bethesda, MD) en ratones C57BL/6 (2 x 106 células/ratón). El día 0 (es decir, el día en el que las células MC38 se implantaron en los ratones), se inyectó por vía intraperitoneal (IP) a cada uno de los cuatro grupos de 10 ratones uno de los siguientes: (1) IgG de ratón (control),

(2) anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 9D9 (anti-CTLA-4 de ratón de ratón, obtenido de J. Allison, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, Nueva York, NY), (3) anticuerpo monoclonal anti-PD-1 4H2 (anticuerpo quimérico en el que un anti-PD-1 de ratón de rata fue modificado con una región Fc de ratón, como se describe en el Ejemplo 6), o (4) anticuerpo anti-CTLA-4 9D9 y anticuerpo anti-PD-1 4H2. Se administraron adicionalmente con posterioridad inyecciones de anticuerpo los días 3, 6 y 10. Los tratamientos con anticuerpos individuales se dosificaron a 10 mg/kg, y la combinación de anticuerpo anti-CTLA-4 y anticuerpo anti-PD-1 se dosificó a 5 mg/kg de cada anticuerpo (es decir, 10 mg/kg de anticuerpo en total). Utilizando un calibrador electrónico, se midieron los tumores en tres dimensiones (alto x ancho x largo) y se calculó el volumen del tumor. Los ratones fueron sacrificados cuando los tumores alcanzaron un tumor criterio de valoración tumoral designado. Los resultados se muestran en la Tabla 5 y la Figura 21.

Tabla 5. Porcentaje de ratones libres de tumor siguiendo el tratamiento con anti-PD-1 y/o anti-CTLA-4

Tratamiento: Total de ratones estudiados Ratones libres de tumores (%)

mIgG1: 10 0

anti-CTLA-4: 10 1 (10)

anti-PD-1: 10 3 (30)

anti-CTLA-4 + anti-PD-1: 10 6 (60)

Ocho ratones del grupo con IgG alcanzaron el criterio de valoración tumoral aproximadamente el día 30 y dos ratones (86066 y 87260) del grupo con IgG tenían tumores ulcerados (Figura 21A). En el grupo con anticuerpo antiCTLA-4 solo, siete ratones alcanzaron el criterio de valoración tumoral aproximadamente el día 60, un ratón tenía un tumor ulcerado (84952), un ratón tenía un tumor con un volumen de menos de 1500 mm3 (85.246), y un ratón estaba libre de tumor (86.057) (Figura 21B). En el grupo con anticuerpo anti-PD-1 solo, seis ratones alcanzaron el criterio de valoración tumoral aproximadamente el día 60, un ratón tenía un tumor ulcerado (86055), y tres ratones estaban libres de tumor (84955, 85239 y 86750) (Figura 21C). En el grupo con anticuerpo anti-CTLA-4 y anticuerpo anti-PD-1 combinados, cuatro ratones alcanzaron el criterio de valoración tumoral aproximadamente el día 40, y seis ratones estaban libres de tumor (84596, 85240, 86056, 86071, 86082 y 86761) (Figura 21D).

La Figura 22 de muestra que el volumen medio del tumor medido el día 21 fue de aproximadamente 2955 mm3 para el grupo de control con IgG; aproximadamente 655 mm3 para el grupo solo con anticuerpo CTLA-4; aproximadamente 510 mm3 para el grupo con anticuerpo para PD-1 solo, y aproximadamente 280 mm3 para el grupo con anticuerpo anti-CTLA-4 y anticuerpo anti-PD-1 combinados. La Figura 23 demuestra que el volumen medio del tumor medido el día 21 fue de aproximadamente 2715 mm3 para el grupo con IgG; aproximadamente 625 mm3 para el grupo con anticuerpo CTLA-4 solo; aproximadamente 525 mm3 para el grupo de PD-1 solo anticuerpo, y aproximadamente 10 mm3 para el grupo con anticuerpo para CTLA-4 y anticuerpo para y PD-1 combinados (y hasta 0 mm3 al día 32).

Este estudio indica que, en un modelo de tumor murino, el tratamiento solo con anticuerpo CTLA-4 solo y el tratamiento con anticuerpo para PD-1 solo tienen un efecto moderado sobre el crecimiento tumoral, y que el tratamiento combinado de anticuerpo para CTLA-4 y anticuerpo para y PD-1 tiene un efecto significativamente mayor sobre el crecimiento del tumor. Es interesante notar que el tratamiento combinado con anticuerpo para CTLA-4 y anticuerpo para PD-1 tuvo un efecto más significativo sobre el crecimiento del tumor a una dosis de 5 mg/kg de cada anticuerpo en comparación con el efecto de cualquier anticuerpo solo cuando cada uno se administra a una dosis más alta de 10 mg/kg.

Ejemplo 14: Eficacia in vivo de la terapia combinada (anticuerpos anti-CTLA-4 y anti-PD-1) sobre el crecimiento de tumores establecidos

Se implantaron célula de cáncer colorrectal MC38 (PD-L1-) en ratones C57BL/6 (2 x 106 células/ratón) durante un tiempo suficiente (aproximadamente de 6 a 7 días) para permitir la formación de tumores. El día 6 después de la implantación (día -1), se tomaron medidas de los tumores y los ratones se distribuyeron al azar basándose en el volumen tumoral medio (aproximadamente 250 mm3) en 11 grupos para la terapia posterior con anticuerpos. El día 0 (es decir, una semana después de que las células MC38 fueron implantadas), se inyectaron IP a los ratones (1) IgG de ratón (control), (2) anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 9D9, (3) anticuerpo monoclonal anti-PD-1 4H2, o (4) anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 9D9 y anticuerpo monoclonal anti-PD-1 4H2, a una concentración de 10 mg/kg por ratón. También se administraron inyecciones de anticuerpo los días 3, 6 y 10. Las composiciones de anticuerpos

monoclonales utilizadas tenían bajos niveles de endotoxina y no se agregaron significativamente. Utilizando un calibrador electrónico, los tumores se midieron en tres dimensiones (alto x ancho x largo) y se calculó el volumen del tumor. Se tomaron medidas de los tumores el día 0 (los tumores al inicio del tratamiento tenían un volumen de aproximadamente 125 mm3), y los días 3, 6, 10, 13, 17 y 20 después de la inyección de anticuerpo. Los ratones fueron sacrificados cuando los tumores alcanzaron un criterio de valoración tumoral designado (un volumen de tumor en particular, tal como 1500 mm3 y/o cuando los ratones mostraron más de aproximadamente 15% de pérdida de peso).

Los once ratones del grupo con IgG alcanzaron el criterio de valoración tumoral aproximadamente el día 17 (Figura 24A). En el grupo con anticuerpo anti-CTLA-4 solo, siete de los once ratones alcanzaron el criterio de valoración tumoral aproximadamente el día 12 (Figura 24B). En el grupo con anticuerpo anti-PD-1 solo, cuatro ratones alcanzaron el criterio de valoración tumoral aproximadamente el día 13 y dos ratones estuvieron libres de tumor (Figura 24C). En el grupo con anticuerpo anti-CTLA-4 y anti-PD-1 combinados, un ratón alcanzó el criterio de valoración tumoral aproximadamente el día 17, un ratón alcanzó el criterio de valoración tumoral aproximadamente el día 45 y nueve ratones estuvieron libres de tumor el día 45 (Figura 24D).

La Figura 25 demuestra que el volumen medio del tumor medido el día 10 fue de aproximadamente 1485 mm3 para el grupo de control con IgG; aproximadamente 1010 mm3 para el grupo con anticuerpo CTLA-4 solo; aproximadamente 695 mm3 para el grupo con anticuerpo PD-1 solo; y aproximadamente 80 mm3 para el grupo con anticuerpos anti-CTLA-4 y anti-PD-1 combinados. La figura 26 demuestra que el volumen tumoral medio medido el día 10 fue de aproximadamente 1365 mm3 para el grupo con IgG; aproximadamente 1060 mm3 para el grupo con anticuerpo anti-CTLA-4 solo; aproximadamente 480 mm3 para el grupo con anticuerpo anti-PD-1; solo y aproximadamente 15 mm3 para el grupo con anticuerpos anti-CTLA-4 y anti-PD-1 combinados (que se había reducido a 0 mm3 el día 17).

Este estudio indica que, en un modelo de tumor murino, el tratamiento con la combinación de anticuerpo para CTLA4 y anticuerpo para PD-1 tiene un efecto significativamente mayor en el crecimiento del tumor que los anticuerpos solos, incluso cuando un tumor ya está bien establecido.

Ejemplo 15: Titulación de la dosis de la terapia combinada (anticuerpos anti-CTLA-4 y anti-PD-1) sobre el crecimiento tumoral establecido

Se implantaron células de cáncer colorrectal MC38 (PD-L1-) en ratones C57BL/6 (2 x 106 células/ratón) durante un tiempo suficiente (aproximadamente de 6 a 7 días) para permitir la formación de tumores como se describe en el Ejemplo 3. En grupos de 10 ratones, se inyectaron IP el día 0, 3, 6 y 10 de la siguiente manera: Grupo (A) IgG de ratón (control, 20 mg/kg), Grupo (B) anticuerpo monoclonal anti-PD-1 4H2 (10 mg/kg), Grupo (C) anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 9D9 (10 mg/kg) e IgG de ratón (10 mg/kg), Grupo (D) monoclonal anticuerpo anti-CTLA-4 9D9 (10 mg/kg) y anticuerpo monoclonal anti-PD-1 4H2 (10 mg/kg), Grupo (E) anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 9D9 (3 mg/kg) y anticuerpo monoclonal anti-PD-1 4H2 (3 mg/kg), o Grupo (F) anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 9D9 (1 mg/kg) y anticuerpo monoclonal anti-PD-1 4H2 (1 mg/kg). Utilizando un calibrador electrónico, se midieron los tumores en tres dimensiones (alto x ancho x largo) y se calculó el volumen del tumor. Las medidas de los tumores se tomaron al inicio del tratamiento (es decir, el día 0 los tumores tenían un volumen promedio de aproximadamente 90 mm3), y los días 3, 6, 10, 13, 17 y 20 después del tratamiento con anticuerpo. Los ratones fueron sacrificados cuando los tumores alcanzaron un criterio de valoración tumoral designado (un volumen de tumor en particular, tal como 1500 mm3 y/o cuando los ratones mostraron más de aproximadamente 15% de pérdida de peso).

La Figura 27A demuestra que los 10 ratones de control habían llegado a un criterio de valoración tumoral. La Figura 27B demuestra que el grupo tratado con 10 mg/kg de anticuerpo anti-PD-1 (Grupo B) tenía 6 ratones que alcanzaron el criterio de valoración tumoral y 4 ratones con tumores que tenían un volumen de aproximadamente 750 mm3 o menos. La Figura 27C demuestra que el grupo tratado con 10 mg/kg de anticuerpo anti-CTLA-4 (Grupo C) tenía 3 ratones que alcanzaron el criterio de valoración tumoral y 7 ratones con tumores que tenían un volumen de aproximadamente 1000 mm3 o menos. La Figura 27D demuestra que el grupo tratado con una combinación de 10 mg/kg de anticuerpo anti-PD-1 con 10 mg/kg de anticuerpo anti-CTLA-4 (Grupo D) tenía 2 ratones con tumores que tenían un volumen de aproximadamente 1000 mm3 o menos, y 8 ratones que estaban libres de tumor. La Figura 27E demuestra que el grupo tratado con una combinación de 3 mg/kg de anticuerpo anti-PD-1 con 3 mg/kg de anticuerpo anti-CTLA-4 (Grupo E) tenía un ratón que había alcanzado el criterio de valoración tumoral, 7 ratones con tumores que tenían un volumen de aproximadamente 500 mm3 o menos, y 2 ratones que estaban libres de tumor. La Figura 27F demuestra que el grupo tratado con una combinación de 1 mg/kg de anticuerpo anti-PD-1 con 1 mg/kg de anticuerpo anti-CTLA-4 (Grupo F) tenía 4 ratones que habían alcanzado el criterio de valoración tumoral, 5 ratones con tumores que tenían un volumen de aproximadamente 1100 mm3 o menos, y un ratón que estaba libre de tumor.

Las Figuras 27G y 27H muestran los volúmenes de los tumores en ratones tratados sucesivamente con anticuerpo anti-PD-1 primero y anticuerpo anti-CTLA-4 segundo, y viceversa. Los ratones de la Figura 27G primero recibieron 10 mg/kg de anti-CTLA-4 en cada uno de los días 0 y 3, y luego recibieron 10 mg/kg de anticuerpo anti-PD-1 en

cada uno de los días 6 y 10. Los ratones de la Figura 27H primero recibieron 10 mg/kg de anticuerpo anti-PD-1 en cada uno de los días 0 y 3, y luego recibieron 10 mg/kg de anticuerpo anti-CTLA-4 en cada uno de los días 6 y 10. Para el grupo G el día 27, 8 ratones alcanzaron el criterio de valoración tumoral, un ratón tenía un tumor muy pequeño (que, después de un retraso significativo, eventualmente creció) y un ratón estaba libre de tumor. Para el grupo H el día 27, 8 ratones alcanzaron el criterio de valoración tumoral y 2 estaban libres de tumor. La figura 28 demuestra que el volumen medio del tumor medido el día 10 fue de aproximadamente 1250 mm3 para el grupo de control con IgG; aproximadamente 470 mm3 para el anticuerpo para PD-1 con la IgG de control; aproximadamente 290 mm3 para el anticuerpo para CTLA-4 con la IgG de control (medido el día 6); aproximadamente 40 mm3 para el grupo con anticuerpo anti-CTLA-4 (10 mg/kg) y anticuerpo anti-PD-1 (10 mg/kg) combinados; aproximadamente 165 mm3 para grupo con anticuerpo anti-CTLA-4 (3 mg/kg) y anticuerpo anti-PD-1 (3 mg/kg) combinados, y aproximadamente 400 mm3 para el grupo con anticuerpo anti-CTLA-4 (1 mg/kg) y anticuerpo anti-PD-1 (1 mg/kg) combinados. La figura 29 demuestra que el volumen tumoral medio medido el día 13 fue de aproximadamente 1680 mm3 para el grupo de control con IgG; aproximadamente 400 mm3 para el anticuerpo para PD-1 con IgG de control; aproximadamente 660 mm3 para el anticuerpo para CTLA-4 con IgG de control; 0 mm3 para el grupo con anticuerpo anti-CTLA-4 (10 mg/kg) y anticuerpo anti-PD-1 (10 mg/kg) combinados; aproximadamente 90 mm3 para el grupo con anticuerpo anti-CTLA-4 (3 mg/kg) y anticuerpo anti-PD-1 (3 mg/kg) combinados, y aproximadamente 650 mm3 para el grupo con anticuerpo anti-CTLA-4 (1 mg/kg) y anticuerpo anti-PD1 (1 mg/kg) combinados. Para el tratamiento combinado de anticuerpo anti-PD-1 con el anticuerpo anti-CTLA-4, el número de ratones por grupo que estaban libres de tumor el día 27 del estudio fue de 8/10 (10 mg/kg), 2/10 (3 mg/kg) y 1/10 (1 mg/kg) (datos no mostrados).

Este estudio indica que, en un modelo de tumor murino, el tratamiento con la combinación de anticuerpo para CTLA4 y anticuerpo para PD-1 funciona de una manera dependiente de la dosis y tiene un efecto significativamente mayor sobre el crecimiento del tumor que ambos anticuerpos por sí solos, incluso a una dosis más baja e incluso cuando un tumor ya está bien establecido. Por otra parte, los anticuerpos se pueden administrar de forma sucesiva (anticuerpo anti-CTLA-4 primero y anticuerpo anti-PD-1 segundo, o viceversa) y la combinación todavía es superior a las monoterapias de anticuerpos.

Ejemplo 16: Eficacia in vivo de la terapia combinada (anticuerpos anti-CTLA-4 y anti-PD-1) sobre el establecimiento y crecimiento de fibrosarcoma

Se implantaron células de fibrosarcoma SA1/N (PD-L1-) (Leach et al. (1996) Science 271:1734-1736) subcutáneamente en ratones A/J (2 x 106 células/ratón) el día 0. Los días 1, 4, 7 y 11 después de la implantación, los ratones fueron inyectados IP de la siguiente manera: Grupo (A) PBS solo (referido como "vehículo"); Grupo (B) IgG de ratón (control, 10 mg/kg por ratón), Grupo (C) anticuerpo monoclonal anti-PD-1 4H2 (10 mg/kg por ratón), Grupo (D) anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 9D9 (10 mg/kg o 0,2 mg/kg por ratón), y Grupo (E) anticuerpo monoclonal anti-PD-1 4H2 (10 mg/kg por ratón) combinado con anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 9D9 (0,2 mg/kg por ratón). El estudio duró 41 días y las mediciones del tumor se tomaron en diferentes días durante todo el curso del estudio (véase la Figura 29). El volumen del tumor se calculó midiendo los tumores en tres dimensiones (alto x ancho x largo) utilizando un calibrador electrónico. Los ratones fueron sacrificados cuando los tumores alcanzaron un criterio de valoración tumoral designado -un volumen de 1500 mm3 y/o un tumor ulcerado.

Las figuras 30A y 30B demuestran que 19 de los 20 ratones de control (9/10 en el grupo A y 10/10 en el grupo B) o bien habían alcanzado el criterio de valoración tumoral o bien habían desarrollado tumores ulcerados. La Figura 30C demuestra que el grupo tratado con 10 mg/kg de anticuerpo anti-PD-1 (Grupo C) tenía 6 ratones que alcanzaron un criterio de valoración tumoral (2 con un volumen superior a 1500 mm3 y 4 con un tumor ulcerado) y 4 ratones que estaban libres de tumor. La Figura 30D demuestra que el grupo tratado con 10 mg/kg de anticuerpo anti-CTLA-4 (Grupo D) tenía 5 ratones que alcanzaron un criterio de valoración tumoral (2 con un volumen superior a 1500 mm3 y 3 con un tumor ulcerado), un ratón con un tumor pequeño (volumen de aproximadamente 70 mm3) y 4 ratones que estaban libres de tumor. La Figura 30E demuestra que el grupo tratado con 0,2 mg/kg de anticuerpo anti-CTLA-4 (Grupo E) tenía 10 ratones que alcanzaron un criterio de valoración tumoral (6 con un volumen superior a 1500 mm3 y 4 con un tumor ulcerado). La Figura 30F demuestra que el grupo tratado con una combinación de 10 mg/kg de anticuerpo anti-PD-1 con 0,2 mg/kg de anticuerpo anti-CTLA-4 (Grupo F) tenía 2 ratones que alcanzaron un criterio de valoración tumoral (uno con un volumen superior a 1500 mm3 y uno con un tumor ulcerado) y 8 ratones que estaban libres de tumor.

Las figuras 31 y 32 muestran la media y la median del volumen tumoral, respectivamente, que se desarrolló en ratones tratados y no tratados durante el curso de este estudio. La inhibición del crecimiento tumoral en los ratones tratados con estos anticuerpos, en comparación con los ratones tratados con el anticuerpo de control IgG de ratón, se resume en la Tabla 6.

Tabla 6. Inhibición del crecimiento del tumor y ratones libres de tumores después del tratamiento con anti-PD-1 y/o anti-CTLA-4

Estos datos indican además que la terapia combinada que comprende los anticuerpos anti-PD-1 y anti-CTLA-4 es sustancialmente más eficaz que el tratamiento con el anticuerpo solo. En efecto, la combinación es aún más eficaz que los tratamientos de anticuerpos individuales, incluso cuando la terapia combinada contiene una dosis subterapéutica de anticuerpo anti-CTLA-4. Estos datos también indican que, sorprendentemente, la presencia o ausencia de PD-L1 sobre el tumor puede no tener ningún efecto sobre la eficacia del tratamiento con esta combinación de anticuerpos, aunque la presencia de PD-L1 puede influir en el efecto de las monoterapias con anticuerpos ya que la expresión de PD-L1 sobre el tumor también puede conducir a la inhibición de las respuestas de células T anti-tumorales (véase la Figura 40).

Ejemplo 17: Eficacia in vivo y titulación de la dosis de la terapia combinada (anticuerpos anti-CTLA-4 y anti-PD-1) sobre el crecimiento de fibrosarcoma PD-L1

Se implantaron células de fibrosarcoma SA1/N (PD-L1-) subcutáneamente en ratones A/J (2 x 106 células/ratón) el día 0 durante un tiempo suficiente (aproximadamente 7 días) para permitir el establecimiento de un tumor. En los días 7, 10, 13 y 16 después de la implantación, a diez grupos de 8 ratones que tenían un volumen tumoral medio de 110 mm3 se les inyectaron IP de la siguiente manera: Grupo (A) PBS solo (referido como "vehículo"); Grupo (B) IgG de ratón (control, 10 mg/kg por ratón); Grupo (C) anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 9D9 (0,25 mg/kg); Grupo (D) anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 9D9 (0,5 mg/kg por ratón); Grupo (E) anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 9D9 (5 mg/kg); Grupo (F) anticuerpo monoclonal anti-PD-1 4H2 (3 mg/kg por ratón); Grupo (G) anticuerpo monoclonal antiPD-1 4H2 (10 mg/kg por ratón); Grupo (H) anticuerpo monoclonal anti-PD-1 4H2 (10 mg/kg por ratón) combinado con anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 9D9 (0,25 mg/kg por ratón); Grupo (I) anticuerpo monoclonal anti-PD-1 4H2 (10 mg/kg por ratón) combinado con anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 9D9 (0,5 mg/kg por ratón); y Grupo (J) anticuerpo monoclonal anti-PD-1 4H2 (3 mg/kg por ratón) combinado con anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 9D9 (0,5 mg/kg por ratón).

Los días 10, 13, 16 y 19 después de la implantación, en dos grupos de 6 ratones que tenían un volumen tumoral medio de 255 mm3 se inyectaron IP de la siguiente manera: Grupo (K) de IgG de ratón (control, 10 mg/kg por ratón); y Grupo (L) anticuerpo monoclonal anti-PD-1 4H2 (10 mg/kg por ratón) combinado con anticuerpo monoclonal antiCTLA-4 9D9 (1 mg/kg por ratón). El estudio duró 51 días y las mediciones del tumor se tomaron en diferentes días durante todo el curso del estudio (véanse las Figuras 33-38). El volumen del tumor se calculó midiendo los tumores en tres dimensiones (alto x ancho x largo) utilizando un calibrador electrónico. Los ratones fueron sacrificados cuando los tumores alcanzaron un criterio de valoración tumoral designado -un volumen de 1500 mm3 y/o un tumor ulcerado.

La Figura 33 muestra la respuesta al tratamiento con anticuerpo inmunoestimulador en ratones con tumores que tenían un volumen inicial de aproximadamente 110 mm3 (es decir, en el momento del tratamiento con el primer anticuerpo. Las figuras 33A y 33B demuestran que los 16 ratones de control (Grupos A y B) alcanzaron un criterio de valoración tumoral (15 con un volumen del tumor mayor que 1500 mm3 y 1 con un tumor ulcerado). Las Figuras 33C33E demuestran que los ratones portadores de tumores responden al tratamiento con anticuerpo anti-CTLA-4 de una manera dependiente de la dosis (p. ej., el Grupo C que recibió 0,25 mg/kg tenía 7/8 que alcanzaron el criterio de valoración tumoral y un ratón con un volumen tumoral inferior a 200 mm3, mientras que el Grupo E que recibió 5 mg/kg tuvo 6/8 ratones que alcanzaron el criterio de valoración tumoral y dos ratones que estaban libres de tumor). Las figuras 33F y 33G demuestran que los ratones respondieron aproximadamente de la misma manera, independientemente de la dosis de anticuerpo anti-PD-1 (el Grupo F recibió 3 mg/kg y el Grupo G recibió 10 mg/kg). En contraste, los ratones que recibieron un tratamiento combinado de 10 o 3 mg/kg de anticuerpo anti-PD-1 con 0,25

o 0,5 mg/kg de anticuerpo anti-CTLA-4 (Grupos H, I y J) mostraron una reducción significativa en el crecimiento del tumor . Por ejemplo, la Figura 33J demuestra que el grupo tratado con una combinación de 3 mg/kg de anticuerpo anti-PD-1 con 0,5 mg/kg de anticuerpo anti-CTLA-4 (Grupo J) tenía 2 ratones que tenían tumores ulcerados, 2 ratones con un volumen tumoral inferior a 500 mm3 y 4 ratones que estaban libres de tumor. El efecto sinérgico

5 inesperado de un anticuerpo anti-PD-1 combinado con un anticuerpo anti-CTLA-4, junto con la sorprendente eficacia de los niveles subterapéuticos de anticuerpo anti-CTLA-4 en la combinación, se muestran en las Figuras 34 (media del volumen del tumor) y 35 (mediana del volumen del tumor).

La Figura 36 muestra la respuesta al tratamiento con anticuerpo inmunoestimulador en ratones con tumores más

10 grandes, aquellos que tiene un volumen inicial de aproximadamente 250 mm3 (es decir, en el momento del tratamiento con el primer anticuerpo). La Figura 36A demuestra que los 6 ratones de control (Grupo K) alcanzaron un criterio de valoración tumoral (4 con un volumen del tumor mayor que 1500 mm3 y 2 con un tumor ulcerado). La Figura 36B demuestra que el grupo tratado con una combinación de 10 mg/kg de anticuerpo anti-PD-1 con 1 mg/kg de anticuerpo anti-CTLA-4 (Grupo L) tenía un ratón con un tumor ulcerado, 4 ratones con un volumen del tumor

15 mayor de 1500 mm3 y un ratón que estaba libre de tumor. La media y la mediana de los volúmenes tumorales se muestran en las Figuras 37 y 38.

La inhibición del crecimiento tumoral en los ratones tratados con estos anticuerpos, en comparación con los ratones tratados con el anticuerpo de control IgG de ratón, se resume en la Tabla 7 y la Figura 39.

20 Tabla 7. Inhibición del crecimiento tumoral después del tratamiento con anti-PD-1 y/o anti-CTLA-4

En conjunto, estos datos indican que la terapia combinada que comprende anticuerpos anti-PD-1 y anti-CTLA-4 es sustancialmente más eficaz que el tratamiento con un anticuerpo solo. Además, es sorprendente que la dosis de

25 cada anticuerpo se puede reducir sin afectar a la eficacia sinérgica de esta combinación de anticuerpos terapéuticos inmunoestimuladores. La terapia combinada todavía parece ser eficaz incluso cuando la masa tumoral es más madura (es decir, más grande).

Ejemplo 18: Inmunidad tumoral en ratones después de tratamiento con anticuerpo anti-PD-1 y re-sensibilización con 30 Células de fibrosarcoma PD-L1

Los ratones que sobrevivieron libres de tumores de la sensibilización con las células tumorales y el tratamiento con anticuerpo anti-PD-1 (es decir, tratamiento similar a los estudios de eficacia descritos en los Ejemplos 5 y 6) fueron

re-sensibilizados a continuación con células tumorales para investigar la inmunidad a la formación de tumores después de un tratamiento de este tipo. En pocas palabras, en la sensibilización inicial, se implantaron por vía subcutánea en ratones A/J (1 x 106células/ratón) células de fibrosarcoma SA1/N (PD-L1-) el día 0. En los días 1, 4, 7, 10, 14, 17 y 20 después de la implantación, los grupos de ratones fueron inyectados IP con IgG de ratón (control, 10 mg/kg por ratón) o con una de las diversas dosis de anticuerpos monoclonales anti-PD-1 4H2 (30, 10, 3, 1 y 0,3 mg/kg por ratón). La formación de tumores y el volumen se controlaron con un calibrador electrónico de precisión dos veces a la semana hasta que el estudio se hubo completado. Un grupo de 8 ratones estuvo libre de tumores después del tratamiento con anticuerpo anti-PD1 (4 que fueron tratados con 30 mg/kg, 2 con 3 mg/kg, uno con 1 mg/kg, y uno con 0,3 mg/kg).

Los ocho, ratones A/J libres de tumores tratados fueron re-sensibilizados por vía subcutánea implantando 1 x 106 células de fibrosarcoma SA1/N/ratón. Como control, en nueve ratones no tratados previamente se implantaron subcutáneamente 1 x 106 células de fibrosarcoma SA1/N/ratón. La formación y el volumen de los tumores se controlaron con un calibrador electrónico de precisión dos veces a la semana hasta el día 62 después de la implantación. Los nueve ratones tratados previamente (control) alcanzaron el criterio de valoración tumoral alrededor del día 22 después de la implantación de las células de fibrosarcoma. Por el contrario, los ocho ratones libres de tumores re-sensibilizados con células de fibrosarcoma no desarrollaron tumores hasta 62 días después de la implantación. La figura 47 muestra la media del volumen del tumor para los ratones no tratados y re-sensibilizados. Estos resultados demuestran que el tratamiento con un anticuerpo inmunoestimulador, tal como anti-PD-1, proporciona al sujeto tratado inmunidad a la formación de nuevos tumores, incluso en la presencia de células capaces de formar un tumor.

Ejemplo 19: Inmunidad tumoral en ratones después de la terapia con un único anticuerpo (anti-PD-1) o de la terapia combinada con anticuerpos (anti-CTLA-4 y anti-PD-1) re-sensibilizados con células de cáncer colorrectal PD-L1

Los ratones que sobrevivieron libres de tumores a la sensibilización con células tumorales y tratamiento con anticuerpo anti-PD-1 solo o anticuerpo anti-PD-1 combinados con anticuerpo anti-CTLA-4 (es decir, un tratamiento similar a los estudios de eficacia descritos en los Ejemplos 2-4) fueron luego re-sensibilizados con células tumorales para investigar la inmunidad a la formación de tumores después de tales tratamientos. En pocas palabras, en la sensibilización inicial, se implantaron células de cáncer colorrectal MC38 (PD-L1-) en ratones C57BL/6 (2 x 106 células/ratón) el día 0. Los días 0, 3, 6 y 10 después de la implantación, se inyectó IP a los grupos de ratones uno de los siguientes tratamientos: (1) IgG de ratón (control, 10 mg/kg por ratón), anticuerpo monoclonal anti-PD-1 4H2, o

(3) anticuerpo monoclonal anti-PD-1 4H2 combinado con anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 9D9. El crecimiento tumoral se controló con calibre de precisión electrónico tal como se describe en el Ejemplo 15. Un grupo de 11 ratones estaban libres de tumor después del tratamiento con anticuerpo anti-PD1 (2 total) o del tratamiento combinado con anticuerpo anti-PD-1/anti-CTLA-4 (9 en total).

Los 11 ratones C57BL/6 tratados, libres de tumores fueron re-sensibilizados por medio de la implantación de 2 x 107 células de cáncer colorrectal MC38/ratón (es decir, una dosis de células 10 x mayor que el desafío inicial). Como control, siete ratones no sometidos a tratamiento previo fueron implantados con 2 x 107 células de cáncer colorrectal MC38/ratón. La formación y el volumen de los tumores se monitorizaron con un calibrador electrónico de precisión durante la duración del experimento de re-sensibilización (al menos 20 días). La Figura 48 demuestra que los siete ratones no sometidos a tratamiento previo (control) desarrollaron un tumor y alcanzaron el criterio de valoración tumoral aproximadamente el día 18 después de la implantación de las células de cáncer colorrectal. En contraste, los 11 ratones libres de tumor re-sensibilizados con células de cáncer colorrectal no desarrollaron tumores hasta 18 días después de la implantación. La figura 49 muestra el volumen medio del tumor de los ratones no sometidos a tratamiento previo y re-sensibilizados. Estos datos indican que, de forma similar a la monoterapia con el anticuerpo, la terapia con anticuerpos combinados que da como resultado el bloqueo de PD-1 y CTLA-4 produce una inmunidad persistente a la recaída del tumor.

Ejemplo 20: Eficacia in vivo de la terapia combinada (anticuerpos anti-CTLA-4 y anti-FD-1) sobre el crecimiento de tumores establecidos

Se implantaron células de cáncer colorrectal CT26 en ratones BALB/C (2 x 106 células/ratón) durante un tiempo suficiente (aproximadamente 10 días) para permitir la formación de tumores. El día 10 después de la implantación, se tomaron las medidas del tumor y los ratones fueron asignados al azar a 5 grupos basándose en el volumen tumoral medio (aproximadamente 250 mm3) para la terapia posterior con anticuerpos. El día 0 (es decir, 10 días después de que las células CT26 fueron implantadas), los ratones fueron inyectados IP con (1) IgG de ratón (control), (2) anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 9D9, (3) anticuerpo monoclonal anti-PD-1 4H2, o (4) anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 y 9D9 y anticuerpo monoclonal anti-PD-1 4H2, a una concentración de 10 mg/kg por ratón. También se administraron inyecciones de anticuerpo los días 3, 6 y 10. Las composiciones de anticuerpo monoclonal utilizadas tenían bajos niveles de endotoxina y no se agregaron significativamente. Utilizando un calibrador electrónico, los tumores se midieron en tres dimensiones (alto x ancho x largo) y se calculó el volumen del tumor. Las medidas de los tumores se tomaron el día 0 (los tumores al inicio del tratamiento tenían un volumen de

aproximadamente 125 mm3), y en los días 3, 6, 10, 13, 17 y 20 después de la inyección con anticuerpo. Los ratones fueron sacrificados cuando los tumores alcanzaron un criterio de valoración tumoral designado (un volumen de tumor en particular, tal como 1500 mm3 y/o cuando los ratones mostraron más de aproximadamente 15% de pérdida de peso). Los resultados se muestran en la Figura 50. Este estudio indica que, en un modelo de tumor murino, el tratamiento con la combinación de anticuerpo para CTLA-4 y anticuerpo para PD-1 tiene un efecto significativamente mayor sobre el crecimiento del tumor que cualquier anticuerpo solo, incluso cuando un tumor ya está bien establecido.

Ejemplo 21: Efecto del anticuerpo anti-PD-1 humano sobre la función de las células T reguladoras

Las células T reguladoras son linfocitos que suprimen la respuesta inmunitaria. En este ejemplo, las células T reguladoras se sometieron a ensayo para determinar su función inhibidora de la proliferación y la secreción de IFN-gamma de células T CD4+ CD25-en presencia o ausencia de un anticuerpo monoclonal humano anti-PD-1.

Las células T reguladoras se purificaron a partir de PBMC utilizando un kit de aislamiento de células T CD4+ CD25(Miltenyi Biotec). Las células T reguladoras se añadieron a una reacción mixta de linfocitos (véase más arriba) que contenía células T CD4+ CD25-purificadas y células dendríticas alogénicas en una proporción de 2:1 de células CD4+ CD25-con respecto a células T reguladoras. Se añadió anticuerpo monoclonal anti-PD-1 5C4 a una concentración de 10 µg/ml. Como control negativo o bien no se utilizó ningún anticuerpo o bien se utilizó un anticuerpo de control de isotipo. Los sobrenadantes de cultivo se recogieron el día 5 para la medición de citoquinas utilizando un sistema de detección de citoquinas Beadlyte (Upstate). Las células se marcaron con 3H-timidina, se cultivaron durante otras 18 horas, y se analizaron para determinar la proliferación celular. Los resultados se muestran en las Figuras 51A (proliferación de células T) y 51B (secreción de IFN-gamma). La adición de anticuerpo monoclonal anti-PD-1 humano 5C4 liberó parcialmente la inhibición impuesta por las células Treg sobre la proliferación y la secreción de IFN-gamma de células T CD4+ CD25-, lo que indica que los anticuerpos anti-PD-1 tienen un efecto sobre las células T reguladoras.

Ejemplo 22: Efecto del anticuerpo anti-PD-1 humano sobre la activación de células T

En este ejemplo, se examinó efecto de bloqueo de la ruta de PD-1 por el anticuerpo anti-PD-1 5C4 sobre la activación de células T. Las células T CD4+ humanas purificadas (kit de purificación de células T CD4 Dynal) se activaron con 1 µg/ml de anticuerpo anti-CD3 soluble (BD) en presencia de monocitos autólogos o células dendríticas derivadas de monocitos (CD). Los monocitos se purificaron utilizando el kit de purificación de monocitos CD14 Miltenyi, y las CD se generaron in vitro después del cultivo de los monocitos con GM-CSF e IL-4 (PeproTech) durante 7 días. Después de tres días de activación en presencia o ausencia de anticuerpo anti-PD-1 o mAb de control de isotipo irrelevante, se recogieron los sobrenadantes de cultivo para el análisis ELISA de la secreción de IFN, mientras se añadía timidina tritiada durante las 18 horas finales del análisis con el fin de medir la proliferación de células T. Los resultados mostrados en las Figuras 52A y 52B demuestran que el bloqueo de PD-1 por el anticuerpo anti-PD-1 dio lugar a una mayor proliferación de células T y secreción de IFN-γ. También se observó un efecto sinérgico por el anticuerpo anti-PD-1 y el anticuerpo anti-CTLA-4 sobre la activación de células T (específicamente en la secreción de IFN-γ) en presencia de monocitos.

Ejemplo 23: Evaluación de la actividad ADCC del anticuerpo anti-PD-1

En este ejemplo, se llevó a cabo un análisis de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) para evaluar si el anticuerpo anti-PD-1 podría inducir ADCC para células diana. Se sometieron a ensayo dos versiones de 5C4, una con una región Fc de IgG1 humana (5C4-IgG1) y la otra con una región Fc de IgG4 humana (5C4IgG4), en el análisis. Se utilizó el kit de Citotoxicidad de Células Delfia de Perkin Elmer para el análisis. Brevemente, las células T CD4 humanas (kit de purificación de células T CD4 Dynal) purificadas fueron activadas por el anticuerpo anti-CD3 unido a la placa (BD) para inducir la expresión de PD-1. Las células T CD4 activadas diana se marcaron a continuación con el reactivo BATDA. Las células T CD4 marcadas se añadieron a una placa de fondo en V de 96 pocillos, seguido de la adición de PBMC humanas (una razón de células efectoras respecto a diana (E/T) de 50:1) y del anticuerpo diseñado. Después de la incubación durante 1 hora a 37°C, la placa se centrifugó. El sobrenadante se transfirió a una placa de fondo plano de 96 pocillos y se leyó la placa utilizando un lector de placa RubyStar. Los resultados demostraron que el 5C4-IgG4 no medió la ADCC sobre células T CD4 activadas, mientras 5C4-IgG1 medió la ADCC de las células T CD4 activadas (Figura 53), lo que indica que la actividad ADCC está relacionada con su región Fc del anticuerpo anti-PD-1.

Ejemplo 24: Evaluación de la citotoxicidad dependiente del complemento del anticuerpo anti-PD-1

En este ejemplo, se examinó la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) del anticuerpo anti-PD-1. Se sometieron a ensayo dos versiones de 5C4, una con la región Fc de la IgG1 humana (5C4-IgG1) y la otra con la región Fc de IgG4 humana (5C4-IgG4). Brevemente, las células T CD4 humanas purificadas (kit de purificación de células T CD4 Dynal) fueron activadas por el anticuerpo anti-CD3 unido a la placa (BD) para inducir la expresión de

PD-1. Se sometieron a ensayo diluciones seriadas de anticuerpo anti-PD-1 (5C4) y anticuerpos de control de 50 µg/ml a 640 pg/ml para determinar la CDC en presencia de complemento humano (Quidel-A113). Se utilizó Azul Alamar (Biosource International) para medir la citotoxicidad. La placa se leyó en un lector de placas de fluorescencia (EX530 EM590). Los recuentos de células viables son proporcionales a las unidades de fluorescencia. Los

5 resultados demostraron que ni 5C4-IgG1 ni 5C4-IgG4 mediaron la CDC sobre células T CD4 activadas, mientras que el anticuerpo de control positivo (anticuerpo anti-HLA-ABC) lo hicieron (Figura 54).

Ejemplo 25:Evaluación de la expresión de PD-1 en células T humanas

10 En este ejemplo, se examinaron las PBMC humanas de diferentes donantes para determinar la expresión de PD-1 en diversos subgrupos de células por medio de FACS. En este análisis se utilizó anticuerpo anti-PD-1 biotinilado, que ha mostrado una sensibilidad mucho mayor que el anticuerpo anti-PD-1 disponible comercialmente en la detección de moléculas PD-1 sobre la superficie celular. El anticuerpo unido se detectó utilizando un estreptavidina conjugada con PE. Los análisis de citometría de flujo se realizaron utilizando una citometría de flujo FACScan

15 (Becton Dickinson) y el soporte lógico FlowJo (Tree Star). Se detectó la expresión de PD-1 en algunas células T humanas periféricas, pero no en células B o monocitos. Un examen más detallado de los subgrupos de células T indica que PD-1 se expresa en células T de memoria y efectoras CD4 y CD8, pero está ausente en las células T CD4 o CD8 no sometidas a tratamiento previo.

20 La presente invención no está limitada en su alcance por las realizaciones específicas descritas en la presente memoria. En efecto, diversas modificaciones de la invención, además de las descritos en la presente memoria, serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción anterior y de las figuras que se acompañan. Tales modificaciones están destinadas a caer dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. La invención, por lo tanto, debe estar limitada sólo por los términos de las reivindicaciones adjuntas junto con el alcance completo de los

25 equivalentes a los que las reivindicaciones tienen derecho.

LISTA DE SECUENCIAS

<110>: Medarex, Inc.

<110>: Ono Pharmaceutical Co., LTD.

<120> ANTICUERPOS MONOCLONALES HUMANOS CONTRA MUERTE PROGRAMADA 1 (PD-1) Y MÉTODOS DE TRATAMIENTO DEL CÁNCER UTILIZANDO ANTICUERPOS ANTI-PD-1 SOLOS O COMBINADOS CON OTROS AGENTES INMUNOTERAPÉUTICOS

<130> GEOP-50

<150> US 60/679.466

<151> 2005-05-09

<150> US 60/738.434

<151> 2005-11-21

<150> US 60/748,919

<151> 2005-12-08

<160> 74

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 113

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

<210> 2

<211> 113

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 3

<211> 113

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

<210> 4

<211> 113

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

<210> 5

<211> 121

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

<210> 6

<211> 113

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

<210> 7

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<212> PRT 5 <213> Homo sapiens

<400> 7

10 <210> 8

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

<210> 9

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<212> PRT

<213> Homo sapiens 20 <400> 9

<210> 10

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10

<210> 11

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 11

<210> 12

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

<210> 13

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<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 13

<210> 14

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 14

<210> 15 15 <211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 15

20 <210> 16

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 16

<210> 17

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens 30 <400> 17

<210> 18

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 18

<210> 19

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 19

<210> 20 15 <211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 20

20 <210> 21

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 21

<210> 22

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens 30 <400> 22

<210> 23

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 23

<210> 24

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 24

<210> 25 45 <211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 25

50 <210> 26

<211> 16

<212> PRT 58

<213> Homo sapiens

<400> 26

<210> 27

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 27

10 <210> 28

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<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 28

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<212> PRT

<213>: Homo sapiens 20 <400> 29

<210> 30

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<213> Homo sapiens

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<212> PRT

<213> Homo sapiens

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<212> PRT

<213>: Homo sapiens 40 <400> 32

<210> 33

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<212> PRT

<213> Homo sapiens

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<213> Homo sapiens

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<213> Homo sapiens

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5 <210> 36

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<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 36

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<212> PRT

<213> Homo sapiens 15 <400> 37

<210> 38

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<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 38

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<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 39

<210> 40 30 <211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 40

35 <210> 41

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 41

<210> 42

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens 45 <400> 42

<210> 43

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 43

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 44

<210> 45

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 45

<210> 46 10 <211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 46

15 <210> 47

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 47

<210> 48

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens 25 <400> 48

<210> 49

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 49

<210> 50

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 50

<210> 51 40 <211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 51

45 <210> 52

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 52

<210> 53

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens 55 <400> 53

<210> 54

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 54

<210> 55

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 55

<210> 56 15 <211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 56

20 <210> 57

<211> 339

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220> 25 <221> CDS

<222> (1)..(339)

<400> 57

<210> 58

<211> 339

<212> ADN

<213> Homo sapiens

35 <220> 62

<221> CDS

<222> (1) .. (339)

<400> 58

5 <210> 59

<211> 339

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220> 10 <221> CDS

<222> (1) .. (339)

<400> 59

<210> 60

<211> 339

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1).. (339)

<400> 60 <210> 61

<211> 363

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (363)

<400> 61

<210> 62

<211> 339 15 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (339) 20 <400> 62

<210> 63

<211> 363

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (363)

<400> 63 <210> 64

<211> 321

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (321)

<400> 64 <210> 65

<211> 321

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (321)

<400> 65

10 <210> 66

<211> 324

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220> 15 <221> CDS

<222> (1).. (321)

<400> 66

<210> 67

<211> 321

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1).. (321)

<400> 67

<211> 321

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (321)

<400> 68

<210> 69

<211> 321

<212> ADN

<213> Homo sapiens 10 <220>

<221> CDS

<222> (1).. (321)

<400> 69

15 <210> 70

<211> 321

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1) .. (321)

<400> 70

<210> 71

<211> 98

<212> PRT

<213> Homo sapiens 15 <400> 71

<210> 72

<211> 95

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 72

<210> 73

<211> 99

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 73

<210> 74

<211> 95

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 74

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo monoclonal aislado, o porción de unión a antígeno del mismo, que comprende:

a) una región variable de cadena pesada que comprende los aminoácidos que tienen la secuencia mostrada en el SEC ID NO: 4; y b) una región variable de cadena ligera que comprende los aminoácidos que tienen la secuencia mostrada en el SEC ID NO: 11;

en donde el anticuerpo se une específicamente a la proteína Muerte Programada 1 (PD-1) humana.
2.

El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo es un isotipo IgG4.
3.

Una composición que comprende el anticuerpo, de la reivindicación 1 o 2, y un portador farmacéuticamente aceptable.
4.

El anticuerpo de la reivindicación 1 o 2, para su uso en un método para modular una respuesta inmunitaria.
5.

El anticuerpo, de la reivindicación 1 o 2, para su uso en un método para inhibir el crecimiento de células tumorales.
6.

El anticuerpo de la reivindicación 5, en donde las células tumorales son de un cáncer seleccionado del grupo que consiste en melanoma, cáncer renal, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de colon y cáncer de pulmón.
7.

El anticuerpo de la reivindicación 5, en donde las células tumorales son de un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer de hueso, cáncer de páncreas, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma maligno cutáneo o intraocular, cáncer de útero, cáncer de ovario, cáncer de recto, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer de útero, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma del cuello uterino, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, enfermedad de Hodgkin, linfoma no-Hodgkin, cáncer del esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroides, cáncer de la glándula suprarrenal, sarcoma de tejidos blandos, cáncer de la uretra, cáncer del pene, leucemia crónica o aguda, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crónica, tumores sólidos de la infancia, linfoma linfocítico, cáncer de la vejiga, cáncer del riñón o del uréter, carcinoma de la pelvis renal, neoplasias del sistema nervioso central (SNC), linfoma primario del SNC, angiogénesis tumoral, tumor de eje espinal, glioma del tronco encefálico, adenoma de la pituitaria, sarcoma de Kaposi, cáncer epidermoide, cáncer de células escamosas, linfoma de células T, cánceres inducidos ambientalmente, incluyendo los inducidos por el amianto, y combinaciones de dichos cánceres.
8.

El anticuerpo de la reivindicación 1 o 2 para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad infecciosa.
9.

El anticuerpo de la reivindicación 8, en donde la enfermedad infecciosa es causada por un virus seleccionado del grupo que consiste en VIH, Influenza, Herpes, Giardia, Malaria, Leishmania, Hepatitis A, B, o C, un virus del herpes, VZV, HSV-1, 6-HAV, HSV-II, CMV, virus de Epstein Barr, adenovirus, virus de la influenza, flavivirus, echovirus, rinovirus, virus de coxsackie, cornovirus, virus sincitial respiratorio, virus de las paperas, rotavirus, virus del sarampión, virus de la rubéola, parvovirus, virus vaccinia, virus HTLV, el virus del dengue, virus del papiloma, virus del molusco, poliovirus, virus de la rabia, el virus JC, virus de la encefalitis por arbovirus, clamidia, bacterias Rickettsiales, micobacterias, estafilococos, estreptococos, neumonococos, meningococos, gonococos, klebsiella, proteus, serratia, pseudomonas, legionella, difteria, salmonela, bacilos, cólera, tétanos, botulismo, ántrax, peste, leptospirosis, bacteria de la enfermedad Lyme, Candida albicans, krusei, glabrata o tropicalis, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus o niger, Mucorales mucor, absidia o rhizophus, Sporothrix schenckii, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum, Entamoeba histolytica, Balantidium coli, Naegleriafowleri, Acanthamoeba sp., Giardia lamblia, Cryptosporidium, Pneumocystis carinii, Plasmodium vivax, Babesia microti, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Toxoplasma Gondi y Nippostrongylus brasiliensis.
10.

Un producto inmunoconjugado que comprende el anticuerpo, de la reivindicación 1 o 2, conectados a un agente terapéutico.
11.

Una composición que comprende el producto inmunoconjugado de la reivindicación 10 y un portador farmacéuticamente aceptable.
12.

El producto inmunoconjugado de la reivindicación 10, en donde el agente terapéutico es una citotoxina.
13.

Una composición que comprende el inmunoconjugado de la reivindicación 12 y un portador farmacéuticamente aceptable.
14. El producto inmunoconjugado de la reivindicación 10, en donde el agente terapéutico es un isótopo radiactivo. 5
15.

Una composición que comprende el inmunoconjugado de la reivindicación 14 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
16.

Una molécula biespecífica que comprende el anticuerpo, de la reivindicación 1 o 2, conectados a un segundo

10 radical funcional que tiene una especificidad de unión diferente que dicho anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo.
17. Una composición que comprende la molécula biespecífica de la reivindicación, y un portador farmacéuticamente

aceptable. 15

Unión de AbHuMab anti-hPD-1 a células T humanas activadas

Concentración [nM] Figura.15a

Unión de AbHuMab anti-hPD-1 a celulas PBMC de mono Cynomolgus activadas

Concentración [nM]

Figura 15b